ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
Tecnología del estudio de ADN
Permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes.

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ADN RECOMBINANTE

INDICE
ADN Recombinante ..................................................................... 1 Aislamiento de segmentos específicos de ADN ........................... 2 Vectores ........................................................................................ 4 Enzimas de Restricción ................................................................ 5 Células Huésped ........................................................................... 5 Clonación ± clones ....................................................................... 6 Hibridación de ácidos nucleicos .................................................. 7 - Métodos de laboratorio (hibridación)....................................... 9 --Uso de Sondas radioactivas ....................................................... 10 Secuenciación de ADN ................................................................. 11 -Técnicas de Secuenciación ......................................................... 12 Biotecnología ............................................................................... 15 Obtención de ADN ....................................................................... 16 Genética molecular de los eucariotas ± Expresión Génica ........................................................................................... 17 El cromosoma eucariótico ± la regulación ................................. 19 Regulación de la expresión génica ± metilación ......................... 20 El genoma eucariótico .................................................................. 22 Clases de ADN .............................................................................. 23 Intrones ......................................................................................... 24 Repeticiones y No repeticiones .................................................... 26 Familias genéticas ± transcripción .............................................. 28 Procesamiento de ARNen eucariotas ......................................... 30 ADN de los organelos energéticos. .............................................. 32 Bibliografía ................................................................................... 33 Anexos

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ADN RECOMBINANTE

ADN RECOMBINANTE
La tecnología del ADN recombinante permite el aislamiento de un gen de un organismo para introducirlo en otro. Entre sus aplicaciones se encuentra la producción de grandes cantidades de la proteína codificada por dicho gen, como por ejemplo proteínas humanas en cantidad suficiente para que puedan ser utilizadas como fármacos. Las proteínas obtenidas por esta técnica se denominan proteínas recombinantes. Antes de la tecnología del ADN recombinante también se utilizaban como medicamentos algunas proteínas, sin embargo la manera de obtenerlas era o bien por síntesis química, o bien mediante el aislamiento de la proteína a partir de su fuente natural (tejido o fluido animal, humano o de plantas). No obstante, ambas técnicas tienen sus limitaciones. La síntesis química debido a su complejidad y elevado coste sólo es aplicable cuando la proteína de interés es muy pequeña. Por su parte, el aislamiento de las proteínas a partir de la fuente natural a menudo se encuentra con el problema de que el rendimiento de la extracción es muy bajo. Por ejemplo hasta hace relativamente poco tiempo la única manera de obtener factores de coagulación para personas hemofílicas era mediante la manipulación de litros de sangre, y era necesario procesar cientos de hipófisis de cadáveres humanos para sacar una pequeña cantidad de hormona del crecimiento, imprescindible para tratar algunos problemas de enanismo. Mediante la aplicación de las técnicas de ADN recombinante es posible solventar estos problemas y obtener proteínas que no se podrían conseguir con los métodos tradicionales. La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen. Cada uno de estos procesos precisa de unas herramientas la mayoría de las cuales son ofrecidas por la propia naturaleza. El aislamiento de un gen no es fácil. Originariamente lo que se hacía era aislar la proteína de la que se quería obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos que la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su totalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen. Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético, fabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos

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que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc. Actualmente gracias a la existencia de genotecas y a la secuencia de muchos genomas, entre ellos el humano, el aislamiento de cualquier gen es una tarea mucho más simple. Los cromosomas, incluso los de las células eucariotas más simples, contienen una enorme cantidad de DNA, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar una aguja en un pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos En los comienzos de la investigación del DNA recombinante, los biólogos se dieron cuenta de que los segmentos de DNA que codifican ciertas proteínas (particularmente las de importancia médica o agrícola) pueden transferirse a bacterias y ser expresados por ellos se las usa como ³fábricas´ para suministrar ilimitadamente proteínas. Estofue el inicio de la biotecnología.

AISLAMIENTO DE SEGMENTOS ESPECÍFICOS DE DNA
Una de las formas de obtener los fragmentos específicos de DNA es cortando moléculas de DNA con enzimas de restricción, transcribiendo el mRNA a DNA con la enzima transcriptasa inversa, o por medio de la síntesis de oligonucleótidos en el laboratorio. Las enzimas de restricción se encuentran en la naturaleza en las células bacterianas y en algunos bacteriófagos. Escinden las moléculas de DNA en secuencias de reconocimiento específicas, que típicamente tienen de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Su función en las células bacterianas es degradar moléculas de DNA extrañas. El DNA de la bacteria se protege de sus propias enzimas de restricción por la metilación de nucleótidos en las secuencias de reconocimiento. Algunas enzimas de restricción producen cortes de la molécula de DNA que dejan extremos rectos. Otras cortan de manera escalonada, dejando extremos ³pegajosos´ que luego pueden unirse, por apareamiento de bases complementarias, con otros fragmentos producidos por la misma enzima. Esto hace posible combinar segmentos de DNA de

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el mRNA viral. segmentos que se conocen como DNA complementario. llamados fragmentos de restricción. EcoRI es de E. como también el RNA viral que será empaquetado en nuevas partículas virales.ADN RECOMBINANTE fuentes diferentes. estas secuencias se denominan secuencias palindrómicas. En el laboratorio. la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de DNA a partir del molde de RNA viral. Otra herramienta para obtener fragmentos específicos de DNA la transcriptasa inversa que fue aislada de ciertos virus que contienen genoma de RNA. la transcriptasa inversa puede utilizarse para sintetizar DNA a partir de un molde de RNA. o cDNA. El gran número de enzimas de restricción y de secuencias de reconocimiento diferentes hace posible que se las utilice para empalmar segmentos de DNA genómico de una variedad ilimitada de fuentes. Las enzimas de restricción generalmente se obtienen de bacterias y su nombre deriva del nombre científico de esas bacterias: HpaI es de Hemophilus parainfluenzae. Cuando estos virus infectan una célula hospedadora. que codifica proteínas virales. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción frecuentemente tienen seis pares de bases de longitud y. coli y HindIII es de Hemophilus influenzae. las dos cadenas complementarias de la secuencia son idénticas. si es tratada o digerida con diferentes enzimas de restricción. Esta enzima es capaz de sintetizar DNA a partir de un molde de mRNA. cuando se leen en la misma dirección (por ejemplo 5' a 3'). se transcribe a partir de este DNA. -3- . Una misma molécula de DNA producirá distintos fragmentos. Algunas enzimas como EcoRI y HindIII escinden el DNA dando como resultado extremos "pegajosos". los retrovirus.

b) Una vez que el retrovirus ha entrado en la célula. -4- . produciéndose una molécula de cDNA de doble cadena. Estas reacciones. Estos problemas fueron soslayados cuando se descubrió que se podían emplear unas herramientas que también están en la naturaleza: los plásmidos y los virus. El cDNA de doble cadena puede integrarse al cromosoma de la célula hospedadora. por ejemplo. Posteriormente se transcriben. Para separar moléculas de DNA de mayor tamaño. a partir del DNA viral integrado. así como la de degradación de la molécula original del RNA viral. tanto el nuevo RNA genómico viral como el mRNA para la síntesis de proteínas virales. Esta envoltura puede fusionarse con la membrana celular de un nuevo hospedador. o bien degradaba el gen que se le había introducido. el RNA viral se libera de la cápside y se transcribe a una única cadena de DNA complementaria (cDNA). un polisacárido aislado de ciertas algas. ésta en lugar de llevar a cabo este proceso.ADN RECOMBINANTE a) La cápside de un retrovirus está rodeada típicamente por una envoltura externa de lipoproteína formada por elementos de la membrana celular de su hospedador anterior y por proteínas virales. a pesar de que se conseguía introducir el gen en la célula huésped que debía fabricar la proteína humana. mediante el uso de técnicas de tinción. Los fragmentos de DNA separados no pueden ser visualizados directamente. sólo una de las hijas recibía copia del gen humano por lo que dicho gen iba diluyéndose. El tamaño de poro de este gel permite separar moléculas cuyo tamaño difiere en un solo nucleótido. c) Comienza de inmediato la síntesis de la segunda cadena de DNA (complementaria a la primera). son catalizadas por la enzima transcriptasa inversa. como los geles de agarosa. VECTORES DE TRANSFERENCIA: PLASMIDOS Los primeros experimentos destinados a conseguir producir proteínas humanas en microorganismos fallaron porque. permitiendo que el virus entre en la célula. se utilizan matrices con poros mayores. o bien a medida que la célula se dividía. Para separar fragmentos de DNA menores de 500 nucleótidos se utiliza como matriz un gel de poliacrilamida.

Estas enzimas cortan los genomas en unas secuencias específicas. independientemente del genoma de la célula. Esto es. Por su parte. Los plásmidos y virus permiten introducir el gen de interés en la célula huésped. 2. ENZIMAS DE RESTRICCION En general para introducir el gen de interés en el genoma de estos vectores se utilizan las enzimas de restricción. especialmente cepas de Escherichia coli. se podrán unir debido a la complementariedad de sus bases. de las demás. CÉLULAS HUÉSPED Una vez que el vector presente el gen de interés. Después. es decir "reproducirse".ADN RECOMBINANTE Los plásmidos son moléculas de ADN circular que se encuentran en muchas bacterias y levaduras. y que se caracterizan porque pueden replicarse. levaduras y ciertas células eucariotas como las líneas celulares derivadas de algún -5- . y que por consiguiente son capaces de crecer en un medio con el antibiótico. Poder crecer rápidamente. gracias a otra enzima denominada ligasa. Un buen organismo huésped debe caracterizarse por: 1. se transfiere a la célula huésped. Hay tres tipos de células huésped: bacterias. Hacerlo de manera barata. Que sea fácilmente manipulable. los virus son entidades que están especializadas precisamente en insertar su material genético en células y utilizar la maquinaria de éstas para multiplicarse. Muchos de ellos contienen genes de resistencia a antibióticos. por lo que se denominan moléculas transportadoras o vectores. lo que permite distinguir las células que han incorporado el plásmido. 3. Cortando el genoma huésped y el gen a insertar con las mismas enzimas los extremos de ambos se vuelven "cohesivos". se vuelven a unir las cadenas de los ácidos nucleicos quedando insertado nuestro gen de interés en el lugar del genoma del vector que nos interese.

se inocula a un fermentador o a botellas de cultivo. nutrientes. por ejemplo la glicosilación. Una de las células modificadas se hace crecer obteniéndose así múltiples células hijas que contienen el gen y que proceden de una única célula inicial. Las células hijas fabricarán todas sub-proteínas más la proteína extraña que se le ha introducido. Para ello el clon de células huésped que mejor expresa el gen de la proteína de interés se selecciona. Las levaduras y las líneas celulares son más complicadas. Su principal inconveniente es que no llevan a cabo algunas de las modificaciones que sí realizan las células eucariotas en las proteínas. etc.en función del tipo de célula huésped. A continuación hay que separar las células que han incorporado el vector del resto. ésta se aísla a partir del medio de cultivo en el que crecen las células o del interior de las propias células dependiendo del tipo de células que se utilizan como sistema de expresión y de cómo se haya diseñado el gene dicha proteína.ADN RECOMBINANTE mamífero. nutrientes y otras moléculas presentes en el medio de cultivo es una tarea cuya puesta a punto puede ser -6- . especialmente estas últimas. mayor cantidad de dicha proteína se podrá obtener. CLONACIÓN Una vez escogida la célula huésped se pone en contacto con el vector al que se ha incorporado el gen de interés. Mediante diferentes técnicas se facilita la entrada del vector en las células. Las bacterias se caracterizan porque su material genético es muy simple. El aislamiento de una proteína a partir de la mezcla de células. Cuantas más células huésped estén fabricando la proteína de interés. La síntesis de la proteína deseada por la célula huésped es lo que se conoce como expresión del gen de dicha proteína. la ventaja es que ambos sistemas pueden llevar a cabo modificaciones como las descritas anteriormente. Este proceso de seleccionar y hacer crecer una única célula se denomina clonación. humedad. Cada uno de estos tipos celulares tiene sus ventajas e inconvenientes. suelen crecer muy rápido y las condiciones de crecimiento son bastante sencillas. No obstante. no crecen tan rápido y suelen ser más difíciles de tratar.y se permite que las células crezcan ofreciéndoles las condiciones más favorables de temperatura. Tras obtener suficiente cantidad de proteína de interés.

HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ± SONDAS RADIOACTIVAS La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos anti-paralelas y con secuencia de bases complementarias. una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión. la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla. En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern. es más. -7- . para uniones ADNARN. en una única molécula de doble cadena. T=A o U=A Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T. donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. por tanto.ADN RECOMBINANTE compleja y que requiere la aplicación de variadas técnicas bioquímicas de separación como las cromatografías. que son las que captan la energía. el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial. C G. que toma la estructura de doble hélice. el paso siguiente es la formulación de la proteína purificada. El %GC no es igual para todas las especies. En caso de que la proteína recombinante se vaya a utilizar como medicamento. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno. según qué tipo vamos a estudiar y esto es importante. ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas. entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mitocondrial. para uniones ADN-ADN y tipo Northern. Por el contrario. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm). que es el proceso por el cual la proteína se preparará en su forma farmacéutica definitiva que será la que le dará la máxima estabilidad y eficacia. El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos. A=U. están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía. dicha energía se traduce en una mayor temperatura. G C. debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos. lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN.

Algunas bacterias de cada colonia son transferidas (blotting) a un filtro especial obteniéndose una réplica. Luego del revelado de la película. Las bacterias transformadas son distribuidas en una placa de Petri con un medio de cultivo sólido que contiene el antibiótico de selección. La réplica es tratada con una solución de alto pH para romper las células y desnaturalizar el DNA del plásmido. complementaria al segmento de DNA de interés. además. Sólo las bacterias que hayan adquirido el plásmido recombinante crecerán formando colonias aisladas.ADN RECOMBINANTE a. producida por un depósito de plata de la emulsión. Las réplicas de las colonias que estén marcadas con la sonda radiactiva después de este tratamiento. cada filtro es cubierto con una película fotográfica y dejado en la oscuridad. Se lava del filtro el exceso de solución que contiene las sondas que no han hibridado. e. Las moléculas de doble cadena que se hayan formado permanecen en su lugar en el filtro y su visualización se realiza por medio de autorradiografía. el radioisótopo libera energía que impacta la emulsión fotográfica. El filtro con el DNA desnaturalizado es incubado en una solución que contiene una sonda radioactiva que consiste en una molécula de DNA o RNA de cadena simple. -8- . la posición del fragmento radioactivo se observa como una marca oscura. Los plásmidos contienen. un gen de resistencia a un antibiótico que se usará para la selección de las colonias que hayan incorporado el plásmido. Cada colonia se origina por divisiones sucesivas de una única bacteria inicial y todas las células de una colonia contienen el mismo plásmido recombinante. identifican las colonias originales que contenían vectores con el segmento de DNA que se deseaba estudiar. Se permite que la sonda se hibride. Las bacterias competentes se transforman con plásmidos que contienen distintos fragmentos de DNA obtenidos por digestión de un DNA genómico con una enzima de restricción. Durante el período de exposición. técnica en la cual primero. El DNA se une químicamente al filtro d. b. c.

La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz. para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. para el caso de sondas  Northern El segundo método. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. Posteriormente. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. tipo northern o northern blot.ADN RECOMBINANTE Métodos de Laboratorio Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular. el método northern sirve para identificar ARN. M. durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN.  Southern El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda. el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa. bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. en qué tejidos o tipos celulares. -9- . Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físicoquímico. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica. Southern para la detección de genes específicos en el ADN celular. El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo).

blanco. En la hibridación in situ. un gen que codifica una proteína de membrana de los glóbulos blancos. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único. .10 - . con la capacidad de transportar información. y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. También en esta categoría destaca el FISH. un oncogén en el cromosoma 8. se lava el exceso de sonda no unido. amarillo. violeta. junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio electrónico. región del cromosoma 21 donde se encuentra el gen responsable del Síndrome de Down. de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. Utilizando técnicas inmuno-histoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. una secuencia sin determinar en el cromosoma 5. Cada color indica la localización de una secuencia de DNA diferente: rojo. las sondas están marcadas con colorantes fluorescentes. Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir. técnica de hibridación in situ. SECUENCIACION DE ADN Una secuencia de ADN o secuencia genética es una sucesión de letras representando la estructura primaria de una molécula real o hipotética de ADN o banda.ADN RECOMBINANTE  Hibridación in situ (uso de sondas radioactivas) Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio. Tras producirse ésta. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana. localización en el cromosoma X del gen de la distrofia muscular infantil más común. donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma. verde. Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección.

adenina. timina. y G se presentan en una secuencia. G. y T. que simbolizan las cuatro subunidades de nucleótidos de una banda ADN . guanina. determinar la secuencia de ADN es útil en el estudio de la investigación básica de los procesos biológicos fundamentales. citosina. hay más de una clase de nucleótidos en esa posición. plantas y microorganismos. en ocasiones fruto de la colaboración de científicos a escala mundial. como en la secuencia AAAGTCTGAC. T. Así pues. así como en campos aplicados.ADN RECOMBINANTE Las posibles letras son A. las secuencias se presentan pegadas unas a las otras. . los plásmidos. Técnicas de Secuenciación Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad. lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. C. Esas letras representan ambigüedad. yendo de 5' a 3' de izq. Otros proyectos relacionados. Las reglas de laUnión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) son las que siguen:                A = adenina C = citosina G = guanina T = timina R = G A (purina) Y = T C (pirimidina) K = G T (keto) M = A C (amino) S = G C (enlaces fuertes) W = A T (enlaces débiles) B = G T C (todos y A) D = G A T (todos y C) H = A C T (todos y G) V = G C A (todos y T) N = A G C T (cualquiera) La Secuenciación de ADN es un conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A. En el típico caso. han establecido la secuencia completa de ADN de muchos genomas de animales. El desarrollo de la secuenciación del ADN ha acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. las letras seguidas de A.11 - . De todas las moléculas muestreadas. La secuencia de ADN constituye la información genética heredable del núcleo celular. sin espacios. En algunos casos especiales. a derecha. que son bases covalentemente ligadas a cadenas fosfóricas. la mitocondria y cloroplastos (En plantas) que forman la base de los programas de desarrollo de los seres vivos. como la investigación forense. C. G y T) en un oligonucleótido de ADN. C.

además. el oligonucleótido iniciador marcado radiactivamente se aparea con el DNA de simple cadena a secuenciar y se inicia la síntesis de la cadena complementaria por parte de la DNA polimerasa. por lo que. Estos son dideoxinucleótidos que carecen del OH. se procede en varias etapas: 2. Esta técnica se vale de oligonucleótidos sintéticos y de una DNA polimerasa termoestable. en el que se separan fragmentos que difieren incluso en un nucleótido de longitud. Con los fragmentos resultantes se realiza una electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. no pueden reaccionar con ningún otro nucleótido y se transforman. cada una de las cuales se somete a un tratamiento químico diferente para romper las moléculas en una sola de las cuatro bases nitrogenadas. La mezcla en la que se producirá la reacción de síntesis se separa en 4 tubos. ddCTP. En la secuenciación por el método enzimático. En la secuenciación de un segmento de una molécula de DNA por el método de Maxam y Gilbert. . el segmento de cadena simple (presente en múltiples copias) se marca radiactivamente en el extremo 5'. se puede inferir la secuencia del segmento completo. una vez que son agregados a la cadena que se está sintetizando. obtenidas por clonado de un segmento producido por digestión con enzimas de restricción o por la técnica de PCR. La solución que contiene al DNA marcado se divide en cuatro porciones. así. cada uno de los cuales contiene.12 - . en el último nucleótido de la cadena. Combinando la información obtenida con cada reacción. uno de los nucleótidos terminadores (ddATP. 2.en la posición 3¶. ddGTP o ddTTP). 1.1 En una primera etapa.ADN RECOMBINANTE Se usan tres técnicas principales de secuenciación: una implica métodos enzimáticos y la otra usa métodos químicos y la última es una modificación de la anterior. La secuenciación depende de la disponibilidad de copias múltiples de un fragmento de DNA.

en ³calles´ separadas. En este caso los fragmentos generados a partir del cebador se van a diferenciar porque el ddNTP terminal va a emitir un color característico que se capta en el aparato. En el recuadro que se encuentra a la izquierda de la fotografía del gel.2 En una segunda etapa. se señalan las posiciones de los fragmentos de DNA de una porción aumentada del gel.13 - . La modificación consiste en que cada uno de los dideoxirribonucleótidos (ddNTP) está unido a un fluorocromo distinto que va a excitarse con la luz emitiendo luz de un color determinado. una guanina. Método automático Se trata de una modificación del método automático de Sanger que ha permitido secuenciar de manera más rápida y reproducible fragmentos de ADN de hasta 500pb. Las posiciones de los fragmentos de DNA permiten leer la secuencia de nucleótidos incógnita de la siguiente manera: por ejemplo. se realiza la autorradiografía del gel que permite leer la secuencia complementaria del DNA original. los productos de reacción son sembrados en la parte superior de un gel. que se ubica en la primera posición en la calle correspondiente a la guanina indica que el primer nucleótido de la secuencia contiene. que esquematiza la cuba electroforética. como base nitrogenada. Luego de la corrida electroforética. si el fragmento de un solo nucleótido.ADN RECOMBINANTE 2. 3. .

Las principales ventajas de estos equipos son la automatización completa de todo el proceso. y la rapidez en el análisis de cada muestra. una ciencia. el capilar se vacía rellenándose nuevamente con polímero fresco y nueva muestra y así sucesivamente. Una vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra. . es un enfoque multidisciplinario que involucra varias disciplinas y ciencias (biología. química. medicina y veterinaria entre otras). inyectando las muestras que se preparan exactamente igual que para la secuenciación en geles de acrilamida. el láser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce esta emisión de fluorescencia en la secuencia correspondiente. bioquímica. Hay muchas definiciones para describir la biotecnología.ADN RECOMBINANTE Los equipos funcionan de forma completamente automática. genética. agronomía. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia. A una altura determinada del capilar. En términos generales biotecnología es el uso de organismos vivos o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para el hombre.14 - . en sí misma. virología. ingeniería. Las muestras se colocan en pocillos para ser inyectadas automáticamente a un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como lo hace el gel desnaturalizante de acrilamida. BIOTECNOLOGÍA La biotecnología no es. leyendo orden de 450 nucleótidos en el plazo de una hora en lugar de las 2-4 horas que se necesitan en un gel En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación.

que han funcionado correctamente para la síntesis de las proteínas codificadas. mediante la utilización de las enzimas de restricción. Los plásmidos utilizados para la expresión de proteínas foráneas se conocen con el nombre de vectores de expresión. hasta la biotecnología moderna. largamente establecidas y ampliamente conocidas y utilizadas (e. La primera síntesis de una proteína de mamífero en una célula bacteriana fue realizada usando el gen para la hormona somatostatina. basada en la utilización de las nuevas técnicas del DNA recombinante (llamadas de ingeniería genética). una proteína pequeña de sólo 14 aminoácidos que podía ser detectada en cantidades muy pequeñas. Más recientemente. unión de este a un ADN vector. Las técnicas de DNA recombinante permiten la construcción de vectores.g. que se utiliza para tratar cierta forma de enanismo en los niños. Un ejemplo es el gen para la insulina humana. que son introducidos en células bacterianas. capaces de reconocer y cortar el ADN en puntos determinados. los anticuerpos monoclonales y los nuevos métodos de cultivo de células y tejidos. portadores de genes específicos. se ha logrado introducir en células bacterianas genes para otras proteínas útiles en medicina. las cuales sintetizan las proteínas codificadas por los genes. . fermentación de alimentos.ADN RECOMBINANTE La biotecnología consiste en un gradiente de tecnologías que van desde las técnicas de la biotecnología "tradicional". fue la pista que orientó hacia el momento en que se podían recombinar los genes en el laboratorio. y la transformación en una célula procariota o eucariota.. control biológico). Otro es el gen para la somatotropina u hormona de crecimiento. El descubrimiento de las enzimas llamadas endonucleasas de restricción. OBTENCIÓN DEL ADN Comprende las siguientes etapas: obtención del inserto de ADN que interese.15 - .

ADN del fago lambda. Los procesos de clonaje y de aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. donde pueden ser replicados. permitirán que los dos ADNs se unan por complementariedad. con uniones no covalentes. Cada ADN se trata con una endonucleasa de restricción que origina en este caso un corte escalonado en las dos hebras dobles de ADN. Posteriormente. que puede adicionar muchos residuos de desoxirribonucleótidos sucesivos al extremo 3 de las hebras del ADN. Los dos DNAs así cortados se mezclan. se forman los enlaces covalentes por el ADN ligasa (forma B). Las uniones covalentes se consiguen añadiendo ADN ligasa y una fuente energética para formar los enlaces (forma A). ya que transporta el inserto de ADN a una molécula hospedadora. cada uno de los cuales procede de una especie diferente podemos utilizar dichas enzimas como herramientas. y después ser transportados como pasajeros al interior de las células de E. Los vectores o transportadores más utilizados son los plásmidos y el ADN del fago lambda. Es otro vector que puede ser utilizado para introducir genes en bacterias. Sus extremos cohesivos se aparearán dando lugar a un nuevo ADN recombinado. El ADN vector es el vehículo de clonaje.ADN RECOMBINANTE Si se quieren unir dos ADNs. Cuando el ADN recombinado del fago lambda. De este modo pueden construirse colas de poli G (nucleótico de guanina) en los extremos 3 de las dos hebras de ADN dúplex y colas de poli C (nucleótico de citosina) en los extremos del otro ADN. se mezcla con la cubierta del virus lambda. coli. Cada plásmido contiene varios genes que se replican. Otra enzima clave para unir ADNs es la transferencia terminal.16 - . con lo cual. Se pueden unir genes extraños a los plásmidos con mucha facilidad. Plásmidos Estos son pequeños ADNs de cadena doble y circular. se calientan y sé enfrían suavemente. pero simultáneamente en el tiempo. con su gen pasajero. se producen partículas fágicas infecciosas. una condición que tiene que tener los dos ADNs que se quiere unir es que tengan un pequeño fragmento igualen sus secuencias. Éstas están formadas por todas las . Como estas colas son complementarias. Los extremos escalonados del ADN1 y el ADN2 son complementarios. que se encuentran en el citoplasma de la mayoría de las bacterias. si el tamaño del ADN recombinado no es muy distinto del ADN natural del virus lambda. transcriben y traducen independientemente de los genes del cromóforo bacteriano.

un mismo tipo celular puede producir variantes de las proteínas que sintetiza en distintas etapas del desarrollo del organismo. Un organismo multicelular usualmente inicia su vida en forma de huevo fecundado. Resulta claro que la diferenciación de las . La regulación génica en los eucariotas.17 - . es muy diferente. A su vez. el cigoto. en respuesta a cambios en los nutrientes en el ambiente. Las investigaciones realizadas sobre estos organismos a nivel molecular develaron también muchas diferencias importantes entre el genoma de los eucariotas y de los procariotas. el cromosoma eucariótico difiere en muchos aspectos del cromosoma procariótico. Sin embargo. GENÉTICA MOLECULAR DE LOS EUCARIOTAS ± EXPRESIÓN GÉNICA Con la ayuda creciente de las herramientas de la tecnología del DNA recombinante. en vez de disminuir. toda la información genética originalmente presente en el cigoto también está presente en cada célula diploide del organismo. La regulación de la expresión génica en los procariotas está relacionada fundamentalmente con el ajuste fino de la maquinaria metabólica de la célula. El cigoto se divide repetidamente produciendo muchas células que se diferencian y cada tipo celular comienza a producir proteínas característicamente diferentes que lo distinguen de otros tipos de células. especialmente en los multicelulares. y es llevada a cabo activando o reprimiendo la expresión de ciertos genes.ADN RECOMBINANTE moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. En primer lugar. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda aplicarse in vivo. progresaron los estudios de genética molecular de los eucariotas y la distancia entre los eucariotas y los procariotas. se fue ampliando.

En los últimos años también se desarrollaron técnicas que permiten obtener copias idénticas de organismos. Hay varias evidencias que han relacionado el desarrollo del cáncer con cambios en el material genético. deleciones y adiciones. El nuevo gen debe establecerse en un gran número de células del tipo apropiado y quedar sujeto a los complicados. y todavía grandemente desconocidos. El mayor anhelo relativo a las aplicaciones basadas en la tecnología del DNA recombinante es que en algún tiempo futuro sea posible corregir defectos genéticos sustituyendo genes ³malos´ ³por genes´ ³buenos´. Las células se hacen crecer en cultivo en tubos de ensayo y se transfieren a óvulos fecundados de ratón y de otras especies de mamíferos y a embriones de Drosophila. Los virus pueden provocar cambios en la constitución genética de la célula y algunos pueden causar cáncer. Más aun. de una regulación de la expresión. En ocasiones. como en el caso de los procariotas. controles del gen normal. La expresión de los genes puede ser regulada en distintas etapas del camino que conduce desde el DNA a las proteínas.ADN RECOMBINANTE células de un organismo multicelular depende de la inactivación de ciertos grupos de genes y de la activación de otros. En estos casos se produce el cáncer. amontonándose. es decir.18 - . genes extraños han sido incorporados y expresados en el nuevo hospedador. las células escapan a los factores que regulan el crecimiento celular normal. Estos incluyen tanto virus con genoma de DNA como retrovirus con genoma de RNA. todos los virus conocidos causantes de cáncer son virus que introducen información en los cromosomas de las células hospedadoras. En cada uno de estos casos. Requiere primero la preparación de un gen que será captado por una célula eucariótica. y luego expresado. el genoma eucariótico contiene un sorprendente arreglo de elementos genéticos móviles. Esta es una tarea enormemente compleja. incorporado a un cromosoma. Las investigaciones en eucariotas han demostrado que. CROMOSOMA EUCARIÓTICO . invadiendo y destruyendo otros tejidos. El análisis del cromosoma eucariótico ha revelado que éste también está sujeto a reordenamientos. pero esto es sólo el comienzo. Se han desarrollado técnicas que permiten la transferencia de genes a células eucarióticas. En consecuencia. las células se multiplican sin control. El descubrimiento del papel de la transcriptasa inversa forjó el eslabón crucial entre los retrovirus y los cromosomas de las células eucarióticas. los clones.

en principio. moléculas relativamente pequeñas con carga positiva. El centro de cada nucleosoma está compuesto por alrededor de 140 pares de bases de DNA y un conjunto de ocho moléculas de histona. Los nucleótidos en la forma de trifosfatos se acoplan a lo largo de una cadena molde de DNA en la forma semiconservativa. La cadena que une los núcleos de los nucleosomas contiene otros 30 ó 60 pares de bases. A-DNA (una hélice dextrógira menos fuertemente enrollada) o Z-DNA (una hélice levógira).ADN RECOMBINANTE El DNA eucariótico siempre está asociado con proteínas. Los nucleosomas se empaquetan unos sobre otros formando una estructura más condensada ±la fibra de 30 nanómetros± que se encuentra tanto en la cromatina en la etapa de interfase como en los cromosomas que entran en mitosis. las DNA polimerasas operan solamente en una . La mayoría de estas proteínas son histonas. La distancia entre los nucleosomas es entre 10 y 11 nanómetros y el diámetro de cada cuenta es aproximadamente de 7 nanómetros. La molécula de DNA se envuelve alrededor de núcleos formados por ocho moléculas de histonas. en la síntesis de las cadenas complementarias. las unidades de empaquetamiento básico del DNA de los eucariotas. El DNA puede tomar in vitro la forma de B-DNA (la hélice dextrógira descrita por Watson y Crick).19 - . que constituyen más de la mitad del peso del cromosoma. con distintas funciones biológicas. para formar nucleosomas. La replicación del DNA en los eucariotas es igual. Las distintas formas del DNA podrían coexistir in vivo. a la replicación del DNA de los procariotas. Como en los procariotas.

por lo tanto. La tinción revela dos tipos de . Durante el desarrollo embrionario. Las histonas ensambladas en los nucleosomas raramente se separan del DNA. algunas de las cuales tienden a activar el gen y otras a desactivarlo. un gen parece responder a la suma de muchas proteínas regulatorias diferentes. la replicación comienza en un único origen y procede bidireccionalmente a lo largo de dos horquillas de replicación. comparativamente pequeño. Esto permite la unión de la RNA polimerasa y la posterior transcripción. Entre estas secuencias regulatorias. la cadena complementaria a la otra hebra madre ¶¶se sintetiza como una serie de fragmentos de Okazaki. El DNA recién sintetizado hereda parte de las viejas histonas pero requiere también de nuevas histonas para empaquetarse y formar la cromatina. en particular. Para poder iniciar la transcripción. En el cromosoma procariótico circular. que luego se unen por la acción de la enzima DNA ligasa. En cuanto se sintetiza. En un organismo multicelular. en los multicelulares. de alguna manera. pasar a través de los nucleosomas parentales. el DNA eucariótico forma los nucleosomas y se asocia también con otras proteínas compactándose en los niveles superiores de condensación. diferentes grupos de genes se activan o inactivan en diferentes tipos de células. a medida que la horquilla de replicación avanza debe. desempeña un papel principal en la regulación de la expresión génica en las células eucarióticas. se hace cada vez más claro que este nivel de control de la transcripción es mucho más complejo en los eucariotas. llamadas factores generales de transcripción. se ensamblen en la región promotora del gen que se va a transcribir. se cuentan las secuencias denominadas enhancers.20 - . Si bien en los procariotas también se da una regulación a este nivel. Muchas evidencias indican que el grado de condensación del DNA del cromosoma. LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN LOS EUCARIOTAS METILACIÓN Los biólogos están comenzando a comprender algunos aspectos de la regulación de la expresión génica en eucariotas. Se cree que cada nucleosoma se desenrolla transitoriamente. Los sitios en los cuales se unen esas proteínas regulatorias pueden estar a centenares o miles de pares de bases de distancia de la secuencia promotora en la que se une la RNA polimerasa.ADN RECOMBINANTE dirección¶¶. que se observa mediante la tinción de la cromatina. Una variedad de proteínas reguladoras específicas desempeñan papeles centrales en la regulación de la expresión génica. permitiendo que la DNA polimerasa copie el DNA nucleosomal desenrollado. la RNA polimerasa requiere que un grupo de proteínas. a las que se unen las proteínas que activan la transcripción.

Además. Otro factor que está involucrado en la regulación génica es la metilación de las bases nitrogenadas citosinas. los individuos tienen la misma cantidad de DNA en cada una de sus células diploides (lo cual no es sorprendente). Este tipo de heterocromatina se denomina heterocromatina constitutiva. desempeña un papel estructural en el movimiento de los cromosomas durante la mitosis y la meiosis. METILACION GENOMA EUCARIÓTICO El examen del DNA de las células eucarióticas reveló cuatro sorpresas principales. Esto fue un descubrimiento particularmente sorprendente. con algunas pocas excepciones. por el contrario. cuando la eucromatina está laxa. que ocurre después de la replicación. en los seres humanos. excepto por las secuencias reguladoras o secuencias señal. o hasta millones de veces. En tercer lugar.ADN RECOMBINANTE cromatina: la eucromatina y la heterocromatina. o por lo menos de DNA cuyas funciones son desconocidas. en una misma especie. cuando las células se diferencian durante el desarrollo embrionario.21 - . pero las variaciones entre las diferentes especies son enormes. desempeña un papel en el desarrollo temprano del embrión. En E. la impronta genómica. virtualmente todo el DNA se expresa. Algunas regiones heterocromáticas son constantes de célula a célula y nunca se expresan. casi la mitad del DNA de la célula eucariótica consiste en secuencias de nucleótidos que se repiten centenas. que ocurre durante la gametogénesis. coli. En primer lugar. Esta región. La metilación diferencial de ciertos genes en ambos sexos. pero la eucromatina se vuelve más laxa. esta cifra puede disminuir hasta el 1%. en cada célula eucariótica parece haber un gran exceso de DNA. que ha sido por largo tiempo el modelo para los genetistas moleculares. reflejando la biosíntesis de diferentes proteínas por diferentes tipos de células. Se estima que en las células eucarióticas menos del 10% de todo el DNA codifica para proteínas. Por contraste en los procariotas y más aún en los virus. que no codifica para proteínas. Un ejemplo es la cromatina altamente condensada. La transcripción del DNA a RNA ocurre solamente durante la interfase. varían de un tipo de célula a otro dentro del mismo organismo. Durante la interfase. Otras regiones de cromatina condensada. cada molécula de DNA cromosómico contiene típicamente sólo una . la proporción de heterocromatina aumenta respecto de la de eucromatina a medida que la célula se vuelve más especializada. localizada en la región del centrómero del cromosoma. En segundo lugar. la heterocromatina permanece condensada.

La tercera clase. Los genes individuales de la familia difieren ligeramente en sus secuencias de nucleótidos. Además. Aunque los intrones se transcriben a RNA en el núcleo. no se traducen a proteínas. Los estudios de hibridación y secuenciación han mostrado tres clases de DNA eucariótico. y tal vez la más inesperada de todas. supuestamente a raíz de mutaciones deletéreas. El DNA de repetición intermedia incluye múltiples copias de los genes que codifican para los RNA ribosómico. Los datos actuales indican que sólo un 1% del genoma humano puede traducirse a proteína. Se cree que las familias génicas tienen sus orígenes en duplicaciones génicas que ocurrieron como resultado de ³errores´ de recombinación. las principales excepciones son los genes que codifican los RNA ribosómicos. en consecuencia. así. sino que están interrumpidas por secuencias no codificadoras. aquellas que se expresan. Las secuencias no codificadoras que producen interrupciones dentro de un gen se conocen como secuencias interpuestas o intrones. se conocen como DNA de secuencia simple. pero también existe en pequeña cantidad en las mitocondrias y .ADN RECOMBINANTE copia de cualquier gen dado. no están presentes en el mRNA en el citoplasma y. forman familias génicas. habitualmente dispersas en el cromosoma. Las repeticiones múltiples de secuencias de nucleótidos cortas. y las secuencias codificadoras. se conocen como DNA de repetición intermedia. constituye hasta el 70% del DNA cromosómico en los seres humanos y dentro de esta fracción se encuentra el DNA que codifica para la mayor parte de las proteínas. el DNA de copia única. como los que codifican para las cadenas polipeptídicas de las moléculas de hemoglobina. son llamadas exones. El DNA de secuencia simple está asociado con la heterocromatina fuertemente condensada en la región del centrómero. dispuestas característicamente en tándem. Las repeticiones más largas. Algunos miembros de las familias génicas no se expresan. las proteínas que ellos codifican difieren ligeramente en estructura y en propiedades biológicas. un gen está presente solamente dos veces por cada célula eucariótica diploide. de acuerdo con la genética mendeliana. seguidos por diferentes mutaciones en diferentes copias del gen. CLASES ADN El ADN es por lo común el constituyente básico de la cromatina (cromosoma) nuclear en las células eucarióticas. Los exones son los segmentos que están presentes en el mRNA citoplásmico y que se traducen a proteína. La cuarta sorpresa. estas secuencias de DNA se conocen como pseudogenes. RNA de transferencia e histonas. no en una multitud de copias. fue que las secuencias de genes eucarióticos que codifican para proteínas habitualmente no son continuas.22 - . este hallazgo fue sorprendente porque. Algunos genes estructurales.

Los porcentajes indicados son del hombre y el ratón. INTRONES Unaregión del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN es un intrónpor el hecho que son segmentos no codificados. es desnudo) y en los virus (DNA virus) que lo poseen constituyen el virión o elemento infestante. Las bases nitrogenadas se colocan casi exactamente perpendiculares al eje de la doble cadena (eje azúcar ± fosfato).ADN RECOMBINANTE cloroplastos. En los procariontes forma el nucloide (que a diferencia de los eucariontes no va asociado a proteínas. Son característicos en cada especie y pueden ser separados por centrifugación. Este ADN tiene la particularidad de presentar zonas metiladas por lo cual no puede ser transcrito a ARN mensajero. sólo una pequeña parte del ADN constituye genes (menos del 10 %). Por cada vuelta de la hélice hay 11pb. Está formado no por 1 par de bases como unidad sino por 2 pares de bases. Se intercalan con el ADN de copia única.23 - . y las proporciones serían las mismas en otras especies. Constituyen la heterocromatina y no se le conoce función.  ADN satélite(altamente repetitivo: 28 %)son unidades cortas de pares de nucleótidos que se repiten en el genomio. una pequeña parte de este ADN contiene los genes. A-ADN: es ADN de tipo Dextrogiro (la hélice está enrollada hacia la derecha). y se cree se forma durante la transcripsion. Por cada vuelta de la hélice hay 10pb. Z-ADN: Es de tipo Levógiro. Es la estructura más estable de las 3. Tiene una estructura molecular más distendida y por lo tanto relativamente "débil" porque la distancia entre las bases y el eje de la hélice es mayor. Acorde a lasevidencias.  ADN repetitivo(20 %)son unidades de aproximadamente 300 pares de nucleótidos* que se repiten en el genoma unas 105 veces(unidades de repetición). B-ADN: es Dextrogiro también y es la forma más abundante del ADN. a diferencia de los exones que . Existen diferentes tipos que los podemos dividiren:  ADN de copia única(el 57 % del total) formados por segmentos de aproximadamente 1000 pares de nucleótidos del longitud. Al parecer se presenta cuando intracelularmente no hay agua o en muestras de ADN deshidratadas (por ejemplo en las usadas para cristalografía). todo eso provoca que la molécula adquiera una forma de zig ± zag.

es un proceso de remoción de intrones). la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinación de los exones. haciendo más fácil moverlos y crear nuevos genes. el cual es una especie de "edición" del contenido del ARN (es decir. . la estructura intrón-exón de los genes eucarióticos. Existen diferentes métodos de empalme del ARN. que ocurre dentro del núcleo de una célula. especialmente en los ARN mensajeros (ARNm).24 - . motiva la formación de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes. Existen 3 preguntas que los científicos estan tratando de resolver acerca de los intrones: ¿Cómo se remueven los intrones del ADN? ¿Qué hacen los intrones? ¿Cuál es el origen de los intrones? De estas 3 preguntas. así como entre los genes de una misma especie. Esta teoría nos lleva hacia la "hipótesis de barajeo de exones". El número y longitud de los intrones varía enormemente entre especies. mientras que los mamíferos y las angiospermas (plantas con flores) suelen presentar numerosos intrones. y la mayoría requiere de la ayuda de proteínas que reconocen secuencias específicas en el pre-ARN. La denominada "teoría exótica de los genes" sugiere que los exones son los bloques constructores de las proteínas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. Por ejemplo. en lo que constituye un proceso más eficiente que construir los nuevos genes a razón de un nucleótido a la vez. Takifugu rubripees. De acuerdo a esta teoría. Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN. el pez globo. la primera es la que tiene la respuesta más satisfactoria. La segunda pregunta sigue siendo tema de estudio. Los Intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota.ADN RECOMBINANTE son regiones que codifican para una determinada proteína. tiene pocos intrones en su genoma. además pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas.

la pregunta que resulta más obvia es: si los intrones son útiles para la recombinación. En ambos grupos. Los intrones del grupo I están presentes en los genes de ARNr de algunos eucariotas inferiores y en los genes mitocondriales de hongos. entonces ¿por qué sólo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? Respecto a la tercera pregunta. Actualmente se reconocen cuatro clases de intrones: Intrones del grupo I Intrones del grupo II Intrones del grupo III Intrones nucleares. existen dos teorías comúnmente aceptadas: la teoría de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardíos". Los intrones del grupo II y III son muy similares y presentan una estructura secundaria altamente conservada.ADN RECOMBINANTE Ante esta teoría. Los del grupo II y III se eliminan mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una adenina o de un spliceosoma. estos ancestros no poseían intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. II y III son intrones que sufren de autosplicing mediante reacciones de transesterificación. se forma una estructura en lazo característica denominada lariat. Los del grupo IV están presentes en los ARNt de los eucariotas y se caracterizan por ser los únicos que se eliminan mediante un corte endonucleótido seguido de un ligamiento en lugar de la reacción de transesterificación . Según la primera. De acuerdo con la segunda teoría. pero éstos últimos los perdieron durante su proceso evolutivo. durante el proceso de empalme de los exones. los ancestros de los eucariotas y los procariotas poseían intrones. De hecho a veces los intrones del grupo III son identificados como intrones del grupo II debido a su similitud funcional y estructural. Se caracterizan por eliminarse mediante un proceso auto-catalítico que requiere de una guanosina o un nucleótido de guanosina libre. La frecuencia con la que encontramos estos intrones en el genoma es relativamente rara si la comparamos con la frecuencia de los intrones spliceosomales. así como por carecer de secuencias consenso en los puntos de empalme. respectivamente.25 - . aunque pueden tenerlas en su interior. spliceosomales o intrones del grupo IV Los intrones del grupo I.

sobre todo. Expansión de trinucleótidos: En ciertos genes hay repeticiones de un trinucleótido entre 10 y 100 veces. que sintetiza ADN independientemente de molde. se han encontrado elementos conocidos de regulación solapando con ellas (cajas).26 - . que no se da en otras partes del genoma. Las repeticiones suelen ser de decenas. La enzima que añade este polinucleótido (diferente para cada especie) es la telomerasa. Tanto la rareza como esta especial distribución y concentración.ADN RECOMBINANTE REPETICIONES Y NO REPETICIONES ADN repetido. Parece que. Favorecen la replicación del ADN en el extremo lineal del cromosoma. por lo que probablemente modulen la unión a ese elemento. pero también parece limitar el número de potenciales divisiones celulares. con un patrón de distribución del dinucleótido característico. Repeticiones de CA en el ADN centromérico. hacen suponer una misión reguladora a estas secuencias. ayuda a estabilizar los cromosomas y evitar su degradación por esos extremos. tanto en la secuencia codificante como en los intrones y las 3' y 5' UTR (untranslated terminal region: región no traducida terminal. que abundan en el ADN espaciador entre genes. hay dos presentes en todos los ARNm y que se encuentran antes y después de los codones y y y y . y Islas CG: Se encuentran aproximadamente 1 Kpb a 5' de muchos genes. ADN telomérico: Consta de secuencias altamente repetidas (cientos de veces) de 4 a 8 nt. De hecho. antes del promotor. además. Agrupaciones de AT y de CA.

27 - . con las secuencias de adhesión y disociación del ribosoma y con implicaciones en la expresión génica). en la que el gen que codifica para la proteína responsable. Lo que es evidente es que juegan un papel importante en la construcción de genomas y que. Este fenómeno se conoce muy bien en la enfermedad de la corea de Huntington. respectivamente. la huntingtina.ADN RECOMBINANTE de inicio y terminación. y SINE (secuencias cortas dispersas entre genes): Son secuencias de unos cientos de pb. Se dice entonces que la mutación es knockin (mutación por inclusión de material genético). No se conoce el mecanismo de replicación de estas secuencias. Estructura de ADN en cuádruplex formada por repeticiones Repeticiones de secuencias largas. en algún momento. Las que mejor se conocen son las de la familia Alu. posee entre 10 y 30 repeticiones del trinucleótido CAG cuando es funcional. lo han hecho a lo largo de la evolución generando una gran variabilidad. cuando no parecen tener ninguna función. pero se supone que deben. presentes en un muy elevado número de copias. probablemente. posibles implicaciones evolutivas) en ADNds y posteriormente incluirse al azar en el genoma. Se sabe que estos elementos son capaces de incluirse en otro sitio del genoma porque se han detectado casos de mutaciones en las que un exón quedaba interrumpido por una de estas secuencias que antes no estaba ahí. LINE (secuencias largas dispersas entre genes): Son secuencias de unos 7000 pb que se encuentran flanqueando genes. y la enfermedad se desarrolla cuando se sobrepasa cualquiera de los dos límites. traducirse (no se sabe si con un promotor propio o con otro cercano) para después retro-transcribirse (como los retrovirus. Por su tamaño forman parte del ADN y . y la gravedad es proporcional al número de repeticiones de más. porque la proteína pierde su función. cada una con 300 pb y distribuidas en 500000 copias. pero en cualquier caso no se sabe qué son ni porqué permanecen en el genoma.

etc. Muchas veces. posee una regulación conjunta de todos los genes durante el desarrollo. por lo que su principal misión sería favorecer la diversificación genética. la unión o separación de cromosomas. actúan de manera totalmente independiente. . a corto plazo. sobre todo porque controlan la expresión de genes que están a Mpb de distancia. o impide el buen funcionamiento en uno u otro sentido. Es importante no confundirlo con ADN repetido.ADN RECOMBINANTE moderadamente repetido. FAMILIAS GENÉTICAS -TRANSCRIPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE ARN EN EUCARIOTES Una familia génica es un conjunto de genes con un alto grado de homología que. sobre él pueden desarrollarse fenómenos de mutación al azar que deriven en un gen funcional y reviertan la inactivación o. de modo que se puede considerar la existencia de un elemento de regulación de la familia entera. pero son independientes. Se cree que favorecen la recombinación y el sobrecruzamiento. porque tiene todos los elementos necesarios para poder llegar a sintetizarse. por ejemplo. por lo que se selecciona negativamente y se inactiva permanentemente. poseen un parentesco evolutivo que es consistente con un proceso de copia. También tiene importantes implicaciones evolutivas. la de las hemoglobinas. Generalmente las familias génicas se encuentran agrupadas. A pesar de que es un gen inútil. cada uno con sus propios elementos de regulación que. Sin embargo. Este hecho permite la aparición de mutantes híbridos. ya que alguna vez la recombinación puede no ser homóloga y provocar. por ejemplo. se conoce desde hace mucho tiempo que familias génicas como. sin llegar a ser alelos (variantes de un mismo gen) porque codifican para productos distintos. el producto no es funcional. como es el caso de la mayoría de las talasemias que conciernen al locus de la hemoglobina. Este gen nunca transcrito se llama pseudogén. el codón de iniciación. diversificación y evolución independiente.28 - . aun constando de proteínas independientes. y los genes que las constituyen distan unos pocos Kpb unos de otros. Se han descubierto elementos de ese tipo a 5' del locus de la hemoglobina. excepto alguno esencial (el promotor. es parte activa en procesos de recombinación genética porque su secuencia es altamente homóloga con la de los genes funcionales de su alrededor.). denominados LCR (locus controlling regions: regiones controladoras del locus). a veces. pero no se sabe cómo actúan. durante la evolución de una copia de un gen determinado.

Existen muchos ejemplos de mensajes idénticos procesados por diferentes métodos (ver El ACTH y su . Luego que en el núcleo de la célula eucariota se transcribe un ARN. La función de esta "cola" de poli A no se conoce. pero puede usarse para capturar mARN para estudios. mientras que en eucariotas tenemos dos procesos separados en tiempo y localización (recordar la existencia de una envoltura nuclear). sino en que en una célula eucariota suele haber cientos de repeticiones en tándem del conjunto de genes que los codifican. Los genes eucariotas no se agrupan en operones como los de los procariotas. En procariotas la traducción comienza inclusive antes que la transcripción haya terminado. Los intrones se cortan y los exones se colocan juntos antes que el mARN deje el núcleo. Si bien los procariotas tienen un solo tipo de ARN polimerasa para todos los tipos de ARN. los eucariotas tienen una para cada tipo. Transcripción El proceso de transcripción en los eucariotas es similar a los de los procariota. Cada gen eucariota se transcribe separadamente. Una ristra de adeninas (tanto como 200 nucleótidos conocido como poli-A) se agrega al extremo 3' del mARN luego de la transcripción. En el humano son unas 200 copias repartidas en cinco cromosomas. claro. existen sin embargo algunas diferencias. Una para el mARN.29 - . Cada una de estas copias tiene su propio promotor. y esto resulta esencial para el pegado del mARN al ribosoma. pero en todas es el mismo. no por las posibles analogías entre cada uno de ellos. Se le agrega 7-metilguanina (una base inusual) al extremo 5' del mARN.ADN RECOMBINANTE Los ARNr son un ejemplo de familia génica. el ARN transcripto es extensamente modificado antes de ser exportado al citoplasma. una para los rARN largos y una tercera para los rARN cortos y los tARN. con un control transcripcional independiente para cada gen.

situada unos 20-30 nucleótidos antes del extremo 3' original. aumentando su vida media en el citosol. contienen información para una sola cadena polipeptídica. Esta cola protege al ARNm frente a la degradación. su nombre en inglés) que es un nucleótido modificado de guanina. Su adición está mediada por una secuencia o señal de poliadenilación (AAUAAA). que se añade al extremo 5' de la cadena del ARNm transcrito primario (ubicado aún en el núcleo celular) mediante un enlace 5'-fosfato 5'1 fosfato en lugar del habitual enlace 3'. un tramo de RNA cuyas bases son todas adenina. Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos. determina el orden en que se unirán los aminoácidos.ADN RECOMBINANTE familia de péptidos). o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas. El ARN mensajero (ARNm. a veces los intrones se tornan exones y viceversa. es decir. 3. Entre esas modificaciones se encuentran la eliminación de fragmentos (splicing). llamadas intrones. En la mayoría de los casos. es decir. no codificantes. codifican más de una proteína. Poliadenilación: es la adición al extremo 3' de una cola poli-A. Moléculas de proteínas se pegan al mARN y luego se exportan del núcleo formando partículas llamadas ribonucleoproteínas (mRNPs) que parecen ayudar en el transporte por los poros nucleares y también en el pegado a los ribosomas. esto es crítico para el reconocimiento y el acceso apropiado del ribosoma. sino que ha de sufrir modificaciones antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN).5'-fosfodiéster. mientras que en los procariotas los ARNm son con frecuencia policistrónicos. ya que estas no poseen intrones en su ADN. Procesamiento de ARN El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito primario o ARN precursor (pre-ARN). de modo que se puede sintetizar mayor cantidad de proteína. que en la mayoría de los casos no se libera del complejo de transcripción en forma totalmente activa. el procesamiento del ARN en eucariotas comprende diferentes fases: 1. es decir. al contrario que el ADN que es bicatenario. el ARN mensajero sufre la eliminación de secuencias internas. El proceso de retirada de los intrones y . Esta caperuza es necesaria para el proceso normal de traducción del ARN y para mantener su estabilidad. Esto no ocurre en células procariontes. 2. El ARN mensajero es un ácido nucleico monocatenario. Concretamente. una secuencia larga de poliadenilato. Adición al extremo 5' de la estructura denominada caperuza o casquete (o CAP. la 7metilguanosina. es decir. la adición de otros no codificados en el ADN y la modificación covalente de ciertas bases nitrogenadas.30 - .

el ARN mensajero no pasa por un proceso de maduración y. o corte y empalme (en inglés. Aquí ocurren diversas reacciones de fosforilación oxidativa. En procariontes. 6. Además no tiene que salir del núcleo como en las eucariotas. Después de cierta cantidad de tiempo el ARNm se degrada en sus nucleótidos componentes. el ARNm se acoplan los ribosomas. porque en las células procariotas no hay un núcleo definido. a través de poros de la membrana nuclear. estos dos organelos tienen su propia información genética y se replican de manera independiente del DNA nuclear. Una vez en el citoplasma. a este fenómeno se le llama ayuste alternativo. intercambiando o eliminando nucleótidos erróneos. por lo cual su DNA presenta muchas mutaciones.ADN RECOMBINANTE conexión o empalme de los exones se llama ayuste. splicing). La diferencia fundamental está en que. permitiendo que con un solo gen se obtengan varias proteínas diferentes. ni se le quitan intrones. que son la maquinaria encargada de la síntesis proteica.31 - . en las procariotas. El ARN mensajero maduro es trasladado al citosol de la célula. no se le añade caperuza ni cola. El proceso de transcripción y el de traducción se realizan de manera similar que en las células eucariotas. por lo tanto. Ciertas enzimas parecen estar involucrados en editar el RNA antes de su exportación fuera del núcleo. generalmente con la ayuda de ribonucleasas. la unión de los ribosomas ocurre mientras la cadena de ARNm está siendo sintetizada. 5. A veces un mismo transcrito primario o pre-ARNm se puede ayustar de diversas maneras. . 4. ADN DE LOS ORGANELOS ENERGÉTICOS Existen dentro de la célula dos organelos que aportan energía la mitocondria y el cloroplasto. en el caso de los seres eucariontes.

haciendo que unos dependieran de otro. eran organismos procariotes capaces de realizar dichas funciones antes mencionadas y que aportan a la célula energía.. N.wikipedia.uam. Las células eucariotes primitivas no eran capaces de fotosintetizar (cloroplastos) o de realizar fosforilizaciones (mitocondria).htm Trabajos y Páginas web consultadas http://es. Sue Barnes 5ta.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/inicio.32 - .ADN RECOMBINANTE El por qué estos dos organelos tienen DNA está basado en una teoría llamada "endosimbiótica" en donde menciona que la mitocondria y el cloroplastos. BIBLIOGRAFÍA Molecular CellBiologyfiftheditionLodish BiologíaCelulardelosMicroorganismos-Brock 10ma Edición Biología de Curtis H.fmedic.unam. se convirtieron en una sola célula.htm http://laguna.html . ya no pudieron dejar de ser diferentes organismos y al evolucionar.mx/~evazquez/0403/dna%20recombinante.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/resumenes/tema14. así que estos tres organismos comenzaron a convivir. y 6ta edición versión online http://www.cobach-elr.org/wiki/ADN_recombinante http://www. Al crearse ese vínculo fuerte.

htm http://es.com/question/index?qid=20090603133537AAhr4SR http://html.wikipedia.com/trabajos12/desox/desox.com/doc/15795726/Genetica-Molecular-Esquema http://www.html http://revistaplaneta.2/num3/art1/index.es/~ecampins/Treballs%202n/Biotecnologia/OBTENCION%20DEL%20A DN%20RECOMBINANTE.uam.iespana.htm http://www.amgen.es/html/adn_reco.edu.htm http://html.wikipedia.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.html http://www.biblioteca.html http://www.ar/adn/adntema4.shtml http://biotec.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_de_ADN http://es.wikipedia.org.ADN RECOMBINANTE http://www2.org/wiki/Secuencia_de_ADN http://www.rincondelvago.ucm.biologia.org/wiki/ARN_mensajero http://www.iib.com/trabajos14/biotecnologia/biotecnologia.answers.33 - .es/adn.html http://es.org.biblioteca.scribd.unam.efn.monografias.ar/libros/hipertextos%20de%20biologia/adntema3.monografias.htm#Transcription and processing of http://www.com/organulos-energeticos.biologia.htm http://www.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_2/03t.yahoo.html .org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_(biolog%C3%ADa_molecular) http://www.htm http://www.htm http://es.com/genetica-molecular_2.htm http://www.uncor.arizona.edu/dep/biologia/intrbiol/adntema3.html http://es.es/servicios/seq/otros/SecuenciaADN/maxam.com/adn-y-arn.mx/vol.ar/libros/hipertextos%20de%20biologia/adntema3.revista.shtml#cla http://html.infotelecom.wikipedia.rincondelvago.rincondelvago.

ADN RECOMBINANTE .34 - .

ADN RECOMBINANTE CUADROS DE RESUMEN I .

ADN RECOMBINANTE II .

ADN RECOMBINANTE III .

ADN RECOMBINANTE IV .

ADN RECOMBINANTE V .

ADN RECOMBINANTE VI .

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