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PRACTICA NÚMERO 1: CULTIVOS FÚNGICOS

OBJETIVOS: Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:  Diferenciar los diferentes tipos de medios de cultivo.  Diferenciar el crecimiento de levaduras y mohos en medios de cultivo en placa y en tubo.  Señalar los pasos para realizar un microcultivo.  Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire agua y tierra.

MEDIO DE CULTIVO Uno de los sistemas más importantes para la identificación de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Al conjunto de estas soluciones líquidas o sólidas que contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos se les conoce como medio de cultivo. El medio de cultivo es aquella solución que cuenta con los nutrientes necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones favorables de temperatura y pH, exento de todo microorganismo contaminante), así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Los medios de cultivo pueden clasificarse:  Según su consistencia: a. Líquidos b. Sólidos
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Los medios líquidos son infusiones preparadas bien sea colocando carne picada en agua o disolviendo en esta un extracto de carne comercializado, no llevan ninguna solución solidificante. Contienen proteínas, factores esenciales de crecimiento y oligoelementos. A estos medios se les pueden añadir otros nutrientes como peptonas y glucosa así como cloruro de sodio y un tampón de pH. Los medios sólidos están constituidos por un medió líquido mas una solución gelificante, como el agar en polvo que se disuelve por ebullición, que los solidifica. Pueden ser trasvasados en tubos o placas de Petri. Estas últimas son recipientes de vidrio o plástico transparente con una tapa y ofrecen una gran superficie para la siembra. 

Según su aporte nutritivo: a. Básicos b. Complejos Los medios básicos contienen las sustancias mínimas para el crecimiento de hongos metabólicamente no exigente. Pueden contener agar o no dependiendo si se quieren sólidos o líquidos, respectivamente; peptonas, glucosa. Deben poseer un pH y una osmolaridad adecuada para la multiplicación de los hongos. Estos medios también pueden ser utilizados como base en la preparación de otros medios como los enriquecidos, selectivos, entre otros. Los medios enriquecidos pueden contener suero, sangre o factores esenciales específicos como vitaminas o cofactores para el crecimiento de hongos exigentes en requerimientos nutritivos y que no crecen bien en los medios básicos.  Según su finalidad: a. Medios de aislamiento: Utilizados para el aislamiento de levaduras por la técnica de agotamiento, han de ser sólidos. Ejemplo, Agar Sabouraud, Agar Lactrimel
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b. Medios selectivos: Son aquellos que permiten la recuperación de un hongo en específico e inhiben el crecimiento de otro. Ejemplo, Sabouraud con clicoheximida (inhibe hongos contaminantes como Aspergillus, etc). c. Medios selectivos diferenciales: son aquellos medios utilizados para recuperar o aislar un hongo en específico, por ello, para diferenciar las distintas colonias, se les añade sustancias que confieren un color diferente a las colonias según la distinta actividad metabólica. Para este propósito se utilizan azúcares como el manitol, la lactosa, sorbitol y otros, junto a un indicador de pH como rojo neutro, azul de bromotimol, etc. Ejemplo. CHROMagar Candida utilizado en la identificación de Candida albicans, Candida krusei y Candida tropicalis. Los medios de cultivo utilizados en micología contienen nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc). El pH ligeramente ácido tiende a facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. A los medios de cultivo se les puede añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprófitas que suelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y la Gentamicina. Se añade también actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprófitos ambientales. Los medios cuya composición contengan actidione no debe ser utilizados para el aislamiento de Cryptococcus neoformans, ya que inhiben su crecimiento. Entre los medios más empleados en la Micología se encuentran: Medio Sabouraud Dextrosa (SAB): Contiene un 2% de glucosa y es ligeramente ácido (pH=6.9), se considera el medio estándar para recuperar y mantener una amplia variedad de hongos que pueden aislarse en el laboratorio de micología clínica. Es el medio estándar para observar la morfología típica de los hongos, pero no es el medio ideal de
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crecimiento o para estudiar la esporulación. Permite el crecimiento de actinomicetos aerobios. Se utiliza indistintamente en tubo o en placa. Medio Sabouraud con Cloranfenicol y Gentamicina: Es el medio Sabouraud clásico con la incorporación de los antibióticos Gentamicina y Cloranfenicol, que permiten el crecimiento de casi todos los hongos filamentosos y levaduras al mismo tiempo que inhiben a una gran mayoría de bacterias. Se utiliza en tubo o en placa. Agar Lactrimel de Borelli: Se emplea para favorecer la producción de pigmentos y la esporulación de la mayoría de dermatofitos. Contiene harina de trigo, leche descremada en polvo, agar, miel y antibiótico. Los medios de cultivo pueden ser preparados en placa o en tubo. Los medios en placa tienen la ventaja de ofrecer mayor superficie para el aislamiento pero, para soportar la deshidratación durante el largo período de incubación a que van a ser sometidos (un mes o más), has de contener una gruesa capa de medio (25 a 40 ml). Son más peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles de contaminar. Mientras que los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero ofrecen máxima seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación. (Figura 2 y 3)
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Figura 2: Medio de cultivo en placa de Petri.

Figura 3: Medio de cultivo en tubo

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A la hora de elegir un medio de cultivo adecuado se debe tener en cuenta el tipo de muestra y los microorganismos fúngicos que requieren ser aislados. Si la muestra procede de zonas presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los medios normales, medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos saprofitos (cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida). Tanto la muestra como las placas y tubos que se van a sembrar deben manipularse por medidas de seguridad y para evitar contaminaciones ambientales, los cultivos con crecimiento micelial (temperatura ambiente) de Histoplasma capsulatum, Paraccoccidioides brasiliensis y Coccidioides posadasii o C. immitis deben ser manipulados en campana de flujo laminar. Han de rotularse adecuadamente, con el número de la muestra y la fecha en que se realiza la siembra. Las placas se precintan con cinta de Parafilm, en la que se realizan un par de aberturas, y los tubos se dejan con el tapón de rosca a medio cerrar (para mantener la aerobiosis). Para realizar un cultivo fúngico, generalmente los especímenes se colocan sobre la superficie del medio de cultivo y se conservan a temperatura ambiente (26 a 27 ºC); en caso de micosis sistémicas, es mejor a 30-37 ºC. Las levaduras se siembran con técnica de agotamiento en placa. Los pelos y escamas se disponen en fragmentos en diferentes puntos de la superficie del medio. En líquidos, heces y pus se deben sembrar aproximadamente 0,5 a 1,0 ml por tubo. Las levaduras se desarrollan en 24 a 48 horas, los contaminantes en dos a cuatro días y la mayoría de los hongos patógenos requiere una a dos semanas. La identificación de los hongos se basa en el examen macroscópico de la colonia y en sus características microscópicas. Semejanzas macroscópicas como la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la producción de pigmentos son muy útiles para la identificación (cuadro 1). En los medios de cultivo las levaduras forman colonias húmedas, cremosas, opacas o pastosas, y los hongos filamentosos producen colonias algodonosas, lanosas o pulverulentas.
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En general, la morfología microscópica de los hongos es estable y presenta pocas variaciones. La identificación definitiva se basa en la forma característica, método de producción y ordenamiento de las esporas, siendo también importante conocer el tamaño y la disposición de las hifas en el caso de los hongos filamentosos, en los levaduriformes se observa la presencia de blastoconidias, seudohifas, clamidosporas. (Cuadro 2)
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS COLOR TAMAÑO DE LA COLONIA Diámetro Aterciopelada, ASPECTO algodonosa, pulverulenta Cremosa HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME Colonia Reverso Pigmento del medio

Cuadro 1. Descripción macroscópica de los hongos

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

HONGO FILAMENTOSO SEPTADO ASEPTADO SEPTADO ASEPTADO GRUESO DELGADO

HONGO LEVADURIFORME

HIALINO MICELIO DEMATIACEO

OBSERVACIÓN DE BLASTOCONIDIAS, SEUDOHIFAS Y CLAMIDOSPORAS

Cuadro 2. Descripción microscópica de los hongos

La preparación del material para la observación microscópica puede realizarse en fresco, con cinta de celofán adhesiva o mediante cultivo en lámina o microcultivo.

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PRODUCCIÓN, TAMAÑOY DISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS

DEPENDIENDO DE LA ESPECIE

PREPARACIÓN EN FRESCO Este procedimiento es el que utilizan la mayoría de los laboratorios, ya que las muestras se preparan con facilidad y rapidez y además permite identificar muchas de las especies de hongos más habituales. El mayor inconveniente de la observación en fresco es que se puede alterar el ordenamiento característico de las esporas al presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es válido en los casos en que es necesario conocer la disposición de las esporas. Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuación: 1. Seleccionar una colonia aislada. 2. Calentar el asa en aguja (al rojo vivo) para esterilizar, dejar enfriar. 3. Extraer un fragmento de la colonia que contenga además un poco de agar en la parte inferior. 4. Depositar el fragmento extraído sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol. 5. Cubrir con un portaobjeto y presionar suavemente para dispersar la colonia y el agar; de esta forma, la muestra está disponible para su observación al microscopio. PREPARACIÓN CON CINTA DE CELOFÁN ADHESIVA Es un método rápido para observar microscópicamente los mohos sin alterar el arreglo de sus conidias. Una de las desventajas es que si la cinta transparente no se presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar. En los casos en que mediante este método no se observen esporas deberá realizarse la preparación en fresco.
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El procedimiento se lleva a cabo como sigue: 1. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre una lámina portaobjeto. 2. Cortar un pedazo de cinta adhesiva transparente (2 a 3 cm) y fijarlo a un asa en aguja. 3. Colocar la cinta sobre la superficie de la colonia de moho, haciendo presión. 4. Colocar la cinta sobre la lámina, cubrir con una laminilla. 5. Observar al microscopio. MÉTODO DE MICROCULTIVO (Método de Riddel): También llamado cultivo en lámina. Este cultivo se realiza una vez recuperado el hongo del espécimen clínico. Es útil para la identificación de especies de hongos filamentosos (exclusivamente). La técnica de microcultivo se realiza de la siguiente manera: 1. Introducir en una placa de Petri un papel absorbente, una varilla de vidrio en forma de U y una lámina portaobjeto. Esterilizar con calor seco. 2. Tomar una placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel y bajo condiciones de esterilidad cortar con un bisturí cuadros de 1 cm. de lado y colocar uno de ellos sobre la lámina portaobjeto previamente esterilizada en el paso 1. 3. Inocular en el centro de los cuatro lados del agar con el hongo en estudio y colocar encima una laminilla o lámina cubreobjeto (Figura 4). destilada estéril, para evitar desecación. 5. Incubar a temperatura ambiente. La colonia crecerá por debajo de la superficie del cubreobjeto. Se examina el montaje periódicamente a simple vista para determinar si la colonia ha crecido o se haya contaminado, se deja por un lapso mínimo de 15 días. 6. Cuando es evidente el crecimiento, se retira cuidadosamente el cubreobjeto con pinzas estériles y se coloca en un portaobjeto que contiene una gota de
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4. Humedecer el papel absorbente con aproximadamente 5 ml de agua

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azul de lactofenol. Si se desea un montaje permanente, se limpia la superficie del portaobjeto e inmediatamente adyacente al borde del cubreobjeto se aplica esmalte para uñas color claro. 7. Observar las dos láminas preparadas al microscopio óptico.

Lámina cubreobjeto Cubo de agar

Inoculo del hongo a los cuatro lados del cubo de agar Lámina Portaobjeto Placa de Petri

Varilla de vidrio en forma de U
Figura 4: Placa de microcultivo. Tomado de Arenas. Micología Médica Ilustrada. McGrawHill. México. 2003

HONGOS CONTAMINANTES Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayoría saprófitos, hallándose libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgánica en descomposición. Las condiciones necesarias para que un hongo crezca en una superficie son: existencia de esporas, base nutriente, humedad y temperatura entre 4 y 38 oC. El crecimiento de hongos en sistemas de aire acondicionado y edificios puede producir en sus habitantes determinadas patologías entre las que cabe destacar asma y alveolitis alérgicas. La contaminación ambiental por hongos en el medio ambiente y en interior de edificios, es debida básicamente a hongos filamentosos y levaduras.
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Procedimiento para el aislamiento de hongos contaminantes Aire: Materiales: Placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel. Las placas serán expuestas en diferentes ambientes (cerrados y externos), mediante 2 procedimientos: a. Captura por sedimentación: 1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y lugar. 2. Destapar la placa y dejarla abierta por 10 minutos. 3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima actividad práctica. b. Captura por choque sobre la superficie de agar: 1. Rotular una placa de Petri con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y lugar. 2. Destapar la placa y agitarla 10 veces. 3. Cerrar la placa e incubarla a temperatura ambiente hasta la próxima actividad práctica. Agua: Materiales: Un tubo con tapa de baquelita, estéril; 1 placa de Petri con Agar Sabouraud o Lactrimel, pipeta Pasteur, hisopo estéril o asa de siembra. 1. Recolectar aproximadamente 10 ml de agua (poceta, filtros, entre otros. Según le indique el profesor), con la ayuda de la pipeta Pasteur y colocarlos dentro del tubo con tapa de baquelita estéril. 2. Rotular el tubo con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y lugar.
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3. Sembrar la muestra en una placa de Petri con medio Sabouraud o Lactrimel según le indique el profesor. 4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profesor, turno, fecha y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma. 5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad práctica. Tierra: Materiales: 1 placa de Petri vacía y estéril, 1 placa de Petri con medio de cultivo Sabouraud o Lactrimel, 1 baja lengua estéril, 1 tubo con tapa de baquelita que contenga 1 ml de solución salina fisiológica (estéril). 1. Recolectar la tierra con baja lengua estéril y colocarla en la placa de Petri estéril, vacía. 2. Llevar al laboratorio. Agregar una porción de tierra con la ayuda de un baja lengua estéril dentro del tubo que contiene 1 ml de solución salina fisiológica (SSF), mezclar para homogeneizar. 3. Agregar esta mezcla (Tierra+SSF) en la superficie de la placa de Petri con agar Sabouraud o Lactrimel. 4. Rotular la placa con el número del equipo de trabajo, profaesor, turno, fecha y lugar. Sellar la placa con papel parafilm o tirro alrededor de la misma. 5. Incubar la placa a temperatura ambiente hasta la próxima actividad
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práctica. Luego de la incubación por una semana a temperatura ambiente, realizar el estudio macroscópico de las colonias aisladas (a simple vista), anotando: color, presencia de pigmento, textura, bordes de la colonia. Realizar también el estudio microscópico a través del reconocimiento de las especies por medio de la morfología de las esporas.

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ACTIVIDAD PRÁCTICA: 1. Describa las características macroscópicas de un hongo filamentoso y de un hongo levaduriforme en medio de cultivo preparado en tubo y en placa de Petri, siguiendo el siguiente esquema:
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS COLOR TAMAÑO DE LA COLONIA HONGO FILAMENTOSO HONGO LEVADURIFORME

ASPECTO

2. Describa las características microscópicas de un crecimiento micelial y uno levaduriforme en láminas proporcionadas por el profesor, siguiendo esquema. Dibuje las estructuras observadas.

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

HONGO FILAMENTOSO

HONGO LEVADURIFORME

MICELIO

PRODUCCIÓN, TAMAÑOY DISPOSICIÓN DE LAS CONIDIAS

3. Realizar el aislamiento de hongos contaminantes del medio ambiente: aire, agua y tierra.

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