Diagnosticul citogenetic

Citogenetica umană începe abia în anul 1956, când Tijo şi Levan au stabilit că numărul corect, diploid de cromozomi ai speciei umane este de 46 şi au descris principalele caractere morfologice ale cromozomilor umani. Caracterizarea morfologică a cromozomilor metafazici are la bază următoarele criterii: lungimea relativă a unui cromozom(raportul dintre suma lungimii braţelor p+q şi lungimea totală a unui set haploid de cromozomi, indicele centromeric (raportul dintre braţul scurt şi lungimea totală a cromozomului ), raportul braţelor(dimensiunea braţului scurt raportată la dimensiunea braţului lung), existenţa sateliţilor, prezenţa constricţiilor secundare, replicarea asincronă a cromozomilor şi modelul de benzi cromosomale. Odată cu punerea la punct a tehnicii de realizare a cariotipului uman , investigarea citogenetică la om a devenit posibilă, permiţând cunoaşterea cauzelor reale pentru oserie întreagă de anomalii datorate diferitelor tipuri de aberaţii cromozomale.S-a descoperit astfel că multe dintre sindroamele a căror etiologie era necunoscută sunt datorate unor modificări ale numărului sau structurii cromozomilor. Exemple: sindromul Down sau trisomia 21 este datorat prezenţei unui cromozom suplimentar din perechea 21, indivizii afectaţi având cariotipul 47,XX(XY)+21. Sindromul Turner este datorat unei aneuploidii heterozomale, indivizii afectaţi având cariotipul 45,XO. În sindromul Klinefelter , investigaţiile citogenetice au evidenţiat numeroase variante în cadrul sindromului. Cea mai frecventă este cea cu cariotipul 47,XXY sau alte variante mai rare 48,XXXY , 49XXXXY , 48XXYY. În afara sindroamelor datorate unor modificări numerice ale cromozomilor , un mare număr de maladii pot fi datorate diferitelor tipuri de aberaţii structurale (translocaţii, deleţii, inversii, duplicaţii, cromozomi inelari, etc.)Simptomele şi gravitatea bolii depind de importanţa genelor plasate pe cromozomul sau cromozomii restructuraţi, de mărimea fragmentului implicat, etc. Tot prin analiza genetică pot fi depistate sindroame de fragilitate sau instabilitate cromozomală cum este anemia Fanconi, sindromul Bloom, ataxia telangiectazia. Fragilitatea cromozomală este datorată unei sensibilităţi crescute la agenţi mutageni, sensibilitate datorată unor deficite în mecanismul reparator al ADN.

Probele fiind celule sau ţesuturi umane vii este normal ca ele să fie purtătoare de floră care aparţine în mod normal corpului uman sau chiar microorganisme patogene. deoarece obţinerea de metafaze depinde de existenţa unor celule în diviziune. Unele microorganisme nu inhibă creşterea celulară dar aderă la lame împreună cu preparatele cromozomale ducând la apariţia unor coloraţii slabe. deoarece microorganismele cresc mai repede decât celulele. Agenţii antivirali nu se folosesc în culturile celulare din laboratoarele de citogenetică.În laborator. care se divid în mod spontan.Condiţii sterile de lucru.au două funcţii de bază : de a furniza substanţele nutritive de a menţine un pH optim . consumă substanţele nutritive din mediu şi produc toxine. Toate ustensilele. dar nici să nu introducem germeni din organismul celui care manipulează culturile. Cele două fungicide folosite cel mai frecvent . timp de 60-90 minute. reactivii şi mediile trebuie să fie sterile. fiind eficiente împotriva multor tulpini bacteriene. . în timp ce recipientele de sticlă pot fi sterilizate în cuptoare la 160˚C . 3. celelalte ţesuturi trebuie cultivate în laborator pentru a da naştere unor populaţii de celule care să se dividă. Cu excepţia celulelor din măduva hematogenă . se autoclavează la 8 atm. gonade sau din stratul citotrofoblastic al vililor corionici. Prezenţa microorganismelor într-o cultură celulară inhibă creşterea celulelor. şi 115˚C. în cultura celulară.Utilizarea antibioticelor şi fungicidelor. atât numărul cât şi concentraţia lor trebuie menţinută la valori minime. Deoarece atât antibioticele cât şi fungicidele pot inhiba creşterea celulelor din cultură. dar niciodată împreună în culturile celulare sunt micostatinul şi amfotericina B (Nistatin ).Culturi de celule umane Cultivarea in vitro a celulelor şi ţesuturilor umane reprezintă un aspect esenţial al diagnosticului citogenetic . Condiţii necesare pentru o creştere optimă a celulelor: 1.Mediile nutritive. 2. sau din mediu.Penicilina şistreptomicina sunt cele mai frecvent introduse împreună în mediile de cultură. timp de 20 de minute.Reactivii lichizi pot fi sterilizaţi prin filtrare cu un filtru microbiologic de 0. toate materialele care pot fi degradate de temperaturi prea ridicate.În unele laboratoare se folosesc kanamicina şi/sau streptomicina care au şi o activitate antimicoplasmică.22 μm. Este bine să se evite ca aceste microorganisme să nu poată contamina persoanele care manipulează culturile .

Temperatura. 5. Dintre aceşti aditivi care trebuie adăugaţi mediilor de cultură fac parte: • ser sau înlocuitori ai serului-rolul precis nu se cunoaşte . Temperatura optimă de creştere a celulelor umane este de 37˚C. fără fluctuaţii mai mari de 0. Alegerea unui anumit tip de incubator depinde de tipul de cultură închisă sau deschisă pe care vrem să-l realizăm În cazul în care vom folosi culturi închise. mediile McCoy 5A.dar este evident că în lipsa serului sau a înlocuitorului .Incubatoare. Pot fi folosite atât serul bovin cât şi serul uman obţinut din sânge uman grupa AB . care poate fi depăşită prin umidificarea aerului. deci culturile de celule umane trebuie ţinute în incubatoare sau incinte în care temperatura se menţine constantă . factori de aderenţă . RPMI 1640.4. celulele nu cresc rapid în cultură. •L-glutamina care este instabilă în soluţie şi se adaugă mediului cu puţin timp înainte de folosirea lui. Leibovitz L-15. Şi evaporarea poate fi o problemă. Creşterea celulelor umane în cultură este optimă la un pH de 7.Cea mai mare parte a acestor medii bazale au nevoie de compuşi suplimentari pentru a funcţiona ca medii de cultură complete. În acest fel se asigură un pH constant . vitamine şi factori de creştere se obţine un mediu de cultură bazal. alese în funcţie de experienţă sau preferinţa personală. . 4. •Antibiotice şi antifungice •Soluţiile tampon. O cultură deschisă necesită un incubator cu CO2 .Există şi o serie de înlocuitori sub forma unor soluţii ce conţin factori de creştere celulară . izoosmolaritate şi sursă de energie.2-7. la care se adaugă o combinaţie de săruri şi glucoză. Cel de-al doilea tip de tampon prezintă avantajul că nu necesită îmbogăţirea în CO2 a atmosferei din incubator şi face posibilă utilizarea unor vase de cultură închise ermetic. Din combinaţia unei astfel de soluţii tampon cu diferiţi aminoacizi. Ham. La ora actuală există o serie de medii bazale care sunt frecvent utilizate în culturile de celule umane : mediul minimal esenţial. hormoni.La baza majorităţii mediilor de cultură stau soluţiile tampon fosfat . Tamponul fosfat are şi rolul de a dizolva anumiţi aditivi cum sunt tripsina şi colcemidul. urme de elemente minerale. etc. un incubator simplu este suficient. vitamine.3˚C. 199. Cele mai utilizate sisteme tampon sunt bicarbonatul de sodiu şi soluţia tampon Hepes.

solutie hipotonica de KCl (0. iar proliferarea celulelor din cultură se realizează cu agenţi mitogeni.075M şi se lasă la termostat la 37-38˚C timp de 15-30 min. data şi ora şi se introduc în termostat . • după 70-90 ore de la iniţierea culturii în fiecare vas se adaugă 0. Utilizarea pe scară largă a culturilor de limfocite se explică prin aceea că sângele este unul dintre ţesuturile cele mai accesibile. frecvenţa lor în populaţie şi efectele fenotipice. Limfocitele au un ciclu celular bine caracterizat. • conţinutul fiecărui vas de cultură se trece apoi în eprubeta de centrifugă şi se centrifugheaza 10-15 min la 400-500 g.1-0. • în fiecare flacon se adaugă 0.5-1.Astfel de culturi de celule umane sunt: I.g/ml) L-Glutamina (200 mM) colcemid sau colchicina. Materiale necesare: ▪ • • • • • • • • mediu de cultura RPMI 1640 sau Ham F 10 sau IC-65 ser fetal bovin sau ser uman din grupa AB PHAa penicilina (5000 UI/ml) streptomicina ( 5000 p. înainte de efectuarea acestui tratament soluţia hipotonică se încălzeşte la 37-40°C. • se prelevează plasma cu o pipetă sterilă şi se repartizează câte 0. care conţin 10 ml mediu de cultură îmbogăţit cu 10-15% ser uman AB sau ser de viţel.5ml în flacoane sau eprubete de cultură de 30-40 ml. • se notează flacoanele cu numele individului de la care s-a recoltat sângele.iar sedimentul celular se resuspendă în soluţie hipotonică de KCl 0.2 ml colchicină 0. în 2-3 zile se pot obţine preparate cromozomale de foarte bună calitate.1-0.2 ml solutie de PHAa şi se amestecă uşor . Cei mai utilizaţi mitogeni pentru culturile de limfocite sunt PHAa (fitohemaglutinina A ) şi virusul Epstein-Barr. după care: • se centrifughează 10 minute la 200-300g.Metoda standard. la 37-37.002% şi se lasă la terrnostat 1-2 ore. . Metoda de lucru: Se prelevează 5-10 ml sânge venos într-o seringă sterilă umezită cu heparină iar apoi se trece sângele într-o eprubetă sterila în care se lasă timp de 2-3 ore la o temperatură de 4-5˚C (la frigider}.5°C timp de 3-4 zile.Ca urmare. fixator ( 3 parti metanol : 1 parte acid acetic glacial). • se înlătură supernatantul . I .Culturile de limfocite care furnizează informaţii importante privitoare la aberaţiile cromozomiale.075 M).

Metoda cu timidină Materiale necesare: • • • ▪ • • mediu de cultură RPMI. ser fetal bovin PHAa penicilina (5000 UI/ml) streptomicina (5000 gg/ml) L-glutamina (200 mM) 10% 2. • cu o pipetă Pasteur se aspiră suspensia celulară şi se picură pe fiecare lamă (bine curăţată şi rece). Ele sunt necesare pentru identificarea unor aberaţii cromozomale (deleţii. iar apoi se mai adaugă 4-5 ml fixator.În acest scop ele trebuie curăţate cu eter şi apoi introduse într-un vas cu alcool absolut în care s-au adăugat câteva picături de HCl. la început se picură 1-2 ml fixator. se înlătură supernatantul şi se adaugă fixatorul.5% 1% 1% 1% . fixarea . • după fixare se introduc la frigider la 4°C timp de 30 minute. fixarea este facilitată de introducerea tuburilor în care s-a adăugat fixatorul în frigider. se înlătură fixatorul vechi şi se adaugă fixator proaspăt. Dacă sunt prea puţine metafaze se prelucrează şi al doilea flacon după 4 zile de cultură. picătură cu picătură pentru a împiedica aglomerarea celulelor în grămezi. II ..• se centrifughează 10-15 minute la 400-500g. • la ultima fixare se adaugă o cantitate redusă de fixator (0. de la 10-15 cm câte 3-4 picături fără ca acestea să se suprapună. a).este important ca fixatorul să fie adaugat foarte încet. curăţarea lamelor de sticlă . • se centrifughează. Pentru fiecare subiect cultura se iniţiază în două vase de cultură pentru siguranţa reuşitei şi pentru obţinerea unui număr suficient de mare de metafaze. agitându-se eprubeta pentru a favoriza o bună dispersie a celulelor. • preparatele se aşează pe hârtie de filtru şi se lasă să se usuce la aer.Metode de obţinere a unor preparate cromozomale de înaltă calitate Aceste metode permit identificarea şi analiza unui număr sporit de subbenzi cromozomale comparativ cu metoda standard.pentru o buna dispersie a cromozomilor este important ca lamele de sticlă pe care se efectuează preparatele să fie foarte curate. b.5-l ml) pentru a se obţine o suspensie celulară convenabilă pentru efectuarea preparatelor. • se efectuează trei fixări succesive la interval de 30 minute. duplicaţii. O serie de factori s-au dovedit a fi foarte importanţi pentru obţinerea unor preparate cromozomale satisfăcătoare. Efectuarea preparatelor se face dintr-un flacon după 3 zile de cultură. inversii) ce implică fragmente cromatidice mici şi care nu pot fi detectate prin tehnicile de rutină. Cei mai importanţi sunt: a.

• se îndepărtează supernatantul şi se resuspendă sedimentul în 7 ml mediu de cultură preîncălzit după care se incubează la 37°C timp de 3 ore şi 45minute.075 M şi se incubează la 37ºC. ▪ se adaugă 0. b). ▪ se centrifughează la 400g timp de 8 minute.• • • • colcemid (10 μg/ml) solutie hipotonică de KCl (0. Metoda de lucru • se introduc 0. ▪ se adaugă 0. fixator (3 părţi metanol : 1 parte acid acetic glacial). 16 ore. ▪ se centrifughează la 400g timp de 8 minute.02 ml colcemid (concentraţie finală de 0. Bromura de etidiu trebuie păstrată la temperatura camerei într-un vas de culoare închisă.4 ml (8 picături dintr-o pipetă Pasteur) de sânge într-un recipient ce conţine 7 ml mediu de cultură şi se incubează la 37˚C timp de 48 ore. se resuspendă sedimentul în 7 ml TPS Dulbecco preîncălzit la 37˚C şi se centrifughează la 400g timp de 8 minute. ▪ se îndepărtează supernatantul.2 ml soluţie colcemid şi se incubează la 37ºC 15 minute .075 M). . ▪ ultimul pas se mai repetă de 2 ori . cu excepţia faptului că în loc de timidină se foloseşte bromura de etidiu într-o concentraţie finală de 10μg/ml care se adaugă împreună cu 0. 5 minute. • se îndepărtează supernatantul. Suspensia de celule astfel obţinută poate fi păstrată la -20ºC până când sunt pregătite lamele. • se transferă conţinutul vaselor de cultură în eprubete de centrifugă şi se centrifughează la 400g timp de 8 minute.2 ml timidină în fiecare vas de cultură şi se incubează la 37˚C. ▪ se îndepărtează supernatantul şi se adaugă picătură cu picătură 5ml de fixator proaspăt şi se centrifughează la 400g timp de 8 minute. timidină 1 g/67 ml tampon fosfat salin (TPS) Dulbecco.metoda cu bromură de etidiu Această metodă este similară celei descrise mai sus . iar sedimentul se resuspendă în 7 ml KCl 0.02μg/ml).

5mm2. când se impun investigaţii din mai multe tipuri de ţesuturi. dar se pot utiliza şi alte zone. Acestea din urmă sunt distribuite în vase de cultură sterile. Se introduc apoi vasele la incubat. ▪ser fetal bovin sau ser uman din grupa AB ▪ PHAa ▪penicilină(5000UI/ml0 ▪streptomicină ( 5000μg/ml) ▪L-Glutamină (200 mM) Metoda de lucru Pentru iniţierea culturii se efectuează biopsia de piele. Se urmăreşte proliferarea celulelor. Ham F10 sau IC-65. iar cu o pensă sterilă se prinde o suprafaţă mică ce se ridică şi se taie cu o foarfecă bine ascuţită şi sterilă sau cu un bisturiu. -în boli hematologice. Peste aceste fragmente se adaugă încet 10 ml mediu de cultură. Porţiunea de piele aleasă se dezinfectează cu un tampon cu spirt.Culturi de fibroblaste obţinute din piele umană Cultura de fibroblaste este necesară: -în studiul mozaicurilor.II. Pentru iniţierea culturii este suficient un fragment de piele cu o suprafaţă de aproximativ 4 mm2. Iniţierea culturilor Materiale necesare: ▪mediu de cultură bazal RPMI 1640. la 37°C. iar după formarea monostratului celular se iau măsuri de subcultivare. . Bucăţica de piele este tăiată apoi în fragmente mai mici cu o mărime de cca. dacă se observă un cariotip anormal în celulele medulare sau în limfocite. Aceasta se face de obicei la nivelul antebraţului. În locul pensei se poate folosi un ac steril cu care se perforează pielea şi se ridică. în atmosferă umedă şi suplimentată cu 5% CO2. unde se presează pe pereţi cu o spatulă sterilă. -pentru determinarea cariotipurilor unor nou-născuţi malformaţi care au murit înainte de analiza citogenetica a culturilor de limfocite. 0.

▪ se îndepărtează supernatantul şi se suspendă peletul în câteva picături de fixator . ▪ se transferă suspensia celulară într-un tub de centrifugă. cu 2-4 ore înainte de realizarea preparatelor se adaugă 0. • fixator (metanol 3 parti : 1 parte ac. suspensia poate fi pastrată sub această formă la -20°C dacă preparatele nu se efectuează imediat. ▪ se bat uşor pereţii vasului de cultură pentru a desprinde celulele. ▪ se efectuează preparatele după metoda picăturii pe lamele curate şi reci. . ▪ cu o pipetă Pasteur se adaugă aproximativ 10 picături de fixator rece. ▪ ▪ când celulele plutesc liber în rnediu se adaugă 2 ml din amestecul de ser fetal bovin cu apă.. stoc 0.Realizarea preparatelor cromozomale Materiale necesare • colcemid sol. • tripsină sol. • ser fetal bovin cu apa 1:9. se spală celulele cu 1 ml versen. se centrifughează la 150g timp de 10 min. urmărindu-se cu microscopul inversat la o mărire de 1000x dacă celulele s-au desprins de pe pereţi . Metoda de lucru • • • • cu 24 ore inainte se schirnbă mediul de cultură. • versen sol. se mai adaugă un supliment de 2 ml mediu de cultură şi se incubează la 37°C timp de 20 min. se îndepărtează mediul de cultură. stoc 10μg/ml.1 ml colcemid. acetic glacial) proaspăt preparat.25%. stoc 1:5000..

dar majoritatea vor fi moarte. Numărul de celule fetale din lichidul amniotic variază în funcţie de vârsta sarcinii. . iar şansa de a reuşi cultura este uşor diminuată. în funcţie de etapa de gestaţie. -familii în care există cazuri de indivizi afectaţi de sindromul cu sit fragil în X sau alte tulburări ce implică existenţa unui cromozom X restructurat. din piele. unele ar putea proveni din vili corionici. în timp ce o probă preluata la 20 de săptămâni va avea mai multe celule. -cupluri fenotipic normale. lichidul amniotic şi vilii corionici. Pot apărea ocazional şi celule din sângele fetal. ce se vor repartiza în mod egal în două tuburi (câte 10 ml/tub). aparat urogenital. dar la care unul sau ambii parteneri prezintă restructurări cromozomale balansate. caz în care vor putea fi cultivate separat. sistem respirator sau digestiv. uşor opac. Se indică îndepărtarea din lichidul amniotic a cheagurilor sau a fragmentelor de ţesuturi solide. Exemplificăm cu culturi celulare din lichidul amniotic : Lichidul amniotic se recoltează de obicei în a 12-a saptamană de sarcină. Dacă proba se recoltează în a 12-a săptămâna.femei a căror vârstă avansată (peste 35 ani) reprezintă un factor de risc pentru disjuncţia crornozomală. 20 ml. Acestea din urmă vor fi examinate la microscopul inversat deoarece. Ţesuturile cele mai frecvent folosite pentru diagnosticul prenatal al aberaţiilor cromozamale sunt reprezentate de sângele fetal. Lichidul amniotic este în mod normal gălbui. ea va fi de cca. în funcţie de densitatea celulelor. -cupluri cu cariotip normal. Uneori lichidul amniotic poate avea o culoare maronie datorată unei hemoragii ce a avut în primele faze ale sarcinii şi a fost urmată de hemoliza acestor celule "bătrâne". iar pe măsură ce vârsta avansează acestea nu mai sunt viabile. diagnosticul prenatal este indicat în primul rând pentru: . Înseamnă că o probă de lichid amniotic recoltată la 12 săptămâni de sarcină poate avea un strat subţire de celule după centrifugare. ca şi de faptul că analizele de laborator implică tehnici al căror cost este ridicat.Ţinând cont de acest aspect. Tuburile în care se recoltează probele treduie să fie sterile şi de preferinţă se evită transvazarea. timpul de creştere în cultură este un pic mai mare. -cazuri în care examinarea cu ultrasunete sugerează existenţa unei afecţiuni fetale ce ar putea fi datorată unei aberaţii cromazomale. ea nu trebuie să depăşească 10 ml (cate 5 ml/tub). Deşi acest risc este relativ mic. el este semnificativ pentru sarcină. El conţine o populaţie heterogenă de celule ce provin.Când conţine cheaguri de sânge se impune determinarea în laboratoare hematologice a provenienţei acestora (maternă sau fetală).Culturi de celule pentru diagnosticul prenatal Tehnicile de recoltare a probelor pentru detectarea prenatală a unor aberaţii cromozomale prezintă un anumit risc. dar majoritatea lor vor fi viabile. Pentru transport tuburile nu se împachetează în gheaţă.III. În cazul acestor probe sângerii sau brune. dar care au mai avut copii trisomici şi/sau au în familie rude cu trisomii. ce cresc riscul de apariţie al unor gameţi neechiliraţi genetic.Când proba se ia în a 15-a săptămână de sarcină.

Mediul de cultură se poate schimba complet sau pe jumătate. 0. schimbarea mediului se efectuează de două ori pe săptămână. În situaţia în care creşterea celulelor nu este afectată.Materiade necesare pentru iniţierea culturilor : Mediul de cultură cel mai frecvent folosit este mediul Ham F10 care se prepara din: • amestec nutritiv Ham F 10 ▪ ser fetal bovin ▪ ultraser G ▪ L-glutamina 200Mm ▪ penicilina 10. se poate îndepărta mediul şi spăla celulele de câteva ori în tampon fosfat cu antibiotice. fără a interveni. cel puţin 6 zile. la intervale de 6-8 zile. Astfel. înseamnă că celulele sunt moarte şi cultura poate fi abandonată. ▪se îndepartează supernatantul până la cca. Majoritatea specialiştilor preferă varianta în care cele două probe provenite de la acelaşi individ se pun nu numai în vase diferite. De obicei. Dacă la 10-14 zile de la iniţierea culturilor nu începe crşterea celulară se va recolta o nouă probă. culturiIe pot fi deja apte pentru efectuarea preparatelor. după care se adaugă 100 ml 20 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml (nu se pune în culturi deschise) . în timp ce în altele. ▪se incubează culturile la 37°C. Culturile se lasă nederanjate.5ml deasupra peletului. cultura infectată poate fi aruncată. Dacă dublura culturii evoluează normal. dar şi în tranşe diferite de mediu de cultură şi în incubatoare diferite. ▪se transferă supernatantul în tuburi pentru testarea alfa-fetoproteinei şi a acetilcolinesterazei. Uneori pot apărea variaţii în ceea ce priveşte ritmul de creştere al celulelor din cultură.000 UI/ml ▪ nistatin 1000 μg/ml ▪ tampon Hepes 1 M Metoda de lucru pentru iniţierea culturilor: ▪se centrifugheaza probele la 200g timp de 10 min. ▪se resuspendă peletul într-o cantitate de mediu corespunzătoare vasului în care se realizează cultura. Dacă nu. la o mărire de 1000x. Când cultura este foarte preţioasă şi s-a infectat. se verifică dacă celulele mai sunt ataşate la suprafaţa vasului de cultură. în unele vase este posibil să nu apară semne de creştere celulară. Infectarea culturilor se evidenţiază prin tulburarea mediului de cultură şi apariţia microorganismelor care pot fi observate la microscopul inversat. după care se poate urmări creşterea celulară la un microscop inversat cu o mărire de 100x.. Pentru culturile deschise se utilizează un incubator cu posibilitate de suplimentare a aerului cu 5% CO2 şi cu o sursă de umidificare.

blocarea diviziunii celulare în metafază. • se bat uşor pereţii vasului pentru a desprinde celulele. Materiale necesare: • colcemid SOX. • cu o pipetă Pasteur se adaugă aproximativ 10 picături de fixator rece. • versen sol. • ser fetal bovin cu apă 1:9. stoc 10 ~Iglm1. urmărindu-se cu microscop inversat la o mărire de 1000x dacă celulele s-au desprins. • se spală celulele cu 1 ml versen. • cu 2-4 ore înainte de realizarea preparatelor se adaugă 0.25%. Realizarea preparatelor Principalele etape care trebuie parcurse în realizarea preparatelor sunt : 1.1 ml colcemid. Este de preferat ca acele culturi care au fost infectate să fie plasate într-un alt incubator. • tripsină sol. 2. • fixator (metanol 3 părţi :1 parte ac.mediu de cultură nou. se mai adaugă un supliment de 2 ml de mediu de cultură şi se incubează la 37°C timp de 20 minute. fixarea celulelor. stoc 1:5000. cu colcemid . stoc 0. tratamentul hipotonic pentru umflarea celulelor. • se transferă suspensia celulară într-un tub de centrifugă. Metoda de lucru: • cu 24 ore înainte se schimbă mediul de cultură. • când celulele plutesc libere în mediu se adaugă 2 ml din amestecul de ser fetal bovin cu apă. • se centrifughează la 150g timp de 10 min. acetic glacial) proaspăt preparat. folosind KCl 3. • se îndepărtează mediul de cultură. . separat de culturile sănătoase.

suspensia poate fi păstrată sub această formă la -20°C dacă preparatele nu se efectuează imediat. eventual moartea celulară.care previne scurtarea progresivă a telomerelor care este implicată în îmbătrânirea . Un tip de cultură celulară celebră este HeLa. utilizată în cercetarea medicală. celulele HeLa ocolesc limita Hayflick. Liniile de celule HeLa sunt utilizate pentru cercetări în domeniul cancerului. Celulele HeLa se numesc „nemuritoare” deoarece ele se pot divide de un număr nelimitat de ori atât timp cât condiţiile necesare supravieţuirii celulare sunt asigurate.În acest mod. culturile din sânge fetal sau provenit de la nou-născuţi sau alte tipuri de culturi celulare pentru diagnostice speciale. Aceste tipuri de culturi celulare umane nu sunt singurele practicate în laborator.• se indepărtează supernatantul şi se resuspendă peletul în câteva picături de fixator . au o versiune activă a telomerazei în timpul diviziunii celulare. sunt doar exemple . în cazul studierii leucemiei granulocitare cronice sau a leucemiei limfocitare cronice. • se efectuează preparatele după metoda picăturii pe lamele curate şi reci. Linia de cultură derivă din celulele de cancer cervical prelevate de la Henrietta Lacks.cred eu ilustrative în ceea ce priveşte subiectul culturilor celulare. Aceste celule se divid anormal de rapid. care a murit de acest cancer în 4octombrie 1951.O problemă interesantă este cea a producerii şi întreţinerii unor linii celulare limfoblastice sau a culturilor de celule din măduva hematogenă sau din ganglionii limfatici. . adică numărul limitat de diviziuni celulare pe care cele mai multe tipuri de celule le pot parcurge înaintede moartea celulară în cultură.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful