BÁO CÁO VỀ MÁY UV – Vis 1800

I. Khái quát về phương pháp phổ tử ngoại - khả biến

Khi phân tử hấp thụ bức xạ tử ngoại hoặc khả kiến thì những electron hoá trị
của nó bị kích thích và chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Vì thế phổ
hấp thụ được gọi là phổ tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet and Visible Spectra, viết tắc là
UV-Vis) và cũng đựoc gọi là phổ hấp thụ electron.

1.1. Các kiểu chuyển mức electron

Khi chúng ta nói về chuyển mức electron thì cần biết đến mối quan hệ giữa các
mức năng lượng.

Hình : Biều đồ thể hiện mối liên quan giữa các mức năng lượng

Sự chuyển từ trạng thái cơ bản lên trang thái kích thích từ phương diện năng
lượng. Đó là sự chuyển mức năng lượng thấp lên một mức năng lượng cao hơn. Trong
phân tử các electron ở các obitan khác nhau (δ, π, không liên kết, phản liên kêt) ứng
với mức năng lượng khác nhau.

Tuỳ thuộc vào mỗi phân tử cụ thể, có thể có các obitan δ1, δ2,…, π1, π2,…, na, nb,
… với các mức năng lượng khác nhau. Mỗi trạng thái electron đều được mô tả bằng
những đường cong thế năng riêng. Như vậy có thể xảy ra nhiều kiểu chuyển mức
electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích cao hơn.
 Hình : Sự phân bố các mức năng lượng của các obitan phân tử

Các kiểu chuyển mức hay gặp:

 Chuyển mức N  V: là sự chuyển electron từ trạng thái liên kết lên trạng

thái phản liên kết có năng lượng cao hơn. Chuyển mức N  V đối với electron δ gọi
là chyển mức δ  δ* và nó ứng với giá trị ΔE lớn nhất nên thường thể hiện ở vùng tử
ngoại xa, đối với electron π gọi là chuyển mức π  π* và nó ứng với giá trị ΔE nhỏ
nhất nên thường thể hiện ở vùng tử ngoại gần hoặc vùng khả kiến khi có nhiều
electron π liên kết với nhau.

Hình: Sự chuyển mức π  π*

 Chuyển mức N  Q: là sự chuyển electron từ trạng thái không liên kết lên
trạng thái phản liên kết có năng lượng cao hơn. Đó là gặp ở các phân tử có chứa các
nguyên tử với các cặp electron chưa tham gia liên kết (như nguyên tử halogen:
oxygen, nitrogen,…). Có hai loại chuyển mức N  Q: chuyển mức n  δ* và
chuyển mức n  π*. Cả hai chuyển mức đều đặc trưng bởi cường độ thấp (giá trị ε
nhỏ). Chuyển mức n  δ* thường thể hiện ở vùng tử ngoại, chuyển mức n  π*
thường thể hiện ở vùng tử ngoại gần hoặc vùng khả kiến.
 Hình: Chuyển mức năng lượng n  π*

 Chuyển mức N  R: là sự chuyển electron từ trạng thái cơ bản lên trạng

thái năng lượng rất cao theo hướng ion hoá phân tử. Chuyển mức này đòi hỏi năng
lượng rất lớn nên thể hiển hiện ở vùng tử ngoại xa. Phổ thu được trong trường hợp này
thường dùng để xác định năng lượng ion hoá phân tử.

 Chuyển mức kèm theo chuyển dịch điện tích: là những chuyển mức mà
trong đó electon chuyển từ một nguyên tử hoặc một nhóm nguyên tử này đến một
nguyên tử hoặc một nhóm nguyên tử khác. Sự hấp thụ kèm theo chuyển dịch điện tích
thường gặp ở các hợp chất vô cơ và phức chất.

1.2. Phân biệt các kiểu chuyển mức electron

 Chuyển mức n  π* có những đặc điểm sau:

1. Chuyển mức n  π* có hệ số hấp thụ mole nhỏ, thường ít khi vượt quá
103.

2. Bước sóng cực đại (λmax) của vân n  π* chuyển dịch về phía bước sóng
ngắn (chuyển dịch xanh) khi chuyển từ dung môi không phân cực sang các dung môi
phân cực mạnh hoặc có khả năng tạo liên kết hydrogen. Thường thì ứng dụng dung
môi này vào khoảng 5 – 20 nm. Dung môi phân cực có một khả năng làm giảm λmax
(chuyển dịch xanh) đối với chuyển mức n  π* là do đã hạ thấp năng lượng ở trạng
thái cơ bản và làm tăng năng lượng ở trạng thái kích thích. Các dung môi tạo liên kết
hydrogen với chất tan thường gây ra sự chuyển dịch mạnh vân hấp thụ n  π* về phía
sáng ngắn do dung môi đã tạo liên kết hydrogen với chính đôi electron n nhận trách
nhiệm hấp thụ bức xạ trong chuyển mức đang xét. Mặt khác ở trạng thái kích thích chỉ
còn một electron n nên liên kết hydrogen bị yếu đi, nó không thể làm giảm năng lượng
của trạng thái kích thích như đã làm đối với trạng thái cơ bản. Trường hợp phân tử có
nhiều hơn một electron n thì sự tạo liên kết hydrogen đối với đôi electron này sẽ gây
hiệu ứng cảm ứng đối với đôi electron kia và do đó cũng dẫn tới chuyển dịch xanh.

3. Vân n  π* thường bị triệt tiêu trong môi trường acid mạnh. Đó là sự

proton hoá hoặc sự tạo thành sản phẩm cộng đã liên kết mất đôi electron n.

4. Việc gắn các nhóm đẩy electron vào nhóm mang màu chứa electron n

cũng thường làm cho vân n  π* chuyển dịch về phía sóng ngắn. Chuyển mức π  π*
thường có cường độ lớn, giá trị ε thường từ 103 đến 105. Ngược với chuyển mức n 
π*, khi chuyển sang dung môi phân cực mạnh, hoặc khi đưa các nhóm đẩy electron vào
phân tử thì vân phổ ứng với chuyển mức π  π* sẽ dịch chuyển về phía sóng dài
(chuyển dịch đỏ). Khi phân biệt chuyể mức π  π* với n  π* không nên chỉ dựa vào
giá trị ε mà phải kết hợp với hiệu ứng dung môi và ảnh hưởng của nhóm thế. Chuyển
mức d - d và chuyển mức kèm theo chuyển dịch điện tích thường xuất hiện ở vùng tử
ngoại gần hoặc vùng khả kiến. Chuyển mức d - d đặc trưng bởi hệ số hấp thụ mole rất
nhỏ (thường không quá 102) còn chuyển mức kèm chuyển điện tích lại có ε lớn (cỡ
104). Người ta nhận thấy rằng vị trí của vân hấp thụ ứng với chuyển mức kèm chuyển
điện tích thay đổi theo khả năng solvate hoá của điện dung : Trong những dung môi
solvate hoá tốt cực đại hấp thụ chuyển dịch về phía sóng ngắn.

1.3. Quy tắc chọn lọc ở phổ electron

Cường độ hấp thụ ứng với mỗi chuyển mức được biểu diễn bởi công thức sau :

ε = 0,87.1020.P.a

Trong đó: P là xác suất chuyển (nhận giá trị từ 0 đến 1), a là diện tích hứng bức
xạ của hệ hấp thụ. Hệ hấp thụ ở đây được hiểu là phần phân tử nhận trách nhiệm hấp
thụ bức xạ tức là nhóm mang màu (chromophore).

Đối với phổ dao động các quy tắc chọn lọc là tương đối đơn giản. Đối với các
chuyển mức electron, các quy tắc chọn lọc là phức tạp hơn nhiều vì chúng là hàm của
tính đối xứng và độ bội của cả trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích. Dưới đây là
tóm tắt nội dung:

 Tất cả các hàm sóng trong phân tử đều được phân thành chẵn (kí hiệu là g)

hoặc lẻ (kí hiệu là u). Đối với các phân tử đối xứng, các chuyển mức g  u hoặc u 
g được phép, còn các chuyển mức g  g và u  u là bị cấm. Quy tắc này gọi là quy
tắc chọn lọc theo chẵn lẻ.

 Chuyển mức giữa các trạng thái có độ bội khác nhau là bị cấm. Chẳng hạn

chuyển mức singlet  triplet là bị cấm do độ bội . Chuyển mức bị cấm do độ bội có ε
không vượt quá 1.

 Chuyển mức ở các phân tử không có tâm đối xứng thì phụ thuộc vào tính
đối xứng của trạng thái đầu và trạng thái cuối.

Các vân phổ với ε nhỏ hơn 103 là kết quả của các chuyển mức bị cấm theo các
mô hình đơn giản nhưng lại xảy ra được do phân tử thực là khác với mô hình đơn giản
mà ta xây dựng cho nó.

1.4. Bức xạ và sự hấp thụ bức xạ

1.4.1. Bức xạ điện từ

Bức xạ điện từ được đặc trưng bởi bước sóng λ (quãng đường mà nó đi được
sau mỗi dao động đầy đủ), hoặc tần số v (số dao động trong một giây). Chúng liên hệ
với nhau bởi biểu thức sau:

Với: “C” là tốc độ ánh sáng (trong chân không c = 2,99.1010 cm/s)

Năng lượng ε (E) của lượng tử với tần số v được tính như sau:

Hay:
 Với: “h” là hằng số Plank (M .Planck), h =6,626.10-34 J.s.

Biểu thức cho thấy năng lượng của bức xạ tỉ lệ thuận với tần số và số sóng, tỉ lệ
nghịch với bước sóng.

Toàn bộ dãy sóng đó được chia thành các vùng phổ khác nhau (hình 1). Mắt
người chỉ cảm nhận một phần phổ điện từ rất hẹp, đó là vùng khả kiến (vùng nhìn thấy
được) bao gồm các bức xạ có bước sóng 396 ÷ 760 nm.

1.4.2. Sự hấp thu bước xạ và màu sắc của các chất

Ánh sáng nhìn thấy bao gồm dãy bức xạ có bước sóng từ 760  396 nm vẫn
được gọi là ánh sáng trắng. Khi cho ánh sáng trắng chiếu qua lăng kính, nó sẽ bị phân
tách bằng một số tia màu (đỏ, da cam, vàng, lục, lam, chàm, tím). Mỗi tia màu đó ứng
với một bước sóng hẹp (bảng ?????).

Nếu ánh sáng chiếu vào một chất nào đó mà bị khuyếch tán hoàn toàn hoặc đi
qua hoàn toàn thì đối với mắt chất đó có màu trắng hoặc không màu.

Thuỷ tinh thường hấp thụ các bức xạ với bước sóng nhỏ hơn 360 nm, nó trong
suốt với các bức xạ khả kiến. Thuỷ tinh thạch anh hấp thụ bức xạ với bước sóng nhỏ
hơn 160 nm, nó trong suốt đối với bức xạ khả kiến và cả bức xạ tử ngoại gần.

Nếu một chất hấp thụ hoàn toàn tất cả các tia của ánh sáng trắng thì chất đó có
màu đen. Nếu sự hấp thụ xảy ra ở một khoảng nào đó của vùng khả kiến thì các bức xạ
khoảng còn lại khi đến mắt ta sẽ gây cho ta cảm giác về một màu nào đó. Hai tia phụ
nhau khi trộn vào nhau sẽ tạo ra ánh sáng trắng. Quan hệ giữa màu của tia bị hấp thụ
và màu của chất hấp thụ (các chất màu phụ của nhau).

Bảng ????: Quan hệ giữa tia bị hấp thụ và màu của chất hấp thụ
 Tia hấp thụ Màu của chất hấp thụ

Màu λ, nm (wavelength) (màu của tia còn lại)

Tím 400 – 430 Vàng lục

Xanh 430 – 490 Vàng da cam

Lục xanh 490 – 510 Đỏ

Lục 510 – 530 Đỏ tía

Lục vàng 530 – 560 Tím

vàng 560 – 590 Xanh

Da cam 590 – 610 Xanh lục

Đỏ 610 - 730 Lục

Để một hợp chất có màu, không nhất thiết λmax của nó phải nắm ở vúng khả kiến
mà chỉ cần cường độ hấp thụ của nó ở vúng khả kiến đủ lớn.

II. Giới thiệu chung máy UV – Vis

Máy UV-Vis là một thiết bị được sử dụng phổ biến trong phòng phân tích. Các
máy phổ hiện thường được nối với máy vi tính, do đó việc ghi phổ hết sức thuận lợi
nhờ có những chương trình đo tự động theo các chế độ khác nhau. Ngoài ra, còn có thể
lưu giữ phổ đối chiếu và so sánh khi cần thiết.
Nhờ sử dụng máy vi tính, bộ tự ghi còn thể ghi ra những số liệu cần thiết như
giá trị bước sóng (λ), độ hấp phụ ( Abs) và ta cũng có thể xác định hệ số hấp thụ mol
(ε) nhờ vào định luật Bouguer – Lamber – Beer:
lg P0
A= =ε.l.c
P

Trong đó :

A là độ hấp thụ.

c là nồng độ chất tan(mol/L)

 l là bề dày của cell chứa mẫu (cm).

ε là hệ số hấp thụ mol (Lmol-1cm-1).

Ý nghĩa của hệ số hấp thụ mol ε :

Hệ số hấp thụ mol đặc trưng cho cường độ hấp thụ của chất nghiên cứu ở bước
sóng đã cho.

Hệ số hấp thụ Mol không phụ thuộc vào nồng độ và bề dày của lớp chất hấp thụ
.ε chỉ phụ thuộc vào bản chất chất hấp thụ và bước sóng của bức xạ hấp thụ Do đó ε
đặc trưng cho cường độ hấp thụ bức xạ của chất được khảo sát.Khi ε lớn ta nói chất
hấp thụ mạnh(cường độ hấp thụ lớn), ngược lại khi ε nhỏ- chất hấp thụ yếu(cường
độ hấp thụ nhỏ).

Ở vùng tử ngoại - khả kiến định luật Bouguer-Lamber-Beer luôn tuân theo vì
vậy giá trị ε thường luôn được xác định và có độ lặp lại tốt.

Giá trị ε của các vân hấp thụ ứng với các chuyển mức electron khác nhau thay
đổi trong những khoảng rất rộng. Điều này rất quan trọng khi nghiên cứu các hợp chất
thiên nhiên với lượng thu được nhỏ.

Dung môi dùng để đo UV-Vis không được hấp thụ ở vùng phổ cần đo.Người ta
thường dùng các loại dung môi như: methanol, ethanol, nước…Ngoài ra người ta còn
sử dụng các loại dung môi không màu như chloroform, dioxane, benzen…

Trong khi đo UV-Vis thì dung môi đóng vai trò quan trọng nên dung môi phải
được tinh chế một cách cẩn thận. Nếu dung môi có lẫn tạp chất chỉ một lượng nhỏ thì
cũng làm sai lệch kết quả đo.

Để đo được chính xác trong một số trường hợp ta phải chạy Baseline lại như:

- Đo các mẫu với các dung môi khác nhau. Ví dụ như mẫu tan trong dung môi
là methanol nhưng mẫu khác lại dùng dung môi là ethanol.

- Để một thời gian lâu ta không sử dụng thì ta phải chạy Baseline lại.

Khi ta tiến hành đo UV-Vis thì ta sẽ thu được độ hấp thụ mol và cường độ hấp
thụ của chất.
 Khi bức xạ chiếu vào các phân tử, nó có thể bị khuếch tán hoặc bị hấp thụ bởi
các phân tử. Sự khuếch tán không làm thay đổi tần số của bức xạ là sự khuếch tán
thường, còn khuếch tán làm thay đổi tần số của bức xạ được gọi là khuếch tán tổ hợp.
Chúng ta quan tâm đến sự hấp thụ bức xạ bởi vì việc ghi phổ chính là ghi lại sự hấp
thụ bức xạ bởi phân tử.

Ở nhiệt độ không tuyệt đối, lớp vỏ electron của phân tử không bị kích thích, sự
quay của phân tử cũng không xảy ra, nhưng phân tử có một năng lượng dao động nào
đó gọi là năng lượng dao động ở điểm không. Khi năng lượng tăng dần dự trữ năng
lượng nhiệt của phân tử đến giá trị 0,03- 0,3 kcal/ mol, phân tử chuyển sang những
trạng thái quay bị kích thích nhưng trạng thái dao động và trạng thái electron vẫn
không đổi.

Khi năng lượng chuyển động nhiệt tăng lên tới 0,3- 12 kcal/mol, trạng thái kích
thích của phân tử cũng chưa bị kích thích nhưng trạng dao động bị kích thích.

Muốn kích thích electron cần phải có năng lượng lớn hơn nhiều, vào khoảng
hàng chục đến hàng trăm kcal/mol. Năng lượng đó ứng với các bức xạ thuộc vùng khả
kiến hay tử ngoại.

Nếu phân tử hấp thụ các bức xạ có năng lượng lớn hơn như bức xạ khả kiến
hoặc tử ngoại thì năng lượng electron của chúng bị thay đổi. Nếu chỉ có trạng thái
electron thay đổi thì vạch hấp thụ tương ứng sẽ có tần số:

Vel = ∆ E/hc.

Sự thay đổi trạng thái electron đồng thời có cả sự thay đổi trạng thái dao động
và trạng quay nên ta không thu được các vạch với tần số v el = vdd + vqy. Phổ thu được
trong trường hợp này được gọi là phổ hấp thụ electron. Hay gọn hơn là phổ electron.
Vì phổ electron thể hiện ở vùng tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) nên cũng được gọi là
phổ tử ngoại – khả kiến.

• Từ phổ UV-Vis và hệ số hấp thụ mol, ta có thể suy ra tính chất của sản
phẩm là:

Khái niệm đậm màu, nhạt màu của dung dịch trong thực tế liên quan tới giá trị
ε của chất hấp thụ và cả nồng độ của nó.
 - Hiệu ứng đậm màu của dung dịch được đo bằng độ hấp thụ. Sự chuyển dịch
cực đại hấp thụ về bước sóng dài (hiệu ứng Batocrom) thì ε tăng.

- Hiệu ứng nhạt màu là hiệu ứng làm giảm cường độ hấp thụ là giảm ε .

Dựa vào phổ ta biết được bước sóng, độ hấp thụ, hệ số hấp thụ mol từ đó ta có
thể so sánh với mẫu chuấn để xác định sản phẩm có đạt được những yêu cầu hay
không (ví dụ như là về nhóm chức, về độ tinh khiết của sản phẩm…)

Dựa vào độ hấp thụ của mẫu, ta có thể xác định nhóm chức đặc trưng của sản
phẩm. Ví dụ như những hộp chất hấp thụ trong vùng 220-800 nm thường là các
hydrocacbon hoặc là dẫn xuất đơn gián của chúng như(CH3Cl, C2H5Cl…). Hoặc nếu
như là hydrocacbon loại anken, ankin thì nối đôi, nối ba trong phân tử ở vị trí cô lập.

1. Cấu tạo chung của máy UV/VIS spectrophotometer

Những bộ phận chủ yếu của máy phổ UV – Vis là: nguồn phát bức xạ, bộ tạo
đơn sắc phân chia chùm sáng, bộ phận đo so sánh cường độ ánh sáng rồi chuyển thành
tín hiệu (detector).

Hình : Sơ đồ cấu tạo chung của máy UV – Vis

 Hình : Cấu tạo của máy UV – Vis

Chức năng của từng bộ phận như sau:

 Curve: vật liệu chính dùng làm curve để đo vùng tử ngoại - khả kiến là
thạch anh hay thuỷ tinh thạch anh, đá silica nung chảy và thuỷ tinh vì các vật liệu đó
trơ ở bước sóng từ 800 – 400 nm.

 Nguồn sáng: Để phát được bức xạ tử ngoại người ta dùng đèn Deuterium
Arc (đơteri) với phạm vi bước sóng 190 – 420 nm, còn với đèn Tungsten (vonfram)
với phạm vi bước sóng 350 – 2,500 nm có thể phát được cả bức xạ tử ngoại và khả
kiến hoặc cũng có thể sử dụng đèn Xenon (đèn khí trơ) có phạm vi bước sóng là 190 –
800 nm.

Hình : Đèn Tungsten

 Bộ tạo đơn sắc: thường dùng lăng kình thạch anh hoặc cách tử có nhiệm vụ
tách riêng từng dãy sóng hẹp (đơn sắc). Nguồn sáng nhiều màu sắc (polychromatic) sẽ
qua khe vào (Entrance slit) và đến thiết bị tán sắc, dưới tác dụng của thiết bị tán sắc sẽ
tạo ra ánh sáng đơn sắc khi qua khe ra (Exit slit) và đi ra ngoài.
 Khe hở
vào
Ánh sáng trắng

Ánh sáng
đơn sắc
Khe hở
ra

Hình : Bộ tạo đơn sắc

 Thiết bị tán sắc: có ba loại thiết bị tán sắc.

o Thứ nhất là filter (lọc): có tác dụng lọc vân hấp thụ và lọc ánh
sáng so sánh.

a) b)

Hình : a) Cấu tạo của thiết bị lọc

b) Ứng dụng trong bánh lọc chuyển động tròn đều (Filter Wheels)

o Lăng kính (prism): là thiết bị tán sắc được biết đến nhiều nhất có tác
dụng làm tán sắc chùm sáng khi đi qua nó.
 Hình : Chùm ánh sáng đi qua lăng kình bị tán sắc

o Grating (cách tử): giống như lăng kính nó có tác dụng tán sắc chùm tia đi
qua nó. Có hai loại: cách tử nhiễu xạ phẳng và cách tử nhiễu xạ lõm.

a) b)

Hình : a) Cách tử nhiễu xạ lõm.

b) Cách tử nhiễu xạ phẳng.

 Detector: là bộ phận phân tích có nhiệm vụ phân tích cường độ chùm ánh
sáng đi qua dung dịch và đi qua dung môi. Detector được dùng cho vùng UV – Vis là
detector phổ hấp thụ quang phân tử UV – Vis. Về nguyên tắc cấu tạo của detector gồm
những phần như sau:

o Nguồn sáng : là đèn D2 (vùng phổ UV), hay đèn W – Halid (vùng phổ
Vis).

o Buồng mẫu và môi trường hấp thụ.

o Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo.
 o Bộ phận điện tử thu nhận và khuyếch đại tín hiệu đo.

o Bộ phận chỉ thị kết quả đo.

2. Nguyên tắc hoạt động của máy UV/VIS spectrophotometer

2.1. Nguyên tắc hoạt động của máy UV – Vis một chùm tia

Hai nguồn sáng phát ra bức xạ tử ngoại – khả kiến từ đèn Deutrium và đèn
Tungsten đến gương lõm dưới phản xạ của gương lõm sẽ tạo ra một tia sáng trắng đi
qua thấu kính chuẩn trực (collimating) và qua khe vào (entrance slit) tới gương lõm.
Dưới sự phát xạ của gương lõm nguồn ánh sáng trắng sẽ đi đến grating nhằm tạo ra tia
sáng đơn sắc và phát xạ lại gương lõm. Cũng dưới sự phát xạ của gương lõm, tia sáng
đơn sắc sẽ đi đến gương phẳng bị phản xạ và chiếu qua khe ra (exit slit) đến filter
wheel (bánh lọc chuyển động tròn đều). Từ filter wheel tia sáng đi đến một gương
phẳng và tiếp tục xuyên qua mẫu. Phía sau mẫu có một màng trập (shutter) có thể hay
không thể cho nguồn sáng đi qua tạo ra sự ngắt quãng. Kết quả sẽ được detector do tìm
và sau đó sẽ có được kết quả trên máy tính.

Hình : Nguyên tắc hoạt động của máy UV – Vis một chùm tia

2.2. Nguyên tắc hoạt động của máy hai chùm tia

Hai nguồn sáng phát ra bức xạ tử ngoại – khả kiến từ đèn Deutrium và đèn
Tungsten đến gương lõm dưới phản xạ của gương lõm sẽ tạo ra một tia sáng trắng đi
qua thấu kính chuẩn trực (collimating) và qua entrance slit tới gương lõm. Dưới sự
phát xạ của gương lõm nguồn ánh sáng trắng sẽ đi đến grating nhằm tạo ra tia sáng
đơn sắc và phát xạ lại gương lõm. Cũng dưới sự phát xạ của gương lõm, tia sáng đơn
sắc sẽ đi đến gương phẳng bị phản xạ và chiếu qua exit slit đến filter wheel (bánh lọc
chuyển động tròn đều). Từ filter wheel tia sáng đi đến một gương phẳng. Gương phẳng
phát ra tia phản xạ đi đến một bộ phận chia chùm sáng sẽ hướng chùm sáng đơn sắc
luân phiên đi tới curve đựng dung dịch mẫu và dung dịch dung môi. Bộ phận phân tích
detector sẽ so sánh cường độ chùm sáng đi qua dung dịch và đi qua dung môi và sẽ
phát tín hiệu để cho ra kết quả đo.

Hình : nguyên tắc hoạt động của máy UV – Vis hai chùm tia

3. Ứng dụng của máy UV/VIS Spectrophotometer

 Phân tích các hoá chất vô cơ hay hữu cơ.

 Phân tích sự an toàn của thực phẩm.

 Phân tích máu huyết.

 Phân tích DNA/RNA.

 Phân tích hàm lượng nông dược dư.

 Phân tích lượng chlorine.

III. Giới thiệu về máy UV/Vis 1800

Máy UV/Vis 1800 là một trong những thiết bị được sử dụng phổ biến trong việc phân
tích phân tử trong vùng tử ngoại và khả kiến. Việc nghiên cứu các đặc tính của các phân tử
hóa học nhờ các phổ hấp thụ vùng tử ngoại và khả kiến được sử dụng rộng rãi trong tất cả các
lĩnh vực của việc nghiên cứu khoa học và thực tế sản xuất.

Hình : Máy UV – Vis 1800

1. Cấu tạo của máy UV/Vis 1800

Cấu tạo và chức năng của máy UV/Vis 1800 cũng giống như cấu tạo và chức năng
của máy UV – Vis Spectrophotometer gồm có các bộ phận: nguồn phát bức xạ (1), bộ tạo
đơn sắc (2), bộ phận chia chùm sáng (3), dung dịch chất nghiên cứu (4), dung môi (5),
detector (6) là bộ phận đo và so sánh cường độ ánh sáng rồi chuyển thành tín hiệu điện,… và
bộ phận ghi phổ (7). Ở đây vật liệu được sử dụng làm curve là thuỷ tinh thạch anh.

Hình : Sơ đồ cấu tạo của máy UV – Vis 1800

2. Nguyên tắc hoạt động của máy UV/Vis 1800

Nguyên tắc hoạt động của máy UV/Vis 1800 cũng dựa trên nguyên tắc hoạt động của
máy UV – Vis Spectrophotometer hai chùm tia.
 Nguồn sáng bức xạ tử ngoại – khả kiến được phát ra từ đèn Deutrium và đèn Tungsten
đến bộ tạo đơn sắc (dùng grating) và tại đây tia sáng sẽ được tách ra từng dãy sóng hẹp (đơn
sắc) và được truyền đến bộ phận chia chùm sáng sẽ hướng chùm tia đơn sắc luân phiên đi tới
curve đựng dung dịch mẫu và đựng dung môi. Sau khi đi qua curve đựng dung môi và curve
đựng mẫu thì tia sáng sẽ đi đến bộ phận phân tích (detector), tại đó detector sẽ so sánh cường
độ chùm sáng đi qua dung dịch (I) và đi qua dung môi (Io). Tín hiệu quang được chuyển thành
tín hiệu điện. Sau khi được phóng đại tín hiệu sẽ chuyển sang bộ tự ghi để vẽ đường cong sự
phụ thuộc của lg Io/I.

Hình 53: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy UV/Vis 1800

3. Ứng dụng của máy UV/Vis 1800

Máy có bức xạ trong vùng tử ngoại và khả kiến nên được xem là một phép phân tích
định tính cũng như phép phân tích định lượng, đặc biệt phương pháp này cũng góp phần xác
định cấu trúc phân tử hợp chất hữu cơ, vô cơ và phức chất.

Máy UV/Vis 1800 có những ứng dụng giống như máy UV/VIS Spectrophotometer.
Nhưng ở công ty thường được sử dụng đo các mẫu lỏng để theo dõi phản ứng hữu cơ, phân
tích định tính và định lượng.

4. Hướng dẫn sử dụng phần mềm UV Probe

Một số lưu ý:

Đây là thiết bị quang phổ nên cần: tránh cho máy không bị bụi ( sử dụng vải
che bụi khi không sử dụng máy), không đặt máy nơi có độ rung hay độ ẩm cao, điện
áp cấp cho máy phải ổn định.

Bật điện và để cho máy ổn định ít nhất 15 phút trước khi bước vào phép phân
tích.
 Thoát khỏi phần mềm UV Probe trước khi tắt máy UV.

Sau khi tắt máy phải chờ tối thiểu 10 phút mới mở máy trở lại.

Bước 1: Vào chương trình.

Đảm bảo máy UV đã được bật điện.

Bật máy tính. Nhấp đúp chuột vào biểu tượng UV Probe trên màn hình để vào
chương trình.

Sau đó nhập User name và password nếu máy có hỏi mật khẩu.

Bước 2: Chọn chế độ đo

( bằng cách kích chuột vào biểu tượng tương ứng trên thanh công cụ)

Có 3 chế độ đo: Spectrum, Photometric, Kineties

Bước 3: Kết nối với máy UV.

 Đo trong chế độ Spectrum

( Đo quét nhầm xác định các cực đại hấp thụ của một mẫu chất chưa biết)

Chọn thông số cho phép đo: Kích chuột vào nút lệnh M sẽ mở của sổ sau:
 Hình 4

Kích chuột vào mục Intrument Parameters sẽ mở tiếp của sổ sau để ta chon
chế độ( Transmittance – Truyền qua – khi mẫu dạng bản mỏng, Absorbance – Hấp thụ
- Thông dụng với hầu hết các mẫu, Energy – Năng lượng – Thường chọn chế độ này
để kiểm tra năng lượng đèn, Reflectance – Phản xạ - Nếu chọn chế độ này cần lắp
thêm bộ phụ kiện đo phản xạ).

Kích chuột vào mục Attachments để mở của sổ khai báo cho các bộ phụ kiện
lắp thêm. Ví dụ: khi ta lắp một khay đặt mẫu loại 6 cell thì phải khai báo loại khay,
khai số cell trong mục Number of cell, sau đó kích chuột vào Initialize để máy xác
nhận sự có mặt của nó.

Tiến hành phép đo:

Đảm bảo trong buồn mẫu không đặt gì.

Kích chuột vào nút Go To WL dể chọn bước sóng mà mẫu phân tích bị hấp thụ
cực đại. Đặt hai cuvet đựng mẫu trắng vào khay kích chuột vào nút Baseline và chờ
máy quét để chuẩn lại đường nền. sau đó đo mẫu, đặt cuvet đựng mẫu cần đo( Sample)
vào khay phía ngoài. Sau đó kích chuột vào nút Start để máy bắt đầu quét.

Xử lý kết quả: ( Phổ có thể vừ quét xong hoặc mở một phổ có sẵn)

Ví dụ sau khi quét xong ta thu được phổ sau:

 Hình 7

Chú ý: Tùy thuộc vào mục đích mà ta sử dụng một hay nhiều chức năng trên.
 Chú ý:

Khi nhấp chuột phải lên cửa sổ chứa phổ, kết quả hay thông số đều hiện ra một
danh sach lệnh cho phép ta tác động lệnh làm thay đổi đặc tính, cho phép ẩn hay
hiện… các phần nằm trong của sổ đó. Nguyên tắc này áp dụng cho tất các chế độ đo.
Ví dụ: Nhấp chuột phải lên của sổ chứa phổ sẽ hiện ra các danh mục sau:

Copy: lệnh này cho phép ta copy phổ sang một chương trình ứng dụng khác.

Auto Scale: tự động đổi giới hạn các tọa độ để phổ hiện ra dể nhìn.

Cross Hair: chuyển con trỏ thành dạng sợi tóc hình dấu cộng, và khi di chuyển
con trỏ các tọa độ sẽ hiện ra ở hai dầu sợi tóc giúp ta đọc được độ hấp thụ tại mỗi bước
sóng.

Customize: sẽ mở ra của sổ cho phép ta thay đổi giới hạn tọa độ, màu đường
phổ ...

Chú ý khác: khi một số menu, của sổ thanh công cụ chứa các nút lệnh bị biến
mất ta cần vào menu View và đánh dấu để hiện lại chúng. Nên đánh dấu tất cả các mục
trong menu View.
 Cửa sổ dưới đây cho phép ta tự chọn peak trên phổ

Thao tác trên của sổ này tương tự như thao tác trên của sổ Peak Pick. Để tính
diện tích một peak nào đó ta có thể tiến hành một trong hai cách sau:

1. Di chuyển đến từng sợi tóc thẳng đứng trên phổ rồi bấm giữ chuột và
rê sợi tóc bên trái đến mép đầu, sợi tóc bên phải đến mép cuối vùng peak. Kết quả sẽ
tự động xuất hiện bên bảng kết quả.

2. Lần lược nhập bước sóng đầu và cuối dải cần tính diện tích vào cột
Start và cột End, và sau đó nhấp chuột vào ô bên cột Erea hoặc Result ta có kết quả.

Có thể nhấp chuột vào mục Color để chọn màu cho từng vùng peak.
  Đo trong chế độ Photometric

( Chế độ định lượng tại một hay nhiều bước sóng, dựng đường cong chuẩn…)

Chọn thông số cho phép đo: Kích chuột vào nút lệnh M sẽ mở của sổ sau:

Các mục quan trọng cần kích chuột để mở của sổ chọn thông số là:
Wavelengths, Measurement Parameters, Calibration, Intrument Parameters.

Mục Wavelength: để nhập bước sóng ta cần đo ứng với mẫu cần phân tích.

Sau đó kích chuột vào nút Add để cộng nó vào danh sách bên dưới.
 Nếu trong mục Wavelength Type ta chọn là Range thì của sổ sẽ hiện ra như
H13. Ta cần nhập bước sóng đầu và cuối dải vào mục WL Start và WL End rồi kích
chuột vào nút lệnh Add để cộng vào danh sách.

Chú ý:

Ta có thể cộng vào danh sách hổn hợp bước sóng dạng điểm ( Point ) và dải
(Range).

Kích chuột vào mục Measurement Parameters sẽ hiện ra của sổ dưới đây cho
phép ta nhập các thông số về việc đo lặp lại ( số lần lặp lại – Sample Repetitions,
khoảng thời gian nghỉ giữa hai lần lập lại liên tiếp… ). Thông thường thì ta bỏ qua cửa
sổ này.

H 14

Kích chuột tiếp vào mục Calibration để chọn các thông số liên quan đến đường
chuẩn ( số điểm chuẩn, đo chuẩn ở bước sóng nào, đơn vị, loại đường chuẩn bậc
mấy…).
 Tiếp đó kích chuột vào vào mục Intrument Parameters để chọn chế độ đo ( hấp
thụ, truyền qua…) và mục Attachments giống như chế độ đo quét.

Sau khi chọn các thông số cho phép đo đã xong ta tiến hành đưa mẫu vào đo. Ví
dụ về phép đo định lượng đường chuẩn 3 điểm có chọn đi qua điểm có chọn di qua
điểm zero như sau:

Tiến hành phép đo:

1. Kiểm tra xem máy UV đã được bật điện và sẳn sàng đo chưa.

2. Trong bản kết quả Standard Table ta lần lược nhập tên của các mẫu chuẩn
vào mục Sample ID và nồng độ của chúng vào mục Conc (mỗi mẫu chuẩn ứng với
một hàng).

3. Trong bảng Standard Table ta chỉ cần nhập tên của các mẫu chưa biết vào
mục Sample ID.

4. Kích chuột vào nút lệnh Go to WL bên dưới màng hình và nhập bước sóng
cần đo ( đây chính là bước sóng mà ta đã nhập trong phần đặt thông số cho phép đo).

5. Đặt hai cuvet cùng đựng “mẫu trắng” vào khay rồi kích chuột lên nút lệnh
Auto Zero bên dưới.

6. Nhấc cuvet bên phía “ chùm tia qua mẫu” ra, đặt cuvet đựng mẫu chuẩn thứ
nhất vào rồi kích chuột vào nút lệnh Start. Máy sẽ đọc và hiện ngay độ hấp thụ lên
bảng Standard Table, đồng thời xuất hiện một điểm trên đồ thị đường cong chuẩn.
 7. Tiếp tục như vậy đối với các mẫu chuẫn còn lại ta sẽ thu được đường cong
chuẩn. Nếu đường cong chuẩn thu được có một số điểm không đạt yêu cầu ta cần loại
chúng ra khỏi đường cong chuẩn bằng cách sau: Pha lại mẫu sau đó kích chuột để
đánh dấu vào mục Ex trong bảng kết quả của chuẩn đó vào một hàng mới trong
Standard Table, đặt mẫu vào rồi kích chuột lên nút lệnh Start để đo lại.

8. Kích chuột vào vị trí bất kỳ trong bảng Sample Table để làm nổi hàng nút
lệnh bên dưới màn hình. Đặt lần lượt các mẫu chưa biết vào và kích nút lệnh Start để
đo. Chương trình sẽ dựa vào đường cong chuẩn và đưa ra nồng độ trong bảng Sample
Table.

Chú ý: Sau khi đo khoảng 3 mẫu ta nên đặt 2 cuvet đựng mẫu trắng vào và tiến
hành Auto Zero.

Xử lý kết quả

Từ đường chuẩn tạo được ta có thể lưu lại, sửa đổi ( như mục 7 bên trên) và mở
ra sử dụng sau này. Tuy nhiên, không nên sử dụng lại đường chuẩn vì điều kiện đo
( sai số do pha mẫu, điều kiện phòng…) giữa các ngày đo rất khác nhau, kết quả sẽ
không chính xác.

Để thêm hay bớt một số cột trong bảng Standard Table hay Sample Table ta
kích chuột phải lên chúng chọn Properties, chọn tiếp Columns sẽ hiện ra của sổ sau:

 Đo trong chế độ Kinetics

Chế độ này thường dùng để đo các mẫu sinh học như enzym, phép đo tiến hành
trong khoảng thời gian dài.
 Đặt thông số phép đo

Kích chuột vào nút lệnh M ở thanh công cụ bên trên sẽ mở ra của sổ sau:

Nếu chọn thời gian là Auto ta cần nhập tổng thời gian đo vào mục Total Time
(đơn vị được mặc định là giây), nhập khoảng thời gian đo nhạy vào mục Activity
Region, nhập bước sóng trong mục Wavelengths ( có thể chọn dạng đơn hay dạng kép
như hình H17). Những mục khác có thể mặc định.

Nếu chọn thời gian đo là Manual của sổ sẽ như sau:

Ta chọn đơn vị trong mục Units, vòng thời gian cho mỗi lần đọc kết quả trong
mục Cycle Time, số lần đọc kết quả trong mục Number of Raedings. Chương trình sẽ
tự động tính ra tổng thời gian đo và hiện ra trong mục Total Time. Còn các mục khác
tương tự như chế độ Auto.

Kích chuột tiếp lên mục Intrument Parameter để chọn chế độ đo trong mục
Measuring Mode. Các mục khác như Sample Preparation, File Options có thể bỏ qua.
Nhấp OK để thoát ra và tiến hành phép đo.

Tiến hành phép đo

Thao tác tương tự như đo ở chế độ Spectrum

Xử lý kết quả

Dưới đây là một ví dụ:

Và cuối cùng là tạo báo cáo và in ra.