You are on page 1of 9

Univerzitet "Sv.

Kiril i Metodij"
Fakultet za veterinarna medicina - Skopje

Seminarska rabota po Mikrobiologija


II

Opis na genite na

koi se koristat vo dijagnostikata i


sozdavaweto na vakcina

Profesor: Izrabotil
Doc. D-rSlav~o Mreno{ki Il~e Bosilkovski br. 982
Corynebacterium pseudotuberculosis e gram pozitiven intracelularen
patogen, i pretstavuva pri~initel na kazeozniot limfandenit
(pseudotuberkuloza). Ovaa bakterija gi inficira kozite i ovcite i
predizvikuva golemi ekonomski {teti voglavno kaj odgleduva~ite na
kozi. I pokraj negovata va`nost kazeozniot limfandenit e slabo
istaknat. Kako e da e so napredokot vo genetikata, mnogu geni na C.
pseudotuberculosis ve}e se opi{ani, glavno vo vrska so virulencijata, kakov
{to e fosfolipazata D. Tuka se prou~uva da se upotrebat nekolku geni
koi se na raspolagawe na C. pseudotuberculosis i da se ispitaat za nivna
aplikacija vo sozdavaweto na vakcina, po efektivna diagnoza na
kazeozniot limfandenit, i kontrola na ovaa bolest.

Rodot Corynebacterium pripa|a na familiata Corynebacteriaceae. Ovie


gram pozitivni bakterii sodr`at mnogu raznovidna grupa na posebni
karakteristiki, kako {to e specifi~na oranizacija na kleto~niot yid.
Vo ovaa grupa pripa|a Corynebacterium pseudotuberculosis, va`en
`ivotinski patogen koj e pri~initel na bolesta kazeozen limfandenit.
Ovaa bolest e rasprostraneta po celiot svet, i nejzinoto golemo
ekonomsko zna~ewe pottiknuva istra`uvawe na nejzinta patogeneza. Kako
i da e, genetskite determinanti za virulencija na C. pseudotuberculosis se
seu{te slabo opi{ani, osven toa ovaj vid ima samo 19 identificirani
geni za sinteza na proteini i oklu 1230 sekvenci od genomot se ve}e
skladirani vo genetskite banki za podatoci.

Genite na C. pseudotuberculosis, skladirani vo GenPept, National Center for


Biotechnology Information (NCBI)
Pogolemiot broj na ovie geni pripa|aat na virulentnite faktori, ili
za pozitivna regulacija na genite za virulencija ili geni koi kodiraat
virulentni faktori koi mu gi davaat patogenite karakteristiki na C.
pseudotuberculosis. Poradi ovaa pri~ina genite za virulencija se cel za
razvoj na novi vakcini i poefekasna terapija i dijagnostika vo
kontrolata na bolestite, glavno na kazeozniot limfandenit koj e seu{te
kontroliran so zaostanata profilaksa. Ova prou~uvawe se odnesuva na
prethono navedenite geni, i nivna aplikacija kako pomo{ pri kontrolata
na kazeozniot limfandenit.

Geni i nivna aplikacija

Fosfolipaza D: virulenten faktor

Posle izve{tajot
na Hodgson i negovite
sorabotnici za
sekvencioniraweto na
nukleotidite,
kloniraweto i
ekspresijata na genot, koj
ja kodira fosfolipaza D
kaj C. pseudotuberculosis,
nekolku prou~uvawa se
odnesuvaat na ovoj gen.
Fosfolipazata D
nekolku godini se smeta
kako glaven virulenten
faktor na C. pseudotuberculosis. Genot koj go kodira egzotoksinot
fosfolipaza D, koj verojatno ja pomaga bakteriskata disseminacija,so
zgolemuvawe na propuslivosta na krvnite sadovi po pat na hidroliza na
esteri~nite vrski vo sfingomielinot na kleto~nite membrani na
kletkite na cica~ite, pri {to sledi infekcija, i i ovozmo`uva na
bakterijata da gi izbegni neutrofilite i oslabuvawe na neutrofilnata
hemotaksa na mestoto na infekcijata.
Nekolku ispituvawa se praveni nadvor od biolo{kata aktivnost
na fosfolipazata D na C. pseudotuberculosis, kako {to e molekularnata
struktura, i rezultatite se prika`ani paralelno so sfingomielinazata
prezentirana vo otrovot od medicinski va`en rod na pajaci Loxosceles. Za
razlika od difterija toksinot koj se pojavuva kaj okolu polovina od
izolatite na C. diphtheria, fosfolipazata D verojatno e karakteristi~en
za pove}eto ili skoro site soevi na C. pseudotuberculosis i C. ulcerans i ne e
pronajdena vo drugi vidovi na Corynebacterium. Poradi imunogenite
karakteristiki na fosfolipazata D, taa ~esto e koristena kako
sredstvo za razvivaweto na vakcina proiv kazeozniot limfandenit.
Vakcinite koi momentalno se proizveduvaat za kontrola na
kazeozniot limfandenit generalno se koristi C. pseudotuberculosis kultura
bogata so formalin - inaktivirana fosfolipaza D bidej}i fosfolipaz-
ata D se smeta kako glaven za{titen antigen, ili se koristi DNA kako
vakcina. Iako komercijalnita vakcina e ve}e dostapna, se misli deka
konvencionalnata atenuirana vakcina e se u{te vo prednost bidej}i
dava podolgove~en humoralen i citotoksi~en T-limfociten odgovor so
samo edna doza vo gluvci.
Hodgson i sorabotnicite koristele soj na C. pseudotuberculosis so gen
za fosfolipaza D izbri{an od hromozomot i poka`ale deka taa
edine~na potko`na vakcinacija od ovoj atenuiran soj, bez toksinot
(Toxminus), gi za{titila ovcite protiv diviot tip na predizvikuva~ot.
Pacheco i sorabotnicite go koristele genot za fosfolipaza D da
razvijat multipleks PCR proba vo koja se vklu~eni rpoB i 16S rRNA genite.
Ovaa metodologija dava mo`nost da se diferencira C. pseudotuberculosis
od drugi srodni vidovi na korinebakterii kako C. ulceran i C. diphtheriae,
davaj}i precizen dijagnosti~ki metod za kazeozniot limfandenit
direktno za klini~ka upotreba.

AroB i aroQ: biosinteza na aminokiselini

Dehidrokinazite se enzimi vklu~eni metaboli~kite biosinteti~ki


procesi. Biosintezata na aminokiselini e voglavno opi{ana kaj
Escherichia coli od kade dehidrokinazata ve}e e izolirana, klornirana,
sekvencionirana i povtorno ekspresirana. Ovie enzimi sodr`at tri
naimenuvani ekspresirani podtipa: monofunkcionalna forma,
bifunkcionalna forma najdena vo rastenija i multifunkcionalna forma
od dehidrokinaza, koja e golem polipeptid.
Kim et al. objavil prisustvo na takvi enzimi vo Mycobacterium
tuberculosis koi se bitni za biosintaza na fenilalanin, tirozin,
triptofan i drugi aromati~ni soedinenija vo bakteriite i drugi
organizmi kako {to se gabite, algite i rastenijata, no se otsutni kaj
cica~ite. Prednost od nepostoeweto na ovie enzimi vo cica~ite e
mo`nost za ravoj na novi lekovi.
Nekolku patogeni se atenuirani so mutacija na biosinteti~kiot pat
na aromati~nite aminokiselini kako {to e Salmonella ssp i drugi patogeni
bakterii. Simmons i sorabotnicite dobile soevi na C. pseudotuberculosis so
mnogu slaba virulencija so pomo{ na atenuirawe na AroB i aroQ genite,
koristej}i alelska promena. Takvi soevi bile nesposobni da
predizvikaat kazeozen limfandenit kaj gluvci, predlo`uvaj}i da se
upotrebat kako vakcini vektori i potencijalni atenuirani vakcini za
kontrola na kazeozniot limfandenit.
FagA, fagB, fagC i fagD: prezemawe na `elezo

Zdobivaweto na `elezo e eden od najva`nite faktori za


bakteriskoto pre`ivuvawe pre`ivuvawe za vreme na infekcijata vo
doma}inot. Ovaj mehanizam e op{irno opi{an kaj Gram-negativnite
bakterii i isto taka i kaj Gram-pozitivnite bakterii, kade nekolku
nau~ni trudovi se objaveni na molekularna osnova na prezemaweto na
`elezoto.
Od prou~uvawata na Staphylococcus aureus se objaveni nekoi geni i
pati{ta vklu~eni vo prezemaweto na `elezoto i ispituvaweto za
prsustvo na siderofori i sistemi koi koristat ABC transporteri od tri
soedinenija.
Op{ta karakteristika
na genite koi kodiraat
transporteri na `elezo e
nivnata lokacija vo PAIs, kade
se dokaz za horizontalen
prenos.
PAIs e isto taka opi{an i kaj
Gram-pozitivnite bakterii
kako {to se C. diphtheriae i S.
pneumoniae, kade C. diphtheriae
poseduva gen IRP1 homologen so
genot na ABC transporterot
vklu~en vo prezemaweto na
`lezo vo S. pneumoniae, lociran
vnatre vo PAI.
Wennerhold i kolegite
identificirale protein DtxR,
koj e vklu~en vo regulacijata
na prezemaweto na `elezoto,
glavno vo visoki GC Gram-
positivni rodovi
(Corynebacterium, Mycobacterium
and Rhodococcus), moduliraj}i ja
ekspresijata na sideroforite
i drugi soedinenija vo
procesite na sobirawe na
`elezo.
Kako i da e vo C.
pseudotuberculosis, Billington i
sorabotnicite opi{ale operon
(fagABC) so 32-47%
identificirani proteini
vklu~eni vo bakteriskiot
sistem za prezemawe na
`elezo kako {to se ABC
transporterite koi mu davaat na C. pseudotuberculosis perzistentna
infekcija kaj kozi. Pretstaveni vo ovoj operon se ~etiri geni: fagA, fagB,
fagC, fagD, locirani stepen podolu od genot za fosfolipaza D. Pristapot
koristen za prou~uvawe na takvi geni e fuziata na operonot za lacZ genot
za ocenuvawe na ekspresijata. Zabele`ano e deka operonot e slabo
ekspresiran vo medium zbogaten so `elezo i medium so ograni~eno
koli~estvo na `elezo, ekspresijata na aktivnosta na β-galaktozidazata e
zgolemena za okolu 3 ″nabori″(fold), {to sugerira na toa deka ekspresijata
na toj operon pravi pridones za virulencijata na bakterijata.

Toplinski stres proteini: chaperonin - imunogenost i


razvivawe na vakcina.

Toplinskite stres proteini -


Heat shock proteins (HSPs) se edni od
najdobro za~uvana grupa na proteini
me|u organizmite. Tie otprvo se
opi{ani deka se vklu~eni vo
toplinskiot stres, no momentalno se
znae deka HSPs u~estvuva i vo drugi
slu~ai kako siroma{nost so hrana,
hipotaksia, poremetuvawe na
metabolizmot, virusni infekcii,
transformacija i drugi kleto~ni
procesi. Chaperonin proteinite se
najdeni skoro vo site organizmi i se
klasificirani vo {est familii:
Hsp10, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, i
Hsp100. Me|utoa, vo prokariotite, od
HSPs naj karakteristi~ni se hsp60
(groEL), hsp70 (dnaK) i hsp10 (groES), a
vo rodot Corynebacterium se opi{ani
dva geni za hsp60.
So prou~uvawata koi gi
oddr`ale od Coelho KS, Miyoshi A i
Azevedo V za prv pat se opi{ani i izolirani genite za hsp10 i hsp60 vo C.
pseudotuberculosis. Poznato e deka pove}eto od HSPs se sposobni da
predizvikaat humoralen i kleto~en odgovor, i poradi toa {to tie
poseduvaat imunogenost. Baziraj}i se na ovaa informacija, istata grupa
na istra`uva~i testirala hsp60 DNA vakcina i vakcina so
rekombinanten protein vo gluvci i predizvikale zna~itelna produkcija
na specifi~en igG.
RecA i RpoB na Corynebacterium pseudotuberculosis: dijagnostika i
filogeneza
Proteinot RecA e pronajden vo eubakteria i e visoko za~uvan
protein me|u bakteriskite organizmi. Toj u~estvuva vo homolognata
rekombinacija, DNA popravkata i SOS odgovorot. Karakteristi~no, toj
povrzuva fragmenti od ednolan~ana DNA i odvitkuva dvolan~ana DNA.
Vo ovaj kontekst, Pogson et al. sozdal izogeni~ni mutanti na C.
pseudotuberculosis kade recA genot e mutiran. Kako rezultat na toa, 10 do 12-
fold redukcija vo rekombinacijata preovladuvala kaj mutantite sporedeni
so roditelskiot soj, {to sugerira za negovo koristewe kako vakcina
vektor.
Genot za rpoB e odgovoren za kodirawe na β-subedinicata od DNA-
zavisnata RNA polimeraza; me|utoa postojat nekolku dokazi koi
sugeriraat na negovata povrzanost so rezistencijata na rifampin. Vo
posledno vreme sekvencite na rpoB se koristeni koko alternativna
alatka za odreduvawe na filogenezata na nekoi enteri~ni bakterii,
Borrelia, Mycobacterium i Bartonella. Dorella et al. koristela gi koristela
genite za rpoB i 16S rRNA da go izgradi filogenetskoto drvo na rodot
Corynebacterium. Ova prou~uvawe poka`alo deka C. pseudotuberculosis e
posroden so C. ulcerans otkolku so C. diphtheriae, {to sugerira na toa deka C.
diphtheriae otstapuvala od dvete nekoe vreme.
Nov protein na Corynebacterium pseudotuberculosis - CP40: drugi
sekretirani toksini
Nov gen na C. pseudotuberculosis otkrien od Wilson et al., CP40, kodira
protein so molekularna masa od 40 kDa i dol`ina od okolu 351
aminokiselina. Uvodnata karakterizacija na proteinot CP40 opi{uva
deka verojatno e serin proteaza, iako nema nikakva homolognost vo
strukturata so drugite prou~eni serin proteazi. Mo`ebi ovaa otsutnost
na homolognosta postoi bidej}i CP40 e su{tinski za C. pseudotuberculosis.
Ovaj protein poka`al biohemiska sli~nost so proteinot
fosfolipaza D. Dvata se hidrofobni i imaat vode~ka sekvenca koja
sodr`i Ala-x-Ala forma na C terminalot. Ovaj protein e pronajden vo
kultura na C. pseudotuberculosis, {to uka`uva deka najverovatno e
sekretiran.

Pristap kon genskata sodr`ina na Corynebacterium


pseudotuberculosis: perspektiva

Momentalno, postoi golem napredok vo prou~uvaweto na genomite,


glavno vo optimiziraweto na sekvencionira~kite tehniki, {to zna~i
sekvencioniraweto stanalo poeftino i poprecizno. Masiven depozit od
sekvenci kako {to se genomskite sekvenci razgleduvani vo javnite bazi
na podatoci go olesnuva baraweto na homologija i otkrivawe na novi
geni. So pomo{ na napredokot na poleto na genetikata, se celi kon
koristewe na takvi alatki za otkrivawe na novi geni, novi dijagnosti~ki
metodi i poefektivni vakcini za kontrola na kazeozniot limfandenit.
Osven toa genomite na nekoi Corynebacteria ssp se {iroko dostapni, kade
{to tie informacii mo`e da se koristat vo komparativnata genetika za
da pomognat da se dobie podobar uvid za sodr`niata na genite i
genomskata organizacija na Corynebacterium pseudotuberculosis.
Koristena literatura:

www.funpecrp.com.br

bepast.org

journals.asm.org

www.urmc.rochester.edu

commons.wikimedia.org

www.nature.com