Guía de Prácticas: Microbiología Industrial

P ÁT A RCI 1 C MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIÓN

I.

OBJETIVOS 1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial. 2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico. 3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los alimentos.

II. MARCO TEÓRICO El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis. 2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas. 2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor. El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos. En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo. Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC durante 1 hora. a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen. b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.

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2.1.2

ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el ADN , y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de una nucleasa. El calor produce tambien una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe tambien degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas. a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos. b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo. c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15-20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización. c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de: Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica. ♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua). ♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión. ♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro. ♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.3 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc. 2.4 ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN ULTRAVIOLETA Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm de longitud de onda, éste método presenta muchas dificultades técnicas.

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III. MATERIALES Y EQUIPO
♠ ♠ ♠ ♠ ♠ ♠

Material de vidrio: pipetas, palcas petri Erlenmeyer, tubos de ensayo Papel craff, algodón, gasa, tijeras Mechero de Bunsen Horno Pasteur de aire caliente Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a)Preparación de tubos matraces Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados según el método siguiente: ♠ De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular ♠ Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra. ♠ Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud. ♠ Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo ♠ Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas. Frascos y Matraces ♠ Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo. ♠ Colocar el nombre del medio de cultivo ♠ Rotular la fecha de preparación. b)Preparación para proteger las pipetas ♠ En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado. ♠ Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante. ♠ Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización.

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c) Preparación de las placas petri ♠ Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas. ♠ Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro, se envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de regalo. 4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal. a)Procedimiento para la esterilización en horno ♠ Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno. ♠ Si hay un ventilador verifique que esté funcionando. ♠ Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60 minutos más. ♠ Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno. ♠ El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado. 4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO

a)Procedimiento para la esterilización con autoclave ♠ Llene con agua el fondo del autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje. ♠ Introduzca en el autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada. ♠ Cierre la tapa del autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado. ♠ Abrir la válvula de salida del aire. ♠ Inicie el calentamiento del autoclave. ♠ Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado del autoclave. ♠ Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente. ♠ Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos. ♠ Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido. ♠ Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave.

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Deje enfriar el autoclave y a continuación cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.

retire

V. CUESTIONARIO 5.1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?. 5.2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiológico, por qué? 5.3 Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave. 5.4.Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas.y explique a que se debe tal diferencia. 5.5.Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.

P ÁT A RCI 2 C MICROSCOPIA I.- OBJETIVOS 1) Identificar cada una de las partes del microscopio óptico, conocer su función y el cuidado de cada uno de ellas. 2) Conocer la morfología de organismos unicelulares. 3) Conocer los distintos métodos de observación de microorganismos “in vivo”.

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II.- MARCO TEORICO El microscopio permite la observación de estructuras muy pequeñas que no pueden ser vistas a simple vista. El poder de resolución de un microscopio esta en relación inversa a la longitud de onda de la luz usada. 2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. Parte mecánica: - Pie - Columna (pilar, charnela y brazo) - Tubo: Revólver - Tornillo macrométrico o sistema de movimiento rápido - Tornillo micrométrico o sistema de movimiento lento - Platina: Pinzas sujetadoras de láminas y mandos coaxiales - Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma iris y soporte para el espejo 2. Parte óptica del Microscopio: - Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador - Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra los objetivos traen impresas las siguientes características: o Magnificación: Ej. x 25 o Apertura numérica (A.N.): Ej. 0,45 o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromático o Longitud del tubo: Ej. 160 mm o Corrección de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm o Aparato de iluminación. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma 2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el tornillo micrométrico. 2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga Verificar que los oculares estén limpios y en posición correcta. 3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan preparaciones frescas o”in vivo” debe mantenerse la platina horizontal. 4. Verificar que los objetivos en el revólver estén en orden progresivo de aumento. 5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico girando el revólver hasta que haga “clik”. 6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el diafragma totalmente. 7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente más cercano. 8. Observe por el ocular la iluminación del campo y trate de lograr la máxima luminosidad moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.

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9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento se logra utilizando los mandos coaxiales. 10. Para iniciar la observación, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panorámico ó 10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mínima (5 mm.), esto se logra bajando el tubo con el tomillo macrométrico y observando por un lado del Microscopio el descenso del mismo. Luego, observe por el ocular y simultáneamente suba al tubo con el tomillo macrométrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo micrométrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lámina con la ayuda de los mandos coaxiales para su observación integral, siempre utilizando el tomillo micrométrico para no perder la nitidez. Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo macrométrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm. 11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste. 12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie de objetivo girando el sistema de revólver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente aumento (45X) y NO el de inmersión. Ponga nítida la imagen únicamente con el tomillo micrométrico. Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse con el tomillo macrométrico porque corre el riesgo de romper la lámina o la lente frontal del objetivo. 13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersión, coloque el elemento seleccionado en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre éste sector de lámina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersión. Luego, continúe girando el revólver hasta que el objetivo de inmersión (100X) contacte con la gota y encaje en el eje óptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo micrométrico. Una vez terminada la observación limpie el objetivo de inmersión y la lámina con el campo ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol. 2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CALCULO APROXIMADO DE DIMENSIONES CELULARES 1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del ocular. Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X 40 x 10 = 400 aumentos 2. Para el cálculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el diámetro del campo microscópico que varía de acuerdo al objetivo que se usa. Diámetro del campo microscópico Diámetro del Objetivo campo en micras 10X 1500 45X 400 100X 150

Ocular 10X 10X 10X

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Ejemplo:

Si observamos una célula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y ocular 10X, y si ésta ocupa la tercera parte del campo microscópico, concluiremos que la célula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la tercera parte de 1500.

2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO 1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo ó la platina, porque a la larga deteriora el tomillo micrométrico. 2. Los objetivos y oculares constituyen la parte mas delicada del Microscopio, por lo que debe tenerse sumo cuidado en su uso. Así, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razón debe desmontarse los objetivos. El objetivo de inmersión no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio después de su uso, para lo cual use el “campo” ligeramente humedecido con alcohol isopropílico o metanol. 3. Al finalizar la observación microscópica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje óptico dejando un espacio de 2 cm. entre éste y la lentilla del condensador, luego apague la luz. 2.5.- OBSERVACIÓN “IN VIVO” DE ORGANISMOS UNICELULARES Indicaciones: 1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina esté en posición horizontal. 2. Coloque la lámina porta objetos en su Microscopio. 3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lámina de manera que la luz del Microscopio la atraviese. 4. Proceda a enfocar con menor aumento y observará que tiene exceso de iluminación y poca visión de la muestra corrija éste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris. 5. Observará elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen características especiales y un fondo de partículas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse: - Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeñas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos. - Diatomeas, de diferentes formas y tamaños, se las distingue porque son brillantes, amarillentas, poco móviles; van desde la forma de un barril pequeño hasta cigarros o prismas. - Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observación. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior observar el núcleo y vacuolas. - También puede observarse a la stilonichia, más pequeña que el Parameccium y con un pelo o cerda en un extremo. - Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo (Protozoario flagelado). - La ameba, difícil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza lentamente emitiendo pseudópodos en la superficie de su cuerpo. - También puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cáliz, con un pedicelo largo y delgado, generalmente viven en colonias. La superficie del “cáliz” está rodeada de cilios.

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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe nuevamente los organismos unicelulares. 7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes. _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

2.6.- EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS 1. Examen en Fresco Es la forma más simple de realizar la preparación de un espécimen para su examen microscópico. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Hay 2 tipos de técnicas: a. Preparación en fresco simple “entre porta y cubre”. Consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego cubrirla con un cubreobjetos. b. Gota pendiente Consiste en colocar una gota de líquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un portaobjetos (de forma invertida) con una excavación central (portaobjetos excavados). Se debe sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta preparación es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo. II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres de movilidad, morfología, agrupación, observación de huevos y quistes de parásitos. EXAMEN EN FRESCO Material -Microcopio -Láminas cubreobjetos -Láminas portaobjetos -Agua destilada -Asas de Kolle -Gérmenes varios -Muestras fermentadas -Cultivo de microorganismos

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Metodología -Si la muestra proviene de un líquido, con un asa de kolle se coloca una gota de líquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto. -Si la muestra proviene de un cultivo sólido, se deposita primero una gota de suero fisiológico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una suspensión y colocar un cubreobjetos. -Observar al microscopio con objetivo 40X. Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

III. CUESTIONARIO i. ¿Qué ventajas y desventajas ofrece una preparación en fresco?

ii.

¿Qué ventaja presenta una preparación gota pendiente?

iii.

¿Realice un dibujo del microscopio y señale sus partes?

iv.

¿A qué se denomina campo óptico?

v.

¿Qué es el sistema parafocal?

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P ÁT A RCI 3 C PREPARACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO: TINCIÓN GRAM I.- OBJETIVOS 2) Observar los microorganismos vivos en suspensión: preparaciones húmedas y coloraciones supravitables. 3) Observar células muertas en frotis seco y teñidas con diferentes procedimientos de coloración. II.- MARCO TEORICO Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeños y su protoplasto posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas. Los colorantes están constituidos en su mayoría por el anillo bencénico, y difieren uno de otro en cuanto al número y disposición de estos anillos y a la sustitución de los átomos de hidrógeno por otras moléculas. Algunos de los grupos cromóforos más comunes hallados en los colorantes son: C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2. La intensidad de coloración de colorante es proporcional al número de radicales cromóforos del compuesto. 2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

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PARED CELULAR El espesor oscila generalmente entre 0.150 µ m y 0.500 µ m de espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 µ m (Lactobacillus). Las paredes de las células jóvenes son más delgadas que las células de cultivo antiguo. GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas está constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptídicos. Sin embargo estas células contienen también una gran cantidad de ácidos teicocos, polímeros de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminoácidos como D-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol. GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa, estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que contiene el antígeno O somático conocido como lipopolisacárido LPS, una capa densa intermedia, y la membrana plasmática interna. Un espesor de 0.0075 µ m. 2.2.- COLORACIONES VITALES Son los montajes de materia viva teñidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observación, mediante el colorante de la morfología y la estructura bacteriana, pero sin provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria. 2.3.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS Este tipo de preparaciones son las más frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de muestras clínicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos. Los pasos a seguir para la realización de una preparación fijada y coloreada son: a. Confección del Frotis. Puede prepararse a partir de productos líquidos o sólidos. Producto liquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino. Cultivo en medio sólido. puede prepararse una suspensión del material en una gota de solución salina colocada previamente en el portaobjetos, extendiéndola con ayuda del asa de platino. b. Secado. Se dejará secar el frotis a temperatura ambiente. c. Fijación. La fijación tiene como objeto la inmovilización de las estructuras del material a estudiar en un estado lo mas próximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rápida de los microorganismos, debida a la coagulación de las albúminas protoplásmicas. Existe un gran número de fijadores, tanto en forma simple (etanol, ácido pícrico). Las formas más habituales de fijación son: por el calor y alcohol en frío. d. Coloración. Es el proceso de coloración de los microorganismos. e. Lavado. Eliminación del exceso de colorante.

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f. Secado. Se secará la preparación al aire. CLASIFICACIÓN DE LAS COLORACIONES La clasificación de los colorantes es algo confusa, pero está basada en los cromóforos presentes. a. Según su estructura química. Pueden clasificarse como Ácido o Básico, término que no índica sus reacciones de pH en solución, sino, si una parte de la molécula es aniónica o catiónica. • Los colorantes básicos, tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina. • Los colorantes ácidos, reaccionan con sustancias básicas, tales como estructuras citoplásmaticas, y como colorante de contraste. Ej: ácido pícrico. • Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante ácido con uno básico. Ej: Wright, Giemsa, Hematoxilina - Eosina. • Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej: Sudán III. CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfología y tipo de agrupación bacteriana. ejplo. Tinción azul de metileno, Tinción fucsina. b. Tinciones Diferenciales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto las características de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tinción Gram, Tinción ácido-alcohol resistente. c. Tinciones Estructurales. Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto estructuras bacterianas. como; Tinción de flagelos, Tinción de esporas, Tinción de cápsulas, Tinción de corpúsculos metacromáticos IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 3.1. COLORACIONES VITALES Estos tipos de exámenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como técnicas intermedias entre éstas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teñidas. Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solución de azul de metileno (1/1000), Asas de platino, Gérmenes diferentes Procedimiento - Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000). - Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o sólida). - Observar al microscopio con el objetivo de 40X. Observación y Resultados

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- Cubrir la preparación con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. - Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. - Secar al aire, a temperatura ambiente. - Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión. Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

TINCIÓN DE SAFRANINA Las bacterias aparecen de color rojo. Procedimiento Tome una lámina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un frotis. Con el asa tome una pequeña porción del cultivo en medio sólido y disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frótices que se obtengan no deben ser ni muy gruesos ni muy finos. Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis. Cubrir la preparación con el colorante de safranina (2 ó 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos. Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de colorante. Secar al aire, a temperatura ambiente. Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión. Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

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3.4. COLORACIONES DIFERENCIALES Material. Microscopio, Láminas portaobjetos, Set para la coloración de Gram, Asas de platino, Gérmenes diferentes, Aceite de inmersión, Xilol TINCIÓN GRAM El cristal violeta actúa como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza química de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aún luego del tratamiento con un decolorante orgánico, tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas. Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipídico en su pared celular, pierden la coloración primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus paredes celulares. Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorción del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con dificultad son así fácilmente diferenciables. Reactivos - Solución de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95º = 20 ml, Agua destilada csp=100 ml) - Solución de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada= 100 ml) - Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) - Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95º= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml) Procedimiento Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lámina portaobjeto limpia. Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la fijación del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso de tinción. Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de caño. Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua. Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el índice y bañar la superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar más colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos más o menos. Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de caño. Secar al aire, a temperatura ambiente. Observar al microscopio con lente de inmersión. (100X) y con aceite de inmersión. Observación y Resultados _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

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_______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ _______________________________________ V. CUESTIONARIO 1. ¿Qué es un colorante y cuáles son sus propiedades? 2. ¿Por qué se le llama a un colorante ácido o básico? 3. ¿A qué se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria? 4. ¿De qué manera influye el pH en la coloración? 5. ¿Por qué es necesario utiliza métodos de tinción para visualizar a las bacterias? 6. Escriba la estructura del azul de metileno y safranina 7. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos 8. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales 9. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique la función que cumple cada uno de ellos. 10. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique la función que cumple cada uno de ellos. 11. Explique el fundamento de la coloración de Gram y esquematice. 12. ¿A qué se denomina mordiente y mencione tres ejemplos? 13. Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo. 14. Dibuje la estructura del colorante cristal violeta 15. Mencione tres microorganismos (género) que sean cocos grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

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P ÁT A RCI 4 C MEDIOS DE CULTIVO I.- OBJETIVOS a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano. b. Describir los medios de cultivo más empleados en bacteriología. c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo más corrientes. d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboración de cualquier medio de cultivo. II.- MARCO TEORICO 2.1. REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con esto, siempre se requerirá una fuente de energía y una fuente no energética como son las sales, factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energía son necesarias para su desarrollo. 2.2.1.- REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS DE LOS MICROORGANISMOS A. FUENTES DE CARBONO En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azúcares en forma de mono o disacáridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e

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incluso hay microorganismos que pueden utilizar azúcares más complejas para obtener energía., como es el caso del almidón. Existen también bacterias capaces de utilizar el gas carbónico CO2 hecho que es característico de las bacterias fotosintetizantes y quimiolitótrofas. Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos como fuente de energía: Ejemplo: Cladosporium. Por último, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energía un gran número de componentes hidrocarbonados diferentes. B. FUENTE DE NITROGENO Pueden presentarse como proteínas completas, que seria el caso de la gelatina o incluso proteínas aún mas complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc. Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrógeno que corresponden a péptidos o polipéptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son también proteínas que están parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal. El bio-Thione, es una denominación comercial correspondiente a una peptona pépsica de carne.. La caseína en forma de peptona tripsica de caseína se usa para estudiar la formación de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de triptófano que posee este tipo de peptona. También es utilizada para estudiar la reducción de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos. La peptona papaínica de soja, es una fuente de nitrógeno especialmente para hongos y ciertos gérmenes como Neisserias. Otra fuente de nitrógeno serian: nitratos, nitrógeno orgánico, amoniaco, sales de amonio, aminoácidos, etc. 2.2.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGÉTICOS DE LOS MICROROGANISMOS A. FUENTE DE AZUFRE Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algún aminoácido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc. Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS. B. FUENTE DE FÓSFORO En general, las bacterias que utilizan el fósforo lo suelen hacer en forma de fosfato. C. IONES METÁLICOS Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc. También se encuentra otro tipo de iones metálicos Cobalto, Molibdeno. Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentración pueden inhibir el ‘crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros. - Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous. - Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus. D. FACTORES DE CRECIMIENTO

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Existen bacterias que aún con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta además una serie de componentes definidos que no son capaces de fabricar por sí solas. A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algún tipo de aminoácido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases púricas o pirimidinicas, etc. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: - Agar sangre enriquecido con metionina, ácido glutámico y ácido nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas. - El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias húmedas, lisas y grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y está enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo. - Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en “gotas de mercurio” brillantes es fácil de apreciar. - Agar sangre enriquecido con nitrógeno suplementario y vitaminas del complejo B para el crecimiento del Flavobacterium. E. FACTORES INHIBIDORES Son componentes que van a impedir el crecimiento de algún tipo de microorganismo por bloqueo de sus procesos metabólicos. Los antibióticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria. La azida sódica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos. Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los Grampositivos. Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos. Las sustancias inhibidoras son muy útiles para la identificación y tipificación de pruebas bioquímicas de las bacterias. Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos: Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias Gramnegativas. El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias. Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentración de sales biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes. Agar Sulfito Bismuto, contiene el metal pesado bismuto y el colorante verde brillante los cuales actúan corno inhibidores del desarrollo de todas las bacterias Grampositivas y de la mayoría de las Gramnegativas, excepto la Salmonella. 2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario: - Una composición de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo. - Unas condiciones físico-químicas apropiadas. De acuerdo con ello, habría que considerar: A. TEMPERATURA ÓPTIMA Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categorías siguientes en función de los rangos de temperatura de crecimiento.

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- Los psicrófilos crecen bien a 0ºC y tienen una temperatura óptima o inferior, la máxima es de 20ºC. Se aíslan del Ártico y Antártico. Pueden crecer a 0ºC, aunque su temperatura óptima sea 20 a 30ºC y la máxima de casi 35ºC. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefacción de alimentos refrigerados. - Los Mesófilos, crecen a una temperatura óptima de 20 a 45ºC, siendo la mínima de 15 a 20ºC y la máxima de casi 45ºC. La mayoría de los microorganismos pertenecen a esta categoría. Las bacterias patógenas para el hombre suelen crecer a una temperatura óptima de 37ºC. - Los termófilos, pueden crecer a una temperatura de 55ºC o superiores. La temperatura mínima es normalmente de 45ºC y la óptima es de 55 a 65ºC. Microorganismos que crecen en fardos de heno, tuberías de agua caliente, aguas termales. - Los Hipertermófilos, temperatura óptima de entre 80ºC y casi 113ºC, no crecen por debajo de 55ºC. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino. RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO Temperaturas cardinales (ºC) Microorganismo Máxim Mínima Óptima a Bacillus psichrophilus -10 23-24 28-30 Microcococcus cryophilus Pseudomona fluorescens Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Thermoplasma acidophilum Bacillus stearthermophilus Sulfolobus acidocaldarius Pyrococcus abyssi Pyrodictium occultum Pvrolobus fumarii Candida scotti Saccharomyces cerevisiae Mucor pusillus -4 4 6.5 0 10 30 45 30 60 67 82 90 0 1-3 21-23 10 25-30 30-37 37 37 35-36 59 60-65 80 96 105 106 4-15 28 45-50 24 40 46 44 45 38 62 75 85 102 110 113 15 40 50-58

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B. GRADO DE HUMEDAD Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento. En general, cualquier medio sólido o líquido requiere cierta proporción de agua. En medios sin agua es muy difícil el crecimiento bacteriano: de ahí que la liofilización y cualquier método de deshidratación, sea un buen medio de conservación. C. pH Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH óptimo de crecimiento. - Los acidófilos tienen un valor de pH óptimo de crecimiento entre 0 y 5.5. - Los neutrófilos, entre 5.5 y 8.0 - Los alcalófilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5 La mayoría de las bacterias y protozoos son neutrófilos. La mayoría de hongos prefieren medios ligeramente ácidos, con valores de pH de 4 a 6. Variaciones intensas en el pH pueden dañar a los microorganismos alterando la membrana plasmática o inhibiendo la actividad de las enzimas y las proteínas transportadoras. El pH óptimo en la mayoría de los casos es cercano a la neutralidad. Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy ácido, a pH próximo a 0. Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8. El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9. En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradación de los nutrientes por parte de las bacterias. Es típico que en la fermentación glucídica se produzca acidificación del medio o en la degradación proteica utilizando la bacteria sales amónicas como fuente de energía se alcalinice el medio. Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro de los límites fisiológicos. EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO Microorganismo Picrophilus oshimae Thiobacillus thiooxidans Sulfolobus acidocaldarius Lactobacillus acidophilus Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Escherichia coli Clostridium sporogenes Pseudomonas aeuriginosa Nitrosomonas Límite inferior 0 0.5 1.0 4.0-4.6 4.2 4.4 4.4 5.5-5.8 5.6 7.0-7.6 pH óptimo 0.7 2.0-3.5 2.5 5.8-6.6 7.0-7.5 6.0-7.0 6.0-7.0 6.0-7.6 6.6-7.0 8.0-8.8 Límite superior SD 6.0 4.0 6.8 9.3 8.4 9.0 8.5-9.0 8.0 9.4

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Bacillus pasteurii Bacillus alcalophilus

8.5 8.5

SD 10.6

SD 11.5

D. PRESIÓN OSMÓTICA Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo superiores. Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotónicos; este hecho es debido a su pared rígida que permite que el agua no penetre en la bacteria y ésta se rompa. En las bacterias halófilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de cloruro sódico; Ej: Staphylococus. Como la concentración osmótica de un hábitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw). Actividad del Ambiente Agua 1.00 (agua pura) Sangre Microorganismo Mayoría de Gramnegativos no halófilos 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 Pan Jamón Salami Conservas Lagos salados Pescado salado Cereales, dulces Chocolate Xeromyces Leche deshidratad a E. CONCENTRACION DE OXÍGENO Un organismo que puede crecer en presencia de oxígeno atmosférico es AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO. Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor en su presencia. Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto en su presencia como en su ausencia. Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus Staphylococus, Saccharomyces Penicillum Halobacterium, Aspergillus 0.70 0.60 Actinospora Aspergillus Saccharomyces Bacilos Basidiomycetes Grampositivos,

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Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides. Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia. Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energía mediante la respiración aerobia y deben utilizar vías de fermentación o respiración anaerobia para este objetivo. Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son MICROAEROFILOS que son dañados por el nivel de oxigeno atmosférico 20% precisando para su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxígeno. 2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, así como diferentes clasificaciones. De acuerdo con esto y según criterios se podrían dividir en: 2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU PROPORCIÓN EN AGUA A. MEDIOS SÓLIDOS Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está siempre por encima del 15%. La importancia, de los medios sólidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificación y visualización del crecimiento en colonias, así como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de caracteres, sólidos elaboración de antibiogramas, etc. Ejemplo de medios de cultivo: Agar azida sangre, permite el aislamiento de estreptococos y estafilococos. Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos. Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus. Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos. Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfología de las colonias. B. MEDIOS LÍQUIDOS también denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realización de recuentos bacteriológicos por turbidimetría, especialmente útil en levaduras, para la realización de inóculos, para obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibióticos, ácidos lácticos, etc. Ejemplo de medios de cultivo: Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradación de glucosa. Caldo Peptona, para investigar la producción de Indol. Caldo Lactosado, para investigar la formación de ácido y gas Caldo Selenito, permite el aislamiento de Salmonella en muestras de heces con abundante concentración de bacterias mixtas. Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difíciles de cultivar. C. MEDIOS SEMISÓLIDOS Son medios intermedios entre los líquidos y los sólidos; su proporción en agar suele ser inferior al 5% pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semisólida. Son útiles para algunas pruebas bioquímicas: Agar O-F Hugh Leiffson, que permite, conocer el tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo de la bacteria problema. Agar SIM, estudiar movilidad, producción de H2S, Indol. Agar MIO, estudiar movilidad, producción de Indol y Ornitina.

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2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU USO O UTILIZACIÓN A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, según sea su composición, se pueden a su vez dividir en: A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les añade además de los componentes básicos, uno o varios elementos, como por ejemplo caseína soja, triptófano, etc., que facilitan el crecimiento de algún tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo que buscamos. A.2. MEDIOS SELECTIVOS Son medios en cuya composición presentan componentes que impiden el crecimiento de algún tipo bacteriano. - El medio Rothe se caracteriza porque en su composición aparece azida sódica confiriendo al medio propiedades selectivas ya que tal componente va impedir el crecimiento de todas las bacterias Gramnegativas, permitiendo el crecimiento de algunas Grampositivas como Streptococus faecalis. - Medio Salmonella Shigella, contiene en su composición sales biliares, citrato de sodio y el verde brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme. A.3. MEDIOS DIFERENCIALES Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es más característico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van a crecer en dicho medio, dan una información suplementaria y específica, es decir, diferencial; por ejemplo: - El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composición eosina y azul de metileno que inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento de la enterobacterias, que según utilicen o no la lactosa darán lugar a una coloración característica para cada tipo de microorganismo. Los medios diferenciales suelen ser también selectivos y se usan con fines de aislamiento e identificación. - Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y Sacarosa, además si puede producir H2S. - Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminoácido Lisina. - Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono. B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL Son medios ya sea en forma líquida o sólida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias. Su composición va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, sales y agua. Dentro de los medios generales más empleados tendríamos el caldo común, que está compuesto por extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sódico y agua. C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante períodos de tiempo relativamente largos manteniéndose tales medios generalmente a temperaturas lo suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.

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2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGÚN SU COMPOSICIÓN A. MEDIOS NATURALES B. MEDIOS SEMISINTÉTICOS C. MEDIOS SINTÉTICOS D. MEDIOS COMPLEJOS 2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIÓN A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS B. MEDIOS YA PREPARADOS C. MEDIOS SÓLIDOS EN PLACA PETRI D. MEDIOS SÓLIDOS EN TUBO D.1. Con Agar Inclinado D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta E. MEDIOS LÍQUIDOS EN TUBO III.- MATERIALES Y REACTIVOS e. MATERIAL REQUERIDO - Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Espátula. Agua destilada. Placas petri .Tubos de ensayo f. MEDIOS DE CULTIVO - Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey Agar Sabourau. Agar LIA . Agar Manitol salado. VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 4.1. PREPARACIÓN - Para la preparación de medios de cultivo se usa agua destilada. - El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, según la cantidad que esta indicada en la etiqueta del medio de cultivo. - Agregar el medio de cultivo en el matraz, y añadir la mitad del volumen de agua que se requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensión homogénea, después incorporar el agua restante, aprovechando esta adición para desprender e incorporar al conjunto las partículas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. - Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolución. - Para reconocer que se ha alcanzado una disolución completa, al agitar no debe adherirse el medio a la pared interna del recipiente; la solución es viscosa y resbala libremente. - Tapar el matraz con el tapón de algodón, envolver con papel Kraft y pabilos. 4.2. ESTERILIZACION - Se esterilizará el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario. - El tiempo es de 15 minutos a 121ºC. 4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO - Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55ºC. - Previamente hay que remover el medio de cultivo haciéndolo oscilar en sentido circular su recipiente para garantizar la homogeneidad del medio. - Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en la posición deseada: o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado o Pico o inclinado o Fondo o El medio de cultivo se deja solidificar en la posición lograda.

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- Repartir: o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:  Agar nutritivo  Agar Mac Conkey o En Tubos: la posición de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)  Agar TSI (3)  Agar LIA (2) o En Tubos: la posición de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)  Agar Citrato de Simmons (2) o En tubos: la posición de Fondo (aproximadamente 3 ml)  Agar SIM (2) o En tubos: los siguientes medios líquidos (aproximadamente 3 ml)  Caldo MRVP (2)  Infusión Cerebro Corazon o BHI (2) 4.4. ALMACENAMIENTO - Los medios de cultivo deshidratados deberán conservarse en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura de 15ºC a 30ºC, y en envases bien cerrados. - Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un sólo tiempo limitado de conservación. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservación es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 – 8ºC. - Las placas petri, preparadas con el medio de cultivo, deberán preeintarse con cinta adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa. 4.5. COMPOSICION Y PREPARACIÓN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS UTILIZADOS AGAR NUTRITIVO a. Composición Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml b.Preparación ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ c. Descripción del Medio 3.1. Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ 3.2. Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ 3.3. Según su proporción en agua _________________________________________________________

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3.4. Según su uso o utilización _________________________________________________________ 3.5. Según la composición _________________________________________________________ 3.6. Según su presentación _________________________________________________________ AGAR MAC CONKEY 1. Composición Peptona de caseína 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g. Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g Agar – Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml. 2. Preparación ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Descripción del Medio 3.1. Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ 3.2. Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: _______________________ 3.3. Según su proporción en agua _________________________________________________________ 3.4. Según su uso o utilización _________________________________________________________ 3.5. Según la composición _________________________________________________________ 3.6. Según su presentación _________________________________________________________ AGAR TSI 1. Composición Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura,3.0 g. , peptona de sacarosa, Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa, Cloruro de sodio,5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar – Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g Agua destilada, 1000 ml 2. Preparación

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________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Descripción del Medio 3.1. Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ 3.2. Requerimiento no Energético Fuente de azufre: ________________________ Fuente de fósforo: _______________________ Iones metálicos: _________________________ Factores de crecimiento: ___________________ Factores de arranque: _____________________ Factores inhibidores: _____________________ 3.3. Según su proporción en agua _________________________________________________________ 3.4. Según su uso o utilización _________________________________________________________ 3.5. Según la composición _________________________________________________________ 3.6. Según su presentación _________________________________________________________ MEDIO EMB. 1. Composición Fosfato dipotásico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar – Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml 2. Preparación ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Descripción del Medio 3.1. Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ 3.2. Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento: ____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ 3.3. 3.4. Según Según su su proporción uso o en agua utilización ___________________________________________ ___________________________________________

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3.5. 3.6.

Según Según

la su

composición presentación.

_____________________________________________ _____________________________________________ CALDO MRVP 1. Composición Peptona de caseína Dextrosa Fosfato dipotásico Agua destilada 7.0 g 5.0 g 5.0 g 1000 ml

2. Preparación ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________ 3. Descripción del Medio 3.1. Requerimiento Energético Fuente de carbono: ________________________ Fuente de nitrógeno: _______________________ 3.2. Requerimiento no Energético Fuente de azufre: _________________________ Fuente de fósforo: ________________________ Iones metálicos: __________________________ Factores de crecimiento:____________________ Factores de arranque: ______________________ Factores inhibidores: ______________________ 3.3. Según su proporción en agua _________________________________ 3.4. Según su uso o utilización. __________________________________ 3.5. Según la composición. ________________________________________ 3.6. Según su presentación. ___________________________________________

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P ÁT A RCI 5 C SIEMBRA DE MICROORGANISMOS VI. OBJETIVOS 1) Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse. 2) Saber llevar a cabo los diferentes métodos de siembra e inoculaciones. 3) Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de asepsia y esterilidad. VII. MARCO TEORICO Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados. Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas: - Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca. - Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son contaminantes, haciéndose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros. 2.1. SIEMBRA Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de inoculación, puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades: a. Para hacer un aislamiento. b. Para hacer un transplante. AISLAMIENTO Permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formación de colonias separadas. Si se aíslan especies distintas, cada colonia tendrá características especiales, la morfología bacteriana será también distintiva. TRANSPLANTE Significa la separación previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede ser líquido o sólido. Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra conocer las propiedades culturales y bioquímicas y como resultado la identificación específica. Los trasplantes se pueden realizar: 1. De líquido a sólido. 2. De líquido a líquido. 3. De sólido a sólido. 4. De sólido a líquido.

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2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION Existen los siguientes materiales: ♠ ASAS DE SIEMBRA El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta y en el otro extremo insertado con un mango cilíndrico para un uso sencillo. Se utiliza para inoculación o siembra por estría en medios sólidos, presentan un arco bastante cerrado en su extremo cuyo diámetro es mas o menos específico es decir muchas asas son calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las más utilizadas son las de 0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

♠ HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA) Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, únicamente es un hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semisólidos y sólidos.

♠ ASAS DE DIGRASKY Son asas de vidrio en forma de triángulo más o menos abierto. Se utiliza para extender el inóculo líquido previamente adicionado en la placa, a través de una pipeta pasteur. Se esteriliza en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la llama hasta agotar el alcohol del asa.

♠ HISOPOS Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecación, deterioro o contaminación. Sirve para extender la muestra a

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través del hisopo en el medio de cultivo. Se suele comercializar ya estéril listo para utilizar y desechables. ♠ PIPETAS Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por esterilización o de plástico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen volúmenes específicos), en cuyo caso su aspiración se realizará con aspiradores para pipeta tipo pera o prepipeta. La pipeta pasteur no contiene volúmenes graduados son muy utilizados en bacteriología y cuya aspiración se realiza con chupetes de goma. También nos encontramos con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio de cultivo. 2.3. PREPAPACION DE INOCULOS Un inóculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos problema. Así pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentración adecuada de microorganismos problema. Si la muestra no es pura se aplicará distintos métodos para el aislamiento mediante técnicas específicas, como es el caso de la siembra por estrías en placa o por agotamiento, o la técnica de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento más o menos separado de los microorganismos. Es muy útil usar medios de cultivo enriquecidos específicos y diferenciales que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como puro. ♠ METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomará siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipeta pasteur estéril en cantidad suficiente y, en ambos casos se homogenizará 2.4. PREPARACIÓN DE INÓCULOS Si la muestra es sólida o semisólida se tomara siempre con asa de siembra estéril. Si la muestra es líquida se tomará con pipeta graduada o pipera pasteur estéril en cantidad suficiente, y en ambos casos se homogenizará posteriormente en el medio específico de cultivo. Si la muestra tomada con asa de siembra estéril se adiciona a un medio líquido se homogenizará y se dejará crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patógenos coincidirá con la temperatura corporal, dejándolos crecer aproximadamente 24 horas. En ocasiones excepcionales se hace necesario la utilización de un rotavapor para que el crecimiento se establezca por igual en todo el medio líquido, aunque esto va a depender de su aplicación posterior y de la cantidad de inóculo que se requiera. Si la muestra se toma con asa de siembra estéril y se adiciona en un medio de cultivo sólido, se utilizara diferentes técnicas de siembra y posteriormente se verificará el cultivo, ej. siembra por agotamiento. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido, se homogenizará la mezcla inicial por agitación y se dejará

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crecer a una temperatura de 37ºC por 24 horas. Es importante que los inóculos sean siempre jóvenes. Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y ésta se añade a un medio sólido, se extenderá con el asa de Digrasky, previamente estéril a través de toda la placa incubándose a un a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren también cultivos jóvenes. Los medios líquidos pueden ser agua destilada estéril, solución salina estéril o caldo de cultivo base. A veces es necesario partir de un inóculo con un número aproximados de microorganismos problema. En estos casos, los inóculos se establecen en medios líquidos y el número de microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparación de medios líquidos con diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una batería de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez según la concentración de sulfato bárico. Cada tubo corresponderá a una determinada concentración de microorganismos. 2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MÉTODOS DE AISLAMIENTO) El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea líquido o sólido se denomina siembra o inoculación. El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. La siembra del inóculo puede realizarse en medio sólido o en medio líquido. 2.5.1. SIEMBRA DEL INÓCULO EN EL MEDIO SÓLIDO Estas siembras pueden darse en placa o en tubo. 2.5.2. SIEMBRA DEL INÓCULO EN PLACA Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio sólido. Se va descargando gradualmente el inóculo, para que en los últimos planos del medio queden escasas células aisladas que en el ambiente nutritivo se irán multiplicando, logarítmicamente hasta formar colonias puras. Los métodos de aislamiento varían según el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inóculo. Cualquiera que sea el método ensayado, aprovechando el máximo de superficie del medio se logra el aislamiento de mayor numero de cepas microbianas. CLASES DE SIEMBRA - Siembra por agotamiento o por estrías. - Siembra por difusión. - Siembra por diseminación. a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inóculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí se realizará movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevos inóculos y no levantándose el asa hasta concluir la siembra en toda la placa.

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- ESTRIA MÚLTIPLE Se tomará la muestra problema con el asa de siembra previamente estéril y dicho inóculo se depositará en el extremo superior de la placa, extendiéndose de un extremo a otro de ésta solo en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos el proceso anterior que nos permitirá arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde quedó la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma dirección se repite la operación hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que vienen cavida aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la misma. El resultado son colonias cada vez más separadas como consecuencia de que cada vez que se va arrastrando y separando más la muestra. Es importante que para separar estas colonias se realice en cada estría un flameado previo del asa de siembra.

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos líneas perpendiculares que deberán cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomará con el asa de siembra estéril una cantidad de inóculo y se adicionará en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendiéndose por todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operación sin flamear el asa en todos los demás cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el microorganismo problema observándose en el ultimo cuadrante las colonias mas aisladas o separadas. - TECNICA DE LOS TRES GIROS Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) ésta técnica no es muy utilizada.

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b. SIEMBRA POR DIFUSION (TÉCNICA DE BARRY) En este método, el medio de cultivo se mezcla con el inóculo, al solidificar las colonias crecen en diferentes niveles, los cuales servirán para contaje de colonias. Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra en el tubo mediante el vibrador. Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa petri estéril y se dejará solidificar, la mezcla también se podría realizar en la misma placa petri, aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos. c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY). Consiste en adicionar el medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.

- TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION Se dispondrá de un batería de tubos con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionará una cantidad de muestra liquida o sólida

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en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inóculo que se añade en el tubo inicial. Se agitará hasta homogenizar. Con la pipeta estéril se tomará una cantidad exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución obtenida por ej. l0-4 y 10-5 inocular en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura óptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluye hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja solidificar.

2.6.

SIEMBRA DEL INÓ7CULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de ésta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos períodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURA Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posición

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central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos ej. medio de oxidación - fermentación de Hugh-Leiffson.

c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a cabo cuando el medio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA CELULARES El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la obtención de cultivos puros, que están constituidos por una única especie microbiana. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleve el uso de cultivos puros. La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución. El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales queden separadas una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una única célula original. Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo: 1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en placa inicial debería dar lugar al repetir la operación a colonias todas del mismo tipo, y cuya morfología concuerda con la del aislamiento inicial. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia deberían mostrar un único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción Gram, son útiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes. Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las precauciones

2.

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necesarias para prevenir la microorganismos no deseados.

contaminación

o

de

las

soluciones

con

VIII. MATERIALES Y EQUIPOS Material de Vidrio Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100) Placas petra Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml Erlenmeyer Equipos Estufa 37ºC Autoclave Otros materiales Gradillas Mechero Bunsen Asas de siembra Algodón Pinzas Reactivo y Medios de cultivo Medios de cultivo • Agar Mc Conkey • Agar nutritivo • Agar chocolate • Agar Saboraud • Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta) • Agar SIM (tubos fondo) • Caldo MRVP, SRI Reactivos Reactivo Covak’s Rojo de metilo

-

IX. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS 4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY Muestra: Inóculo de un cultivo puro Medio de cultivo: Agar nutritivo Propósito: Demostrar la susceptibilidad a los antimicrobianos.

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____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA Muestra: Orina Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ 4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES Muestra: Muestra fermentada Medio de cultivo: Agar Sabauraud Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________ ____________________________________________________________

P ÁT A RCI 6 C

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DEMANDA QUÍMICA DE OXIGENO (DQO) a.- Fundamento. Se define como el oxigeno químicamente equivalente al bicromato consumido en este proceso. Cada (Cr2O7)-2 consume 6 electrones para formar Cr3+, y cada O2 consume 4 electrones para formar agua, por consiguiente un mol de (Cr 2O7)-2 es equivalente a 1.5 mol de oxígeno en este cálculo ( Harris, 2007). Se define también, como la cantidad de oxigeno expresado en mg/l consumido por las sustancias oxidables en las condiciones de ensayo, contenidas en 1 litro de agua. Se usa un oxidante fuerte como el dicromato de potasio. Esta determinación no hace distinción entre sustancias biodegradables y no biodegradables, tal es el caso de la celulosa, que biológicamente se degrada con mucha lentitud, pero que oxidada con dicromato, se degrada rápidamente. Lo inverso también ocurre, pues algunos compuestos carbonados son degradados por bacterias, pero no son oxidados por el bicromato (caso de algunos alcoholes y ácidos), salvo que esté presente un catalizador, como los iones plata, por lo cual es recomendable adicionar AgSO 4. Asimismo el dicromato no es capaz de oxidar a los hidrocarburos aromáticos, y la piridina. (Romero, 1999) El método se basa en la oxidación de la materia orgánica contenida, por el dicromato de potasio, agregado en exceso. CnHaOb + cCr2O7-2 + 8cH ------- vCO2 + (a/2 + 4c)H2O + 2cCr+3 Donde: c = (2n/3) + (a/6) – (b/3) Posteriormente se valora el exceso no consumido de dicromato usando ioduro de potasio, que libera yodo. Cr2O7K2 + 6IK + 4 H2SO4 ------- K2SO4 + (SO4)Cr2 + 7H2O + 3I2 Luego el iodo es valorado por el tiosulfato de sodio, 0.025 N 2S2O3Na2 + I2 ---- 2INa + S4O6Na2 b.- Reactivos. Solución de sulfato de plata. Se toman 6.6 gr. de AgSO4 se colocan en un matraz de 1000 ml, con 250ml de agua bidestilada, y con precaución se agregan 50 ml de SO4H2 (d= 1.84), para disolver el reactivo. Una vez frío se lleva a volumen con agua bidestilada. Solución de bicromato de potasio. 2.5 g de Cr2O7K2 en 500 ml de acido ortofosforico al 85%, es conveniente triturar el bicromato en mortero, macerándolo en unas gotas de acido ortofosfórico para facilitar la disolución se agregan 500 ml de H2SO4 (d=1.84), se agita con varilla de vidrio, y se filtra en lana de vidrio. Solución de yoduro de potasio. 55 gramos de IK en 200 ml de agua bidestilada. Solución 0.025 N de tiosulfato de sodio. Solución de almidón. Solución de glucosa al 1%. La glucosa debe ser preparada en el momento de uso. c.- Procedimiento. En un balón de 500 ml de cuello esmerilado, se colocan 5 ml de la muestra que se diluye con poca agua y se agrega 1 ml de solución de sulfato de plata, que eliminará la interferencia de eventuales cloruros presentes, actuando también de catalizador en el proceso de oxidación. Se le agregan 20 ml de la solución oxidante de bicromato. Se conecta al balón un refrigerante, se calienta a reflujo durante 25 min exactamente controlados desde el momento en que comienza la ebullición. Se deja enfriar y se enjuaga el refrigerante, dejando caer unos 50 ml de agua, desconectar el refrigerante

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y agregar unos 100 ml de agua al balón, se enfría nuevamente y se agregan 10 ml de la solución de ioduro de potasio. Paralelamente se conduce un ensayo en blanco donde la muestra ha sido sustituida por agua bidestilada El exceso de bicromato no consumido en la oxidación habrá reaccionado con el ioduro y liberado el equivalente en yodo, que será titulado por el tiosulfato (Romero, 1999). Cálculo. DQO (mg/l) de O2 =F.N.(A-B)8000/D Donde: F = factor de corrección. N = Normalidad de la solución de tiosulfato. A = ml de tiosulfato de sodio gastados en la titulación del blanco. B = ml de tiosulfato de sodio gastados en la titulación de la muestra. D = ml de la solución problema. d.- cuestionario. 1.- Explique, cual es el objeto de hacer hervir la muestra. 2.- Explique para que se usa el tubo vertical sobre el balón. 3.-Que utilidad práctica, tiene el uso de la DQO. 4.- Que ventajas y desventajas tiene el uso de la DBO como indicador de la contaminación de aguas residuales. 5.- Que ventajas y desventajas tiene el uso de la DQO como indicador de la contaminación de aguas residuales.

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P ÁT A RCI 7 C

CONTEO DE CÉLULAS MICROBIANAS I. OBJETIVO 1) Determinar el recuento directo de células microbianas con la cámara de contaje celular. FUNDAMENTO TEÓRICO Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos de contaje celular como el “Cell Coulter”. Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. la cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensión a medir. El dispositivo presente unas señales que determina un volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el numero de partículas presentes en ese volumen se pueden determinar la densidad de partículas en la suspensión de origen. La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milimetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

II.

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Si contamos las cuatro áreas sombreada (L) observando un total de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será : Concentración en la suspensión (células / mL) == 10000 (x/4) En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rápida de estimar la cantidad de células microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones: 1) No se distinguen las células muertas de las células vivas. 2) Las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas células. 3) La precisión es difícil de lograr

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4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teñido la muestra. 5) El método no es adecuado para suspensiones de células de baja densidad. En el asa de bacterias, en una suspensión de células con menos de 106 células por mililitro, se podran ver pocas o ninguna bacteria.

III. MATERIALES Y REACTIVOS - Cultivo de E. coli - Cultivo de levadura - Matraz - Pipetas - Cámara del Neubauer -Pipeta Pasteur - Estufa - Microscopio IV. METODOLOGÍA CARGANDO LA CÁMARA Agita la suspensión celular con el vórtex. Aspira una pequeña cantidad de suspensión con una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequeña en la superficie pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del cubre. La suspensión entrará en la cámara por capilaridad. Una cámara adecuadamente llenada contiene células solo en el espacio contenido entre el cubre y la cámara de recuento. No debería sobrar fluido que cayera en los surcos. CUESTIONARIO 1.- Investigue las características de: Cámara de cuenta de Petroff – Hausser, equipos automáticos de Contaje celular, Otros métodos de recuento celular 2.- Indique como diferencia las células viables de células totales. 3.- Describa los métodos directos e indirectos de contaje celular.

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P ÁT A º RCI N 8 C
CURVA DE CRECIMIENTO I. INTRODUCCIÓN Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetría mide la entidad de luz transmitida por la suspensión, mientras que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometría. Por estos procedimientos se puede estimar el número de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células en el cultivo. El espectrofotómetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz monocromática por medio de un filtro que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensión bacteriana es medida por una célula fotoeléctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la multiplicación bacteriana no se expresa como disminución de la luz transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta última es directamente proporcional al número de bacterias presentes en la suspensión. La relación entre la transmitancia y la absorbancia se expresa matemáticamente de la siguiente manera: Absorbancia = 2 - log % de transmitancia Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelómetro. Para el manejo práctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy útil el uso de matraces con brazo lateral, ya que permite la realización de medidas sin necesidad de tomar muestras del cultivo, evitando así el riesgo de contaminación por la manipulación. II. OBJETIVOS 1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano. 2) Realizar una curva de multiplicación bacteriana.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la célula aumentan en cantidad, en la mayoría de organismos el crecimiento continua hasta que la célula se divide en dos nuevas células, proceso denominado fisión binaria. Cada una de las células hijas recibe, un cromosoma completo, copias de todas las macromoléculas, monómeros e iones inorgánicos. El intervalo para la formación de dos células a partir de una se llama generación y el tiempo requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, el que yana entre los microorganismos, algunos crecen rápidamente y se dividen en solo 20 a 30

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minutos, otros requieren de una a tres horas, otros de varias horas o incluso días. 3.1.CURVA DE CRECIMIENTO Si se inocula un medio liquido con células microbianas, procedentes de un cultivo que ha crecido a saturación, en el que se ha determinado el número de células variables por minuto periódicamente y trazamos una gráfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes: 1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptación, los microorganismos se encuentran desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie. 2. Fase Exponencial.- Llamada fase logarítmica, es consecuencia de la división celular y las nuevas células crecen en progresión geométrica, se sintetiza nuevo material celular a velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial. 3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metabólicos tóxicos. Aquí cesa el crecimiento de una población. 4. Fase de Declinación.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta alcanzar un nivel sostenido.

Fases de Crecimiento
Latencia
Rezago Adaptación

Exponencial
Logaritmo Divisón celular Crecimiento

Estacionaria
Nutrientes se agotan Acumulan metabolitos tóxicos Sesa crecimiento

Muerte
Declinación

9,0 Log 10 organismos viables/ml

1

8,0

Viables

Turbidez (densidad óptica)

0,75 0,5

Densidad óptica

7,0

6,0

0,25

5,0 Tiempo

0,1

IV. PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES Y REACTIVOS - Cubres - Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo - Cubetas - Solución salina estéril

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-

-

Pipetas Pasteur Pipetas estériles Caldo nutritivo estéril Placas estériles Contómetro

Equipo - Mechero Bunsen - Estufa de incubación a 37ºC - Microscopio - Espectrofotómetro V. METODOLOGIA
5.1.

CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO

Curva de Crecimiento.- Las células que están creciendo en un cultivo discontinuo (en un matraz en agitación) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las células en fase de latencia, que proceden de una alícuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida. Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rápido. La duración de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inóculo, de la temperatura, de la concentración en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la aireación, y de la concentración de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo. Una vez que las células empiezan a crecer rápidamente, se dice que han entrado en la fase de crecimiento logarítmica (log) o exponencial. En este estadio las células crecen rápidamente, y a diferencia de las células de las fases de latencia y estacionaria, la mayoría de las células se hallan en el mismo estado fisiológico. La velocidad de crecimiento durante la fase log depende del nivel de nutrientes y de la aireación de cultivo. La constante de velocidad de crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicación o tiempo de generación). Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las células no están todas en el mismo estado fisiológico; algunas todavía se están dividiendo mientras que otras ya han comenzado a morirse. Pero la población total se mantiene constante. Conforme se agota la mayor parte de los nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número de células que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.

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Realización (Fig. 1) (Todas las maniobras que se describen a continuación se deben realizar en condiciones de esterilidad en las proximidades del mechero.) 1.Añadir solución salina estéril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3 mi) y resuspender las bacterias en la solución salina por agitación. 2. Tomar 0.5 ml de la suspensión bacteriana con una pipeta estéril y añadirlos a un matraz con 50 mi de CN estéril. 3. Incubar el matraz en un baño termostatado a 37 ºC, con agitación (200 rpm). 4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540 nm). Ajustar el espectrofotómetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo CN estéril antes de cada medida. 5.Recoger alícuotas de 4 ml del cultivo a los tiempos de 0-2-4-6-8-1012-14-16-18-20-22-24 hrs de incubación y colocadas en refrigeración hasta su lectura 6. Dibujar una curva de multiplicación con los datos obtenidos, colocando en el eje de abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.

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Cuestionario: 1. ¿Por qué se calibra el espectrofotometro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estéril? 2. ¿Por qué motivo puede ser de alguna forma útil conocer la curva de multiplicación de una bacteria? 3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.

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P AT A RCI 9 C

AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MÉTODO DE DILUCIÓN EN PLACA OBJETIVOS Aprender la técnica de dilución para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inóculo. INTRODUCCIÓN Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formación de colonias, la técnica por vaciado en placa es la mas utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estériles, se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45°C y se mezcla con la muestra. Después de la incubación se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la dilución que corresponda permite estimar el número de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoquímicas y tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referirá a determinado grupo de microorganismos. Esta técnica permite la mayoría de las veces cuantificar la contaminación en alimentos, medicamentos. MATERIAL REACTIVOS Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tinción de Gram, Cajas petri, Pipetas de 1 y 10 ml, Cilindro para esterilizar pipetas, Parrilla, Agitadores magnéticos, 1 probeta de 100 ml, Vaso de precipitados 1000 ml, Matraz erlenmeyer de 2000 ml, Balanza analítica, Microscopio de luz, Portaobjetos, Cubreobjetos, Gasa, Algodón, Papel de estraza, Cuenta colonias. Material que deben traer los alumnos: muestras (agua residual, bebidas refrescantes, yogurt), franela, masking-tape, algodón, gasa, alcohol. METODOLOGÍA 1.- Preparación de reactivos y medio de cultivo: a) Solución isotónica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada b) Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo. 2.- Envolver cajas de petri y pipetas. 3.- Colocar en un tubo de rosca 9 ml y en el resto 9.9 ml de solución isotónica. 4.- Esterilizar el material, los tubos con solución salina y el medio de cultivo en el autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos. 5.- Hacer frotis y tinción de Gram a la muestra a cultivar. 6.- Bajo condiciones estériles hacer las diluciones en la solución isotónica estéril, de acuerdo a la figura 1. 7.- Tomar 0.1 ml de la dilución 10-3 y colocar en dos cajas de petri bajo condiciones estériles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes 8.- Se realizará el conteo en placa por superficie. 9- Incubar las cajas en forma invertida a 30°C, de 24 a 48 horas. 10.- Considerar las siguientes reglas para la realización del reporte de la práctica: Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo.

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Contar todas las colonias de la placa. Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas se multiplica por 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes y el número de colonias contadas se multiplica por 4. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el número de cuadros que ocupa la caja. El número de colonias contadas deberá ser multiplicada por el inverso de la dilución y considerar si la técnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra). Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dígitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49 Fig. 1

RESULTADOS Reportar el número de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir. Presentar descripción de morfología de colonias y microscópica. CUESTIONARIO 1. Indique la importancia de utilizar el método de dilución para el aislamiento de microorganismos. 2. Comparar el método de dilución con el de estría para el aislamiento de microorganismos. 3. Porque el número de microorganismos es el resultado de multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución.

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4. De los datos obtenidos en la práctica cuales cree que sean congruentes y cuales no y porque

P ÁT A 0 RCI 1 C AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM V. OBJETIVO Obtener nódulos de Rhizobium de raíces de alfalfa. Observación microscópica de bacterias de Rhizobium

VI. FUNDAMENTO TEÓRICO La producción agrícola basada en leguminosas es fundamental para la alimentación humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interacción natural de estas plantas con una bacteria del suelo a nivel de la raíz, es ecológicamente importante, como medida para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el ambiente. La fijación biológica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta a través de los pelos radicales para que en la matriz de las células corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El nódulo en el sistema radical de la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al ribosoma vegetal para la síntesis de proteínas vegetales; simultáneamente por la fotosíntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirán como fuente de carbono y energía para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo activo en el nódulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta. Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicación de fertilizantes químicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de producción y la contaminación de mantos acuíferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable. GRUPOS DE INOCULACIÓN CRUZADA Y ASOCIACIONES DE Rhizobium – LEGUMINOSA Especies de Grupo de Inoculación cruzada Rhizobium Género hospedero Leguminosa incluida

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Grupo de alfalfa

R. meliloti

Medicago Melilotus Trigonella Trifolium

Alfalfa Trebol dulce Alholva Trébol

Grupo del trébol

R. leguminosarum biovar trifolii

VII. MATERIALES Y REACTIVOS Material Biológico - Raíces de alfalfa con nódulos Matraces - Placa Petri - Pinzas bisturí - Mecheros - Vasos PP 100 ml Reactivos - Agua destilada estéril - Hipoclorito de sodio 2.5% - Bicloruro de Mercurio 0.2% - Medio PSA (papa sacarsa agar) VIII.METODOLOGÍA 1. Preparación del Medio PSA Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas estén cocidas. Filtrar la solución de cocción y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2 g agar – agar autoclave 120ºC 15? Y proceder a plaquear 2. Observación Microscopia de Bacterias de Rhizobium - Obtener los nódulos de Rhizobium de las raíces de alfalfa. - Caracterizar los nódulos según posición en las raíces, color, forma, tamaño. - Lavar con agua destilada los nódulos y realizar disección del nódulo sobre un porta objeto y dejar caer el líquido interno para realizar un frotis. - Fijar el frotis de Rhizobium. - Realizar coloración Gram - Observación en el microscopio a 100X 3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA Esterilización de nódulos - Disponer los nódulos en un matraz de 100 ml - Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar. - Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 – 8 minutos, decantar - Lavar con agua destilada estéril 3 veces - Realizar la disección del nódulo con la ayuda de pinzas y bisturí sobre papel estéril. - Dejar caer el líquido interno del nódulo seccionado apretando con la pinza o pasar sobre la superficie del medio. - Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 – 27ºC en estufa, 5 días. CUESTIONARIO

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Qué otros medios se utilizarían para el cultivo de Rhizobium. Cuál es la ruta metabólica que utiliza el Rhizobium. Cuál sería la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.

Abono de poliuretano
(NC&T) Geoff Robson y su equipo de la Facultad de Ciencias Biológicas han descubierto que ciertos hongos pueden degradar el plástico en la tierra. Además, la velocidad de la degradación aumenta cuando lo hace el volumen de estos hongos o se agregan nutrientes a la tierra para estimular la actividad de los mismos. Ahora están efectuando estudios para asegurarse de que la degradación de los poliuretanos no afecte adversamente al proceso de compostaje o a sus productos.

Éste es un hallazgo importante. Los poliuretanos se usan para fabricar muchos productos y ocupan un gran volumen en los terrenos usados como basureros, quedándose estos rápidamente sin espacio. Debido a ello, los poliuretanos resultan un gran contaminante medioambiental.

Este estudio abre la posibilidad de que los hongos puedan utilizarse para degradar estos materiales en lugar de arrojarlos a los vertederos. Recomienda esta página Ahora el equipo está investigando cuál sería el mejor modo de aplicar sus hallazgos al manejo de la basura de poliuretano. Un posible método sería rociarlo con los hongos. El objetivo final es obtener compost a un costo razonable empleando el poliuretano, junto con otros materiales, y usando los medios ya existentes.

Nuevo modo de generar electricidad
(NC&T) De un modo parecido a como las olas arrastran pequeños objetos flotantes en el mar hasta depositarlos en la playa, una ola térmica (un pulso móvil de calor) viajando a lo largo de un cable microscópico puede impulsar a los electrones a través de éste, creando así una corriente eléctrica. El ingrediente principal en esta singular receta son los nanotubos de carbono. Estos tubos, de sólo unos nanómetros de diámetro, forman parte de una familia de nuevas moléculas de carbono, que incluye a las buckybolas y a las láminas de grafeno, con muchas y asombrosas aplicaciones potenciales.

El equipo de Michael Strano y Wonjoon Choi del MIT, ha logrado que su sistema suministre una cantidad de energía que, en proporción a su peso, es aproximadamente 100 veces mayor que la de una pila de ión-litio de peso equivalente. La cantidad de energía liberada es mucho mayor que la predicha por los cálculos termoeléctricos. Si bien muchos materiales semiconductores pueden producir un potencial eléctrico cuando se calientan, ese efecto es muy débil en el carbono. Hay por tanto algo más actuando tras ese singular fenómeno.

Guía de Prácticas: Microbiología Industrial - Una posible aplicación práctica del fenómeno sería permitir la creación de nuevos tipos de aparatos electrónicos extremadamente pequeños (por ejemplo, del tamaño de un grano de arroz), entre los que podrían figurar dispositivos para tratamiento médico inyectables en el cuerpo, sensores fijos, e incluso sensores móviles esparcibles como el polvo en el aire.

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Aunque los nanocables son diminutos, se podría agruparlos en conjuntos numerosos para así posibilitar el suministro de cantidades significativas de energía para aparatos más grandes.

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