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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

“ZARAGOZA”

MICROBIOLOGIA GENERAL I

SEMINARIO DE AISLAMIENTO Y
CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS
AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN
DE MICROORGANISMOS
AISLAMIENTO
Consiste en separar los microorganismos de interés de
una comunidad microbiana ,el aislamiento es
importante por que se obtienen cultivos para estudios
detallados y controlados de laboratorio y para su
aplicación en biotecnología y en microbiología
ambiental e industrial.
¿COMO SE LOGRA?

El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivo


para el organismo que se desea aislar, e inhibir el
crecimiento de otros microorganismos no deseados
pero sin afectar a la especie o grupo que se desea aislar.
MEDIO DE CULTIVO CLASIFICACION EJEMPLO DE M.O AISLADOS

EMB SELECTIVO Y Escherichia coli


DIFERENCIAL Klebsiella pneumoniae
Enterococcus faecalis
SAL Y MANITOL SELECTIVO Y Staphylococcus auerus
DIFEENCIAL Escheriachea coli
Klebsiella pneumoniae
S-110 SELECTIVO Staphylococcus aureus
MAC CONKEY SELECTIVO Y Shigella flexneri
DIFERENCIAL Proteus mirabilis
E. Coli
CHAPMAN SELECTIVO S . aureus
¿CÓMO LOGRO UN AISLAMIENTO?

Separando los microorganismos físicamente mediante


diluciones o por agotamiento (estría).

Utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir los


m.o no deseados.
CUANTIFICACION

Es un método muy utilizado en diferentes áreas como


por ejemplo:
Industria alimenticia (leches, jugos, néctares)
Hospitalaria (procesos patológicos infecciosos)
MÉTODOS DE CUANTIFICACION

Existen métodos que permiten establecer el número


de microorganismos o en una muestra dada.
Hay métodos que cuantifican el numero de células, y
existen otros que cuantifican la masa total de la
población.
RECUENTO EN PLACA POR FILTRO
DE MEMBRANA
Fundamento

 Paso de la muestra a
través de una membrana
porosa que retiene los
microorganismos y que
posteriormente se coloca
sobre una placa.
RECUENTO EN PLACA POR FILTRO
DE MEMBRANA

Ventajas Desventajas
Mide el no. De células Requiere bastante tiempo
viables (24 horas o más)
Las bacterias crecen en
unidad, en cadenas o como
grumos
RECUENTO EN PLACA
Fundamento:
 Se basa en la suposición de que cada bacteria o
agrupación de colonia crece y se divide para formar
una sola colonia.

 Dispersión de la muestra
 Formación de colonias
¿COMO SE CUENTAN LAS COLONIAS POR
VACADO EN PLACA?

 El método más usual para realizar el conteo de células


viables se basa en contar el número de células de una
muestra que es capaz de formar colonias al sembrarlo
en un medio adecuado.

 Método de extensión en placa.


 Método de vertido en placa (o diluciones).
RECUENTO EN PLACA

Ventajas Desventajas
Mide el no. De células Requiere bastante tiempo
viables (24 horas o más)
Microorganismos sensibles Las bacterias crecen unidad,
al calor pueden resultar en cadenas o como grumos.
dañados por el agar fundido
SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA
Ventajas Desventajas
Mide el no. De células Requiere bastante tiempo
viables (24 horas o más)
Microorganismos sensibles Las bacterias crecen unidad,
al calor pueden resultar en cadenas o como grumos.
dañados por el agar fundido
En medios diferenciales las
colonias que se forman
debajo de la superficie no
son adecuadas (solo las de la
superficie)
FACTORES QUE AFECTAN EL
VACIADO EN PLACA
• Tipo de muestra y microorganismos presentes en ella.

• Procesamiento de la muestra.

• Temperatura del medio de cultivo.

• Tipo de diluyentes.

• Es importante que haya un número determinado de


colonias en la placa (30-300).
RECUENTO EN PLACA POR
EXTENSION SUPERFICIAL
FUNDAMENTO
 Se basa en la extensión de la muestra, agregada con un asa
calibrada sobre una placa seca.
RECUENTO EN PLACA POR
EXTENSION SUPERFICIAL

Ventajas Desventajas
rápido Poco exacta
No diluciones Carencia de uniformidad en
la extensión
Muy poca muestra tiempo
Evita el contacto de las
células con el agar fundido
DILUCIONES SERIADAS
FUNDAMENTO:
VENTAJAS
 Es fácil.
DESVENTAJAS
 Afecta el no hacer bien las
diluciones.
 No homogenizar bien la
muestra.
 No contar correctamente.
 Cuenta los viables mesofilos.
 No cuenta anaerobios.
 Cuantifica muestras solidas y
trabajar mas.
 No cuantifica bacterias
exigentes nutricionalmente.
FUNDAMENTO:
VENTAJAS DESVENTAJAS
 Su rapidez.  El tiempo.
 No ocupas material
de laboratorio.
 Se utiliza poca
muestra.
 No hay restricción
de unidades
formadoras de
colonias.
MILES-MISRA
FUNDAMENTO:

Nùm. De bacterias (mL) = NxF


V
DESVENTAJAS
 No es fácil.
 Hay restricción.
 El tiempo.
RECUENTO ELECTRONICO
 CONTADORES ELECTRONICOS
Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a
pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño
conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un
microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la
resistencia de éste se incrementa debido a que la
conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos
cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o
voltaje y contados
RECUENTO ELECTRONICO
 Es posible contar y medir varios miles de partículas por
segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.
 Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en
la resistencia que son comparables al "ruido" generado
por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido
por el orificio.
RECUENTO MICROSCOPICO
 RECUENTO EN CAMARA DE PETROFF-HAUSER Un
volumen conocido de muestra es depositado en un
portaobjetos especial para cuenta, esta consiste de un
portaobjetos excavado y cuadriculados que facilitan el
recuento por unidad de superficie y de volumen.
RECUENTO MICROSCOPICO
 Este tipo de recuento se utiliza para determinar la
cantidad total de microorganismos de una muestra.
Es un método que resulta ser bastante exacto debido a
que tiene una dimensión que facilita el conteo de los
microorganismos por cuadrante.
CUANTIFICACION
Tipo de Area Volume Factor
cuadro [cm2] n [1/Volume
[ml] n

Cuadrado 1.00 x 10-2


2.00 x 10-5 5.00 x 104
total
Cuadrado 4.00 x 10-4
8.00 x 10-7 1.25 x 106
grande
Cuadrado 2.50 x 10-5
5.00 x 10-8 2.00 x 107
pequeño
CAMARA PETROFF HAUSER
 Ventajas:
 Es un método que se realiza fácilmente.
 Su procedimiento es rápido.
 Si se realiza adecuadamente es muy exacto.
 Desventajas:
 No es posible diferenciar microorganismos vivos de
microorganismos muertos
CUANTIFICACION
 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar
la cámara de recuento.
 Número de cuadrados contados: Cantidad de
cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar
un el número de bacterias.
 Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado
de la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde
se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado
pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50
µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml)
MÉTODO DE BREED
FUNDAMENTO:
 Es un método directo para cuantificar células totales en el cual
un volumen conocido de la muestra diluida se extiende
uniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal.
 Observando al microscopio el campo de observación contando
los microorganismos en diversos campos microscópicos.
 Se obtiene el valor medio de células por campo que se logra
multiplicando el número de campos microscópicos
comprendidos en la preparación.
 Ello da el número de microorganismos existentes en el volumen
conocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total de
microorganismos /ml o g de muestra original.
VENTAJAS

 Es un método rápido
 Es un método económico
DESVENTAJAS
 Es imposible diferenciar a las células vivas de las
muertas.
 Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones
pequeñas, el margen de error es grande.
 El método no suele ser adecuado para suspensiones
con baja densidad celular.
 Las pequeñas células son difíciles de ver.
APLICACIÓN
 Utilizada para contar bacterias de la leche.
 Es usado para diagnóstico de mastitis bovina
(diagnóstico subclínico).
MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
(NMP)
FUNDAMENTO:
 Es un método estadístico que se fundamenta en la
teoría de la probabilidad.
 En él se preparan múltiples series de diluciones
decrecientes, con cada dilución se inoculan varios
tubos que contienen el medio de cultivo adecuado.
APLICACIONES
 Este método se utiliza para contar microorganismos
difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar
el número de células que pueden crecer en un medio
líquido determinado, como el análisis para determinar
la contaminación del agua potable.
NEFELOMETRÍA
(TURBIDEZ)
FUNDAMENTO.
En una suspensión microbiana, la cantidad de m.o está
directamente relacionada con la turbiedad o densidad
óptica de la misma, e inversamente relacionada con la
cantidad de luz que pasa por la misma. A mayor
turbidez mayor número de bacterias.
ESCALA MCFARLAND
Es una curva estándar construida con una suspensión
testigo de concentración celular conocida. Se basa en
la mezcla de concentraciones crecientes de BaCl2 con
concentraciones decrecientes de ácido sulfúrico
obteniéndose un precipitado de Sulfato de bario en
cantidades diferentes.
VENTAJAS
Rápido

Poca muestra

Sensible
DESVENTAJAS

No debe tener materia orgánica en


suspensión.
No debe tener color.
Es total.
La curva no esta hecha a base de bacterias si
no de sales.
Bibliografía

Vullo. Microbiología en la práctica. Editorial atlante. Buenos Aires Argentina.


2000. pág 61-73

Dauget. Técnicas en bacteriología. Editorial Jims. Barcelona España. 1977. pág.


82-86.

Alejandro Camacho; Ruth Alvarez. Manual de microbiología