UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN ALIMENTOS

CARRERA DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

PROFESOR: Dr. Ramiro Velasteguí PhD

AYUDANTE: Egdo. Lenin Sarabia

NOMBRE: Isaác Molina

SEMESTRE: Séptimo “BQ”

PRÁCTICA: 2 FECHA: 15-09-10

TEMA: “AISLAMIENTO Y CULTIVO IN VITRO DE Rhizobium spp”

INTRODUCCIÓN

Algunos microorganismos del suelo pueden utilizar el nitrógeno de la atmósfera

para producir compuestos nitrogenados que quedan disponibles para las
plantas, proceso que se denomina Fijación Biológica del Nitrógeno (este
proceso natural es extraordinariamente importante). De todos esos
microorganismos, los más importantes son los rizobios, bacterias capaces de
vivir dentro de formaciones especializadas de la raíz de la mayoría de las
leguminosas, llamadas nódulos.

Entre las leguminosas y los rizobios se establece una simbiosis o sea una
relación de beneficio mutuo: las bacterias utilizan el nitrógeno del aire y lo
convierten en compuestos nitrogenados asimilables por las plantas y éstas, a
su vez, le suministran a las bacterias carbohidratos originados en la
fotosíntesis, como fuente de energía. Esto significa que la Fijación Biológica del
Nitrógeno consume energía solar que es infinita y no se paga.

OBJETIVOS

General:

 Inocular Rhizobium spp a partir de nódulos de raíces de distintas

leguminosas como fréjol y alfalfa.

Específicos:

 Observar la presencia de colonias aisladas de Rhizobium spp en placas

de Petri con medio ALM.

 Determinar ciertas características de las especies de Rhizobium

obtenidas del fréjol y de la alfalfa, empleando la tinción de Gram.

MATERIALES

 Leguminosas (fréjol y alfalfa)

 Papel filtro
 Etanol 95%
 Solución de cloruro mercúrico al 0.1%
 Solución salina estéril (NaCl: 8.5 g, H2O: 1 litro)
 Agar ALM (Agar Levadura Manitol)
 Incubadora
 Pinzas estériles
 Placas de Petri
 Varillas de vidrio
 Tubos de ensayo bacteriológicos
  Autoclave
 Erlenmeyer de 100 ml
 Micropipeta
 Puntas para micropipeta

Agar Levadura Manitol

 K2HPO4 0.5 g
 MgSO4•7H2O 0.2 g
 NaCl 0.1 g
 Manitol 10 g
 Extracto de Levadura 1g
 Agua destilada 1000 ml
 Agar 10 – 15 g

PROCEDIMIENTO

Aislamiento de cepas de Rhizobium

El método más efectivo para obtener diferentes cepas para colección es aislar
los rizobios de las leguminosas nativas.

1. Se lavaron los nódulos bajo la canilla para eliminar la mayor parte del
suelo, luego se secaron entre dos trozos de papel filtro.
2. Se colocaron los nódulos brevemente (5 – 10 seg) en etanol al 95%.
Se transfirieron a una solución de cloruro mercúrico al 0.1% y se
dejaron de 30 seg a 4 min (se recomienda dejar diferentes muestras
de la misma especie por diferentes períodos de tiempo).
3. Se pasaron los nódulos, usando unas pinzas esterilizadas con
alcohol y expuestas rápidamente a la llama, a un recipiente
conteniendo agua destilada estéril. Éste fue el primer lavado.
Rápidamente se repitió la operación 5 veces. Luego, se lavó otras 3
 veces dejando los nódulos por lo menos 15 minutos en cada cambio
de agua.
4. Se transfirió cada nódulo a un tubo de hemólisis de vidrio con 0.5 ml
de solución salina estéril (NaCl: 8.5 g, H2O: 1 litro). Cada nódulo se
maceró usando una varilla de vidrio previamente sumergida en
alcohol y expuesta rápidamente a la llama.
5. Se colocó 0.1 ml de cada suspensión en ALM en placa de Petri. Se
distribuyó la suspensión sobre la placa de Petri usando el método de
estriado.
6. Se incubaron las placas a 28 ºC y se observó la aparición de colonias
típicas de Rhizobium a lo largo de las estrías. Cuando aparecieron
las colonias, se repicaron en una nueva placa de Petri (medio ALM)
por agotamiento en superficie.
7. Los cultivos de Rhizobium obtenidos con éstas condiciones se
conservaron entonces en tubos con medio ALM inclinado.

RESULTADOS

 Presentar gráficos de las observaciones macro y microscópicas de

Rhizobium obtenidas en la práctica.

Gráfico 1. Observación macroscópica de fréjol

Fuente: Lab. de Bioprocesos

Gráfico 2. Observación microscópica de fréjol (1000x)

Fuente: Lab. de Bioprocesos

Gráfico 3. Observación macroscópica de alfalfa

Fuente: Lab. de Bioprocesos

Gráfico 4. Observación microscópica de alfalfa (1000x)

 Fuente: Lab. de Bioprocesos
DISCUSIÓN

Los nódulos obtenidos de las leguminosas fréjol y alfalfa sirvieron para la

inoculación de Rhizobium en placas de Petri con ALM. En las placas se realizó
estrías simples para obtener colonias aisladas de las dos especies de rizobios
(Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli del fréjol y Rhizobium meliloti de la
alfalfa). Después de una semana, se revisaron las placas y se observó el
crecimiento de colonias típicas de Rhizobium, siendo la placa en la que se
colocó la suspensión de nódulos de alfalfa la que presentó mayor número de
colonias aisladas. Mediante la tinción de Gram y con la ayuda del microscopio
compuesto se vio que la mayor cantidad de bacilos estaban presentes en las
placas inoculadas con la suspensión de nódulos de la alfalfa. Sin embargo las
bacterias Rhizobium obtenidas a partir del fréjol presentaron mayor tamaño que
las bacterias de Rhizobium procedentes de la alfalfa. La manera en cómo se
realizó el frotis pudo haber influido en la cantidad de colonias típicas de
Rhizobium observadas.

Al existir contaminación en las placas de Petri se realizaron repiques de las

mismas. Los resultados obtenidos concuerdan con los datos bibliográficos, esto
es que Rhizobium son bacilos Gram positivos, de tamaño pequeño y que
poseen flagelos.

 ¿Hay similitud en el desarrollo de Rhizobium de las diferentes

leguminosas? Si o no, explique.

Si existen similitudes en el desarrollo de Rhizobium de las leguminosas

fréjol y alfalfa. Por ejemplo las bacterias después de entrar en la tinción
de Gram retuvieron el colorante de contraste (safranina), por lo que se
vieron de color rojo, es decir son bacterias Gram negativas. Además
ambas especies de Rhizobium fueron bacilos, con forma de varillas.

Sin embargo también se observaron diferencias en el desarrollo de

Rhizobium de ambas leguminosas. Las placas de Petri aisladas con de
 los nódulos de alfalfa presentaron mayor cantidad de colonias típicas de
Rhizobium.

CUESTIONARIO

1. Indique las condiciones óptimas de desarrollo de Rhizobium in

vitro e in vivo.

Rhizobium se desarrollará al máximo, si en las condiciones in vitro

se emplean medios de cultivo que contengan una fuente de carbono
como manitol o glucosa, amonio o nitrato y otras sales inorgánicas
(por ejemplo el medio de cultivo ALM), una temperatura de
incubación entre 18 a 28º C, un pH entre 5.5 -7.0 y una humedad
(entre el que debe ser en un 30 %.

Para el desarrollo de Rhizobium in vivo, la acidez, la presencia de

metales pesados, bajas concentraciones de fósforo asimilable, el
exceso de sal, la falta de agua o los altos niveles de metales pesados
o nitrógeno combinado son los principales factores naturales del
suelo a considerar. A estos hay que añadir los derivados de las
prácticas agronómicas dirigidas a la eliminación de enfermedades,
plagas o malas hierbas que utilizan agroquímicos, la mayor parte
tóxicos para la microbiota del suelo.

2. Explique el mecanismo de fijación de nitrógeno atmosférico por

parte de Rhizobium.

Las bacterias del género Rhizobium no pueden independientemente

fijar nitrógeno atmosférico: requieren una planta hospedante, por lo
que dicho proceso ocurre a través de la simbiosis Rhizobium-
leguminosas. Esta asociación se produce a través de un proceso de
reconocimiento específico entre la bacteria y la raíz de la planta. Esto
determina el éxito de la asociación simbiótica.
 La asociación se inicia con el proceso de infección, cuando las
bacterias son estimuladas por los exudados radicales y proliferan.
Esto induce un alargamiento y arqueado de los pelos radicales y
posterior formación de una estructura tubular por donde Rhizobium
es conducido hasta la base del pelo. Luego atraviesa la pared de la
célula cortical, se establece y se engloba por la membrana
plasmática de la célula vegetal, lo que resulta en la formación del
nódulo. Allí, en los nódulos radiculares, las bacterias encuentran un
ambiente que las protege suficientemente del oxígeno como para
poder producir la enzima nitrogenasa que reduce el N2 molecular del
aire a amonio.

Los dos simbiontes, planta y bacteria, se benefician. Las bacterias

reducen N2 a amonio (NH4), el cual es exportado al tejido vegetal
para su asimilación en proteínas y otros compuestos nitrogenados.
Por su parte, la glucosa fabricada durante la fotosíntesis es
transportada a la raíz donde los bacterias la usan como fuente de
energía.

3. ¿Cuáles son los factores que influyen en la actividad fijadora del

género Rhizobium?

Hay ciertos factores que influyen en la actividad fijadora del género

Rhizobium. Se ha demostrado que cuando la planta huésped es
colocada en un medio exento de luz solar, es decir, privada de la
función fotosintética, la actividad de estas bacterias se reduce al
mínimum y actúan entonces como elementos parasitarios; sin
embargo, un exceso de fotosíntesis produce el efecto contrario. Este
mismo fenómeno se produce cuando hay un desequilibrio en el
balance carbono-nitrógeno, influenciado por la presencia de gran
cantidad de nitratos en el suelo.

La relación huésped-bacteria es muy importante en la fijación del

nitrógeno, pues se ha demostrado la existencia de biotipos capaces
 de producir nudosidades muy pobres sobre el huésped, debido a que
provocan en el mismo la formación de sustancia sinhibidoras del
tejido bacterial.

4. Expresar 200mg/L en: ppm y %

 ppm

200 mg
=200 ppm
L

 % masa (g)/volumen (ml)

200mg 1L 1g
∗ ∗ ∗100 %=0.02 %
L 1000 ml 1000 mg

CONCLUSIONES

 Los nódulos obtenidos del fréjol y alfalfa y sirvieron para la inoculación

de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y Rhizobium meliloti
respectivamente, en el Agar Levadura Manitol o ALM.

 En las placas de Petri con medio ALM se observó la presencia de

colonias aisladas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli y
Rhizobium meliloti. Con los nódulos de la arveja se formaron la mayor
cantidad de colonias aisladas. La realización de una estría simple fue de
vital importancia para obtener dichas colonias.

 Mediante la tinción de Gram se determinaron varias características de

las especies de Rhizobium obtenidas del fréjol y de la alfalfa, como por
ejemplo que son bacilos Gram negativos, de pequeño tamaño, finos, en
forma de bastoncillos y que no forman esporas.
BIBLIOGRAFÍA

 ArgenBio. (2007). Los microorganismos del suelo y la biotecnología en la

agricultura.

 Garassini, Luis. (1967). Microbiología Agraria. Caracas.

 Lascano, Carlos y Spain, James. (1998). Establecimiento y Renovación

de Pasturas. Centro Internacional de Agricultura Tropical: Veracruz.

 Neyra, M. (1995). Manual Técnico de la Fijación Simbiótica del Nitrógeno

Leguminosa/Rhizobium. Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación: Roma.

 Olivares, José. (2008). Fijación biológica de nitrógeno. Centro Superior

de Investigaciones Científicas: Armilla.

 Quinto, Carmen y Cárdenas, Luis. (2008). Diálogo para ganar:

interacción simbiótica entre una bacteria del suelo y el frijol.

 Redondo, Miguel; Bonilla, Ildefonso y Bolaños, Luis. (2002). Fijación

biológica del nitrógeno