You are on page 1of 12

Laboratory Activity Report

Fundamentals of Biomedical Science IV
Faculty of Medicine Universitas Islam Bandung

I. ISOLATION OF DNA

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu
DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang
mengandung sel berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur
dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan isolasi
DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan
tersebut relatif mudah diperoleh.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA
suatu organisme, baik dengan metode PCR (polymerase chain
reaction) atau menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA
fingerprinting”). Hasil pemeriksaan dari kedua teknik tersebut
kemudian dapat digunakan untuk diagnosis penyakit infeksi yang
disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi adanya mutasi gen
yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter,
menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik
dalam bidang kedokteran.

A. Tujuan
Mengetahui cara mengisolasi DNA dari sample darah

B. Prinsip Kerja
a) memecahkan membran
b) memisahkan DNA dengan protein
c) memisahkan DNA dengan organel

Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]]

1
0

buang supernatant yang tertinggal dan ambil pellet WBC Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 . Mengambil DNA dari sampel darah yaitu sel darah putih dengan cara memisahkan sel darah merah dan menghancurkan membran inti sel darah putih dan juga memisahkan protein yang menempel pada DNA sehingga kita mendapatkan hasil akhir pellet DNA. RBC (red blood cell)lysis solution (150mM NH4CL. Prosedur 1. RNAse (10mg/ml) 5.5 mM EDTA. Ammonium acetate 5M 6. C. Isopropanol 7. 2. 10 mM KHCO3. Eppendorf tube D.0. Alat dan Bahan 1.000 rpm selama 20 detik. 0. KOH) 3. Ethanol 70% 8. 1 ml EDTA blood 2. Kocok tube 2-3 kali selama persiapan.000-16. ini dapat merusak sampel. Jangan sampai sampel didiamkan pada RBC lysis solution selama beberapa lama.25 mM EDTA. Masukkan 300 µl darah + 900 µl (3x volume darah) RBC lysis solutions ke dalam Eppendorf tube.5 % SDS) 4. 0. Cell lysis solutions (10mM Tris –HCL pH 8. TE buffer 9. Inkubasi sampel selama kurang lebih 10 menit pada suhu ruangan. Centrifuge dalam suhu ruangan pada 13.

Kocok tabung dengan dibolak-balik sebanyak 25-30 kali hingga pellet DNA berwarna putih terlihat (pastikan semua pellet terlihat). Tuangkan supernatant dan tambahkan 300 µL ethanol 70%. tambahkan 300 µl cell lysis solution ke dalam tabung centrifuge dan pipet larutan sehingga sel lisis (pastikan larutan menjadi homogen) 4. 5. tambahkan 100 µl protein precipitation solution (5M ammonium acetate) ke dalam tabung centrifuge lalu vortex hingga larutan terlihat seperti susu.000 rpm selama 1 menit. Kocok beberapa kali untuk mencuci DNA. Centrifuge pada 13. Centrifuge pada 13. 9. Lalu tuangkan supernatant yang mengandung DNA ke dalam eppendorf tube yang bersih yang terisi 300 µl isopropanol. tambahkan 1. Lalu ulangi langkah 1 hingga semua RBC hilang. 3. Untuk mengendapkan protein. DNA akan terlihat sebagai pellet berwarna putih.5 RNAse A (10mg/ml) ke dalam tabung centrifuge. Lalu vortex agar pellet terpisah pada bagian bawah supernatant.000 rpm selama 3 menit .000-16. 6. Ini bisa berlangsung lebih lama. Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 . lakukan langkah ini pada suhu ruangan. protein yang mengendap akan berbrntuk pellet berwarna coklat terang. yang terlihat. 7. 8. Jika pellet protein tidak terlihat ulangi langkah 5. 10.000-16. Campur larutan dengan mengocok beberapa kali lalu inkubasi pada suhu 37o C dalam water bath selama 15 menit. Lalu vortex hasil dari pengulangan langkah 1 hingga semua sel darah merah hilang.

Hasil Didapatkan pellet DNA yang berwarna putih dalam larutan hasil isolasi DNA F. Kesimpulan Isolasi DNA dilakukan dengan cara memisahkan WBC dari RBC dan menghancurkan membran inti sel WBC dan mendapatkan DNA. Simpan pada suhu 37o C dalam water bathselama 2 jam untuk mendapatkan larutan DNA. Hidrat ulang DNA dalam 100 µl TE. Gunakan cotton swab untuk menghilangkan supernatant yang berlebihan pada sisi tabung. Simpan pada suhu – 20o C E. Putar lagi dan tuangkan 70% ethanol. 12. Lalu biarkan DNA mongering. 13.11. Pastikan larutannya homogen. Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .

Isolasi DNA sangat berguna untuk mendiagnostik penyakit. PCR merupakan teknik yang sensitive. A. POLYMERASE CHAIN REACTION PCR ( Polimerase Chain Reaction) Adalah suatu teknik untk mensintesis asam nukleat atau gen tertentu in vitro secara enzimatis. Tujuan Untuk mengetahui cara dan proses Polimerase Chain Reaction B. kepentingan forensik. Prinsip Kerja Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 . spesifik dan singkat. Laboratory Activity Report Fundamentals of Biomedical Science IV Faculty of Medicine Universitas Islam Bandung II. Penggunaan PCR untuk membandingkan gen klon abnormal dengan gen klon serta analisis forensic evolusi untuk jaringan. dll.

Pada siklus yang ketiga produk yang dihasilkan tidak memperlihatkan segmen aslinya lagi. Templat DNA (kromosom/plasmid/molekul DNA dari mitokondria) b. Alat dan Bahan Reagents : a. dan ekstensi. Produk siklus pertama akan menjadi templat bagi siklus kedua. Amplifikasi (perbanyakan) enzimatik suatu fragmen DNA yang di apit oleh primer oligonukleotida. b. annealing. Dan produk selanjutnya adalah amplifikasi dari segmen yang baru ini. Teknik reaksi rantai polymerase berdasarkan: a. Produk yang dihasilkan pada dua siklus pertama akan menunjukkan ukuran yang heterogen. C. Pengulangan siklus pemanasan yang terdiri dari proses denaturasi. demikian pula produk yang kedua akan menjadi templat yang ketiga. dan seterusnya. Sepasang primer (Oligonucleotide primer) control A primer contents of 24 nucleotides : 5’CAA TGT ACT ATG ACCT CTT TGC AGG A 3’ common B primer contents of 25 nucleotides : 5’GAG TCA AGG CTG AGA AGA TGC AGG A 3’ common C primer contets of 20 nucleotides : 5’ ACC TCA CCC TGT GGA GCC AC 3’ IVS1-nt5 mutant primer contents of 30 nuclotide : 5’ CTC CTT AAA CCT GTC TTG TAA CCT TGT TAG 3’ IVS1-nt5 normal primer contents of 30 nuleotides : 5’ CTC CTT AAA CCT GTC TTG TAA CCT TGT TAC 3’ Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .

01% gelatin d. they were : (stock solution concentration for each primer : 1µ M IVS1-nt5 mutant : control A primer Control B primer Control C primer IVS1-nt5 mutant primer IVS1-nt5 normal : control A primer Control B primer Control C primer IVS1-nt5 normal primer c.0 dNTP stock solution consists of : • 50 mM dATP (deoxyadenin triphophate) • 50 mM dTTP (deoxyadenin triphophates) • 50 mM dGTP (deoxyadenin triphophates) Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .3 50 mM KCL 1. neutralized by NaOH to pH 7. PCR buffer 10X 10mM tris pH 8.5 mM MgCl2 0. Empat macam deoksinukleotida trifosfat (dNTP) stock solution 10X Deoxynucleotide Trihosphates solution (perkin Elmer-Cetus). Variation of primer were used to detect mutan gene area.

0 µ l control C primer = 1.0 µ l IVS1-nt5 mutant = 1.0 µ l Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .5 ml consists of : PCR buffer solulion 10 X = 2.50 U f.5 µ l dNTP solution 10X =2.5 U =0.0 µ l primer : control A primer =1.0 µ l Sterilizes ddH2O = 15. taq DNA polymerase h. Prosedur 1.2 µ l Gemonic DNA = 1.0 µ l control B primer =1. mineral oil (paraffin liquid) D.0 µ l Taq polymerase 0. • 50 mM dCTP (deoxyadenin triphophates) e. make PVR mix for (in cold condition) : a) mutant PCR mix in eppendorf tube 0. poliberase (perkin Elmer-cetus) stock solution : 0. dd H2O all solution (1a-1e) were stored at – 20oC g.

while other reagents composition are same. Total = 25. centrifuge the solution at 5000 rpm in 30 seconds 4.0 µ l Taq polymerase 0. add 25 µ l paraffin liquid or mineral oil to 25 µ l PCR mix.0 µ l b) Normal PCR mix in eppendorf tube 0. The amplification program is: Denaturation : 93oC in 1 minute Annealing : 65oC in 1 minute 25 cycles Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .0 µ l control B primer =1. in order to avoid evaporation while incubate in high temperature 3.5 ml consists of : PCR buffer solulion 10 X = 2.5 U =0.0 µ l IVS1-nt5 normal = 1.0 µ l For each detection make blank PCR mix by changing genomic DNA with stelized ddH20 .5 µ l dNTP solution 10X =2.0 µ l Sterilizes ddH2O = 15. 2.2 µ l Gemonic DNA = 1.0 µ l primer : control A primer =1.0 µ l Total = 25. put all eppendorf tubes that failed by PCR mix into PCR machine or Programble thermal controller.

Denaturing : DNA akan berubah dari double strands ke single strand pada suhu 94-96 0C 2. dilakukan elektoforesis.5 minute Extra extension : 72oC in 3 minute. than 4oC to store the PCR product. Extension : ditambahkan enzim polimerase sehingga primer akan bertambah panjang oleh bantuan enzim Taq DNA pada suhu 72 0C Untuk mencegah penguapan setelah seluruh isi campuran tabung lengkap terakhir ditambahkan paraffin. Untuk mengetahui keberhasilan PCR. Kemudian pita DNA hasil reaksi PCR dapat di deteksi pada ruang gelap dengan bantuan sinar UV. annealing 055 C dan extention pada 72 0C. Extension : 72oC in 1. Annealing : kemudian suhu di turunkan menjadi 50-65 0C sehingga DNA yang single strand akan berikatan dengan primer pada templat 3. Pemanasan awal dilakukan pada suhu 95 0 C kemudian diikuti dengan tahap pertama siklus pada suhu 94 0C. siklus secara otomatis diulang sampai jumlah DNA terdeteksi. Proses 1. Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .

Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .

2010. DAFTAR PUSTAKA • Laboratory Manual : Fundamentals of Biomedical Science IV. Faculty of Medicine Universitas Islam Bandung Laporan ‘Laboratory activity report_case1’thalasemia’_FBS IV [[by: Kelompok M]] 1 0 .