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Diagnostico Microbiologico

Texto e Atlas Colorido

Quinta Edi<;ao

ELMER W. KONEMAN, M. D.

Chefe de Secao do Laboratorio de Microbiologia Departamento de Patologia

Veterans Affairs Medical Center

Professor de Patologia

University of Colorado School of Medicine Denver, Colorado

PAUL C. SCHRECKENBERGER, PH. D., M. S. Professor Associado de Patologia

Diretor do Laboratorio de Microbiologia Clinica The University of Illinois

College of Medicine at Chicago

Chicago, Illinois

STEPHEN D. ALLEN, M. D. Professor de Patologia

Indiana University School of Medicine Diretor da Divisao de Microbiologia Clinic a Indiana University Hospitals Microbiologista Clinico

Wishard Memorial Hospital e

Roudebush Veterans Affairs Hospital Indianapolis, Indiana

WASHINGTON C. WINN, JR., M.D., M.B.A. Professor de Patologia

University of Vermont College of Medicine Diretor do Laborat6rio de Microbiologia Clinica Fletcher Allen Health Care

Burlington, Vermont

TradurJo e SupervisJo ARLETE EMILY CURY

WILLIAM M. 'JAN!):;; P'H.-D.

.~ > ", •

Professor Assoqiado de Patologia

Diretor Associado do Laboratorio de Mlcrobiologia

Clfnica . , ~

The University of-Illinois .'{ ;,

College of Medicine-at Chicago

Chicago, Illinois

Livre Docente

Faculdade de Ciencias Farmaceuticas da Universidade de Sao Paulo, Disciplina de Parasitologia e Micologia Clinica

Professor Associado de Parasitologia e Micologia Clinica

2001

NEDSi

PRANCHA COlORIDA 2-1

AVALIA\=Ao DE ESFREGAt;OS DE ESCARRO POR COLORAt;AO DE GRAM

A qualidade das amostras de escarro pode ser avaliada mediante contagem do rnimero relativo de celulas epiteliais de descamacao e neutrofilos segmentados por campo de baixo poder de resolucao em urn esfregaco submetido it coloracao de Gram. A presenca de celulas epiteliais de descamacao indica contaminacao com seerecoes orofarfngeas, Em contraste, uma pneumonia bacteriana produz grande quantidade de neutrofilos segmentados no escarro. A seguir, encontram-se fotomicrografias de esfregacos de amostra de escarro corados segundo a tecnica de Gram, ilustrando a presenqa relativa dos varies componentes eelulares.

A. Observacao com menor aumento de urn esfregaco de escarro mostrando urn campo com celulas epiteliais de descamacao e ausencia de neutrofilos segmentados, Esta amostra representa saliva, pode dar uma contagem de baixa qualidade e nao e aceitavel para cultivo,

B. A celula epitelial de descamacao observada aqui encontra-se intensamente colonizada com bacterias gram-positivas. 0 sobrecrescimento de celulas bacterianas em amostras de escarro em geral indica que a amostra sofreu uma demora no transporte ao laboratorio e qualquer resultado semiquantitativo ten) pouco valor.

C. Este esfregaco de escarro corado com Gram mostra uma rnistura de celulas de descamacao e neutrofilos segmentados. A presence de neutrofilos segmentados indica que existe urn foeo de infeccao em alguma parte do trato respiratorio; entretanto, as celulas epiteliais de descamacao indicam contaminacao com secrecoes do trato respiratorio superior, Este tipo de esfregaco de escarro e de diffcil interpretacao, porque as infeccoes do trato respiratorio superior nao podem ser diferenciadas das infeceoes do trato respiratorio inferior.

D. Campo repleto de neutrofilos e virtual ausencia de celulas epiteliais de descamacao, Esta e uma amostra de escarro de alta qualidade, que fomece uma boa oportunidade para produzir resultados relevantes.

E. Observacao com maior aumento da amostra D, mostrando neutrofilos segmentados dispersos contra urn fundo de fios de mucina corados em rosa.

F. Esfregaco de uma amostra de escarro induzido corada com Diff Quick, mostrando varias celulas epiteliais colunares ciliadas, Estas celulas tern origem no trato respirat6rio inferior e, quando presentes em urn esfregaco de escarro, como se mostra aqui, indicam uma amostra de alta qualidade a partir da qual podem ser obtidos resultados potencialmente relevantes.

G. Observacao com maior aumento de urn esfregaco corado com Gram ilustrando a morfologia de uma, celula epitelial colunar ciliada, Observam-se os nitidos cilios encimando a porcao terminal em forma de chama desta celula epitelial colunar de coloracao eosinofila.

H. Coloracao com azul-de-toluidina de uma amostra de escarro induzido mostrando celulas mononuc1eares inflamatorias consistentes com macr6fagos alveolares .. Como as celulas epiteliais colunares ciliadas, os macrofagos alveolares tern origem em sftios profundos do trato respiratorio inferior, e a presenca deles em arnostras de escarro aumenta a importancia de qualquer especie bacteriana isolada.

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PRANCHA COLORIDA 2·2

DIVERS AS COLORAr,;:OES UTILIZADAS EM MICROBIOLOGIA

Visto que muitos dos organismos de importancia medica possuem indices de refracao proximos ao da agua, sao necessarias coloracoes para tornar possfveis a deteccao e 0 estudo deles. Ao longo dos anos desenvolveu-se uma variedade de coloracoes, cada uma das quais planejada para pOl' em evidencia organelas intemas ou componentes especificos da parede celular, As seguintes sao ilustracoes de coloracoes selecionadas e de algumas de suas aplicacoes,

A. Coloracda de Gram. E a mais comum das coloracoes utilizadas no laboratorio de microbiologia. Foi planejada para diferenciacao entre as bacterias que podem reter 0 corante cristal violeta, apresentando cor negro-azulada intensa ap6s a deseoloraeao (gram-positivas), e aquelas que nao retem 0 corante e apresentam cor vermelha (gram-negativas). Aqui se encontra ilustrada uma preparacao corada com Gram. que mostra bacilos gram-negativos corados em vermelho.

B. Coloraciio para acido-resistsncia. Esta coloracao e utilizada comumente para evidenciar diversos microrganismos resistentes ao acido, incluindo especies de Nocardia em amostras de escarro e oocistos de Cryptosporidium em amostras de fezes. Aqui sao mostrados grupos de bacilos acido-resistentes, corados em vermelho, em uma amostra de bi6psia de figado de urn paciente com AIDS. Estes microrganismos aparecem em vermelho com a coloracao para acido-resistencia, e os mostrados aqui foram identificados como pertencentes ao complexo Mycobacterium avium-iniracellulare.

C. Fluorescencia direta. Os corantes fluorescentes (rodamina e auramina) reagem diretamente com a parede celular das micobacterias, Tambem se encontram dispomveis antic orpos conjugados com fluorescein a para por em evidencia uma variedade de agentes microbianos mediante 0 usa da prova de fluorescencia direta de anticorpos. Aqui sao mostradas micobacterias com fluorescencia verde-amarelado em uma arnostra concentrada de escarro de urn paciente com tuberculose pulmonar,

D. Laranja de acridina. Esta coloracao fluorescente e utilizada para evidenciar formas bacterianas em esfregacos diretos e montagens de lfquidos bio16gicos. E particularmente util para detectar bacterias gram-negativas em cultivos positivos de sangue em meio lfquido, que podem passar despercebidas nas coloracoes com Gram devido ao fundo de restos celulares corado intensamente em vermelho. Aqui e mostrada uma bacteria longa, em forma de bastao, com urn brilho aJaranjado caracterfstico quando observada com urn rnicroscopio de fluorescencia

E. Azul-de-metileno. Esta coloracao inespecffica e rapida e utilizada para evidenciar bacterias e outros microrganismos em esfregacos diretos. Aqui sao mostrados bacilos que incorporam 0 corante. Uma aplicacao importante e a deteccao de bacterias em esfregacos diretos de liquido cefalorraquidiano, em cases suspeitos de meningite aguda, em particular por especies gram-negativas que poderiam ser obscurecidas pelo fundo de material proteico corado em vermelho.

F. Branco de calcofluor. Este agente branqueador autofluorescente tern a propriedade de acoplar-se a residuos de carboidratos nas paredes celulares dos fungos. Aqui sao mostradas hifas coradas em verde-amarelado brilhante, por coloracao direta de uma montagem com branco de calcofhior, como observadas com urn microsc6pio de fluorescencia,

G. Wright-Giemsa. Esta coloracao e comumente utilizada para evidenciar os elementos celulares em esfregacos de sangue periferico e medula ossea. Em microbiologia, esta colora~ao e empregada com frequencia para detectar parasitos intra-eritrocitarios (plasm6dios, babesias) e exoeritrocitarios (tripanossomas, microfilarias), inclusoes de clamtdias e, como se mostra aqui, forrnas de leveduras intracelulares de Histoplasma capsulatum ..

H. Acido periodico de Schiff (PAS). Esta coloracao gerale utilizada para evidenciar paredes celulares ric as em polissacarfdeos. E aplicada especificamente para detectar fungos em cortes de tecido e em esfregacos. Aqui e observado 0 corpo de frutificacao de uma especie de Aspergillus rode ado por conidios corados em vermelho, em urn esfregaco de aspirado de lesao pulmonar.

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PRANCHA COLUKIUA :l-j

IDENTIFICACAO PRESUNTfVA DE BACrERIAS COM BASE NA OBSERVACAO DA MORFOLOGlA DAS COLONIAS

Os microbiologistas utilizam diversas caracteristicas das colonies bacterianas que crescem na superffcie de meios de cultura de agar para efetuar uma identificacao presuntiva do grupo au genera, e como guia para selecionar provas diferenciais para estabelecer a identificacao final da especie. Os criterios comumente empregados sao tamanho, forma, COIlsistencia, cor, producao de pigmento e presenca de reacoes bemolitieas em agar sangue.

A. Plaea de agar sangue com crescimento de colonias arredondadas, branco-amareladas, lisas, convexas e nao-hemoliticas, sugestivas de Staphylococcus.

B. Colonias em agar sangue rodeadas por nitidas zonas de ~-hem6lise. A relacao entre tam anho das colonias e as zonas de hemolise e utilizada para diferenciacao entre algumas especies. Aqui sao rnostradas especies de Streptococcus, que em geral possuem urn valor baixo para a relacao entre tamanho de colonia e zona hemolitica, em contraste com as especies de Staphylococcus, nas quais 0 tamanho relative das eol6nias e geralmente maior.

C. Placa de agar sangue que mostra a descoloracao esverdeada do meio, caracterfstica da u-hemolise. Nesta placa sao observadas as colonias diminutas de Streptococcus viridans com grandes zonas de o-hemolise.

D. Colonias opacas, acinzentadas e algo timidas em agar sangue (esquerda) eagar MacConkey (direita), sugestivas de urn dos membros da famflia Enterobacteriaceae. 0 crescimento em agar MaeConkey nao mostra pigmentacao vermelha, indieando que 0 microrganismo nao e fermentador de lactose. As colonias mostradas aqui pertencem a uma especie de Salmonella.

E. Colonias secas e rugosas de uma especie de Bacillus. Colonias de aparencia similar sao observadas em Pseudomonas stuizeri.

F. Colonias de pigmentacao amarela em agar sangue. A producao de pigmentos e uma caractenstica importante na identificacao diferencial de muitas especies de bacterias, partieularmente as pertencentes a varies grupos de bacilos nao-fermentados. As colonies observadas aqui sao de Flavobacterium, desenvolvidas ap6s 48 horas de incubacao, sendo as ultimas 24 horas a temperatura ambiente. A intensidade do pigmento pode acentuar-se ap6s uma incubacao adicional a temperatura ambiente.

G. Colonias nitidamente muc6ides em agar sangue. De modo geral, a consistencia muc6ide das colonias e secundaria a producao de capsulas, urn mecanismo de protecao utilizado por muitas especies de bacterias para defesa contra a fagocitose. Especies de Pseudomonas, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae e Cryptococcus neoformans estao entre as especies de microrganismos produtores de colonias muc6ides isoladas com mais frequencia. As colonias observadas sao de Streptococcus pneumoniae.

H. Colonias cinzas, semitranshicidas de Eikenella corrodens em-agar sangue. Observar 0 halo que aparece ao redor das colonias ilustrando 0 "fossete" caracteristico da especie,

I. Colonias cinzas, lis as e sernitransparentes de Capnocytophaga ochracea. Observar a extensao nebulosa das colonias, que ilustra a motilidade caractecistica das especies de Capnocytophaga.

J. Colonia branca e seca de especie de Nocardia. As especies de Streptomyces produzem colonias de aparencia similar. Essas identificacoes presuntivas pod em sec confirmadas quando se detecta 0 odor de "ambiente mofado" caracteristico dessas especies,

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IDENTIFICACAo PRESUNTIVA DE BACTERIAS COM BASE NA OBSERVACAO MICROSCOPICA DA MORFOLOGIA CELULAR EM EsFREGA!,;OS CORADOS

A coloracao de Gram para bacterias, alem de outras tecnicas de coloracao, e uma das determinacoes mais importantes para a identificacao presuntiva de microrganismos. A morfologia das celulas bacterianas, sua organizacao e caracteristicas tintoriais sao, com frequencia, suficientemente distintivas para permitir uma identificacao presuntiva em um esfregaco corado com Gram. Nesta prancha estao incluidas as caracteristicas microsc6picas sugestivas de varies grupos de bacterias.

A. Bacilos gram-negativos relativamente delgadas, dispostos em letras chinesas, que sugerem uma das especies de bacterias corineformes (difteroides),

B. Bacilos esporulados gram-positivos. Estes bacilos formadores de esporo em aerobiose pertencern ao genero Bacillus; OS formadores de esporos em anaerobiose pertencem ao genera Clostridium. Aqui sao mostradas celulas esporuladas de Bacillus sphaericus.

C. Coloracao de Gram direta de urn exsudato purulento que mostra cocos gram-positives dispostos em cachos pequenos, caractensticos das especies de Staphylococcus.

D. Esfregaco direto de exsudato de urn caso de mionecrose. Os minusculos cocos grampositivos observados nesta fotomicrografia sao estreptococos.

E. Coloracao direta com Gram de um esfregaco de escarro purulento que rnostra diplococos gram-positives, caracterfsticos de Streptococcus pneumoniae.

F. Exsudato purulento proveniente da parede toracica de urn paciente com empiema agudo supurativo. Sao observados numerosos bacilos gram-positivos ramificados contra urn fundo de neutr6filos segmentados. As especies de Actinomyces e Nocardia podem apresentar aspectos simi lares a este; entretanto, neste caso, foi isolada uma especie de Bifidobacterium em cultivo puro, em anaerobiose.

G. Preparacao corada com Gram de um esfregaco de sedimento urinario em um caso de cistite aguda. Observar a presenca de varies bacilos gram-negatives contra urn fundo de neutr6filos segmentados. Neste caso foi isolada Escherichia coli em cultivo puro.

H. Coloracao de Gram de urn esfregaco preparado a partir de urn exsudato uretral purulento de urn homem sexualmente ativo, mostrando diplococos intracelulares gram-negativos caracterfsticos de Neisseria gonorrhoeae. Nesta fotografia, as celulas bacterianas aparecem mais palidas do que se observa normalmente atraves do microsc6pio.

I. Fotomicrografia de urn esfregaco de escarro mostrando Urn fundo com poucos neutr6filos segmentados, assim como uma infiltracao difusa com muitos bacilos gram-negativos curtos, alguns dos quais apareceram rodeados por urn halo. No cultivo cresceu Klebsiella pneumoniae.

J. Fotomicrografia de filamentos gram-positivos delicados, ramificados, sugestivos de uma especie de Actinomyces. No cultivo cresceu Propionibacterium acnes.

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IDENTIFICA<;Ao PRESUNTfVA DE ENTEROBACTERIACEAE

A identificacao presuntiva de Enterobacteriaceae se baseia no aspecto das colonies que crescern em meios de isolamento primaries e na determinacao de certas caracterfsticas bioqufmicas. Par definicao, para que urn microrganismo possa ser classificado dentro da famflia Enterobacteriaceae, deve fermentar a glicose, para produzir acido ou acido e gas, reduzir nitratos a nitritos e nao apresentar atividade de citocrorno oxidase.

A. Coloracao de Gram de urn esfregaco de escarro que mostra os caracteristicos bacilos gramnegativos curtos, rolicos, tfpicos dos membros da familia Enterobacteriaceae. Tambem sao observados leuc6citos polimorfonucleares, que sugerern a ocorrencia de urn processo infeccioso no paciente. Neste caso, 0 cultivo confirmou a presenca de K. pneumoniae.

B. Cultivo misto de urn crescimento de 24 horas em agar sangue de dois rnorfotipos de grandes bacilos grarn-negativos e urn terceiro morfotipo correspondente a urn rnicrorganismo rnenor, 0 qual pode ser suspeitado como uma especie grarn-positiva. Urn dos morfotipos apresenta colonias grandes, brilhantes e brancas, enquanto que 0 outro mostra colonias grandes, acinzentadas, com bordas irregulares. Ambos os tip os de colonies sao suspeitos de pertencerem a bacilos gram-negativos tipicos dos membros de Enterobacteriaceae. Tambem sao observadas rnuitas colonias pequenas, brancas, lisas, tfpicas de urn dos cocos gram-positivos.

C. Colonias grandes, rosadas, muc6ides, brilhantes, em agar MacConkey, tipicas de especies de Klebsiella e Eruerobacter. Apenas por seu aspecto estas colonias sao suspeitas de pertencerem a familia Enterobacteriaceae.

D. Aspecto invasor de uma especie m6vel de Proteus em uma placa de agar chocolate.

E. Uma serie de tubos de agar ferro Kligler (KIA) inclinado ou em pico, que apresenta varies tipos de reacao. 0 tuba da extrema esquerda mostra urn pico acido (amarelo) e urn fundo acido (arnarelo), que indica fermentacao tanto da glicose como da lactose. Notal' tambem o espaco vazio que existe no fundo do tuba e a ruptura do agar no centro deste, que indica producao de gas (C02) pelo rnicrorganismo. Grandes quantidades de CO2, como as observadas aqui, sao produzidas habitualmente apenas por microrganismos pertencentes Ii Tribo V (Klebsielleae). 0 segundo tuba da esquerda mostra uma reacao acida/acida, mas sem presenca de gas, tfpica de E. coli. 0 terceiro tubo apresenta urn pi co alcalino (vermelho) e um fundo acido, reacao caracteristica de um nao-fermentador da lactose. 0 quarto tubo tern um pica vennelbo/fundo negro que indica producao de sulfeto de hidrogenio (~S). Quando se observa este tipo de reacao em om microrganismo oxidase-negativo, presumese que a porcao profunda do agar seja acida (amarela), 0 que indica fermentacao da glicose, mesmo que a cor amarela esteja rnascarada pela producao de H2S. A rea9ao do quinto tubo (extrema direita) vermelho/vermeLho e tfpica dos bacilos gram-negativos nao-fermentadares, que nao fermentarn glicose nem lactose.

F. Tres tub os de caldo com tubos de Durham para demonstrar a producao de gas. Os dois tubos da direita mostram formacao de acido a partir da glicose (amarelo) em comparacao com 0 controle negativo da esquerda. 0 tubo da extrema direita mostra a colecao de gas no interior do tubo de Durham, caracteristica de urn microrganismo que produz acido e gas a partir da glicose.

G. Prova da citocromo oxidase apresentando uma reacao positiva de cor purpura (esquerda), comparada com uma reacao negativa a direita (nao aparece car azul em 10 segundos - vel:

Protocolo 16). Qualquer microrganismo que reaja positivamente pode ser exclufdo da fanulla Enterobacteriaceae.

H. Meio de provas para nitratos com tubos de Durham para demonstrar a formacao de nitrogenic gasoso. 0 tuba da esquerda mostra uma reacao positiva (vennelho) ap6s adicao de o-naftilamina e acido sulfanflico. 0 rnicrorganismo em estudo reduziu os nitratos, contidos no meio, a nitrites, que reagiram com os reativos para forrnar 0 pigmento vermelho p-sulfobenzeno-azo-n-naftilamina (ver Protocolo 53).0 tubo tambem mostra uma reacao positiva para nitratos, mas neste caso ap6s reducao dos nitratos a nitritos, estes por sua vez foram reduzidos a nitrogenio gasoso, indicado pela colecao de gas dentro do tuba de Durham. Como neste caso nao existem nitritos no meio, nao ocorre desenvolvimento de cor vermelha ap6s adic,:ao dos reativos. 0 tubo da extrema direita mostra ausencia de cor vermelha e de gas, representando uma reacao negativa para reducao de nitratos.

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ASPECTO DE COLONIAS DE ENTEROBACTERIACEAE EM AGAR MAC CONKEY E EMB

o agar MacConkey eo agar eozina-azul-de-metileno (EMB) sao dais meios seletivos de isolamento primario utilizados habitual mente para a diferenciacao presuntiva de mernbros ferrnentadores de lactose da famflia Enterobacteriaceae. No agar MacConkey as colonias que fennentam lactose aparecern em vermelho devido a conversao acida do indicador vennelho neutro. Em agar EMB, as especies que fermentam intensivamente a lactose mostram um brilho verde-metalico, com producao de suficiente acido para levar 0 pH a aproximadamente 4,5 ou men os ..

A. Superficie de agar MacConkey com urn crescimento de 24 boras de colonias vermelhas, fermentadoras de lactose. A car vermelha difusa no agar e produzida par microrganismos que fermentam com intensidade a lactose, produzindo grande quantidade de acidos mistos e precipitacao dos sais biliares do agar que envolve as colonias (p.ex. Escherichia coli).

B. Superffcie de agar MacConkey que mostra colonias vennelbas de fermentadores de lactose e colonias menores, transparentes, de nso-fermentadores de lactose.

e e D. Superffcie de placas de agar EMB que mostram 0 brilbo verde produzido POf membros das Enterobacteriaceae que ferment am intensivamente a lactose (au a sacarose), A malaria das cepas de E. coli forma colonias com este aspecto em agar EMB, e como E. coli se encontra entre os isolados mais freqnentes de amostras clfnicas, 0 aspecto dessas colonias pode servir para a sua identificacao presuntiva, Entretanto, outras caracteristicas devem ser determinadas alem da coloracao verde em agar EMB, antes da identificacao definitiva de um microrganismo como E. coli, porque outras Enterobacteriaceae fermentadoras de lactose podem ter um aspecto similar.

E e F. Superficie de placas de agar EMB que ilustram urn cultivo misto de E .. coli (colonias com brilbo verde) e de espeeies de Shigella. A maioria das especies de Shigella nao ferrnenta a lactose e, portanto, em agar EMB produzem colcnias sem pigmentacao, semitranslucidas. Outras especies incapazes de fermentar lactose produzem colonias de aspecto similar aos destas fotografias,

PRANCHA COtORIDA 4-3

ASPECTO DE ENTEROBACTERIACEAE EM PLACAS DE AGAR XLD E HE

Habitualmente em laboratories de microbiologia clfnica sao utilizados varies tipos de meios mais seletivos que 0 agar MacConkey ou 0 agar EMB para isolar membros selecionados de Enterobacteriaceae. 0 agar xilose-lisina-desoxicolato (XLD) eo agar enterico de Hektoen (HE) s5.o os mais empregados; os meios altamente seletivos, como 0 agar sulfato de bismuto, sao utilizados apenas para aplicacoes especiais. Estes meios nao so pennitem diferenciar rnicrorganismos fermentadores de lactose dos nao-fermentadores, como tambem detectar microrganismos produtores de sulfeto de hidrogenio (H2S).

A. Superficie de agar XLD que mostra a viragem do agar por colonias de E. coli produtoras de acido,

B. Colonies nao-fermentadoras de lactose (nao ha conversao acida no meio) de uma especie de Salmonella na superffcie de agar XLD. Observar a cor negra de algumas col6nias, indicando producao de I1:zS.

C. Placa de agar XLD semeada com uma mistura 50/50 de E. coli e de especies de Salmonella. Observar 0 desenvolvimento preponderante das especies de Salmonella (colonias vermelhas) em comparacao com as poucas colonias amarelas fermentadoras de lactose de E. coli que foram efetivamente inibidas, 0 evidente halo rosado ao redor das colonias de Salmonella indica a descarboxilacao da Iisina, caracterfstica uti] para diferenciar as especies de Salmonella (positivas) das especies de Proteus produtoras de I1:zS.

D. Placa de agar XLD semeada com uma cepa produtora de H2S de uma especie de Proteus.

Observar a ausencia de halo rosado ao redor das colonias, 0 que indica que nao ha descarboxilacao de Iisina (comparar com as colonias em C).

E. Superffcie de agar HE que ilustra a ptoducao de acido (amarelo) por colonias de E. coli.

F. Superficie de agar HE que mostra as colonies esverdeadas (incolores) de uma Enterobacteriaceae nao-fermentadora de lactose.

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PRANCHA COLORIDA 4-4

CARACTERlSTICAS DIFERENCIAIS DE ENTEROBACTERIACEAE

A. A prova de orto-nitrofenil-~-D-galactopiranos[deo (ONPG) mostra uma reacao posiriva (amarelo), (a esquerda), em cornparacao com urn controle negativo (a direita). Uma reacao positiva indica que 0 microrganismo e capaz de produzir ~-galactosjdase, enzima necessaria a degradacao inicial da lactose, liberando 0 orto-nitrafenol amarelo para 0 meio.

B. Tuba de agar semi-solido de sulfeto-indol-motilidade (SIM) ea dire ita) e pico de agar ferro KUgler (KIA), (a esquerdai, as quais mostram as diferencas de sensibilidade para deteccao de H2S par diferentes meios. 0 emagrecimento de1icado e difuso no tuba SIM e produzido pOl' um microrganismo move! e fracamente produtor de H?S (neste caso S. typhi). Observar que 0 H2S produzido no tuba KIA:, menos sensivel, aparece apenas na porcao media do meio, na interface entre 0 pica e a fundo, um aspecto tfpico de S. typhi neste agar.

C e D. Quatro tubos que mostram as provas de indol (I), vermelbo de metila (MR), Voges-Praskauer (VP) e citrato (C). Quando realizadas simultaneamente, estas quatro provas constituem as classicas rea90esIMViC. A formacao de indol a partir de triptofano e indicada pelo aparecimenta de uma cor vermelha ap6s adicao do reativo de Kovac ttubo da extrema esquerda, C). o aparecimento de cor vermelha no tuba MR reflete urn decrescirno de pH a 4,4 ou menos, indicativo da presenca de fortes fermentadores, pradutores de acidos mistos (segundo tuba da esquerda, C). A cor vennelha no tubo VP indica presenqa de acetofna (acetilmetilcarbinol) produzida a partir de piruvato pela via metab6lica do butileno glicol (terceira tubo da esquerda, D). 0 desenvolvimento no pico do agar citrato de Simmon e a viragem do indicador azul de bromotimol para uma cor azul-alcalina indicam que 0 microrganismo pode utilizar 0 citrato de sodio como unica fonte de carbona (ultimo tuba da direita, D). Em C, podem ser observadas as reacoes de E. coli (+ + ~ -) e, em D, as reacoes de Klebsiella/Enterobacter (~ ~ + +).

E. Os dois tubos da esquerda ilustram, respectivamente, reacoes negativa (amarelo-palido) e positiva (verde-escuro) para fenilalanina desaminase, A car verde e produzida pela reacao entre 0 reativo FeC13 e 0 acido fenilpinivico presente no meio, resultante da desaminacao da

. fenilalanina (ver Protocolo 60). Os tres tubos da dire ita contem agar ureia de Christensen. 0 terceiro tubo a partir da direita mostra uma reacao fortemente positi va (cor vennelha em todo 0 rneio, indicando a reacao alcalina produzida pela degradacao da ureia), em comparacao com 0 controle negativo (extrema direita) completamente amareio. A reacao no segundo tuba a partir da direita (cor vermelha apenas no pico) e produzida por determinados microrganismos, como especies de Klebsiella e certas especies de Enterobacter, que sao fracos produtores de urease.

F. Quatro tubes com meio de Moeller coberto com uma camada de oleo mineral para proporcionar urn ambiente anaerobic (ver Protocolo 18). A Ieitura da esquerda para a direita e: tubocontrale isento de aminoacido (0 crescimento e indicado pela conversao it cor amarela pel a fermentacao da glicose do meio), lis ina, arginina ou ornitina, 0 indicador purpura de bromocresol e amarelo em pH acido e piirpuro em pH a1calino. Portanto, qualquer tubo em que se observa coloracao purpura indica urn pH aJcalino, reacao praduzida por microrganismos que podem descarboxilar 0 aminoacido presente no meio. 0 microrganismo representado aqui e arginina-negativo e lisina e ornitina-positivo, tfpica reacao observada com E. aerogenes.

G. 0 agar ferro-lisina (LIA) e utilizado para diferenciar microrganisrnos entericos corn base na capacidade para descarboxilar ou desaminar a lisina e formar H2S. Os microrganismos que descarboxilam a lisina produzem uma reacao alcalina (purpura) no fundo do agar (tubo do meio). As bacterias que desarninam a lisina produzem um pico vermelho sobre um fundo amarelo (tuba a. esquerdas, As bacterias que produzem H2S enegrecem 0 agar principalmente na porcao media e no fundo do tubo tobservar tambem 0 tuba a esquerda). 0 tuba a esquerda mostra uma reacao lisina desaminase positiva e lisina descarboxilase negativa. No tubo central, observa-se reacao negativa para lisina desaminase e positiva para lisina descarboxilase, e no tuba a direita, lisina desaminase e lisina descarboxilase negativas.

H. Tubos com meio para motilidade. Os microrganisrnos rnoveis mostram crescimento difuso para fora da linha de inoculacao por puncao (tubo da esquerday; as microrganismos im6veis crescem apenas ao longo da 1iOOa de inoculacao (tubo da direita). Pode-se utilizar tambern 0 meio para motilidade adicionado de cloreto de 2,3,5-trifeniltetraz6lio (TIC). 0 crescimento de microrganismos capazes de reduzir 0 TIC aparece em vermelho ao longo da puncao, assim como nas areas para as quais migrou, facilitando a diferenciacao entre bacterias moveis e im6veis. (Fotografia cedida por Health and Education Resources, Inc., Bethesda, MD.)

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PRANCHA COLORIDA 5-1

CARACTERlSTICAS IMPORTANTES PARA DIFERENCIAR BACILOS GRAM-NEGATIVOS NAo- FERMENT ADORES

A. 0 tuba KIA a direita mostra uma reacao pico alcalino/fundo alcalino caracterfstica de um microrganismo nao-fermentador; 0 tuba da esquerda mostra uma reacao pica acido/fundc acido, que indica fermentacao da glicose e lactose, caracteristica de muitas especies de Enterobacteriaceae. A ausencia de producao de acido em agar ferro Kligler (KIA) au em agar triplice acticar-ferro (TSI) indica a incapacidade de a bacterias nao-fermentadoras utilizarem a lactose au a glicose no KIA (ou a sacarose no TSD.

B. Prova de citocromo oxidase. 0 desenvolvimento de cor dentro de 10 segundos ap6s extensao de uma colonia em estudo sobre uma tira de papel filtro saturada com reativo para oxidase (diidrocloreto de tetrametil-p-fenilenodiamina) indica atividade de citocromo oxidase, uma caracteristica iitil para a identificacao de muitas especies de bacterias naofermentadoras. Todos os membros de Enterobacteriaceae sao citocromo oxidase-negativos.

C. Incapacidade de crescer em agar MacConkey, ou uma inibicao do crescimento em agar MacConkey, e uma indicacao de que urn bacilo gram-negativo pode ser nao-fermentador, Apesar de muitas especies de nao-fermentadores serem capazes de crescer neste meio, a ausencia de crescimento, como ilustrado a direita, exclui Enterobacteriaceae, cuja totalidade dos membros cresce bem em agar MacConkey (a esquerda).

D. Utilizacao oxidativa de glicose .. Aqui podem ser observados dois tubos com meio de HughLeifson de oxidacao-fermentacao (OF). 0 meio a direita encontra-se em contato com a atmosfera, enquanto que 0 da esquerda esta coberto com oleo mineral para evitar a exposic;ao ao oxigenio atmosferico. A formacao de acido (cor amarela) s6 e observada na porcao superior do tuba sem 0 6leo, indicando que 0 microrganismo e capaz de oxidar a glicose, mas nao de fermenta-Ia,

E. Tubos contendo rneio Motilidade B, com cloreto de 2,3,5-trifeniltetraz6lio (TIC). A rnotilidade pode ser dificil de ser observada em bacterias nao-fermeutadoras, pois os microrganismos tendem a crescer apenas na porcao superior (principalmente aer6bia) do meio. A adicao de tetraz6lio ajuda a detectar a motilidade, visto que os microrganismos capazes de reduzir TIC aparecem em vermelho ao longo da linha de inoculacao, assim como na area dentro da qual as celulas migraram, 0 que toma mais facil diferenciar entre bacterias moveis e im6veis.

F. Placa de agar tripticase- oja inoculada com uma bacteria amarela produtora de pigmentos. A producao de pigmentos e uma importante caracterfstica diferencial para identificar bacilos gram-negativos nao-fermentadores. 0 microrganismo mostrado aqui e Brevundimonas vesicularis.

G. Tubas de agar Flo e Tech inoculados com Pseudomonas aeruginosa, observados sob Iuz visivel, Estes meios sao utilizados para aumentar a producao de dois pigmentos: pioverdina (fluorescefna), que aparece como urn pigmento amarelo que se difunde no agar Flo, e piocianina, que aparece em azul-turquesa em agar Tech. Apesar de tres especies de bacilos nao-fermentadores produzirem pioverdina (P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida), apenas uma especie (P. aeruginosai produz piocianina.

H. Tubos de agar Flo e Tech inoculados com Pseudomonas aeruginosa, observados sob luz ultravioleta (UV) utilizando-se uma lfunpada de Wood. Observar que 0 tube de agar Flo (a esquerdai fluoresce, enquanto que 0 tubo de agar Tech (it direita) nao fluoresce sob a luz Uv, Apenas 0 pigmento pioverdina, cuja producao e intensificada pelo crescimento do microrganismo em agar Flo, fluoresce sob a luz Uv.

OXIDASE TEST +

B

H

PRANCHA (OLORIDA 5-2

PROVAS UTILIZADAS NA IDENTIFICACAo DE BACILOS GRAM-NEGATlVOS NAO-FERMENTADORES

A. Dais tubos de agar ureia de Christensen mostrando a cor vermelho-fiicsia de uma prova positiva (direita), comparados com um controle negativo iesquerday. Uma prova de ureia positiva, rapida « 4 h), e observada com as seguintes especies de bacilos nao-fermentadores: Bordetella bronchiseptica, CDC Grupo IVc-2, Oligella ureolytica e Bergeyella zoohelcum.

B. Dois tubos demonstrando a reducao de nitrato (ll esquerdai e de nitrito (a direita). Ambos os tubos content tubos de Durham para detectar a formacao de nitrogenio gaso o. 0 tubo da esquerda mostra a reducao de nitrato a nitrogenio gasoso e 0 da direita mostra a reducao de nitrito a nitrogenio gasoso. Observar que ha maior formacao de gas no tuba da dire ita, indicando a producao quantitarivamente maior de nitrogenio gasoso a partir de nitrito que de nitrato no mesmo periodo de incubacao, A producao de gas a partir de nitrato, assim como a partir de nitrito, e tfpica do grupo Stutzeri e de Alcaligenes xylosoxidans subesp, xylosoxidans.

C. Tres tubos com caldo triptofano que ilustram uma reacao de indol negativa (esquerda), uma reacao de indol positiva (centro) e uma reacao de indollaranja (direita). Os dois tubos da esquerda mostram 0 tipo de reacoes de indol positiva e negativa obtidas utilizando-se 0 metodo de extracao por xileno, seguida da adicao do reativo de Ehrlich (ver Protocolo 40), A reacao de indol positiva e diferenciada pelo aparecimento de uma faixa vermelha na interface do caldo triptofano e a camada de xileno. Os bacilos nao-fermenradores indol-positivos incluem Baineatrix, Bergeyella, Chryseobacterium, Empedobacter, Weeksella e alguns grupos CDC sem nome. Uma reacao peculiar' de indol laranja (tubo II extrema dire ita) e observada quando 0 reativo de Kovac e adicionado ao caldo triptofano que foi inoculado com Comamonas acidovorans. Esta reacao e observada apenas com 0 reativo de Kovac, e se deve a formacao de acido antranilico a partir do triptofano. A reacao pode demorar mais de uma hora para desenvolver-se, ap6s a adicao do reativo de Kovac.

D. Quatro tubos com meio descarboxilase de Moeller coberto com uma camada de oleo mineral. Lendo da esquerda para a direita: lisina, arginina, ornitina, controle sem aminoacido. Com os bacilos nao-fermentadores, nas provas negativas os meios pennanecem com a cor original, enquanto que as reacoes de descarboxilacao positivas aparecern em cor purpura mais escura, produzidas por um pH mais alcalino no meio, devido a formacao de arninas alcalinas. A reacao positiva de lisina descarboxilase mostrada aqui ocorre apenas com duas especies de bacilos nao-fermentadores: Stenotrophomonas maltophilia e Burkholderia cepacia. (Fotografado par Leon J. LeBeau, University of Illinois, Chicago.)

E. Imagem dividida, cada uma rnostrando dois tubos de agar esculin a observados sob luz visivel (a esquerdai, e os mesmos tubos observados sob luz ultravioleta de uma lampada de Wood (ll direita). Quando hidrolisado por um microrganismo, 0 glicosideo esculina e convertido a esculitina e glicose. A esculitina reage com urn sal de ferro (citrato ferrico) do meio para formar um complexo de cor marrom-escura ou negra (segundo tuba a partir da esquerdai. Pode ser dificil diferenciar a producao de um pigmento marrom-escuro ou negro quando 0 microrganismo produz por si mesmo pigmentos marrons ou de cor escura. Visto que a esculina e um composto fluorescente, sua hidr6lise verdadeira pode ser determinada observando-se a ausencia de fluorescencia. A fluorescencia brilhante na imagem a direita (segundo tuba a partir da extrema direita) representa a reacao observada em urna reacao negativa para a esculina. 0 tuba a extrema direita mostra pronunciada reducao da fluorescencia, em particular na parte inc1inada do meio, indicando que 0 microrganismo estudado e capaz de hidrolisar a esculina.

F. Tiras de API Nf'T que mostram reacoes de 24 horas (acima) e 48 horas (abaixo). Observar que as primeiras oito provas (tendo da esquerda para a dire ita) sao reacoes colorimetricas convencionais, enquanto que as 12 restantes sao reacoes de assimilacao de carbono, as quais sao lidas como positivas, quando aparece um crescimento turvo, ou negativas, na ausencia dessa turvacao .. Os usuaries desse sistema devem considerar que essas tiras sao incubadas a 30°C em vez dos usuais 35°C. (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of illinois, Chicago.)

G. Sistema Remel Uni - NIF mostrando a placa circular que contem 11 cavidades perifericas seladas de modo independente e uma cavidade central com meio para detectar a producao de indol e sulfeto de hidrogenio, 0 tuba GNP que possui um estreitamento (segundo a partir da direita) e utilizado para detectar a fermentacao da glicose e a producao de nitrogenio gasoso (abaixo do estreitameniot e fluorescencia no pico do meio. 0 tuba 42P sem estreitamento (extrema direita) e utilizado para estudar 0 crescimento a 42°C e a producao do pigmento piocianina. (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of Illinois, Chicago.)

H. Sistema Rapid NP Plus mostrando as reacoes tipicas observadas com P aeruginosa. 0 sistema consiste em uma bandeja plastics que contem 10 cavidades de reacao. Sete dessas cavidades (da4! a 1()l!) sao bifuncionais e incluem duas provas distintas na mesma cavidade. 0 sistema e inoculado com uma suspensao abundante do rnicrorganismo em estudo e incubado por 4 horas a 35°C. Apos a incubacao, sao registradas primeiro as provas bifuncionais, antes da adicao do reativo que fornecera 0 resultado da primeira prova (fila superior). A me sma cavidade e registrada novamente, ap6s a adicao do reativo que fornecera 0 resultado da segunda prova (fila inferior). As reacoes obtidas com estas 17 provas, mais a prova da oxidase, fornecem 0 resultado de 18 provas.

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a PRANCHA COLORIDA 5-3

MORFOLOGIA MACROSCOPICA E MICROSCOPICA DE CERTOS BACILOS NAO-FERMENTADORES

Algumas especies de bacilos nao-fennentadores gram-negativos possuem caracterfsticas que podem ser observadas em urn meio de crescimento ou em preparar;:oes coradas com Gram. 0 conhecimento dessas caracterfsncas pode ser urn auxilio para a correta identificar;:ao das especies,

A. Placa de agar sangue mostrando 0 crescimento de Alcaligenes faecalis apes 48 horas de incubacao a 35°C. As colonias sao brancas e brilhantes; em cultivos mais velhos, as colonies tendem a expandir-se a partir de sua borda. Essa especie libera tipicamente urn odor de frutas, as vezes descrito como urn aroma similar ao de ma,(a verde.

B. Cepa muc6ide de Pseudomonas aeruginosa em agar MacConkey. As colonias podem ser extremamente muc6ides, quase liquidas. Esta e a aparencia tipica das cepas de P. aeruginosa isoladas de escarro de pacientes com fibrose cfstica, (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of illinois, Chicago.)

C. Pseudomonas stutreri em meio de agar sangue. Observar as colonias caracteristica. mente secas e rugosas, tfpicas dessa especie, Cabe supor de imediato tratar-se de P stutrer] quando urn bacilo nao-fermentador produz esse tipo de colonias em agar sangue. (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of Illinois, Chicago.)

D. Placa de agar sangue que ilustra 0 crescimento de Stenotrophomonas maltophilia em agar sangue. 0 pigmento arnarelo-opaco e caracterfstico dessa especie, mas as vezes pode ser de diffcil visualizacao. Ao serem cultivadas de modo continuo, as colonias podem aparecer tam bern coradas em canela-escuro a lavanda, particularmente se deixadas a temperatura ambiente,

E. Preparacao corada com Gram que mostra cocobacilos gram-negativos. Especies de Acinetobacter e Moraxella sao bacilos'nao-fermentadores que caracteristicamente possuem essa morfologia. 0 esfrega90 mostrado aqui foi realizado a partir de urn cultivo lfquido de A. baumannii.

F. Acinetobacter baumannii em agar MacConkey mostrando cor rosada a lavanda, tipica des sa especie, Com frequsncia, pode ser observada uma pigmentacao azulada, particularmente notavel em colonias que crescern em agar EMB, descritas como flor de centauria azul.

G e H. Uma provatitil para diferenciar especies de Neisseria e Moraxella e produzir urn

. crescimento dos microrganismos em agar sangue em tome de urn disco de penicilina.

Ambos os microrganismos sao sensfveis a penicilina e mostram uma zona de inibi'(ao em tome do disco (G). Ap6s incuba'(iio durante 18 horas, realiza-se uma coloracao de Gram a partir de colonies desenvolvidas na borda da zona de inibi,(iio. As especies de Neisseria sao cocos verdadeiros e, em presenca de concentra90es subinibitarias de penicilina, continuarao corando-se como diplococos gram-negativos (lado dire ito, H). As especies de Moraxella sao cocobacilos e, em presenca de concentra90es subinibitorias de penicilina, formarao celulas bizarras em forma de bastao (lado esquerdo, H). (Fotografado por Leon J. LeBeau, University of Illinois, Chicago.)

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PRANCHA COLORIDA 5-4

MORFOLOGIA MACROSCOPICA E MrCROSCOPICA DE CERTOS BACTLOS NAo-FERMENTADORES (CONTINUA<;Ao)

A. Tres placas mostrando 0 crescimento de especies de Methylobacterium. It observado pouco crescimento em agar sangue (abaixo) e urn crescimento algo rnelhor em agar com carvao e extra to de levedura tampon ado (BCYE, acima, it esquerda), enquanto que 0 melhor crescimento ocorre em agar Sabouraud dextrose iacima; a direita). As colonias sao secas e rnostram uma pigmentacao coral ou rosa-escuro .. Essas col6nias absorvem Iuz ultravioleta e sao obscuras, quando colocadas sob uma Iampada de Wood.

B. Coloracao de Gram de especies de Methylobacterium mostrando bacilos gram-negatives com vacuoles caracterfsticos ..

C. Agar Sabouraud dextrose onde crescem especies de Roseomonas, Estas sa.o colonies rosapalido, mucosas, quase lfquidas. Como as especies de Methylobacterium, as de Roseomonas tambem crescem melhor em agar Sabouraud; entretanto, nao absorvem a luz UV e nao . sao obscuras, quando colocadas sob uma lampada de Wood.

D. Coloracao de Gram de especies de Roseomonas mostrando form as cocoides gram-negativas caracterfsticas. Anteriormente estas bacterias eram referidas como 0 "grupo cocoide rosa" de bacilos nao-fermentadores.

E. Crescimento de Agrobacterium radiobacter em agar MacConkey. Embora nao sejam fermentadoras, estas bacterias oxidam rapidamente a lactose e, em consequencia, aparecern Como colonias mucosas, rosadas, em agar MacConkey. Estes rnicrorganismos podem ser facilmente confundidos com fermentadores lactose-positivos. No entanto, sao oxidasepositives, 0 que exclui automaticamente qualquer membro das Enterobacteriaceae.

F. Coloracao de Gram do grupo EO-2 dos CDC oriundo de urn caIdo de cultivo, Duas forma- 90eS gram-negativas caracteristicas, em forma de "0", podem ser observadas no centro da imagem.

G. Coloracao de Gram de Neisseria weaveri desenvolvida em caldo de cultivo, Ao contrario da tipica aparencia de diplococos da maioria das especies de Neisseria, estas especies sao caracterizadas por celulas que mostram morfologia de bastonetes,

H. Coloracao de Gram de Neisseria elongata desenvolvida em caldo de cultivo, Esta e outra especie anpica de Neisseria que rnostra forma em bastonete em vez de morfologia de diplococos.

PRANCHA COLORIDA 6-1

IDENTIFICACAO LABORATORIAL DE ESPECIES DE CAMPYLOBACTER

A. Coloracao de Gram de Campylobacter jejuni ilustrando bacilos gram-negativos pleomorficos, alguns curtos e curvos e outros formando espirais. Observa-se que algumas celulas se conectam em formas de "asas de gaivota" e "S" ..

B. C. jejuni em placas de agar nao-seletivo para Brucella apos isolamento de amostra de fezes, utilizando-se a tecnica de filtracao por membrana (descrita no texto). Observa-se que 0 crescimento ocorreu apenas na area da placa onde 0 filtro foi colocado.

C. C. jejuni em agar sangue mostrando co16nias elevadas, branco-acinzentadas e algo mucosas.

D. C. jejuni em agar Campy BAP mostrando a tendencia do microrganismo a crescer ao longo da linha da estria.

E. Tubos que mostram a reacao rapida de hipurato. Ocone formacao de cor purpura apos adicao de ninbidrina, quando 0 hipurato foi hidrolisado para formar glicina e acido benzoico (tuba positivo a esquerda, comparado com a controle negativo a direita). Entre as especies de Campylobacter, apenas C. jejuni origina uma reacao hipurato-positiva.

F. Placa de agar sangue para Brucella mostrando 0 crescimento de C. jejuni em torno de discos de cefalotina e acido nalidixico, Observa-se que, com C. jejuni, ocorre formacao de uma zona de inibicao ao redor do disco de acido nalidixico (direita), indicando que essa especie e suscetivel ao acido nalidfxico, mas resistente a cefalotina. Esta prova e facil de ser realizarda e permite a identificacao presuntiva de C. jejuni.

G. Reacoes em picos de agar triplice acucar-ferro (TSI) mostrando a reacao do sulfeto de hidrogenio (~S) para diferentes especies, 0 tuba da extrema esquerda mostra a ausencia de H2S, caracteristica de C. jejuni, C. fetus subesp. fetus e C. fetus subesp. venerealis. Os tubos 2, 4 e 5 (Zenda a partir da esquerda) mostram uma reacao intensa no fundo do meio, caracteristica de C. sputorum biovar bubulus, C. sputorum biovarfecalis ou C sputorum biovar sputorum. 0 tubo 3 mostra uma inten a reacao no pico do meio de cultura, caracteristica de C. mucosalis.

H. Corte de mucosa gastrica corado com prata mostrando ao longo da camada epitelial grupos de bacilos corados em negro-azulado, consistentes com formas bacilares de Helicobacter pylori. Quando se observa uma preparacao corada com Gram, as celulas individuais sao gran des. espessas e curvas.

B

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PRANCHA COlORIDA 6-2

IoENTlFTCACAO LABORATORiAL DE VIBRIO CHOLERAE E OUTRAS ESPECIES DE VIBRIO

A. Aparencia de Vibrio cholerae em agar que contem tiossulfato, sacarose, citrato e sais biliares (TCBS). As colonias amarelas resultam da utilizacao de citrate e formacao de acidos a partir da uti]izayaa da sacarose contida no. meio, A forma~ao de colonias amarelas nesse

meio e virtualmenn, um diagnostico de V. cholerae. .

B. Colonies de V parahaemolyticus em agar TCBS rnostrando uma coloracao cinza-esverdeada, semitransllicida, caracteristica.

C. Agar gelatina com colonias opacas e brancas de V. cholerae. Observa-se a opalescencia do agar adjacente as colonias, indican do a hidrolise e a desnatural(ao da gelatina,

D. Coloracao de Gram deV vulnificus mostrando celulas bacterianas gram-negativas, curvas e em forma de bas tao, npicas das especies de Vibrio ..

E. Prova do colar positiva para V cholerae. Quando as co16nias de V. eholerae Sao. misturadas com uma gota de desoxicolato de sodio a 0,5%, produzem uma suspensaa viscosa que forma urn "colar'' ao ser Ievantada com uma alea de inoeulayao.

F. Prova de aglutinay30 em lamina positiva para V cholerae utilizando-se anti-sore polivalente O.

G. Placa de agar sangue rnostrando colonias relativatnente grandes, ~-hernoliticas do biotipo

EI Tor de V. cholerae. ~

H. Prova de aglutinal(ila de eritrocitos de galinha. As cepas classicas de V' cholerae nao aglutinarn os elitroeitas de galinha (acima), em eantraste com 0 biotipo El Tar (abaixo), que e capaz de aglutinar esses eritrocitos.

cho.l.ezae BAP

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