INDICE BIOMEDICINA Caracterización molecular de cepas y vectores de Trypanosoma cruzi del Estado de Veracruz. .................

85 Clonación de un fragmento del gene que codifica para la proteína NS3 de los 4 serotipos del virus dengue ............................................................................................................................................................... 54 Confirmacion diagnostica de Virus Del Papiloma Humano (VPH) en biopsias de cervix, mediante reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). ........................................................................................................ 20 Detección de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae en especímenes genitourinarios mediante PCR Múltiple .......................................................................................................................................... 49 Detección de clonas de Staphylococcus aureus meticilino resistentes (MRSA) en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz (HRV) ...................................................................................................... 26 Diagnóstico molecular de dengue .............................................................................................................. 32 Efecto del extracto polar de moussonia deppeana sobre la proliferación y la viabilidad de la línea celular de cáncer de próstata lncaP. .................................................................................................................. 74 Efectos bioclínicos de la obesidad y la inducción de la diabetes en la rata Wistar hembra ......................... 79 Evaluacion de la eficiencia del metodo de conservacion de microorganismos en papel filtro .................... 11 Evaluación del efecto de catequina y epicatequina de theobroma cacao sobre las líneas mda-mb 231 y bt474 de cáncer de mama ........................................................................................................................ 45 Evaluación del efecto de oxiesteroles dietarios sobre el perfil de lípidos de la membrana plasmática en hepatocitos de rata wistar. .................................................................................................................... 15 Evaluación del efecto del Ácido Linoleico Conjugado (CLA) dietario sobre el estrés oxidativo en ratas con síndrome metabólico e hígado graso. ...................................................................................................... 3 Evaluación del potencial adyuvante de un toxoide derivado de Listeriolisina O sobre células presentadoras de antígeno humanas............................................................................................................................. 94 Identificación de receptores de Angiotensina II y caveolina-1 en cordón umbilical y células endoteliales de cordón umbilical (HUVECs) de pacientes preeclámpticas ....................................................................... 40 Identificación de una zona con alta seroprevalencia de infección por Trypanosoma cruzi en la zona centro del Estado de Veracruz ........................................................................................................................... 89 Inmunopatogenia en 200 pacientes con dengue ...................................................................................... 36 Interleucina 17A e IL-17F, nuevos mediadores inflamatorios en la infección por virus del Dengue .............. 7 Mutaciones en genes asociados a resistencia a RIfampicina y Etambutol, en cepas de pacientes con Tuberculosis Drogorresistente ............................................................................................................... 63

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Numero de eosinofilos en mucosa esofógica de pacientes con esofagitis eosinofilica, esofagitis erosiva, enfermedad por reflujo no erosivo y controles asintomático. Un estudio en pacientes mexicanos. ...... 69 Patron de susceptibilidad de microorganismos aislados en urocultivos en la unidad de servicios analiticos de salud bioanalisis (usasb). Enero 2007, dicembre 2009 Xalapa Veracruz ............................................. 98 Variación de la respuesta a un estimulo doloroso en ratas Wistar con ansiedad inducida bajo un estimulo externo. ................................................................................................................................................. 59

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EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL ÁCIDO LINOLEICO CONJUGADO (CLA) DIETARIO SOBRE EL ESTRÉS
OXIDATIVO EN RATAS CON SÍNDROME METABÓLICO E HÍGADO GRASO
Yohevet Romero Sarmiento Alfonso Alexander Aguilera. Ida Soto Rodríguez Agustín Arzaba Villalba Hugo Sergio García Galindo

Marco teórico:
El hígado graso no alcohólico (HGNA) se define como la acumulación de grasa macrovesicular en el hígado que excede 5 al 10% del mismo que puede asociarse a grados variables de inflamación lobulillar con o sin fibrosis(1). Esta condición puede desencadenar a una cirrosis hepática. El síndrome metabólico y sus manifestaciones clínicas como la obesidad y la diabetes son los dos factores de riesgo más importantes para desarrollar hígado graso. Aproximadamente un 80% de las personas obesas tienen hígado graso, en la gran mayoría asociada a síndrome metabólico. La resistencia a la insulina es el mecanismo fisiopatológico de estas alteraciones y que determina que la grasa se acumule fuera del tejido adiposo. El estrés oxidativo es el otro y

segundo evento celular en su progresión a esteatosis, esteatohepatitis y fibrosis, el cual se define como la exposición inadecuada a especies reactivas de oxígeno (ROS) y el resultado del desequilibrio entre compuestos prooxidantes y antioxidantes que conduce al daño por muerte celular y tisular. En la actualidad no existe tratamiento específico y han sido utilizados aquellos que revierten el estado de resistencia a la insulina. El tratamiento dietoterapéutico juega un papel fundamental. El ácido linoleico conjugado (CLA) es una mezcla de isómeros del ácido linoleico (cis-9, cis-12-octodecadienoico) que poseen sus dobles enlaces en posición conjugada (principalmente 9, 11 ó 10, 12), ha sido considerado recientemente como compuestos nutracéuticos, en los cuales el CLA ha mostrado un amplio rango de efectos

Estudiante de Maestría Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos Instituto Tecnológico de Veracruz yohevet_romero@hotmail.com

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biológicos: anticancerígenos, antiateroscleróticos y antioxidantes. Actualmente no se conoce el efecto dietario que el CLA tiene sobre la inhibición del desarrollo de hígado graso específicamente sobre el estrés oxidativo hepático(5,6,7).

ratas con hígado graso, que muestre el potencial dietoterapéutico en esta enfermedad en un modelo animal.

Metodología:
Se realizó un estudio experimental en dos etapas, primero se llevó a cabo la inducción del síndrome metabólico e hígado graso en ratas wistar macho recién destetadas, utilizando sacarosa al 30% en agua para beber (ad libitum) durante 9 semanas; posterior al tratamiento experimental se determinaron los marcadores de daño hepático (AST y ALT) y análisis histológico para el diagnóstico de esteatosis. La segunda etapa consistió en la evaluación del efecto del CLA bajo un diseño experimental completamente al azar, formado por 4 grupos: testigo (T), experimental (CLA)reciebiendo el aporte del compuesto en estudio, Hígado graso (HG)recibend aporte de aceite vegetal el cual es incapaz de revertir a la normalidad a estos roedores y en donde se mantienen las condiciones de daño hepático y el grupo ingesta previa de IP-CLA (el cual recibió CLA desde el inicio ingesta de sacarosa simultáneamente al tratamiento experimentación CLA). Se determinaron los marcadores de estrés oxidativo (SOD, GSH-PX y TBARS) en suero y en homogenizado de hígado bajo el efecto del CLA dietario para evaluar los efectos sobre este mecanismo del hepatocito.

Planteamiento del problema:
El CLA ha sido utilizado para evaluar su efecto dietoterapéutico sobre la fisiopatología del síndrome metabólico en modelos animales y humanos; aunque existen estudios sobre el efecto que tiene en el mecanismo de resistencia a la insulina, se desconocen los efectos sobre los marcadores celulares de estrés oxidativo como base fisiopatológica del desarrollo del hígado graso no alcohólico, en el cual participan las enzimas alanin-aminotransferasa (ALT) y apartato-aminotranferasa (AST) como indicadoras de daño hepático y la superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSHPX) y compuestos reactantes al ácido tiobarbituricos (TBARS) como indicadores de la presencia de compuestos prooxidantes hepáticos. En base a lo antes expuesto, el planteamiento del problema se basa en el siguiente cuestionamiento ¿cuál es el efecto del CLA dietario sobre los marcadores de estrés oxidativo en ratas con hígado graso no alcohólico, como agente nutracéutico con potencial dietoterapéutico?.

Objetivo General:
Evaluar el efecto del ácido linoleico conjugado (CLA) dietario sobre los marcadores de estrés oxidativo a nivel tisular: superóxido dismutasa (SOD), glutatión peroxidasa (GSH-PX) y compuestos reactantes al ácido tiobarbiturico (TBARS) en

Resultados:
Se obtuvo la inducción de hígado graso en el modelo utilizado caracterizado por el aumento del peso corporal de los roedores y los parametros metabólicos que caracterizan al síndrome metabólico; se presentaron

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alteraciones en los marcadores de daño hepático tanto en suero como en el homogenizado de tejido hepático. La AST y AST mostraron concentraciones mayores en el grupo Higado Graso (HG) (78.67 ± 3.62 U/L vs 20.16 ± 1.81 U/L; p<0.05 y 68.11 ± 3.62 U/L vs 35.00 ± 0.81 U/L; p<0.05), asociado a alteraciones histológicas hepáticas compatibles con hepatomegalia y esteatosis caracterizada por un aumento de vesiculas de grasa y alteraciones del parenquima hepatico como destrucción de los sinusoides y la arquitectura del lobulillo hepático. El efecto del CLA durante 7 semanas de tratamiento experimental, mostró que las enzimas antioxidantes aumentaron en el grupo recibiendo el aporte del CLA con respecto al grupo Higado Graso (HG) que se mostraron disminuidos; para GSH-PX(11.915 ± 0.463 U/mg prot. vs 8.930 ± 0.625 U/mg prot; p<0.05)y para SOD(78.77 ± 6.56 U/mg prot. vs 43.36 ± 17.5 U/mg prot; p<0.05). Los niveles de éstas enzimas se mantuvieron normales en el grupo que recibió una ingesta previa de CLA con respecto al grupo Testigo Sano, para GSH-PX(16.264 ±1.691 vs 17.983 ± 1.150)y para SOD (80.09 ± 8.02 vs 92.00 ± 4.14). Los compuestos reactantes al acido tiobarbíturico (TBARS) como indicador de estrés oxidativo en suero e hígado fueron normales en los roedores del grupo recibiendo el aporte del CLA, mientras que fueron significativamente mayores en el grupo de roedores con hígado graso.

posterior catabolismo en mitocondrias por beta oxidación, todo ello genera especies reactivas de oxigeno (ROS) como indicador de estrés oxidativo celular, a la vez de una marcada disminución de las enzimas antioxidantes como la SOD y GSH-PX; sin embargo algunos estudios muestran, que algunos ácidos grasos dietarios como los omega 3 influyen sobre la expresión de genes que codifican para algunas enzimas y receptores celulares(2,3,4). El CLA es un regulador de la expresión de algunos genes de resistencia a la insulina y pudiera estar regulando la expresión de las enzimas de estrés oxidativo, dado el aumento encontrado de las mismas en los roedores recibiéndolo como aporte de CLA dietario, con respecto al grupo que desarrolló hígado graso y que mantiene niveles muy bajos de SOD y GSH-PX y aumento de especies reactivas de oxígeno tanto en suero como en el tejido hepático.

Conclusión:
El CLA dietario mostró un efecto benéfico sobre los niveles de marcadores de hígado graso (AST y ALT) y estrés oxidativo (SOD y GSH-PX,) caracterizado por reversión a concentraciones normales tanto en suero como en tejido hepático de las enzimas con actividad antioxidante estudiadas; mostrando de esta forma, su potencial dietoterapéutico como auxiliar en el tratamiento de hígado graso en este modelo animal de la enfermedad.

Discusión:
La acumulación de grasa en el hígado cambia sus condiciones fisiológicas y metabólicas, aumenta el acortamiento de las cadenas de ácidos grasos en peroxisomas para su

Referencias Bibliográficas:
1. Evan S.S, Mrak A.R. Imaging of Hepatic Steatosis. Sem. Liv. Dis. 2001; 1:71-80.

5

2. Foschini , et al. Identificaction of mitocondria in liver biopsies. Virchows Arch. 1998; 267-273. 3. Harrison SA, Di Bisceglie AM. Avances en la comprensión y el tratamiento del hígado graso no alcoholico. 2003; Drugs 63(22): 23792394. 4. Kumar NS, et al. Oxidative stress in experimental liver microvesicular steatosis: Role of mitochondria and peroxisomes. Hepatology. 2006; 1240-1249.

5. Morales SA, Arrese JM. Hígado graso no alcohólico: Patogenia y tratamiento. 2008; 19(2):96-100. 6. Prieto I, et al. Tumor Necrosis Factor alpha, interleukin-1 beta and nitric oxide: induction of liver megamitochondria in prehepatic portal hypertensive rats. World J Surg. 2005; 29:903-908. 7. Valera JMM. Enfermedad por hígado graso no alcoholic, opciones terapéuticas. 2006. Gastr. Latinoam. 17(2):191-193.

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INTERLEUCINA 17A E IL-17F, NUEVOS MEDIADORES
INFLAMATORIOS EN LA INFECCIÓN POR VIRUS DEL

DENGUE
Fatima del Rocío Sánchez Vega César Iván Berzunza Huerta José Zarrabal Meza Maria Teresa Martinez Cázares Aurora Parissi Crivelli Héctor Vivanco Cid

Marco teórico:
Los Flavivirus son un grupo de patógenos con un alto impacto en la salud pública mundial, debido a su amplia distribución y su capacidad para causar enfermedades con tasas elevadas de morbilidad y mortalidad en humanos. Más de 75 diferentes Flavivirus han sido identificados a la fecha y aproximadamente la mitad de los mismos son capaces de causar enfermedad en seres humanos (1). Dentro de este género se ubica el virus del Dengue, el cual es considerado un patógeno re-emergente debido a que en las últimas dos décadas, la incidencia de enfermedades provocadas por este, han aumentado a un ritmo alarmante. Más de 2500 millones de personas, es decir, más de dos quintas partes de la población mundial viven en zonas de riesgo para Dengue y más de 100 países han informado de la presencia de esta enfermedad en su territorio (2). La Región de las Américas ha sido una de las más afectadas por la forma clásica o fiebre

por Dengue y su forma más grave, el Dengue Hemorrágico (DH). La enfermedad es transmitida a humanos a través de la picadura del mosquito Aedes aegypti, que es el principal vector. Otras especies de Aedes tales como A. albopictus y A. polynesiensis también han sido implicados en la transmisión. Pueden distinguirse cuatro serotipos antigénicamente relacionados del virus Dengue denominados como Dengue 1, 2, 3 y 4. La infección primaria se presenta en un individuo no sensibilizado previamente o bien en aquellos que ya han estado expuestos al contacto previo con algún serotipo y que contraen una nueva infección (infección secundaria) con otro serotipo diferente. La infección en el humano causa un espectro de manifestaciones que van desde sudoración, desarrollo de un cuadro febril, el cual de manera relevante se asocia con viremia, dolor de cabeza intenso, mialgias, artralgias, exantema, hasta cuadros más severos tales como DH o el síndrome de choque por Dengue (SCHD), las cuales

Estudiante de Licenciatura INSTITUTO DE INVESTIGACIONES MEDICO BIOLOGICAS UNIVERSIDAD VERACRUZANA vivacid@hotmail.com

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constituyen las complicaciones más severas (3,4). El DH y el SCHD son definidos por un conjunto de manifestaciones clínicopatológicas que comprenden: fiebre continua durante 2 a 7 días, petequias, prueba de torniquete positiva, equimosis, tendencia a hemorragias que pueden ser de leves a severas, trombocitopenia (100,000 células por mm3 o menos), aumento en la permeabilidad vascular, hemoconcentración, culminando en choque hipovolémico y la muerte del paciente (5).

Planteamiento del problema:
La alarmante situación epidemiológica del dengue en el mundo, aunado a la carencia de una vacuna efectiva en contra del agente etiológico de la enfermedad hacen necesario enfocar los esfuerzos en investigación para conocer más acerca de los mecanismos inmunopatológicos implicados en la infección e investigar sobre nuevos biomarcadores y blancos terapéuticos que permitan establecer nuevas estrategias de seguimiento y control de las formas severas de la enfermedad. Desde el punto de vista inmunológico la infección por dengue en el humano cursa con liberación de una cascada de mediadores inflamatorios producidos por elementos tanto de inmunidad innata como por elementos de inmunidad adquirida. En el presente trabajo se estudio por primera vez la participación de dos isoformas de la familia de citocinas conocidas como Iinterleucina 17: IL-17A e IL-17F. La función de estas dos citocinas ha comenzado a estudiarse y clarificarse en el contexto de una gran variedad de patologías que van desde procesos autoinmunes, alergias, cáncer y por supuesto, procesos infecciosos.

La familia de citocinas IL-17, incluye a seis miembros descritos a la fecha denominados como IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (también conocida como IL-25) e IL-17F, siendo IL-17A el miembro mejor caracterizado y más ampliamente estudiado a la fecha (91-92). IL-17A, es una citocina altamente proinflamatoria con diversas funciones biológicas y secretada por diferentes poblaciones de linfocitos T activados incluyendo a linfocitos T CD8+, linfocitos T CD4+ (células Th17), células T ; ; y células T asesinas naturales (NKT), eosinófilos, neutrófilos y monocitos (93-100). Todos los miembros están relacionados entre un 16-50% en su secuencia de aminoácidos con IL-17A (101-104), siendo IL17F la de más alta homología. En infección, se ha demostrado la participación de estas citocinas en mediar una respuesta inmune protectora contra patógenos intracelulares típicos como Candida albicans, Listeria monocytogenes, Salmonella entérica, así como Mycobacterium tuberculosis. Recientemente se ha demostrado su participación en infecciones virales como Hepatitis C y la mediada por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) (57,58). A la fecha no existen evidencias científicas en la literatura que hayan estudiado la participación de esta citocina en el contexto de la infección por virus dengue tanto clásico como hemorrágico.

Objetivo General:
Determinar la participación de las citocinas inflamatorias IL-17A, IL-17F en el contexto de la infección por virus del Dengue (dengue clásico y dengue hemorrágico).

Metodología:

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Tipo de estudio: Observacional, prospectivo, transversal. Se analizaron muestra de suero de pacientes con diagnóstico confirmado de Dengue, las cuales se obtuvieron del Laboratorio Estatal de Salud Pública durante el periodo de Mayo a Noviembre del 2009. Sueros de pacientes cursando Dengue clásico (n=939), Dengue Hemorrágico (n=292) o sujetos controles sanos (n=359), fueron analizadas para determinar los niveles séricos de citocinas como IL-17A, IL17F; Las citocinas fueron determinadas por técnica convencional de ELISA (usando kits comerciales de las marcas Peprotech y Ebioscience). El Análisis estadístico de los datos obtenidos entre los diferentes grupos de estudio fue realizado con el programa GraphPad Prism versión 5, empleando test no paramétrico de MannWhitney.

sanos registraron un valor promedio de 153 pg/ml, mientras que para IL-17F, la concentración promedio fue de 126 pg/ml. De esta forma una elevación clara de ambas isoformas de IL-17 es detectada durante la infección activa por dengue.

Discusión:
Los resultados obtenidos en el presente trabajo han permitido describir por primera vez la participación de las citocinas inflamatorias IL-17A e IL-17F en el contexto de la infección por dengue. Un aumento significativo en la concentración de ambas citocinas, de entre 5 a 6 veces sobre los niveles basales detectados en sujetos sanos de la misma área endémica, pero sin datos clínicos de infección reciente, fue evidente en el curso de la infección activa por virus dengue. El presente trabajo abre nuevas preguntas sobre la participación de esos mediadores inflamatorios en protección o en la inmunopatogénesis de la enfermedad.

Resultados:
Del total de las muestras con diagnostico confirmado de dengue analizadas, 697 (74%) dieron resultados positivos para ambas: IL17A e IL-17F, de las cuales, 454 correspondieron a dengue clásico y 243 a dengue hemorrágico. Los resultados cuantitativos mostraron una media de 728 pg/ml de IL-17A y 630 pg/ml de IL-17F para el grupo de pacientes con diagnóstico clínico de dengue clásico, valores que no fueron muy diferentes a los encontrados en el grupo de pacientes con dengue hemorrágico: 815 pg/ml para IL-17A y 654 pg/ml de IL-17F. Ambos grupos de pacientes con dengue, mostraron niveles de IL-17A e IL-17F aumentados significativamente con respecto a sujetos control sanos, sin evidencia de infección aguda reciente o crónica (p= 0.0055). Los niveles de IL-17A en sujetos

Conclusión:
Durante la infección por virus del dengue en humanos es posible detectar niveles elevados tanto de IL-17A como de IL-17F, lo cual sugiere la participación de estos mediadores durante la inmunopatología de la enfermedad.

Referencias Bibliográficas:
Mukhopadhyay A. Structural perspective of the flavivirus life cycle. Nat Rev Microbiol. 2005. 3, 13–22. 2. Guzmán MG, Kourí G. Dengue: an update. Lancet Infect Dis. 2002.
1.

9

2:33(42). 25. William JH McBride, Helle BielefeldtOhmann. Dengue viral infections; pathogenesis and epidemiology. Microbes and Infection. 2000, 10411050. 4. Gubler DJ. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health,
3.

social and economic problem in the 21st century. TRENDS in Microbiology. 2002. 10 (2). 5. Green S, Rothman A. Immunopathological mechanisms in dengue and dengue hemorrhagic fever. Curr Opin Infect Dis. 2006. 19 (5):429-36.

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EVALUACION DE LA EFICIENCIA DEL METODO DE
CONSERVACION DE MICROORGANISMOS EN PAPEL FILTRO
Vanesa Lopez Rosaldo

Marco teórico:
A lo largo del siglo XX la tradición institucional de la investigación microbiológica ha estado centrada en brindar soluciones a problemas en los campos de la salud dejando un invaluable legado y un conjunto de colecciones de microorganismos que constituyen la base de futuras investigaciones. Es importante entender que para el mantenimiento de los cultivos deben permanecer puros y homogéneos bajo condiciones que aseguren la estabilidad microscópica, mascrocòpica, bioquímica, fisiológica y genética. Hay gran número de métodos descritos para la preservación microbiana. Los criterios a ser considerados para la selección del método son la viabilidad, pureza, costos del proceso, cantidad de cultivo (para la producción de microorganismos) y frecuencia de uso. Las colecciones de cultivo son organizaciones que se ocupan de conservar convenientemente cepas de

microorganismos, células superiores o diversos materiales biológicos, suministrándolos previa solicitud a laboratorios de docencia e investigación. Las primeras colecciones de cultivo que aparecieron en el mundo fueron: La de Praga en el siglo siglo XIX (KRAL) fue la primera colección que contó con un catálogo de microorganismos. La más antigua es la de Lobaina en Bélgica dedicada a la conservación de hongos. La American Type Culture Collection (ATCC) fue fundada en 1925.Actualmente existen todavía varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son: Rockville, USA

Bacteria- Survey, Inglaterra

Docente y Profesional de la salud Universidad rosaldo04@hotmail.com

Veracruzana

Facultad

de

Bioanalisis

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: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japón CCTM: Colección Nacional – Lille, Francia RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Moscú, Rusia. NCIB: Colección Nacional industrial – Aberdeen, Escocia DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen – Gottinger, Alemania Servicios que prestan las colecciones de cultivos: Recolección: Es el servicio mas típico de una Colecciones de Cultivo. Las colecciones reúnen cepas que les llegan a través de distintos conductos, las conservan convenientemente y las suministra previa petición. Conservación: Es el trabajo medular de las colecciones microbianas, las cuales mantienen conservadas a los microorganismos bajo diferentes métodos entre ellos la liofilización como preservación a largo plazo. Suministro de cepas microbianas: Se hace por correo de superficie, aéreo o mensajería, pero siempre empaquetado correctamente considerándolo como material “potencialmente patógeno” Depósito de cepas microbianas.1.- Depósito público: Cualquier microbiólogo puede depositar una cepa, que considere interesante, en la colección. Esta cepa se incorpora en el catálogo y puede suministrársela a cualquier otro microbiólogo que la solicite.2.- Depósito no público: Algunas Colección de Cultivo reciben el nombramiento de Autoridad Internacional de Depósito para fines de patentes, de esta manera se garantiza la descripción total y reproducción del proceso patentado. Una vez conseguida la patente, la cepa puede suministrarse previa autorización

escrita del propietario, aunque no figure en el catálogo; Organización de Cursos, Investigación y Asesoria.

Planteamiento del problema:
¿Cual es la eficiencia o porcentaje de recuperación que ofrece el método de conservación de microorganismos en papel filtro a 10 años de su realización en especies bacterianas que forman el cepario bacteriano de la facultad de Bioanálisis?

Objetivo General:
Evaluar la eficiencia o porcentaje de recuperación del método de conservación de papel filtro de los microorganismos conservados en el cepario microbiano de la facultad de Bioanalisis desde hace 10 años.

Metodología:
El trabajo metodológico se fundamenta en la capacidad de los microorganismos conservados en papel filtro de reactivar su metabolismo en caldo nutritivo y permitir su aislamiento e identificación morfológica y bioquímica que a la ves de conocer la eficiencia de conservación del metodo, verificar que el nombre encontrado a la cepa es el correcto. Se partió de un acervo de viales que se tienen en el cepario de la facultad de Bioanalisis las cuales se seleccionaron con el requisito que tuvieran como mínimo 10 años de conservación, después se propagaron en caldos nutritivos, se inocularon en medios de cultivo por estría cruzada en donde se obtuvo la morfología colonial, enseguida se les hizo la prueba bioquímica en donde se obtuvo la identificación taxonómica y se determino la eficiencia en % de la

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recuperación.1)SELECCIONAR CEPAS CONSERVADAS EN PAPEL FILTRO(10 AÑOS DE CONSERVACION)2)PROPAGACION EN CALDOS DE CULTIVO.3)PRUEBAS DE IDENTIFICACION.3.1)MORFOLOGIA COLONIAL Y 3.2) BIOQUIMICAS. 4) IDENTIFICACION TAXONOMICA.5)DETERMINACION DE LA EFICIENCIA EN % DE RECUPERACION EN:5.1)PAPEL FILTRO. 5.2) ACEITE MINERAL.5.3) CONGELACION EN GLICEROL.

que fueron reactivas posterior a su conservación durante 10 años fue la siguiente el 30% correspondió a bacteria Gram positivas, mientras que el 70% fueron Gram negativas y en donde el 28.57% fueron Gram positivas que no tuvieron desarrollo y el 71.42% son Gram negativas sin desarrollo.

Discusión:
Los resultados obtenidos muestran una buena eficiencia del método de conservación de microorganismos en papel filtro ya que esta correspondió al 58.82%, no permitiendo la recuperación del 41.17% de los viales estudiados. Sin embargo, es importante considerar que este método de conservación es considerado a mediano o sea presentan efectividad para aproximadamente 5 años aproximadamente, por lo tanto el encontrar una eficiencia de recuperación en aproximadamente un poco mas de la mitad de los cultivos muestra ciertas ventajas de este método de conservación. Como se puede observar este método mostró una mayor eficiencia de conservación para bacterias Gram negativas y para un número considerable de especies principalmente de la familia Enterobacteriaceae. Los resultados de esta evaluación de la eficiencia del método de conservación en papel filtro muestra su factibilidad de aplicación técnica y económica para la conservación de microorganismos en el cepario microbiano; aunado a lo anterior se pone de manifiesto que hace 10 años de haber realizado el método se cumplió con los objetivos propuestos en el trabajo que antecede al que a la fecha realizado.

Resultados:
A continuación se detallan los resultados obtenidos del estudio de “evaluación de la eficiencia del método de conservación de microorganismos en papel filtro”, el cual se realizó hace 10 años para la creación del cepario microbiano de la facultad de Bioanálisis. Se partió de un grupo de 85 viales conservados los cuales fueron propagados para el aislamiento e identificación de los microorganismos conservados. VIALES CONSERVADOS QUE FUERON REACTIVADOS Y MOSTRARON CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO:N= 85. 41.17% SIN DESARROLLO Y 58.82% CON DESARROLLO.TIEMPO DE RECUPERACION DE LOS MICROORGANISMOS CONSERVADOS EN PAPEL FILTRO: Durante la etapa de recuperación de los microorganismos conservados se observó que el 48% de ellos mostró desarrollo en caldo de cultivo a las 24 horas de incubación, seguido del 38% que mostró desarrollo a las 48 horas, finalmente el 14% se reactivó mostrando crecimiento a las 72 horas. DESARROLLO MICROBIANO APARTIR DE LOS VIALES CONSERVADOS, CLASIFICADOS DE ACUERDO A LA TINCION DE GRAM: En relación al tipo de bacterias

Conclusión:

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El método de conservación de microorganismos en papel filtro demostró que SI es posible recuperar bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas después de 10 años de conservación. Los resultados obtenidos en la evaluación de este método nos sugiere que es útil para las necesidades e infraestructura con que cuenta la facultad de Bioanalisis, para poder seguir utilizándolo en la conservación de microorganismos para el apoyo académico y del proceso enseñanza-aprendizaje de la licenciatura en Química Clínica.

cultivo de bacterias” (Fecha de ingreso 30 de agosto del 2007) disponible en: http://med.unne.edu.ar/revista138. htm 2. García F. “MB-5000 BACTERIOLOGIA MEDICA 5000 BACTERIOLOGIA MEDICA 1 CICLO LECTIVO” (fecha de ingreso 14 de agosto del 2007) disponible en: http://netropica.org/pdfs%20b%20m edica.pdf 3. Ferradiz Santos Juan, Amador Romero Javier “MANUAL DE MICROBIOLOGIA” Unidad de calidad. Dirección área 11. INSALUD.MADRID 1999.

Referencias Bibliográficas:
1.

Hernandez CH. F. “Experiencia en el

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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE OXIESTEROLES DIETARIOS
SOBRE EL PERFIL DE LÍPIDOS DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA EN HEPATOCITOS DE RATA WISTAR.
Rosa Isela Villaraus Cirilo Ida Soto Rodríguez Alfonso Alexander Aguilera Guillermo Hernández Díaz Hugo Sergio García Galindo

Marco teórico:
El colesterol (colest-5-en-ßol) es un metabolito esencial requerido en las principales funciones biológicas, proporciona la fuente bioquímica para la síntesis de hormonas esteroides y para la biosíntesis de la bilis y de las sales ácidas de ésta1. Los organismos obtienen el colesterol a través de la biosíntesis y de la dieta. La biosíntesis del colesterol es un proceso que ocurre principalmente en el hígado, glándulas suprarrenales, ovarios y testículos de mamíferos, los cuales muestran mayor actividad biosintética. El colesterol también es requerido en la formación de la estructura de la membrana celular, junto con las moléculas de los fosfolípidos forman la parte integral de la capa bilipídica2, éste se inserta dentro de la bicapa de la membrana con su eje largo perpendicular al plano de la membrana, previniendo la cristalización de las cadenas acil de las grasas al ajustarse entre ellas y modificando la actividad de las enzimas enlazadas a la membrana3. El colesterol es una molécula con un enlace

insaturado en la posición ∆;5-6 del núcleo del esterol, por lo tanto es propenso para la oxidación4. La molécula sufre una autooxidación por el mecanismo de radicales libres generando la formación de hidroperóxidos y posteriormente oxidación de varios productos, denominado oxiesteroles. Estos productos de la oxidación son un grupo de esteroles similares en estructura al colesterol, pero contienen un oxígeno funcional adicional como un grupo hidroxilo, grupo epóxido o grupo cetona en el núcleo del esterol o al extremo de la cadena de la molécula5. Los oxiesteroles se han asociado con la génesis de enfermedades crónico degenerativas como la aterosclerosis. Esta se caracteriza por daño histológico de la estructura arterial por acumulación de lípidos que contienen colesterol oxidado como la LDL oxidada. Asimismo, se han relacionado con procesos mutagénicos y recientemente, con la apoptosis o muerte celular programada6. El consumo de oxiesteroles a través de la dieta, es un factor asociado al desarrollo de

Docente y Profesional de la salud Facultad de Bioanálisis Campus Veracruz UNIVERSIDAD VERACRUZANA rosy_isevi@hotmail.com

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diversas patologías, por lo que se han desarrollado trabajos experimentales en modelos “in vitro”, principalmente en líneas celulares puras de células conjuntivas, musculares y nerviosas, en las cuales se ha medido el efecto citotóxico del 7hidroxicolesterol y del 25-hidroxicolesterol5; sin embargo, poco se sabe sobre su efecto en modelos “in vivo”.

Planteamiento del problema:
¿Los oxiesteroles dietarios modifican el perfil de lípidos de la membrana plasmática de los hepatocitos?

Objetivo General:
Evaluar el efecto de oxiesteroles dietarios sobre el perfil de lípidos de la membrana plasmática en hepatocitos de rata Wistar.

elaboración de croquetas. Al grupo testigo se le administraron croquetas “placebo”. Todos los animales recibieron su respectiva dieta “ad libitum” durante ocho semanas. Se registró el peso corporal y la presión arterial (PA) de los animales al inicio y al término del experimento. Al sacrificio de los animales se obtuvieron muestras de hígado para extraer las membranas plasmáticas por medio de gradiente de Percoll así como muestras de suero el cual, fue analizado utilizando estuches de diagnóstico para colesterol, glucosa, triglicéridos y LDL. Los lípidos de las membranas plasmáticas de los hepatocitos se obtuvieron por el método de Folch7 para su identificación y cuantificación por CG previa metilación.

Resultados:
El análisis de cromatografía de gases realizado a la mezcla de oxiesteroles formados por calentamiento para su administración en las dietas de las ratas Wistar mostró la presencia de los siguientes oxiesteroles: 4β-hidroxicolesterol (3 464.67 ppm), 3,6-dione (7 555.99 ppm) 7βhidroxicolesterol (3 768.57 ppm), 7α– hidroxicolesterol (25 327.27 ppm); 20hidroxicolesterol (4 475.64 ppm), colestanotriol (6 909.38 ppm), 7cetocolesterol (8 928.22 ppm), 25hidroxicolesterol (3 919.52 ppm), oxiesteroles no identificados (13 308.00 ppm) y colesterol (16 490.00 ppm). En cuanto al peso corporal registrado de los animales no hubo cambio significativo entre los grupos experimentales y el testigo. Con respecto a la presión arterial (PA), al inicio del experimento los cuatro grupos de animales mostraron la misma PA: grupo

Metodología:
Para analizar el efecto de los oxiesteroles se diseñó un modelo experimental formando por cuatro grupos con seis ratas Wistar machos cada uno de cinco semanas de edad, alojadas individualmente con un ciclo de luz/obscuridad de 12 h a 25°C: a) grupo 1 (testigo), b) grupo 2 (POC´s+colesterol 1%), c) grupo 3 (POC´s+colesterol 2%) y d) grupo 4 (colesterol 1%). Para la dieta experimental se adquirió 1 Kg de colesterol puro. De esta cantidad, 500 g se calentaron durante 90 días a 90°C, y se obtuvo una mezcla de oxiesteroles (POC´s), la cual fue analizada por cromatografía de gases (CG) para su identificación y cuantificación. Para los grupos experimentales se incorporó la mezcla de POC´s 1% y 2% ó colesterol puro al 1% al alimento de mantenimiento molido hasta formar una pasta homogénea para la

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testigo (166±6 mm/Hg), grupo POC´s+colesterol 1% (167±4mm/Hg), grupo 3 POC´s+colesterol 2% (165±3mm/Hg), y grupo colesterol 1% (159±4mm/Hg); sin embargo, al final de la administración de las diferentes dietas la PA de los grupos mostró diferencia significativa entre los grupos experimentales: grupo testigo (170±6 mm/Hg), grupo POC´s+colesterol 1% (206±3mm/Hg), grupo 3 POC´s+colesterol 2% (210±4mm/Hg), y grupo colesterol 1% (196±4mm/Hg). Al final del experimento el perfil bioquímico de la glucosa y de los triglicéridos no presentaron cambios significativos entre los animales alimentados con colesterol, POC´s+colesterol 1% y POC´s+colesterol 2% (93±4mg/dl) pero si en relación con el grupo testigo. Los parámetros de colesterol fueron significativamente distintos entre los animales alimentados con colesterol (151±4mg/dl), POC´s+colesterol 1% (97±2mg/dl) y POC´s+colesterol 2% (99±3mg/dl) en relación con el grupo testigo (126±7mg/dl) y en los niveles de LDL también hubo cambios significativos en los grupos experimentales de colesterol, POC´s+colesterol 1% y 2%: (105±5mg/dl; 54±3mg/dl; 52±2mg/dl) respetivamente, comparados con el grupo testigo (61±1mg/dl). Con respecto al perfil de lípidos en la membrana plasmática del tejido hepático, la concentración y composición de ácidos grasos saturados, monosaturados y polinsaturados no mostró diferencias significativas, entre los grupos experimentales. Sin embargo, la concentración del colesterol fue significativamente mayor en el grupo de animales alimentados con colesterol. Cabe señalar que en los grupos POC´s+colesterol

1% y 2% además de disminuir los niveles de colesterol, se identificó el 7 ceto-colesterol en las membranas de los hepatocitos, lo que permite suponer que los oxiesteroles son capaces de incorporarse a la membrana plasmática.

Discusión:
El aumento significativo de la PA en los animales experimentales y de manera particular en los alimentados con las dietas POC´s±colesterol 1 y 2% obedece a que el consumo dietario de oxiesteroles inhibe la enzima óxido nítrico sintasa (ONS) encargada de regular los niveles de óxido nítrico a nivel del endotelio8. Los valores del colesterol sérico disminuidos en los grupos POC´s±colesterol 1 y 2% pudo deberse a que los oxiesteroles inhiben la formación de la hidroximetilglutaril CoA reductasa encargada de regular el metabolismo del colesterol endógeno9. Los niveles elevados de triglicéridos en el grupos de animales alimentados con POC´s+colesterol supone la posibilidad que pueden tener los oxiesteroles dietarios en la activación de enzimas que promuevan la formación de ácidos grasos libres lo que dar lugar a una dislipidemia (SEO,2004)10. En ratas Wistar alimentadas con oxiesteroles se ha observado trastornos en el metabolismo de los quilomicrones plasmáticos particularmente, el transporte de LDL, debido a que alteran la fracción de apolipoproteína de la LDL, facilitando la oxidación de la LDL11. En el presente trabajo la diferencia de los niveles de LDL en los grupos POC´s+colesterol 1 y 2%, pudo deberse al mismo efecto. En cuanto a la composición de lípidos de la membrana plasmática, los oxiesteroles no modifican la

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cantidad y el tipo de ácidos grasos; sin embargo, su incorporación puede afectar las propiedades biofísicas de la membrana como la permeabilidad a la glucosa en los liposomas o un aumento en la transferencia de albúmina en el endotelio por lo que se les considera pro-aterogénicos. Asimismo pueden modificar las proteínas embebidas en la membrana y alterar su función como receptores a biomoléculas específicas12.

7.

8.

Conclusión:
Conclusión: Los oxiesteroles se incorporan a la membrana plasmática del hepatocito promoviendo cambios en sus propiedades biofísicas.

9.

Referencias Bibliográficas:
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CONFIRMACION DIAGNÓSTICA DE VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) EN BIOPSIAS DE CERVIX, MEDIANTE REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR).
Salvador Contreras Huerta Ivone Gomez Gonzalez Guadalupe Alcantar Garcia Armando Mendez Perez

Marco teórico:
El Virus del Papiloma Humano (VPH) es uno de los virus que se transmite con mayor frecuencia por vía sexual. Al menos la mitad de los hombres y mujeres sexualmente activos contraerán el VPH en algún momento de sus vidas. Este virus es considerado inductor de neoplasias malignas de tipo escamoso en el cervix uterino y esta vinculado de forma directa con el cáncer cervicouterino y de pene. Después del cáncer de mama, el cáncer de cervix ocupa el segundo lugar con una incidencia del 87% y es considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una de las principales causas de muerte en el mundo, cálculos estadísticos prevén en 40 años pudiera alcanzar la cifra de un millón de casos. En la actualidad se cuenta con diversas metodologías capaces de diagnosticar este padecimiento, siendo las de mayor relevancia aquellas que involucran al ADN viral; una de estas pruebas es la denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) la cual cuenta con un grado de sensibilidad y especificidad alto. El

desarrollo de las técnicas de biología molecular y su amplio uso en estudios epidemiológicos ha permitido estimar que entre un 2 y un 20 % de la población femenina mundial es portadora oculta del VPH en el cuello uterino. En la última década se ha confirmado la relación etiológica entre la infección por ciertos genotipos del VPH y el cáncer de cuello uterino. En el campo de la investigación básica, este hallazgo constituye un nuevo modelo para estudiar el mecanismo viral de la oncogénesis y en el terreno de la epidemiología, la carcinogénesis cervical es de gran trascendencia. Aunque las pruebas de histopatología aporten datos de lesión indirecta, es necesario realizar el diagnostico certero y oportuno de la presencia viral y la tipificación del mismo, con la finalidad de ayudar a disminuir el numero de infecciones y por consiguiente el de casos mortales por CaCu al impedir el desarrollo de la neoplasia.

Planteamiento del problema:
Se desconoce el porcentaje de casos realmente positivos para VPH diagnosticados
Xalapa Departamento De Patologia

Docente y Profesional de la salud Facultad De Medicina. Uv Experimental qcpatoex@hotmail.com

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por histopatología en biopsias de cérvix y la identificación de los subtipos virales circulantes en la región.

Objetivo General:
Confirmar la presencia de VPH en biopsias cervicales mediante la técnica de PCR.

analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5% con solución buffer TBE 1X. Todos los productos amplificados por PCR y digeridos por RFLP se visualizaran en un transiluminador con luz ultravioleta. ANALISIS DE LA INFORMACION: se emplearan para la base de datos los Software Office 2007 Excel y Statistica versión 6.0, en primera instancia se realizara un análisis estadístico univariado aplicando tablas de frecuencias, gráficas circulares, de barras, así como diagramas de cajas y alambres. Posteriormente efectuaremos un análisis divariado que consistirá en hallar las posibles correlaciones del padecimiento.

Metodología:
DISEÑO: Prospectivo, Transversal, Comparativo y Observacional. UNIVERSO DE ESTUDIO: Se estudiaran un total de 80 biopsias de cérvix con diagnóstico histopatológico de lesión intraepitelial o tumor infiltrante inducidos por el virus del papiloma humano y un total de 20 biopsias de cérvix sin lesion. VARIABLES: Virus de papiloma humano Subtipos viralesAmbas variables serán medidas en escala nominal considerando presencia o ausencia. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: Se utilizarán biopsias de cérvix en bloques de parafina tomadas previamente y diagnosticadas por histopatología con lesión intraepitelial de alto grado o carcinoma escamoso invasor, se aislara el ADN para realizar posteriormente amplificación por PCR de la región L1 del papiloma virus con el fin de obtener un segmento de 450 pares de bases al someterse a electroforesis en gel de agarosa 1 % en buffer de TBE 1X, posteriormente y si las muestras son positivas se realizara la tipificación empleando enzimas de digestión según la técnica de “polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción”(RFLP) utilizando las enzimas RsaI, PstI, BamHI, HaeIII e HinFI y los productos serán

Resultados:
Para la realización de este estudio se utilizaron 80 muestras de biopsia de cérvix provenientes de pacientes diagnosticados con lesión viral por papiloma con edad variable de 14 a 55 años y 20 muestras de pacientes que se consideraron sanas con un rango de edad de 20 a 41 años. En la amplificación por PCR de la región L1 del virus del papiloma, el grupo de casos tuvo amplificación solo en el 77.5% (62 muestras), el 22.5% (18 muestras) no amplifico. El grupo control no tuvo amplificación tal y como se esperaba. En la identificación del subtipo viral por RFLP en las 62 muestras (100%) que si amplificaron a la región L1, se observaron 6 expresiones virales las cuales se ordenaron por frecuencia de la siguiente manera: el subtipo 6 fue el de mayor frecuencia con 26% (16 casos), seguido del subtipo 11 con 23% (14 casos), subtipo 42 con 18% (11 casos), subtipo 16 con 16% (10 casos), subtipo 33 con 9% (6 casos) y el subtipo 54 fue el de menor frecuencia con 8% (5 casos).

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Al clasificarlos de acuerdo al grado de oncogenicidad se obtuvo que el 25% (16 casos) corresponde a subtipos de alto grado (VPH16 y 33) y el siguiente 75% (46 casos) a los clasificados como de bajo grado (VPH6, 11, 42 y 54). Al analizar su distribución por grupos de edades se encontró que los VPH 16 y 33 tienen mayor relevancia en el grupo de edad de 21-27 años y nula presencia en el grupo de 14-20 años, por su parte los VPH 6,11 y 42 tuvieron también mayor expresión en el grupo de 21-27 años con cuatro casos cada uno, en el grupo de 14-20 el VPH 11 mantuvo su expresión al igual que el VPH 6 en el grupo de 35-41 años. Al efectuar el comparativo entre ambos métodos (histopatológico/PCR) se notaron marcadas diferencias, en primer lugar que de el total (80 muestras) solo un 77.5% fue realmente portador de VPH, segundo que el 43.75% (35 casos) considerados como de alto grado, disminuyo a un 20% por PCR y el 56.25% (45 casos) catalogado como de bajo grado aumento a un 57.5% por PCR al demostrarse por RFLP que 1 caso considerado de alto grado no lo era; finalmente un 22.5% resulto no ser portador de virus y mucho menos ser de alto grado.

Discusión:
El desconocimiento de este agente viral, la poca atención de la gente a campañas de prevención y diagnostico oportuno, aunado al inicio temprano de la vida sexual, la promiscuidad y no practicar el sexo seguro; ha incrementado el numero de infecciones y por consiguiente el numero de casos de CaCu.Si bien es cierto la mayoría de estos diagnósticos son efectuados por gente especializada en citología e histopatología, es

claro también que existen errores humanos que pudieran alterar un resultado y por consiguiente su tratamiento, razón que motivó a la realización de este trabajo; con la finalidad de corroborar los diagnósticos obtenidos por las técnicas antes mencionadas junto con los reportados por métodos moleculares como es el caso de PCR. Tras comparar los resultados obtenidos por ambos métodos (histopatología/PCR), se muestra que el primer estudio tiene una sensibilidad del 77% con margen de error del 23% tal y como se manifiesta en estudios realizados por el Depto. de Anatomía Patológica de la Universidad de la frontera en Chile y por el Servicio de Anatomía Patológica del Policlinico de España en sus artículos titulados “Detection of human papilloma virus in cytologic samples or biopsies of the cervix y Correlación diagnostica entre las displasias de cérvix y detección por PCR del papiloma virus humano, mostrando gran diferencia de las pruebas realizadas por PCR que implican la amplificación de un gen tardio (L1) del VPH empleando ADN, que tienen una excelente sensibilidad para detectar alteraciones celulares no captadas por otros métodos convencionales.

Conclusión:
Después de haber realizado el presente trabajo, de analizar los resultados y llevar acabo el comparativo de los mismos en los procedimientos que aquí se describieron anteriormente, se concluye que: • La prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) conjuntamente con la amplificación del gen tardío L1, constituye una metodología útil y muy sensible para la

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detección del Virus del Papiloma Humano, además de confirmar el diagnóstico citológico, colposcópico e histopatologico; particularmente en lesiones intraepiteliales o con atipias. • El empleo de la técnica de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) facilita la identificación de los subtipos virales causantes de las lesiones en el cérvix, ayuda también a que el medico brinde de acuerdo a sus conocimientos el tratamiento adecuado y permita la detección temprana de precursores graves del cáncer. • Se espera que los estudios por ADN de VPH con sus respectivos oligonucleótidos (MY09/MY11) constituyan un método racional para complementar el frotis de Papanicolaou, la colposcopia y la histopatología en nuestra entidad y ofrecer así un sistema más preciso para el diagnostico y valoración del riesgo carcinógeno. • Finalmente se pone a consideración de las Instituciones de Salud y de sus profesionales involucrados en este tema, el uso de técnicas avanzadas como es el PCRRFLP para incorporarlos a sus laboratorios como una herramienta más de apoyo diagnostico y por consiguiente se sugiere la preparación adecuada de su personal para poder desarrollarlas.

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DETECCIÓN DE CLONAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS METICILINO RESISTENTES (MRSA) EN EL HOSPITAL REGIONAL DE ALTA ESPECIALIDAD DE VERACRUZ (HRV)
Miguel Ángel Ortiz Gil María Elena Velázquez Meza Javier Paul Mora Domínguez Irma Gabriela Echániz Avilés María Noemí Carnalla Barajas Elsa Lilia Mendiola Del Moral

Marco teórico:
Antes del uso de antibióticos una bacteriemia causada por S. aureus producía una mortalidad de aproximadamente el 82%. Aun ahora este porcentaje sigue siendo elevado entre el 25-63%.(1) S. aureus produce exoproteinas que contribuyen a colonizar y causar enfermedad en el humano.(2) S. aureus meticilino resistente (MRSA), posee un elemento genético móvil llamado, casete cromosomal estafilocócico mec (SCCmec), que incluye al gen mecA,(3) el cual codifica para la proteína de unión a penicilina 2a (PBP2a) y determina la resistencia a todos los β-lactámicos.(4). Existen múltiples linajes clónales de MRSA como consecuencia de la transferencia horizontal del mecA.(5) Seis tipos de clonas pandémicas de MRSA han sido reportadas: Ibérica, Brasileña, Húngara, Nueva York/Japón, Pediátrica y EMRSA-16.(6). En México en el Instituto Nacional de Salud Pública, se han realizado estudios encaminados a conocer las clonas que

circulan en diversos hospitales de la república mexicana ( Hospitales del Distrito Federal, Guadalajara, Chihuahua, Monterrey y San Luis Potosí) y se ha documentado la presencia de la clona EMRSA-16(7) y la clona internacional multiresistente Nueva York/Japón(8),(9). Las 6 clonas pandémicas de MRSA posen características distintas en cuanto a sus factores de virulencia y resistencia antimicrobiana. La clona más predominante en este momento en México es la clona Nueva York/Japón que tiene la capacidad de propagarse, causar brotes y reemplazar las clonas existentes,(10) esto se debe a su alta capacidad de virulencia; entre los genes que posee se encuentran algunas enterotoxinas, las cuales le permiten causar entre otras cosas fascitis necrotizante.(11). También posee la toxina del síndrome de choque tóxico 1, que causa una gran variedad de síndromes clínicos, incluyendo el síndrome de choque tóxico e infecciones supurativas(12) y a esto se suma que es resistente a β- lactámicos y a una amplia gama de otros antibióticos.(13)

Estudiante de Maestría Instituto Nacional de Salud Publica Especialidad de Veracruz (SSAVER) maog86@gmail.com

Hospital

Regional

de

Alta

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Planteamiento del problema:
La prevalencia de MRSA en México ha aumentado de forma progresiva en las tres últimas décadas, provocando la diseminación de cepas multiresistentes y altamente virulentas. Dada la importancia que representa este patógeno para la salud pública y debido a los cambios epidemiológicos y moleculares que se han venido produciendo, se ha planteado realizar un análisis de las clonas de MRSA que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz (HRV) y su perfil de resistencia antimicrobiana. La presencia de cepas de MRSA descendientes de clonas epidémicas favorece con frecuencia el desarrollo de brotes dentro de los hospitales, por lo cual se plantea la siguiente pregunta de investigación:¿Cuáles son las clonas de S. aureus meticilino resistente que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz?

similitud con el programa (NTSys).(19)

Resultados:
En el periodo de estudio se colectaron un total de 99 cepas, las cuales fueron obtenidas de 8 diferentes servicios médicos, siendo el de mayor frecuencia medicina interna (53%) y el sitio de aislamiento más predominante fue el hemocultivo (35%). Los resultados fenotípicos mostraron que el 100% de las cepas fueron catalasa positiva, 92.6% fueron coagulasa positiva y 97% mostraron resistencia a cefoxitina. El 90% de las cepas fueron identificadas como MRSA, siendo estas sensibles a rifampicina, teicoplanina, trimetroprim/sulfametoxazol y vancomicina y resistentes al resto de los antimicrobianos probados. El análisis genotípico por PFGE mostró la presencia de los subtipos clónales (C28, C31 y C35) los cuales se encuentran relacionados con la clona Nueva York-Japón y el patrón (Ib) es un subtipo de la clona Ibérica.

Objetivo General: Discusión:
Objetivo General: Identificar las clonas de S. aureus meticilino resistente que circulan en el Hospital Regional de Alta Especialidad de Veracruz. En México, la incidencia de infecciones nosocomiales oscila entre 3.8 y 26.1 casos por cada 100 egresos; la mortalidad asociada con infecciones intrahospitalarias en promedio es 5% y para el 2001 ocupó la séptima causa de muerte.(20) Los recursos para el control de las infecciones por MRSA siguen siendo limitados y los MRSA son una de las principales causas de infección nosocomial en nuestro país, sin embargo, la magnitud del problema no se entiende completamente, ya que los datos tienden a provenir de grandes hospitales, mientras que gran parte de la población es atendida en centros comunitarios de salud que no cuentan con amplias instalaciones para realizar vigilancia microbiológica. En México los estudios demuestran un aumento en la prevalencia de los MRSA durante los últimos años, la Organización

Metodología:
Estudio transversal prospectivo, se recolectaron cepas del HRV en un periodo comprendido de septiembre 2009 a julio 2010.Se realizó las pruebas de coagulasa, catalasa y cefoxitina.(14) La identificación de especie y susceptibilidad antimicrobiana se hizo por Sensititre®(15), (16). Para el análisis genotípico se utilizó la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE).(17) Los resultados fenotípicos se analizaron con Excel 2010, mientras que los resultados del PFGE se analizaron de acuerdo a los criterios de Tenover 1995(18) y se realizó un dendrograma de coeficiente de

26

Panamericana de la Salud (OPS) en el 2004 reportó una prevalencia de MRSA del 52%, la Asociación Panamericana de Enfermedades Infecciosas para 2006 reportó una tasa de MRSA de 32% y datos más recientes del 2008 procedentes del estudio TEST muestran una prevalencia del 48% de MRSA.(21) Por lo cual este estudio permitió establecer una vigilancia epidemiológica de las infecciones nosocomiales por MRSA en el HRV, mostrando que el 93% de los aislados fueron S. aureus con una prevalencia de resistencia a meticilina del 97%. Esta información difiere mucho con lo reportado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición “Salvador Zubirán” (INCMNSZ) durante 1981 a 1992, donde encontraron que el 8% de los aislados fueron S. aureus con una prevalencia de resistencia a meticilina menor a 20%. Sin embargo, estudios recientes muestran prevalencias muy similares entre el HRV y el INCMNSZ (2004 – 2005), donde indican una prevalencia de S. aureus superior a 50% en aislados con una tasa de resistencia a meticilina del 100%.(22). Estas prevalencias y resistencias antimicrobianas varían en cada hospital y dependen del control en el uso de antimicrobianos y del programa de vigilancia de infecciones nosocomiales. Este estudio evidencio la presencia de dos clonas MRSA pandémicas en el HRV, estableciendo que los patrones C28, C31 y C35 son subtipos de la clona Nueva York/Japón y el patrón Ib es un subtipo de la clona Ibérica. La importancia de este hallazgo radica en que la primera cepa de MRSA resistente a vancomicina (VRSA) perteneció al linaje Nueva YorkJapón.(23),(24) Mientras que la clona Ibérica se disemino ampliamente en Europa(25),(26) y EEUU(27) y fue causante de severos brotes hospitalarios en estas regiones(28) y fue la primera cepa de S. aureus con resistencia intermedia a vancomicina (VISA)(29),(30),(31) y sensibilidad reducida a la teicoplanina.(32)

Conclusión:
La clona Nueva York/Japón ha sido identificada previamente en otros hospitales en México (norte y centro). Este es el primer reporte de esta clona al sur de México, lo que demuestra claramente su gran capacidad de expansión geográfica, multiresistencia y virulencia. Además por primera vez se evidencia la presencia de la clona Ibérica en México. La vigilancia epidemiológica molecular de las clonas de MRSA permiten tener un mayor entendimiento de la dinámica de distribución de las clonas responsables de infecciones en el HRV; conocimiento indispensable para la prevención, control y posible erradicación de este microorganismo.

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30

DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DENGUE
Armando Mendez Perez : Salvador Contreras Huerta Mercedes Tepetla Peredo Dolores Carranza Gonzalez

Marco teórico:
A principios de 1990 el Dengue se convirtió en uno de los 5 mayores problemas de salud que aquejan a los países centroamericanos y una de su variantes; el Dengue clásico es una enfermedad viral que afecta las regiones tropicales y subtropicales en el mundo, predominantemente en áreas urbanas y suburbanas, puede evolucionar hacia sus formas graves de dengue hemorrágico y shock asociado a dengue. Se estima que existen anualmente 50 a 100 millones de nuevos casos infectados por virus del dengue en el mundo y de los cuales resultan 250,000 a 500,000 casos de dengue hemorrágico y 24 muertes cada año por lo cual se ha considerado un problema serio de salud publica. El Dengue es un virus RNA encapsulado y el mas prevalente de los arbovirus en regiones subtropicales y tropicales, genómicamente está constituido por 11 kb y esta subdividido en 3 genes que codifican proteínas estructurales (C,M y E) y 7 genes que codifican proteínas no estructurales. Hay 4 subtipos que inducen inmunoprotección para el mismo subtipo pero parcialmente en subsecuente infección

con otros serotipos. Esta generalmente aceptado que una infección secundaria por este flavivirus implica una respuesta Th2 importante que propicia incremento notable en la formación de complejos inmunes los cuales juegan un papel critico en la patogenia de dengue hemorrágico y shock. La infección por virus del dengue implica un amplio espectro clínico desde inaparente infección, resfriado común, fiebre indeterminada, dengue clásico hasta la expresión clínica mas grave correspondiente a dengue hemorrágico o shock. El diagnostico de certeza, inmediato y de diferenciación del subtipo resulta fundamental para el estudio etiológico, clínico y control epidemiológico. La amenaza del Dengue no se debe, ni se puede enfrentar aisladamente en las actuales condiciones mundiales. Los países centroamericanos y en especial el nuestro deben actuar de manera conjunta y coordinada para solucionar este problema. En el campo clínico el diagnostico por laboratorio debe ser apoyado por las nuevas tecnologías que permitan no solo detectar la presencia del agente causal, sino mejor aun
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tener una respuesta pronta en los sitios donde se estén presentando los primeros brotes.

Planteamiento del problema:
Se desconoce cuales son los subtipos virus del Dengue presentes en una población y cuales son los que propician el tipo hemorrágico.

Objetivo General:
Confirmar la presencia del virus dengue por medio de RT-PCR en 200 pacientes clínicamente catalogados e identificar los subtipos mediante Nested PCR.

Metodologia:
DISEÑO Prospectivo, Comparativo y Observacional. Transversal,

UNIVERSO DE ESTUDIO: Se muestrearon 200 pacientes con diagnostico clínico de dengue procedentes del Hospital Civil de Martínez de la Torre, Casa de Salud de la UV en Veracruz, Ver. Y Centro de Salud Carranza de la SSA ubicado en la Colonia el Manglar de Boca del Rio, con el consentimiento aprobado. Los pacientes presentaron un cuadro nosológico caracterizado por fiebre de 39.2°C cefalalgia frontal, mialgias, artralgias, dolor retroorbitario, anorexia y eritema parcial. De estos 200 pacientes 17 cursaron con trombocitopenia, petequias, hemorragia mucocutánea y tres de estos pacientes con un cuadro de shock progresivo. También se seleccionaron 100 muestras aparentemente sanas como testigos. VARIABLES: Dengue clásico: medida en

escala nominal considerando presencia o ausenciaDengue hemorrágico: medida en escala nominal considerando presencia o ausenciaSubtipos 1, 2,3 y 4: medida en escala nominal considerando presencia o ausencia. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: Se obtuvo de cada uno de los pacientes 7 c.c. de sangre, se centrifugó a 3500 rpm, se separó el plasma y se almacenó en tubos de eppendorff a -70°C. Se eliminaron eritrocitos mediante solución de lisis y se separaron leucocitos. Del suero y leucocitos se aisló RNA con método tradicional. La transcripción en reversa se realizó utilizando el amplicón D2-D1 especifico correspondiente a la región génica Pre-M del virus. Se incluyó transcriptasa inversa AMV ( avian mieloblastosis virus). La cadena resultante se sometió a PCR anidado mediante los primers TS1, TS2, TS3y TS4 de los cuales se esperaba obtener amplicones de 482, 119, 290 y 392 pb. Respectivamente. ANALISIS DE LA INFORMACION: Las variables estudiadas fueron Dengue clásico, Dengue hemorrágico y subtipos 1, 2, 3 y 4, en primera instancia se realizo un análisis estadístico univariado aplicando tablas de frecuencias, gráficas circular, de barras, así como diagramas de cajas y alambres. Posteriormente se efectuó un análisis divariado que consistió en hallar las posibles correlaciones del padecimiento.

Resultados:
En la Amplificación de la región D1-D2 por RT-PCR, se observo que el 100% de las muestras del grupo de casos fue positivo

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para Virus dengue, en la determinación de los subtipos virales para por NESTED PCR se observaron las siguientes expresiones medidas en porcentajes: subtipo viral T1 (0%) T2 (30%) T3 (15%) T4 (12.5% ) y en combinaciones por reinfección T2-T1(2.5%) T2-T3 (37.5%) Y T2-T4 (2.5%). Con ello se logro identificar que el 42.5 % correspondió a dengue hemorrágico y el 57.5 % para dengue clásico.

anti viral durante meses no permite diferenciar con certeza si la infección corresponde a un brote primario o secundario y con el inconveniente de presentar reacción cruzada a antígenos homólogos y heterólogos , por lo tanto no es posible identificar si se trata de una infección por algún otro de los 4 subtipos virales o reacción cruzada a otro flavivirus.

Referencias Bibliográficas:
1.

Discusión:
El diagnostico molecular de dengue por medio de RT-PCR y PCR anidado múltiple es un análisis sumamente confiable en el diagnostico de la enfermedad y clasificación del subtipo viral. Este método conduce a un diagnostico del dengue en su fase aguda desde el primer día de evolución aislando RNA viral del suero de los pacientes en fase aguda o convalecientes, para identificación de los 4 subtipos virales ; además de contribuir al diagnostico etiológico también lo hace significativamente en el control clínico y diferenciación entre una entidad clínica primaria o secundaria otorgando además especificidad diagnostica del 98%.

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2.

3.

Conclusión:
Entre las técnicas serológicas mas comúnmente utilizadas es la captura de IgG e IgM, por método de ELISA IgM es detectable entre el día 3 y 5 en el 50% de los pacientes en la fase aguda de la enfermedad primaria o secundaria y alcanza su pico durante 2 semanas y declina hasta hacerse imperceptible a los 2 o 3 meses de evolución. El serodiagnóstico de infección por dengue identificando IgG

4.

5.

6.

33

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10. Dengue

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INMUNOPATOGENIA

EN 200 PACIENTES CON

DENGUE
Armando Mendez Perez Salvador Contreras Huerta Mercedes Tepetla Peredo Dolores Carranza Gonzalez

Marco teórico:
La infección por virus del dengue causa una significativa morbilidad y mortalidad en los países tropicales. Aunque inicialmente se describió predominantemente en la infancia, esta enfermedad se ha diseminado actualmente en todos los grupos de edad, con el primer reporte de pandemia en 1950 con este primer brote en el sureste asiático. El virus del dengue pertenece al género de flavivirus y se divide en 4 serotipos cada uno de ellos es capaz de de ocasionar un espectro de expresión con un rango amplio desde portadores asintomáticos a una enfermedad febril con cifras altas de temperatura, hasta una discrasia hemorrágica con frecuencia fatal.Las primeras manifestaciones clínicas son entre 5 y 8 días post-inoculación, el huésped desarrolla una viremia que dura aproximadamente cinco días. Los síntomas más frecuentes son: fiebre elevada 39-40ºC intermitente bifásica, cefalea, mialgias, artralgias, con dolor cervical y lumbar, dolor retrocular, náuseas y/o vómito, dolor

abdominal. Los síntomas respiratorios (tos, rinitis, faringitis) son frecuentes y se pueden presentar erupciones cutánea maculopapular que aparece al comienzo de la fiebre o coincide con un segundo pico febril a los 35 días. Pueden observarse poliadenopatías, granulocitopenia, linfocitosis relativa y trombopenia En los casos severos de la enfermedad (DH) Dengue hemorrágico (SCHD) Síndrome de choque por dengue) además del cuadro anterior se presenta abruptamente hipotensión, déficit en la perfusión tisular periférica y manifestaciones hemorrágicas a distintos niveles siendo leves en algunos casos o evolucionando rápidamente hasta llegar a sufusiones en piel, tubo digestivo, sistema nervioso, aparato urinario y serosas con derrame pleural siendo letal un 10-40 por ciento de los casos. En el Dengue hemorrágico hay un descenso del nivel de plaquetas por debajo de 100.000/mm3 y un aumento del hematocrito (hemoconcentración) En los casos benignos o moderados, luego del descenso de la fiebre, el resto de los síntomas y signos retroceden recuperándose
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espontanèamente pero en los casos severos después de un descenso de la fiebre entre el 3º y el 7º día, el estado del paciente empeora repentinamente, presentándose cianosis, taquipnea, hipotensión, hepatomegalia, hemorragias múltiples y falla circulatoria. La situación es de corta duración, pudiendo llevar a la muerte en 12 a 24 horas (1 a 10% de los casos) o a la rápida recuperación luego del tratamiento antishock. Existe aumento de la permeabilidad vascular, hemoconcentración, trombocitopenia, y deplección del fibrinógeno (y del factor VIII, factor XII, etc.) con concentración elevada de sus productos de degradación. A pesar de los avances en el estudio de la respuesta inmunitaria del huésped a los antígenos virales la patogénesis no es exacta, aunque son varios los mecanismos involucrados simultáneamente. Este trabajo se inclina hacia el estudio de la función polarizada y dominante de linfocitos CD4 en particular su variante Th2.

UNIVERSO DE ESTUDIOSe estudiaron 200 muestras de suero con diagnostico clínico de dengue confirmado por RT-PCR de pacientes del Hospital Civil de Martínez de la Torre, Casa de Salud de la UV en Veracruz, Ver. Y Centro de Salud Carranza de la SSA ubicado en Colonia el manglar en Boca del Rio. Los pacientes cursaron con fiebre de 39.2°C, cefalalgia frontal, dolor retroorbitario, artralgias, mialgias y eritema cutáneo. De estos 200 casos 17 cursaron con dengue hemorrágico caracterizado por hemorragias puntiformes en mucosa oral, pinguéculas, púrpura e hipotensión. Como grupo control se usaron 40 sueros de individuos considerados sanos. VARIABLES: Virus Dengue: medida en escala nominal considerando presencia o ausenciaIL4, IL 9, CCL 18 y CCL 2 : medición cuantitativa en picogramos (pg). PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: Se obtuvieron 2 c.c. de suero de cada paciente estos se conservaron a menos 70°C e identificaron correctamente. Se llevo a efecto la cuantificación de IL 4, IL 9, CCL 18 y CCL 2 mediante método de ELISA con anticuerpos monoclonales recombinantes marca R&D Systems. Para cada una de las interleucinas se coloco una curva estándar, terminada la reacción y formación de complejos se realizo lectura de las muestras a 450nm en lector de microplacas y se obtuvieron lecturas derivadas de las absorvancias mismas que fueron utilizadas para hacer los cálculos expresados en picogramos. ANALISIS DE LA INFORMACION: Para la base de datos se empleo el Software Office 2007 Excel donde se realizo un análisis estadístico

Planteamiento del problema:
Se desconoce el comportamiento de la cinética inmunitaria en los 200 pacientes con virus Dengue.

Objetivo General:
Realizar la cuantificación de las interleucinas IL4, IL 9, CCL 18 y CCL 2 mediante método de ELISA con anticuerpos monoclonales recombinantes.

Metodología:
DISEÑO Prospectivo, Comparativo y Observacional. Transversal,

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para cada interleucina por separado obteniendo la media y realizando una comparación con el grupo control, aplicando gráficas de barras, así como diagramas de cajas y alambres.

propiciando disfunción endotelial, esfacelación y trombocitopenia, previa fijación y activación del complemento.

Conclusión:
DISCUSION Y CONCLUSION: El primer contacto del virus con el sistema inmune se produce cuando se internaliza en células dendríticas a nivel tisular. Estas células procesadoras y presentadoras de antígenos alojan las partículas virales en retículo endoplásmico y endosomas donde RNA viral interactúa con Toll 4 y se activa el sistema inmunocompetente . Una vez que estas líneas de células se activan liberan IL 4. Este mediador propicia por vía paracrina transducción y transcripción en células procesadoras y presentadoras de antígenos de CCL 18, esta proteína es quimiotactico de Linfocitos Th2 los cuales al activarse sintetizan IL 9. CD 40L es expresado en linfocitos TH2 y a través de este ligando con CD40 en linfocitos B transcriben la síntesis de IgM e IgG. Estas inmunoglobulinas identifican antígenos virales que forman complejos y dibujan un tipo de lesión humoral mediada por anticuerpos al unirse al RII gamma de inmunoglobulina en plaquetas y endotelio propiciando disfunción endotelial, esfacelación y trombocitopenia, previa fijación y activación del complemento.

Resultados:
Se observaron cifras elevadas en pacientes con dengue clásico de IL 4 28pg/ml (en testigos 3.6 pg/ml), CCL 18 arrojo cifras de 1348 pg/ml en pacientes ( testigos 789pg/ml,) IL 9 en pacientes mostro cifras de 265pg/ml (en controles 24 pg/ml.) y CCL2 60pg/ml (testigos 79.3 pg/ml).

Discusión:
DISCUSION Y CONCLUSION: El primer contacto del virus con el sistema inmune se produce cuando se internaliza en células dendríticas a nivel tisular. Estas células procesadoras y presentadoras de antígenos alojan las partículas virales en retículo endoplásmico y endosomas donde RNA viral interactúa con Toll 4 y se activa el sistema inmunocompetente . Una vez que estas líneas de células se activan liberan IL 4. Este mediador propicia por vía paracrina transducción y transcripción en células procesadoras y presentadoras de antígenos de CCL 18, esta proteína es quimiotactico de Linfocitos Th2 los cuales al activarse sintetizan IL 9. CD 40L es expresado en linfocitos TH2 y a través de este ligando con CD40 en linfocitos B transcriben la síntesis de IgM e IgG. Estas inmunoglobulinas identifican antígenos virales que forman complejos y dibujan un tipo de lesión humoral mediada por anticuerpos al unirse al RII gamma de inmunoglobulina en plaquetas y endotelio

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IDENTIFICACIÓN DE RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II Y CAVEOLINA-1 EN CORDÓN UMBILICAL Y CÉLULAS ENDOTELIALES DE CORDÓN UMBILICAL (HUVECS) DE
PACIENTES PREECLÁMPTICAS
José Arnold Gonzalez Garrido Aracely Lopez Monteon Ángel Ramos Ligonio José Rubén García Sánchez Guillermo Manuel Ceballos Reyes Enrique Méndez Bolaina

Marco teórico:
La preeclampsia es un desorden específico que afecta al 5% de las enzimas hepáticas todos los embarazos y es reconocida clínicamente por la presencia de hipertensión (HTA), aumento de y un bajo conteo de plaquetas (síndrome HELLP), proteinuria (presencia de proteínas en la orina) y edema, que ocurre después de la vigésima semana.1En algunos casos la preeclampsia progresa a algo más serio conocido como eclampsia, la cual conlleva al coma o la muerte materno-fetal. Cuando la preeclampsia no progresa a eclampsia puede dejar secuelas tales como fallo renal, ruptura hepática, retardamiento del crecimiento intrauterino y muerte fetal intrauterina2,3. Las causas de la preeclampsia no son conocidas, pero existe evidencia de estar asociada a la activación y disfunción endotelial, muchas investigaciones han demostrado mediante marcadores

endoteliales una probable asociación, proponiendo un incremento en la circulación de los niveles del factor de Von Willebrand, Angiotensina II (Ang II), endotelina y fibronectina.4 El sistema renina-angiotensina (encargado de la regulación de la presión arterial), realiza su función a través de la Ang II y sus receptores AT1 y AT2, los cuales están implicados en distintos procesos como el desarrollo y diferenciación celular.5En 1953 se observo en la membrana celular de células endoteliales la presencia de invaginaciones, las cuales se denominaron como “caveolas”.6,7 Estudios posteriores encontraron la presencia de proteínas en las caveolas, denominándolas caveolinas (Cav), describiéndose tres tipos Cav-1, -2 y -3. Dentro de las caveolinas destaca la cav-1 por tener funciones importantes para la caveola como; direccionar la formación de caveola y ser un inhibidor inespecífico de proteínas tirosina cinasa (mediante su péptido definido en el aminoácido 82-101, CSP-1), por lo que
Biomédicas Universidad Veracruzana

Estudiante de Doctorado Centro arngonzalez@uv.mx

de

Investigaciones

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la cav-1 podría tener un papel importante en la disfunción endotelial que se presenta en la preeclampsia

Planteamiento del problema:
Debido a que la preeclampsia es una enfermedad de la que se desconocen sus causas de origen, y se asocia a una activación y disfunción endotelial, el enfoque de este trabajo es evidenciar la disfunción a nivel de los receptores de Ang II y observar si existe un cambio en la expresión de la Cav-1, la cual es un inhibidor inespecífico de proteínas cinasas.

Objetivo General:
Determinar la expresión de las proteínas AT1, AT2 y Cav-1 en el cordón umbilical y células endoteliales del cordón de mujeres embarazadas con preeclampsia.

Metodologia:
Tipo de Estudio: Investigación Básica Recolección de Muestras. Se realizó un estudio experimental con cordones umbilicales de pacientes eutócicos y preeclámpticos donados por el Hospital General Córdoba, Veracruz, llevado a cabo de Agosto de Octubre de 2009 a Marzo de 2010. Se realizaron cultivos de endotelio de cordón umbilical de pacientes eutócicos y preeclámpticos, se transportaron de 2 a 4 cordones umbilicales frescos en solución de transporte. Los cordones se procesaron en campana de flujo laminar, se extrajeron las células endoteliales, las cuales fueron resuspendidas en Medio Suplementado y fueron sembradas en caja de cultivo de 75 cm2, se incubaron y se observó su crecimiento de 5 a 6 días posteriores a su

obtención, manteniéndose en crecimiento hasta confluencia celular. Una vez obtenido los cultivos se realizaron ensayos de inmunocitoquímica para caracterizar al endotelio a través de la identificación del factor Von Willebrand, el cual es expresado solo por células endoteliales y megacariocitos.Inmunocitoquímica de proteínas AT1, AT2 y Cav-1 en HUVECs Una vez caracterizado el endotelio se realizaron los ensayos de inmunocitoquímica indirecta para observar la inmunoexpresión de las proteínas AT1, AT2 y Cav-1, utilizando anticuerpos contra cada una de las proteínas, posteriormente se utilizó un anticuerpo secundario acoplado a FITC y TRIC. Se realizo el conteo de pixeles en el programa IPLab 3.6.5 y los datos se sometieron a un análisis estadístico. Western Blot en el cordón umbilical. Se realizó el análisis de la expresión de los receptores de Ang II en el cordón umbilical de embarazos eutócicos y preeclámpticos. Se realizó la extracción de proteína de los cordones umbilicales y se cuantificó la proteína mediante el método de lowry. Se realizó el Western Blot en condiciones desnaturalizantes para identificar la presencia de las proteínas AT1, AT2, Cav-1 y GAPDH mediante el uso del anticuerpo antiAT1 (1:200), AT2 (1:200), Cav-1 (1:500) y GAPDH (1:3000) (Santa Cruz Biotechnology). Se realizó el revelado de las membranas por la reacción de la Diaminobencidina (DAB), identificándose la presencia de las proteínas. Se realizó un análisis densitométrico de los Blots en el programa Labworks 4.0, estos experimentos fueron realizados por triplicado y se sometió a un análisis estadístico en el programa Prism 5.0. Para evidenciar las diferencias estadísticas por

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medio de p 0.05.

Resultados:
En el análisis de la expresión de las proteínas AT1, AT2 y Cav-1 en el cordón umbilical. Se encontró que el receptor AT1 está presente en una mayor expresión en los cordones de preeclampsia en comparación con los cordones eutócicos. Al analizar su expresión en las HUVECs se encontró AT1 está presente en una mayor expresión en HUVECs de preeclampsia en comparación con las HUVECs eutócicas observándose en el análisis diferencias estadística de p<0.05. En la expresión del receptor AT2 se encontró un aumento en la expresión en los cordones de preeclampsia en comparación con los cordones eutócicos observándose en el análisis densitométrico una diferencia estadística de p<0.05. Al analizar su expresión en HUVECs se encontró que el receptor AT2 está presente en una mayor proporción en las HUVECs de preeclampsia en comparación con las HUVECs eutócicas, encontrándose diferencias significativas. En la expresión de Cav-1 no se encontró ninguna diferencia en cordones eutócicos o preeclámpticos, al analizar la expresión de Cav-1 en las HUVECs no se encontró ninguna diferencia en su expresión, tanto en las HUVECs eutócicas o preeclámpticas. En ambos análisis no se encontraron diferencias significativas.

Discusión:
Se han realizado estudios que han evidenciado en la preeclampsia la implicación de los receptores de Ang II en tejido placentario, mostrando que el receptor AT1 se encuentra disminuida su

expresión, debido a una baja participación de la placenta en la disfunción causada por la preeclampsia,9 por otra parte nosotros realizamos la evaluación de la expresión de los receptores en el cordón umbilical de pacientes con embarazos eutócicos y preeclámpticos, donde se observó que los receptores AT1 y AT2 en el cordón umbilical de preeclampsia se encuentra aumentada su expresión con respecto al cordón eutócico, sin embargo, fue evidente el incremento en la expresión del receptor AT2 en comparación con el receptor AT1 en ambos cordones, donde se ha descrito que la expresión del receptor AT2 es importante en el desarrollo y diferenciación celular, asociando su aumento en la expresión en tejidos neonatales.10 Aunque, a pesar de que el cordón contiene una variedad de células, al evaluar la expresión de estos receptores en el cultivo de endotelio de cordón umbilical se encontró que la expresión de los receptores de Ang II se mantiene de la misma forma que en el cultivo celular. Lo cual nos permite sugerir que el endotelio mantiene la expresión del tejido al cultivo.La proteína Cav-1 que es parte de la caveola, y dentro de este está contenido el péptido de anclaje de Cav-1 definido en el aa 82-101, el cual es un inhibidor inespecífico de cinasas y de gran importancia en el funcionamiento celular.11 La expresión de la Cav-1 no mostro diferencias en los cordones eutócicos o preeclámpticos, además de que se realizo su búsqueda en endotelio en cultivo, en los cuales se mantuvo la misma expresión que en el cordón umbilical. Se ha propuesto que el desarrollo de la hipertensión en la preeclampsia resulta del daño endotelial generalizado y/o falta de equilibrio en la

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producción y/o acción de agentes vasoactivos, dentro de estos agentes determinantes se encuentra la Ang II que lleva a cabo su acción a través de sus receptores AT1 y AT2, de los cuales, el receptor AT1 se ha descrito que participa en la vasoconstricción y que el receptor AT2 es un antagonista del receptor AT1, el cual se une directamente formando un heterodímero que inhibe la función de vasoconstricción de receptor AT112, en nuestros resultados observamos que en el endotelio preeclámptico la expresión de estos receptores se encuentra aumentada en comparación con el endotelio eutócico, evidenciando la disfunción endotelial en el endotelio preeclámptico. Por otra parte, se ha descrito que el CSP-1 es un inhibidor inespecífico de tirosinas cinasas13, al realizar los ensayos para detectar la presencia de la Cav-1 encontramos que no hay cambios en la expresión de esta proteína tanto en el endotelio eutócico como preeclámptico, por lo cual al aumentar “in vitro” el CSP-1 nos permitirá en un futuro próximo evaluar su desempeño en un endotelio eutócico y preeclámptico

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6.

Conclusión:
De acuerdo a nuestro objetivo general que fue determinar la expresión de las proteínas AT1, AT2 y Cav-1 en la preeclampsia encontramos un aumento en la expresión de las proteínas AT1 y AT2 tanto en el cordón umbilical completo como en las HUVECs. Por otra parte la expresión de Cav-1 no mostró diferencias en su expresión en el cordón umbilical completo ni en las HUVECs de pacientes con embarazos eutócicos y preeclámpticos.
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EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CATEQUINA Y EPICATEQUINA DE THEOBROMA CACAO SOBRE LAS LÍNEAS MDA-MB 231 Y BT-474 DE CÁNCER DE MAMA
Melissa Hernández Martínez . Ivonne María Olivares Corichi Guillermo Manuel Ceballos Reyes José Rubén García Sánchez José Arnold Gonzalez Garrido

Marco teórico:
A nivel mundial, el cáncer de mama es la neoplasia más común entre las mujeres, reportándose 411,000 muertes al año a causa de esta enfermedad y correspondiendo al 10.5% de todos los nuevos casos de cánceres registrados [1].El cáncer de mama se define como una proliferación acelerada, desordenada y no controlada de las células que forman la glándula mamaria. En México, se estima que doce mujeres mueren diariamente a causa de esta neoplasia [2].Hoy en día se sabe que el cáncer de mama es una enfermedad multifactorial donde genes encargados de la regulación del ciclo celular, genes supresores de tumor y genes involucrados en el crecimiento y diferenciación celular muestran alteraciones. Si bien, es indudable la participación de los mecanismos

genéticos, las modificaciones epigenéticas están emergiendo rápidamente como alteraciones que ocurren en las primeras fases de la tumorogenesis y que juegan un papel importante en el desarrollo y la progresión del tumor [3]. Actualmente existe un gran número de evidencias que señalan a la dieta como un elemento clave en la prevención del cáncer de mama [4]; de hecho, efectos quimio preventivos de los componentes fitoquímicos de frutas y hortalizas han sido detectados, así como su capacidad de activar genes silenciados por alteraciones epigenéticas [5] y su posible capacidad de modular eventos celulares como son la apoptosis, la diferenciación y el ciclo celular [6].Uno de los fitoquímicos más representativos e intrigantes son los polifenoles; una familia de compuestos que

Estudiante de Maestría E.S.M. SECCION DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL meily_zza@hotmail.com

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se han propuesto como una posible terapéutica contra el cáncer [7]. Entre estos polifenoles tenemos a los flavonoides, que incluyen los monómeros de Catequina y Epicatequina, los cuales se les relaciona con las propiedades antineoplásicas, sin embargo los mecanismos moleculares involucrados con estos efectos son poco entendidos.

Planteamiento del problema:
Debido a que los flavonoides han sido propuestos como una posible terapia en la carcinogénesis, la pregunta a resolver está enfocada en determinar si los flavonoides Catequina y Epicatequina en su forma monomérica presentan efectos antiproliferativos en las líneas celulares MDA MB-231 y BT-474 provenientes de cáncer de mama.

Objetivo General:
Evaluar el efecto de Catequina y Epicatequina sobre la proliferación celular y la inducción de apoptosis en las líneas MDA MB-231 y BT-474 provenientes de cáncer de mama.

Metodologia:
Tipo de estudio: Investigación básica. Reactivos: Catequina y Epicatequina se obtuvieron de SIGMA Aldrich. Fueron disueltos en metanol a una concentración de 10 mM y almacenados a -20oC. MTT (3-[4,5Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) se disolvió en DMEN sin rojo de fenol y se almaceno a 4oC. Líneas celulares: Se emplearon las líneas celulares provenientes de carcinoma de mama; BT-474 (ductal) crecida en DMEN AVANZADO, suplementado con 10% de suero fetal bovino

(FBS) y la línea MDA MB-231(lobulillar) crecida en DMEN Alto en glucosa y suplementado con 7.5% de FBS. Ambas líneas se mantuvieron a 37oC, 5% de CO2 y 95% de humedad. Ensayos de viabilidad celular. Las líneas celulares MDA MB-231 y BT-474 (1X103, 5X103 y 1X104) fueron sembradas en cajas de 96 pozos y se mantuvieron por 24 hrs en condiciones de cultivo. Posteriormente las células fueron incubadas con epicatequina y catequina (100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 y 450 µM) por 72 hrs. La viabilidad celular fue determinada empleando el reactivo de MTT y de acuerdo al protocolo estándar. Curvas dosis respuesta fueron construidas con los resultados obtenidos y la concentración inhibitoria 50 (CI50) fue determinada.Efecto de la mezcla Epicatequina-Catequina sobre la viabilidad celular. Las líneas celulares MDA MB-231 (1x104 células) fueron sembradas en caja de 96 pozos y se dejaron reposar 24 hrs. Las células fueron incubadas con la mezcla Epicatequina-Catequina [350 µM de cada flavonoide] por un periodo de 72 hrs. La viabilidad celular fue determinada cada 24 hrs empleando el reactivo de MTT y de acuerdo al protocolo estándar. Como un control del efecto de cada flavonoide; Epicatequina y Catequina fueron empleados individualmente y sus efectos sobre la viabilidad fueron determinados como se menciono anteriormente. Determinación de apoptosis por fragmentación de ADN. Las células MDA MB-231 y BT-474 (1x106) fueron sembradas y se mantuvieron por 24 hrs en condiciones de crecimiento. Posteriormente, se cambio el medio por DMEN claro en la presencia de los compuestos fenólicos (350 µM). Cada 24 hrs las células fueron recolectadas y el ADN fue

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obtenido. Las células fueron lizadas, el DNA fue obtenido por precipitación y su análisis se realizó a través de electroforesis en geles de agarosa al 2%.Análisis estadístico. Los ensayos de proliferación celular fueron realizados por cuadruplicado, se realizaron dos veces y se analizaron con el programa estadístico GraphPad Prism versión 5.

Resultados:
Con el objetivo de evaluar el efecto antineoplásico de Catequina y Epicatequina sobre las líneas MDA MB-231 y BT-474 se realizaron ensayos de proliferación celular, para lo cual, se sembraron diferente número de células de ambas líneas celulares en presencia de los compuestos fenólicos a diferentes concentraciones (ver material y métodos).Los ensayos de proliferación celular mostraron que la línea MDA MB-231 presentó un efecto inhibitorio en su proliferación celular con ambos flavonoides, dicho efecto fue dependiente de la concentración e independiente del número de células. Al evaluar la proliferación de la línea celular BT-474 bajo estas condiciones no se observó efecto alguno. Con los datos obtenidos con Catequina y Epicatequina sobre la proliferación celular en la línea MDA MB-231 se calculó la Concentración Inhibitoria 50 (CI50) obteniendo un valor de: 350 µM para ambos compuestos. Con el objetivo de observar si Catequina y Epicatequina administrados en combinación producían un mayor efecto, se realizaron ensayos de proliferación celular con la línea MDA MB-231 (ver material y métodos). Los resultados obtenidos mostraron un mayor efecto inhibitorio en la presencia de esta mezcla de flavonoides, este resultado

sugiere la existencia de diferentes mecanismos de acción de estos flavonoides. Este resultado abrió la posibilidad de estudiar un posible efecto de esta mezcla en la línea celular BT-474, los ensayos de proliferación celular en la línea BT-474 y la mezcla de flavonoides mostraron un efecto inhibitorio. Para evaluar el posible mecanismo de acción de estos flavonoides, la línea celular MDA MB-231 se creció en presencia de epicatequina, catequina y la mezcla (ver material y métodos). El ADN fue obtenido y analizado electroforéticamente en geles de agarosa al 2 %. Los resultados obtenidos mostraron que Catequina, Epicatequina y la mezcla inducen una fragmentación del ADN indicativa de apoptosis. Similares resultados fueron obtenidos en la línea BT-474 cuando la mezcla de flavonoides fue empleada.

Discusión:
En el presente estudio se demostró la acción antiproliferativa de los monómeros de Catequina y Epicatequina en las líneas celulares MDA MB-231 y BT-474 provenientes de cáncer de mama. Si bien, un efecto inhibitorio sobre la proliferación celular de MDA MB-231 fue observado con ambos flavonoides, un mayor efecto fue detectado cuando una mezcla de ambos flavonoides fue utilizada. Interesantemente, el efecto inhibitorio en la línea celular BT-474 solo fue observado cuando la mezcla de ambos flavonoides fue empleada. Es importante señalar, que si bien, hoy en día la gran mayoría de los estudios son orientados a los polímeros de estos compuestos [8], en este trabajo presentamos las propiedades antineoplásicas de estos monómeros. Por

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otro lado, los resultados obtenidos en el análisis del ADN bajo estas condiciones, mostraron una fragmentación característica indicadora de la presencia de apoptosis, sugiriendo como un posible mecanismo de acción la inducción de muerte celular programada en la célula tumoral por parte de estos monómeros.

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Conclusión:
Los ensayos de proliferación celular muestran que los monómeros Catequina y Epicatequina tienen un efecto inhibitorio sobre la proliferación celular independiente del número de células en la línea MDA MB231.La combinación de los compuestos fenólicos produjo un mayor efecto en la inhibición del crecimiento de la línea celular MDA MB-231.El efecto antineoplásico de Catequina y Epicatequina en la línea celular BT-474 solo fue observado cuando una mezcla de estos flavonoides fue utilizada.El análisis electroforético del ADN de células MDA MB-231 y BT-474 tratadas con catequina y epicatequina sugiere a la apoptosis como un posible mecanismo de acción de estos flavonoides.

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DETECCIÓN DE CHLAMYDIA TRACHOMATIS Y NEISSERIA
GONORRHOEAE EN ESPECÍMENES GENITOURINARIOS MEDIANTE PCR MÚLTIPLE.
Salvador Contreras Huerta Armando Mendez Perez Yuritzi Alejandra Sandoval Hernandez Martha Lucero Mirafuentes Merino Julio Cesar Baizabal Rebolledo

Marco teórico:
Las infecciones de transmisión sexual (ITS) figuran entre las principales causas de enfermedad en el mundo. Durante los últimos 20 años su importancia se ha acrecentado debido a su relación con graves problemas del aparato reproductor. Aunque la magnitud exacta del problema no es bien conocida, en los países industrializados al menos 1 de cada 100 personas consulta por una ITS, anualmente. En los países en desarrollo las ITS figuran entre los cinco motivos más frecuentes de consulta en los servicios de salud y cada año más de 333 millones de personas en el mundo adquieren una ITS, la mayoría de las cuales son previsibles y curables. En muchos casos, estas infecciones permanecen asintomáticas y sin tratamiento, con riesgo de contagio a otros individuos y con la posibilidad de ocasionar serios problemas de salud, incluyendo la infertilidad. Previamente, las ITS de mayor relevancia eran sífilis y gonorrea, sin embargo en la actualidad el

agente de mayor importancia es Chlamydia trachomatis (CT). Este agente infeccioso causa cerca de 90 millones de nuevos casos de infección genital por año, seguido de gonorrea que ocasiona 60 millones de nuevos casos por año. En la mayoría de los individuos de uno u otro sexo la infección genital por CT suele ser asintomática. Sin embargo, en 30% de mujeres que presentan cervicitis se ha observado desarrollo de salpingitis. Asimismo, se puede aislar CT hasta en 50% de las mujeres con enfermedad pélvica inflamatoria.6 Esta situación es preocupante porque la infección tubaria puede degenerar en obstrucción permanente y a consecuencia de ello producir infertilidad, o cuando se ocasiona obstrucción parcial puede presentarse embarazo ectópico.7 La infección por Neisseria gonorrhoeae (NG) es también causa de salpingitis e infertilidad. Por otra parte, las úlceras genitales ocasionadas por infecciones bacterianas constituyen condiciones de riesgo para la transmisión del

Docente y Profesional de la salud DEPARTAMENTO MEDICINA. UV XALAPA. qcpatoex@hotmail.com

DE

PATOLOGIA

EXPERIMENTAL

FACULTAD

DE

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virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus del papiloma humano (VPH), y por lo tanto para el SIDA y el cáncer cérvicouterino. En hombres la uretritis gonocóccica o clamidiásica puede ser asintomática hasta en 30% de los casos. Se ha observado que la infección subclínica crónica puede degenerar en prostatitis, epididimitis, estenosis de uretra y de los conductos deferentes, con el riesgo de esterilidad por azoospermia.En vista de la importancia que las ITS tienen para la salud pública y personal es necesario conocer su frecuencia y características de presentación. En México se ha documentado que la prevalencia de infección por CT en el tracto genital inferior varía entre 3.3 y 28.4%, y la de gonorrea entre 2.8 y 11.6%, dependiendo de la población muestreada y de la metodología utilizada para el diagnóstico.

pacientes con edades variables (18-50 años) y de ambos sexos (28 femeninos y 12 masculinos) con diagnostico presuntivo de ITS por clamidia y gonococo. Cada uno de los pacientes incluidos en este estudio otorgo su consentimiento y proporciono información personal así como de inicio de vida sexual y numero de parejas. Se incluyeron también 20 individuos considerados sanos que sirvieron como grupo control para realizar la validación del estudio. VARIABLES: Chlamydia trachomatis: medida en escala nominal considerando presencia o ausenciaNeisseria gonorrhoeae: medida en escala nominal considerando presencia o ausencia. PROCEDIMIENTO DE RECOLECCION: La recolección del material biológico se efectuó de varias formas, en mujeres se obtuvo muestras de orina y de secreción vaginal, en varones fue raspado uretral, secreción purulenta y de orina según las condiciones de cada paciente. Concluida la recolección las muestras fueron rotuladas y procesadas de inmediato. Para la obtención de ADN se realizaron lavados de las secreciones y centrifugados de las orinas, se obtuvo en todos los casos un botón celular el cual fue sometido a lisis nuclear, una vez liberado el ADN se purifico con lavados de etanol absoluto, 96% , 70% y se solubilizo con NaOH 0.8mM.El ADN de cada una de las muestras fue amplificado por PCR Múltiple mediante el uso de dos pares de iniciadores KL1/KL2 y HO1/HO3 específicos para clamidia y gonococo respectivamente. Concluida la amplificación se efectuó electroforesis en geles de agarosa al 1.5% en buffer de TBE 1X para la identificación de productos.

Planteamiento del problema:
No se dispone de información exacta sobre la prevalencia de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae identificada por PCR Múltiple en especímenes genitourinarios.

Objetivo General:
Detectar y determinar la prevalencia de Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae mediante PCR Múltiple en especímenes genitourinarios.

Metodología:
DISEÑO Prospectivo, Comparativo y Observacional. Transversal,

UNIVERSO DE ESTUDIO: Se muestrearon 40

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ANALISIS DE LA INFORMACION: Las variables estudiadas fueron Chlamydia trachomatis y Neisseria gonorrhoeae, en primera instancia se realizo un análisis estadístico univariado aplicando tablas de frecuencias, gráficas circular, de barras, así como diagramas de cajas y alambres. Posteriormente se efectuó un análisis divariado que consistió en hallar las posibles correlaciones del padecimiento.

pueden ser comparables con las descritas en la literatura al demostrarse que el grupo femenino es el más comprometido y por consiguiente el mas afectado.En nuestro estudio la mayor prevalencia de infección es la descrita para C trachomatis y con un porcentaje menor la combinación de ambas entidades patológicas. Respecto a los varones los resultados indican una menor prevalencia tanto de gonorrea como de clamidiasis. Como se mencionó en México no existen datos que revelen la estadística de casos diagnosticados por PCR Multiple para C.trachomatis y para N. gonorrhoeae ya que la mayoría de los estudios han utilizado como marcador de infección la presencia de las bacterias en secreciones genitales, identificadas a través de diversas técnicas con diferente sensibilidad y especificidad. Considerando que esta investigación constituye una de las primeras que se realizan con iniciadores específicos para ambas entidades utilizando como indicador de infección la presencia de ADN de las mismas.

Resultados:
En la Amplificación por PCR Múltiple con los iniciadores KL1/KL2 y HO1/HO3, se observo que de los 40 casos sospechosos para ITS 24 (60%) fueron positivos para Chlamydia trachomatis, 8 (20%) para Neisseria gonorrhoeae, 4(10%) para ambas entidades y 4(10%) resultaron negativas. Para el grupo control no hubo amplificación tal y como se esperaba.En la distribución por sexo se identifico que el grupo femenino tuvo amplificación para Chlamydia trachomatis en 15 casos (37.5%), 5 casos (12.5%) para Neisseria gonorrhoeae y 4 casos (10%) para ambas entidades; por su parte el grupo masculino presento 9 casos (22.5%) para Chlamydia trachomatis y 3 casos (7.5%) para Neisseria gonorrhoeae. Por su parte el grupo de edades con mayor numero de casos para ambas patologías fue el de 27 a 36 años con un 45% y de estos el 22% cuenta con mas de una pareja sexual y el 13% no cuenta con una pareja estable.

Conclusión:
Con lo expuesto anteriormente queda de manifiesto que el uso de pruebas especificas y de alta sensibilidad como el PCR Múltiple permiten identificar de manera rápida y efectiva a N gonorrhoeae y C trachomatis, generando un diagnostico oportuno que permite prevenir fundamentalmente las secuelas en el aparato reproductor causando infertilidad en ambos sexos y disminuir la gravedad de las infecciones. A su vez este procedimiento es relevante con fines diagnósticos, con el propósito de definir la epidemiología de las infecciones de

Discusión:
Los resultados de este estudio demuestran que la tasa de individuos con riesgo de contraer o que cursan cualquiera de estas dos patologías infecciosas es muy alto. Las cifras encontradas en mujeres y hombres

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transmisión sexual y para determinar la susceptibilidad antimicrobiana.

Referencias Bibliográficas:
1. Anceschi, M. M., C. Falcinelli, M. Pieretti, and E. V. Cosmi. 1990. Multipleprimer pairs polymerase chain reaction for the detection of human papillomavirustypes. J. Virol. Methods 28:59–66. 2. Bauwens, J. E., A. M. Clark, M. J. Loeffelholz, S. A. Herman, and W. E.Stamm. 1993. Diagnosis of Chlamydia trachomatis urethritis in men by polymerasechain reaction assay of first-catch urine. J. Clin. Microbiol. 31:3013–3016. 3. Birkenmeyer, L., and A. S. Armstrong. 1992. Preliminary evaluation of theligase chain reaction for specific detection of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin.Microbiol. 30:3089–3094. 4. Bobo, L., B. Munoz, R. Viscidi, T. Quinn, H. Mkocha, and S. West. 1991.Diagnosis of Chlamydia trachomatis eye infection in Tanzania by polymerasechain reaction/enzyme immunoassay. Lancet 338:847–850. 5. Cano, R. J., J. C. Palomares, M. J. Torres, and R. E. Klem. 1992. Evaluationof a fluorescent DNA hybridization assay for the detection of N. gonorrhoeae.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11:602–609 6. Chernesky, M. A., S. Castriciano, J. Sellors, I. Stewart, I. Cunningham,S.

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.

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CLONACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GENE QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA NS3 DE LOS 4 SEROTIPOS
DEL VIRUS DENGUE
Laura Mónica Álvarez Rodríguez Méndez-Bolaina Enrique Ramos-Ligonio Angel Aracely López-Monteon

Marco teórico:
El dengue es un padecimiento infeccioso viral de tipo agudo y de distribución mundial causado por cualquiera de los cuatro serotipos del virus del dengue (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4), el cual es transmitido al humano por la picadura de la hembra hematófaga del mosquito del género Aedes (1). La infección por cualquiera de los 4 serotipos del virus puede provocar cuadros clínico variados que van desde una forma asintomática hasta ciertas manifestaciones clínicas, y aún causar la muerte. Básicamente, se reconocen tres cuadros clínicos: la fiebre del dengue o dengue clásico (FD), la fiebre hemorrágica por dengue o dengue hemorrágico (FHD) y el síndrome de choque por dengue (SCD) (2). Este virus posee un RNA el cual codifica para una poliproteína que es procesada por proteasas tanto de origen viral como celular dando origen a 10 proteínas, 3 estructurales (C, prM, E) y 7 no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, y NS5 (3).

El tratamiento para la infección del dengue solo se basa en aliviar síntomas relacionados con la enfermedad, ya que no existen agentes terapéuticos específicos para eliminar al virus (4). Por este motivo, el desarrollo de vacunas contra el dengue se ha convertido en una prioridad a nivel mundial, para prevenir epidemias tanto en países endémicos como no endémicos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) menciona que una vacuna contra el dengue debe brindar protección de larga duración frente a la infección por cualquiera de los 4 serotipos del dengue (5). Las técnicas de biología molecular han permitido la clonación de genes que codifican para proteínas del virus, esto nos proporciona la oportunidad de evaluar posibles inmunógenos que podrian ser buenos candidatos a vacunas. En el ser humano, la respuesta inmune contra el virus del dengue ha sido muy variada y está dirigida frente a diversos epitopos de las proteínas víricas. Estos epitopos, específicos para cada serotipo, pueden utilizarse para el diseño y
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creación de vacunas tretavalentes que protejan hacia los 4 serotipos. Las proteínas no estructurales, como NS1 y NS3, se han reportado como buenos inmunógenos, por lo que las hace buenos candidatos en el desarrollo de vacunas contra el dengue (6).

virus dengue (VD) y que posee en su mayoría epitopes para células T, en el presenta trabajo se propuso la construcción de una proteína recombinante de cada serotipo con la finalidad de utilizarlos como candidatos a vacunas.

Planteamiento del problema:
A pesar de la gran incidencia del dengue en el mundo y de su grave situación, no se dispone de vacunas preventivas ni fármacos antivirales específicos para el tratamiento del dengue. En la actualidad, existen proyectos en desarrollo que intentan construir vacunas recombinantes que expresen las proteínas externas de todos los serotipos. La mayoría de las vacunas se han preparado utilizando partículas virales inactivas o modificadas. Las vacunas producidas exclusivamente a partir de las proteínas virales externas sintetizadas en bacterias son más seguras dado que, sin el ácido nucleico viral, no puede ocurrir contaminación de la vacuna por partículas infectivas. Sin embargo, las dificultades en desarrollar una vacuna efectiva se centran en el requisito indispensable de una vacuna tetravalente protectora contra los cuatro serotipos. Se sabe que anticuerpos presentes en un individuo que ha sufrido FD representan un factor de riesgo para FHD, facilitando la entrada a la célula del serotipo reinfectante. Por lo tanto, una inmunización parcial con una vacuna monovalente implicaría un riesgo aumentado en el individuo vacunado de sufrir una forma más severa de enfermedad ante una infección con alguno de los otros tres serotipos. Tomando en cuenta todo lo anterior, y a que la proteína NS3 es el principal antígeno del

Objetivo General:
Clonar un fragmento del gene que codifica para la proteína NS3 de los 4 serotipos del virus dengue.

Metodologia:
Es un estudio experimental. Se utilizó la línea celular C6/36 de Aedes albopictus infectada con los cuatro serotipo del virus dengue para aislar el RNA viral mediante el método de TRizol (7). El RNA fue inmediantamente retrotranscrito a cDNA. El cDNA se empleo como molde para amplificar un fragmento del gen de la proteína NS3 del virus dengue mediante PCR utilizando oligonucleótidos serotipo-específicos (8). Los productos de PCR de cada serotipo se ligaron de manera independiente en el vector de clonación pCR 2.1 TOPO. Con el DNA plasmídico de cada una de las clonas de cada serotipo se realizaron reacciones de restricción con la enzima Eco RI para identificar la liberación de los fragmentos de NS3. Con la finalidad de expresar los fragmentos de NS3 de cada serotipo, éstos, se subclonaron en el vector de expresión pGEX-5X-1 el cual fue linearizado con la enzima Eco RI. Las clonas obtenidas se crecieron para la extracción del DNA plasmídico por lisis alcalina, posteriormente fueron sometidas a reacciones de restricción y los fragmentos fueron analizados en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. Para

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identificar la expresión del gen de la proteína NS3 se utilizaron las clonas positivas al fragmento de cada serotipo. Brevemente, se realizaron cultivos no inducidos e inducidos con IPTG, se realizaron extractos celulares los cuales se analizaron mediante geles de poliacrilamida al 10% y teñidos con azul de coomassie. Finalmente se comprobó la expresión del fragmento del gen de la proteína NS3 de los cuatro serotipo mediante Western Blot (WB) utilizando un Ab policlonal dirigido contra GST.

expresaron una proteína de 49 kDa (22 kDa correspondiente al fragmento NS3 y 27 kDa correspondientes a la GST). Para comprobar la expresión de la proteína recombinante se realizo un WB con un anticuerpo policlonal anti-GST observándose el reconocimiento de la proteína recombinante del peso esperado.

Discusión:
Debido al impacto actual del dengue en todo el mundo y su diseminación, ha aumentado el interés en el desarrollo de una vacuna contra el dengue que sea segura, eficaz y que induzca protección de por vida hacia los cuatro serotipos. Los avances en las técnicas de biología molecular han facilitado el desarrollo de vacunas recombinantes contra diferentes virus, lo que ha permitido la producción de proteínas a gran escala. La mayoría de los esfuerzos se han enfocado a producir vacunas utilizando la proteína E, mientras que también se han utilizado las proteínas no estructurales del virus (NS) (9). La proteína NS3 se puede considerar como una posible candidato para el diseño de una vacuna debido a que constituye la fuente principal de epitopes de células CD4 + y CD8+ (10, 11). En principio, es factible realizar una vacuna contra el VD ya solo causa infección aguda y la replicación del virus es efectivamente controlada después de 3 a 7 días de viremia. Sin embargo los individuos que se han recuperado de una infección por VD, son inmunes al reto con el mismo serotipo pero no a otros serotipos del VD (12). Los problemas en el desarrollo de una vacuna contra el VD son que no se comprende aun la patogénesis del FHD, así como la ausencia de un modelo animal para la enfermedad. Se sabe que los anticuerpos

Resultados:
De las reacciones de ligación de cada uno de los fragmentos de NS3 de cada serotipo del VD en el vector pCR 2.1 TOPO, se selecciono una clona que mostro la liberación de un fragmento de 597, 596, 590 y 598 pb para el serotipo DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4 respectivamente. Los fragmentos de cada una de estas clonas se subclonaron en el sitio Eco RI del plásmido pGEX-5X-1 para obtener la proteína recombinante. Este plásmido tiene la característica de que la proteína sale fusionada a la GST, lo que facilita su purificación por afinidad. Se obtuvieron varias clonas positivas para cada serotipo, seleccionadas a través de la liberación del fragmento correspondiente, sin embargo, simultáneamente se realizaron ensayos de expresión piloto con IPTG debido a que la ligación se realizo con una sola enzima de restricción se corría el riesgo de que los fragmentos estuvieran en orientación contraria y esto diera lugar a la pérdida del marco de lectura abierto. De las clonas analizadas, se obtuvó una clona positiva para el serotipo DEN1, DEN2, DEN3 y tres clonas positivas para el serotipo DEN4, todas ellas

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pre-existentes contra el VD son un factor de riesgo para desarrollar FHD, por lo tanto, una vacuna efectiva deberá ser tetravalente y necesita prevenir la infección provocada por los cuatro serotipos el VD (13).

Conclusión:
6.

Figueroa R, Méndez A, Ramos C. (2005). Induction of protective antibodies against dengue virus by tetravalent DNA immunization of mice with domain III of the envelope protein. Vaccine. 23:3469-76. López Antuñano FJ, Mota J. (2000). Desarrollo de agentes inmunizantes contra el dengue. Rev Panam Salud Pública. 7(5): 285-292 Houts GE, Miyagi M, Ellis C, Beard A, and Beard JW. (1979). Reverse transcriptase from avian myeloblastosis virus. J. Virol. 29(2): 517–522. Li J, Lim SP, Beer D, Patel V, Wen D, Tumanut C, Tully DC, Williams JA, Jiricek J, Priestle JP, Harris JL, Vasudevan SG. (2005). Funtional profiling of recombinant NS3 proteases from all four serotypes of dengue virus using tetrapeptide and octapeptide substrate libraries. J.Biol.Chem. 280:28766-28774. Sugrue RJ, Fu J, Howe J, Chan YC. (2007). Expression of the dengue virus structural proteins in Pichia pastoris leads to the generation of virus like particles. J Gen Virol. 78:1861-1866.

Los resultados nos permiten concluir que tenemos las proteínas recombinantes correspondientes a la proteína NS3 del VD de cada serotipo, lo cual nos permitirá utilizarla como antígeno tetravalente en el modelo de ratón, la efectividad del candidato a vacuna se realizará comparando la respuesta inmune inducida por la vacuna con el perfil de inmunidad protectora desarrollada en una infección natural.

7.

8.

Referencias Bibliográficas:
1.

Hung SL, Lee PL, Chen HW, Chen LK, Kao CL, King CC. (1999). Analysis of steps involved in dengue virus entry into host cells. Virology. 257: 156167. Shu PY, Huang JH. (2004). Current Advances in dengue diagnosis. Clin Diagn Lab Immunol. 11(4):642-50. Beasley, D. (1994). Preparation of a recombinant dengue virus vaccine. A literature review highlights. httt://www.life.sci.qut.edu.au/david /litrev/litrev.htm. Gibbons RV, Vaughn DW. (2002). Dengue: an escalating problem. Clinical review. BMJ: 324(7353):1563-1566. Mota J, Acosta M, Argotte R,

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9.

3.

10. Kurane I, Zeng L, Brinton MA, Ennis

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5.

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VARIACIÓN DE LA RESPUESTA A UN ESTIMULO DOLOROSO EN RATAS WISTAR CON ANSIEDAD INDUCIDA BAJO UN ESTIMULO EXTERNO.
Victor Manuel Duran Sainz Rosa María Torres Hernández Rosa María Alvarez Santaman Pedro Gutierrez Aguilar

Marco teórico:
La ansiedad se define como un estado de malestar caracterizado por intranquilidad, expectación aprehensiva y aumento de la vigilancia en ausencia de un estimulo desencadenante; que se manifiesta también reacciones autonómicas, como la sudoración, taquicardia, alteraciones gastrointestinales, tensión muscular e insomnio, entre otras. Cuando un individuo se enfrenta a una situación de peligro se puede observar un conjunto de cambios conductuales y vegetativos orientado a contender de manera adecuada con dicha situación. Entonces, la ansiedad puede definirse como uno de los procesos cerebrales directamente involucrados en la sobrevivencia de diferentes especies animales, especialmente de aquellas que por su naturaleza son víctimas de los depredadores. La definición más aceptada de dolor la que indica que es una experiencia subjetiva acompañada de componentes

sensoriales y emociones desagradables y que frecuentemente está descrito en función de la magnitud del daño con el que se asocia. El término que involucra al conjunto de mecanismos por los cuales el estímulo nocivo periférico es transmitido al sistema nervioso central (SNC) se denomina nocicepción.3 Cuando un animal se enfrenta a un depredador, con frecuencia se puede observar que su primera reacción es escapar para evitar que lo captures. Si no puede escapar, entonces la respuesta predominante es mantenerse inmóvil, esta respuesta es directamente relacionada con la naturaleza del estímulo adverso; cuando éstos se enfrentan a un estímulo perturbador localizado, como un electrodo o una fuente de luz, despliegan un patrón conductual especifico dirigido a ocultar este estímulo. Esta conducta se conoce como conducta defensiva de enterramiento, y depende de la disponibilidad de material
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Facultad de Medicina Veracruz

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para enterrarse.4. El tipo de respuestas observada en los animales de laboratorio se agrupan en tres categorías.A) Músculoesqueléticas; B) Autonómicas y C) Conductuales (psíquicas) que incluyen: agresividad, vocalización, forcejeo y escape. Se considera que estas últimas son las más útiles desde el punto de vista experimental y se estima que representan una integración central del estímulo original.5Teniendo en cuenta la subjetividad del dolor y la similitud de esta experiencia en la mayoría de los seres dentro de la filogenia, los estudiosos del dolor han tratado de determinar parámetros comunes de evaluación, de ahí que numerosas investigaciones se hayan enfocado en el examen de las conductas asociadas al dolor, las que se catalogan como una serie de comportamientos con los que el animal comunica a su ambiente que está padeciendo una experiencia nociceptiva.En consecuencia, dentro de los variados modelos animales que existen para el estudio del dolor, existen los que se basan en la producción controlada de dolor por medios químicos o mecánicos, precisando determinadas características de la estimulación nociceptiva, como intensidad, localización, frecuencia, duración y se evalúan las respuestas dadas a dicha estimulación. Generalmente se analizan la latencia de respuesta del retiro o de la huida de la estimulación progresiva que inflinge el daño; dicha latencia tiene una relación inversamente proporcional a la intensidad de la estimulación nociceptiva, también se presentan conductas de huida, saltos o ataque con el objetivo claro de disminuir las fuentes del dolor.6Existen diversas razones por las que resulta importante identificar la ansiedad y la depresión: la ansiedad

disminuye el umbral y la tolerancia al dolor; ambas se asocian con la magnificación de los síntomas médicos; la depresión se acompaña de pobre respuesta al tratamiento. Así mismo, el malestar emocional se ha asociado con la manifestación de síntomas físicos a través de la activación autonómica del estado de alerta o la exacerbación de los síntomas existentes.7

Planteamiento del problema:
¿ Cual es la respuesta al estimulo doloroso en la rata winstar en estado de ansiedad en comparación del estado normal?

Objetivo General:
Determinar la respuesta al estimulo doloroso en la rata winstar en estado de ansiedad en comparación del estado normal

Metodología:
Se realizó un estudio transversal, comparativo, experimental y prospectivo. Con autorización del Comité de Ética e Investigación de la Facultad de Medicina. Criterios de inclusión ser ratas con peso entre 150 a 300 mg (cuadro 1), que no hayan recibido medicamentos en un lapso de una semana mínimo. De los criterios de no inclusión abarcara a ratas que estén embarazadas, que no tengan algún miembro, o que hayan recibido medicamentos en un lapso de una semana.Se eligieron al azar las ratas que formaron parte del grupo A (n = 10) y el grupo B (n = 10). Habiendo elegido al grupo A se inició colocándolas individualmente en un recipiente con agua hasta una altura de 30 cm, a temperatura ambiente, durante 10 minutos. Posteriormente se les colocó una pinza de

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caimán adecuada para el estudio en la base de la cola y se registró la vocalización, forcejeo y si intentaron o no escapar en un estado basal, a los 10 y 20 minutos; se llevó a cabo el procedimiento con la pinza de caimán en las ratas del grupo B. Análisis estadísticos: La significancia estadística se determino mediante el análisis de las variables ordinales con la prueba de χ2.

Resultados:
A la presencia de intento de escape de las ratas del grupo A (100%) en comparación a las del grupo B (30%) (p<0.01), La vocalización en estado basal de las ratas del grupo A fue predominantemente Alta (70%) mientras que en el grupo B fue de intensidad Media (70%)(NS). El forcejeo en el grupo A tuvo un predomino de intensidad alta (70%) y el grupo B (45%) (p<0.01).A los 10 minutos después de repetir el estimulo la vocalización de intensidad media en el grupo A el 70% el grupo B el 90%(p<0.01); el forcejeo se vio proporcionalmente equiparado con una intensidad predominantemente media en el grupo A con el 90% y el grupo B con 80%. A los 20 minutos después del estimulo doloroso, la vocalización media del grupo A (70%) mientras que el grupo B (50%), (p<0.01); el forcejeo en el grupo A fue predominantemente de intensidad media (90%) y en el grupo B de (60%), (p<0.01)

estos a su vez descubrieron una relación entre la ansiedad mesurada bajo el tiempo que tarda el roedor con la “Conducta defensiva de enterramiento” y la percepción del dolor nociceptivo.Los datos recaudados señalan que las ratas del grupo B poco a poco fueron equiparando a las ratas del grupo A con respecto a la vocalización y al forcejeo, esto podría darse a interpretar al dolor como propio mecanismo ansiogénico.

Conclusión:
Este estudio muestra que un aumento en la ansiedad aumenta la percepción de la nocicepción inducida tras un estimulo doloroso, mostrando una relación entre estos factores.

Referencias Bibliográficas:
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2.

Discusión:
Los estudios de la Dra. Guadalupe JiménezVelázquez y colaboradores5 donde su población demostró tener un incremento de la nocicepción mediante el registro por el modelo PIFIR (del inglés “Pain-Induced Functional Impairment Model in the Rat”);

3.

60

farmacodinámicas de analgésicos, Revista mexicana de Anestesiología 2007; Vol. 30: pp 114-121.
4.

nocicepción, Revista mexicana de Anestesiología 2007; Vol. 30: pp 1419.
6.

Banos, J. E. Y Ruiz-Barria, G.. La evaluación del dolor experimental en el laboratorio: los modelos de dolor neuropático en animales. Revista Social Esp. Dolor. 2006; vol.13, pp. 542-552. Jiménez-Velázquez Guadalupe, Fernández-Guasti Alonso, LópezMuñoz Francisco Javier. Efectos de la ansiedad (inducida farmacológicamente) sobre la

Gómez Clauda, Saldívar-González J. Alfredo, Rodríguez Rodolfo, Modelos animales para el estudio de la ansiedad: Una aproximación crítica, Salud Mental 2002; Vol. 25: 14- 24 Santacruz María del Pilar, Oyuela Raúl, Brinez José Arturo. Efectos sobre la actividad nociceptiva de la rata de un péptido nootrópico sintético. Revista Latinoamericana de Psicología, 2008; Vol.40, p.97-109.

7.

5.

61

MUTACIONES EN GENES ASOCIADOS A RESISTENCIA A RIFAMPICINA Y ETAMBUTOL, EN CEPAS DE PACIENTES CON TUBERCULOSIS DROGORRESISTENTE
Betzaida Cuevas Córdoba Roberto Zenteno Cuevas Aremy Cuellar Sánchez Beatriz Buentello Volante

Marco teórico:
La tuberculosis (TB) es una enfermedad remergente causada por bacterias del género Mycobacterium. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2007 se reportaron 9.27 millones de casos nuevos, 13.7 millones de casos prevalentes y 1.78 millones de defunciones1. Uno de los factores que han dificultado el manejo y control clínico de la TB a nivel mundial es la drogorresistencia (TB-DR), la OMS estima que el 20% de los casos de TB son resistentes a un antibiótico y el 5.3% son resistentes a isoniacida y rifampicina, es decir multidrogorresistentes (TB-MDR)2. Tradicionalmente, el diagnóstico confirmatorio de la TB-DR requiere de 4 a 9 semanas, favoreciendo su dispersión al permitir el contagio a los contactos del paciente 3-5. En contraparte, el empleo de nuevas técnicas en biología molecular, permiten desarrollar novedosos métodos diagnósticos de TB-DR, altamente sensibles específicos y rápidos. El diagnóstico de

resistencia a Rifampicina es de suma importancia debido a su fuerte asociación con la resistencia a Isoniacida, por lo cual se considera como marcador de TB-MDR3. Por otro lado el Etambutol se recomienda para tratar infecciones especialmente en personas con VIH, Diabetes Mellitus, o antecedentes de abandono o recaída6,7; la probabilidad de resistencia a este fármaco es más baja que otras drogas, por lo cual se incluye en el tratamiento primario de países con una tasa elevada de resistencia primaria a otro fármaco de primera línea7. Es bien sabido que los bacilos de Mycobacterium son desarrollan resistencia mediante mutaciones en genes específicos; aunque dichos mecanismos moleculares están parcialmente descritos, la resistencia a rifampicina (Rifr) y etambutol (Etar), se ha asociado a mutaciones en los genes rpoB y embB respectivamente3,6. Sin embargo, el porcentaje en que se presentan los tipos y localizaciones de dichas mutaciones es variable entre zonas geográficas.

Estudiante de Doctorado Instituto de Salud Pública / Doctorado en Ciencias Biomédica Universidad Veracruzana betsaida_20@hotmail.com betcuevas@uv.mx

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Planteamiento del problema:
Veracruz es uno de los estados que presenta más casos de TB-DR a nivel nacional. El prolongado tiempo de espera para su diagnóstico favorece la implementación de tratamientos farmacológicos generalizados, inespecíficos, poco efectivos y más costosos. Con menor probabilidad de curación y mayor riesgo de contagio, lo cual incrementa la DR y hace de este un fuerte problema social, económico y de salud. En contraposición, los recientes avances tecnológicos del campo molecular permiten la incorporación de nuevas técnicas que proporcionan información sobre las mutaciones que explican la DR en las cepas de Mycobacterium del estado; permitiendo el desarrollo a mediano plazo de procedimientos de diagnóstico molecular específicos, sensibles y rápidos, así como evaluar la utilidad, efectividad, validez y seguridad local de emplear métodos diagnósticos aprobados en otros países.

Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Veracruz (LESP), de los cuales 88 fueron aptos para realizar el estudio. A partir de los bacilos se realizó: extracción de ADN, amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) los genes; rpoB (266pb) y embB (260pb), secuenciación por electroforesis capilar (Applied Biosystems 3500) y análisis de mutaciones (Sequencing Analysis y SeqScape) A nivel molecular se identificó: codón de mutación, tipo de cambio de base y tipo de mutación. Mediante el resumen clínico y el reporte de perfil de farmacorresistencia proporcionado por el LESP se obtuvieron datos epidemiológicos del paciente portador del bacilo como: resistencia a fármacos, edad, sexo, comorbilidad, toxicomanías, tiempo de evolución de de TB y tipo de tratamiento. Finalmente se realizaron análisis estadísticos de asociación entre las mutaciones presentes en el genoma del bacilo y las variables epidemiológicas del paciente portador de TB-DR.

Objetivo General:
Realizar una caracterización genética de las cepas DR de Mycobacterium tuberculosis presentes en Veracruz, identificando mediante secuenciación, la frecuencia de mutaciones en regiones de genes rpoB y embB, que ocasionan resistencia a Rifampicina y Etambutol respectivamente; en relación al contexto epidemiológico del paciente.

Resultados:
Se analizaron 88 cepas del mismo número de pacientes, la media de edad fue de 45 años (±15) con rango de 15 a 87años. En cuanto al género, el 66% fueron hombres y el 34% mujeres, con una razón de masculinidad de H:M 1.96:1. Respecto a la drogorresistencia el 68.1% (60) fueron Rifr y 58% (51) Etar. Para el análisis de cepas Rifr se secuenciaron 60 fragmentos de 266pb del gen rpoB (codón 478-564), incluyendo la región reportada como portadora del mayor número de mutaciones asociadas a resistencia a Rifampicina (codón 507 al 533). En el 10% de los aislados no se encontraron cambios de

Metodología:
Estudio observacional en el cual se recolectaron 114 aislados TB-DR entre los años 2007-2010 provenientes del

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base en el fragmento analizado; sin embargo, el 90% presentaron mutaciones no sinónimas en 4 codones (516, 522, 526, 531), las cuales se explican por 10 cambios de base. La mutación encontrada con mayor frecuencia fue en el codón 531 (70%), con un cambio de base en el nucleótido 163 de C→;T ó G, cambiando de aminoácido de Ser a Leu ó Trp. Se realizó análisis estadístico de X2 y Test exacto de Fisher para buscar asociación entre la mutación S531L,W del gen rpoB respecto a las otras variables. Se encontró asociación con alta significancia estadística (p=0.01) entre dicha mutación y la resistencia a Estreptomicina, la cual posiblemente se explique por la relación en el mecanismo de acción de ambos fármacos. A cerca de las cepas Etar, se secuenciaron 51 fragmentos de 260pb del gen embB (codón 264-349), incluyendo al codón 306 que es donde se reporta el mayor número de mutaciones asociadas a resistencia a Etambutol, encontrando que en más del 60% no se identificaron mutaciones en el fragmento analizado. Por otro lado, el 40% de las cepas analizadas presentaron mutaciones no sinónimas ubicadas en 3 codones (306, 328, 330), las cuales se explican por 6 cambios de base. La mutación encontrada con mayor frecuencia fue en el codón 306 (31.4%), con cambios de base en los nucleótidos 128 de A→; G, o 130 de G→;C,A ó T, ocasionando el cambio de Met a Val o Iso. Tras el análisis estadístico de X2 y Test exacto de Fisher se observó que todas las cepas que presentaron mutación M306V,I en gen embB fueron resistentes >3 fármacos y ninguna cepa monorresistente o birresistente presentó dicha mutación,

encontrando asociación con alta significancia estadística (p=0.01) entre esta mutación y la mulltirresistencia, específicamente con la resistencia a Isoniacida (p=0.37). Pese a realizar análisis de asociación de las mutaciones rpoB 531 y embB 306 con variables como: sexo, jurisdicción de residencia, diabetes, alcoholismo, drogadicción y tipo de tratamiento, no se encontró significancia estadística en ningún caso.

Discusión:
Un alto porcentaje de cepas presentaron mutaciones en la región caliente del gen rpoB (90%), lo cual concuerda con lo reportado en otros países6,8-11; sin embargo, 6 cepas no presentaron mutaciones del codón 478 al 564, lo cual tal vez sugiere otro mecanismo de resistencia para este fármaco. Según los resultados obtenidos, una prueba de diagnóstico molecular con una sensibilidad del 95% requeriría el diseño de 10 sondas distintas, lo cual incrementaría su costo. Por otro lado, la utilización de la prueba comercial INNO-LiPA Rif TB, incluye sondas para las mutaciones: D516V,H526D,Y y S531L12; considerando los resultados de este estudio hubiera generado una sensibilidad máxima de 75% o menor en función de los cambios de nucleótidos que originaron el cambio de aminoácido, generando un alto porcentaje de falsos negativos. Este hecho resalta la importancia de describir las mutaciones presentes en una región antes de implementar un sistema de diagnóstico. Respecto a la resistencia a Etambutol, la mutación del codón 306 se observó en el 31.4%, a diferencia de lo

64

reportado en otros países como Moroco en Sudáfrica con un 42.3%13 ó China en donde esta mutación se presentó en el 62.2% de las cepas14,; lo cual refleja que la región secuenciada está poco conservada en Veracruz, abriendo la pauta para extender la búsqueda de mutaciones buscar río arriba o en otros genes asociados al operón como embA y embC, con la finalidad de incrementar la sensibilidad y especificidad de futuras pruebas moleculares para el diagnóstico de resistencia a dicho fármaco. En este sentido, la mutación en el codón 306 de embB parece ser por sí sola, un posible marcador de resistencia a múltiples fármacos, lo cual concuerda con lo reportado por otros autores que sugieren que mutaciones en dicho codón parecer proveer a la cepa de ventajas para desarrollar resistencia ante Isoniacida y Rifampicina, siendo más común que desarrollen multidrogorresistencia y drogorresistencia extrema15., o como sugieren otros autores podría incrementar la habilidad de la cepa para la transmisión entre sujetos16.

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2.

3.

4.

Conclusión:
5.

El porcentaje de mutaciones identificadas en los aislamientos para rpoB y embB fue menor a lo reportado por otros países (531 rpoB=40-75%, y 306 embB=40-60%), evidenciando la necesidad de realizar este tipo de estudios para el diseño de herramientas de diagnóstico molecular de TB-DR altamente sensibles y específicas. Así mismo, los resultados encontrados abren la posibilidad de utilizar la mutación embB 306 como marcador de MDR, en cepas de TB de Veracruz.

6.

7.

Referencias Bibliográficas:

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66

NÚMERO DE EOSINOFILOS EN MUCOSA ESOFÓGICA DE PACIENTES CON ESOFAGITIS EOSINOFÍLICA, ESOFAGITIS EROSIVA, ENFERMEDAD POR REFLUJO NO EROSIVO Y CONTROLES ASINTOMÁTICO. UN ESTUDIO EN PACIENTES MEXICANOS.
Eli De la Cruz Patiño Maura Torres Aguilera : Peter Gruber Pagola Isabel Ruíz Juarez Federico Roesch Dietlen José María Remes Troche

Marco teórico:
En la última década existen reportes acerca del incremento de una entidad denominada Esofagitis eosinofilica (EEo), la cual se caracteriza por que en población adulta afecta a hombres de raza blanca y que frecuentemente sufren de disfagia y/o pirosis refractaria. El diagnóstico de esta entidad se basa en un incremento en el recuento de eosinófilos que infiltran la mucosa esofágica ( >20 eosinofilos por campo de alto poder). Sin embargo, otras condiciones como la Enfermedad por Reflujo Gastroesofágico (ERGE) también puede producir un incremento en el número de eosinófilos en la mucosa esofágica, aunque el punto de corte en esta condición no está

bien definido, e incluso en algunas poblaciones se sugiere añadir otros parámetros (hallazgos anatomo patológicos característicos: formación micro abscesos de eosinófilos y capas superficiales de eosinófilos frecuentemente asociados a zonas desprendimiento de zonas de necrosis de células escamosas) para establecer el diagnostico de EEo, esto debido a un amplio margen de concentración de eosinófilos en las diferentes poblaciones estudiadas . La EEo se ha asociado antecedentes de atopia, sin embargo la fisiopatología aun es desconocida.

Planteamiento del problema:
La EEo es un padecimiento emergente, ocasiona altos costos a los sujetos
Instituto de Investigaciones Medico

Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana Biológicas mauri_ta@hotmail.com elihistop@hotmail.com

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afectados, ya que los síntomas no son específicos por lo que habitualmente suele hacerse el diagnostico con ERGE refractario, la EEo es una de las causas principales de disfagia, y pirosis, ocasionando un impacto elevado en la calidad de vida. La población mexicana esta frecuentemente expuesta a enfermedades parasitarias, que ocasionan un incremento en el número de eosinófilos a nivel sanguíneo, y es probable que este antecedente sea un factor que ocasione un aumento en la concentración de eosinófilos en la mucosa del tracto digestivo. Se ignora si el conteo de eosinófilos en la mucosa esofágica en nuestro medio es similar a lo reportado en otras poblaciones.

Objetivo General:
evaluar de forma prospectiva el número de eosinófilos (a gran aumento) presentes en la mucosa esofágica de pacientes con EEo, Esofagitis Erosiva, Enfermedad por Reflujo No Erosiva (ERNE) y en un grupo de sujetos considerados como controles asintomáticos

eosina. Según los datos clínicos, endoscópicos y anatomo-patológicos se clasificaron a los sujetos en los siguientes grupos: GRUPO A (GA), sujetos con síntomas de ERGE 3 veces por semana y Esófago normal endoscópicamente (ERNE); GRUPO B (GB), sujetos con síntomas de ERGE 3 veces por semana y Esofagitis Erosiva grado A-o B de los Ángeles; GRUPO C (GC), sujetos sin síntomas de ERGE y Esófago endoscópicamente normal (Controles Sanos); GRUPO D: Diagnóstico definido de EEo (sintomatología asociada a >20 Eosinófilos en campo de alto poder, sin respuesta a terapia anti secretora. Las biopsias fueron analizadas por un patólogo gastrointestinal cegado. Se realizó el conteo de eosinofilos que infiltraron la mucosa esofágica en 10 campos de alto poder (40x) y se realizo el análisis mediante estadística descriptiva.

Resultados:
Se incluyeron 124 sujetos en el grupo con ERNE, 35 con Esofagitis Erosiva , 16 controles y 6 casos de EEo. No hubo diferencias en cuanto al genero y la edad en los grupos A, B y C, pero los pacientes con EEo fueron mayores ( p<0.05). En el Grupo A con 124 sujetos (70 femenino), edad promedio 44.8 (13 - 40), presento un media de numero de eosinófilos en el esófago próxima de 0 (0-0) y en el distal de 3.5 (2-5); en el Grupo B se incluyeron a 35 sujetos (14 femenino), con edad media 49.6 (26-58) con una media de eosinófilos en esófago proximal de 0 (0-0), y 5 (3-7) en el distal; En el Grupo C se incluyeron 16 sujetos (5 femenino) edad media 49.2, con 0 (0-0) eosinófilos en la porción distal y 0 (0-0) en la distal; en el

Metodología:
Se trata de un estudio observacional, transversal, analítico, cegado simple, donde se incluyeron sujetos adultos de forma consecutiva que, previo consentimiento informado, y evaluación clínica inicial, fueron sometidos a endoscopia gastrointestinal alta, en el periodo comprendido del entre Agosto 2008 y Diciembre de 2009, a los cuales se les realizo toma de biopsia de la mucosa esofágica de todos los sujetos de estudio (8 fragmentos, 4 de esófago proximal y 4 de la porción distal del esófago), las cuales fueron posteriormente procesados de forma convencional y teñidos con hematoxilina

68

Grupo D se incluyeron 6 sujetos (1 femenino) edad media 60.25, con un conteo de eosinófilos de 18 (18-22) en la porción proximal y de 25 (20-37) en la porción distal

Discusión:
En nuestro estudio cabe destacar la ausencia de infiltración eosinófilica en el área próxima del esófago tanto en el grupo control, sujetos con ERNE y ERGE erosivo (Grupos A, B y C), en contraste con los sujetos con EEo donde la concentración media de eosinófilos en la porción proximal fue elevada y muy similar al conteo de eosinófilos de la porción distal del esófago, este hallazgo es similar a lo encontrado en otros países, donde incluso han protocolizado las toma de biopsias de esófago a diferentes niveles para evitar falsos positivos. Si bien en porción distal del esófago del grupo con ERNE y con ERGE erosiva hubo infiltración eosinófilica, los rangos se mantuvieron considerablemente inferiores de los rangos de sujetos con EEo, diversos estudios realizados en otras poblaciones han demostrado que la terapia anti secretora reduce el conteo de eosinófilos en estos sujetos. Cabe destacar que en sujetos sin sintomatología (grupo control) no hubo infiltración de eosinófilos en ninguna sección del esófago.

ERNE se localiza solo en porción distal del esófago, la cual se encuentra en contacto directo con el agresor (reflujo acido y/o no acido) responsable de la lesión hística a la mucosa que conlleva a la infiltración y reacción inmunológica secundaria local y circunscrita. El promedio de conteo de eosinófilos en la mucosa esofágica de los pacientes con EEo mexicanos, es menor que lo reportado en otras poblaciones.

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2.

3.

Conclusión:
Este estudio demuestra que normalmente en población mexicana no debe de existir infiltración por eosinofilos en la mucosa esofágica. En las variantes de la ERGE, puede existir infiltración esoinofilica de bajo grado. La existencia de infiltración esosinófilica tanto en sujetos con ERGE erosivo como

4.

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EFECTO DEL EXTRACTO POLAR DE MOUSSONIA DEPPEANA SOBRE LA PROLIFERACIÓN Y LA VIABILIDAD DE LA LÍNEA CELULAR DE CÁNCER DE PRÓSTATA LNCAP.
: Cynthia Fernández Pomares . Miguel Ángel Domínguez Ortiz . Enrique Juárez Aguilar . Omar Muñoz Muñiz Myriam Bravo Ávila María Elena Hernández Aguilar

Marco teórico:
El cáncer es una de las causas más importantes de morbilidad y mortalidad alrededor del mundo.1 En el 2008 la neoplasias malignas fueron la tercera causa de muerte entre la población mexicana, siendo el carcinoma prostático la neoplasia con mayor incidencia en los hombres2. Esta enfermedad se desarrolla debido a alteraciones en los genes responsables del control del ciclo celular, en consecuencia, las células cancerosas proliferan descontroladamente e invaden otros órganos del cuerpo.3. La incidencia del cáncer está fuertemente relacionada con el estilo de vida y alimentación de cada país. Datos epidemiológicos muestran que individuos que migran a otro país, tienen la misma incidencia de cáncer que los habitantes originarios del país al que emigró;4. Dato sumamente importante que

sugiere que el ambiente es un factor más determinante en el desarrollo del cáncer que el mismo fondo genético del individuo.5. Además, estos estudios también indican que poblaciones que poseen una alimentación rica en frutas y vegetales tienen una menor incidencia de cáncer.6

Planteamiento del problema:
A pesar de todos los avances en la investigación sobre el cáncer, actualmente no se cuenta con un tratamiento cien por ciento efectivo, es por ello que se ha encontrado en la fitoterapia una alternativa prometedora para combatir este mal, puesto que existen compuestos fitoquímicos capaces de prevenir y combatir el cáncer, tales como el licopeno del tomate, el resveratrol de la uva, la quercetina de la guayaba y la curcumina de la cúrcuma.7 Con fundamento en lo anterior, el presente

Estudiante de DoctoradoUniversidad Veracruzana chiselv8@yahoo.com chiselv8@hotmail.com

Dependencia:

Instituto de Neuroetología

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estudio evaluó el efecto del extracto de Moussonia deppeana sobre la proliferación y la viabilidad de la línea celular de cáncer de próstata LNCaP.

Objetivo General:
Evaluar el efecto del extracto polar de Moussonia deppeana (H2O/EtOHMd) sobre la línea celular de carcinoma prostático LNCaP.

Metodologia:
Obtención del extracto. La planta M. deppeana fue recolectada en el mes de noviembre en el Municipio de Coatepec, Veracruz. El extracto polar se obtuvo mediante maceración de 300 g de la parte aérea de la planta (hojas y tallos) en una mezcla de etanol: agua 1:1 v/v.Análisis Fitoquímico. La identificación cualitativa de los metabolitos presentes en el extracto se realizó mediante cromatografía en capa fina, utilizando como agentes reveladores luz UV, CoCl2, FeCl3 (para flavonoides), ácido perclórico (para esteroles) y solución de Dragendorff (Bi(NO3)3/KI/CH3COOHpara alcaloides). Además, se realizó un análisis en Resonancia Magnética Nuclear de protón (H1 RMN) para la identificación la naturaleza química de los compuestos presentes en el extracto.Determinación de la capacidad antioxidante. La capacidad antioxidante del extracto se determinó por el método de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracilo) (BrandWilliams modificado por Miliauskas, 2004). El DPPH es un radical libre que es estabilizado por los antioxidantes presentes en el extracto. La reacción es evaluada mediante el espectro visible donde se aprecia una disminución en la absorbancia (517 nm)

proporcional a la reducción del DPPH. Contenido total de polifenoles. Se determinó el contenido total de polifenoles utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu. Las sales de molibdeno y tungsteno presentes en el reactivo son reducidas por los antioxidantes del extracto formando óxidos de molibdeno y tungsteno de color azul intenso. La absorbancia obtenida en el espectrofotómetro a 765 nm es directamente proporcional al contenido de polifenoles, el cual es reportado como miligramos de ácido gálico por gramo de peso del extracto seco (mg GAE/g dw). Determinación del poder reductor. El poder reductor se evaluó mediante el método de Oyaizu, 1986.8. La capacidad antioxidante es determinada por la reducción del ión Fe+3 a Fe+2, reacción colorimétrica que es cuantificable en el espectrofotómetro a 700 nm. Cultivo de la línea celular LNCaP. La línea celular de carcinoma prostático de humano, derivada de metástasis del nodo linfático supraclavicular, fue mantenida en medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 8%, a 37º C en atmósfera de CO2 al 5%. Es productora de fosfatasa ácida prostática humana y de antígeno prostático específico. Posee receptores a andrógenos y estrógenos.Ensayos de Proliferación celular. Las células fueron sembradas en cajas de 96 pozos a una densidad de 5022 cel/pozo, incubándose por 48 horas en las condiciones anteriormente descritas. Posteriormente las células fueron tratadas con diferentes concentraciones del extracto H2O/EtOHMd (62.5, 125, 187.5, 250, 500 y 1000 µg/ml) utilizando como vehículo DMSO (Dimetil sulfóxido) a un volumen final del 0.25%. Finalmente la proliferación de las células fue

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evaluada a diferentes tiempos de incubación con el extracto (24, 48, 72 y 96 hrs) por el ensayo de Metil tiazol tetrazolium (MTT) descrito por Mossman, 1983.9 Brevemente, los cultivos son incubados con MTT (5 mg/ml) por 4 hrs a 37oC y 5% de CO2, finalmente los cristales de formazán obtenidos son disueltos con DMSO y la absorbancia de dicha solución es cuantificada en un lector de ELISA a 570 nm. Para diferenciar el efecto antiproliferativo de un posible efecto citotóxico en este ensayo, se determinó la viabilidad de los cultivos tratados mediante la tinción con azul de tripano y el conteo directo en cámara de Neubauer.Ensayo de citotoxicidad. Las células fueron sembradas a una densidad de 10000 cel/ pozo en una placa de 96 pozos y se incubaron 72 hrs a 37º C y 5% de CO2. Una vez que el cultivo alcanzó la confluencia, se aplicó el extracto H2O/EtOHMd a diferentes concentraciones (62.5, 125, 187.5, 250, 500 y 1000 µg/ml). La viabilidad celular fue evaluada a las 48 hrs posttratamiento mediante el ensayo de MTT. Finalmente se determinó la concentración inhibitoria (IC50).Análisis estadístico. Los datos de los ensayos de proliferación y citotoxicidad se analizaron con un ANOVA de dos vías con ranqueo de datos y prueba posthoc de Tukey en el programa JMP 6, los resultados se expresan como el porcentaje promedio de proliferación o viabilidad, respectivamente, en relación con el valor más alto obtenido por el control en el tiempo. La determinación de la IC50 se realiza con un ajuste no linear en el programa Sigma Plot 10.0. Cada ensayo se realizó por triplicado.

Resultados:

Las pruebas cualitativas para la identificación de metabolitos revelaron la presencia de alcaloides, esteroles y polifenoles en el extracto polar de M. deppeana. La resonancia magnética nuclear (1H RMN) muestra señales en la región de 6.5 a 8 ppm, lo que sugiere la existencia de compuestos de tipo aromático. El extracto también mostró adecuados niveles de activad antioxidante y poder reductor, además de un alto contenido de polifenoles. Por otra parte, las células tratadas con EH2O/EtOHMd a las concentraciones de 250, 500 y 1000 µg/ml tuvieron un porcentaje de proliferación menor al alcanzado por el cultivo sin tratamiento a las 48, 72 y 96 hrs (F(6,83)= 101.15, P < 0.05, r2= 0.96). Sin embargo, la observación microscópica reveló una diferencia en la densidad y morfología de los cultivos tratados con el extracto a las concentraciones de 500 y 1000 µg/ml, donde se aprecia a las células redondeadas y con núcleo picnótico, lo cual indica que el extracto polar tiene un efecto citotóxico a esas dosis. Por otro lado, las células tratadas con dosis menores (62.5 a 250 µg/ml) no muestran diferencia morfológica aparente respecto al cultivo sin tratamiento, sin embargo se puede apreciar una disminución en la densidad celular dependiente de la dosis y del tiempo de tratamiento. Para corroborar los resultados se evaluó el porcentaje de viabilidad celular por tinción con azul de tripano durante el ensayo de proliferación celular, donde se aprecia una disminución en el porcentaje de viabilidad de las células tratadas solo con las dosis más altas del extracto. En el ensayo de citotoxicidad se apreció una disminución en el porcentaje de viabilidad de los cultivos tratados con el extracto respecto a las

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células sin tratamiento de forma dosis dependiente, donde la dosis inhibitoria del 50% de la población (IC50) fue de 222.667 µg/ml. El análisis microscópico muestra diferencias morfológicas sólo en los cultivos tratados con dosis de 500 y 1000 µg/ml.

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Discusión:
El extracto polar de M. deppeana posee actividad antiproliferativa y citotóxica sobre la línea celular LNCaP, efectos que son dependientes de la dosis y del tiempo de tratamiento. El análisis fitoquímico del extracto y los ensayos de actividad antioxidante, revelan la presencia de compuestos polifenólicos, los cuales pueden ser responsables de los efectos del extracto sobre la vida y el crecimiento del cultivo, esto de acuerdo a lo reportado con otros compuestos de esta misma naturaleza, mismos que podrían actuar a nivel molecular regulando la expresión de los genes implicados en estos procesos.(10-12)

Conclusión:
Estos resultados nos sugieren un gran potencial del extracto de M. deppeana como agente anticancerígeno, por lo cual es de suma importancia evaluar el potencial antiproliferativo de este extracto sobre otras líneas celulares, caracterizar el tipo de muerte celular, los mecanismos moleculares y los compuestos químicos por medio de los cuales ejerce su efecto antineoplásico.

Referencias Bibliograficas:
1. Abbas, AK, Andrew Lichtman. Cellular and Molecular Immunology. 4th ed. Philadelphia,

75

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EFECTOS BIOCLÍNICOS DE LA OBESIDAD Y LA INDUCCIÓN DE LA DIABETES EN LA RATA WISTAR HEMBRA
Areli Olazo Marinero José Arnold González-Garrido Octavio Maldonado-Saavedra Aracely López-Monteon Guillermo Manuel Ceballos-Reyes Enrique Méndez-Bolaina

Marco teórico:
La obesidad es la enfermedad nutricional más prevalente en los países industrializados y está experimentando un incremento significativo en los países en vías de desarrollo. Numerosos estudios epidemiológicos evidencian que la esperanza de vida en los obesos es reducida y su morbilidad es elevada, siendo un problema de Salud Pública. Además de ser un factor de riesgo para desarrollar diabetes mellitus 2 (DM2), hipertensión arterial y otras enfermedades crónicas.1El Índice de Masa Corporal (IMC) es el resultado de dividir el peso en kilogramos por el cuadrado de la talla en metros (kg/m2), es una indicación simple de la relación entre el peso y la talla, se utiliza frecuentemente para identificar sobrepeso y obesidad.2,3La Organización Mundial de la Salud (OMS) define el sobrepeso como un IMC>25 kg/m2, y la obesidad como un IMC>30 kg/m2. Según la norma oficial mexicana (NOM-043-SSA2

2005) la obesidad es la enfermedad caracterizada por el exceso de tejido adiposo en el organismo.3,4Enfermedades relacionadas con la obesidad Complicaciones respiratorias, hepatobiliares, del aparato locomotor, enfermedades cardiovasculares, cáncer, DM2 y síndrome metabólico, etc.4,5,6La DM es un de trastorno metabólico, que afecta a diferentes órganos y tejidos, se caracteriza por hiperglicemia. La diabetes es una enfermedad crónica que aparece cuando el páncreas no produce insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente la insulina que produce.7,8,9Clasificación de la diabetes según la OMSDM1, DM2 y Diabetes gestacional.8La DM2 representa el 90% de los casos mundiales y se debe en gran medida a un peso corporal excesivo, a la inactividad física, entre otras.8,9Órgano importante para el metabolismo de los carbohidratos

Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana (Orizaba, Veracruz) enmendez@uv.mx emendezb@hotmail.com

Facultad

de

Ciencias

Químicas

76

El hígado, es la mayor víscera del ser humano. Pesa aproximadamente 1.5 kg, es de color rojo-oscuro, situado en la parte superior derecha de la cavidad abdominal, justo debajo del diafragma. Ayuda en el metabolismo de los carbohidratos, lípidos y triglicéridos.10,11La forma de diagnosticar esta enfermedad, es a través de los signos y síntomas, aunque, en ocasiones es asintomática, por lo que para confirmar o descartar su presencia se han desarrollado pruebas del tipo estímulo-respuesta,11 como la prueba de tolerancia a la glucosa.12,13

pancreatomía hasta la utilización de productos químicos.19,20,21 La estreptozotocina (STZ) (2-desoxi-2([metil(nitroso)amino]carbonilamino)- β;-Dglucopiranosa, sintetizada por la Streptomycetes achromogenes, utilizada para inducir la DM1 como la 2, según el momento de la inyección, la dosis empleada y frecuencia de inyección.22,23

Objetivo General:
Analizar los efectos de la obesidad y la inducción de la diabetes en los valores de glucosa, colesterol y triglicéridos en rata Wistar hembra.

Planteamiento del problema:
La diabetes espontánea entre los animales es relativamente común. El primer caso fue descrito en 1851 en un primate. En la mayoría de los roedores, la diabetes es de origen genético y se acompaña de obesidad.14,15Características generales de la rata Wistar. Esta caracterizada anatómica, fisiológica y genéticamente, se reproduce fácilmente, son animales muy adaptables, fáciles de cuidar y manejar. Es posible producirlas libres de gérmenes y enfermedades, , con lo cual se reduce la principal variable no controlada.16Efectos de la dieta La abundancia calórica parece facilitar el desarrollo de la obesidad y la diabetes en los seres humanos. En algunos roedores también se ha demostrado que los factores ambientales contribuyen a la presentación de este síndrome.17,18 Diabetes inducida La inducción de la diabetes se ha logrado por diversos medios. En 1889, Von Mering y Minkowski produjeron diabetes experimental en perros mediante la remoción quirúrgica del páncreas.Existen diferentes modelos que van desde la

Metodologia:
Para el desarrollo de este trabajo se utilizaron ratas Wistar hembra, con un peso de 200 a 220 g, divididas en 3 grupos (n=5):• Grupo control, las cuales se mantuvieron con alimento normal y acceso libre a agua. • Grupo de ratas obesas, a las cuales se les mantuvo con alimento hipercalórico y acceso libre a agua.• Grupo diabético (ratas obesas y/o diabéticas), las cuales recibieron STZ, vía ip, (65 mg/kg de peso/0.5 mL de citrato de sodio-pH 4.5) para alcanzar una concentración de glucosa en plasma de 14 mmol/L o mayor.El valor de glucosa se obtuvo utilizando un glucómetro digital Bayer Health Care™, mediante punción en la pata de la rata, la muestra de sangre se colocó en la tira reactiva (biosensor de glucosa oxidasa), los valores fueron reportados en mg/dL. Para determinar los niveles séricos de colesterol y triglicéridos se realizo una punción cardiaca, las muestras fueron analizadas en el Laboratorio de Análisis Clínicos-FCQ-UV. Los datos se

77

presentaron como la media±de. Para la expresión gráfica y el análisis estadístico de resultados se utilizaron los programas Prism 3.02 e InStat 3.05, respectivamente; y una
ANOVA para establecer diferencias significativas (p<0.05).

Resultados:
Al comparar los pesos de las ratas en diferentes tiempos: inicial, intermedio y final, los efectos más significativos fueron a partir de las ratas obesas intermedias (210.4±8.6) vs. control (203±9.2) (p<0.001), al comparar a las ratas obesas diabéticas intermedias (209±6.6) vs. control (203±9.2) (p<0.001), al comparar a las obesas finales (229.7±6.6) vs. control (223.7±10) (p<0.001), comparando también las obesas finales (229.7±6.6) contra las obesas diabéticas finales (190±14) (p<0.05). Aunque se observo disminuido el peso en las obesas diabéticas debido a los efectos de la diabetes por la STZ, al compararla vs. control (223.7±10) (p<0.001). En los resultados obtenidos para el valor de glucosa se observaron cambios significativos partir de las muestras intermedias, al comparar las ratas obesas intermedias (129.8±2) vs. control (56±1) y contra las obesas diabéticas intermedias (199.6±4.7) (p<0.001), al comparar al grupo obeso final (143.2±2.8) vs. control (56±0.8) y vs. grupo obeso diabético final (251±39.4) (p<0.001).En el nivel de colesterol en sangre los cambios se observaron en la semana 8 comparando las ratas obesas (98.2±2.3) vs. control (97.8±1.6) (p>0.05, no significativa), pero al comparar las ratas obesas diabéticas finales (103.6±3) vs. control (97.8±0.8) (p<0.05).Para los niveles de triglicéridos observamos cambios significativos comparando las obesas intermedias

(71.4±3.6) vs. control (36.2±1.9) (p<0.001), comparando obesas diabéticas intermedias (79.4±2.3) vs. control (36.2±1.9) (p<0.001). Al comparar a las obesas finales (77±2.7) vs. obesas diabéticas finales (82±1.2) y vs. control (37.2±2.3) (p<0.001). Al comparar las dimensiones del hígado de las ratas obesas diabéticas finales (5.9±0.3) vs. control (5.1±0.4) (p<0.01), comparando obesas finales (8.7±0.4) vs. control (7.4±1) (p<0.01), al comparar las obesas diabéticas finales (9.4±0.06) vs. control (7.4±1) (p<0.01), para el tamaño y peso del páncreas no se observaron diferencias significativas (p>0.05).

Discusión:
El presente modelo fue diseñado para observar los efectos de la diabetes inducida por STZ y para encontrar una asociación entre la reducción del peso de los animales, el peso relativo del hígado y el páncreas en ratas Wistar hembra. En este estudio, se utilizó STZ en una dosis de 65 mg/kg.26 Esta reportada la utilización de 90 mg/kg por vía ip en ratas. Los niveles de glucosa, colesterol y triglicéridos en sangre, tanto el peso corporal, así como las mediciones al hígado y páncreas se registraron para poder observar los efectos, el cual demostró que la STZ fue eficaz para producir hiperglucemia grave.25,19,30En los animales tratados con STZ se observó la pérdida de peso debido a los efectos deletéreos de STZ que causa la alquilación del ADN y produce hiperglucemia.26,31El hígado de los animales tratados con STZ, se observo un aumento en su peso(hipertrofia) cuando los animales del grupo obeso diabético fueron comparados vs. control, a pesar de que el

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peso de todos los animales del grupo tratado con STZ se observó disminuido. Probablemente debido a la acumulación de triglicéridos que conducen al agrandamiento del hígado debido a la afluencia cada vez mayor de ácidos grasos en el hígado inducida por hipoinsulinemia, así como la obesidad y la baja capacidad de excreción de lipoproteínas del hígado como resultado de una deficiencia de síntesis de la apolipoproteína B.27,28,31El peso del páncreas en el grupo obeso diabético no mostró ningún cambio respecto al tratamiento con STZ. La disminución en el peso corporal y la tendencia a la disminución de peso del páncreas podría atribuirse a la alteración y desaparición de los islotes pancreáticos y la destrucción selectiva de las células productoras de insulina.25,29Se puede concluir que la STZ a través de su acción directa alquilante puede causar necrosis celular y la destrucción selectiva de las células beta pancreáticas causando hiperglucemia, en una dosis de 65 mg/kg. Además, la producción de la diabetes por STZ y la hipoinsulinemia causan cambios en el peso corporal de los animales obesos diabéticos. También se puede concluir que la reducción en el peso corporal se asoció con aumento del peso relativo del hígado aunque el peso del páncreas no fue afectado, se observó una tendencia a la disminución en el peso y tamaño de este último.

cada uno de los modelos, se vieron afectados algunos órganos por la selectividad de la STZ. Finalmente, se concluyó que empleando una dosis de 65 mg/kg de STZ en ratas Wistar hembra obesas, se indujo en los animales diabetes que afecto de forma significativa los órganos internos importantes en el metabolismo (hígado y páncreas) y los niveles séricos de triglicéridos, colesterol y glucosa, por lo que podría ser empleado como herramienta para evaluar el efecto de la obesidad y la DM2.

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Conclusión:
Se evidenció que existe una relación entre la dosis de STZ y la inducción de diabetes estable en ratas. Los parámetros evaluados demostraron una alteración dependiente tanto de la STZ, como del peso corporal de

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/article/003101.htm 2010).

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8-05-

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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS Y VECTORES DE TRYPANOSOMA CRUZI DEL ESTADO DE VERACRUZ.
Jesús Torres Montero Daniel Guzmán Gómez Aracely López Monteon Eric Dumonteil Angel Ramos Ligonio

Marco teórico:
La enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana es una enfermedad infecciosa que se encuentra ampliamente diseminada y es considerada como un problema importante de salud pública que afecta a toda América Latina 1. De 16-18 millones de individuos son infectados por T. cruzi en América Central y Sudamérica 2.El agente causal de la enfermedad es el protozoario hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi), y su principal mecanismo de transmisión es el vectorial, por insectos de la familia Reduviidae, siendo el principal género Triatoma. La prevalencia de esta enfermedad se relaciona con el subdesarrollo y la pobreza. Conocer si los vectores contienen al parásito, indica el riesgo en el que la población está expuesta de padecer la infección por T. cruzi por habitar en zonas endémicas en convivencia con el agente vector. Con el apoyo de la biología molecular se ha logrado diagnosticar y clasificar a T. cruzi en líneas filogenéticas, incluyendo distintos linajes 3, 4. De la misma manera la identificación taxonómica en el vector utilizando el análisis de espaciadores del

transcrito interno (ITS) del DNA ribosomal (DNAr), donde los ITS-1 diferencia complejos y los ITS-2 diferencía especies 5. La identificación taxonómica del vector, se realiza mediante el análisis del segundo espaciador del transcrito interno del DNAr (ITS-2), revelando diferentes haplotipos y facilitando la taxonomía del vector 6.

Planteamiento del problema:
T. cruzi es un parásito protozoario, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, considerada una enfermedad crónica, el parásito es transmitido por insectos triatominos (chinches) que se distribuyen en distintas regiones geográficas de América latina. Conocer si los vectores contienen al parásito, indica el riesgo en el que la población está expuesta de padecer la infección por T. cruzi por habitar en zonas endémicas en convivencia con el agente vector. Recientemente se ha clasificado a T. cruzi en líneas filogenéticas, las cuales incluyen distintos linajes. Debido a la gran diversidad genética que presenta hoy en día el parásito es necesario clasificar a T. cruzi y estudiar los hábitats en donde éste se

Estudiante de Doctorado Centro De Investigaciones Biomédicas Universidad Veracruzana jetorres@uv.mx angramos@uv.mx

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localice para proponer estrategias de control del vector y de la misma enfermedad, con el fin de obtener una correlación entre la heterogeneidad de cepas y su tropismo tisular (presentación clínica de la enfermedad), y por otra parte, el conocer la clasificación de los vectores, distribución en la zona e identificar la presencia de T. cruzi en ellos representa un acercamiento de gran alcance epidemiológico para determinar los ciclos de transmisión de las diversas poblaciones del parásito entre los vectores y especies mamíferas. En base a lo anterior es de vital importancia realizar la tipificación molecular de cepas de T. cruzi aisladas de vectores colectados que circulan en localidades rurales de la zona centro del estado de Veracruz para contar con una información más certera sobre la epidemiología de la enfermedad en la región; así como herramientas para la predicción y vigilancia entomológica de la enfermedad que permitan a las autoridades de salud intervenir de forma más eficiente.

Municipio de Tezonapa perteneciente al estado de Veracruz a los cuales se les realizó lavado intestinal. A partir de la muestra obtenida se diagnosticó el agente infeccioso T. cruzi mediante la amplificación del kDNA mediante ensayos de PCR y se caracterizó el linaje (I-II) del parásito a las muestras que salieron positivos a T. cruzi. Por otro lado, a partir de las extremidades de los vectores se extrajo DNA y con éste se caracterizó taxonomicamente a T. dimidiata presente en la zona; mediante (ITS-2) empleando el metodo de la PCR.

Resultados:
Se encontraron 297 vectores, de los cuales 224 (75.42%) se recolectaron en lugares intradomiciliares, 58 (19.52%) en lugares peridomiciliares, 3 (1.01 %) en lugares silvestres y 12 (4.05 %) de ellos se desconoce su procedencia. Resultaron 41 (13.80%) vectores positivos de un total de 297 analizados. Los 41 muestras positivas a T. cruzi corresponden al linaje I del parásito. Los 297 vectores pertenecen al grupo 2 dentro de la clasificación filogenética utilizando como marcador al ITS-2.

Objetivo General:
Identificar y caracterizar molecularmente la (s) cepa (s) del parásito Trypanosoma cruzi y al vector Triatoma dimidiata presentes en localidades rurales de la zona centro del estado de Veracruz.

Discusión:
En base a los análisis y resultados obtenidos, observamos que el parásito está presente en la región y por lo consiguiente que el hombre adquiera la enfermedad. El linaje I de T. cruzi encontrado concuerda con estudios generados mediante el análisis de marcadores genéticos (RAPD); formando un grupo homogéneo para los ciclos domésticos y selváticos sobre el área geográfica de México. No así el linaje II característico de los ciclos domésticos en Argentina, Brasil, Bolivia

Metodología:
Es un estudio de tipo experimental. Se recolectaron vectores en comunidades rurales, para la identificación y caracterización de T. cruzi, y para la clasificación de los vectores. Se recolectaron vectores de 13 localidades rurales del

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y Chile. A pesar de que los vectores analizados pertenecen al grupo 2 (que junto con el grupo 3 se encuentra presente en México) dentro de la clasificación filogenética, no deja de ser importante ya que se pueden presentar híbridos debido a la migración del vector ó al mismo hombre llevando consigo al vector; incluso al parásito, creando nuevos híbridos tanto para el vector como para T. cruzi al adaptarse a nuevos habitas y huéspedes. Incluso llegar a infestar lugares si no se tiene el control adecuado de los vectores, lo que provocaría posibles infecciones. El análisis por PCR es costoso sin embargo presenta buenos resultados a diferencia de la microscopia óptica.

Rassi A. Chagas disease (American Trypanosomiasis) Its impact on transfusion and clinical medicine.1992.
2.

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3.

4.

Conclusión:
Se encontró la presencia de Trypanosoma cruzi en vectores colectados en zonas rurales del Municipio de Tezonapa, sugiriendo una transmisión vectorial activa del parasito en estas localidades rurales, El linaje I de T. cruzi encontrado concuerda con estudios realizados por otros grupos donde se ha observado que es el que predomina en distintos estados del país. Por otra parte, los vectores corresponden al grupo 2 dentro de la clasificación filogenética. Estos resultados sugieren una convivencia estrecha con el vector representando así un riesgo potencial para la transmisión del parásito, por lo que es necesario implementar nuevos programas de control contra el vector que permitan asegurar la calidad de vida de los habitantes de estas comunidades.

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84

IDENTIFICACIÓN DE UNA ZONA CON ALTA SEROPREVALENCIA DE INFECCIÓN POR TRYPANOSOMA CRUZI EN LA ZONA CENTRO DEL ESTADO DE VERACRUZ
: Daniel Guzmán Gómez Aracely López Monteon Eric Dumonteil Angel Ramos Ligonio

Marco teórico:
La enfermedad de chagas o tripanosomosis americana es causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Esta enfermedad representa un problema de salud pública en América latina, en donde la organización Mundial de la salud estima que aproximadamente 60 millones de personas esta en riesgo de adquirir la infección y 9-12 millones de personas están infectadas (1). En México, la enfermedad de chagas es endémica en varias regiones, pero estos datos permanecen subestimados, esta información limitada no es disponible acerca de la epidemiología de la enfermedad (2, 3).El Estado de Veracruz, es una de las regiones donde la endemicidad de la infección por T. cruzi es poco establecida, posee un total de 7 millones de personas y es dividido en 11 jurisdicciones sanitarias, varias especies de Triatominos han sido encontrados en el estado, incluyendo algunos con una alta capacidad vectorial, tales como Triatoma dimidiata o T.

pallidipenis (4). También la presencia de infección por T. cruzi ha sido documentada en varias poblaciones humanas. De acuerdo a la encuesta nacional de seroprevalencia en los años 80’s, Veracruz fue uno de los estados en México con alta seroprevalencia en la población general (≤; 3.0 %) (5). También se ha documentado la infección por T. cruzi en donadores de banco de sangre en la ciudad de Orizaba, Ver. (6). Y casos de cardiomiopatía chagásica crónica se han observado en las jurisdicciones sanitarias de Poza Rica Veracruz (7). Otros estudios de la distribución de la infección en diferentes jurisdicciones sanitarias del estado de Veracruz indican que la infección por T. cruzi puede estar ausente en jurisdicciones tales como Coatzacoalcos, Orizaba y Martínez de la Torre, y una alta seroprevalencia fue observada en las jurisdicciones de Tuxpan y Pánuco (2.8% y 1.6% respectivamente) y en la jurisdicción de Córdoba (1.3%). Además, la detección de la infección por T. cruzi en niños menores de 18 años de edad (1.85.2%) sugiere la presencia de una trasmisión
Centro de Investigaciones

Estudiante de Doctorado Universidad Veracruzana Biomédicasdaguzman@uv.mx angramos@uv.mx

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activa del parásito jurisdicciones (4).

en

estas

mismas

Planteamiento del problema:
Como se detalló, la enfermedad de Chagas forma parte de las enfermedades infecciosas presente en el estado de Veracruz, pero su importancia y dinámica de transmisión permanece desconocido. Dada la importancia en salud pública de esta enfermedad en las Américas, es de suma importancia llevar a cabo un estudio epidemiológico inicial que proporcioné datos claves y actualizados sobre la magnitud del impacto de la enfermedad de Chagas y los riesgos de transmisión en diferentes poblaciones y regiones del estado, utilizando una metodología rigorosa y pruebas diagnosticas bien establecidas.

total de 654 muestras que se utilizaron para la identificación de anticuerpos especificos para T. cruzi utilizando cuatro diferentes ensayos: dos ensayos de ELISA utilizando extractos crudos del parásito, un ensayo de ELISA utilizando una proteína recombinante, un ensayo de inmunofluorescencia (IFI) y un análisis de Western blot (6). Un cuestionario corto fue aplicado a los participantes acerca del conocimiento del vector y de aspectos clínicos generales.

Resultados:
De los 654 sueros colectados, la mayoría provenía de mujeres (61%). Todas las muestras fueron tamizadas para la presencia de anticuerpos contra T. cruzi, con un total de 110 muestras positivas con al menos dos pruebas, con una seroprevlaencia del 16.8% (IC 95%=14.2-19.9%). Ciento cinco muestras dieron resultados positivos a tres pruebas y 44 fueron positivos solo para una prueba (IFI). Las dos pruebas de ELISA y la IFI fueron congruentes con índices kappa de hasta 0.99 ± 0.005, sin embargo el Western blot mostro una baja sensibilidad (κ;= 0.56 ± 0.05%). Adicionalmente, los pacientes que fueron positivos mencionaron que identificaban al insecto vector (78.5%) al contrario de los pacientes negativos (66%).Los análisis de distribución geográfica de la infección por T. cruzi, mostraron que la infección se concentro en 11 de las 13 localidades del municipio de Tezonapa con una seropositividad del 28.9%. El porcentaje más alto de infección se observó en las localidades de Caxapa (61.5%) y las Josefinas (40%), mientras que de las 5 localidades del municipio de Tierra Blanca, solamente tuvieron casos positivos las localidades de El

Objetivo General:
Actualizar los datos seroepidemiológicos de la infección por T. cruzi en la zona centro del Estado de Veracruz.

Metodología:
Es un estudio de tipo experimental y observacional. Diecinueve localidades rurales pertenecientes a los municipios de Tezonapa y Amatlán en la jurisdicción de Córdoba y del municipio de Tierra Blanca en la jurisdicción de Cosamaloapan. En cada localidad rural se informó acerca de la enfermedad de Chagas mediante el apoyo de las Unidades Medicas Rurales (IMSSOportunidades), y los participantes interesados donaron una muestra de sangre, previo consentimiento informado. A partir de las muestras se obtuvo el suero de cada uno de los pacientes, se recolectaron un

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Moral y Amatlán. Las diferencias observadas pueden ser atribuidas a factores ambientales tales como tipo de vegetación, uso de tierra, humedad y posiblemente a la separación geográfica de las dos áreas por montañas. La ausencia de infección por T. cruzi en Tierra Blanca fue asociada a la pérdida de vegetación y humedad, y la alta infección en Tezonapa fue asociada con la presencia de vegetación tropical.

Discusión:
El proposito de este estudio fue la actualización de la información epidemiológica por la infección de T. cruzi en la región central del estado de Veracruz. Las muestras fueron analizadas con cuatro ensayos diagnósticos. La concordancia entre las dos ELISAs y la IFI fue alta, lo cual representa una alta credibilidad de los resultados. Por el contrario, el ensayo de Western blot parece tener una baja sensibilidad porque este solo confirma una limitada proporción de los casos que resultaron ser positivos con los otros ensayos. Este bajo reconocimiento del Western blot ha sido observado en previos estudios en el estado de Morelos, México, en el cual solamente el 20 % de los casos positivos por ELISA fueron confirmados (10), y en un estudio con muestras de donadores de sangre en Orizaba, Veracruz (6). Este reconocimiento puede ser debido a un pobre reconocimiento de los antígenos desnaturalizados y sugiere que el Western blot puede ser un método no apropiado para la confirmación de la infección por T. cruzi. Por su parte, la alta concordancia entre los ensayos basados sobre las cepas Y y H1, las cuales pertenecen a diferentes linajes, y

conjunto con otros estudios, muestran un excelente reconocimiento en ensayos basados con una variedad de fuentes de antígenos con sueros de pacientes en México (11, 12).Sobre la base de dos o mas ensayos positivos, se detectó un promedio de seroprevalencia a la infección por T. cruzi de 16.8 % (IC95%= 14.2-19.9%) en esta área de estudio, la cual es considerablemente mas alta que en estudios previos. Se han reportado en esta jurisdicción rangos de seroprevalencia van de 1.3% en la población general y de 1.8% en niños menores de 18 años, sin embargo, el tamaño de las muestras es mucho mas pequeño y las localizaciones geográficas no se han especificado y puede haber diferencias por este hecho (4, 8). Interesantemente, no se han reportado casos en niños en la jurisdicción de Cosamaloapan (4), y nuestros datos parecen confirmar esta observación ya que no se detectaron casos en el municipio de Tierra blanca perteneciente a la jurisdicción de Cosamaloapan. Sin embargo, se encontró una alta seroprevalencia en la jurisdicción de córdoba, particularmente en el municipio de Tezonapa, el cual tiene un promedio significativo de elavada infección en niños. Sobre los datos de un rango de transmisión vertical ≤; 10% (13), nosotros calculamos arriba de 3.4 % de recién nacidos infectados por via congénita y posiblemente mas casos relacionados a la familia (14). Basado a un total de mil nacimientos por año, esto podría corresponder aproximadamente a 35 niños infectados congénitamente en el municipio de Tezonapa. Nuevamente estos resultados son muchos mas altos que los reportados en el noreste del estado de Veracruz, donde ningún caso de infección congénita fue

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encontrado en donde la seroprevalencia a la infección por T. cruzi en mujeres embarazadas fue de 3.5 % (15).

Conclusión:
El promedio de seroprevalencia de infección por T. cruzi fue de 16.8 %, y se identificó al municipio de Tezonapa como un región hiperendemica, con rangos de seroprevalencia mayores del 45% en la población infantil. Estos rangos de transmisión elevados pueden asociarse con una transmisión congénita y vectorial, en donde estudios adicionales tendrán que realizarse para ayudar a identificar estos procesos de transmisión.
5.

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EVALUACIÓN DEL POTENCIAL ADYUVANTE DE UN TOXOIDE DERIVADO DE LISTERIOLISINA O SOBRE
CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO HUMANAS
: Diana Magali Viveros Luna : Alfredo Domínguez López Leonardo Daniel Enríquez-Tenorio : Roberto Lagunes Torres Carmen Sofia Silva Cañetas Héctor Vivanco-Cid.

Marco teórico:
Uno de los aspectos clave en vacunación, es la identificación de estrategias para incrementar la inmunogenicidad de antígenos. El uso de moléculas adyuvantes y acarreadores es sin duda, la estrategia más empleada en vacunación para tal fin. Los adyuvantes son a menudo necesarios para crear vacunas eficientes al actuar de una forma no-específica, mediante la activación de uno o más componentes del sistema inmune innato, promoviendo inflamación de bajo grado y de esta forma potenciando la respuesta hacia el antígeno de interés. El conocer los mecanismos por los cuales estos actúan, así como la evaluación de aspectos básicos tales como la seguridad de su empleo en modelos experimentales animales y posteriormente en el humano, son aspectos muy importantes cuando se estudian nuevas moléculas candidatos a ser considerados como adyuvantes y/o acarreadores. En años recientes, una molécula producida

por el patógeno intracelular Gram-positivo Listeria monocytogenes (LM) denominada Listeriolisina O (LLO), ha cobrado gran interés en el campo de investigación enfocado a la identificación de nuevos adyuvantes y moléculas acarreadoras. LLO es una toxina formadora de poros, con la capacidad de unirse a membranas celulares a través de colesterol (1). Algunas estrategias se han utilizado para incluir a LLO en innovadoras formulaciones vacunales experimentales. Se ha utilizado para facilitar el acceso de proteínas pasajeras hacia el citosol de células presentadoras de antígeno profesionales (APCs), básicamente para inducir respuestas de linfocitos CD8 in vivo e in vitro. (2-3). Además de esto, LLO ha sido empleada también como una molécula acarreador para incrementar la inmunogenicidad de antígenos del virus de inmunodeficiencia humana, (4) antígenos tumorales (5) y antígenos modelo tales como ovoalbúmina entre otras (2). En todas estas propuestas la administración conjunta de LLO en combinación con el antígeno de interés (ya

Estudiante de Licenciatura hvivanco@uv.mx

Instituto De Investigaciones Medico Biologicas Universidad Veracruzana vivacid@hotmail.com

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sea como proteínas de fusión o bien como formulaciones de liposomas que encapsulan ambos: LLO + antígenos pasajeros) ha permitido incrementar la inmunogenicidad de los antígenos de interés, con vigorosa respuesta celular (CD4 y CD8), así como una notable respuesta inmune humoral.

Planteamiento del problema:
Una de las limitantes del uso de toxinas bacterianas como moléculas adyuvantes, lo es el potencial riesgo que representa su actividad biológica en la administración a seres humanos. LLO posee actividad citotóxica sobre múltiples estirpes celulares cuando esta es empleada en altas concentraciones. En el modelo murino, la inyección vía intravenosa de esta toxina, produce un efecto letal cardiotóxico en ratones (22). Este efecto adverso está asociado a la propiedad citolítica de la molécula, la cual provoca una destrucción masiva de globulos rojos, así como daño sobre tejidos de múltiples órganos blancos (corazón, hígado y riñón entre otros). Con la finalidad de explorar si en ausencia de la propiedad citolítica, LLO aún puede ser un adyuvante-acarreador efectivo en vacunación, en el presente trabajo se generó y evaluó los efectos de una mutante no lítica de LLO (denominada como detoxLLO), sobre células presentadoras de antígenos humanas (Celulas Dendríticas y macrófagos humanos), enfocándose sobre los parámetros de maduración de células dendríticas y producción de citocinas inflamatorias.

maduración de células dendríticas a través del análisis de la expresión de moléculas coestimuladoras CD80, CD86, CD40 y la expresión de MHC clase II, así como evaluar el efecto de detoxLLO en la producción de mediadores inflamatorios como el Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α;), IL-1 e IL-6 en macrófagos humanos.

Metodología:
Tipo de estudio: Básico, experimental. El gen de Listeriolisina O ha sido clonado dentro del vector de expresión pET29 por reacción en cadena de la polimerasa. El gen de Listeriosina fue modificado en su porción carboxi-terminal por medio de un protocolo estándar de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y PCR. La porción conocida como región de unión a colesterol (“Cholesterol Binding Domain”) fue modificada, insertando tres mutaciones en los codones que codifican para los aminoácidos Cisteína en posición 484, Triptofano 491 y Triptofano 492 de la proteína madura. Se procedió a realizar la expresión y purificación de la proteína detoxLLO y la proteína LLO nativa para ser usada como control o referencia. La expresión de las proteínas se realizó transformando la cepa BL21 con los vectores. Las bacterias fueron crecidas en medio LB con kanamicina, se adicionó IPTG para promover la expresión de los plásmidos. Las bacterias fueron cosechadas y sonicadas para liberar las proteínas recombinantes. Se realizó la purificación de las proteínas con una matriz de afinidad de iones níquel (NiNTA agarose beads, Qiagen). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana mediante gradiente de densidad

Objetivo General:
Evaluar los efectos de una mutante no lítica de Listeriolisina O (detoxLLO) en la

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empleando Ficoll-hypaque y se sembraron en botellas de cultivo celular de 75 cm2 estériles. Mediante adherencia al plástico se separaron los monocitos de las células no adherentes. Las células dendríticas inmaduras se obtuvieron al incubar los monocitos humanos purificados, en presencia de GM-CSF 200 ng/mL e IL-4 50 ng/mL durante 7 días a 37OC con 20 mL de medio RPMI suplementado suero fetal bovino al 10%. Para la obtención de macrófagos humanos, los monocitos purificados por adherencia fueron incubados con medio RPMI 1640 con suero fetal de bovino descomplementado al 10% y suero humano al 2%. Las células se incubaron a 37°C y 5% CO2 durante 6 días. Células dendríticas inmaduras (500,000) fueron estimuladas con 500 ng/ml de detoxLLO o LLO nativa durante 24 horas en placas de cultivo de 24 pozos. Las células fueron recolectadas y centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en 100 µl de solución de bloqueo y se incubaron a 4 C durante 1 hora. Posteriormente las células se incubaron con los siguientes anticuerpos monoclonales anti-CD80-FITC, anti-CD86-PE y anti-CD40FITC y contra moléculas del MHC clase II en solución de tinción y analizarlas por medio de citometría de flujo. Determinación de citocinas inflamatorias en el sobrenadante de macrófagos humanos estimulados con detoxLLO: Macrófagos humanos (500,000 células) fueron estimulados con 500 ng/ml de detoxLLO, LLO nativa o con 100 ng/mL de LPS de E. coli como control positivo, durante 24 horas en placas de 24 pozos. Al término de este tiempo se recuperaron los sobrenadantes y fueron congelados a -20 C hasta analizar la producción de citocinas

proinflamatorias: TNF-alfa, IL-1 e IL-6 por técnica de ELISA.

Resultados:
Al comparar la proteína nativa LLO y el toxoide generado (detoxLLO), ambas moléculas indujeron significativos niveles de citocinas inflamatorias humanas en macrófagos humanos con una tendencia de detoxLLO a inducir niveles más elevados de mediadores inflamatorios. La producción de TNF-alfa alcanza su pico máximo de producción (1620 pg/ml de TNF-alfa) a las 24 horas en macrófagos estimulados con 500 ng/ml de LLO nativa. La misma concentración de detoxLLO (500 ng/ml) indujó niveles superiores de TNF-alfa a las 24 horas (1830 pg/ml de TNF-alfa. La producción de IL-1 a las 24 horas en macrófagos estímulados con LLO nativa registró un valor promedio de 1200 pg/ml, niveles inferiores a los obtenidos para los macrófagos estimulados con detoxLLO (1546 pg/ml). Para IL-6 los valores obtenidos fueron muy similares entre ambas proteínas (880 pg/ml para macrófagos estimulados con LLO nativa, y 960 pg/ml de detoxLLO). Al comparar ambas proteínas por su potencial de inducir la maduración de células dendríticas humanas, se observó un aumento en la expresión de las moléculas co-estimuladoras CD80, CD86, CD40 y MHC clase II para las 24 horas, en comparación con células dendríticas humanas sin estimular. La expresión de estos marcadores fue mayor en las células estimuladas con detoxLLO que las estimuladas con la preparación de LLO nativa, aunque la intensidad media de fluorescencia fue menor a la registrada por células dendríticas humanas estimuladas con

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100 ng/ml de Lipopolisacarido.

Discusión:
Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten confirmar que la capacidad de inducir la activación de células del sistema inmune innato humanas de la proteína LLO, es independiente de su actividad citolítica. El toxoide generado en el presente trabajo (detoxLLO), conserva sus propiedades inmunogénicas, con ligera tendencia a promover una mayor cantidad de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos estimulados durante 24 horas. De igual forma que para los mediares inflamatorios, detoxLLO conserva su capacidad de inducir la expresión de marcadores de maduración celular en células dendríticas humanas, uno de los aspectos claves que se sabe, permiten el inicio de la inmunidad adquirida. Es probable que las tendencias observadas de mayor producción de mediadores inflamatorios y una mayor expresión de moléculas de coestimulación, se expliquen por su reducción en su potencial citotóxico per se, lo cual permitiría que un mayor número de células en cultivo, sobrevivieran por más tiempo en el cultivo y por tanto siguieran produciendo una mayor cantidad de mediadores inflamatorios en el sobrenadante o una mayor expresión de moléculas de coestimulación en las células en cultivo.

antígeno humanas a secretar mediadores inflamatorios como TNF-alfa, IL-1 e IL-6, así como la expresión de moléculas de coestimulación como CD80, CD86, CD40 y MHC clase II, lo cual abre la posibilidad de utilizar esta molécula como un adyuvante eficaz y seguro en vacunación.

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3.

4.

Conclusión:
El toxoide generado a partir de la molécula Listeriolisina O nativa, conserva sus propiedades inmunogénicas, al inducir la activación de células presentadoras de

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PATRON DE SUSCEPTIBILIDAD DE MICROORGANISMOS AISLADOS EN UROCULTIVOS EN LA UNIDAD DE SERVICIOS ANALITICOS DE SALUD BIOANALISIS (USASB). ENERO 2007, DICEMBRE 2009 XALAPA VERACRUZ.
Jose de Jesus Daniel López Muñoz Claudia Belen Ortega Planell Omar Lagunes Merino Andy Arceo Rodríguez

Marco teórico:
Las infecciones del tracto urinario se definen como un grupo de condiciones que tienen en común la presencia de un número significativo de bacterias en la orina. Las infecciones agudas de las vías urinarias se pueden subdividir en dos grandes categorías anatómicas: la infección de las vías superiores (uretritis, cistitis y prostatitis) y la infección de las vías superiores (pielonefritis aguda, absceso renal y perinéfrico). En la mayor parte de los casos, el crecimiento de 101 unidades formadoras de colonias por mililitro (ml), puede ser clínicamente importante especialmente en niños y en especímenes obtenidos por catéter urinario; cualquier crecimiento patógeno es considerado clínicamente importante si fue obtenido por aspiración supra púbica. La infección del tracto urinario puede ser recidivante, que pueden ser recaídas o reinfecciones. La recaída se refiere a la reactivación de la infección con el mismo

microorganismo que estaba presente antes de iniciarse el tratamiento, es decir se debe a la persistencia del microorganismo en el tracto urinario. La reinfección es un nuevo efecto con un microorganismo diferente de la bacteria original, aunque en ocasiones puede ser el mismo agente bacteriano. El uso indiscriminado de antibióticos por parte de la población, ha causado el incremento de la resistencia de diversos agentes causales de IVU. La resistencia bacteriana es un tema trascendental en salud pública dado que es de vital importancia el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana encaminados a la orientación para la elaboración de esquemas de tratamiento eficaces. La flora de los pacientes hospitalarios es muy distinta a la de la comunidad, esto se debe a la multirresistencia presentada por los agentes causales de enfermedades en los pacientes hospitalizados y a la modificación de la flora debido a la colonización por microorganismos propios de la flora nosocomial de gran patogenicidad. Los
Facultad de Bioanálisis

Docente y Profesional de la salud Universidad Veracruzana jojedanlm@hotmail.com asiolita@yahoo.com.mx

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microorganismos que se aíslan con mayor frecuencia son los bacilos Gram negativos y los estafilococos. De acuerdo a diversos estudios realizados en nuestro país, las bacterias Gram negativas son las responsables de las IVU y los antimicrobianos evaluados con mayor porcentaje de susceptibilidad son el ceftibuten y la netilmicina en cambio, la ciprofloxacina, trimetoprim-sulfametoxazol, amikacina y la levofloxacina representaron los antibióticos con mayor resistencia (Barriga Angulo y cols. 2008). En un estudio llevado a cabo en el Instituto Nacional de Pediatria (2002) no se encontraron diferencias significativas en la resistencia de bacterias Gram negativas y el uso de ciprofloxacina, cefepime y ceftriaxona.

urocultivos en el USASB de agosto del 2008 a diciembre del 2009.

Metodología:
El tipo de estudio fue observacional, descriptivo y transversal. Se llevó a cabo en la Unidad de Servicios Analíticos de Salud Bioanálisis, durante el periodo de agosto del 2008 a diciembre del 2009 una evaluación de 138 muestras de urocultivos.Se estudiaron 138 muestras de las cuales 34 fueron positivas. Los aislamientos fueron caracterizados a nivel de género y especie con base a las técnicas reco-mendadas por la Sociedad Americana de Microbiología. Con respecto a la sensibilidad se utilizaron diferentes antimicrobianos: Cefalotina, Netilmicina, Nitrofurontoina, Amikacina, Ampicilina, Carbenicilina, Meropenem, Acido Nalidixico, Trimeto/Sulfame,Pefloxacina, Cefotoxima, Cefoperaxone, Gentamicina, Nitrofurontoia. Para la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana, se llevaron a cabo los procedimientos recomendados por el Instituto de Estándares de Laboratorios Clinicos (CLSI) de Estados Unidos de América, utilizando la técnica de difusión con sensidiscos (Kyrbi-Bauer) en agar de Müeller Hinton.Para el análisis de los datos se elaboró una base de datos en el programa Microsoft Excel 2007® y posteriormente se realizó estadística descriptiva para calcular frecuencias absolutas y relativas.

Planteamiento del problema:
De acuerdo a cifras reportadas por diversos estudios, la incidencia anual de infecciones en vías urinarias es de 0.5 a 0.7 casos por paciente. En Norteamérica, cada año se enferman ocho millones de personas, representando 100, 000 ingresos hospitalarios. En México, la morbilidad debido a las IVU se encuentra dentro del tercer lugar, solo por debajo de las infecciones respiratorias y diarreicas. En cuanto al ambiente hospitalario, las IVU contribuyen la etiología de las infecciones nosocomiales y se asocia con las insuficiencia renal crónica. Por esta razón, se hace necesaria la determinación de la susceptibilidad de los agentes causales de IVU, con la finalidad de conocer el patrón de resistencia/sensibilidad en la población que acude a la Unidad de Servicios Analíticos de Salud Bioanálisis (USABS).

Resultados:
Fueron un total de 231(100%) muestras de urocultivos, se obtuvieron 163(70.56%) positivas y 68(29.43%) negativas; los microorganismos que se aislaron con mayor frecuencia fueron los siguientes: Klebsiella

Objetivo General:
Determinar la susceptibilidad de diferentes antibióticos en microorganismos aislados de

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oxytoca, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pantoea agglomerans, Pseudomonas sp, Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis.

Discusión:
Más del 95 % de la IVU son causadas por bacilos gram negativos y entre ellos las entero bacterias, de las cuales Escherichia coli es la más frecuente. En este estudio Escherichia coli es reconocida como el microorganismo que se aisló con mayor frecuencia. El porcentaje de aislamiento de Escherichia coli es similar a los resultados publicados por autores internacionales de estudios sobre prevalencia de microorganismos bacterianos en urocultivos tales como Hooton TM. The current management strategies for communityacquired urinary tract infection.Otras bacterias aisladas en fueron Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Enterobacter agglomerans, Pseudomonas sp. La existencia del incremento de cepas resistentes a la ampicilina convierte a esta droga en una opción menos eficaz para el tratamiento de la IVU.

para uso empírico y teniendo en cuenta el costo-beneficio podrían ser una herramienta útil a la hora de tomar una decisión terapéutica. La elección de un antibiótico para el tratamiento de la infección de vías urinarias requiere un conocimiento de las bacterias más frecuentes y su perfil de resistencia bacteriana. La ampicilina debe ser eliminada como opción terapéutica inicial dada la alta tasa de resistencia que presentan los patógenos más frecuentes.

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Conclusión:
Según los resultados obtenidos de nuestro estudio, se corrobora de acuerdo con otros estudios, que la mayor frecuencia de infección de vías urinarias se da en el sexo femenino. Claramente observamos que el microorganismo responsable de la mayor parte de los casos de IVU es la Escherichia coli, sin embargo encontramos otros no tan frecuentes, como Klebsiella, Proteus y Enterobacter.De acuerdo con los antibióticos utilizados para realizar nuestras pruebas el antibiótico que mostro mayor sensibilidad en las bacterias fue amikacina ya que presentaron un alto margen de seguridad

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