You are on page 1of 485

PAUL SINGLETON

Bakterie
w biologii, biotechnologii i medycynie
tłumaczenie zbiorowe pod redakcją naukową Zdzisława Markiewicza

Dane oryginału:
Bacteria in Biology, Bacteriology and Medicine

Paul Singleton Fifth edition Copyright © 1981, 1992, 1995, 1997 and 1999 by John Wiley & Sons Ltd. Baffins Lane, Chichester, West Sussex PO 19 1UD, England AU rights reserved. Authorised translation from the English language edition published by John Wiley & Sons Ltd.

Okładkę i strony tytułowe projektowała Maryna Wiśniewska Fotografia na okładce (pochodząca z wydania angielskiego): barwienie Grama żywych komórek wykorzystujące preparat fluorescencyjny BacLight™: Bacillus cereus (gramdodatnia, pomarańczowa); Pseudomonas aeruginosa (gramujemna, zielona). Szczegóły barwienia podano w sekcji 14. 9. 1. 1. Zdjęcie dzięki uprzejmości Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA. Redaktor Krystyna Mostowik Redaktor techniczny Jolanta Cibor

Podręcznik akademicki dotowany przez Ministerstwo Edukacji Narodowej

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA Warszawa 2000

ISBN 83-01-13212-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SA ul. Miodowa 10, 00-251 Warszawa, tel.: 659 43 21 e-mail: pwn@pwn. com. pl http: //www. pwn. com. pl

Spis treści
Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście Przedmowa do wydania polskiego Przedmowa do wydania angielskiego 1 Bakterie - wprowadzenie 1. 1 Co to są bakterie? 1. 2 Dlaczego badamy bakterie? 1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii 2 Komórka bakteryjna 2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie 2. 3 Formy nitkowate i cenocyty 3 Wzrost i rozmnażanie 3. 1 Warunki wzrostu 3. 2 Wzrost pojedynczej komórki 3. 3 Wzrost populacji bakteryjnych 3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) 3. 5 Pomiar wzrostu 4 Różnicowanie 4. 1 Cykl życiowy Caulobacter 4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming) 4. 3 Komórki spoczynkowe 4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia 5 Metabolizm I - energia 5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów 5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów 5. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 5. 4 Systemy transportu 6 Metabolizm II - węgiel 6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów 6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów 6. 3 Synteza, wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 6. 4 Metylotrofia u bakterii 7 Biologia molekularna I - geny i ich wyrażanie się 7. 1 Chromosomy i plazmidy 7. 2 Kwasy nukleinowe - struktura 7. 3 Replikacja DNA VIII IX XI 1 1 3 4 6 6 10 34 36 36 41 49 55 55 56 56 58 59 63 66 67 80 83 86 95 96 97 98 104 106 106 107 112 V

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA 7. 5 Synteza RNA - transkrypcja 7. 6 Synteza białka 7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA 7. 8 Regulacja ekspresji genów 7. 9 Bakteryjny RNA

118 120 122 130 133 155

8 Biologia molekularna II - zmienianie informacji genetycznej 157 8. 1 Mutacje.. .......................................................................................................... 157 8. 2 Rekombinacja................................................................................................... 162 8. 3 Transpozycja........................................................................................................ 163 8. 4 Przekazywanie (transfer) genów 167 8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne techniki związane z analizą DNA 175 9 Bakteriofagi 231 9. 1 Fagi wirulentne — cykl lityczny................................................................ 233 9. 2 Fagi umiarkowane — lizogenia................................................................ 239 9. 3 Fagi męskie 241 9. 4 Konwersja fagowa 241 9. 5 Transdukcja.......................................................................................................... 242 9. 6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? 243 10 Bakterie w świecie ożywionym 244 10. 1 Zespoły mikroorganizmów 244 10. 2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty 247 10. 3 Bakterie a obieg materii 249 10. 4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody ("lodotwórcze") 257 10. 5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? 257 10. 6 Efekt cieplarniany 259 10. 7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku 260 10. 8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne 260 11 Bakterie w medycynie 262 11. 1 Bakterie jako patogeny 262 11. 2 Drogi infekcji 263 11. 3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby 274 11. 4 Mechanizmy obronne gospodarza 281 11. 5 Patogen — czynniki wirulencji 296 11. 6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa.. 306 11. 7 Rozprzestrzenianie się choroby 306 11. 8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium 307 11. 9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych 312 11. 10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii 313 11. 11 Niektóre schorzenia bakteryjne 314 12 Bakteriologia stosowana I — żywność 12. 1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności 12. 2 Środki zapobiegające psuciu się żywności 12. 3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych 13 Bakteriologia stosowana II - różnorodne aspekty 13. 1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin 13. 2 Biokopalnictwo (bioługowanie) 320 320 322 327 334 334 336

VI

13. 3 Biologiczne proszki do prania 337 13. 4 Oczyszczanie ścieków 337 13. 5 Skąd pobieramy wodę? 342 13. 6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka 348 13. 7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol 348 13. 8 Bioremediacja................................................................................................... 349 14 Nieco praktycznej bakteriologii 350 14. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium 350 14. 2 Podłoża bakteriologiczne................................................................................. 351 14. 3 Techniki aseptyczne 355 14. 4 Narzędzia bakteriologa 357 14. 5 Metody inokulacji 358 14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów 359 14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych 362 14. 8 Liczenie bakterii 363 14. 9 Barwienie.......................................................................................................... 365 14. 10 Mikroskopia................................................................................................... 368 15 Człowiek przeciwko bakteriom 372 15. 1 Sterylizacja........................................................................................................... 372 15. 2 Dezynfekcja...................................................................................................... 376 15. 3 Antyseptyka............................................................................................... 378 15. 4 Antybiotyki.................................................................................................... 379 16 Identyfikacja i klasyfikacja bakterii 401 16. 1 Identyfikacja....................................................................................................... 401 16. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotów 417 Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin, rzędów i innych kategorii bakterii Skorowidz 430 442

Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście
(Krótkie nazwy — Lancet, Nature, Science — nie są skracane)
AAC Antimicrobial Agents and Chemotherapy AEM Applied and Environmental Microbiology ARB Annual Review of Biochemystry ARM Annual Review of Microbiology ARP Annual Review of Physiology BBA Biochimica et Biophisica Acta BC Biodiversity and Conservation BCID Bailliere's Clinical Infectus Diseases BR Biological Reviews CCM Critical Care Medicine CMC Cell Motility and the Cytoskeleton CMI Clinical Microbiology and Infection COGD Current Opinion in Genetics and Development EJB European Journal of Biochemistry FEMSIMM FEMS Immunology and Medical Microbiology FEMSME FEMS Microbiology Ecology FEMSML FEMS Microbiology Letters FEMSMR FEMS Microbiology Reviews GD Genes and Development IJSB International Journal of Systematic Bacteriology INFIM Infection and Immunity JAC Journal of Antimicrobial Chemotherapy JAMA Journal of the American Medical Association JB Journal of Bacteriology JBC Journal of Biological Chemistry JBM Journal of Basic Microbiology (Berlin) JCB Journal of Cellular Biochemistry JCM Journal of Clinical Microbiology JGM Journal of General Microbiology JID Journal of Infectious Diseases JIM Journal of Immunology JINF Journal of Infection JMB Journal of Molecular Biology JMM Journal of Medical Microbiology JSB Journal of Structural Biology LAM Letters in Applied Microbiology MEHD Microbila Ecology in Health and Disease MM Molecular Microbiology MP Microbial Pathogenesis MR Microbiological Reviews NAR Nucleis Acids Research NB Nature Biotechnology NEJM New England Journal of Medicine PB Process Biochemistry PNARMB Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology PNAS Proceedings of the National Academy of Science of the USA PRS Proceedings of the Royal Society of London, Series B (Biological Sciences) PTRSLB Philosophical Transaction of the Royal Society of London, Series B RMM Reviews in Medical Microbiology SAM Systematic and Applied Microbiology TIBS Trends in Bichemical Sciences TIBTECH Trends in Biotechnology TIFS Trends in Food Science and Technology TIG Trends in Genetics TIM Trends in Microbiology TLD Tubercle and Lung Disease TREE Trends in Ecology and Evolution TRSTMH Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene

Przedmowa do wydania polskiego
Na książkę Paula Singletona Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie (czwarte

wydanie) trafiłem przeglądając niezmiernie bogaty zbiór podręczników do mikrobiologii w znanej nowojorskiej księgarni akademickiej Barnes & Nobles (mikrobiologia jest wciąż „modna" !). O mało jej nie przeoczyłem wśród znacznie większych, grubszych, a przede wszystkim niezwykle barwnie i bogato ilustrowanych tomów, często wzbogaconych płytą kompaktową. Na szczęście wpadła mi w ręce i, jak mniemam, bardzo dobrze się stało. Książka Singletona nie na darmo wcześniej była przekładana na kilka języków. Jest ona znakomitym, nowoczesnym podręcznikiem, podającym w dobrze zorganizowany sposób podstawowe i niezbędne dla kursu mikrobiologii informacje, poszerzone o różne ciekawostki i fakty. Mimo skromniejszej szaty graficznej od wspomnianych wyżej podręczników, nie ustępuje im jakością, tym bardziej że zwraca uwagę na różne aspekty działalności bakterii i ich wykorzystania, często pomijane przez innych autorów. Główna część książki zajmuje się fizjologią bakterii, gdyż to różnorodność przeprowadzanych przez nie procesów metabolicznych stanowi o zastosowaniu tej grupy organizmów w wielu procesach przemysłowych (biotechnologia). Bakterie przeprowadzając swoje procesy życiowe przekształcają otaczające je środowiska, w tym środowiska organizmów żywych, co może prowadzić do powstania objawów chorobowych. Singleton pisze o wielu z tych procesów (o wszystkich nie sposób) i podaje przykłady różnych mechanizmów chorobotwórczych. Rozdział 11 kończy się zbiorem krótkich opisów najczęstszych schorzeń człowieka powodowanych przez bakterie. Godne podkreślenia są wyczerpujące opisy współczesnych technik biologii molekularnej znajdujących zastosowanie np. w diagnostyce wielu chorób lub wyjaśnieniu przyczyn lekooporności. W książce jest bardzo wiele prostych, ale przez to łatwo zrozumiałych rycin, oraz kilkadziesiąt zdjęć. Zaangażowanie osobiste i entuzjazm Paula Singletona zaowocował przystąpieniem do tłumaczenia piątego, zmienionego i rozszerzonego wydania, a nie czwartego, i to w niewiele tygodni po jego ukazaniu się w Wielkiej Brytanii. Do końca kwietnia 2000 Paul Singleton przesyłał na moje ręce uzupełnienia oraz drobne poprawki do wydania angielskiego. Stąd w polskim wydaniu Bakterii są powołania na pozycje literaturowe (jedna z wielu zalet tej książki) z bieżącego roku i jest ono bardziej aktualne niż jego pierwowzór. Przekładu podjął się zespół pracowników Instytutu Mikrobiologii, Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, który w większości we współpracy z PWN uczestniczył już w wydaniu, przekładzie lub unowocześnieniu pokaźnej
IX

który składając wspólne dzieło wielu osób nadał mu taki kształt. W tym miejscu gorące podziękowania należą się pani redaktor Krystynie Mostowik z PWN. która podjęła się trudnego zadania ujednolicenia terminologii i stylistyki tekstu tłumaczonego przez siedmiu mikrobiologów o często różnym temperamencie i sposobie pisania oraz Markowi Woźniakowi z Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego.liczby książek z zakresu mikrobiologii. Zdzisław Markiewicz . jaki trafia do rąk szacownego Czytelnika.

wyjaśnia podstawy prezentacji cząsteczek na powierzchni komórki (biotechnologia) oraz wyjaśnia tło patogenezy dyzenterii (medycyna). INSERM U411. fuzję genową z wykorzystaniem „białka fluoryzującego na zielono". wykorzystujące techniki oparte na DNA. a jednocześnie wyczerpująco. Innogenetics (Belgia). cyklu komórkowego. Wybierając materiał do książki. VIII. a klucz do skrótów odpowiadających tytułom czasopism umieszczono na s. W tekście znajdują się pozycje literaturowe umożliwiające Czytelnikowi uzyskanie bardziej szczegółowych danych lub poszerzenie wiadomości. badania patogenezy in vivo (np. Paryż. mutagenezę transpozonową.odgrywająca bardzo dużą rolę we współczesnej metodologii — opisana jest krótko. Gen-Probe (USA). rozszerzony opis fuzji genowych odzwierciedla znaczenie tej techniki w bardzo różnych badaniach (np.Przedmowa do wydania angielskiego Książka Bakterie omawia zagadnienia mikrobiologiczne odzwierciedlające współczesne osiągnięcia nauki i ujmuje je w sposób zintegrowany W piątym jej wydaniu znacznie poszerzono część dotyczącą fizjologii bakterii oraz roli tych organizmów w wybranych działach medycyny i biotechnologii. Pharmacia (Szwecja) i Roche (Wielka Brytania). IVET. Oxoid (Wielka Brytania). Harshey. Uniwersytet Teksasu. Perkin Elmer (USA). Chiron Diagnostics (USA). Technika PCR . Z kolei. Różne firmy uprzejmie udostępniły informacje dotyczące swoich produktów: Abbot Diagnostics (USA). nowa sekcja omawiająca odpowiedź na stres tlenowy szerzej zajmuje się regulacją genetyczną i również wyjaśnia mechanizm oporności na izoniazyd (lek stosowany przeciw prątkom). Rasika M. Wprowadzenie w tym wydaniu opisu sekrecji typu IV białek służy co najmniej trzem celom: poszerza wiedzę na temat mechanizmów transportowych (biologia). Boehringer Mannheim (RFN). Molecular Probes (USA). Tego typu podejście pozwoliło na większy zakres informacji. Dynal (Norwegia). Szczególne wdzięczny jestem następującym doktorom: Chantal de Chastellier. mutageneza typu STM). Pozycje te wydrukowano w nawiasach kwadratowych. priorytet dano informacjom ważnym w różnych kontekstach. Postęp w nauce często jest odzwierciedleniem rozwoju w postaci nowych lub ulepszonych metod. tworzenia endospor). XI . rozdział immunomagnetyczny oraz badanie oporności na antybiotyki. By nie być gołosłownym. zdjęcia lub materiał przygotowany do druku. Podano również zasady technologii „DNA-chip". W wydaniu tym opisano zatem liczne nowe udoskonalenia w technologii — a więc: nowe sondy DNA i RNA (sondy świetlne). Wielu ludzi szczodrze udostępniło publikacje.

Chciałbym złożyć podziękowania za niezwykle cenną pomoc ze strony Biblioteki Medycznej Uniwersytetu w Bristolu oraz SRIS przy Bibliotece Brytyjskiej w Londynie. Słowacka Akademia Nauk. Imrich Barak. których zawodowe umiejętności bardzo przyczyniły się do publikacji tej książki. 1999 . Szpital Pellegrin.Austin. Houston oraz Lurdews Monteiro. Bordeaux. jestem bardzo wdzięczny paniom Sally Beveridge i Lisie Tickner (Nauki Medyczne i Przyrodnicze) oraz innym członkom zespołu wydawnictwa John Wiley (Chichester). Paul Singleton Clannaborough Barton. Devon Styczeń. Na koniec. Uniwersytet Teksasu. William Margolin.

pierwotniaki. mleko "kwaśnieje". 1 Co to są bakterie? Bakterie są niewielkimi organizmami. O ich istnieniu nie wiedziano aż do momentu wynalezienia mikroskopu w XVII wieku.ROZDZIAŁ 1 Bakterie . grzyby. Jedna z hipotez zakłada. Wynika stąd. obejmuje kilka odmiennych typów organizmów — glony. która znacznie odbiega od organizacji komórek eukariotycznych zwierząt i roślin. Powinno się także rozróżniać „mikrobiologię" (naukę o mikroorganizmach) i „bakteriologię" (naukę o bakteriach). że prokarioty można podzielić na dwie 1 . że wywodzą się one ze związków symbiotycznych o podłożu energetycznym. autonomiczną komórką. mięso „psuje się". oprócz bakterii. 1 Notka na temat stosowania terminu „bakterie" Powszechnie stosowany termin „bakterie" często określa ogólnie „organizmy prokariotyczne" — i w tym znaczeniu odnosi się do wszystkich prokariotów. wirusy. lecz nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Eukarioty prawdopodobnie pojawiły się około 2-3. Bakterie są bardzo małe. a drugiej z domeny Archaea (patrz niżej) [hipoteza wodorowa: Martin i Muller (1998) Nature 392: 37-41].wprowadzenie 1. 1 (cechy prokariotyczne zawarte w tabeli opisano dokładniej w dalszych rozdziałach). 1. W większości przypadków bakteria jest pojedynczą. które występują prawie wszędzie. Bakterie zalicza się do kategorii „mikroorganizmów". Grupa ta. Niektóre z różnic przedstawiono w tabeli 1. niekiedy jednak nie budzi ona wątpliwości — rany ulegają zakażeniom. do których doszło pomiędzy dwoma rodzajami komórek prokariotycznych: jednej z domeny Bacteria. 1. 5 miliarda lat temu [Doolittle i wsp. Zazwyczaj nie zdajemy sobie sprawy z ich obecności. że wszystkie bakterie są mikroorganizmami. porosty. Ma ona budowę prokariotyczną. Badania molekularne wykazały jednak. (1996) Science 271: 470-477].

używany w książkach i czasopismach termin „bakterie" często określa specyficznie kilku. takich jak gleba [Bintrim i wsp. 1) grupuje organizmy. Z tego powodu. W niniejszej książce „bakterie" to przedstawiciele domeny Bacteria. w zależności od kontekstu. Woese i Overbeek (1994) JB 176: 1-6]. Wiele gatunków Archaea żyje w ekstremalnych środowiskach. są omówione w dalszych rozdziałach. (1997) PNAS 94: 277-282]. Czytelnik sam powinien próbować ocenić jego znaczenie. w którym jest on użyty. które uprzednio zaklasyfikowano do królestwa Archaebacteria. Domena Archaea (patrz rys. Niektóre z nich występują jednak w środowiskach umiarkowanych. 2 . 1. charakteryzujących się wysoką temperaturą. dużym zasoleniem itp. [dodatkowe informacje: Horikoshi (1998) Extremophiles (ISBN 0471 026182)]. bądź wszystkich przedstawicieli domeny Bacteria. odróżniające te organizmy od „prawdziwych bakterii". Opisane tu zostały prawie wyłącznie organizmy tej grupy. Różne aspekty biologii archeonów.zasadniczo różne grupy (domeny): domenę Bacteria i domenę Archaea [zagadnienie to zostało omówione w: Olsen. ile archeonów (a także bakterii) pozostaje nadal niezidentyfikowanych. Jest to mniejsza z dwóch grup prokariotów — chociaż nie wiemy. natomiast istnieją gatunki bakterii związane z warunkami ekstremalnymi.

jest wykorzystywany jako środek żelujący i zagęszczacz w przemyśle spożywczym. wywołujące choroby) opisano w rozdziale 11. weterynarii oraz rolnictwie. Jeszcze inne wykorzystuje się jako „mikrobiologiczne insektycydy" — chroniące plony przed działaniem pewnych owadów — szkodników.1. Być może wyda się to dziwne. bakterie zwykle źle się kojarzą. Większość bakterii powoduje niewielkie szkody. a także ługowania metali z ubogich rud lub trudno poddających się procesom metalurgicznym ang. które nadają tym produktom charakterystyczny smak. bądź nie wyrządza ich wcale. przyczyniają się bowiem do jej psucia się oraz powodują zatrucia pokarmowe. wytwarzany przez niektóre szczepy bakterii. 7). podczas gdy inne dostarczają enzymów np. 12). sera i jogurtu pewne bakterie dokonują przemiany cukru zawartego w mleku (laktozy) na kwas mlekowy. 2). Zapobieganie tym chorobom oraz ich zwalczanie zależy w znacznym stopniu od wysiłku bakteriologów specjalizujących się w medycynie. Wiele z nich jest dla nas pożytecznych. ale bakterie wykorzystuje się powszechnie w przemyśle spożywczym (rozdz. na przykład. Niektóre bakterie. które zrewolucjonizowały medycynę. 3 . Ksantan. Bakterie patogenne stanowią jedynie niewielki procent wszystkich bakterii. Również ocet winny jest produkowany z alkoholu (etanolu) dzięki działalności bakterii. Bakterie znalazły też zastosowanie do wytwarzania tworzyw sztucznych. 2 Dlaczego badamy bakterie? Ważnym powodem jest walka z chorobami. Bakterie patogenne (tzn. które ulegają biodegradacji („Biopol" — sekcja 13. do „biologicznych" proszków do prania. przy wytwarzaniu masła. Bakterie wywołują kilka poważnych oraz wiele mniej groźnych chorób. Bakterie wytwarzają także związki. Gdy mowa o żywności. wytwarzają antybiotyki. biomining — sekcja 13. Jednak niektóre rodzaje bakterii uczestniczą w produkcji żywności. Na przykład. Bakterie stosuje się także w produkcji kakao i kawy.

tym lepiej możemy ograniczyć ich szkodliwe działanie oraz pełniej wykorzystywać aktywność pożyteczną. rodziny. np. 10). W rozdziałach 12 i 13 przedstawiono sposoby działania kilku pożytecznych bakterii. Rodzaj klasyfikacji przedstawiony wyżej. Bakterie glebowe wpływają na żyzność i strukturę gleby. nie zawsze odzwierciedla ewolucyjne pokrewieństwo między bakteriami. powszechnie wykorzystywane do klasyfikacji (i identyfikacji) bakterii. a także. Bakterie (i ich składniki) są bardzo ważne w medycynie. 10). Bakterie odgrywają znaczącą rolę w naturalnych cyklach krążenia materii (rozdz. Gatunek może być podzielony na dwa lub więcej szczepów. przemyśle i rolnictwie. warunkami fizycznymi koniecznymi do wzrostu oraz sposobem barwienia z zastosowaniem niektórych barwników. Poznanie sposobów funkcjonowania tych organizmów pozwoli lepiej gospodarować gruntami i zbiorami. Istnieje potencjalne zagrożenie wykorzystywania bakterii do produkcji broni biologicznej i zastosowania ich w teroryzmie. bakterie są klasyfikowane w kategoriach ułożonych hierarchicznie. grupujących organizmy nieznacznie różniące się od siebie. wymaganiach pokarmowych. rodzaje. Schweitzer i Dorsch (1998) Superterrorism. Gatunki wystarczająco do siebie podobne są zaliczane do tego samego rodzaju. które ostatecznie są podstawą całego życia biologicznego.Niektóre z opisanych aktywności można zrozumieć dzięki poznaniu reakcji chemicznych (metabolizmu) przeprowadzanych przez komórki bakteryjne (rozdz. strukturą. 5. rodzajem pobieranego pokarmu. a rodzaje wykazujące pewien stopień podobieństwa są zgrupowane w rodzinie. chociaż użyteczny do wielu celów. kształtu i rozmiaru. Podobnie jak w innych działach biologii. wykorzystywać tę samą formę energii i w podobny sposób reagować na pewne barwniki. 1. Przedstawione wyżej cechy. aby można było wyżywić naszą stale rosnącą populację. w leczeniu zakrzepicy) (sekcja 8. warunkach wzrostu. aktywnością metaboliczną. co ma olbrzymie znaczenie dla rozwoju rolnictwa. w pewnej mierze. rozmiarem. lecz na podstawie definicji zaliczane do tego samego gatunku. mogą być z łatwością zbadane nawet w skromnie wyposażonym laboratorium. Kluwer Academic Publishers/Plenum]. Zasadniczo członkowie (powiedzmy) rodziny bakterii powinni mieć podobną strukturę. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii W jaki sposób odróżnia się jeden typ bakterii od drugiego i jak się je klasyfikuje? Bakterie mogą się różnić na przykład kształtem. 5 i 6). Od około dziesięciu lat prowadzi się badania mające na celu określenie najbardziej 4 . formą wykorzystywanej energii. Gatunki w takiej rodzinie mogą być łączone w rodzaje na podstawie różnic w aktywnościach metabolicznych. że im więcej wiemy o bakteriach. gatunki. Będzie to w przyszłości konieczne. Z tego krótkiego wprowadzenia powinno być oczywiste. Kwestia ta została omówiona w kilku ostatnio opublikowanych książkach [np. Jednym z przykładów wykorzystania rekombinacyjnej technologii DNA jest produkcja takich czynników jak streptokinaza (stosowana np.

Actinomycetales). Enterobacteriaceae). bądź być przejawem braku akceptacji dla pewnych zmian taksonomicznych. aby znaczenie skrótu było zrozumiałe. do którego należy dany organizm. Składa się ona z: 1) nazwy rodzaju. Na przykład Escherichia coli ma nazwę rodzaju (Escherichia) i określenie (coli). Nazwy te mają także standardowe końcówki. Nazwa rodzaju zawsze rozpoczyna się wielką literą. i następującego po niej 2) „specyficznego epitetu". Podobnie jak w przypadku zwierząt i roślin. jest bardzo powszechnym organizmem eksperymentalnym — nazwa i pisownia tego rodzaju powinny więc być ogólnie znane). gdy pisana odręcznie. każdemu gatunkowi bakterii nadano łacińską. coli. pełniącego funkcję etykiety dla każdego z gatunków. które zostały stworzone przez International Commitee of Systematic Bacteriology. (E. Jednak. często wspominana w tej książce. Nazwę gatunku można przedstawić w niepełnej formie skracając nazwę rodzaju — np. dwuczłonowa nazwa jest drukowana kursywą lub. a rzędów — końcówkę „-ales" (np. Ten aspekt klasyfikacji przedstawiono w dalszych rozdziałach. Escherichia coli może być zapisana E. Według przyjętej konwencji.podstawowych cech bakterii. dwuczłonową nazwę. Może to wynikać z nieznajomości reguł lub wprowadzonych nazw. coli. gdy pełna nazwa rodzaju została wcześniej podana. . Nazwy rodzin i rzędów bakterii nie są pisane kursywą i wszystkie rozpoczynają się wielką literą. Nazwa rodziny zawsze ma końcówkę „-aceae" (np. można go zastosować jedynie wtedy. Korzyści wynikające z międzynarodowej standaryzacji systemu nazewnictwa są oczywiste. łacińska. lecz nie zawsze reguły te są stosowane w literaturze. zaś nazwa epitetu — małą. podkreślona pojedynczą linią. Nazewnictwem bakterii formalnie rządzi wiele reguł. które odzwierciedlałyby główne drogi ich ewolucji.

rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 2. W końcu są także promieniowce. Zgrupowane lub zmasowane strzępki nazywa się grzybnią. 2. Ponadto. Wyniki badań prowadzonych nad ewolucją morfologii bakterii sugerują. Na przykład niektóre ziarniaki mają kształt nerkowaty. a gdy powstał. Wygięte pałeczki określa się jako przecinkowce. których większość gatunków. 1. zależnie od kształtu i właściwości. Różne kształty bakterii przedstawiono na rysunku 2. 1 Kształty. coccobacilli). 1 i na fotografiach 2.ROZDZIAŁ 2 Komórka bakteryjna 2. 2. mają bardzo zróżnicowany kształt. że stałe formy morfologiczne. wydaje się prawdopodobne. Okrągłe lub kuliste komórki każdego gatunku nazywane są ziarniakami. Ziarniak może więc być zdegenerowaną formą pałeczki. 4). a niektóre pałeczki o spiczastych końcach — wrzecionowaty. zależnie od gatunku. 1. nazywanych strzępkami (rys. Istnieją też tak zwane „bakterie kwadratowe" (o kształcie bardzo płaskich prostopadłościanów) i „pudełkowate" (tworzące wielościany o nieregularnych kształtach). lewej części). są odzwier- 6 . Natomiast krętki i pozbawione ścian mikoplazmy powstały tylko raz w procesie ewolucji bakterii. w dolnej. że kształt ziarniaków pojawił się niezależnie w wielu przypadkach (w różnych liniach bakteryjnych). 2. Wydaje się. podobnie jak grzyby. 1. widoczne u dzisiejszych bakterii. gdyż organizmy o takim właśnie kształcie mają najstarszy rodowód genealogiczny. Występują także owoidalne komórki. Ziarniaki nie zawsze są idealnie kuliste i nie wszystkie formy pałeczkowate mają dokładnie taki sam kształt. zaś formy wydłużone i pałeczkowate — pałeczkami lub laseczkami. o kształcie pośrednim między ziarniakami i pałeczkami (ang. rośnie w postaci cienkich nitek. zazwyczaj przetrwał do dzisiejszego dnia. Są również dwa rodzaje komórek spiralnych: jedne dość sztywne — śrubowce (fot. drugie giętkie — krętki (fot. że przedstawiciele domeny Bacteria wywodzą się od wspólnego przodka przypominającego pałeczkę. 1n). 1 Kształt Komórki bakteryjne.

2. 1. 2. 2. 2. 9. 7). to jednak u kilku gatunków poszczególne komórki różnią się między sobą — czasami bardzo znacząco. 9. . Zjawisko to nazywa się pleomorfizmem.ciedleniem zarówno biochemicznych i biofizycznych właściwości polimeru ściany komórkowej — peptydoglikanu (sekcje 2. rys. Chociaż kształt komórek danego gatunku bakterii jest zwykle w miarę jednolity. jak i kontroli genetycznej związanej z jego syntezą [Siefert i Fox (1998) Microbiology 144: 2803-2808]. 2.

8 .

Yamaguchi University School of Medicine. 9. 3 μm długości i 0. pojedyncze komórki lub w formie charakterystycznych zgrupowań. które mają około 250 μm długości. komórki Chlamydia). W zaplombowanym zębie: mikroorganizmy kolonizujące niewielką przestrzeń między plombą a ścianą zęba. Japonia i Society for General Microbiology. sekcja 2. Są one wytwarzane spontanicznie przez kilka gatunków bakterii lub. Drezno. 3 Układy tworzone przez komórki bakteryjne Bakterie danego gatunku mogą być widoczne pod mikroskopem jako oddzielne. Medizinische Akademie Carl Gustav Carus. co wynosi około 0. 1. W lewej dolnej części. Markusa B. W dolnej prawej części. 0001 mm. dr. Uniwerytet w Zurychu. Durrenbergera. 2. Preparat ten. Na drugim końcu skali znajdują się komórki Spirochaeta. Każda rzęska jest pokryta przedłużeniem komórkowej błony zewnętrznej (sekcja 2. Bakteria ta ma trzy rzęski (rys. 2. Fot. 1 Niektóre kształty. przylegający do powierzchni komórki nabłonka jamy ustnej. Withington Hospital. Londyn i Blackwell Scientific Publications Ltd. że wymiary najmniejszej bakterii znajdują się na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego. Typowa komórka Helicobacter pylori (x 21 000). 2. Escherichia coli dzięki uprzejmości dr. występujące w wodach słodkich. u innych. ruchliwe bakterie wiążące azot. Clements i Pace (1993) Nature 326: 239-241]. Pojedyncza komórka Escherichia coli: prosta pałeczka o zaokrąglonych końcach. King's College. μm (wcześniej nazywanych mikronami. Centralnie. Wydaje się. Zdjęcie Helicobacter pylori dzięki uprzejmości dr. Aquaspirillum peregrinum dzięki uprzejmości dr. komórki mogą występować w parach. 5 μm. Alana Curry. W górnej prawej części. 2. Bakterie ułożone w formie „kolby kukurydzy" dzięki uprzejmości prof. 1 μm = 0. Są to jednak krańcowe przypadki. Simonsiella dzięki uprzejmości dr Caroline Pankhurst. Niemcy. PHLS. Szwajcaria. pojawiają się po indukcji np. że bulwiaste struktury widoczne na końcach rzęsek są miejscami. Należy zwróć uwagę. Hisanori Konishi. 2 μm. Nazwa bakterii pochodzi od Lister Institute of Preventive Medicine w Londynie. 2.Komórkowe formy L mają kształt nerkowaty lub kulisty. która u około 25% ludzi wchodzi w skład mikroflory jamy ustnej. Zależnie od gatunku. Maksymalny rozmiar komórek większości gatunków wynosi od 1 do 10 μm. 2 Wielkość Wielkość komórek bakteryjnych zwykle określa się w mikrometrach. Komórki Aquaspirillum peregrinum. Każda rzęska ma około 3 μm długości. która zamieszkuje jelito ryby morskiej Acanthurus nigrofuscus [Angert. pod wpływem szoku termicznego lub innych rodzajów bodźców fizykochemicznych. Najmniejsze bakterie mają około 0. 14). gdzie błona została „napompowana" — prawdopodobnie jest to wynik technik stosowanych w mikroskopii elektronowej. Komórka na prawo ma około 7. Największą poznaną bakterią (600 μm) jest Epulopiscium fishelsoni. Ube. 9 . 2 μm (np. Manchester. w nieregularnych gronach. 2. Simonsiella — wielokomórkowa bakteria tworząca filamenty. wielkości i układy komórek bakteryjnych W lewej górnej części. Każda ze struktur przypominających kolbę kukurydzy jest złożona z dużej liczby małych ziarniaków (każdy o średnicy poniżej 1 μm) zgrupowanych na końcu strzępki — być może wskazuje to na układ symbiotyczny między dwoma rodzajami organizmów. 2. spiralnie skręcona pałeczka z przewodu pokarmowego człowieka. 1. 2). Wolfganga Klimma. mająca około 2 μm długości. 6 μm grubości. uwidacznia filament o długości około 3. μ). barwiony czerwienią rutenową.

Cytoplazma zawiera rybosomy — niewielkie ciała uczestniczące w syntezie białek. Rysunek 2. Niektóre rodzaje układów komórek przedstawiono na rysunku. Nukleoid jest zanurzony w cieczy o złożonej strukturze — cytoplazmie. uogólniony szkic komórki bakteryjnej. w których zachodzi 10 . nazywana nukleoidem. Pearl i Pickney (1996) Microbial Ecology 31: 225-247]. która wypełnia wnętrze komórki. cytoplazma. Komórki wielu gatunków formują długie łańcuchy połączonych ze sobą komórek (ang. wytwarzając cylindryczne struktury (proteasomy). Gatunek Pelodictyon clathratiforme jest dość niezwykły. Między błoną cytoplazmatyczną a ścianą komórkową znajduje się przestrzeń peryplazmatyczna. Na rysunku tym widoczny jest chromosom komórki — zwykle kolista. Niektóre bakterie mają więcej niż jedną rzęskę. jest sztywna (odporna mechanicznie) ściana komórkowa. włosowatą strukturą zbudowaną z białek. których wnętrze zawiera aktywne miejsca enzymatyczne. ponieważ nie zawiera wyspecjalizowanych struktur (jądro. 1). 7). a dwie lub więcej komórek może pozostać połączonych ze sobą po procesie podziału komórkowego. Czasami mówi się. nazywanych konsorcjami [patrz np. W warunkach naturalnych pewne bakterie występują w stabilnych. Nukleoid. 2. że komórka bakteryjna ma „prostą" budowę. jak i składem chemicznym. na poziomie molekularnym. wielogatunkowych zbiorowiskach komórek. w regularnych pakietach złożonych z czterech. tzn. 3. Nie istnieje więc bakteria o „typowej" budowie. Rzęska jest połączona z osłonami komórkowymi za pomocą wyspecjalizowanej struktury. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie Czy wszystkie bakterie mają podobną strukturę? Otóż nie: komórki poszczególnych gatunków mogą różnić się znacznie zarówno strukturą.w łańcuchach. jej przemieszczanie. 2 przedstawia schematyczny. Tworzą się one. Najbardziej zewnętrzną warstwą. 1. Czasami występują także ziarnistości zapasowe. trichomes) (sekcja 2. silnie zwinięta struktura DNA (rozdz. Są też takie. ułożonych w szeregu i przylegających do siebie. Umożliwia ona ruch komórki. Te różnorodne układy nie są wynikiem agregacji pojedynczych komórek. gdyż jego komórki tworzą trójwymiarowe sieci. bakterie stosują chytre i wyrafinowane strategie świadczące o wysokim stopniu ich strukturalnej i funkcjonalnej organizacji [Mayer (1993) FEMSMR 104: 327-346]. gdyż komórki różnych gatunków dzielą się (rozmnażają) na różne sposoby. które mają ich dużo bądź nie mają ich wcale. Na przykład w pewnych bakteriach (i niektórych archeonach) grupy enzymów proteolitycznych ulegają samoskładaniu. rybosomy i ziarnistości zapasowe są otoczone błoną cytoplazmatyczną (nazywaną także błoną komórkową lub błoną plazmatyczną). ośmiu lub większej liczby komórek. Jednak. 2. widoczną na rysunku 2. Te oraz inne cechy komórki bakteryjnej są opisane w dalszych sekcjach. mitochondrium) znajdowanych w komórkach eukariotycznych. 2. bądź w formie palisady tworzonej przez wiele. Rzęska jest cienką. Błonę cytoplazmatyczną i ścianę komórkową określa się łącznie jako osłony komórkowe (ang. cell envelope). Proteasomy typu 20S są analogiczne do struktur eukariotycznych. wydłużonych komórek. zawierające zapasy składników odżywczych itp.

7). rozwijanie i translokacja białek (przeznaczonych do degradacji) — to prawdopodobnie procesy zależne od ATP (jako że proteasomy mają miejsce wiązania dla ATPaz) [Prokariotyczne proteasomy: De Mot i wsp. Ponieważ wejście do proteasomu jest dość wąskie. nukleoid. mogą podlegać rytmom dobowym (sekcja 7. które muszą być degradowane w sposób pozwalający na uniknięcie niekontrolowanej komórkowej proteolizy. 12). 1 Nukleoid U większości bakterii chromosom jest kolistą cząsteczką kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) (opisany w rozdz. Ich zachowanie w zbiorowiskach może się różnić od zachowania pojedynczych. jedynie niezwinięte białka mogą się doń przedostać. 1. 1). 2. pojawiającej się podczas podziału komórki (fot. co wymaga udziału dynamicznych form regulacji [Dynamie spatial regulation in the bacterial cell: Shapiro i Losick (2000) Cell 89-98]. wyizolowanych komórek (sekcja 10. (1999) TIM 7: 88-92]. 1). Mogą nimi być uszkodzone lub nieaktywne białka. 4. 2. jednak u niektórych gatunków jest on liniowy.degradacja białek. tzw. U bakterii Escherichia coli 11 . Ponadto pewne bakterie. 3. 2). 8. Rozmieszczenie białek w komórce bakteryjnej wydaje się obecnie dużo bardziej uporządkowane niż wcześniej przypuszczano [Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718]. Staje się oczywiste. Przykładem wysokiego poziomu organizacji bakterii jest również obecność (krótkotrwała) szczątkowej formy cytoszkieletu. Podstawowym kryterium rozróżniania pewnych białek jest ich aktywność w określonych miejscach komórki bakteryjnej (sekcja. Silnie zwinięty DNA tworzy w komórce zwartą strukturę połączoną z błoną cytoplazmatyczną. tak jak organizmy wyższe. DNA jest związany z pewnymi rodzajami białek. Zakotwiczenie. Białkowe substraty bakteryjnych proteasomów nie są znane. jednak niektóre z nich są „stworzeniami socjalnymi". Chociaż z reguły bakterie to organizmy jednokomórkowe. które biorą udział w jego zwijaniu. że białka biorące udział w różnych procesach fizjologicznych pojawiają się w komórce w odpowiednim czasie i miejscu.

Bakteryjna cytoplazma nie ma odpowiednika retikulum endoplazmatycznego komórek eukariotycznych. ciałka R. w cytoplazmie niektórych gatunków może występować kilka unikatowych i interesujących struktur. może zawierać więcej niż jedną kopię chromosomu (rozdz. 7) i białek. W wyjątkowych przypadkach. zależnie od gatunku i warunków wzrostu. zaokrąglonymi strukturami. 3 Rybosomy Rybosomy są niewielkimi. podtrzymywaniem funkcji komórkowych oraz metabolizmem energetycznym. W pewnych warunkach mogą występować ziarnistości zapasowe. 3). Podobnie jak rybosomy. enzymy. 2. 13). nazywane magnetosomami [artykuł przeglądowy: Stolz (1993) JGM 139: 1663-1670]. 12 . 2 Cytoplazma Cytoplazma jest wodnistą cieczą zawierającą rybosomy. [The bacterial nucleoid revisited (artykuł przeglądowy): Robinow i Kellenberg (1994) MR 58: 211-232. Ważną rolę w utrzymaniu tej struktury odgrywają jony magnezu. powodują odpowiednie ułożenie komórek w polu magnetycznym. które rosną powoli. które są trujące dla wielu owadów. 1. w górnej części) i są miejscem syntezy białek (rozdz. Na przykład u E. tym rybosomy sedymentują szybciej. U niektórych wodnych bakterii niewielkie cząsteczki magnetytu (Fe3CO4). lecz przez określenie szybkości sedymentacji w ultrawirówce. o wielkości około 0. 2.chromosom ma około 1. Bakterie te wykorzystuje się w rolnictwie jako biologiczne insektycydy (rozdz. Występują one w dużej ilości w cytoplazmie (fot. Prawdopodobnie obie części rybosomu „trzymają się razem" dzięki wiązaniom wodorowym oraz oddziaływaniom jonowym i hydrofobowym. Wartość tę podaje się w jednostkach Svedberga (S). im jest ona większa. Inne bakterie (pasożyty pierwotniaków) zawierają tzw. będące ciasno zwiniętymi wstęgami zbudowanymi z elastycznego białka. DNA jest więc upakowany w komórce o długości zaledwie kilku mikrometrów — pozostawiając w niej jeszcze wiele wolnego miejsca! Pojedyncza bakteria. jony. Rybosomy charakteryzuje się zwykle nie na podstawie ich średnicy. ] 2. składniki pokarmowe. ale są podobne (rozmiarami) do rybosomów chloroplastów roślin i glonów. 2. 02 μm. Na przykład Bacillus thuringiensis zawiera czasami kryształy. zbudowanymi z RNA (polimer podobny do DNA — rozdz. U niektórych gatunków wszystkie komórki mają zwykle kilka kopii chromosomu. od którego głównie zależy funkcjonowanie tego ciała. Rybosomy bakteryjne są mniejsze od eukariotycznych. produkty przemiany materii i różnorodne cząsteczki związane z syntezami. 7). 3 mm długości. Każdy rybosom bakteryjny (70S) zawiera jedną podjednostkę 50S i jedną 30S (tak. 50S+30S=70S!). 8. Rybosom w około 70% jest zbudowany z RNA (rybosomowy RNA = rRNA). coli komórki szybko rosnące mają więcej chromosomów niż te.

coli podjednostka 30S ma 21 różnych rodzajów białek. 2. który może stanowić do 80% masy komórki. U niektórych gatunków granule PHB gromadzą się wtedy. które. (1999) Nature 400: 833-840]. z którego można korzystać. 2. 5 i 6). 5%. jak się uważa. że większa część regionu przylegającego do drugiej podjednostki (prawdopodobnie najważniejsza funkcjonalnie) zawiera RNA [Clemons i wsp.cząsteczki RNA również określa się w jednostkach Svedberga. 2. Do związków tych zalicza się poli-β-hydroksymaślan i polifosforan. gdy inne składniki odżywcze stają się bardziej dostępne. 3). Analiza krystalograficzna rybosomowej podjednostki 30S Thermus thermophilus potwierdziła wcześniejsze przypuszczenia. poly-β-hydroxybutyrate) jest liniowym polimerem β-hydroksymaślanu (rys. odzwierciedlają ich naturalne (ewolucyjne) pokrewieństwo. gdy wzrost komórki jest hamowany brakiem składników pokarmowych (innych niż źródło węgla). 1 Poli-β-hydroksymaślan Poli-β-hydroksymaślan (PHB. Odmienne sekwencje w pokrewnych organizmach mogą zatem świadczyć o ewolucyjnej rozbieżności między tymi organizmami. W danej cząsteczce rRNA nukleotydy są ułożone w określonej sekwencji kodującej. 4. 4 Ziarnistości zapasowe W pewnych warunkach wiele bakterii wytwarza polimery. U E. 2. Podjednostka 30S zawiera 16S rRNA. które są odkładane w cytoplazmie w formie ziarnistości. Rybosomowy RNA jest polimerem zawierającym cztery różne rodzaje podjednostek (nukleotydy). Enzymy biorące udział w syntezie PHB (a także prawdopodobnie enzymy depolimeryzujące) występują na powierzchni ziarnistości. W ostatnich latach cząsteczkę 16S rRNA wykorzystuje się do klasyfikacji bakterii w grupy. sekwencje cząsteczek 16S rRNA gatunków należących do tego samego rodzaju zwykle różnią się w co najmniej 1. Na przykład. 2. podczas gdy podjednostka 50S ma ich ponad 30. W tym przypadku związek ten zastępuje tlen. Sekwencje te wydają się pozostawać stosunkowo nie zmienione w ewolucyjnych odcinkach czasu. zawierającą głównie fazyny 13 . jako źródło siły oksydacyjnej. ang. U bakterii glebowej Azotobacter beijerinckii w warunkach niedostatku tlenu gromadzi się PHB. Na przykład. różnica w 16S rRNA była główną przyczyną wydzielenia domen Archaea i Bacteria. W komórkach tych PHB pełni rolę magazynu źródła węgla i energii (rozdz. Białka rybosomowe stanowią około 30% masy rybosomu. Każda dojrzała granula jest otoczona jednowarstwą o grubości < 4 nm. natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA.

o średnicy około 60-250 nm. Zjawisko to nazywa się metachromacją. Każda Wakuole gazowe (patrz fot. [Bacterial PHAs. 5 Wakuole gazowe flos-aquae) i u przedstawicieli Archaea (np. błękitem metylenowym. Halobacterium i Methanosarcina). 14 . raport z sympozjum): FEMSMR (1992) 103: 91-376]. 2. including PHB and Biopol (wielu autorów. błękit Nilu A. 2. np. w komórce) barwnikami. Każdy z nich pokryty jest białkową ścianą. długich. 4. Na przykład Pseudomonas oleovorans. wytwarza granule poli-β-hydroksyoktanianu. 7).(cząsteczki białek amfifilowych) i fosfolipidy. zaś w niektórych przypadkach mogą być związane z metabolizmem energetycznym. 2) występują jedynie u niektórych (typowo wodnych) prokariotów. a granule są czasami nazywane ziarnistościami metachromatycznymi. podlegających biodegradacji (Biopol: patrz sekcja 13. wolutyna) Granule polifosforanu (ΡO 3 2~ -Ο-[ΡO 3 ~ ] n -ΡO 3 2~ ) występują u większości bakterii. Granule polifosforanu można wybarwić np. ang. PHB jest stosowany w produkcji tworzyw sztucznych. 2. 2. 2 Polifosforan (polimetafosforan. W niektórych przypadkach wakuole gazowe wytwarzane są konstytutywnie. u cyjanobakterii tworzących zakwity (takich jak Anabaena wakuola składa się ze skupiska drobnych. Przyjmuje się. poly-β-hydroksyalkanoates). 2. że stanowią one zapas fosforanu. Regiony hydrofilowe białek i fosfolipidów są skierowane w stronę cytoplazmy [Mayer i Hoppert (1997) JBM 37: 45-52]. gdy rośnie na pożywce z n-oktanem. U niektórych bakterii spotyka się inne polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA. wypełnionych gazem pęcherzyków. jednak uzyskują one inne zabarwienie niż kolor stosowanego barwnika. w innych zaś powstają po indukcji. takimi jak np. Ziarnistości PHB można wybarwić in situ (tzn.

1). które powstały wcześniej. 2. Fosfatydyloetanoloamina (rys. 6 Karboksysomy Karboksysomy to wewnątrzkomórkowe struktury błonowe o średnicy około 100-500 nm. 2. 7 Tylakoidy Tylakoidy to spłaszczone. 2. W niektórych przypadkach są one także miejscem aktywności oddechowej (rozdz. 9. 4). u cyjanobakterii Oscillatoria agardhii. 2. wewnątrzkomórkowe struktury błonowe. czy gramujemnych — patrz sekcja 2. 8 Błona cytoplazmatyczna Błona cytoplazmatyczna jest dwuwarstwą o grubości 7-8 nm. wykorzystujących dwutlenek węgla jako główne źródło węgla). jak i wewnętrzna strona błony jest hydrofilowa. Struktury podobne do tylakoidów (ale nazywane chlorosomami lub pęcherzykami Chlorobium) występują u bakterii z podrzędu Chlorobiineae. częściowo lub całkowicie. Drugi z wymienionych mechanizmów funkcjonuje np. gdyż zawiera chlorofile. W tylakoidach zachodzi proces fotosyntezy (rozdz. Obecność innych rodzajów lipidów zależy głównie od tego. w której zanurzone są. Błona tylakoidów różni się od struktury błony komórkowej. Lipidy są w większości fosfolipidami.Obecność wakuoli gazowych wpływa na gęstość pławną komórek unoszących się w wodzie. 5). z których u bakterii najpowszechniej występuje fosfatydyloglicerol (rys. Intensywne światło hamuje zaś wytwarzanie pęcherzyków. 2. 5). Występują one w bliskim sąsiedztwie ściany i ułożone są do niej równolegle. 6. Pełnią one funkcje podobne jak tylakoidy. 5). 2. a więc prowadzi do zwiększenia gęstości pławnej. 2. gdyż dzięki temu zyskują one optymalny dostęp do światła. czy dana bakteria jest zaliczana do grupy bakterii gramdodatnich. 5) obecna jest u niektórych bakterii gramujemnych. Fosfatydylocholina (lecytyna) (rys. ulegają „rozcieńczeniu" w trakcie kolejnych podziałów komórki. że zarówno zewnętrzna. Niektóre z tych białek przechodzą przez całą grubość ściany (rys. 5) występuje powszechnie u bakterii gramujemnych. podczas gdy wnętrze błony jest hydrofobowe. 2. cząsteczki białka. a te. 2. 2. 2. Jest to szczególnie ważne dla organizmów fotosyntetyzujących. które spotyka się u większości cyjanobakterii. które występują u wielu bakterii autotroficznych (tzn. zbudowaną z cząsteczek lipidów. wybarwiona na ciemno). 3. tzn. Niedobór światła stymuluje powstanie nowych pęcherzyków. Gęstość pławna komórek może być regulowana przez co najmniej dwa mechanizmy. w lewej górnej części. Cząsteczki lipidów ułożone są w taki sposób. Pojedynczy karboksysom zawiera wiele kopii enzymu (RuBisCO) biorącego udział w „wiązaniu" atmosferycznego dwutlenku węgla (rys. 2. ale nie spo15 . „lubiąca wodę" (fot.

Cząsteczki lipidów. 9. Białka PBP mogą stanowić część kompleksu białkowego błony cytoplaz- Połączenia między glicerolo-3-fosforanem i dwiema cząsteczkami kwasów tłuszczowych (zawierającymi długie łańcuchy węglowe) to wiązania estrowe. 2. 1 i 6. Błona nie jest sztywną strukturą. „białka wiążące penicylinę" (PBP. penicillin binding proteins).tyka się jej u bakterii gramdodatnich. W bakteryjnych błonach cytoplazmatycznych są także niewielkie ilości glikolipidów. a sterole jedynie u bakterii z rodziny Mycoplasmataceae. Białka błony cytoplazmatycznej zawierają różne enzymy — np. 3. diphosphatidylglicerol. 3. ang. ang. są utrzymywane razem dzięki działaniu sił międzycząsteczkowych. występujące w stanie płynnym. tj. U E. polimeru ściany komórkowej (sekcja 2. które biorą udział w syntezie peptydoglikanu. 1). coli głównym lipidem jest fosfatydyloetanoloamina. kardiolipina). Sfingolipidy występują rzadko. 16 . lecz są również niewielkie ilości fosfatydyloglicerolu i difosfatydyloglicerolu (DPG.

a także elementy systemów przekształcających energię. Przepuszczalność błony cytoplazmatycznej odgrywa ważną rolę w osmoregulacji (sekcja 3. umożliwiające transbłonową dyfuzję wody i/lub niektórych innych obojętnych cząsteczek. Przykładem może być kanał MscL u E. Ułatwiają w ten sposób wydalanie wody i pewnych rozpuszczonych w niej substancji. Phoenix i Pratt (1994) FEMSMR 13: 1-12]. Białka te. U kilku bakterii stwierdzono obecność „białek sensorowych". Błona cytoplazmatyczna nie jest swobodnie przepuszczalna dla większości cząsteczek. np. Akwaporyna-1 jest spokrewniona z: integralnym białkiem soczewki oka ssaków. Otwierają się one. Kanały tego typu występują u wielu bakterii. Szlak transbłonowy. Methanobacterium thermoautotrophicum). (1999) EMBO Journal 18: 1730-1737]. 5). zaś białko w nim uczestniczące nazwano akwaporyną-1 (Aqpl). brak u Methanococcus jannaschii). Dodatkowo. gdy ciśnienie turgorowe w komórce zbliża się do poziomu zagrażającego jej życiu [Levina i wsp. coli akwaporyna AqpZ jest kodowana przez gen aqpZ. natomiast szczepy dzikie reagują w tych warunkach wzmożoną ekspresją aqpZ. Występują w niej także składniki systemów transportu (które przenoszą przez błonę jony i inne cząsteczki). sekcje 2. Inne cząsteczki (wliczając np. Ten rodzaj transportu po raz pierwszy zaobserwowano w krwinkach czerwonych. Niektóre z nich wymagają dostarczenia energii przez komórkę. 1.matycznej [Gittins. Sugeruje to. U Lactococcus lactis kanał MIP transportuje zarówno wodę. występują we wszystkich grupach organizmów żywych. NH 3 (ale nie NH 4 + ) i woda. Dzięki tym mechanizmom komórka może gromadzić pewne związki w stężeniu znacznie przewyższającym ich zawartość w otaczającym środowisku. takich jak ATPazy i łańcuchy transportu elektronów (rozdz. (1997) ARP 59: 633-657]. iż AqpZ pełni ważną rolę fizjologiczną. Nie ma ich również cieli Archaea (np. pozbawione ładunku lub hydrofobowe cząsteczki. coli [Mechanosensitive channels in E. 17 . O2. coli: Sukharev i wsp. zaliczane do „rodziny białek MIP" (ang. 2. Archaeoglobus fulgidus. który tworzą białka z rodziny MIP. Kanał ten składa się z pojedynczego polipeptydu. Niektóre małe. CO2. mogą przechodzić przez nią dość swobodnie. a transporter glicerolu kodowany jest przez gen glpF. Posiadają one bardzo konserwatywne regiony. jak i glicerol. Struktura ta jest najwyraźniej stałą drogą transportu wody (kanał = akwaporyna) lub glicerolu (i/lub innych obojętnych cząsteczek) (kanał = transporter glicerolu). 2 i 7. gdzie pełnią ważną rolę w adaptacji do warunków stresu osmotycznego. W błonie cytoplazmatycznej występują kanały aktywowane naprężeniem mechanicznym. w błonie cytoplazmatycznej wielu (nie wszystkich) bakterii występują molekularne szlaki. które zwiększają rozmiar porów w odpowiedzi na wzrost turgoru w komórce. składniki pokarmowe) i jony muszą być transportowane przez błonę za pomocą specjalnych mechanizmów. integralnym białkiem tonoplastu roślin i białkiem GlpF Escherichia coli. który zapętla się. 8). W grupie tej wyróżnia się dwa typy białek: akwaporyny i transportery glicerolu. U E. Kanały MIP spotyka się u niektórych przedstawilecz nie u wszystkich (np. 6). main intrinsic proteins). nazywa się kanałem MIP. Szczepy z mutacją w genie aqpZ rosną gorzej w środowisku o niskim ciśnieniu osmotycznym. które rozpoznają zmiany w środowisku zewnętrznym (patrz np. przechodząc wielkorotnie przez błonę cytoplazmatyczną. 15. 8.

8. 2. Obydwa typy cząsteczek mają pojedyncze polarne końce. 2. takie jak przekształcanie energii i odbieranie bodźców. Jeśli protoplast znajdzie się w środowisku bardziej rozcieńczonym niż jego cytoplazma. zewnętrzna warstwa — ściana komórkowa (rys. są pełnione przez białka. 2. mające dwa polarne końce. chociaż ograniczony jedynie błoną cytoplazmatyczą. Chlamydia trachomatis.u niektórych bakterii (np. 9). lipidy dieterowe i diestrowe. Mycobacterium tuberculosis. 2. 6). 18 . woda zacznie przechodzić przez błonę (na drodze osmozy). W lipidach bakteryjnych glicerol jest połączony z kwasami tłuszczowymi wiązaniami estrowymi (rys. mogą przechodzić przez całą grubość błony. 2. 5) jest niezbędna do prawidłowego zwijania błonowego białka LacY (produkt genu lacY — sekcja 7. 2. 2. 9 Ściana komórkowa U większości bakterii sztywna. Jednak w niektórych przypadkach (np. 2. Niektóre z lipidów błony cytoplazmatycznej archeonów i bakterii są strukturalnymi analogami. po utracie ściany komórkowej (rys. że właściwości lipidów (i białek) archeonów odzwierciedlają ich zdolności adaptacyjne do życia w warunkach ekstremalnych. 2). 2. U bakterii delikatny protoplast jest zwykle chroniony przed lizą osmotyczną dzięki obecności sztywnej ściany komórkowej (sekcja 2. natomiast w lipidach archeonów (zawierających np. 2) — chroni delikatny protoplast (sekcja 2. co spowoduje napęcznienie i w końcu pęknięcie komórki. cząsteczki. coli [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264]. niezależnie od pierwotnego kształtu komórki. tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol) występują dwie. może przetrwać (w warunkach laboratoryjnych) i nadal przeprowadzać wiele procesów komórkowych. Często uważa się. 1. 2. zaś ważne funkcje. tzn. 8. 2. Protoplast. które pomagają w poprawnym zwijaniu specyficznych białek (sekcja 7. 1 Protoplasty Komórka. Na przykład. cząsteczki glicerolu — po jednej na każdym końcu cząsteczki lipidu. (2000) TIM 8: 33-38]. Zjawisko to nazywa się lizą osmotyczną. 2 Błona cytoplazmatyczna u przedstawicieli Archaea Błona cytoplazmatyczna tych organizmów zawiera lipidy. 1) u E. 8. połączone wiązaniem eterowym. Cząsteczki takie. Treponema pallidum) [Microbial MIP channels: Hohmann i wsp. np. że funkcją lipidów błony cytoplazmatycznej jest współudział w procesie selektywnej przepuszczalności błony. fosfatydyloetanoloamina (rys. 8. izoprenoid lub hydroizoprenoid) występują wiązania eterowe. 2. Jednak fosfolipidy błony odgrywają też istotną rolę jako „chaperony" (lipidy opiekuńcze). Wydaje się prawdopodobne. których nie spotyka się u przedstawicieli Bacteria. Określa ona także kształt bakterii: wyizolowany protoplast jest kulisty. 1) przed uszkodzeniami mechanicznymi i lizą osmotyczną. Helicobacter pylori. 5). tworzy strukturę zwaną protoplastem.

połączonych poprzecznie krótkimi peptydami. 2. U bakterii o innej strukturze ściany. noszą miano bakterii gramujemnych. 1 Ściana bakterii gramdodatnich ściana bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba (około 30-100 nm) i. XIX wieku przez duńskiego naukowca Christiana Grama. Ściana w 40-80% jest zbudowana ze sztywnego. 9. 1. które zatrzymują barwnik (mające jeden typ ściany). Tworzą one trójwymiarową. w regulacji transportu jonów i cząsteczek. bakterie stają się bezbarwne). 9. która otacza protoplast. strukturą i składem. Ściany komórkowej nie można jednak uważać za zwykle „pudełko" zamykające żywą komórkę. nawet po działaniu takich rozpuszczalników jak aceton lub etanol.Ponadto. strukturę (sakulus) (rys. złożonego polimeru — peptydoglikanu (zwanego także mureiną). Peptydoglikan składa się z liniowych łańcuchów heteropolisacharydów. 1. W czasie wzrostu nowy Peptydoglikan odkłada się na wewnętrznej 19 . znaczenie określeń — bakterie typu gramdodatniego i typu gramujemnego). Obydwa rodzaje ścian komórkowych omówiono dalej. natomiast te. Wyróżnia się jednak tylko dwa główne typy ściany. Kilka przykładów bakterii gramdodatnich i gramujemnych wymieniono w tabeli 2. 7). podobną do sieci. Bakterie. ma prostą. 9. po barwieniu fioletem krystalicznym i jodem zatrzymują barwnik. (W przypadku niektórych bakterii nie otrzymuje się jednoznacznego wyniku po zastosowaniu metody barwienia Grama: patrz sekcja 14. Bakteryjna ściana komórkowa może znacznie się różnić grubością. jednolitą strukturę. nazywa się bakteriami gramdodatnimi. działa jako „sito molekularne" — stanowi bowiem barierę przepuszczalności dla różnych cząsteczek. barwnik zostaje usunięty (tzn. Sakulus jest zbudowany z wielu warstw peptydoglikanu. które są określane na podstawie sposobu barwienia pewnymi barwnikami. 1. 2. Ta ważna procedura barwienia została opracowana w latach 80. które mogą go utracić (mają drugi typ ściany). gdyż odgrywa ona także aktywną rolę np. w podobnych warunkach. 2. Barwienie Grama opisano w sekcji 14. Komórki. jak wynika z obserwacji w mikroskopie elektronowym. w tym niektórych antybiotyków. mające dany typ ściany.

9. że Peptydoglikan jest wielowarstwowy. najbliższa błonie cytoplazmatycznej. 2. O-swoiste łańcuchy tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany. Jednak w tym przypadku fosfolipidy tworzą jedynie wewnętrzną warstwę błony. in. Do peptydoglikanu przyłączone są kowalencyjnie kwasy tejchojowe. dla pewnych antybiotyków. górnej części). o grubości 15 nm. 1. 2. 1 i 5. 20 . 6). Po lewej stronie błony zewnętrznej widoczna jest poryna (sekcja 2. zaś wielowarstwowy Peptydoglikan może występować na jej biegunach. który stanowi od 1 do 10% suchej masy komórki. podczas gdy u innych (np. zwana błoną zewnętrzną (rys. 2. Mycobacterium) ściana zawiera lipidy. dzięki mikroskopii elektronowej) sugeruje. Błona zewnętrzna — ważna bariera przepuszczalności np. Warstwa wewnętrzna (rys. a przebieg jego syntezy omówiono w sekcji 6. 2 Ściana bakterii gramujemnych W ścianie komórkowej bakterii gramujemnych (o grubości 20-30 nm) obserwowanej w mikroskopie elektronowym widoczne są wyraźne warstwy. Skład chemiczny peptydoglikanu E. 2. Jednak badania szybkości metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach Escherichia coli wskazują. zawiera Peptydoglikan. Najstarsze z nich ulegają złuszczeniu i są stopniowo zrzucane. 3. 2. 2. W miarę wzrostu. Zewnętrzna warstwa ściany. że ścianę boczną komórki stanowi jego pojedyncza warstwa [Park (1993) JB 175: 7-11]. coli przedstawiono na rysunku 2. Na przykład zawartość fosforanów w podłożu wpływa na ilość kwasów tejchojowych w ścianie komórkowej Bacillus. 6. zbudowane z polimerów fosforanów glicerolu lub rybitolu. jest w istocie. U niektórych bakterii (np. 3. 7. 9. 2). szczepy Streptococcus) — węglowodany. warstwy te przesuwają się na zewnątrz w kierunku powierzchni komórki. 4. Skład ściany komórkowej może się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. 2. Peptydoglikan jest scharakteryzowany w sekcji 3. 3 w lewej. 6 (który powstał m. Połączona jest ona z peptydoglikanem poprzez lipoproteiny Brauna. 7. fot.(cytoplazmatycznej) stronie ściany. dwuwarstwą lipidową — przypomina więc błonę cytoplazmatyczną. zawierającą białka. Schemat przedstawiony na rysunku 2. zaś jej warstwę zewnętrzną stanowią makrocząsteczki nazywane lipopolisacharydami (LPS).

6) jest glikolipidem.Lipid A (rys. wykorzystywanym również w syntezie peptydoglikanu. głównie Mg 2+ i Ca2+. Jej przepuszczal21 . które nazwane są np. coli i pokrewnych jej bakterii) zawiera cząsteczki glukozy i galaktozy. jest jednak znacznie mniej przepuszczalna (lub nieprzepuszczalna) dla cząsteczek hydrofobowych lub amfipatycznych. ang. kodowany przez gen lpxΑ. 8. 2. coli i pokrewnych jej bakterii występują tysiące cząsteczek lipoproteiny Brauna (rys. Każda z nich jest połączona kowalencyjnie z leżącym niżej peptydoglikanem. do której także przyłączony jest oligosacharyd rdzeniowy. [LOS: Kahler i Stephens (1998) Critical Reviews in Microbiology 24: 281-334]. a także podstawione cząsteczki innych cukrów. in. sekcja 7. m. po której następuje wieloetapowy proces prowadzący do powstania heksaacylowanego disacharydu (lipid A). 2. 1). Niektóre białka wydają się połączone z oligosacharydem rdzeniowym. Błona zewnętrzna jest zwykle przepuszczalna dla niewielkich jonów i cząsteczek hydrofilowych. Łańcuchy O-swoiste. U E. coli O-swoistego łańcucha. Następnie pod wpływem deacetylazy (enzym zawierający cynk i kodowany przez lpxC) zachodzi deacetylacja. coli składa się on z ufosforylowanego disacharydu (dwie cząsteczki glukozoaminy) niosącego sześć lipofilowych łańcuchów acylowych. 6). Wszystkie łańcuchy acylowe są skierowane do lipofilowego wnętrza błony zewnętrznej. 3. (Zwróć uwagę. Obecność takich porów umożliwia niektórym jonom oraz cząsteczkom przechodzenie przez błonę zewnętrzną. białko błony zewnętrznej. Około połowy masy błony zewnętrznej stanowią białka. w którym występuje komórka (patrz np. nie mają typowego dla E. 1). np. Względne proporcje poszczególnych poryn mogą się zmieniać w zależności od środowiska. fosforan heptozy. 1. które tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany komórkowej. że niektóre bakterie. coli i pokrewnych jej bakterii błona zewnętrzna zawiera kilka różnych typów poryn. U E. Poryny są połączone z peptydoglikanem za pomocą mostków jonowych. Oligosacharyd rdzeniowy (np. białka związane ze specyficznym mechanizmem pobierania („transportu") i poryny. W błonie występują także enzymy. Lipid A jest połączony hydrofobowo z resztami kwasów tłuszczowych fosfolipidów. OmpC. Prekursorem lipidu A. Skład chemiczny łańcuchów O-swoistych może się różnić u poszczególnych szczepów. (Omp. przechodzą przez błonę. jest UDP-N-acetyloglukozoamina (UDP-GlcNAc) (sekcja 6. dzięki oddziaływaniom jonowym. Cztery z nich są związane z pojedynczą cząsteczką glukozoaminy. co wykorzystuje się w serologicznej identyfikacji szczepów bakterii (sekcja 16. 5. Szczegóły syntezy lipidu A przedstawili Wyckoff. Cząsteczki poryny. OmpF itd. tworząc wypełnione wodą „pory". 6). W biosyntezie lipidu A UDP-GlcNAc jest początkowo monoacylowana przez enzym. Raetz i Jackman [(1998) TIM 6: 154-159]. 3. Neisseria meningitidis. Przylegający do błony oligosacharyd rdzeniowy jest z nią połączony kationami dwuwartościowymi. u E. outer membrane protein). in. składają się z liniowych lub rozgałęzionych łańcuchów podjednostek wielocukrowych. występujące w zgrupowaniach po trzy (czasami po dwie). Struktura analogiczna do LPS nazywana jest lipooligosacharydem — LOS). Usunięcie tych kationów za pomocą chelatorów jonów prowadzi do rozerwania błony zewnętrznej. Na przykład u E. Poszczególne elementy błony zewnętrznej utrzymywane są razem m.

22 .

W tym przypadku tło zostało wybarwione na ciemno przez eozynę i fuksynę karbolową („barwienie negatywowe"). 3 Ściana komórkowa u przedstawicieli Archaea Ściana niektórych przedstawicieli tej grupy organizmów (np. W prawej górnej części.Każda otoczka jest widoczna jako jasne „halo" otaczające komórkę. 9. Fox Chase Cancer Center. Centralnie. która jest ściśle związana z błoną cytoplazmatyczną. Filadelfia. Makrootoczki barwiono czerwienią rutenową. fragilis dzięki uprzejmości dr Sheili Patrick z Queen's University of Belfast. Fimbrie E. 2. aby uwidocznić dużą liczbę fimbrii (oznaczone małymi grotami strzałek) (x54 000). 2. polimiksyny (sekcja 15. warstwy S i białka Μ (patrz dalej). o średnicy poniżej 10 nm. coli. 2. specyficznym dla tego pilusa. Aby wykazać jego obecność. W pobliżu centralnej części zdjęcia widoczne są miejscowe połączenia błon: zewnętrznej i cytoplazmatycznej. 2. Duże groty strzałek wskazują fragmenty rzęski. Thermoplasma). x 1000) (z tej samej hodowli przygotowano preparat do mikroskopii elektronowej — patrz zdjęcie obok). 2. 9. np. w lewej części. włosowatą strukturą) wyrastający z powierzchni komórki E. fragilis w mikroskopii świetlnej (ok. 3 Struktury osłon komórkowych i struktury powierzchniowe niektórych bakterii gramujemnych W lewej górnej części. Methanobacter ściana zawiera pseudomureinę — podobny do peptydoglikanu polimer. zależnie od gatunku) oraz kwas N-acetylo-L-talozoaminouronowy. coli dzięki uprzejmości dr. Sam pilus. jest prawie niewidoczny. 9. nie jest przecinana przez enzym lizozym. Pilus kodowany przez plazmid F (będący wyspecjalizowaną. „wyznakowano" go pewnym. Fragment ściany E. gatunków Halobacterium. Mikrootoczka przedstawiona na mikrografii elektronowej nie byłaby widoczna w mikroskopii świetlnej. 5). Błona zewnętrzna (om). coli dzięki uprzejmości dr Ann Field. 4 Warstwy leżące po zewnętrznej stronie ściany komórkowej U niektórych bakterii występuje jedna bądź kilka warstw leżących po zewnętrznej stronie ściany. w prawej części. uwidocznione w mikroskopii elektronowej (x28000). 23 . bakteriofagiem (MS2). z tak zwanej warstwy S (sekcja 2. wybarwionej. W tym przypadku do pilusa zostały przyłączone trzy cząstki wirusa MS2 (każdy o średnicy około 25 nm). Fragilis posiadające otoczki. w którym łańcuchy szkieletu zawierają N-acetylo-D-glukozoaminę (i/lub N-acetylo-D-galaktozoaminę. Methanococcus i Thermoproteus) składa się głównie. Fot. 5 Bakterie pozbawione ściany Komórki prokariotyczne pozbawione ściany komórkowej spotyka się u przedstawicieli domeny Bacteria (np. Pseudomureina. (Plazmoliza — usunięcie wody z komórki powoduje „odstawanie" błony cytoplazmatycznej od błony zewnętrznej). lub wyłącznie. Bayera. 2. Widoczne są szczeliny powstałe między błoną zewnętrzną (grot strzałki) a leżącą niżej błoną cytoplazmatyczną. Manfreda E. w przeciwieństwie do peptydoglikanu. 11). 2. Centralnie. Osłony bakteryjne na cienkim skrawku komórki E. W lewej dolnej części. Komórki B. Zdjęcia B. Miejsca połączenia błon i pilus plazmidu F E. Dwie komórki B. 4. Mycoplasma) i Archaea (np. Public Health Laboratory Service. 4. W prawej dolnej części. coli (x 150 000). Londyn. 2. które oznaczono grotami strzałek. otoczki.ność może się zwiększać (co jest niekorzystne dla bakterii) w obecności pewnych antybiotyków. błona cytoplazmatyczna (cm) i mikrootoczka (mc) na cienkim skrawku Bacteroides fragilis (x52 000). 12). coli po plazmolizie (x10 000). U np. Zalicza się do nich np. Komórka w górnej części zdjęcia jest w trakcie podziału. lub czynników hamujących biosyntezę lipidu A (sekcja 15.

24 .

Każdy mostek peptydowy. Μakrootoczka. z ułożonymi na przemian cząsteczkami N-acetyloglukozoaminy (G) i kwasu N-acetylomuraminowego (M). 8 i 6. Enzym lizozym hydrolizuje wiązanie β-l. utrzymywane są razem dzięki krótkim peptydom łączącym reszty kwasu N-acetylomuraminowego. a peptydy boczne połączone są mostkami penta. Ich obecność jest ważnym przyczynkiem do rozważań o fizjologii bakterii [Woldringh (1994) MM 14: 597-607]. Warstwa ta nazywana jest otoczką. Trimerowy mostek peptydowy powstaje. 2. 7 Peptydoglikan. które występują w obrębie osłon komórkowych (sekcja 2. występującego w innym peptydzie bocznym. Mostki te mogą być trawione enzymem lizostafiną. jest na tyle gruba. (b) Struktura mostków peptydowych łączących sąsiadujące ze sobą łańcuchy szkieletu. 1). 3.D-alanina (obramowane liniami przerywanymi). 11 Otoczki i warstwy śluzowe Wiele bakterii wytwarza substancję pokrywającą zewnętrzną powierzchnię ściany komórkowej. które łączą razem trzy (lub nawet cztery) łańcuchy szkieletu. przypominająca sieć cząsteczka peptydoglikanu: łańcuchy szkieletu. 3: w prawej. na trzecim łańcuchu szkieletu. 3. przedstawiony na schemacie. 2. łączy dany łańcuch z innym łańcuchem szkieletu. 2. Różne typy mostków peptydowych występujących w E. zwana też „prawdziwą" otoczką. 4. Wyniki badań dowodzą. 1). iż można ją zobaczyć (stosując odpowiednią preparatykę) w zwykłym mikroskopie świetlnym (ponad -0. Inny rodzaj mostka peptydowego — dimer tetra-tri (tetra-tri). (Numery pisane kursywą oznaczają poszczególne atomy węgla w cząsteczce). Budowa peptydoglikanu u bakterii gramdodatnich znacznie się różni od struktury przedstawionej wyżej. których obecność może być stwierdzona jedynie po zastosowaniu mikroskopii elektronowej lub np. coli opisano niżej w (b). Przedstawione struktury są typowe dla Escherichia coli. określa się jako dimer tetra-tetra (lub tetra-tetra). Do każdej reszty kwasu N-acetylomuraminowego dołączony jest krótki peptyd boczny — w tym przypadku tetrapeptyd: L-alanina kwas D-glutaminowy . 2. 1). Mostek taki. 2. PBP mogą być inaktywowane przez penicylinę oraz pokrewne antybiotyki β-laktamowe (sekcja 15. Odmienne są również rodzaje i usytuowanie wiązań poprzecznych. powstaje po połączeniu jednego tetrapeptydu i jednego tripeptydu. górnej części). W tym rodzaju mostków peptydowych D-alanina jednego peptydu bocznego związana jest kowalencyjnie z grupą ε-aminowej mezo-DAP. Podobne rodzaje peptydoglikanu występują u wielu innych bakterii gramujemnych (a) Trójwymiarowa.lub heksaglicynowymi. 2. ang. składający się z dwóch peptydów bocznych (każdy z nich zawiera cztery reszty aminokwasowe). 4-glikozydowe w łańcuchu szkieletu (patrz schemat). 10 Połączenia międzybłonowe (u bakterii gramujemnych) Połączenia międzybłonowe to miejscowe fuzje pomiędzy błonami: zewnętrzną i cytoplazmatyczną (fot. 25 . Na przykład w łańcuchach szkieletu Mycobacterium występują reszty kwasu N-glikolilomuraminowego. penicil binding proteins). W tym przypadku peptyd boczny. co powoduje lizę całej komórki. W peptydoglikanie Staphylococcus aureus nie wszystkie reszty kwasu muraminowego są acetylowane.kwas mezo-diaminopimelinowy (mezo-DAP) . że są także mostki peptydowe. co osłabia strukturę ściany komórkowej. 2. technik serologiczRys. 2 μm grubości). które obserwuje się w warunkach plazmolizy.2. Występują też mikrootoczki. tworzy wiązanie kowalencyjne z wolną grupą ε-aminową (patrz schemat) mostka dimerowego. gdy nastąpi połączenie trzech łańcuchów szkieletu. Poznanie różnych typów mostków peptydowych jest niezbędne do zrozumienia modelu syntezy peptydoglikanu (sekcja 3. Synteza peptydoglikanu jest zależna od enzymatycznych aktywności białek wiążących penicylinę (PBP.

gdy występuje. Skład białka Μ różni się nieznacznie w poszczególnych szczepach S. kwas kolanowy. W szczepach niektórych bakterii. 1. u bakterii gramujemnych okrywa błonę zewnętrzną). zagęszczacz i inhibitor krystalizacji. np. 26 . alginian. 13 Białka Μ Cząsteczki białka Μ tworzą cienką warstwę otaczającą ścianę komórkową patogena Streptococcus pyogenes (paciorkowiec z grupy A Lancefield — patrz Streptococcus — w Aneksie). a wszystkie szczepy w danej grupie mają podobny rodzaj białka M. Otoczki mogą być połączone ze ścianą wiązaniami jonowymi i/lub kowalencyjnymi. 6). stanowić rezerwę pokarmową. 9). Wyróżnia się około 60 grup serologicznych (serogrupy Griffitha). zdolnością do wywoływania choroby). Warstwa S. 2. Jest to przykład typowania (sekcja 16. zwykle otacza ścianę komórkową (np. która swobodnie przylega do ściany komórkowej. otoczka jest homopolimerem kwasu D-glutaminowego. Mogą one na przykład: chronić przed wysychaniem. stanowić barierę przepuszczalności dla toksycznych jonów metali. 2. gdyż czyni bakterię mniej podatną na fagocytozę i często działa jako adhezyna (sekcja 11. Otoczki pełnią różne funkcje. jej szczepy bezotoczkowe są zazwyczaj niepatogenne (patrz także sekcje 11. Podwójna warstwa S występuje np. tzn. dekstran) lub heteropolisacharyd (np. 1 i 11. szkarlatynę. co umożliwia zastosowanie testów serologicznych do ich klasyfikacji (sekcja 16. Tak więc w przypadku bakterii chorobotwórczej mającej zwykle otoczkę. pyogenes. 2. (anginę. zapobiegać infekcji przez bakteriofagi (rozdz. U niektórych przedstawicieli Archaea warstwa S jest ścianą komórkową. 5. 5) pomocnego w badaniach epidemiologicznych. ropnie). Niektóre z wydzielanych polisacharydów wykorzystuje się w przemyśle. 5. 1. gdy komórka rośnie w środowisku płynnym. 3: centralnie i w lewej górnej części). Często rozprzestrzenia się ona do podłoża. Składnikiem organicznym jest zazwyczaj homopolisacharyd (np. umożliwiać adhezję (ważne np. który wywołuje np. U bakterii patogennych tworzenie otoczki jest często skorelowane z patogennością (tzn. Na przykład heteropolisacharyd ksantan (wytwarzany przez szczepy Xanthomonas campestris) jest stosowany w przemyśle spożywczym jako środek żelujący. Składa się ona z powtarzających się cząsteczek białka lub glikoprotein ułożonych w formie kwadratów lub sześciokątów. 2. Białko to jest czynnikiem wirulencji. okrywa błonę cytoplazmatyczną. wielocukrowym śluzem. celuloza. 3. 12 Warstwy S Warstwa S jest zazwyczaj najbardziej zewnętrzną strukturą komórki. 2. Bacillus anthracis. kwas hialuronowy). Otoczki są zbudowane głównie z wody. stabilizator żelu. 2. 5. 1). Warstwa śluzowa jest wodnistą wydzieliną.nych (fot. dla bakterii jamy ustnej tworzących płytkę nazębną) i chronić przed fagocytozą. 1). w szczepach Aquaspirillum i Bacillus. Gatunki Xanthobacter mogą wywarzać otoczkę z α-poliglutaminy wraz z obfitym.

2. 2. że (u np. potem hak. kolejno odkładane są na jego rosnącym końcu. liczba pierścieni) różnią się w zależności od gatunku. Stanowi ono złożony mechanizm przekształcający energię. Elementy składowe pierścieni L i P. Rzęska obraca się wokół własnej osi. fimbrie i pili. dwie rzęski — po jednej na każdym biegunie (urzęsienie amfitrychalne). ułożonych podobnie jak włókna liny. powodując rotację rdzenia. że mogą one być trans27 . 2). 2. Motor składa się z wielu struktur o kształcie pierścieni. E. z rodzaju Pseudomonas i Vibrio oraz u Helicobacter pylori. 8). Każda rzęska bierze początek w ciałku podstawowym (=motor rzęski). coli i innych bakterii jelitowych) pierścień MS wraz z pierścieniem C obraca się. składniki rzęski — najpierw podjednostki tworzące rurkowaty rdzeń. pęczek rzęsek na jednym bądź obu biegunach (monopolarne lub bipolarne urzęsienie lofotrychalne). 2. 14. Powstawanie rzęski. ułożonych osiowo (wraz z innymi składnikami) na pałeczkowatym rdzeniu w błonie cytoplazmatycznej (rys. zakotwiczony w błonie cytoplazmatycznej. włókna rzęski mogą być widoczne w mikroskopie świetlnym. może mieć jedną rzęskę (urzęsienie monotrychalne). 2.2. 2. Struktury te można podzielić na trzy główne typy: rzęski. że zakotwiczone w osłonach komórkowych pierścienie L i Ρ tworzą „tuleję" dla wirującego rdzenia (rys. mają sekwencje sygnałowe (sekcja 7. Hak jest pustą. Wydaje się. 2. Obecnie uważa się. [Proste barwienie rzęsek: Heimbrook i wsp. w określonej kolejności. Każda rzęska składa się z włókna. zależnie od gatunku. 2. o rozmiarach 5-20x0. 2. transportowane są. 5). 1 Rzęski Rzęski umożliwiają bakterii poruszanie się w płynnym środowisku (sekcja 2. Szczegóły budowy (np. 6). Przez kanał w pierścieniu MS. (1989) JCM 27: 2612-2615]. giętką strukturą białkową (rys. na całej powierzchni komórki (urzęsienie perytrychalne) (patrz rys. 8). np. przechodzą przez jego kanał osiowy. będącą przedłużeniem błony zewnętrznej (patrz fot. 1. a następnie. Bakteria. 2. 1). ma strukturę helikalną. Ruch rotacyjny zademonstrowano poprzez zakotwiczenie wolnego końca rzęski na szklanej powierzchni. Ruch rzęski wymaga dostarczenia energii w formie gradientu jonów w poprzek błony cytoplazmatycznej (rozdz. Po zastosowaniu specjalnej metody barwienia. haka i ciałka podstawowego (rys. Włókno. które usytuowane jest w osłonach komórkowych. a więc i włókna. tworzące wydłużający się filament. 8). co umożliwiło zaobserwowanie rotacji całej komórki. Zbudowane jest ono z jedenastu podjednostek białkowych. lub wiele rzęsek. włókno otoczone jest pochewką. w przeciwieństwie do innych białek rzęski. w górnej lewej części). Wzdłuż osi włókna biegnie kanał o średnicy około 70 A. Podjednostki białka (flagelliny). Przyjmuje się. U niektórych gatunków. włosowate włókna białkowe odchodzące od powierzchni komórki. 02 μm. 15). 14 Rzęski. fimbrie i pili U wielu bakterii występują drobne. i w końcu włókno.

zawiera białka FliG. Pierścień C („przełącznik"). Katayama i wsp. 7. (cytowany wyżej) wspomina o prawdopodobnym „aparacie eksportu" w pierścieniu C (linia przerywana). 7. MotB jest przyłączone do peptydoglikanu. P. Nie ulega wątpliwości. występujący w błonie cytoplazmatycznej. Katayama i wsp. 7. Pierścień C odgrywa także rolę w chemotaksji (rys. Pierścienie L i Ρ są związane. 13). FliM i FliN (tab. Białka FliM i FliN są składnikami obwodowymi. 3). pozwalającego przechodzić przez pierścień MS jedynie odpowiednim 28 . Kihara i wsp. Zawiera on cząsteczki białka FliF (tab. (1996) JB 178: 4582-4589. Dlatego też tak zwany aparat eksportu musi pełnić funkcje „portiera". Pierścienie S i Μ są teraz widoczne jako pojedyncza struktura — pierścień MS. (b) Obecny model [oparty na np. dzięki energii powstałej w trakcie przepływu protonów przez motor. 3). Wytwarzanie naprężeń (rotacja rzęski) następuje w wyniku interakcji zachodzących między FliG i MotA. Pierścienie L. że komórka nie może tolerować istnienia otwartego kanału łączącego cytoplazmę (gdzie powstają składniki rzęski) ze środowiskiem zewnętrznym. a nie przez pierścień MS. z błoną zewnętrzną i warstwą peptydoglikanu.(a) Wcześniejszy model. odpowiednio. 4. rdzeń i białka MotA i MotB stanowią motor rzęski (= ciałko podstawowe). portowane w poprzek błony cytoplazmatycznej w podstawowym szlaku sekrecyjnym (sekcja 5. 3). Białka MotA i MotB (elementy stacjonarne) otaczają pierścień MS. Białko FliG podtrzymuje pierścień MS. MS i C. (1996) JMB 255: 458-475]. przyłączony do pierścienia MS.

Inne typy fimbrii powodują „mannozooporną" 29 . a więc inaczej niż bakteryjna [Jarrel. Fimbrie występują na całej powierzchni komórki (fot. na końcach fimbrii występuje specjalne białko adhezyna. Kontrolę genetyczną procesu powstawania rzęski opisano w sekcji 7. podjednostki innego typu. Krętki są bakteriami gramujemnymi. ang. „Aparat eksportu" i pierścień C powstają wraz z pierścieniem MS lub wkrótce po jego pojawieniu się. 2. rzęski peryplazmatyczne. Ich rzęski występują na obu biegunach komórki. 2 Fimbrie Średnica fimbrii wynosi zwykle 2-10 nm. a długość od 0. 7. Cecha ta oraz widoczne podobieństwa pomiędzy flagellinami archeonów i 4 typem fimbrii sugerują. strukturą i sposobem powstawania. W przypadku bakterii patogennej może to ułatwiać proces infekcji. Na przykład u Neisseria spp. 2. Rzęska peryplazmatyczna wydaje się obracać w sposób charakterystyczny dla innych rzęsek [Charon i wsp. a włókno jest zwykle znacznie cieńsze od włókien bakteryjnych. Ponadto flagellina archeonów zawiera sekwencję sygnałową (sekcja 7. 2. które przechodzą przez puste struktury powstającej rzęski) jest transportowane do błony. Peryplazmatyczne rzęski Treponema pallidum (bakteria wywołująca kiłę) przedstawiono na fotografiach 2. 2. w prawej dolnej części). które mają unikatową strukturę. między warstwą peptydoglikanu i błoną zewnętrzną. 2. mannosesensitive haemagglutination). w skład którego wchodzą również. 3. że rzęska archeonów rośnie od podstawy. Bayley i Kostyukova (1996) JB 178: 5057-5064]. zaś Borrelia burgdorferi ma ich około siedmiu. Zbudowane są głównie z białka o identycznych podjednostkach. bądź jedynie w określonych jej miejscach. Rzęska archeonów różni się znacznie od rzęski bakteryjnej składem. U bakterii gramujemnych wyrastają one z błony zewnętrznej. Na przykład flagellina archeonów jest glikozylowana. 14. 1 μm do kilku mikrometrów.białkom. 2. 5) (Adhezję u patogenów omówiono w sekcji 11. iż białko to (odmiennie niż flagelliny bakterii. które ułatwia związanie tych patogenów z komórkami gospodarza. Fimbrie występują powszechnie u bakterii i mogą być kodowane przez chromosom lub plazmid — rozdział 7. 6). Rzęska u przedstawicieli Archaea. 3). często wyspecjalizowane. mówimy wtedy o „mannozowrażliwej" hemaglutynacji (MSHA. W niektórych przypadkach zachodzą one na siebie w centralnej części komórki. 4. Ich liczba różni się w zależności od gatunku. (1992) JB 174: 832-840]. dzięki czemu komórka staje się bardziej hydrofobowa. Obecność fimbrii umożliwia wielu bakteriom adhezję międzykomórkową. Białka fimbrii zawierają duże ilości aminokwasów niepolarnych. Jeśli obecność D-mannozy hamuje ten proces. Na przykład Leptonema illini ma dwie rzęski ułożone biegunowo. Dla wielu patogenów fimbrie są ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11. co sugeruje. 8. Czasami fimbrie mylnie nazywane są pilusami (patrz sekcja 2. Rzęski krętków. Bakterie mające dany typ fimbrii adhezyjnych mogą być wykryte w laboratorium dzięki zdolności do hemaglutynacji. Są to tzw. 1). wyrastających z każdego bieguna komórki. czyli zbijania erytrocytów (krwinki czerwone) w widoczne skupiska. 14.

ang. na którą cukier ten nie ma żadnego wpływu. Niektóre przykłady fimbrii wymieniono w tabeli 2. 2. Synteza pewnych fimbrii (np.hemaglutynację (MRHA. mannose-resistant haemaglutination). fimbrii typu 1 30 . Pojedyncza komórka może mieć kilka ich rodzajów.

Powstałe kompleksy przenoszone są do białka przekazującego znajdującego się w błonie zewnętrznej. chaperon) wiąże poszczególne podjednostki. uniemożliwiając im w ten sposób abortywny kontakt z innymi podjednostkami. 14. Geny kodujące elementy strukturalne fimbrii oraz geny mechanizmu składającego 31 . 2. 1).u E. Peryplazmatyczne białko opiekuńcze (ang. coli i typu b u Haemophilus influenzae) bywa okresowo wyłączana przez komórkę — nie wszystkie komórki mają wtedy taką fimbrię. które trasportuje je ku podstawie powstającej fimbrii. W co najmniej kilku przypadkach składanie tej struktury u bakterii gramujemnych zachodzi w następujący sposób. Większość fimbrii powstaje od podstawy. a więc odmiennie niż bakteryjne rzęski (sekcja 2. 6) przechodzą najpierw przez błonę cytoplazmatyczną. Powstawanie fimbrii. Neisseria gonorrhoeae występuje mechanizm genetyczny powodujący cykliczne zmiany składu białkowych podjednostek fimbrii. Podjednostki białkowe fimbrii (mające sekwencję sygnałową — sekcja 7. U np.

1). 2. wielkością i kształtem. Salmonella. 7). 5 nm. 1). 8. 3 Pilusy Pilusy to długie lub włosowate struktury białkowe. 2. Na przykład operon kodujący typ 1 fimbrii zawiera geny fimA (główna podjednostka). a więc w procesie umożliwiającym międzykomórkową wymianę materiału genetycznego. a także uciekać od substancji szkodliwych. odchodzące od powierzchni komórki. fimC (chaperon) ifimD (białko przekazujące) [Fimbriae in E. 1 Ruch W większości przypadków zdolność ruchu jest uwarunkowana występowaniem jednej lub większej liczby rzęsek (sekcja 2. w której występuje kanał osiowy o średnicy około 2. Potrafią one także przemieszczać się w kierunku występowania lepszych źródeł związków odżywczych. E. 2.występują w operonach (sekcja 7. Najlepiej został poznany giętki pilus kodowany przez plazmid F(pilus typu F)(fot. ang. 1 sekundy). Wznowienie płynnego ruchu następuje. Rodzaj pilusa jest uzależniony od warunków fizycznych. 2. cienkie i giętkie. Gdy większość rzęsek tworzących wiązkę na jednym z biegunów obraca się w kierunku CCW. Biorą one czynny udział w koniugacji (rozdz. U bakterii urzęsionych perytrychalnie (np. Każda rzęska przez około 95% czasu obraca się w kierunku niezgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara (CCW. podczas gdy inne bywają krótkie i sztywne. W danej komórce występuje zazwyczaj jeden lub kilka pilusów. 2. Niektóre z nich są długie. coli (artykuł przeglądowy (1996) FEMSMR19: 25-52]. Ma on średnicę 8-9 nm i długość od jednego do kilku mikrometrów. bakteria pchana jest do przodu. 8) bakterii gramujemnych. przypadkowy ruch komórki. 2. Każda rzęska sama reguluje częstość przełączania kierunku własnej rotacji. 15. w których zachodzi proces koniugacji (rozdz. Białka pilusów są kodowane przez elementy genetyczne nazywane plazmidami (rozdz. counterclockwise). 32 . coli) rzęski obracają się niezależnie od siebie [Macnab i Han (1983) Cell 32: 109-117]. 14. 3. Pilus ten. Ten płynny ruch jest zaburzany (z częstością raz na sekundę) przez krótkotrwałe przełączenie kierunku ruchu rotacji (z CCW na CW) niektórych rzęsek. ma rurkowatą strukturę. Taka kierunkowa reakcja nazywa się chemotaksją. 0. a przez resztę czasu — w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW. czyli chwilowy (trwający ok. 2. gdy większość rzęsek znowu zaczyna się obracać w kierunku CCW. w dolnej lewej części). 8). Wywołuje to koziołkowanie. 14. zbudowany z helikalnie ułożonych podjednostek białkowych. Podstawą ruchu rzęskowego jest rotacja rzęski w ciałku podstawowym. 15 Ruch i chemotaksja Wiele bakterii może się aktywnie poruszać w płynnym środowisku. 2. ang. Poszczególne typy pilusów różnią się np. clockwise).

u szczepów cyjanobakterii Synechococcus [Pitta i wsp. że Borrelia burgdorferi porusza się raczej ruchem wężowym. Borrelia również wydaje się obracać wokół własnej osi. 2. Przypuśćmy jednak. Buttle i Charon (1996) JB 178: 6539-6545]. 1. gdyż znajdują się one wewnątrz komórek swoich gospodarzy (patrz np. 2 Chemotaksja Chemotaksja to ukierunkowany ruch komórki w odpowiedzi na gradient stężeń różnych związków chemicznych. gatunki z rodzaju Beggiatoa i Oscillatoria). 15. sekcja 11. które mogą się poruszać z prędkością 600 μm/s [Fenchel (1994) Microbiology 140: 3109-3116]. Mechanizm tego ruchu nie jest znany. Pseudomonas aeruginosa) osiągają zazwyczaj prędkość około 70 μm/s. mimo wygięcia wzdłuż długiej osi komórki. Niezależny od rzęsek ruch aktywowany wapniem (mechanizm nieznany) występuje np. Jest to bierny ruch zachodzący najprawdopodobniej wskutek działania zewnątrzkomórkowych sił fizykochemicznych. z rodzaju Neisseria i Pseudomonas. mogą się poruszać tzw. 3). w tym przypadku. U bakterii (wyposażonych w fimbrie) np. ruchem ślizgowym. 15. U Leptonema Mini rotacja rzęski w kierunku CCW powoduje. Serratia marcescens wykazuje niezależny od rzęsek sposób przemieszczania. 2. po liniach prostych leżących w różnych płaszczyznach. [Structure/motility of spirochaetes: Goldstein. W środowisku chemicznie jednorodnym urzęsione komórki poruszają się w przypadkowych kierunkach (sekcja 2. zaś urzęsione perytrychalnie około 30 μm/s. Wyjątkiem są perytrychalnie urzęsione komórki Thiovulum majus. Komórka zaczyna się obracać wokół własnej osi w kierunku CW. (1995) JB 177: 987-991]. W komórkach urzęsionych monotrychalnie rzęska obraca się równie długo w kierunku CW. wynikać z ruchów Browna (patrz sekcja 16. Jest to płynny ruch. (1997) JB 179: 2524-2528]. Czy komórka. że przednia część komórki przybiera kształt śruby. 2. jak i w kierunku przeciwnym. gdy komórki mają kontakt z powierzchnią podłoża stałego.Następujące na przemian: płynny ruch i koziołkowanie powoduje. obserwuje się ruch drgający (ang. 2. Niektóre bakterie. 2. zgodnie z ruchem wskazówek zegara. 1). Przypadkowość kierunku ruchu (wywołana koziołkowaniem w komórkach urzęsionych perytrychalnie) może. że stężenie składników pokarmowych wzrasta w pewnym kierunku. Podobnie jak Leptonella illini. twitching motility). 1. Ruch bez udziału rzęsek. U pewnych patogenów obserwuje się ruch zależny od aktyny. Ruch krętków jest związany z rotacją ich rzęsek peryplazmatycznych. że poszczególne jej części znajdują się w różnych płaszczyznach. może podróżować w stronę zwiększającego się stężenia składników pokarmowych? 33 . która przypadkowo zmienia kierunek ruchu. w którym istotną rolę może odgrywać napięcie powierzchniowe [Matsuyama i wsp. które występują w cienkich błonach wody. w wyniku czego bakteria porusza się do przodu ruchem śrubowym. Ślizgająca się komórka pozostawia za sobą „ślad śluzu". że komórka porusza się w przypadkowych kierunkach. nie posiadające rzęsek (np. który zachodzi jedynie wtedy. Komórki urzęsione monotrychalnie (np. 1). powodującego. Wydaje się natomiast.

2. 13). w której ruchliwe komórki reagują na gradient stężenia tlenu. Ujednolicenie stężenia efektora (duże lub małe stężenie) przywraca „normalną" częstość koziołkowania. po prostu poruszając się w tym kierunku zmniejszać częstość koziołkowania. Efektem występowania gradientów stężeń różnych związków w środowisku jest tzw. 7. natomiast te. 8. Z drugiej strony przybliżanie się do atraktanta wydłuża czas ruchu płynnego. Dzięki temu komórka przez dłuższy okres porusza się płynnie w „odpowiednim" kierunku. [(1998) JB 180: 1009-1022]. Jaki jest mechanizm aerotaksji? W co najmniej kilku przypadkach stwierdzono. na przykład. rys. dzięki receptorom w jej ścianie komórkowej. Sygnały powstałe w kompleksie receptora trafiają do motora rzęskowego na drodze przekazywania sygnału (ang. Jednak niektóre bakterie egzystują tworząc formy nitkowate lub cenocyty. Różne aspekty wrażliwości bakterii na bodźce chemiczne omówiono w pracy przeglądowej Mansona i wsp. autonomicznych komórek. które przyciągają komórkę. a więc w stronę większego stężenia składników pokarmowych. Celowe zachowanie jest więc wynikiem selekcji ruchów przypadkowych. 5). przypadkowa celowość ruchu (ang. uwolnienie cząsteczki atraktanta od receptora MCP wzmacnia sygnał wywołujący rotację rzęski w kierunku zgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara (który sprzyja koziołkowaniu). Częstość koziołkowania wzrasta więc w miarę oddalania się komórki od atraktanta. Obydwa rodzaje związków określa się łącznie jako efektory. receptor (w danym czasie) może mieć większe bądź mniejsze powinowactwo do wiązania cząsteczki efektora. 6). sekcja 7. biased random walk). Mogą one przemieszczać się w kierunku stężenia tlenu (wyższego lub niższego) optymalnego dla ich wzrostu (sekcja 3.Może. 34 . że większość bakterii występuje w formie pojedynczych. a zwiększać. 3. 3 Formy nitkowate i cenocyty Wspomniano wcześniej. Aerotaksja jest szczególnym rodzajem chemotaksji. gdy zaczyna się od niego oddalać. Związki. że sygnał wywołujący ruch tego typu wymaga zmiany stanu energetycznego komórkowej błony cytoplazmatycznej (sekcja 5. W łańcuchu paciorkowców. W zależności od kierunku gradientu. 1. W jaki sposób komórka „wyczuwa" różne stężenia danego związku i jak kontroluje częstość koziołkowania? Komórka płynąca w kierunku zwiększającego lub zmniejszającego się stężenia efektora może wykryć zmianę stężenia np. chociaż komórki dzielą wspólne mikrośrodowisko. Połączenie atraktanta z receptorem (bądź rozpad tego kompleksu) powoduje hamowanie lub stymulowanie pewnych sygnałów wewnątrzkomórkowych. nazywa się atraktantami. które powodują jej ucieczkę — repelentami. 6. to jednak każda z nich funkcjonuje zupełnie niezależnie. signal transduction pathway. Na przykład.

(Pory takie nie występują w zwykłym „łańcuchu" komórek. Taki wielonukleoidowy organizm nazywany jest cenocytem. a także niektóre inne bakterie tworzą rurkowate strzępki pozbawione sept. 1 Formy nitkowate U niektórych bakterii. jaki tworzą np. 3. 3. gatunki z rodzaju Beggiatoa. Umiejscowienie septy (w formie przewężenia) nie zawsze jest widoczne z zewnątrz filamentu. Formy takie tworzy wiele cyjanobakterii i np. Sąsiadujące komórki komunikują się ze sobą za pomocą niewielkich porów (mikroplazmodesmy). . komórki po kolejnych podziałach pozostają ze sobą połączone tworząc filamenty (ang. 2. Poszczególne komórki są oddzielone septami. które niekiedy mogą być pokryte wspólną pochewką. W tym przypadku cytoplazma jest więc ciągła — od jednego nukleoidu do następnego. 2 Cenocyty Nitkowate promieniowce Streptomyces. trichomes).2. paciorkowce).

włączając różne cukry i inne węglowodany. 5) odpowiednie pH. że wzrost i rozmnażanie się są u bakterii ściśle ze sobą związane. np. 1 Warunki wzrostu Bakterie rosną jedynie w odpowiednim dla siebie środowisku. sole nieorganiczne i dwutlenek węgla. wartość najwyższej temperatury pozwalającej na wzrost bakterii może być znacznie obniżona w środowisku o nieoptymalnym pH. 6) odpowiednia ilość (lub brak) tlenu. Oczywiście. Wynika z tego. 1 Substancje odżywcze Komórki potrzebują substancji odżywczych do wzrostu. Ogólnie. a termin wzrost oznacza zazwyczaj oba te procesy. który np. metan. bakterie wykorzystują do odżywiania się bardzo różnorodne związki. zależnie od gatunku i warunków. a zmiana jednego z nich może zwiększyć lub zmniejszyć wpływ innego. sterole.ROZDZIAŁ 3 Wzrost i rozmnażanie Wzrost komórki bakteryjnej jest związany ze skoordynowanym zwiększeniem masy jej części składowych. alkohole. 4) odpowiednia temperatura. wzrost może być wolniejszy lub może nie zachodzić wcale. przy czym nie jest to jedynie wzrost całkowitej masy. podobne do siebie lub identyczne. 1. Pojedyncza bakteria nie może jednak wykorzystać tych wszystkich związków. 2) źródło energii. bakterie mogą nawet ginąć. mógłby być powodowany nagromadzeniem się związków zapasowych w komórce. żaden z tych czynników nie działa osobno. aminokwasy. Do czynników wzrostowych ważnych dla bakterii należą: 1) dostęp odpowiednich substancji odżywczych. przeżycia i podziału. węglowodory. Wzrost prowadzi zazwyczaj do podziału komórki na dwie komórki potomne. Jeśli nie jest ono optymalne. 3) woda. ponieważ nie ma 36 . 3. 3.

Niektóre ważne problemy związane z odżywianiem się bakterii są poruszone w rozdziałach 6 i 10. Pyrodictium 37 . niekiedy może być ona związana w hydrofilowych żelach lub przez jony znajdujące się w roztworze). poza którą w ogóle nie rośnie. w różnym zakresie. Energii poświęcony jest rozdział 5. 55-70°C) i Thermotnicrobium (opt. każdy typ bakterii rośnie najszybciej w określonej temperaturze — optymalnej temperaturze wzrostu. Dla każdej bakterii istnieje określona maksymalna i minimalna temperatura. w kompostach. Gatunki fototroficzne otrzymują energię głównie lub wyłącznie ze światła. 3 Woda Około 80% lub więcej bakteryjnej masy stanowi woda. fosforu. Zaliczamy do nich gatunki Thermobacteroides (opt. 1. Bakterie termofilne to takie. Podczas wzrostu substancje odżywcze wchodzą do komórki. Niektóre bakterie zdolne są do zaspokojenia tych potrzeb wykorzystując proste sole nieorganiczne i takie związki jak dwutlenek węgla i amoniak. Wśród Archaea. Termofile występują np. [Desiccation tolerance of prokaryotes: Potts (1994) MR 58: 755-805. azotu. kominach hydrotermalnych na dnie oceanu. Bakterie mogą więc rosnąć w środowisku zawierającym odpowiednią ilość wolnej (dostępnej) wody. siarki i innych pierwiastków tworzących materię organiczną. a produkty odpadowe opuszczają ją w postaci roztworów. gorących źródłach. 1. komórki bakteryjne potrzebują źródła węgla. 1. jak również jej osłony nie mają systemów umożliwiających pobranie (transport) tych licznych składników do wnętrza komórki. 4 Temperatura Ogólnie. bardziej lub mniej skomplikowanych związków organicznych. (Nie cała woda w danym środowisku dostępna jest dla bakterii. natomiast gatunki chemolitotroficzne uzyskują energię na drodze „przetwarzania" związków chemicznych pobranych ze środowiska. gdy temperatura przekracza bądź nie osiąga optimum. Krańcowy brak wody (wysuszenie) jest tolerowany w różnym zakresie przez poszczególne gatunki bakterii. pochodzących z innych organizmów. których optymalna temperatura wzrostu przekracza 45°C. 3. inne bakterie potrzebują. 3. Niektóre gatunki wykorzystują oba źródła energii.wszystkich niezbędnych enzymów. 70-75°C). 2 Energia Energia jest potrzebna żywej komórce do przeprowadzenia większości ważnych reakcji chemicznych. np. ] 3. Wzrost zamiera. Niezbędna jest również np. do ruchu rzęski i do pobrania różnych substancji odżywczych. Niezależnie od gatunku. Całość energii jest uzyskiwana ze źródeł znajdujących się w środowisku. wiele gatunków nie może jednak przeżyć przez długi czas w stanie wysuszonym.

1. 5 i 9. które przeżywają pasteryzację (sekcja 12. 2-8. w mułach rzecznych lub w żwaczu przeżuwaczy.ma niezwykle wysoką temperaturą optymalną — 105°C. 3. gatunek. najlepiej jednak rosną powyżej 15°C. pH 8. nazywane są właściwymi lub bezwzględnymi tlenowcami. 1). Mezofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze między 15 a 45°C. w morzach podbiegunowych. a najniższa temperatura umożliwiająca ich wzrost to 0°C lub niższa. organizmy te występują np. W bakteriologii mleczarskiej do tej grupy zalicza się bakterie. ale mogące również rosnąć w warunkach beztlenowych (tj. Adaptacja ta widoczna jest w budowie struktur komórki (np. 0-5°C). które muszą mieć tlen do wzrostu. Bakterie termowytrzymałe mogą przeżywać — choć niekoniecznie rosnąć — w temperaturze. Do tych acydofilów należy Thiobacillus thiooxidans. dla podkreślenia ich całkowitej zależności od tlenu. 3. 5) występuje np. 2. 5) było odnajdywane w ściekach z przemysłu przetwórstwa ziemniaczanego. pH 8. Acydofile i alkalofile mogą rosnąć wolno lub nie rosną wcale w pH 7. a Exiguobacterium aurantiacum (opt. przy braku tlenu). Psychrotropowe bakterie mogą rosnąć w niskich temperaturach (np. Inne alkalofile są spotykane w naturalnych zasadowych jeziorach. Jeszcze inne mogą rosnąć niezależnie od dostępności lub braku tego pierwiastka. Mezofile żyją w wielu środowiskach. a w niektórych wypadkach nawet w rodzaju metabolizmu energetycznego (patrz sekcja 5. 1. Jednak pewne bakterie (odnajdywane np. dla którego optymalne pH wynosi 2-4. Alkalofile rosną najlepiej w środowiskach zasadowych — zazwyczaj powyżej pH 8. Psychrofile występują np. rosnących) bakterii. nie rosną powyżej około 20°C. natomiast inne — jego braku. 1. natomiast dla Thermoplasma acidophilum optymalne pH wynosi 0. Gatunek Sulfolobus należący do Archaea rośnie w pH 1-5. Psychrofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze 15°C lub poniżej. 5 pH Większość bakterii rośnie najlepiej w pH około 7 (obojętne). błony cytoplazmatycznej). 3. Niektóre termofile odznaczają się cechami związanymi z adaptacją do wzrostu w wysokiej temperaturze. Bakterie zwykle rosnące w obecności tlenu. należą do nich bakterie patogenne dla człowieka i zwierząt. w kopalnianych ściekach lub niektórych gorących źródłach) nie tylko tolerują. 8-3. Bakterie. z czego znaczna część nie może w ogóle rosnąć w pH silnie kwaśnym lub zasadowym. nazywane są względnymi 38 . 6 Tlen Niektóre bakterie wymagają do wzrostu tlenu. Thermobacterium roseum (opt. Właściwe lub bezwzględne beztlenowce rosną jedynie w warunkach braku tlenu. 6). górna granica ich wzrostu wynosi 20°C. która na ogół zabija większość innych wegetatywnych (tj. lecz nawet „wolą" kwaśne lub bardzo kwaśne środowisko. w ciepłych źródłach.

1. Adaptacja wymaga niejednokrotnie syntezy nowych rodzajów białek (niezbędnych do pełnienia specyficznych funkcji) lub zahamowania syntezy innych. 1). które mogą rosnąć w elektrolitach o stężeniu 2. Niektórzy przedstawiciele Archaea (np. 15. należy do nich wiele szczepów StaphyloJony nieorganiczne mogą być istotne dla regulacji wielu funkcji fizjologicznych. 7 Jony nieorganiczne Wszystkie bakterie wymagają jonów nieorganicznych (np. 6. 4. 4. gdy stężenie tlenu jest mniejsze niż w powietrzu (na ogół znacznie). 2. (1996) JB 178: 3677-3682]. 3. 2) i w wielu innych enzymach. Taka kontynuacja wzrostu (lub przeżycie) oznacza. np. 2) i sporulacji u B. 1.beztlenowcami. 3. Zwiększenie osmolalności prowadzi do wypływu 39 . chemotaksji (sekcja 2. Halotolerancyjne bakterie są definiowane jako nie-halofile. są przykładami krańcowych halofilów: potrzebują stężenia przynajmniej 1. że organizmy te albo nie są wrażliwe na określone zmiany. Halobacterium salinarium). które występują w słonych jeziorach. magnez — w błonie zewnętrznej (sekcja 2. Jony pełnią różne funkcje. ale mają zdolność do wzrostu w obecności tlenu. 1. gdy w środowisku zaszły istotne zmiany. Na przykład jony Ca 2+ pełnią stwierdzoną lub tylko przypuszczalną rolę w nabywaniu zdolności transformacji (kompetencji) (sekcja 8. Mikroaerofilne bakterie zazwyczaj rosną najlepiej. a mangan i nikiel — w enzymach i systemach enzymatycznych (patrz również sekcja 11. 8. 8 Odpowiedź na zmieniające się warunki — adaptacja Bakterie żyjące w środowiskach bardzo wyspecjalizowanych. a 3-4 Μ do wzrostu wydajnego. rybosomów i osłon komórki. Podobnie te. np. 1. ulec zmianie) w sposób umożliwiający tolerancję lub czerpanie korzyści z nowych warunków. 3). subtilis (sekcja 7. 2). np. 2). Innym przykładem jest adaptacja do zmian osmolalności środowiska lub pożywki (= osmoregulacja). żelazo w cytochromach (sekcja 5. 15. 2.. Elektrolity służą do stabilizacji struktur komórkowych. co z kolei pociąga za sobą zmiany w wyrażaniu się różnych genów (rozdz. 8. większe stężenie na ogół hamuje wzrost. nazywamy względnymi tlenowcami. Niektóre bakterie charakteryzują się aerotaksja (sekcja 2. w krańcowej temperaturze lub wewnątrz komórek innych organizmów. 2. 5 Μ NaCl do wzrostu. 1) [Calcium signalling in bacteria: Norris i wsp. itp. albo zdolne są zaadaptować się (tj. które zwykle rosną beztlenowo. nie tolerują zazwyczaj innych środowisk. 5 M. 6). Pewne bakterie (halofile) rosną jedynie w obecności dużych stężeń elektrolitów (zazwyczaj NaCl). Wiele jednak bakterii nadal rośnie (lub przynajmniej przeżywa) nawet wtedy. coccus. 1. w roztworach rozcieńczonych komórki niektórych gatunków pękają z powodu rozluźnienia osłon. Jednym z przykładów może być adaptacja Salmonella typhimurium do warunków silnie kwasowych (sekcja 7. solonych rybach. 2. chlorkowych lub magnezowych) w małym stężeniu. 9. 7).

Większość K+ uwalnianego przez E. Halotolerancyjna bakteria Staphylococcus aureus ma dwa systemy transportujące betainę glicynową [patrz np. 1) nazwanego ProU [Lucht i Bremer (1994) FEMSMR 14: 3-20]. „kanały mechanowrażliwe" w błonie cytoplaz- 40 . Prowadzi to do przeciwdziałania wysokiej zewnętrznej osmolalności przez wzrost osmolalności zewnętrznej. a to z kolei zmniejsza turgor i zwiększa stężenie roztworów wewnątrzkomórkowych do poziomu hamującego wzrost. sekcja 7. w związku z czym nie mogą one powodować zwiększonej osmolalności tej bakterii. które mogą być gromadzone wewnątrz komórki nawet w dużych stężeniach bez negatywnego wpływu na jej przeżywalność. Prowadzi to do wzrostu wewnątrzkomórkowej osmolalności. Pourkomalian i Booth (1994) Microbiology 140: 3131-3138]. która jest wydajnie pobierana przez E. których stopień fizjologicznej szkodliwości zależy od ich stężenia. Wypływ nie jest uzależniony od energii metabolicznej. K+ i glutaminian są gwałtownie usuwane przez E. coli przy udziale systemu transportowego zależnego od białka wiążącego (sekcja 5. [Regulation of compatible solute accumulation in bacteria: Poolman i Glaasker (1998) MM 29: 397-407]. pobierając jony potasowe (K+) i syntetyzując glutaminian (jon o przeciwnym ładunku). 4. że system Kdp zostaje włączony na skutek zmniejszenia turgoru (lub przez podobny czynnik). Escherichia coli reaguje natychmiast na wzrost osmolalności. Pobranie betainy glicynowej w następstwie podwyższenia ciśnienia osmotycznego jest zjawiskiem powszechnym zarówno wśród bakterii gramujemnych. system Trk (który jest konstytutywny — tzn. coli w wyniku obniżenia ciśnienia osmotycznego przechodzi przez tzw. W przypadku tego organizmu zwiększenie ciśnienia osmotycznego powoduje gromadzenie endogennych substancji rozpuszczalnych (np. a specyficzne. włączając betainę glicynową. (1998) JB 180: 5044-5051]. Wydaje się. 1. np. 8. 6). W pobieraniu K+ bierze udział kilka systemów transportu (sekcja 5. Wynika z tego. co powoduje zmniejszenie ich rozmiarów. jak i gramdodatnich. Podwyższenie ciśnienia osmotycznego przyczynia się również do pobrania (lub syntezy de ηονο) nieszkodliwych substancji rozpuszczalnych. że substancje te mogą zastępować przynajmniej część nagromadzonych jonów potasowych. nieszkodliwe substancje rozpuszczalne są uwalniane przez inne organizmy. zawsze aktywny) i system Kdp (który jest indukowany przez wysoką osmolalność. Sinorhizobium meliloti metabolizuje (a więc nie akumuluje) większość znanych osmoprotektantów. glutaminianu i amidu N-acetyloglutaminyloglutaminowego). coli. 4). np. Do nieszkodliwych rozpuszczalnych substancji zalicza się betainę glicynową ((CH3) -N+-CH2COO") — cząsteczkę powszechnie występującą. W Escherichia coli znaczne podwyższenie zewnętrznej osmolalności prowadzi do zmian we względnych ilościach niektórych białek tworzących pory błony zewnętrznej.wody z komórki. którego akumulacja jest stymulowana przez endogenną sacharozę [Gouffi i wsp. czyli pewnych rodzajów małych cząsteczek. co kontrastuje z pobieraniem betainy glicynowej przez system transportu ProU (który jest zależny od ATP). Obniżenie ciśnienia osmotycznego prowadzi do aktywacji systemów wypływu związków z komórki.

komórka początkowo „przeholowuje" (tzn. kanał MscL (sekcja. natomiast jej długość zmniejsza się do rozmiaru końcowego (który nadal przewyższa rozmiar początkowy). Genetyczne i regulacyjne problemy związane z adaptacją są omawiane w sekcjach 7. średnica pozostaje niezmienna. 2. 1. osiągając nową wartość. (rys. jej długość szybciej i. zbytniego zmniejszenia się długości komórki. 1 Cykl życiowy Większość badań dotyczących cyklu życiowego komórki wykonano z Escherichia coli (gramujemną pałeczką) i głównie na tych danych oparte jest przedstawione podsumowanie. Szybko rosnące komórki są większe (pod względem masy i objętości) niż komórki rosnące powoli. 2. im szybciej komórka rośnie (tj. podczas pewnych. 3. syntezy nowych enzymów (białek). 3. a na początku okresu C masa komórki (w przeliczeniu na ilość miejsc początku replikacji chromosomu. Niektóre są syntetyzowane w sposób bardziej lub mniej ciągły. Podczas wzrostu ze stałą szybkością przyrost masy komórki jest związany jedynie z przyrostem jej długości. Następnie rośnie średnica komórki. część dolna) są praktycznie stałe. zwiększa się bardziej niż byłoby to właściwe dla nowej szybkości wzrostu). co wymaga. między innymi. im krótszy jest okres I). C + D. w rezultacie. 2 Wzrost pojedynczej komórki W rosnących komórkach obserwujemy skoordynowany wzrost masy jej składników. tzw. 6. okresy cyklu życiowego C i D.. 8. Ten cykl zdarzeń związanych ze wzrostem i podziałem komórki na dwie potomne nazywany jest cyklem życiowym. 6 i 7. Wiele względnie beztlenowych bakterii (sekcja 3. 5). Struktury zwane akwaporynami (ang. 6) może adaptować się do wzrostu beztlenowego (lub powracać do życia w warunkach tlenowych) przez zmianę alternatywnych dróg metabolizmu energetycznego (rozdz. W tych warunkach. że wszystkie części komórki tworzą się jednocześnie. (1997) JBC 272: 32150-32157]. tym większy będzie wzrost jej masy (i objętości) pod koniec stałego okresu poprzedzającego podział komórki. 2. Gdy czas podwojenia liczby komórek (sekcja 3. zostało to stwierdzone w trakcie badań nad mutantami w genie mscL [Blount i wsp. dokładnie wyznaczonych okresów. 3-7. 8). 2. 8. 8. 41 . Wraz ze zwiększeniem szybkości wzrostu komórka staje się większa: średnica komórki wzrasta powoli. dowodów na to jednak nie ma. Zmniejszenie szybkości wzrostu prowadzi do początkowego. np. Również i w tym wypadku średnica komórki przystosowuje się wolniej niż jej długość do nowej szybkości wzrostu [Zaritsky i wsp. aquaporins) (sekcja 2. 8) mogą odgrywać rolę w osmoregulacji. 2. (1993) JBM 139: 2711-2714]. origins) jest również stała dla danej szybkości wzrostu. Rozmiary komórki podczas wzrostu. 3. 2.matycznej. 2. 3) jest krótszy niż 1 godz. inne tworzą się w określonej kolejności. 2. Słowo „skoordynowany" nie znaczy.

a to z kolei jest uzależnione od uprzedniego związania w tym miejscu wielu cząsteczek DNA. Holtje postuluje istnienie dwóch typów holoenzymów: jednego działającego w ścianie komórkowej. Model jest przedstawiony na rysunku 3.Synteza osłon komórkowych. 2. a przede wszystkim do biegunów komórki. wiadomo jednak. 2. mimo że jest regulowana. może zajść w różnych. 3) i podziału komórkowego jest przedstawiona w sekcji 3. Oba typy enzymów byłyby związane z białkami wiążącymi penicylinę (ang. 2. 1. 8) i z „litycznymi transglikozylazami". Jednym z nich jest wewnątrzkomórkowe stężenie białka DnaA (lub. nagłówek). Synteza osłon komórkowych zachodzi prawdopodobnie w ciągu całego cyklu komórkowego podczas ciągłego. 2. 6). PBPs. 7. 2. Co kontroluje inicjację (rozpoczęcie) replikacji podczas cyklu życiowego? Odpowiedź na to pytanie nie jest znana. jak i istnienie różnych typów mostków peptydowych. Wynika stąd. że niedostateczna ilość DnaA może opóźniać inicjacje. Ważne jest porównanie górnych i dolnych zbiorów sekwencji 1+ C + D oraz zwrócenie uwagi na synchronizacje inicjacji (początek okresu C) z różną szybkością wzrostu. że błona cytoplazmatyczna rozwija się w sposób bierny. Niedawno Holtje [Microbiology (1996) 142: 1911-1918] przedstawił model woreczka (sakulusa) peptydoglikanowego. Model ten uwzględnia zarówno liczne cechy biosyntezy. Synteza peptydoglikanu zależy jednak od syntezy fosfolipidów błonowych. enzymami mającymi zdolność do degradacji peptydoglikanu w sposób procesywny (tzn. jakie są w komórce [Nordstrom i Austin (1993) MM 10: 457-463]. Niektóre czynniki pełnią istotną rolę w inicjacji replikacji. 4. Hipoteza ta jest zgodna z późniejszymi badaniami dotyczącymi metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach [Park (1993) JB 175: 7-11]. 1 i na rysunku 3. iż inicjacja. Jeden z modeli [Cooper (1991) MR 55: 649-679] przyjmuje. sekcja 2. jednostajnego wzrostu. drugiego — związanego z tworzeniem septy. 3). cięcie enzymatyczne związane jest z przesunięciem się enzymu). Czasową zależność inicjacji replikacji od szybkości wzrostu przedstawiono na rysunku 3. które występują w woreczku (ryc. jest równe połowie C). Inicjacja replikacji wymaga rozdzielenia dwóch nici DNA w chromosomowym origin (sekcja 7. (Może to być przydatne do narysowania nowego zbioru 1+ C + D. zwany „3 za 1". a to sugeruje nowy sposób regulacji wzrostu osłony komórkowej [Rodionov i Ishiguro (1996) Microbiology 142: 2871-2877]. Przyjmuje się. Niezbędna koordynacja replikacji (DNA) chromosomu (sekcja 7. że Peptydoglikan jest włączany w sposób rozproszony do ściany bocznej. natomiast w okolicach biegunów występuje kilka jego warstw. po prostu „dotrzymuje kroku" rosnącemu woreczkowi peptydoglikanowemu. Wyniki tych badań sugerują. oznaczające początek replikacji. tj. W celu koordynacji różnych syntetycznych i litycznych procesów związanych z syntezą woreczka. Replikacja chromosomu (DNA). 1. tj. że ściana boczna zawiera jedną warstwę peptydoglikanu. być może. określonych momentach od rozpoczęcia cyklu (zależy to od szybkości wzrostu) oraz że zachodzi ona mniej więcej w tym samym czasie we wszystkich miejscach origin. jego aktywnej formy). gdzie I. 42 . Metaboliczny obrót peptydoglikanu pozwala na ponowne wykorzystanie peptydów podczas wzrostu komórki (sekcja 5.

co prowadzi do powstania mostka potrójnego (rys. Według przedstawionego modelu podwojenie długości komórki wymaga. 7b).(a) Pojedyncza warstwa peptydoglikanu. 2. 43 . Aby te wiązania mogły powstać. że mechanizm wzrostu musi mieć możliwość odróżnienia „starych" łańcuchów do usunięcia od „nowych". być może w połączeniu z pierścieniem FtsZ (sekcja 3. że środkowy łańcuch w trójce. zwany łańcuchem „do wycięcia". Boczne łańcuchy tej trójki są połączone kowalencyjnie z każdej strony z łańcuchem „do usunięcia". (c) Łańcuch „do usunięcia" usuwany jest enzymatycznie. Widać stąd. ponieważ nowo syntetyzowany Peptydoglikan jest związany z woreczkiem jedynie przez mostki peptydowe typu tetra-tetra (rys. Przedstawiony model zakłada. boczny peptyd (rys. 7b). zostanie zastąpiony przez trzy inne łańcuchy (stąd nazwa „3 za 1"). Struktura ta znajduje się pod stałym naprężeniem. zostały zastąpione przez nową trójkę. aby: 1) łańcuchy „do usunięcia" wymieniły się w woreczku i 2) tylko te z łańcuchów do usunięcia. nowy tryplet zajmuje pozycję usuniętego łańcucha. (b) Trzy połączone łańcuchy są umieszczone pod (tzn. ze względu na naprężenie warstwy peptydoglikanu. 2. Z tego powodu podwójny mostek łączący każdy z bocznych łańcuchów powinien mieć wolną grupę ε-aminową położoną w bocznym peptydzie bocznego łańcucha. Środkowy łańcuch . Ma to znaczenie w wydłużaniu się komórki. Natomiast na początku każdego nowego cyklu komórkowego wszystkie wiązania tetra-tetra muszą przejść (na skutek działania enzymu LD-karboksypeptydazy) w wiązania tetra-tri. tworzenie septy). co z kolei pozwala na ich rozpoznanie jako łańcuchy „do usunięcia". od strony cytoplazmy) warstwą peptydoglikanu. Kolejne dodawanie trójek w miejscu wyznaczającym środek komórki. 1. będzie funkcjonował jak nowy łańcuch „do usunięcia". że nowe łańcuchy (identyfikowane przez wiązania tetra-tetra) nie są rozpoznawane jako łańcuchy „do usunięcia". 7b) każdego bocznego łańcucha łączy się z grupą ε-aminową podwójnego mostka peptydowego. a następnie. W ten sposób nowe łańcuchy „do usunięcia" włączone podczas bieżącego cyklu komórkowego nie mogą być zastąpione dopóki nie rozpocznie się nowy cykl. może mieć znaczenie dla wrastania peptydoglikanu do wnętrza komórki podczas tworzenia się septy. Postulowano więc. 2. które były na początku nowego cyklu komórkowego. 2. po włączeniu do woreczka peptydoglikanowego. Jest to możliwe.

każda z nowych komórek potomnych ma dokładnie jeden chromosom. Cykl podziału komórki może być przedstawiony jako liniowy ciąg złożony z trzech okresów: I. a więc na długo przed podziałem komórki. D jest okresem tworzenia septy. W wyniku tego każda komórka potomna przedstawiona na rysunku ma około 1 1 / 2 chromosomu. 3). I oznacza okres między początkiem kolejnych rund replikacji chromo- 44 . oznaczonym jako małe kółko.Replikacja zaczyna się w określonym miejscu chromosomu — origin (sekcja 7. Dzieje się tak. C to okres. nowa runda replikacji rozpoczyna się przed zakończeniem poprzedniej. Kiedy wzrost jest powolny (góra). pod jego koniec następuje podział komórki. Kiedy wzrost jest szybki. ponieważ po podwojeniu się chromosomu nowa runda replikacji nie zaczyna się przed końcem podziału komórkowego. podczas którego zachodzi replikacja. C i D.

W szybko rosnących komórkach stadium replikacji chromosomu w nowej komórce potomnej zależy od momentu inicjacji. którego stężenie wewnątrzkomórkowe jest jest odwrotnie proporcjonalne do szybkości wzrostu. 7. W każdym. Regulacja czasu inicjacji może być związana z opóźnioną lub stopniową metylacją oriC. Mechanizm rozdziału chromosomów do komórek potomnych nie jest znany. a to z kolei może opóźnić inicjację (patrz wyżej oraz rozdz. Duże stężenie może hamować syntezę białka DnaA. Dolny zestaw I + C + D przedstawia kolejne cykle komórkowe. 2. że ppGpp ma również związek z syntezą białka FtsZ biorącego udział w tworzeniu septy. (1993) MM 7: 343-350]. Niektóre z mutacji w genie parC E. 1). nowa runda replikacji chromosomu nie zacznie się przed końcem okresu D. inicjacja jest połączona z szybkością wzrostu. Górny zestaw I + C + D pokazuje kolejne cykle komórkowe podczas powolnego wzrostu. czyli od początku okresu C w komórce rodzicielskiej. jak ogniwa łańcucha). związanego z tą funkcją (produktu genu mukB) [Chromosome partitioning in Escherichia coli: Lobner-Olesen i Kuempel (1992) JB 174: 7883-7889]. W tej sytuacji. Rozdział jest związany z funkcją pewnych enzymów (topoizomeraz). 2. Jeśli jakaś istotna topoizomeraza jest niefunkcjonalna (np. 3). 8. Dekatenacja i rozdział chromosomów. Może polegać na: 1) połączeniu nukleoidów z błoną cytoplazmatyczną (wtedy byłyby one rozsuwane mechanicznie). ciągu I + C + D stosunek między daną sekwencją I + C + D a tą wykreśloną powyżej obrazuje stosunek komórek potomnych do rodzicielskich. Ciekawe jest to. 2) wzajemnym odpychaniu się nukleoidów lub/i 3) działaniu przypuszczalnego białka. Jeden z sugerowanych mechanizmów tej korelacji jest związany z małą cząsteczką. a więc pod koniec okresu D nowa runda replikacji jest już w toku. 4. przed końcem podziału komórek. czyli przegrody komórkowej (co będzie omówione dalej). 2. Chromosomy po rozdziale ulegają zagęszczeniu i tworzą nukleoid (sekcja 2. a więc muszą się rozdzielić. że gdy I = C + D. 8). które mogą przeciąć jedną lub dwie nici DNA. Zaraz po powieleniu chromosomy występują w formie katenatów (czyli są szczepione ze sobą. 5'-difosforanem 3'-difosfoguanozyny (tetrafosforanem guanozyny. przedstawionym na diagramie. ppGpp). czego przyczyną może być trudna dostępność miejsc regulacyjnych dla enzymów metylujących. 5). gdy wzrost jest szybki. Może to być zależne od przyłączenia wielu cząsteczek białka HU. somu (tj. coli (kodującym podjednostkę topoizomerazy IV) zapobiegają dekatenacji i prowadzą do powstania bardzo długich komórek — filamentów (zawierających sczepione chromosomy). że kolejna runda replikacji chromosomu rozpoczyna się zanim poprzednia runda dobiegnie końca. coli okresy C i D są mniej więcej stale i wynoszą odpowiednio 42 min i 22-25 min. 7.Innym czynnikiem jest stopień metylacji origin (oriC) (sekcja 7. tj. Koniec poprzedniego okresu I zbiega się z początkiem okresu następnego. dekatenacja nie zachodzi. Podczas podziału każda z komórek potomnych otrzymuje tę samą liczbę chromosomów. DNA) i równa się czasowi podwojenia się liczby komórek (sekcja 3. a następnie przesunąć je (ją) przez powstałą lukę. które wiąże się najlepiej do zgiętego DNA [Pontiggia i wsp. 45 . W szybko rosnących komórkach E. co znaczy. okres I jest krótszy niż C. 8. w wyniku mutacji). jak również komórek pozbawionych jądra (nie zawierających chromosomu). Należy zauważyć. W końcu.

Zarówno SpoOJ. przyczynia się prawdopodobnie do ruchu chromosomów potomnych do dwóch biegunów komórki. a więc era może być ważnym czynnikiem podziału komórki [Bacterial division sites: Bouche i Pichoff (1998) MM 29: 19-26]. FtsW. Tak więc rozdział chromosomów wydaje się procesem dynamicznym. również jest potrzebne do utworzenia pierścienia FtsZ. przypominającym mitozę [Glaser i wsp. 1). Powielają się one na początku każdej rundy replikacji DNA. Tworzenie septy rozpoczyna się od powstania pierścieniowatego tworu złożonego z cząsteczek białka FtsZ (produktu genu ftsZ) na obwodzie wewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej w środku komórki (fot. W E. z kolei w pełnieniu tej funkcji pomaga obecność prawidłowego nukleoidu tworzonego w obecności Smc. Inne białko błonowe. Utworzenie pierścienia FtsZ (pierścienia Z) wymaga dostarczenia energii. Methanococcus jannaschi i Archaeoglobus fulgi- . po czym następuje bierny ruch pozostałej. a w konsekwencji może być potrzebne do jego prawidłowego rozdziału. a powstałe skupiska potomne dążą do biegunów komórki. Ten bierny ruch jest prawdopodobnie związany ze wzrostem osłon komórkowych [Sharpe i wsp. że składanie pierścienia Z rozpoczyna się w tzw. coli sugerują rolę ppGpp w kontroli ekspresji FtsZ podczas podziału komórki [Powell i Court (1998) JB 180: 1053-1062]. większej części każdego nukleoidu do miejsc wskazanych przez oriC. Powstanie wiązania między FtsZ a białkiem należącym do osłon komórkowych (ZipA) jest z pewnością konieczne do podziału komórki [Hale i deBoer (1997) Cell 88: 175-185]. „jądrze nukleacji". Badania nad mutantami ftsZ E. Sugeruje się. U Bacillus subtilis prawidłowy rozdział chromosomów (zarówno podczas wzrostu. można z tego wysnuć wniosek. (1998) JB 180: 547-555]. Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. Związek między rozpoczęciem wytwarzania tego pierścienia a cyklem komórkowym nie jest znany. Badania ostatnich lat wykazują. Ten rozdział skupisk. coli mutacje w genie mukB dają prawdopodobnie ten sam efekt. a następnie postępuje dwukierunkowo wzdłuż obwodu komórki. Homodus. Białko Smc Bacillus subtilis (kodowane przez gen smc) prawdopodobnie odgrywa ważną rolę w tworzeniu struktury nukleoidu. jak i Smc mają więc udział w tworzeniu nukleoidów gotowych do rozdziału [Britton. Tworzenie septy. co określa płaszczyznę późniejszej septy. jak i sporulacji) jest zależny od produktu genu spoOJ. że rozdział nukleoidów może być procesem dwufazowym. że Smc i MukB pełnią podobne funkcje. 46 logi Smc były opisane w archeonach. nie związany z wydłużaniem się komórki. 3. Samo tworzenie miejsc nukleacji może zależeć od białka Era (produktu genu era) — GTPazy należącej do superrodziny Ras. Rosnąca komórka może się podzielić na dwie potomne przez wytworzenie rozdzielającej je ściany komórkowej (septy).Badania bakterii z rodzaju Bacillus sugerują. Mutacje w smc są przyczyną powstania nienormalnych (mniej gęstych) nukleoidów. że SpoOJ bierze udział w organizacji regionu oriC. (1997) GD 11: 1160-1168]. Początkowo regiony oriC nukleoidów odpychają się wzajemnie w sposób aktywny. SpoOJ tworzy skupiska umiejscowione na biegunach komórki. które mogą być nieprawidłowo zwinięte oraz mogą przeszkadzać w tworzeniu się prawidłowych skupisk Spo0J.

Komórki E. 491-503].Co ciekawe. kiedy 47 . że aparat związany z podziałem komórkowym występował już u wspólnego przodka prokariotów [Wang i Lutkenhaus (1996) MM 21: 313-319]. 3. że tworzenie miejsc podziału nie zależy od obecności chromosomu [Sun. Pierścień Z wytwarzany jest również przez Archaea. U innych gatunków podział może nie następować natychmiast. Podczas szybkiego wzrostu nowa runda replikacyjna rozpoczyna się. 2) replikację chromosomu w jednym cyklu komórkowym. 3). 2. W tej sytuacji nowa komórka potomna otrzymuje tylko jeden chromosom. 1. Wskazuje to. Yu i Margolin (1998) MM 29. Jeśli wzrost jest powolny. bezjądrowe komórki (powstałe w wyniku omawianej poprzednio mutacji parC) również mogą tworzyć pierścień — pierścień C. 1 Model Helmstettera-Coopera W cyklu komórkowym bardzo ważna jest właściwa synchronizacja replikacji chromosomu z podziałem komórki. 3. coli rozchodzą się natychmiast po podziale. co prowadzi do powstania zgrupowań komórek (sekcja 2. to między podziałami zachodzi jedno całkowite podwojenie się chromosomu. Cykl komórkowy Archaea jest omówiony przez Bernandera [(1998) MM 29: 955-961]. Model Helmstettera-Coopera opisuje (rys. co sugeruje. 1.

8. 3. 2) Nie ma bezpośrednich dowodów na związek replikacji chromosomu z podziałem komórki. który między innymi hamuje podział komórkowy. Tak więc. 3. położonymi blisko biegunów. ale również prawidłowe ich rozmieszczenie w obrębie komórki. którego produkt blokuje FtsZ. MinCD nie może się wiązać w środku komórki. z wytworzeniem dwóch nowych biegunów w komórkach potomnych. Nordstrom. Oznacza to. MinCD usuwa białko FtsZ. Bernander i Dasgupta (1991) MM 5 769-774] są zwolennikami istnienia kontroli niezależnej. 1) w komórkach Bacillus subtilis tworzenie się septy przy biegunach może również zależeć od działania kompleksu MinCD (patrz podpis do rys. Jeden z modeli zakłada. 1. Niektórzy badacze [np. 1). morfogenów i ich produktów. uszkodzenie DNA potencjalnie prowadzące do zahamowania replikacji indukuje system SOS (sekcja 7. 3 Kontrola cyklu komórkowego W cyklu komórkowym jakiekolwiek zdarzenie może być bezpośrednio uzależnione od wystąpienia zdarzenia poprzedniego. 2. 14). że białko FtsZ (sekcja 3. bądź też mogą być skoordynowane. sytuacja ta pozwala białku FtsZ zapoczątkować tworzenie się septy w połowie długości komórki. chociaż pośrednia ich koordynacja z pewnością istnieje. 7) cyklu komórkowego wymaga prawidłowego funkcjonowania tzw. 1) Niektóre zdarzenia w cyklu komórkowym mogą być zablokowane niezależnie. białko konieczne do zapoczątkowania tworzenia się septy (sekcja 3. które kodują białka wiążące penicylinę. że podczas podziału komórki septa musi się wytworzyć raczej w pozycji odpowiadającej połowie jej długości. 3. Geny te muszą zapewnić nie tylko tworzenie odpowiednich produktów we właściwym czasie. Zdarzenia te mogą być kontrolowane niezależnie. Na przykład podział komórki może nastąpić bez poprzedzającej go replikacji chromosomu lub właściwego rozdziału nukleoidów. To zahamowanie jest związane z genem sulA należącym do systemu SOS. W ten sposób można wytłumaczyć wpływ szybkości wzrostu na liczbę chromosomów w komórce (sekcja 2. 2. 2. 2. MinCD. 1). a więc każda komórka może otrzymać więcej niż jeden chromosom — około 11/2 chromosomu. ponieważ wyklucza to poprzednie związanie się produktu genu minE (MinE) w miejscu przyległym [Huang. a nie blisko biegunów komórkowych. 2. 2. że produkty genów minC i minD tworzą kompleks. ze podczas tworzenia się endospor (sekcja 4. Należy zauważyć. 1) musi być w jakiś sposób skierowane do miejsca odpowiadającego połowie długości komórki. jak na rysunku 3. Coa and Luthenhaus (1996) JB 178 5080-5085]. Wiadomo jest na przykład. Produkt morfogenu envA jest konieczny do rozdziału septy. w tym wypadku żaden sygnał nie może być przekazany (w normalnych warunkach) od zdarzenia poprzedzającego etap badany. który wiąże się z alternatywnymi miejscami tworzenia septy. a tym samym zapobiega tworzeniu się septy w pobliżu biegunów. 2. 7. Geny związane z cyklem komórkowym — „morfogeny" Kontrola genetyczna (rozdz. 2) — ogólny mechanizm regulacyjny. 2. 48 . Wiążąc się w tych miejscach.poprzednia nie jest jeszcze zakończona. 1. Za takim wnioskiem przemawia kilka faktów. Do morfogenów należą również geny.

W bakteriologii każde ciało stałe lub płyn przygotowany specjalnie do wzrostu bakterii nazywamy pożywką (podłożem) (sekcja 14. u Pelodictyon — organizmu tworzącego trójwymiarową sieć komórek. „Asymetryczny" podział. 2). u Caulobacter (rozdz. Mycobacterium. 49 . coli) na dwie potomne. Podział na trzy prowadzi do utworzenia trzech komórek z jednej i występuje np. 3. które są zazwyczaj podobne lub identyczne. 3. prowadzący do wytworzenia komórek niepodobnych do komórki rodzicielskiej występuje np. u sinic. Czas ten jest najkrótszy w warunkach optymalnych. 3.3. Populacje mogą się rozwijać na powierzchniach stałych lub w płynach. jest z pewnością najpowszechniejszym sposobem podziału komórek bakteryjnych. dzieli się na dwie. 3 Wzrost populacji bakteryjnych Każda komórka potomna powstała w wyniku podziału komórkowego może sama rosnąć i dzielić się. E. dla niektórych innych gatunków. 2. Komórka więc rośnie. 1 Wzrost na podłożu stałym Jednym z typowych stałych podłoży powszechnie stosowanych w bakteriologii jest galaretowata substancja (żel agarowy) zawierająca związki odżywcze i inne składniki. że czas podwojenia liczby komórek Mycobacterium leprae. nazywany podziałem na dwie. 3 Czas podwojenia liczby komórek Czas konieczny do przebiegu jednego pełnego cyklu komórkowego. np. czyli czas podwojenia liczby komórek. u gatunków Blastobacter. Podział wielokrotny jest związany z powtarzającymi się podziałami podwójnymi i występuje np. waha się zależnie od gatunku i warunków wzrostu. 2. podczas którego komórka potomna powstaje z komórki macierzystej (ojcowskiej) na skutek miejscowego przerostu (pączka) i spotykany jest np. czas ten wynosi wiele godzin. Dla E. Hyphomicrobium i Nitrobacter. w zainfekowanych tkankach trwa około 2 tygodni. W związku z tym. a każda z komórek potomnych powtarza te procesy. 4). Pączkowanie jest formą podziału. Załóżmy. coli minimalny czas podwojenia liczby komórek wynosi około 20 min. 3. bakterii wywołującej trąd. że pojedyncza komórka bakteryjna została umieszczona na powierzchni takiego podłoża dostarczającego wszystkich składników potrzebnych do wzrostu i podziału. Nazywamy ją kolonią. w sprzyjających warunkach z jednej komórki może powstać liczna populacja. W trakcie ciągłego wzrostu i podziału potomstwo komórki wyjściowej tworzy widoczną gołym okiem masę komórek. Wyliczono. 2 Modele podziału komórkowego Podział komórki (np.

Z tego powodu. jak śluz). Może wówczas brakować dostatecznego miejsca do wytworzenia się pojedynczych kolonii. Powierzchnia kolonii natomiast bywa gładka lub szorstka. Wielkość kolonii może być ograniczona np. Potomstwo takich bakterii może pływać w wilgotnej warstewce pokrywającej powierzchnię i w ten sposób rozprzestrzeniać się po całym podłożu. Zlewający się wzrost obserwuje się również po wysianiu na podłoże jednej lub kilku ruchliwych bakterii. przez miejscowe wyczerpanie się substancji odżywczych (zależne od wzrostu kolonii). Konsystencja kolonii może być śluzowata (lepka. w określonych warunkach wzrostu. w przypadku gatunków ruchliwych. Niektóre 50 . krucha (rozpadająca się) itp. fioletowe).Zazwyczaj. Przypuśćmy. Kolonie bakterii nie mających tej cechy są szare. położone blisko siebie kolonie są przeważnie mniejsze od kolonii odległych. liczne. Podłoże pod błoną może być prawie pozbawione komórek. W ten sposób wzrost i podział komórek w podłożu płynnym doprowadza do ich jednolitego rozprzestrzenienia się w całym środowisku. Szybkość powiększania się rozmiarów kolonii zależy od temperatury i innych czynników. Zwiększenie się liczby komórek prowadzi zazwyczaj do wzrostu zmętnienia pożywki. 3). Wyjątkowo niektóre bakterie mają skłonność do tworzenia warstwy (błony) na powierzchni podłoża. Bakterie wytwarzające barwniki tworzą zazwyczaj jaskrawo zabarwione kolonie (np. Potomstwo tak wysianych komórek będzie tworzyć jednolitą warstwę pokrywającą całą powierzchnię podłoża. lecz ich duża liczba została rozprowadzona na powierzchni podłoża. 3. czerwone. 3. albo. że nie pojedyncza komórka. na drodze aktywnego ruchu. białawe lub kremowe. Taki jednolity wzrost nazywany jest zlewającym się („murawa"). kształcie (rys. 3. Podczas wzrostu na różnych podłożach lub w innych warunkach różnicujących mogą powstawać różne rodzaje kolonii. świecąca lub matowa itp. żółte. kolorze i konsystencji. masłowata (podobna do masła). 2 Wzrost w pożywce płynnej W pożywce płynnej bakterie mogą się swobodnie przemieszczać albo na drodze dyfuzji. każdy gatunek tworzy kolonie o charakterystycznym rozmiarze.

Namnażając bakterie w lub na podłożu otrzymujemy hodowlę. które następnie było przechowywane w temperaturze odpowiedniej dla danego gatunku. komórki zaczynają rosnąć i dzielić się z szybkością maksymalną dla danego gatunku w tych warunkach. szczepy Acetobacter xylinum tworzą sztywną błonę zawierającą celulozę. że kilka bakteryjnych komórek zostało wprowadzonych do odpowiedniego płynnego podłoża. Nie zawsze podział komórki rozpoczyna się natychmiast po wprowadzeniu bakterii do świeżego. płynnego podłoża. Często występuje początkowa faza zastoju (faza lag). 8 komórek w czasie 60 min może być 3 oznaczone jako 2 (3 jest wykładnikiem potęgi). Mówimy o wzroście zbalansowanym. np. W fazie tej zachodzi adaptacja do nowego środowiska — np. Liczba komórek podwaja się ze stałą szybkością. w czasie której komórki dzielą się powoli lub nie dzielą się wcale. 2. 4a). 3. że komórki charakteryzują się wzrostem niezbalansowanym. tworzone są enzymy niezbędne do wykorzystania nowych. w których bakterie bytowały przed wprowadzeniem do określonego podłoża. Długość początkowej fazy zastoju zależy w znacznym stopniu od warunków. 1 Hodowle okresowe Przypuśćmy. Mówimy wówczas. że skala ta nie jest przydatna dla dużej liczby bakterii. Początkowe wprowadzenie komórek do podłoża zwie się inokulacją (zaszczepieniem). Czy istnieje inny sposób przedstawienia wzrostu w fazie wykładniczej? Tabela 3. W przypadku wzrostu komórek w podobnym lub tym samym podłożu początkowa faza zastoju jest krótka lub w ogóle nie występuje. Tę fazę wzrostu nazywamy logarytmiczną lub wykładniczą. Długa faza zastoju występuje. 3. 1 (dolny rząd) pokazuje. W regularnych odstępach czasu pobrano małe próbki i policzono zawarte w nich bakterie (metody liczenia bakterii: sekcja 14.błony składają się zarówno z bakterii. że liczba komórek może być wyrażona w postaci potęgi liczby 2. Zabiegi zmierzające do utrzymania określonej temperatury (i/lub innych żądanych czynników) potrzebnych do wzrostu bakterii nazywamy inkubacją. gdy komórki przebywały w trudnych warunkach lub rosły wykorzystując inne substancje pokarmowe lub w innej temperaturze. co dotyczy również całej populacji. Dla komórek danego gatunku bakterii rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach krzywa wzrostu ma określony kształt. 8). jak i produktów ich metabolizmu. dostępnych substancji pokarmowych. czyli wzrostu liczby komórek w czasie. Podczas (adaptacyjnej) fazy początkowego zastoju zachodzi synteza związków chemicznych. np. ale wzrostowi masy populacji bakteryjnej nie towarzyszy przyrost liczby komórek. Każdy z wykładników w ta51 . Wykres przedstawiający liczbę komórek w funkcji czasu nazywamy krzywą wzrostu. 3. Sposób ten umożliwia śledzenie rozwoju populacji. Hodowlą nazywamy więc płynne lub stałe podłoże z bakteriami wyrosłymi (lub nadal rosnącymi) w nim lub na nim. Po adaptacji do nowego podłoża. Oczywiste jest. W logarytmicznej fazie wzrostu wykres przedstawiający liczbę komórek bakterii w funkcji czasu jest ostro wznoszącą się krzywą — przy założeniu. że skala jest arytmetyczna (rys.

Jeżeli więc. 4b). a następnie zatrzymuje się. zamiast bezpośredniego wykreślania liczby komórek wykreślimy log2 danej liczby. 3. log2) odpowiadającej liczby komórek. Z tego powodu wzrost staje się wolniejszy wraz z upływem czasu. podczas której w ogóle nie obserwujemy wzrostu liczby żywych komórek. Wykres w fazie logarytmicznej będzie nadal linią prostą — zmieni się jedynie jej nachylenie. Rosnące komórki zużywają substancje odżywcze i wytwarzają produkty odpadowe. logio i log2 mogą być wzajemnie zamienione z zastosowaniem następującego wzoru: log 10 N=0. Wykreślając krzywe wzrostu wygodniej jest zastosować logio zamiast log2. tj. (Warta przeczytania jest krótka monografia „Life after log" [Siegele i Kotler (1972) JB 174: 345-348]. Może to nastąpić w wyniku wyczerpania się substancji odżywczych. wynikiem będzie linia prosta (rys. nazywa się fazą stacjonarną. 1 jest oczywiście logarytmem (przy podstawie 2. Na takim wykresie każda jednostka na skali log2 określa podwojenie liczby bakterii. 52 . Czas podwojenia liczby bakterii (w minutach) może być więc bezpośrednio odczytany z osi wykresu przedstawiającej czas. nagromadzenia się produktów odpadowych lub jednoczesnego działania tych dwóch czynników. które gromadzą się w podłożu. ) Po fazie stacjonarnej następuje faza śmierci. Fazę. 301 log2N. Czas podwojenia liczby bakterii zwany jest również czasem generacji.beli 3. podczas której liczba żywych komórek w populacji stale się zmniejsza.

[Function of secondary metabolites: Vining (1990) ARM 44: 395-427. uboczne produkty podstawowego metabolizmu (związanego ze wzrostem) mogą być zużywane przez komórki do syntezy tzw. choć czasami lepiej jest hodować bakterie w stałych. metabolitów wtórnych. 3. Określenie to pochodzi od tego. iż wzrost bakterii od początkowej fazy zastoju do fazy śmierci zachodzi w tym samym podłożu. które nie są potrzebne do wzrostu. kontrolowanych i ściśle określonych warunkach. Metabolity wtórne wytwarzane przez niektóre gatunki bakterii to ważne antybiotyki lub toksyny. 2 Komórki w różnych fazach wzrostu Biologia komórek i ich metabolizm zmienia się zasadniczo w różnych fazach wzrostu hodowli. ] Dodanie substancji odżywczych we właściwym czasie do hodowli może stworzyć optymalne warunki do syntezy określonych metabolitów w danej fazie wzrostu.Na rysunku 3. komórki rosnące są zazwyczaj zabijane przez penicylinę. hodowli okresowej. 3. W warunkach ograniczających wzrost lub gdy w ogóle go nie ma. 5 pokazano fazy wzrostu tzw. Hodowle okresowe są przydatne do wielu badań. dokarmiane stosuje się w przemyśle. Na przykład. że jego skład nieustannie się zmienia w wyniku zużycia substancji odżywczych i nagromadzenia się produktów odpadowych. 3 Hodowle ciągłe Wzrost bakterii w stałej objętości podłoża (jak w hodowlach okresowych) sprawia. 2. Takie hodowle okresowe. 2. 3. 3. a wraz z ustaniem wzrostu stają się oporne na ten antybiotyk. Możemy to osiągnąć zakładając 53 .

W praktyce idealne (przewidywane) działanie chemostatu nie zawsze można osiągnąć z powodu niedostatecznie szybkiego (natychmiastowego) mieszania lub takich czynników jak wzrost bakterii na ścianach chemostatu. W populacji 54 . Innym problemem jest pojawianie się mutantów (rozdz. 3.hodowle ciągłe (hodowle z ciągłym przepływem. tzn. a każdy skok obrazuje gwałtowne podwojenie się liczby komórek. 2. a podczas wzrostu zapewniony jest ciągły dopływ świeżego. odpowiadającej μmax· Jeśli to nastąpi. W ten sposób masa komórek (biomasa) w chemostacie pozostaje nie zmieniona. hodowla stopniowo ulega rozcieńczeniu. hodowle otwarte). opiera się na tym. tj. Oczywiście wartość D nie powinna przekroczyć krytycznej szybkości D c . gęstość bakterii zmienia się podczas cyklu komórkowego. mówimy. W takich hodowlach bakterie rosną w podłożu płynnym. Związek między specyficzną szybkością wzrostu a stężeniem substancji odżywczej ograniczającej wzrost opisuje równanie Monoda: gdzie μmax oznacza maksymalną szybkość wzrostu. Gęstość jest największa w komórkach tuż przed podziałem i w świeżo powstałych komórkach potomnych. sterylnego podłoża i jednoczesny. w aparacie zwanym chemostatem. 9) podczas długiego okresu hodowli. odpływ hodowli (tj. do badań bakteryjnego metabolizmu. w gramach. Logarytmiczna część krzywej obrazującej taki typ wzrostu — zwany wzrostem synchronicznym — ma wówczas przebieg skokowy. W chemostacie utrzymywana jest zazwyczaj szybkość wzrostu mniejsza od maksymalnej. W celu utrzymania równowagi w chemostacie. s — stężenie substancji odżywczej ograniczającej wzrost. zachodzący z tą samą szybkością. a V — objętość hodowli. podłoża i komórek). Szybkość rozcieńczania (D) równa się F/V. że stosunek masy do objętości. statycznej (nie mieszanej) populacji komórek. Specyficzna szybkość wzrostu (μ) oznacza ilość biomasy wytwarzanej w ciągu godziny w przeliczeniu na całkowitą biomasę. gdzie F to szybkość dopływu pożywki do chemostatu (w litrach na godzinę). Takie warunki umożliwiają ciągły wzrost logarytmiczny. zrównoważony w przedłużonym czasie. 5 μ m a k s . ze względu na wzrost w stałych i określonych warunkach. Stałe i silne wytrząsanie zapewnia szybkie mieszanie się wpływającego. 4 Wzrost synchroniczny W populacji rosnących bakterii komórki nie dzielą się jednocześnie. świeżego podłoża z hodowlą w chemostacie. Jedna z metod otrzymania hodowli synchronicznej. szybkość rozcieńczania hodowli musi się ilościowo równać specyficznej szybkości wzrostu. czyli synchronizacji hodowli. ponieważ szybkość zbliżona do maksymalnej powoduje niestabilność układu. Hodowle ciągłe. są użyteczne np. prowadzący do wytworzenia wyodrębnionej. że jest „wymywana". W laboratorium możemy jednak otrzymać populacje komórek dzielących się w przybliżeniu w tym samym czasie. 3. ks — stężenie substancji odżywczej ograniczającej wzrost przy μ = 0.

Zaletą tej czysto fizycznej metody jest możliwość uniknięcia zakłóceń metabolizmu komórkowego. w którym logarytm szybkości wzrostu jest wykreślony względem odwrotności temperatury absolutnej (l/K). Ratkowsky i wsp. Taki sposób wzrostu nazywamy diauksją. 1. W ograniczonym zakresie temperatur zależność między szybkością wzrostu a temperaturą jest podobna do zależności między szybkością reakcji chemicznych a temperaturą. W momencie zmiany substancji odżywczej wzrost może być powolniejszy lub nawet się zatrzymać. 2. jeśli wykreślimy pierwiastek kwadratowy szybkości wzrostu względem temperatury absolutnej. Ta subpopulacja mniej gęstych komórek może być oddzielona od reszty populacji przez zastosowanie techniki wirowania w gradiencie gęstości (sekcja 8. Jednak dla szerokiego zakresu temperatur wykres ten nie jest liniowy. 5. Mechanizm diauksji jest omówiony w sekcji 7. 5 i 6). 4) pomiar ilości substancji radioaktywnej włączonej do biomasy w określonym czasie i 5) nefelometrycznie. 3. 4). co obrazuje wykres Arrheniusa. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) Jeżeli w pożywce dostępne są dwie różne substancje pokarmowe. 2. że zależność liniowa może być osiągnięta dla całego zakresu temperatury biokinetycznej. 2) oznaczenie wzrostu suchej biomasy w określonym czasie. [JB (1983) 154: 1222-1226] pokazał. 3. 8). 1. Zużywanie drugiej substancji rozpocznie się po wyczerpaniu się pierwszej. 8. coli zużyje najpierw glukozę.niesynchronicznej komórki charakteryzujące się najmniejszą gęstością są więc prawdopodobnie w podobnych stadiach cyklu komórkowego. 3. . 5 Zależność wzrostu od temperatury — wykres Arrheniusa i wykres Ratkowsky'ego Zmiany temperatury mają duże znaczenie dla szybkości wzrostu głównie z powodu ich wpływu na reakcje chemiczne zachodzące w komórce (metabolizm — rozdz. bakteria może preferencyjnie zużywać jedną z nich. 3) śledzenie pobrania (lub wydzielenia) określonej substancji. czyli przez pomiar zwiększenia zdolności do rozpraszania wiązki świetlnej podczas jej przejścia przez płynną hodowlę (rozproszenie światła zwiększa się wraz ze wzrostem liczby komórek). 5 Pomiar wzrostu Wzrost (zmiany liczby komórek lub biomasy w czasie) mogą być mierzone przez: 1) liczenie komórek (sekcja 14. Z mieszaniny glukozy i laktozy E. 3. a po jej wyczerpaniu zacznie wykorzystywać laktozę.

2). Ich natura jest nieznana. Tworzy on dwa zupełnie różne typy komórek. w jakich znajduje się komórka. Moment rozpoczęcia takiego różnicowania jest często związany z warunkami środowiska. 1). a przejście z jednego typu do drugiego stanowi ważną część cyklu życiowego (rys.ROZDZIAŁ 4 Różnicowanie U większości gatunków bakterii nie obserwuje się w cyklu życiowym dużych zmian kształtu komórki lub jej funkcjonowania. jak i zachowania. w trakcie normalnego wzrostu Caulobacter w odpowiednim czasie i miejscu powstaje rzęska i łodyżka. 5. Występowanie formy ruchliwej w cyklu życiowym jest korzystne. Cyklem komórkowym Caulobacter rządzą sygnały pochodzące z samej komórki. z zastosowaniem takich technik jak fuzja z GFP (sekcja 8. Jednak u niektórych bakterii z komórek określonego typu mogą powstać komórki znacząco różne. ale może wytworzyć formę zdolną do ruchu. Ruchliwą komórkę można traktować jako niedojrzałą. że przekazanie sygnału zacho- 56 . gdyż pozwala organizmowi na przenoszenie się do różnych miejsc. 4. żyjącą w glebie i wodzie. aby mogło dojść do asymetrycznego podziału na komórkę z rzęską i komórkę z łodyżką. Jak to się dzieje? Odpowiedzi na pewne pytania dotyczące rozwoju i różnicowania dostarczają badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek. Tak więc. 4. Dzięki nim w niektórych przypadkach można było wykazać powiązanie aktywacji swoistych białek (wyznakowanych GFP) w komórce z ważnymi aspektami jej podziału lub różnicowania. gdyż przed kolejnym podziałem musi ona utracić rzęskę i wytworzyć łodyżkę (prostheca). 1 Cykl życiowy Caulobacter Caulobacter jest ściśle tlenową bakterią gramujemną. ale wydaje się. Na następnych stronach omówimy kilka przykładów różnicowania bakterii. z komórkami rodzicielskimi. Komórki potomne są w mniejszym lub większym stopniu identyczne. Macierzysta komórka z łodyżką (dojrzała forma) sama nigdy nie staje się ruchliwa. zarówno pod względem wyglądu.

1) i nieaktywnego białka FlbD. FlbD~P inicjuje transkrypcję „późnych" genów rzęskowych w komórce potomnej. Staje się nową komórką macierzystą. Białko FliF jest przenoszone (dzięki nieznanemu mechanizmowi) do swoistego miejsca na biegunie rozwijającej się komórki potomnej. zlokalizowaną blisko przegrody w komórce potomnej. 7. co prowadzi do powstania rzęski na biegunie tej komórki. będącego regulatorem genów. 14. 3. 14). 6. 5. 4. że pierścień MS powstaje zanim zostanie wytworzona przegroda. Komórka z łodyżką zaczyna się dzielić. ftsZ (biorącego udział w tworzeniu przegrody (septy): sekcja 3. co prowadzi do transkrypcji różnych genów — w tym również „wczesnych" genów rzęskowych. 8). 8. Zachodzi asymetryczny podział poprzeczny i ruchliwa komórka potomna odpływa. ) Ponadto w komórce potomnej (ale nie w komórce z łodyżką) CtrA~P wiąże się z origin chromosomu (sekcja 7. Po rozpoczęciu replikacji DNA w komórkach z łodyżką (przed podziałem komórki) poziom CtrA~P rośnie. tak więc komórka ruchliwa nigdy się 57 . 2. Komórka z łodyżką może rosnąć i wytwarzać dalsze komórki ruchliwe. 6) lub w transferze fosforu (rys. Po wytworzeniu przegrody między komórką z łodyżką i komórką potomną białko FlbD jest aktywowane (fosforylowane) przez kinazę FlbE. 2. Komórka ruchliwa traci rzęskę i przykleja się swoim zaczepem do podłoża. takich jak fliF (kodującego pierścień MS: rys. Na wolnym końcu komórki potomnej powstaje rzęska. obdarzoną łodyżką. co oznacza. Rozwija się łodyżka i komórka dojrzewa.1. 7. W Caulobacter crescentus regulatorem odpowiedzi jest CtrA. dzi podobnie jak w dwuskładnikowym systemie regulacji (sekcja 7. (Analogicznie w czasie sporulacji u Bacillus subtilis lokalizacja fosfatazy SpoIIE na specyficznej stronie asymetrycznej przegrody jest ważnym czynnikiem różnicowania — patrz legenda do rys. 2. 3) i hamuje replikację DNA. Dojrzała komórka z łodyżką przyczepiona do powierzchni lepkim „zaczepem".

zaopatrzonymi w kilka rzęsek. Widać koncentryczne pierścienie wzrostu (sekcja 4. gdy hoduje się go na 1. 1). komórki te w normalny sposób dzielą się i wytwarzają kolonię.nie podzieli zanim nie stanie się dojrzała (rys. swarming) występuje też u różnych innych bakterii. ] Różnicowanie komórek nieruchliwych w ruchliwe. zachodzi też w różnych gatunkach Hyphomicrobium i Rhodomicrobium. vulgaris) na odpowiednim podłożu stałym. Rasika M. Po pewnym czasie na zewnętrznym brzegu tej strefy powstaje następne pokolenie długich komórek. mirabilis (lub inny gatunek — P. Harsheya. [Control of differentiation in Caulobacter crescentus: Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718. W ten sposób cała powierzchnia pożywki zostaje pokryta koncentrycznymi strefami wzrostu (fot. Jednak po kilku godzinach wzrostu. tworząc grubą. to pierwsze komórki potomne są krótkimi pałeczkami o długości 2-A μm. Jeśli hoduje się P. komórki znajdujące się na krawędzi kolonii rosną do długości 20-80 μm i pokrywają się licznymi rzęskami. swarming) Proteus jest gramujemną pałeczką występującą w jelitach zwierząt i człowieka. 1). Tam każda dzieli się na kilka krótkich pałeczek — podobnych do komórek wyjściowych. 58 . 5% agarowym podłożu minimalnym z glukozą i hydrolizatem kazeiny. 4. Zdjęcie uzyskane dzięki uprzejmości: dr. 2). University of Texas w Austin. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. 4. Komórki te (ang. Przez kilka pokoleń komórki te normalnie rosną i dzielą się. swarm cells) wypływają z kolonii i osiadają w miejscu oddalonym o kilka milimetrów od jej brzegu. USA. 4. koncentryczną warstwę wzrostu wokół początkowej kolonii. zdolnych do wzrostu „rozpełzliwego" i cykl się powtarza. Texas. Serratia marcescens. zarówno gramujemnych (w tym np. Zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (ang. i vice versa.

niektóre nukleozydy purynowe. Toguchi i Harshey (1998) PNAS 95: 2568-2573]. 2) o mniejszym niż zwykle stężeniu agaru. że oporność endospor na wysoką temperaturę jest spowodowana małą zawartością wody. Mogą to być. 2. różne czynniki chemiczne. 4. Aktywacja zachodzi np. w zależności od gatunku. Samo kiełkowanie z kolei rozpoczyna się pod wpływem pewnych substancji. 3. Nieodwracalną inaktywację endospor może zapewnić jedynie brutalny proces sterylizacji (sekcja 15. 15. a ich budowę pokazano na fotografii 4. staje się metabolicznie aktywna. Clostridium. podczas gdy u innych powstają indywidualne mikrokolonie. coli). 1 Endospory Endospory zostały lepiej zbadane niż jakikolwiek inny typ spor bakteryjnych. tzn. Desulfotomaculum. Thermoactinomyces oraz kilka innych gatunków. 2. Nie zawsze powstają przy tym koncentryczne pierścienie wzrostu. mirabilis (dzięki okresowemu występowaniu zdolności do wzrostu „rozpełzliwego")· Niektóre bakterie rosną „rozpełzliwie" przez cały czas.(fot. po ogrzaniu w temperaturze subletalnej lub poddaniu działaniu pewnych związków chemicznych. Uważa się. Endospora powstaje we wnętrzu komórki w odpowiedzi na niedobór składników odżywczych. azotu i/lub fosforu. promieniowanie. takie jak obserwuje się w przypadku P. 2. 2) i E. że chociaż w zjawisku tym biorą udział składniki systemu chemotaksji (sekcja 2. a także uszkodzenia fizyczne. Coxiella. dipikolinian wapnia występujący w rdzeniu endospory może działać jako drugorzędny stabilizator. ] Badania wykonane na E. Taki stan uśpienia może trwać bardzo długo. 1). np. W dojrzałej endosporze zachodzi bardzo niewiele (albo może nawet żadna) reakcji przebiegających w rosnących komórkach wegetatywnych. Można to wykazać stosując podłoże agarowe (sekcja 14. 2). [Swarming (artykuł przeglądowy): Harshey (1994) MM 13: 389-394. coli wskazują. 3 Komórki spoczynkowe U niektórych bakterii w wyniku różnicowania powstają komórki spoczynkowe — spory albo cysty. jak i gramdodatnich. W odpowiednich warunkach spora lub cysta kiełkuje i tworzy nową komórkę wegetatywną. Wytwarzają je gatunki należące do rodzajów Bacillus. wysychanie. Potem kiełkująca endospora przemienia się w komórkę wegetatywną. 59 . różne jony lub pewne cukry. Formy te mogą pomagać w rozsiewaniu organizmu lub/i służyć do przetrwania w niekorzystnym środowisku. 4. Tworzenie endospor przedstawiono schematycznie na rysunku 4. tworzą więc jedną cienką warstwę wzrostu. w szczególności na brak węgla. 4. Ta forma komórki jest niezwykle oporna na szkodliwe czynniki środowiska: ekstremalne temperatury i pH. to substancje/sygnały wywołujące wzrost „rozpełzliwy" różnią się od chemoefektorów znanych w chemotaksji [Burkart. L-alanina. Kiełkowanie może się rozpocząć od przyłączenia takiego związku do receptora w zewnętrznej błonie spory. W odpowiednich warunkach endospora kiełkuje. Endospory niektórych gatunków wymagają „aktywacji" przed kiełkowaniem.

60 .

Endospory dzięki uprzejmości dr. Johna C. 2 Różnicowanie Lewa górna część. 2. Montana. Priscu. Środek. każda kropka to cząstka złota koloidalnego. Szkocja. 1). N o t k a . 1). USA. Endosporę otacza osłona komórkowa (ce) komórki macierzystej. 3. Komórka traci wtedy rzęski i buduje złożoną ścianę cysty. 3. Heterocysty — dzięki uprzejmości prof. 2). Mikrografia świetlna Anabaena spiroides (grube nici) i Anabaena circinalis (cienkie nici) z jeziora Hebgen w Montanie. 4. 2 Inne spory bakteryjne U wielu promieniowców rosnących w formie strzępek powstają egzospory — w wyniku tworzenia przegród i fragmentacji strzępek (rys. zawierającą polisacharyd alginian [Alginate biosynthesis (artykuł przeglądowy): Gacesa (1998) Microbiology 144: 1133-1143]. Między błoną i wielowarstwowym płaszczem spory (sc) leży korteks (cx). 3 Bakteryjne cysty Cysty wytwarza na przykład bakteria glebowa Azotobacter vinelandii. 4. 3. Fot. Komórki Serratia marcescens zdolne do wzrostu „rozpełzliwego"(patrz sekcja 4. Spory te nie mają wyspecjalizowanych struktur (takich jak korteks i płaszcz spory). Texas. białka i lipidy. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocysty Anabaena oscillarioides. 4. 8. Cysty tego gatunku. University of Glasgow. mogą w stanie uśpienia przetrwać w suchych glebach przez wiele lat. 4. oporne na wysychanie. U takich promieniowców jak Actinoplanes i Pilimelia ruchliwe (urzęsione) zoospory powstają w środku zamkniętego woreczka zwanego sporangium. do cząsteczki wiążącej się swoiście z nitrogenazą. Komórki wykazujące wzrost „rozpełzliwy" — dr Rasika M. wysychanie i niektóre związki chemiczne. 1. chociaż nie są w stanie całkowitego uśpienia. University of Texas at Austin. Zwróć uwagę na dużą liczbę rzęsek na każdej z nich. Słowo „endospora" zostaje niekiedy skrócone do „spora". 2). Sporangia rozwijają się ze strzępek wegetatywnych. Środek. 3. „Rdzeń" (protoplast) endospory jest otoczony błoną (mem). 6. 4. część prawa. które powstały pomiędzy komórkami wegetatywnymi w nici.Kontrola genetyczna inicjacji tworzenia endospor została opisana w sekcji 7. 2. Prawa górna część. USA. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocysty (wyżej) i komórki wegetatywnej (niżej) Anabaena oscillarioides. Harsheya. 1 μm średnicy). ale wykazują pewną oporność np. Bozeman. Stany Zjednoczone. Montana State University. Spory Streptomyces są metabolicznie mniej aktywne niż strzępki wegetatywne. Bardzo małe czarne kropki (widoczne najlepiej przez lupę) oznaczają miejsca lokalizacji enzymu — nitrogenazy (sekcja 10. Johna Coote'go. Strzałki pokazują heterocysty. część lewa. Dół. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) endospory Bacillus subtilis w komórce macierzystej (ok. 3). Zwykle w cyście nagromadzony zostaje PHB (sekcja 2. które jest przyłączone. 61 . Zwróć uwagę na grube osłony. Nie należy jednak mylić endospor z innymi typami spor bakteryjnych (patrz sekcja 4. na ogrzewanie na sucho. Sygnałem do powstawania cyst mogą być zmiany poziomu węgla i azotu w środowisku. jako materiał elektronogęsty.

Powstaje asymetryczna przegroda (septa). Zmodyfikowany peptydoglikan odkładany między tymi dwiema błonami tworzy sztywną warstwę zwaną korteksem. Stadium I. białkowy płaszcz spory (stadium V) i spora dojrzewa (stadium VI). 3. protoplaście spory (otoczonym zewnętrzną błoną). dzieląca protoplast na dwie nierówne części (fot. złożone z dwóch chromosomów. Wytworzone zostaje włókno osiowe. 62 . 2. 3). 4. zwany presporą. Stadium II. stanie się endosporą. który jest następnie usuwany w wyniku hydrolizy. Przegroda jest znacznie cieńsza niż ta. Dojrzała spora zostaje uwolniona wskutek zniszczenia komórki macierzystej. Błona cytoplazmatyczna większego protoplastu wypukla się. skąd jej obraz w mikroskopie świetlnym. tzn. że nie każda endospora ma egzosporium. Mniejszy z protoplastów. W tym czasie w „rdzeniu". jak pokazano na rysunku. nabywając takie cechy charakterystyczne jak oporność na ciepło i zdolność do silnego rozpraszania światła. Wegetatywna komórka zawierająca dwa chromosomy jest gotowa do sporulacji. zwana egzosporium. Stadium II dzieli się na część 1. W stadium III prespora zostaje całkowicie otoczona dwiema błonami. nagromadza się dipikolinian wapnia. (Zwróć uwagę. Stadium VII.Stadium 0. ). Na zewnętrznej błonie odkładany jest wielowarstwowy. W tym czasie może się też rozwijać luźna osłona białkowa. gdyż zawiera znacznie mniej peptydoglikanu. Stadia V-VI. otaczając presporę. która powstaje w czasie normalnego podziału komórki. Stadium IV.

(a) Koniec powietrznej strzępki wegetatywnej, (b) Koniec strzępki zaczyna się zwijać, (c) W całej zwiniętej strzępce powstają przegrody, (d) Ściany rozwijających się spor grubieją i każda z nich zaokrągla się. (e) Spory zostają uwolnione.

4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia
Struktury te są tworzone przez różne nitkowate sinice — bakterie fotosyntetyzujące występujące np. w glebie, wodach i żyjące w związkach symbiotycznych z niektórymi eukariotami.

4. 4. 1 Akinety
Akinety są wyspecjalizowanymi komórkami wytwarzanymi przez niektóre gatunki, np. w warunkach głodu. Każda ma zgrubiałą ścianę i zawiera w cytoplazmie wiele substancji zapasowych (takich jak glikogen). Akinety są zwykle większe od komórek wegetatywnych i mają obniżony poziom metabolizmu. Wykazują pewną oporność na wysychanie oraz niską temperaturę, mogą więc stanowić formy ułatwiające przezimowanie i/lub rozsiewanie tych sinic.

4. 4. 2 Heterocysty
Heterocysty są tworzone przez pewne gatunki, gdy brak jest dostępnych źródeł azotu. W takich warunkach dochodzi do różnicowania niektórych komórek w nici i przekształcenia ich właśnie w heterocysty. Są to wyspecjalizowane komórki „wiążące" azot atmosferyczny (gazowy) — czyli przeprowadzające go w formę dostępną dla organizmu (sekcja 10. 3. 2. 1). Proces różnicowania obejmuje między innymi: wytworzenie grubych osłon, rearanżację tylakoidów, zaprzestanie wytwarzania tlenu (pochodzącego z fotosyntezy) i syntezę nitrogenazy (enzymu wykorzystywanego w wiązaniu azotu). Wydaje się, że grube osłony (patrz fot. 4. 2) chronią nitrogenazę przed tlenem atmosferycznym, na który jest ona wrażliwa. Anabaena flos-aquae tworzy grubsze osłony, gdy hoduje się ją pod zwiększonym ciśnieniem cząstkowym tlenu [Kangatharalingam, Priscu i Paerl (1992) JGM 138: 2673-2678]. Komunikowanie się między heterocystą i sąsiadującą z nią komórką wegetatywną zachodzi poprzez cienkie pory (mikroplaz63

64

modesmy) występujące w przylegających błonach cytoplazmatycznych. Związany azot jest przenoszony do komórek wegetatywnych, które z kolei przekazują heterocyście związki węgla i inne substancje.

4. 4. 3 Hormogonia
Hormogonium to krótka nić, nie zawierająca ani akinet, ani heterocyst, wytworzona np. z nici wegetatywnej. Zwykle wykazuje zdolność do ruchu ślizgowego. Komórki w hormogonium mogą być mniejsze niż w nici macierzystej. U niektórych gatunków (np. Nostoc muscorum) tylko hormogonia zawierają wakuole gazowe, co może potwierdzać pogląd, że te krótkie nici służą do „rozsiewania" sinic.

Fot. 4. 3 Sporulacja a podział komórki u Bacillus subtilis Góra. Komórka jest we wczesnej fazie sporulacji (rys. 4. 2, stadium II1). Widać asymetryczną przegrodę. Podziałka = 0, 3 μm. Środek. Endospora (prespora) w późniejszym stadium rozwoju. Podziałka = 0, 3 μm. Dół. Wegetatywny podział komórki. Przegroda zlokalizowana pośrodku komórki jest znacznie grubsza niż przegroda asymetryczna. Podziałka=0, 3 μm. Fotografie — dr Imric Barak, Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovak Republic.

ROZDZIAŁ

5
Metabolizm I - energia

„Metabolizm" to reakcje chemiczne zachodzące w żywych komórkach: cząsteczki są syntetyzowane (anabolizm), rozkładane (katabolizm) lub zmieniane z jednego typu na inny, a różne atomy są utleniane lub redukowane. W większości z tych reakcji biorą udział swoiste białka katalityczne, zwane enzymami. Zwykle enzymy działają jedynie w ograniczonym zakresie warunków fizykochemicznych; poza tym zakresem mogą utracić swoją aktywność lub zostać zinaktywowane. Wydaje się, że enzymy „ekstremofili" (sekcja 1. 1. 1) mają unikatową strukturę i/lub są stabilizowane przez takie czynniki jak np. termoprotektanty. Stosuje się je w badaniach nad stabilnością enzymów. Jest też prawdopodobne, że zostaną wykorzystane w biotechnologii [Danson i Hough (1998) ΉΜ 6: 306-314]. ) Sekwencja reakcji metabolicznych, w których jeden związek jest kolejno przekształcany w inny (lub inne), zwana jest szlakiem metabolicznym. W takim szlaku substrat (np. związek odżywczy) jest przekształcany poprzez jeden lub wiele związków pośrednich do tak zwanego produktu końcowego lub produktów końcowych. Liczne z bakteryjnych szlaków metabolicznych nie występują u eukariotów. Reakcje metaboliczne są w wielu wypadkach endoergiczne, tzn. wymagają dostarczenia energii. Energia jest też potrzebna do ruchu (u gatunków ruchliwych) i do pobierania różnych składników pokarmowych. Większość bakterii uzyskuje energię przekształcając związki chemiczne ze środowiska. Organizmy te są zwane chemotrofami. Inne bakterie, które wykorzystują energię słoneczną, określa się mianem fototrofów. Jednak ani związki chemiczne ze środowiska, ani światło słoneczne nie mogą być wykorzystane bezpośrednio do zasilania procesów komórkowych wymagających energii. Tak więc komórka musi mieć zdolność przekształcania tych „środowiskowych" źródeł energii na taką jej formę, jaka będzie mogła być przez nią wykorzystywana. Jaka jest ta „dogodna" forma energii? Wykorzystując pewne związki chemiczne lub światło słoneczne bakterie mogą wytwarzać specyficzne związki „wysokoenergetyczne", które mogą następnie zaspokajać ich potrzeby energetyczne. Do związków tych należą: adenozyno66

-5-fosforan (ATP), fosfoenolopirogronian, acetylofosforan i acetylo-CoA. Nazwano je cząsteczkami „waluty" energetycznej, gdyż komórka może je wydatkować (zamiast energii „środowiskowej"), tak jak my używamy monet i banknotów zamiast sztabek złota. Niektóre z takich cząsteczek przedstawiono na rysunku 5. 1. ATP (rys. 5. la) dostarcza energii, gdy zostaje rozerwane jego końcowe wiązanie fosforanowe. Skutkiem tego, w miarę jak wykorzystywane są cząsteczki ATP (do potrzeb energetycznych komórki), powstają cząsteczki adenozyno-5'-difosforanu (ADP). Tak więc poprzez fosforylację ADP energia środowiskowa zostaje sprzęgnięta z resyntezą ATP. Inny typ „waluty" energetycznej stanowi dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD), który niesie energię w postaci „siły redukującej": może on przyjmować i oddawać energię będąc, odpowiednio, redukowany i utleniany (rys. 5. 1b). Inne nośniki siły redukującej to fosforan NAD (NADP) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD). Energia pochodząca ze środowiska może też zostać przekształcona w formę + elektrochemiczną, w postaci gradientu jonów (zwykle protonów — H ) między dwiema powierzchniami błony cytoplazmatycznej. Energia tego gradientu może być wykorzystana do transportu, do napędzania ruchu obrotowego rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1) i do syntezy związków wysokoenergetycznych! W jaki sposób bakteria tworzy związki wysokoenergetyczne lub gradient jonów z energii „środowiskowej"? Chemotrofy i fototrofy wykorzystują do tego celu różne strategie, co opisano niżej.

5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów
Chemotrofy przetwarzają związki chemiczne, by uzyskać energię. Chemoorganotrofy wykorzystują związki organiczne, zaś chemolitotrofy — związki nieorganiczne bądź pierwiastki chemiczne. (Mechanizmy pobierania związków chemicznych zostały omówione w sekcji 5. 4. )

5. 1. 1 Metabolizm energetyczny chemoorganotrofów
Chemoorganotrofy wykorzystują substraty organiczne w dwóch głównych typach metabolizmu energetycznego: fermentacji i oddychaniu1. Niektóre z nich mogą przeprowadzać tylko jeden z tych procesów, inne — oba, w zależności od warunków. 5. 1. 1. 1 Fermentacja Fermentacja jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat jest metabolizowany bez udziału egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika Angielskie terminy „respiration" i „respiratory metabolism" są tłumaczone odpowiednio jako „oddychanie" i „metabolizm oddechowy" i stosowane do określenia wszystkich procesów dostarczających energii bakteriom chemotroficznym (zarówno chemoorganotrofom, jak i chemolitotrofom), w których wykorzystany jest łańcuch transportu elektronów i fosforylacja oksydatywna (przyp. tłum). 67
1

(a) Adenozyno-5'-trifosforan (ATP). Przy dostarczaniu energii rozrywane jest wiązanie γ i odłączona zostaje grupa fosforanowa; powstający w wyniku tego adenozyno-5'-difosforan (ADP) musi być fosforylowany, aby został zregenerowany ATP. (b) Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) w formie zredukowanej (wyżej) i utlenionej + (niżej); e=elektron. Ściśle rzecz biorąc forma utleniona powinna być zapisana jako NAD , ale dla wygody często pisze się NAD; podobnie forma zredukowana powinna być zapisana jako + NADH + H , ale stosuje się NADH. Fosforan NAD (NADP) to 2'-fosforan NAD, który ma grupę fosforanową w pozycji 2' cząsteczki (lewoskrętnej) cukru (D-rybozy).

utleniającego. ( N o t k a . Fermentacja zwykle (ale niekoniecznie) zachodzi beztlenowo, ale nie jest to cecha charakterystyczna wyłącznie dla tego procesu; jak zobaczymy później, oddychanie też może zachodzić bez udziału tlenu. ) Ponieważ nie jest tu wykorzystywany zewnętrzny czynnik utleniający, produkty fermentacji w sumie nie są ani bardziej, ani mniej utlenione niż substrat. Oznacza to, że utlenianie jakiegoś związku pośredniego w fermentacji jest zrównoważone przez redukcję innego związku pośredniego w tym procesie. Zostało to schematycznie przedstawione na rysunku 5. 2.

68

W procesie tym z substratu organicznego powstają związki pośrednie, które wzajemnie się utleniają i redukują. W sumie produkty mają taki sam stopień utlenienia jak wyjściowy substrat. (Porównaj z rys. 5. 4).

Można te procesy lepiej zrozumieć rozważając pewne konkretne przykłady szlaków metabolicznych. U wielu bakterii fermentacja glukozy zaczyna się od szlaku zwanego glikolizą lub szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3). W szlaku tym 1 cząsteczka glukozy dostarcza (poprzez pewną liczbę związków pośrednich) 2 cząsteczek kwasu pirogronowego, będącego produktem końcowym. W dwóch miejscach tego szlaku (rys. 5. 3) energia pochodząca z reakcji egzoergicznych (tzn. dających energię) jest wykorzystywana do fosforylacji ADP, to znaczy do syntezy ATP z ADP. Proces bezpośredniego wykorzystania energii pochodzącej z reakcji chemicznej do syntezy ATP z ADP zwany jest fosforylacją substratową.

Uwzględniając cząsteczki będące „walutą" energetyczną szlak EMP można podsumować następująco: 2ATP + 4ADP + 2NAD -> 2ADP + 4ATP + 2NADH Tak więc każda cząsteczka glukozy daje 2NADH i netto 2ATP. Aby następne cząsteczki glukozy mogły być metabolizowane, musi zostać dostarczony zarówno ADP, jak i NAD. ADP powstaje z ATP, gdy ten jest wykorzystywany jako dawca energii. W jaki sposób jednak powstaje NAD z NADH, skoro nie ma w fermentacji zewnętrznego czynnika utleniającego? Wspomniano wcześniej, że fermentacja glukozy może zacząć się od glikolizy; w rzeczywistości szlak ten jest jedynie początkiem pewnej liczby różnych dróg metabolicznych: to, co się będzie działo z NADH (i kwasem pirogronowym), zależy od zachodzących potem reakcji. W najprostszym przypadku NADH oddaje swoją siłę redukującą kwasowi pirogronowemu, co oznacza, że utlenienie NADH do NAD jest sprzężone z redukcją kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego: kwas pirogronowy + NADH —» kwas mlekowy + NAD Reakcja ta pokazuje jedną z możliwych odmian fermentacji — tak zwaną fermentację mlekową. Reakcja, w której kwas mlekowy jest jedynym (lub dominującym) produktem, zwana jest fermentacją homomlekową. W wyniku fermentacji heteromlekowej obok kwasu mlekowego powstają też inne produkty. Kwas mlekowy — produkt końcowy fermentacji — zostaje uwolniony przez komórki do środowiska. 69

Przerywaną strzałką, poczynając od fruktozo-1, 6-bisfosforanu, oznaczono uproszczony odcinek tego szlaku. Każdą z dwóch fosforylacji substratowych zaznaczono gwiazdką; w obu przypadkach fosforan jest przenoszony na ADP z wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego w związku organicznym. Chociaż dwie z reakcji w tym szlaku wymagają ATP, to zysk netto wynosi 2ATP na każdą cząsteczkę zużytej glukozy. ( N o t k a . Nazwy kwas pirogronowy i pirogronian oraz kwas fosfoenolopirogronowy i fosfoenolopirogronian używa się wymiennie. ) Większość reakcji tego szlaku jest odwracalna.

Tak zwane bakterie mlekowe (np. różne gatunki Lactobacillus i Leuconostoc) są szeroko wykorzystywane w przetwórstwie spożywczym (np. do wyrobu niektórych serów i innych produktów mlecznych, salami, kiszonej kapusty i ogórków, chleba pieczonego z użyciem zakwasu). [Genetics, metabolism and application of lactic acid bacteria (sympozjum): FEMSMR (1993) 12: 1-272. ] Należy zwróć uwagę, że kwas mlekowy (C3H6O3) ma taki sam stopień utlenienia jak glukoza (C6H12O6), tzn. netto nie zaszła tu ani redukcja, ani utlenienie. Wprawdzie aldehyd 3-fosfoglicerynowy został utleniony, ale jest to zrównoważone przez redukcję kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego (rys. 5. 4). Inne fermentacje, zaczynające się od glikolizy, to fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) i fermentacja butanodiolowa (rys. 5. 6). W obu procesach kwas pirogronowy jest metabolizowany do kilku produktów końcowych, których względne ilości mogą się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. 70

Zwróć uwagę na to, że utlenianie jest zrównoważone odpowiednią redukcją. Fermentację homomlekową przeprowadzają niektóre tzw. bakterie mlekowe, wykorzystywane w przemyśle spożywczym.

Fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) zachodzi np. u Escherichia coli i u bakterii należących do rodzajów Proteus i Salmonella. W kwaśnym środowisku E. coli i inne gatunki, które mają układ enzymatyczny liazy mrówczan: wodór, mogą rozłożyć kwas mrówkowy na dwutlenek węgla i wodór; przeprowadzają więc fermentację z wytworzeniem gazu. Bakterie, które podobnie jak Shigella nie mają tego systemu enzymatycznego, nie wytwarzają gazu. (Z tego widać, że nie zawsze produktem fermentacji jest gaz. ) Fermentację butanodiolową (rys. 5. 6) przeprowadzają np. gatunki należące procesie jest znacznie mniejsza niż w fermentacji kwasów mieszanych. Niektóre szczepy w pewnych warunkach produkują małe ilości diacetylu (CH3. CO. CO. CH3) z kwasu acetomlekowego. Chociaż fermentacje kwasów mieszanych i butanodiolowa są bardziej skomplikowane niż fermentacja homomlekowa, to jednak podlegają tym samym podstawowym zasadom. Tworzenie produktów bardziej utlenionych niż glukoza (np. kwas mrówkowy) jest zawsze zrównoważone przez tworzenie produktów bardziej od niej zredukowanych (np. etanol), natomiast względne proporcje produktów końcowych mogą się zmieniać. NADH i inne związki powstające w czasie fermentacji są wykorzystywane w różny sposób. Część NADH zostaje utleniona w reakcjach biosyntezy (zamiast być wykorzystana do tworzenia takich produktów jak kwas mlekowy). Dzięki temu związki takie jak pirogronian będą mogły zostać zużyte w reakcjach biosyntezy jako prekursory (sekcja 6. 3. 1 i rys. 6. 3). U chemoorganotrofów zarówno w oddychaniu (sekcja 5. 1. 1. 2), jak i w fermentacji istnieje ścisły związek między metabolizmem energetycznym i metabolizmem węglowym (sekcja 5. 3. 1). Bakterie przeprowadzające fermentację wykorzystują związki wysokoenergetyczne, takie jak ATP i NADH, a także mogą wykorzystywać energię w formie gradientu jonów, o której wspomniano wcześniej. Ten rodzaj energii jest u nich zwykle otrzymywany poprzez przekształcenie ATP w specyficznych, błonowych systemach enzymatycznych zwanych ATPazami (szczegóły w sekcji 5. 1. 1. 2). U niektórych bakterii fermentacyjnych gradient jonów może również powstawać w wyniku wypływu produktów końcowych (sekcja 5. 3. 3). N o t k a . Zanim skończymy omawiać ten temat, warto wspomnieć, że w przemyśle termin „fermentacja" jest powszechnie używany na określenie każdego procesu chemicznego przeprowadzanego przez bakterie, nawet takiego, w którym reakcje fermentacji nie zachodzą. 71
do Enterobacter, Erwinia, Klebsiella i Serratia. Ilość kwasu wytworzonego w tym

72 .

73 .

1. gdyż elektrony poruszają się w kierunku obszarów o mniejszej energii. 5. Takie utlenienie substratu daje więcej energii niż jego fermentacja. (Ponieważ wciąż mówimy o chemoorganotrofach. ) W sytuacji wykorzystania zewnętrznego czynnika utleniającego substrat zostaje całkowicie utleniony (rys. 1. lecz poprzez łańcuch transportu elektronów (patrz tekst). substrat jest zawsze związkiem organicznym. 5. 2). Tego rodzaju przepływ elektronów dostarcza energii. 1. Zwykle NADH i zewnętrzny czynnik utleniający współdziałają nie bezpośrednio. w którym substrat jest przekształcany z udziałem egzogennego (tzn. Uwolniona energia jest wykorzystywana przez komórkę do pompowania protonów (jonów wodorowych — H+) Wzajemne powiązania między substratem. które tworzą drogę przenoszenia elektronów. produktami końcowymi i zewnętrznym czynnikiem utleniającym w oddychaniu wykorzystującym typowy substrat organiczny (porównaj rys. Elektrony z NADH mogą płynąć w dół gradientu do zewnętrznego czynnika utleniającego. całość procesu można podsumować tak jak pokazano na rysunku 5. 2 Oddychanie Oddychanie jest rodzajem metabolizmu energetycznego. Sekwencja poszczególnych czynników redoks jest taka. zewnętrznego) czynnika utleniającego (porównaj z fermentacją: sekcja 5. a powstający NADH jest utleniany przez zewnętrzny czynnik utleniający. Jest to łańcuch wyspecjalizowanych cząsteczek (czynników redoks). glukoza na przykład może zostać utleniona do dwutlenku węgla i wody. W jaki sposób jest utleniany substrat i jak jest otrzymywana energia? Utlenianie typowego substratu organicznego pokazano na rysunku 5. że elektrony mogą płynąć w dół gradientu redoks (w kierunku bardziej dodatniego końca) w serii reakcji utlenienia/redukcj'i. chociaż czynnik utleniający może być organiczny bądź nieorganiczny.5. 7: jest ono sprzężone z redukcją NAD. lecz poprzez łańcuch transportu elektronów zlokalizowany w błonie cytoplazmatycznej. Zachodzi to na ogół nie bezpośrednio. 74 . 1. NADH wytworzony w czasie metabolizowania substratu jest utleniany przez zewnętrzny czynnik utleniający. Oddychanie może zachodzić w obecności tlenu (przy czym sam tlen służy jako zewnętrzny czynnik utleniający) lub beztlenowo (gdy zamiast tlenu są wykorzystywane inne nieorganiczne lub organiczne czynniki utleniające). 1). 7). Końcowy biorca elektronów (w tym wypadku tlen) jest nazywany końcowym akceptorem elektronów. W tym przykładzie. gdy jest nim tlen. 8.

W oddychaniu. poprzez błonę cytoplazmatyczną z jej strony wewnętrznej do zewnętrznej. 9. coli). Zarówno utlenienie NADH (enzym dehydrogenaza NADH). Domena Fo obraca się względem domeny F1 w czasie translokacji protonów. 14. W łańcuchu tym NADH jest utleniany przez przeniesienie elektronów na utlenioną formę X (która zostaje zredukowana). kiedy siła protonomotoryczna jest wykorzystywana jako źródło energii do syntezy ATP z ADP. do transportu (pobierania) różnych jonów. 2. przy utlenianiu typowego. organicznego substratu oddechowego. do zwiększania siły protonomotorycznej. ] 75 . Tendencja protonów do powrotu na stronę wewnętrzną błony (a więc do stanu zrównoważonego) stanowi formę energii zwaną siłą protonomotoryczną. 28). Takie ATPazy zwane są ATPazami typu (Fo F 1 ) . Część NADH jest utleniana do NAD w reakcjach biosyntezy. Wang i Oster (1998) Nature 391: 510-513. 1. Cały ten mechanizm jest podsumowany na rysunku 5. jak i redukcja tlenu (przez oksydazę cytochromową) zachodzi na wewnętrznej (tzn. a uwolniona energia jest wykorzystywana do pompowania protonów (na zewnątrz) przez błonę. Ciągłe linie zakrzywione oznaczają drogę przepływu elektronów. Ciekawe. 1).Łańcuch transportu elektronów składający się z trzech składników (Χ. a część poprzez łańcuch transportu elektronów. tzn. Domena Fo jest kanałem protonowym. Protony przechodząc poprzez ATPazę (z zewnętrznej na wewnętrzną powierzchnię błony) dostarczają energii niezbędnej do uwolnienia ATP z miejsc katalitycznych ATPazy na cytoplazmatycznej stronie błony. domena F1 oddziałuje z cytoplazmatyczną stroną Fo i zawiera miejsca katalityczne. Pobieranie jonów jest procesem wymagających energii. proces ten jest zwany fosforylacją oksydatywną (porównaj z fosforylacją substratową w sekcji 5. Prowadzi to do braku równowagi ładunkowej (i pH) między dwiema powierzchniami błony. 1). gdyż błona cytoplazmatyczna jest zwykle dla nich nieprzepuszczalna (sekcja 2. Siła ta jest jedną z najważniejszych i najbardziej uniwersalnych form energii w komórce. transport laktozy u E. Zredukowana forma X zostaje utleniona przez przeniesienie elektronów na utlenioną formę Υ — i tak dalej. że ATPazy błonowe mogą też katalizować hydrolizę ATP do ADP. Υ i Z). z tlenem jako końcowym akceptorem elektronów. 1. w których syntetyzowany jest ATP. Metabolizm komórkowy wytwarza NADH. Końcowym etapem jest redukcja tlenu do wody. Może zostać użyta bezpośrednio do zaspokojenia pewnych potrzeb energetycznych. do fosforylacji ADP (z wytworzeniem ATP) przez kompleksy enzymów (ATPazy) zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej. który musi być utleniany w celu odtworzenia NAD. który przechodzi przez całą szerokość błony. [Energy transduction in ATP synthase: Elston. na przykład do napędzania ruchu rzęsek (sekcja 2. Siła protonomotoryczna może też dostarczać energii do transportu niektórych substratów przez błonę cytoplazmatyczną (np. cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej. Sama ATPaza składa się z dwóch głównych części. Tak więc energia zawarta w ATP i sile protonomotorycznej może ulegać wzajemnym przemianom.

które mogą ulegać odwracalnej redukcji. które pobierają elektrony i następnie przekazują je w wyniku przemiennej redukcji i utleniania atomu żelaza. a także u danego gatunku w zależności od warunków wzrostu. 5. takie jak ferredoksyny. W tej drugiej kwas pirogronowy jest przekształcany w acetylo-CoA i włączany do szlaku cyklicznego. U bakterii łańcuch transportu elektronów biorący udział w oddychaniu (łańcuch oddechowy) występuje w błonie cytoplazmatycznej (i w pewnych wypadkach w tylakoidach). 2). cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej. w oddychaniu). NADPH jest wykorzystywany np. w niektórych komórkowych reakcjach biosyntezy (np. który katalizuje zależną od siły protonomotorycznej fosforylację ADP do ATP. jego składniki mogą różnić się u poszczególnych gatunków. „ATPaza protonowa" jest systemem enzymatycznym (w błonie cytoplazmatycznej). Jednak po wytworzeniu kwasu pirogronowego droga fermentacyjna i oddechowa są całkowicie różne. Składnikami łańcucha oddechowego mogą być: 1) cytochromy — białka zawierające żelazo. 8) wydają się zachodzić w wewnętrznej (tzn.„Łańcuch oddechowy" to termin używany do określenia łańcucha transportu elektronów w metabolizmie oddechowym (tzn. Możemy teraz przyjrzeć się niektórym szlakom wykorzystywanym w bakteryjnym oddychaniu. Przy wykorzystaniu w oddychaniu typowego substratu organicznego (rys. Siła protonomotoryczna uczestniczy też w redukcji NADP przez NADH. 3). Na rysunku 5. 3. a sama zwiększa się w wyniku jego hydrolizy (dostarczającej energii). zarówno utlenienie NADH. jak i redukcja końcowego akceptora elektronów (tlen na rys. Siła protonomotoryczna jest wykorzystywana do syntezy ATP. i 3) chinony — związki aromatyczne. 8 źródło NADH jest określone po prostu jako „metabolizm wytwarzający NADH". asymilacja amoniaku (sekcja 10. znanego pod nazwą cyklu 76 . a także hydrolizę ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (Pi). 5. 5. 2) białka żelazo-siarkowe. 8). U wielu bakterii metabolizm oddechowy glukozy rozpoczyna się szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys.

W warunkach beztlenowych. Rysunek 5. Może jednak być też procesem pożytecznym. Oddychanie beztlenowe. w zależności od bakterii. tlenku azotu. W czasie 77 . że w cyklu kwasów trikarboksylowych acetylo-CoA i kwas szczawiooctowy łączą się. bursztynian (u E. że wydajność energetyczna oddychania jest znacznie większa niż fermentacji. coli). w odpowiednich warunkach. 2. 3. 10 pokazuje. Do bakterii denitryfikacyjnych należą Alcaligenes faecalis. siarczany i siarkę jako końcowe akceptory elektronów. są zdolne do dysymilacyjnej redukcji azotanu do amoniaku (sekcja 10. tworząc kwas cytrynowy. Inne są do niej zdolne nawet w obecności tlenu. 3. Substratem (donorem elektronów) wykorzystywanym przez chemoorganotrofy w oddychaniu beztlenowym może być któryś z rozlicznych związków organicznych. W oddychaniu utlenienie NADH prowadzi. Siła protonomotoryczna powstaje w wyniku działania beztlenowego łańcucha oddechowego. W następnych reakcjach wyjściowa cząsteczka kwasu pirogronowego jest w rezultacie utleniana do dwutlenku węgla. Oddychanie beztlenowe w zasadzie jest takie samo jak tlenowe: w obu rodzajach wykorzystywany jest zewnętrzny akceptor elektronów. Są wreszcie takie. Jeśli w wyniku redukcji powstaje głównie azot cząsteczkowy i tlenek azotu (tzn. Niegdyś uważano. W oddychaniu azotanowym jako końcowy akceptor elektronów jest wykorzystywany azotan. Niektóre z nich przeprowadzają denitryfikację tylko w warunkach beztlenowych. siarczan czy fumaran. gazy). do syntezy ATP przez błonową ATPazę. czy też cyklu kwasu cytrynowego. proces zwany jest denitryfikacją. zamiast tlenu są jednak wykorzystywane takie czynniki utleniające jak azotan. do syntezy ATP. 5. że tlen działa różnie na poszczególne bakterie denitryfikacyjne. odpowiednio. syntetyzowana jest 1 cząsteczka ATP i zregenerowana 1 cząsteczka kwasu szczawiooctowego. azotu lub amoniaku. w zależności od gatunku i warunków.kwasów trikarboksylowych (rys. Bacillus licheniformis. gdyż powoduje straty azotu do atmosfery. Do substratów wykorzystywanych przez chemoorganotrofy jako donory elektronów w oddychaniu azotanowym zalicza się np. Powinno być teraz jasne. Denitryfikacja stanowi problem w rolnictwie. a powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystana np. wykorzystywanym do usuwania azotu ze ścieków w oczyszczalniach (sekcja 13. 2). że denitryfikacja zachodzi jedynie w warunkach beztlenowych lub gdy zawartość tlenu jest zmniejszona. Paracoccus denitrificans i Pseudomonas stutzeri. Niektóre gatunki. 10) lub cyklu Krebsa. gdyż zmniejsza żyzność gleby (sekcja 10. NADH i FADH2 zostają utlenione w łańcuchu oddechowym. Teraz wiemy. Bakterie redukujące siarczany i bakterie redukujące siarkę wykorzystują. 4). podczas gdy w fermentacji (gdzie nie ma zewnętrznego czynnika utleniającego) komórka musi pozbyć się NADH syntetyzując takie produkty uboczne jak kwas mlekowy. 2). Na każdą cząsteczkę utlenionego kwasu pirogronowego zostają zredukowane 4 cząsteczki NAD(P) i 1 cząsteczka FAD. poprzez siłę protonomotoryczną. które wykorzystują jednocześnie tlen i azotan — chociaż zwykle szybkość denitryfikacji maleje wraz ze wzrostem stężenia tlenu. ulegając redukcji do azotynu.

2). Reakcja kwas izocytrynowy -» kwas α-ketoglutarowy jest katalizowana przez enzym dehydrogenazę izocytrynianową. 9). 7. FADH2 może zostać utleniony poprzez łańcuch oddechowy. NADPH jest wykorzystywany w reakcjach biosyntezy. która u większości bakterii jest raczej swoista dla NADP niż dla NAD. 78 . FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy).Bardzo rozpowszechniony w metabolizmie oddechowym (sekcja 5. niesie energię w postaci „siły redukującej". w czasie wiązania aminoacylo-tRNA do miejsca „A" podczas syntezy białek (rys. U wielu bakterii w etapie prowadzącym od bursztynylo-CoA do kwasu bursztynowego zachodzi synteza guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) zamiast ATP. 1. co prowadzi do powstania siły protonomotorycznej. GTP jest wykorzystywany jako cząsteczka „waluty" energetycznej. np. 1. podobnie jak NAD.

Do chemolitotrofów (bezwzględnych i względnych) zalicza się na przykład bakterie z rodzaju Thiobacillus i bakterie nitryfikacyjne. takie substraty jak siarczek czy siarkę. Donorem elektronów dla tej bakterii są Fe (II) (jony żelazawe). wodór. etanol) lub wodór wykorzystują arsenian i selenian jako końcowe akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym. jak i nieskażonych tymi pierwiastkami. coli. Gatunki z rodzaju Thiobacillus występują np. gatunki z rodzaju Nitrobacter i Nitrococcus).oddychania beztlenowego siarczan bądź siarka są redukowane do siarczku (rys. siarczek. gatunki rodzaju Desulfovibrio (redukują siarczan) i Desulfuromonas (redukują siarkę). siarkę elementarną. wykorzystywane w czasie wzrostu beztlenowego. Donorem elektronów mogą być różne związki w zależności od gatunku. 4). zależnego od azotanu (który jest redukowany przede wszystkim do azotu cząsteczkowego) [Straub i wsp. pirogronian. z użyciem tlenu. mleczan. Wykazano. 3. 3). jony żelazawe itd. Bakterie o takim typie oddychania można spotkać zarówno w środowiskach skażonych. może utleniać zarówno jony żelazawe. gatunki z rodzaju Nitrosococcus i Nitrosomonas) oraz azotynu do azotanu (np. 79 . Odgrywają one ważną rolę w obiegu azotu (sekcja 10. 2). Tego typu oddychanie występuje u różnych bakterii. Metabolizm energetyczny u chemolitoautotrofów Chemolitotrofy wykorzystują w swoim metabolizmie energetycznym substraty nieorganiczne — np. Można je znaleźć zwykle w mułach i glebie. amoniak. Energię uzyskują w wyniku nitryfikacji. Niektóre bakterie (zarówno gatunki gramdodatnie. Odpowiadają za większość siarkowodoru powstającego w wodach zanieczyszczonych materią organiczną. Zwykle utleniają one. Metabolizm jest oddechowy. w glebie i osadach morskich. Bakterie z rodzaju Thiobacillus odgrywają ważną rolę w obiegu siarki (sekcja 10. denitrificans może wykorzystywać te substraty beztlenowo w oddychaniu azotanowym. 3. 2. ] 5. jak i gramujemne) utleniając substraty organiczne (takie jak octan. [Bacterial respiration of arsenic and selenium: Stolz i Oremland (1999) FEMSMR 23: 615-627. w wyniku czego powstaje siła protonomotoryczna (patrz też sekcja 5. W oddychaniu fumaranowym końcowym akceptorem jest pochodzący ze środowiska fumaran. bezwzględny tlenowiec. 3). Thiobacillus ferrooxidans. glicerol. Tego typu oddychanie beztlenowe przeprowadzają np. 3. jeśli są ku temu odpowiednie warunki. który ulega redukcji do bursztynianu. czyli utleniania amoniaku do azotynu (np. jak i substraty siarkowe. choć T. że reduktazy arsenianu i selenianu występują w peryplazmie i są związane z błonami. (1996) AEM 62: 1458-1460J. gdzie są warunki beztlenowe. zewnętrzny czynnik utleniający. tlenowy bądź beztlenowy. Elektrony z substratu są przenoszone na końcowy. Bakterie nitryfikacyjne są organizmami o bezwzględnie tlenowym metabolizmie oddechowym. Żyją w glebie i środowiskach wodnych. 1. Proces ten zachodzi bez udziału NAD (porównaj z metabolizmem oddechowym chemoorganotrofów). 10. w tym u E.

1. We wszystkich przypadkach fotosynteza zachodzi w błonach zawierających chlorofile. Końcowy etap reakcji jest termodynamicznie korzystny i wydaje się sprzężony z wytworzeniem siły protonomotorycznej. 5.5. es. Jednak w roku 1987 Bak i Cypionka [Nature (1987) 326: 891-892] opisali taki typ metabolizmu energetycznego. ] Niektóre metanogeny (np. 2 Wytwarzanie metanu Metan (CH4) jest produktem końcowym procesu energetycznego przeprowadzanego przez pewne bezwzględnie beztlenowe organizmy należące do Archaea. Metanogeny żyją np. Atom węgla z CO 2 wiąże się kolejno z każdą z serii cząsteczek nośników C1 i podlega stopniowej redukcji poprzez -CH 2 i CH 3 do metanu (CH4). Taką „chemolitotroficzną fermentację" przeprowadza np. w którym substraty (siarczyn lub tiosiarczan) podlegały „dysproporcjonacji". Methanobacterium. w mule rzecznym oraz w żwaczu krów i innych przeżuwaczy (środowiska charakteryzujące się Eh niższym niż -330 mV). 2. tetrahydrometanopteryna i kilka koenzymów. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów Fototrofy uzyskują energię ze światła słonecznego — w większości przypadków w wyniku fotosyntezy. barwniki dodatkowe i łańcuch(y) 80 . cus. Niektóre metanogeny (np. w których w redukcji CO2 bierze udział wodór. Zasadniczo w wyniku rozkładu octanu powstaje CO i CH 3 . Wzrost na pożywce z octanem jest wolniejszy niż na dwutlenku węgla i wodorze (ΔG0 reakcji CH3COOH -> CH 4 + CO2 wynosi około -36 kJ). tworząc siarczek i siarczan. 5. Methanococcoid. Methanococ- 5. W błotnistych glebach octan może być substratem preferownym w niskich temperaturach [Wagner i Pfeiffer (1997) FEMSME 22: 145-153]. że żaden organizm należący do Bacteria nie jest zdolny do wytwarzania metanu. Methanolobus) mogą wytwarzać metan np. 1 Fotosynteza W fotosyntezie energia w postaci światła jest absorbowana przez wyspecjalizowane barwniki i wykorzystywana do wytworzenia cząsteczek „waluty" energetycznej i/lub siły protonomotorycznej. Desulfovibrio sulfodismutans. 1 Fermentacja nieorganiczna Do całkiem niedawna uważano. 2. [Enzymes in methanogenesis: Ferry (1999) FEMSMR 23: 13-38. Methanobrevibacter. z octanu lub metanolu. podczas gdy CO jest utleniany przez wodę (enzym dehydrogenaza CO) do CO 2 i 2H. że żaden substrat nieorganiczny nie może podlegać fermentacji. Methanothermus) wytwarzają metan w serii złożonych reakcji. Cząsteczki nośników to metanofuran. 1. 2. zwane metanogenami. przy czym ten ostatni jest redukowany do metanu. Wydaje się.

do których światło jest kierowane przez wyspecjalizowane kompleksy zbierające światło. a powstającym produktem ubocznym jest tlen. lecz za „niebieskozielone glony". Tak zwane jasne reakcje fotosyntezy obejmują wszystkie (fotochemiczne) zdarzenia biorące udział w przekształcaniu energii świetlnej w siłę protonomotoryczną lub energię chemiczną. również zachodzi redukcja NADP przez PSU [(patrz Prince (1996) TIBS 21: 121-122]. Inne bakterie fotosyntetyzujące zawierają jeden lub większą liczbę bakteriochlorofili . (1993) JB 175: 575-582]. Przepływ elektronów (z lewa na prawo na rys. zbudowane z białek i barwników. ) Fotosyntezę oksygenową przedstawia się na ogół w postaci schematu Z (rys. wykorzystując jako donor elektronów siarczek zamiast wody. które przeprowadzają fotosyntezę beztlenową (i nie wytwarzają tlenu). by zredukować NADP do NADPH. Elektrony o dużej energii wyrzucone z fotosystemu II (PSU) przepływają przez łańcuch transportu elektronów do fotosystemu I (PSI). 7). Istnieją też sinice zdolne do wzrostu chemoorganotroficznego. 11). do różnych reakcji biosyntezy. 81 . że są one bakteriami. W poddanym ostatnio rewizji eukariotycznym schemacie Z. bardzo przypominający fotosyntezę roślin zielonych i glonów.transportu elektronów. Ponieważ sinice przeprowadzają fotosyntezę typu eukariotycznego. (Komórka wykorzystuje NADPH np. co powoduje powstanie siły protonomotorycznej w poprzek błony tylakoidu. 2. były przez wiele lat uważane nie za bakterie.barwników podobnych do chlorofili. Dziś nie ma wątpliwości. 1. 1 Fotosynteza oksygenowa (z wytworzeniem tlenu) u bakterii Tego typu proces. Kiedy do chlorofilu dociera energia świetlna. wyrzuca on elektrony o dużej energii. składniki aparatu fotosyntetycznego występują w błonie cytoplazmatycznej. U prawie wszystkich sinic fotosynteza zachodzi w błonach tylakoidów (sekcja 2. ) Chlorofile występują w tak zwanych centrach reakcji. (W szczepach Gloeobacter. Na skład tych kompleksów mają wpływ czynniki środowiskowe. Reakcje ciemne (= reakcje niezależne od światła) to przemiany związane z wykorzystaniem przez komórkę energii pochodzącej z fotosyntezy do syntezy związków węgla. i takie. 5. Zachodzi to w wyniku utlenienia wody. Sinice zawierają chlorofil a (który występuje też u glonów i roślin wyższych). 2. Elektrony wyrzucone z PSI mają wystarczająco dużą energię. Bakterie fotosyntetyzujące można podzielić na dwie grupy: przeprowadzające fotosyntezę tlenową (i wytwarzające tlen jako produkt uboczny). Niektóre sinice (np. 5. takie jak rodzaj światła oraz dostępność azotu i siarki [Grossman i wsp. zachodzi u sinic. 5. 11) wymaga ich dostarczenia do PSU. Elektrony te mogą „spłynąć" w dół łańcucha transportu elektronów i dostarczyć energii do wytworzenia siły protonomotorycznej i/lub bezpośredniej redukcji NADP. Chlorofile są zielonymi barwnikami zawierającymi magnez. Oscillatoria limnetica) mogą alternatywnie przeprowadzać fotosyntezę beztlenowo. Proces wykorzystania tej właśnie siły do syntezy ATP (przez ATPazę błonową) nazywamy fotofosforylacją. które nie mają tylakoidów. przy czym siarczek jest utleniany do siarki elementarnej.

U tak zwanych „purpurowych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Rhodospirillineae) wszystkie składniki fotosyntetyczne występują w wewnątrzkomórkowych błonach.Energia świetlna powoduje. spokrewnionych z sinicami. 5. w wyniku czego uwalniany jest tlen. natomiast centra reakcyjne znajdują się w błonie cytoplazmatycznej. Taki niecykliczny przepływ elektronów 82 . fotofosforylacji). 2. Elektrony wyrzucone z PSU są uzupełniane przez utlenianie wody. U „zielonych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Chlorobiineae) składniki kompleksów zbierających światło mieszczą się w chlorosomach (sekcja 2. U bakterii „zielonych" przepływ elektronów powoduje powstanie siły protonomotorycznej (zużytej np. U bakterii „purpurowych" elektrony wyrzucone z centrum reakcyjnego poruszają się na drodze cyklicznej — poprzez łańcuch transportu elektronów wracają do centrum reakcji. które stanowią jedną całość z błoną cytoplazmatyczną. 1. do syntezy ATP (tzn. 27). Powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystana np. Obecnie znamy tylko trzy gatunki tych bakterii: Prochloron didemni. Prochlorothrix hollandica i Prochlorococcus marinus. PSU) wyrzucają elektrony o wysokiej energii. Przepływ elektronów z PSU do PSI powoduje powstanie siły protonomotorycznej. ]. 2 Fotosynteza anoksygenowa Fotosynteza anoksygenowa (w której nie powstaje tlen) jest przeprowadzana beztlenowo przez bakterie z rzędu Rhodospirillales. że centra reakcji (PSI. Niewielka grupa organizmów prokariotycznych (Prochlorophyta. prochlorofity). poziomy energetyczne i miejsca docelowe zaznaczono strzałkami. (1996) TIBS 21: 44-49. do syntezy ATP) i może też być wykorzystany do bezpośredniej redukcji NAD do NADH. zawiera oba chlorofile eukariotyczne: a i b. [How does PSU split water? (artykuł przeglądowy): Rogner i wsp.

biorąc pod uwagę oddziaływania między tym metabolizmem a innymi procesami w komórce. wybarwiony na purpurowo. W tym czasie protony są pompowane na zewnątrz w poprzek błony. nie cała energia uwalniana w wyniku transportu elektronów jako siła protonomotoryczna będzie wykorzystana do fosforylacji oksydatywnej. Fototrofy wykorzystujące nieorganiczne donory elektronów nazywamy fotolitotrofami. te zaś. Donory organiczne to np. co oznacza. 2. stąd ich fotosynteza jest zawsze anoksygenowa. należącego do Archaea. siarczek. Głównym barwnikiem purpurowym jest bakteriorodopsyna. lecz raczej stanowi część złożonej całości. może nie być nigdy osiągana. Z tego powodu maksymalna teoretyczna wydajność tworzenia ATP w metabolizmie oddechowym. obszar błony cytoplazmatycznej — błonę purpurową.wymaga więc ich dostarczenia z egzogennego donora. są zdolne do wykorzystywania energii słonecznej. 1. 1. które używają donorów organicznych — fotoorganotrofami. 5. 2 Błona purpurowa Niektóre szczepy Halobacterium saiinarum (ekstremalny halofil — sekcja 3. co dzieje się w ciągu kilku tysięcznych części sekundy. z powiedzmy jednej cząsteczki glukozy. że w wyniku cyklicznego fotowzbudzenia bakteriorodopsyny tworzy się siła protonomotoryczna. 3. Kiedy cząsteczka bakteriorodopsyny absorbuje energię świetlną. 3 Donory elektronów w fotosyntezie Do nieorganicznych donorów elektronów biorących udział w fotosyntezie należy np. woda (wykorzystywana jedynie przez sinice). w warunkach tlenowych lub przy małej zawartości tlenu mogą rosnąć chemoorganotroficznie. siła ta w błonie purpurowej powstaje na skutek bezpośredniego pompowania protonów w poprzek błony. Pewna jej część może 83 . 5. chociaż nie potrafią przeprowadzać fotosyntezy. 5. Na świetle. przechodzi bardzo szybko przez szereg pośrednich stanów wzbudzonych (fotointermediatów). ale nigdy woda. Jednak w przeciwieństwie do fotosyntezy. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 5. 2. Donorami elektronów u tych bakterii mogą być np. 1 Wydajność tworzenia ATP W żywej komórce żaden proces nie zachodzi w oderwaniu od innych. kwas mrówkowy czy metanol. w warunkach beztlenowych lub przy małej zawartości tlenu wykształcają one zróżnicowany. Na przykład. siarczek i tiosiarczan. siarka i wodór. bez udziału chlorofilu. Niektóre spośród Rhodospirillales (w tym wiele bakterii „purpurowych"). 7).

3 Pozbywanie się produktów odpadowych Bakterie fermentacyjne wytwarzają bardzo dużo NADH. ale niektóre z nich mogą też wykorzystywać donory nieorganiczne. a tym samym w tworzeniu ATP. 1). 2). Nie mają z tym nigdy problemu bakterie o fermentacyjnym typie metabolizmu. 5. Zamieniając konieczność na korzyść. 2 Odwrotny transport elektronów Bakterie wymagają siły redukującej — np. takie jak siarczek. NADH i/lub NADPH — do reakcji biosyntezy. Muszą się pozbyć pewnej jego ilości. waliny i leucyny. jakim jest mleczan. dehydrogenazy NAD. gdzie NAD jest redukowany do NADH. 3. 1. Oczywiście zysk energetyczny jest wtedy mniejszy niż w przypadku całkowitego utlenienia tego kwasu. Odwrotny transport elektronów występuje również u bakterii nitryfikacyjnych i innych chemolitotrofów (sekcja 5. jak się wydaje.zostać zużyta do transportu jonów lub ruchu rzęskowego. by zredukować NAD. Lactococcus cremoris dawniej Streptococcus cremoris) uzyskują energię wiążąc protony z produktem ubocznym. Jednak niektóre proste substraty energetyczne (takie jak H2 i Fe2+). są utleniane na zewnętrznej części 84 . Wymaga to dostarczenia elektronów przez zewnętrzny donor elektronów. Na przykład. że one także nie tworzą NADH w czasie metabolizowania substratu energetycznego. Ten właśnie NADH nie zostanie utleniony w łańcuchu oddechowym. Reakcję tę przeprowadzają w wyniku odwrotnego transportu elektronów. syntetyzując produkty odpadowe. 4 Utlenianie pozacytoplazmatyczne Złożone substraty energetyczne są na ogół transportowane przez błonę cytoplazmatyczną i metabolizowane w komórce. niektóre bakterie (np. 3. a więc nie będzie uczestniczył w wytwarzaniu siły protonomotorycznej. „towarzyszące" mu protony automatycznie zwiększają siłę protonomotoryczną! 5. Należy zwróć uwagę. do enzymu błonowego. 5. gdyż elektrony wyrzucone z ich centrów reakcyjnych nie mają dość energii. z wykorzystaniem niecyklicznego przepływu elektronów. Ponadto część NADH powstającego w czasie oddychania może zostać wykorzystana w reakcjach biosyntezy. Wreszcie związki pośrednie powstające w metabolizmie energetycznym mogą służyć komórce jako „cegiełki" budulcowe w reakcjach biosyntezy. Bakterie „purpurowe" zwykle wykorzystują do tego celu organiczne donory elektronów. 3. Jednak „purpurowe" bakterie fotosyntetyzujące nie są w stanie tego dokonać. 1. takie jak kwas mlekowy (sekcja 5. W procesie tym siła protonomotoryczna jest wykorzystana do przenoszenia elektronów „pod prąd". 1. Kiedy kwas mlekowy przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną. Sinice i „zielone" bakterie fotosyntetyzujące uzyskują te cząsteczki w wyniku bezpośredniej redukcji. kwas pirogronowy jest wykorzystywany do syntezy aminokwasów — alaniny.

(1996) JB 178: 5199-5204]. Lenormand i Grimont (1989) IJSB 39: 61-67]. Jednak szczep mutanta E. Być może. tlenem). i maleje. 1). U bakterii tych enzym — dehydrogenaza glukozy (ze swoim kofaktorem pirolochinolinochinonem — PQQ/ ang. organizm ten wykazuje aerotaksję (sekcja 2. Escherichia coli (i wiele pokrewnych jej bakterii) zwykle syntetyzuje błonową dehydrogenazę glukozy pozbawioną niezbędnego jej PQQ. 5. dając wodorotlenek żelaza i protony. gdy odpływa ona w przeciwnym kierunku. odpowiadając na zmiany redoks składnika(ów) łańcucha transportu elektronów. że zdolność A. coli. gdzie stężenie tlenu wynosi tylko 3-5 mM. że taka bakteria jak Azospirillum brasiliense. Niektóre bakterie (np. ale w normalnych warunkach nie ulegają ekspresji [Biville. Czysty zysk to wytworzenie siły protonomotorycznej. Aby znaleźć się w warunkach optymalnych. 2). Według pewnej koncepcji wytworzony pozacytoplazmatycznie Fe 3+ reaguje z wodą. 5 Siła protonomotoryczna a aerotaksja Jest zadziwiające. Glukonian zostaje przetransportowany przez błonę i ulega fosforylacji do 6-fosfoglukonianu. gdy dostarcza się im PQQ [Bouvet. 2. który ma niefunkcjonalny system fosfotransferazowy (sekcja 5. 6. 2). to mikroaerofil (sekcja 3. 15. U E. która charakteryzuje się metabolizmem oddechowym i wykorzystuje tlen jako końcowy akceptor elektronów. 13) wydaje się innym. niezależnym sensorem w aerotaksji 85 . Białko Tsr (białko MCP: rys. brasiliense siła protonomotoryczna rośnie. podczas gdy elektrony (z Fe2+) redukują końcowy akceptor elektronów (tlen?) na cytoplazmatycznej stronie błony. pyrroquinoline quinone) występuje na zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Świadczy to. to zmiana poziomu siły protonomotorycznej działa jako sygnał regulujący ruchy aerotaktyczne [Zhulin i wsp.błony cytoplazmatycznej albo w przestrzeni peryplazmatycznej. coli. Wydaje się. białko sensorowe Aer może pośredniczyć w aerotaksji. 4. Co ciekawe. U A. 2. brasilense do prowadzenia tlenowego metabolizmu respiracyjnego przy tak małym stężeniu tlenu wynika z bardzo wydajnej oksydazy (enzymu redukującego tlen). 2) przepływem elektronów (z substratu) przez błonę do jej strony cytoplazmatycznej (wewnętrznej) i 3) oddziaływaniem tych elektronów z protonami i końcowym akceptorem elektronów (np. 3. gdy komórka porusza się w stronę preferowanego stężenia tlenu. 6). Na przykład ścisły tlenowiec Thiobacillus ferrooxidans zdobywa energię utleniając Fe2+ (do Fe3+) w niskim pH. który jest włączany do szlaku Entnera-Doudoroffa (rys. warunki te są korzystne dla wiązania azotu przez tę bakterię (sekcja 10. może syntetyzować PQQ i przeprowadzać utlenianie pozacytoplazmatyczne. 7. Turlin i Gasser (1991) JGM 137: 1775-1782]. 3. Takie organizmy przeprowadzają utlenianie pozacytoplazmatyczne tylko wtedy. Pseudomonas aeruginosa) mogą wytwarzać siłę protonomotoryczną w wyniku pozacytoplazmatycznego utleniania glukozy do glukonianu. Takie pozacytoplazmatyczne utlenianie substratu charakteryzuje się: 1) uwalnianiem protonów z substratu i/lub wody poza teren cytoplazmy. poruszając się w stronę miejsc. że geny kodujące PQQ występują u tej bakterii. 1. 2).

[Ion permeability at high temepratures: Driessen. 1. 5. (1997) PNAS 94: 10541-10546]. van de Vossenberg i Konigs (1996) FEMSMR 18: 139-148. 4 Systemy transportu Błona cytoplazmatyczna (sekcja 2. U pewnych bakterii morskich (np. Jednak niektóre termofile (sekcja 3. co oznacza. Skład ich błony cytoplazmatycznej jest taki.i może odpowiadać na zmiany siły protonomotorycznej [Rebbapragada i wsp. Siła sodowomotoryczna jest też wykorzystywana do poruszania biegunowej rzęski Vibrio cholerae [Kojima i wsp. coli taki antyport jest wykorzystywany jako źródło energii (siła sodowomotoryczna) odpowiednie np. 8) jest skuteczną barierą. umożliwia bowiem komórce kontro86 . 6 Siła sodowomotoryczna Siła sodowomotoryczna to energia związana z elektrochemicznym gradientem jonów sodu między wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnią błony cytoplazmatycznej. W wyższych temperaturach organizm wykorzystujący siłę protonomotoryczną będzie musiał wydatkować dodatkową energię na wytworzenie określonego jej poziomu. Wzrost w wyższym zakresie temperatury powoduje zwiększenie właściwej dla błony cytoplazmatycznej przepuszczalności zarówno dla protonów. Na przykład Clostridium fervidus wykorzystuje Na + jako jedyny jon sprzęgnięty z metabolizmem energetycznym (tzn. W pewnych przypadkach komórka może wytwarzać siłę sodowomotoryczną wykorzystując siłę protonomotoryczną: wejście protonów do cytoplazmy jest związane z wyjściem jonów sodu poprzez błonę (antyport Na + /H + ). Tak więc melibioza i jony sodu są wspólnie transportowane do cytoplazmy (symport Na+/melibioza). Vibrio alginolyticus) energia z metabolizmu oddechowego może być wykorzystana bezpośrednio do pompowania Na + na zewnątrz poprzez pompę sodową. 5. do pobrania (transportu. (Jest to oczywiście bardzo istotne. U E. 4) zarzuciły wykorzystywanie protonów w swoim metabolizmie energetycznym. jak i jonów sodu. jest ona analogiczna do siły protonomotorycznej. Jednak dla protonów wzrost ten jest większy niż dla jonów sodu. wykorzystywać siłę sodowomotoryczną do pobierania różnych aminokwasów i jako źródło energii dla ruchu obrotowego swej biegunowej rzęski. że pobieranie melibiozy zachodzi z wykorzystaniem siły sodowomotorycznej. Organizm ten może np. sekcja 5. uniemożliwiającą większości cząsteczek (i wszystkim jonom) swobodne przechodzenie do i z cytoplazmy. gatunek ten nie wykorzystuje siły protonomotorycznej). (1999) JB 181: 1927-1930]. Pewne organizmy znalazły sposób na zminimalizowanie tego problemu. że podwyższona temperatura ma mniejszy wpływ na przepuszczalność dla protonów. 3. ] Enzymy biorące udział w przemieszczaniu jonów sodu zostały omówione w artykule przeglądowym przez Dimroth [(1997) BBA 1318: 11-51]. 4) cukru melibiozy. 2. po prostu w celu skompensowania zwiększonej dyfuzji protonów do wnętrza.

1. Dwa z tych białek mają (na swojej powierzchni cytoplazmatycznej) swoiste miejsce wiązania ATP (ABC. z udziałem wyspecjalizowanej K+-ATPazy (pompa potasowa). Transport typu III wydaje się całkowicie związany z chorobotwórczością. α-hemolizyna E. 2).lowanie swojego środowiska wewnętrznego. Istnieje wiele różnych przenośników ABC. 13). Na przykład u E. jako że laktoza i protony są razem transportowane do cytoplazmy. a każdy z nich uczestniczy w imporcie lub eksporcie/sekrecji określonych jonów lub cząsteczek. 5. coli. recycling) różnych składników komórkowych (sekcja 5. Znane są cztery główne sposoby sekrecji białek: typ I (sekcja 5. 5) (rys. Wyjątkowo dobrze poznany jest transport białek poprzez osłony komórkowe. 3). ale niektóre czynniki wirulencji są też transportowane przez inne systemy — np. 4. 11). 4. 4. Dzięki systemom transportu zachodzi powtórne wykorzystywane (ang. 4. 8. coli (wydzielana poprzez system typu I). 4. 2. niektóre z nich zostały opisane w następnych sekcjach. W sumie umożliwiają one 87 . typ II (sekcja 5. białko ΤΕΤ w sekcji 15. 5. W czasie metabolizmu komórka musi mieć jednak możliwość pobierania różnych substratów (do celów energetycznych i innych) i pozbywania się produktów ubocznych. 1 Transportery ABC Transporter ABC to system transportu składający się z wielobiałkowego kompleksu w osłonach komórkowych. Hydroliza ATP w miejscu ABC dostarcza energii do transportu. K+ może być transportowany przez tak zwany system Kdp (sekcja 7. że nawet w tej samej komórce dany związek może być przenoszony przez systemy różnego typu. 2) jest związany z chemotaksją i represją kataboliczną. czy też białko IcsA Shigella odpowiedzialne za czerwonkę (system typu IV). 4) i typ IV (sekcja 5. Białko zawierające takie miejsce będzie tu określane mianem „białka ABC". 4. która jest zwykle dostarczana w postaci siły protonomotorycznej i/lub „wysokoenergetycznego fosforanu" takiego jak ATP. 4. 2). Są one często swoiste dla poszczególnych substratów lub dla małej liczby substratów podobnych — chociaż bywa. Służą do tego różne systemy transportu. Transport poprzez system PTS (sekcja 5. Energia potrzebna do transportu jonów jest czasem dostarczana w wyniku hydrolizy ATP przez błonową ATPazę. Hydroliza ATP umożliwia pompie pobranie K+ wbrew gradientowi stężeń. typ III (sekcja 5. coli symport proton-laktoza pozwala na pobieranie laktozy kosztem siły protonomotorycznej. Wiele systemów transportowych ma złożoną budowę i ich działanie nie jest całkowicie jasne. 6). 6) i usuwanie antybiotyków (patrz np. ang. ATP-binding cassette). 9. 4. ) Bakterie gramujemne mają dodatkową barierę w postaci błony zewnętrznej (sekcja 2. Transport często wymaga energii. Na przykład u E. gdyż bakterie patogenne zwykle wywołują chorobę wydzielając toksyny białkowe lub enzymy. Siła protonomotoryczna może bezpośrednio napędzać transport pewnych naładowanych i nienaładowanych rozpuszczonych substancji.

enzymów. 2 Eksportery ABC Ogólnie mówiąc eksportery pośredniczą w eksporcie/sekrecji różnego typu białek. 1). w którym białko peryplazmatyczne wiąże histydynę i przenosi ją do kompleksu błonowego. Ten z kolei przekazuje ją do cytoplazmy [patrz np. Zwykle importer zawiera dwa różne białka (w błonie cytoplazmatycznej). Na przykład niektóre z nich importują związki odżywcze lub jony ważne w osmoregulacji. 5. podczas gdy inne wydzielają toksyny białkowe i antybiotyki. Transportery ABC występują zarówno u bakterii gramujemnych. 1 Importery ABC (transportery zależne od białek wiążących. Wydaje się. 4. Na przykład u Salmonella typhimurium transporter kodowany przez geny sapABCDF bierze udział w imporcie pewnych toksycznych peptydów (w celu ich detoksyfikacji). że zwykle dany eksporter może transportować różnego rodzaju cząsteczki pokrewne lub podobne [ABC transporters (bacterial exporters): Fath i Kolter (1993) MR 57: 997-1017. ) Przykładem importera ABC jest system ProK. które są niezbędne dla oporności bakterii na te peptydy [patrz np. ] Jeden z eksporterów u E. transporter ABC może też wpływać na kanały. ale ma też wpływ na kanały dla + jonów K . 13). uczestniczący w pobieraniu cząsteczki osmoregulacyjnej. cukrów i jonów. Inny przykład to system transportu histydyny u Salmonella typhimurium.import/eksport bardzo różnych substratów. 1. Wszystkie importery zawierają białko wiążące. 88 . że biorąc udział w transporcie pewnych związków rozpuszczonych. jak i gramdodatnich. 1. przez które są przenoszone inne związki rozpuszczone. połączony dimer białek ABC i substratowo swoiste peryplazmatyczne białko wiążące. antybiotyków peptydowych i (u niektórych bakterii) polisacharydowych składników otoczek. np. 5. które wiąże substrat i przenosi go do kompleksu błonowego. 4. Regiony transporterów ABC odpowiedzialne za hydrolizę ATP zostały omówione w artykule przeglądowym: Schneider i Hunke [(1998) FEMSMR 22: 1-20]. jaką jest betaina glicynowa (sekcja 3. U Streptomyces antibioticus eksporter ABC wydziela antybiotyk oleandomycynę (należącą do tej samej grupy co erytromycyna). coli pośredniczy w jednoetapowym transporcie α-hemolizyny z cytoplazmy na zewnątrz komórki. 5. Należy on do tzw. Higgins (1995) Cell 82: 693-696]. Ciekawe. chemosensing. cukrów i białek. Hung i współpracownicy opisali budowę krystaliczną HisP — białka ABC permeazy histydynowej Salmonella typhimurium [(1998) Nature 396: 703-707]. hemolizyn (sekcja 16. permeazy peryplazmatyczne) Importery pośredniczą w pobieraniu pewnych aminokwasów. 8). Liu i Ames (1997) JBC 272: 859-866]. 4. w tym jonów nieorganicznych. 1. 1. systemów sekrecji typu I (rys. (Niektóre białka wiążące uczestniczą również w „rozpoznawaniu" chemicznego stanu środowiska — ang.

ułatwiając transport. że przynajmniej w pewnych przypadkach składniki eksportera układają się w określonym porządku. transportują je na zewnątrz komórki). glukozy. to fosforylacja w czasie pobierania jest pozytywnym aspektem transportu PTS. ] 89 . Niektóre badania sugerują. 7. 3). cyklolizyna u Bordetella pertussis (wywołującej krztusiec) czy alkaliczna proteaza u Pseudomonas aeruginosa. poprzez nieznany intermediat(y). z białkiem CheY systemu MCP (rys. i 3) PTS nie odpowiada na repelenty. MFP może łączyć błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną. 2 System fosfotransferazowy zależny od fosfoenolopirogronianu System fosfotransferazowy (PTS. co wpływa na ruch rzęski. Delepelaire i Wandersman (1996) EMBO Journal 15: 5804-5811]. przy czym źródłem energii jest tu fosfoenolopirogronian (wzór rys. 6). W najprostszym przypadku fosfoenolopirogronian dostarcza fosforanu i energii do sekwencyjnej fosforylacji dwóch kolejnych białek (oznaczonych I oraz H) w cytoplazmie. tzw. Po połączeniu substratu z ABC to ostatnie oddziałuje z MFP. Fosforan i energia zostają przeniesione z Η na związaną z błoną cytoplazmatyczną permeazę swoistą dla cukrów (tzw. phosphotransferase system) jest wykorzystywany przez różne bakterie gramujemne i gramdodatnie do pobierania pewnych cukrów (np. które wydzielają białka (tzn. 4. 2). np. glukozo-6-fosforan na rys. Tak więc: 1) substrat musi być transportowany (a nie po prostu związany). błonowe białko fuzyjne (MFP. fruktozy. Ponieważ cukry są często metabolizowane w postaci ich fosforylowanych pochodnych (np. mogą mieć mniej składników białkowych niż te. 5. 2) w adaptacji nie bierze udziału metylacja. 5. kompleks II). która ma być wydzielona) z białkiem ABC. Niektóre eksportery u bakterii gramujemnych zawierają: białka ABC. tworząc w ten sposób kompletny system transportowy. 5). [PTS (artykuł przeglądowy): Saier i Reizer (1994) MM 13: 755-764. ang. i że zachodzi to w wyniku związania substratu (tzn. 5. 5. 5. cząsteczki. laktozy). Zwykle białka przenoszone przez eksportery ABC są pozbawione N-końcowej sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 3 i 6. alkoholocukrów (np. która wiąże się z substratem. 13). która może bezpośrednio oddziaływać z białkami ABC. ale mają C-końcową sekwencję sekrecyjną. 12). Eksportery. N-acetyloglukozoaminy). PTS odgrywa rolę nie tylko w transporcie: komórka może też wykazywać chemotaksję w odpowiedzi na cukry pobrane przez system PTS. mannitolu) i cukrów podstawionych (np. które przenoszą cząsteczki do peryplazmy lub błony zewnętrznej jako miejsc docelowych. które z kolei wiąże się ze składnikiem błony zewnętrznej [Letoffe. ang.W skład białek wydzielanych przez patogeny wchodzą niektóre ważne czynniki wirulencji (sekcja 11. membrane fusion protein) (w błonie cytoplazmatycznej. Jeden z możliwych mechanizmów to oddziaływanie fosforylowanych składników PTS (rys. ale częściowo też w peryplazmie) i składnik występujący w błonie zewnętrznej. następnie fosforyluje go i jednocześnie transportuje do cytoplazmy (rys. 12). Chemotaksja zachodząca z udziałem PTS różni się od systemu MCP [Titgemeyer (1993) JCB 51: 1-6].

Źródłem energii dla transportu jest fosfoenolopirogronian (PEP). że cząsteczki Η i I nie są specyficzne dla żadnej permeazy. ale kontroluje też pewne procesy metabolizmu węgla. Na przykład permeaza fruktozowa bakterii jelitowych składa się z białka błonowego. Zwróć uwagę. 11) uczestniczących w pobieraniu/katabolizmie źródeł węgla. Zgodnie z proponowaną nomenklaturą dla permeaz PTS [Seier i Reizer (1992) JB 174: 1433-1438]. operonu lac. zawierającego IIC i IIB oraz oddzielne białko. Poza rolą. 90 . rys. transbłonowa domena IIC. tzn. Eco + IIAGlc'Eco. IIA i IIB systemu PTS uczestniczą w regulacji pewnych operonów katabolicznych (sekcja 7. ang. a następnie na białko Hpr (oznaczone H). Hydrofobowa. jak i IIB zawiera miejsca fosforylacji. w miejscu określonym jako „domena regulacji przez PTS" (PRD. 2. ale przypuszczalnie tylko ta druga bierze bezpośredni udział w fosforylacji substratu. Tak więc cząsteczki przenoszące grupy fosforanowe w PTS (rys. mogą fosforylować każdą z nich. PTS-regulation domain) [Stulke i wsp. Zarówno domena IIA.Pokazano udział PTS w transporcie mannitolu i glukozy poprzez błonę cytoplazmatyczną (CM) z peryplazmy (wyżej) do cytoplazmy (niżej) u Escherichia coli. uczestniczy w tworzeniu kanału transbłonowego. jak i H. 1). Analogiczny enzym z Rhodobacter capsulatus to pojedyncze białko łączące funkcje ΠΑ. a domena IIB uczestniczy w fosforylacji substratu. ) Permeaza mannitolowa (po lewej) jest enzymem całkowicie błonowym i składa się z trzech domen: IIA. Następnie fosforan zostaje przeniesiony na permeazę (kompleks enzymu II. 1) zachodzi poprzez fosforylację regulatorów transkrypcji. sekwencja fosforylacji prowadzi od IIA do IIB. która wiąże substrat. 2. We wszystkich przypadkach fosforylacja cząsteczki substratu jest integralnym elementem jej transportu do cytoplazmy. 12) regulują aktywność niektórych operonów (np. System jest zasilany energetycznie w wyniku sekwencyjnego transferu grupy fosforanowej Ρ ζ „wysokoenergetycznego fosforanu" w PEP na enzym I (oznaczonego I). składniki H. Η i I. pełniące zarówno funkcję IIA. (Zwróć uwagę. 8. 8. a permeazę glukozową E. W permeazie glukozowej domena IIA jest odrębnym białkiem. jak się wydaje. oznaczony jako II). W wielu przypadkach ta kontrola operonów (sekcja 7. (1998) MM 28: 865-874]. IIB i IIC. że glukoza i mannitol są pobierane przez różne systemy związane z błonami („permeazy")/ jak opisano niżej. 5. W przypadku niektórych permeaz PTS składniki są ułożone w inny sposób. coli — IICBGlc. 7. MtlEco permeazę mannitolowę E. jaką pełnią w transporcie. PTS nie tylko bierze udział w transporcie substratów. coli oznacza się IICBA .

2. ang. coli. GSP jest określony przez pewne geny (analogiczne do genów sec E. np. Następnie cały kompleks wiąże się przejściowo z błoną cytoplazmatyczną (poprzez białko FtsY). coli powstający peptyd (wraz ze swoim rybosomem) najpierw wiąże się z tak zwaną cząstką rozpoznającą sygnał (SRP. (1998) EMBO Journal 17: 2504-2512]. Salmonella. 6). 5. pewne enzymy. Etap pierwszy. albo zaraz po niej. poprzez translokon. gdzie znajduje się SecA — błonowa ATPaza. 4 Systemy typu III sekrecji białek u bakterii gramujemnych W systemach typu III białka są wydzielane przez por lub kanał. 2. SecB zostaje uwolnione. (Początkowy(e) etap(y) GSP są też wykorzystywane przez białka. ) Wśród różnych szlaków sekrecji białek. SecB.5. Wydaje się. toksyny. składającą się z małej cząsteczki RNA i GTPazy. van der Does i Driessen (1997) JB 179: 5699-5704]. Białka wydzielane w szlaku GSP są syntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją sygnałową (sekcja 7. co więcej niektóre z białek są podobne do składników innych systemów sekrecji białek. U różnych gatunków składniki systemów typu III są podobne (homologiczne). zwanym translokonem. 1). że ten etap GSP nie występuje u E. 2. Transport z peryplazmy na zewnątrz komórki jest słabo poznany. w systemach tych może uczestniczyć 20 lub nawet więcej białek. system sekrecji typu II) u bakterii gramujemnych Wiele z wydzielanych białek. do peryplazmy. ang. których końcowym przeznaczeniem jest błona cytoplazmatyczna. która ułatwia ich przejście przez błonę cytoplazmatyczną i jest enzymatycznie odcinana od białka w czasie przechodzenia przez błonę. 91 . Wydaje się. Tak więc u E. dane białko jest przenoszone przez białko opiekuńcze (chaperon). poczynając od cytoplazmy aż do powierzchni komórki. Shigella (sekcja 11. Odmiennie niż w transporterach ABC (sekcja 5. 4. jest transportowanych z cytoplazmy na zewnątrz komórki przez dwuetapowy szlak sekrecji ogólnej (GSP. 1). który przechodzi przez osłony komórkowe. a energia z hydrolizy ATP (w SecA) kieruje białko (które już całkowicie uległo translacji). general secretory pathway). 6). signal recognition particle). 1). których produkty tworzą system transportu białek do i przez błonę cytoplazmatyczną. zanim rybosom wraz z polipeptydem zostanie uwolniony i połączony z translokonem SecYEG. 5. Cały proces jest zasilany energią z hydrolizy GTP [Valent i wsp. 4. peryplazma lub błona zewnętrzna. 4. coli). Taki transport wymaga energii: siły protonomotorycznej i ATP. który tworzy kanał sekrecyjny w błonie cytoplazmatycznej. do błony cytoplazmatycznej w miejsce. że systemy typu III występują głównie lub wyłącznie u patogenów — np. 3 Szlak sekrecji ogólnej (szlak zależny od sec. Etap drugi. szczepów EPEC (sekcja 11. SecA jest związana z kompleksem białkowym (SecYEG) [Manting. W przypadku niektórych białek kierowanie z cytoplazmy do błony cytoplazmatycznej w czasie translacji zachodzi w inny sposób. 1) i Yersinia (sekcja 11. Albo jeszcze w trakcie translacji (sekcja 7.

3). z wydzieleniem domeny a. 3). IpaB u Shigella (sekcja 11. a jeden z modeli określa to następująco. [Systemy typu III (artykuł przeglądowy): Lee (1997) ΉΜ 5: 148-156. Mechanizm wydzielania nie jest w pełni zrozumiały. Domena β tworzy następnie w błonie zewnętrznej por o strukturze „baryłki β". W takich przypadkach białka mogą być wydzielane przez bakterię bezpośrednio do komórki gospodarza. 2) domeny α i 3) C-końcowej domeny β. że przynajmniej niektóre z wydzielanych białek występują w komórkach gospodarza. Wiadomo. coli). U niektórych bakterii systemy typu III są przypuszczalnie aktywowane przez kontakt z komórkami eukariotycznymi (np. W tym czasie zostaje odcięta sekwencja sygnałowa. Potwierdzają to następujące spostrzeżenia. Nieznane są wymagania energetyczne systemów typu III. który może być wydzielany przez domenę β tego samego białka. (1998) MM 28: 143-155] i Yersinia). przy czym domena a zostaje wydzielona. cytoplazmatyczne białko YscN może działać jak ATPaza. jako że tę samą nazwę stosuje się do określenia całego (trzyczęściowego) białka prekursorowego. Domenę a nazywa się też autotransporterem. ] 5. harpins) bakterii chorobotwórczych dla roślin. 2) ulec autokatalitycznemu rozszczepieniu. Białko może potem np. szczepy EPEC [Wolff i wsp. 1).: 1) pozostać w stanie nienaruszonym w błonie zewnętrznej. opisanego wyżej. 92 . lub w ogóle nie wpływają na komórki gospodarza in vitro. EspB i EspE/Tir (szczepy EPEC). 4. Peptyd liderowy działa jako sekwencja sygnałowa (sekcja 7. Wymagania energetyczne systemu sekrecji typu IV nie są jasne. 5. 6) — tak więc białko najpierw przechodzi przez błonę cytoplazmatyczną z udziałem systemu (typu II) zależnego od sec (sekcja 5.a wydzielane białka działają w sposób charakterystyczny na komórki eukariotyczne. 2) oraz „harpiny" (ang. Domena a jest więc „pasażerem". jak to się dzieje w systemach typu II (zależnych od sec) (sekcja 5. Po pierwsze same białka wydzielane przez systemy typu III mają mały wpływ. choć może to być mylące. Tego typu systemy wydzielania występują zarówno w bakteriach chorobotwórczych dla roślin [Alfano i Collmer (1997) JB 179: 5655-5662]. 4. Wydzielane białka mają N-końcową sekwencję. 5. Białka wydzielane przez inne patogeny to np. Po drugie wykazano. składającego się z: 1) N-końcowego peptydu liderowego. 5 Systemy typu IV sekrecji białek (autotransportery) u bakterii gramujemnych Białko wydzielane z udziałem tego systemu jest syntetyzowane jako część większego białka. SipC (Salmonella typhimurium). przez który domena a (tego samego białka) przechodzi na powierzchnię komórki. jak i w patogenach człowieka i zwierząt. związane z porem. która kieruje je do poru i nie jest odcinana. W przypadku Yersinia wydzielane białka (Yop) wywierają swoiste działanie na gospodarza (sekcja 11. 3) ulec rozszczepieniu przez inne białko błony zewnętrznej (takie jak proteaza OmpT E. 4. że u Yersinia.

[Autotransportery: Henderson. 2). 3. Do badań tych gen białka heterologicznego poddano fuzji (in vitro) z DNA kodującym domenę β AIDA-I. 2). które rozszczepia przeciwciała klasy IgA (rys. System autotransporterowy AIDA-I (ang. podjednostki Β toksyny cholery) na powierzchni zmutowanych szczepów E. 5. coli został wykorzystany do wyeksponowania heterologicznego białka (np. ] 93 . 11. heterologiczne białko (pasażer) było eksportowane i eksponowane na powierzchni komórki (8. coli pozbawionych OmpT. Holland (1998) TIM 6: 388-389. Navarro-Garcia i Nataro (1998) TIM 6: 370-378. adhesin involved in diffuse adhesion) E. coli. Innym przykładem jest białko IcsA (zatrzymywane na powierzchni komórki) odpowiedzialne za inwazyjność Shigella wywołującej czerwonkę (sekcja 11. 3. w czasie ekspresji w komórkach E. 13).Pierwszym poznanym systemem autotransporterowym była proteaza IgAl u Neisseria gonorrhoeae — białko (sekrecyjne). tym samym.

1. W cytoplazmie tripeptyd (L-alanylo-y-D-glutamylo-mezo-diaminopimelinian — rys. 10). Inny rodzaj dużych cząsteczek transportowanych przez ściany to w pewnych typach koniugacji (sekcja 8. sekcja 5. W warstwie peptydoglikanu musi też powstać pewien „wyłom" w czasie składania ciałka podstawowego rzęski. 7) i częściowo ponownie wykorzystuje powstałe produkty do jego resyntezy (recycling). zachowując jednak jego integralność (patrz rys. 1) przez inny enzym (ligazę) [produkt genu mph Mengin-Lecreubc i wsp. Na przykład E. α-hemolizyna E. 6 Transport metabolitów powtórnie wykorzystywanych (salvage transport) W pewnych przypadkach bakteria może ponownie wykorzystywać niektóre (makro)cząsteczki. Kompleksy podjednostek z peryplazmatycznym białkiem wiążącym (oznaczonym MppA) są przenoszone poprzez błonę cytoplazmatyczną przez swoisty system transportu (kodowany przez geny oppBCDF). 3. W pewnych przypadkach udało się rzeczywiście powiązać te procesy [artykuł przeglądowy: Dijkstra i Keck (1996) JB 178: 5555-5562]. 1). Składanie fimbrii (i innych wypustek) również wymaga przeniesienia na zewnątrz komórki ich składników białkowych. 4. który jest przenoszony z komórki dawcy do biorcy. którą komórka musiałaby wydatkować na syntezę. 2. zamiast je tracić wydzielając do środowiska. Peptydoglikan jest degradowany (przez enzymy peryplazmatyczne) do podjednostek disacharydotripeptydowych. Jednak warstwa peptydoglikanu nie może całkowicie otaczać protoplastu. 5. 7 Transport poprzez barierę peptydoglikanu Aby nie doszło do lizy osmotycznej. stale degraduje swój Peptydoglikan (rys. (1996) JB 178: 5347-5352]. Składanie struktur związanych z transportem czy też innych struktur przechodzących poprzez osłony komórkowe najprawdopodobniej zachodzi z udziałem enzymu(ów). 3. . (1998) JB 180: 1215-1223]. 4. 2) muszą być transportowane poprzez osłony. W ten sposób wchodzi ponownie do szlaku biosyntezy ściany komórkowej [Park i wsp. bakteria musi mieć nienaruszone osłony komórkowe. 3. ale również energii. 2. 7) jest odłączany od podjednostki przez enzym amidazę i dołączany do UDP-MurNAc (sekcja 6. gdyż różne duże cząsteczki (np. Według jednego z przyjętych modeli. 4. które lokalnie modyfikują Peptydoglikan. 2. Brak w nim również ciągłości w miejscach połączenia błon — cytoplazmatycznej i wewnętrznej (sekcja 2.5. Jest to sensowne nie tylko z powodu oszczędności materiału budulcowego. coli. coli. 4. 2) kompleks DNA-białko. rosnąc.

albo fotolitotrofami (tzn. W rozdziale tym omawiamy: 1) wymagania węglowe bakterii. Ogólnie. mogą one wykorzystywać ogromną gamę związków węgla. jakie są zawarte w żywych organizmach i są przez nie tworzone. w tym cukry. a wykorzystywanie dwutlenku węgla jako jedynego (lub głównego) źródła węgla to autotrofia. ale również proste substraty energetyczne (rozdz. 5). w obiegu azotu (rozdział 10). Takie organizmy zwane są autotrofami. u sinic i oczywiście u roślin zielonych oraz glonów.ROZDZIAŁ 6 Metabolizm II . Te ostatnie mogą wykorzystywać wyłącznie dwutlenek węgla. Są albo chemolitotrofami (tzn. u innych — bezwzględna. 2) sposoby przyswajania różnych związków węgla i 3) syntezę. Ten typ metabolizmu jest unikatowy w świecie ożywionym i można go znaleźć wyłącznie u niektórych wyspecjalizowanych prokariotów. Bezwzględne autotrofy wykorzystują nie tylko proste źródło węgla. Jakich rodzajów związków węgla wymagają bakterie do wzrostu? Niektóre z nich mogą wykorzystywać dwutlenek węgla do syntezy większości lub wszystkich związków węgla. U niektórych bakterii autotrofia jest względna. Metabolizm azotu i siarki jest przedstawiony w rozdziale 10. kwasy tłuszczowe. chemolitoautotrofami).węgiel Dlaczego węgiel? Po prostu dlatego. Większość bakterii to nie autotrofy: nie mogą one wykorzystywać dwutlenku węgla jako głównego źródła węgla. fotolitoautotrofami). Metabolizm fotolitoautotroficzny występuje np. że właściwie wszystkie związki. Metabolizm chemolitoautotroficzny występuje u stosunkowo nielicznych bakterii (oraz u niektórych członków domeny Archaea). Chemolitoautotrofy odgrywają ważną rolę np. przemiany i polimeryzację związków węgla. alkohole 95 . nawet jeśli glukoza czy inne substraty są łatwo dostępne. to związki węgla. a chemoorganotroficzne heterotrofy to chemoorganoheterotrofy. Ich wzrost zależy od złożonych związków organicznych pochodzących z innych organizmów. Bakterie wymagające do wzrostu złożonych związków węgla zwane są heterotrofami.

10). Autotrofy dysponują różnymi sposobami wiązania dwutlenku węgla. Enzymy te występują tylko w komórkach wiążących dwutlenek węgla w cyklu Calvina. Zalicza się do nich Bacillus Schlegelii i Pseudomonas carboxydovorans. że nie pasują one do ścisłej definicji „autotrofa". Utleniają one tlenek węgla do dwutlenku węgla (w warunkach tlenowych) i asymilują dwutlenek węgla w cyklu Calvina. zanieczyszczonych wodach i ściekach. 6. 6. 6. Są nimi. że został on „związany". Gdy jest on włączany do tego typu związków. 3 Karboksydobakterie Karboksydobakterie mogą wykorzystywać tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii. Każdy obrót cyklu wymaga znacznego nakładu zarówno ATP.i różne inne substancje organiczne. 6) i fosforybulokinaza. 96 . ale dwa ze znanych mechanizmów występują najczęściej — cykl Calvina i reduktywny cykl kwasów karboksylowych. jak i siły redukującej. Podobnie jak w cyklu Calvina. 2 Reduktywny cykl kwasów karboksylowych Szlak ten wykorzystują do wiązania dwutlenku węgla bakterie fototroficzne z rodziny Chlorobiaceae i chemotroficzny archeon Sulfolobus. mówi się. 1. Część cyklu Calvina przedstawiono na rysunku 6. Enzymem kluczowym tego szlaku jest karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l. wszystkie gatunki wywołujące choroby człowieka. 6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów Autotrofy wykorzystują dwutlenek węgla występujący w środowisku do tworzenia złożonych związków organicznych. na przykład. 5-bisfosforanowa (RuBisCO — patrz też sekcja 2. 1. że wiązanie dwutlenku węgla łączy się z dużym nakładem energii. w tym niektóre anoksygenowe bakterie fotosyntetyzujące i większość sinic. 2. Organizmy takie występują w glebie. wiązanie dwutlenku węgla wymaga tu wielkiego nakładu energii. zwierząt i roślin. co oznacza. 5. 1. Bakterie heterotroficzne są szeroko rozpowszechnione w przyrodzie. w którym reakcje nieodwracalne (takie jak kwas szczawiooctowy -» kwas cytrynowy) zostały zmodyfikowane przez różne enzymy/sekwencje reakcji. 1 Cykl Calvina Szlak ten (zwany też reduktywnym cyklem pentozofosforanowym) wykorzystują bardzo liczne autotrofy. 1. co oznacza. Zasadniczo przypomina on działający w odwrotną stronę cykl kwasów trikarboksylowych (rys.

a sposób jej asymilacji zależy od szlaków i systemów enzymatycznych. a następnie — cykl kwasów trikarboksylowych (rys. jak i związków będących prekursorami w biosyntezie. Wszystkie te procesy dostarczają zarówno energii. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów Heterotrofy mogą asymilować szeroką gamę związków organicznych. Do ciągłego działania cyklu Calvina konieczne jest stałe dostarczanie rybulozo-l. Wiele heterotrofów wykorzystuje glukozę. Dla przejrzystości rysunku pominięto w cyklu Calvina liczne połączenia z innymi szlakami. takich jak szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza. ) RuBisCO to enzym karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l. rys. 97 . 5-bisfosforanowa. Pseudomonas aeruginosa jest zdolny do asymilacji glukozy w wyniku utleniania pozacytoplazmatycznego (sekcja 5. Węgiel wchodzi do cyklu wskutek wiązania dwutlenku węgla i opuszcza go w postaci związków pośrednich pobranych do reakcji biosyntezy. a także do tworzenia pirogronianu — prekursora alaniny. 10). Na przykład liczne bakterie (w tym E. Na przykład 3-fosfoglicerynian jest wykorzystywany do syntezy pewnych aminokwasów (takich jak glicyna i seryna). Niżej podano jedynie kilka przykładów. 3). 5. Zwróć uwagę.Szlak ten umożliwia wykorzystanie dwutlenku węgla do syntezy złożonych związków budujących komórkę. (Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. coli) mogą przyswajać glukozę w szlakach „energetycznych". 5-bisfosforanu. 6. 4). 3. Tak więc ilość węgla pobieranego z cyklu nie może przekraczać ilości węgla doń wchodzącego. że bezwzględne autotrofy muszą syntetyzować wszystkie aminokwasy niezbędne do syntezy białek. 5. leucyny i innych aminokwasów. jakimi dysponuje dany organizm.

że będzie on pobierany i wykorzystywany przez daną bakterię: patrz represja kataboliczna (sekcja 7. aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zasilać glikolizę i dostarczać w ten sposób energii w wyniku fosforylacji substratowej. 6. [ED pathway in E. Ponadto. wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 6. 8. który zostaje włączony do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa. 5. 2. Szlak Entnera-Doudoroffa dostarcza NAD(PH) do biosyntez oraz różnych cząsteczek prekursorowych. Wśród powstających produktów jest też disacharyd — celobioza. takie jak glukoniany (występujące np. takich jak L-tryptofan i L-fenyloalanina. Jest też źródłem NADPH będącego siłą redukującą w różnych reakcjach biosyntetycznych — np.Liczne bakterie (a także niektórzy przedstawiciele Archaea) przyswajają glukozę i np. w jelitach ssaków). ważnego prekursora nukleotydów (rozdz. 3. Bakterie te wytwarzają enzymy rozkładające na zewnątrz komórki pewne rodzaje celulozy. polimer glukozy. 3). Celuloza. Trzeba tu podkreślić. 3 Synteza. Jest on podobny do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. coli: Peekhaus i Conway (1998) JB 180: 3495-3502. a substraty. 1). 6. U E. kompoście itp. rozkładających celulozę) należą gatunki Cellulomonas i n p . Komórka potrzebuje jednak nie tylko cząsteczek „strukturalnych". w syntezie kwasów tłuszczowych. Do bakterii celulolitycznych (tzn. Clostridium thermocellum oraz szczepy Pseudomonas i Ruminococcus. 3). glukoniany poprzez szlak Entnera-Doudoroffa (rys. oraz erytrozo-4-fosforanu. coli szlak Entnera-Doudoroffa może odgrywać ważną rolę w przyswajaniu węgla. bakterii żwacza (część trawiąca przewodu pokarmowego krów i innych przeżuwaczy). Występuje u mikroorganizmów eukariotycznych. jest źródłem węgla dla pewnej liczby promieniowców (bakterii występujących w glebie. natomiast galaktoza — w szlaku Leloira. Szlak heksozomonofosforanowy jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie. 2). ] Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) dostarcza rybulozo-5-fosforanu (rys. mogą być metabolizowane nawet w obecności glukozy. 2). u zwierząt i roślin. że dostępność danego substratu nie musi oznaczać wcale. ) oraz np. W szlaku tym galaktoza ulega fosforylacji (z udziałem ATP) do galaktozo-1-fosforanu enzymatycznie przekształcanego poprzez glukozo-1-fosforan w glukozo-6-fosforan. niezbędnego do syntezy aminokwasów aromatycznych. ponieważ oba zaczynają się fosforylacją heksozy i w obu przypadkach powstaje kwas pirogronowy. Glukoza jest metabolizowana w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. Escherichia coli rozszczepia cukier laktozę na glukozę i galaktozę. 6. 5. 1 Synteza związków węgla Synteza ogromnej liczby różnorodnych cząsteczek budujących żywą komórkę wymaga zachodzenia niezwykle złożonej (i ściśle kontrolowanej) sieci reakcji chemicznych. 7) i aminokwasu histydyny. 98 . w organizmach przeprowadzających oba wymienione szlaki.

99 .Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) jest do niego podobny aż do etapu 6-fosfoglukonianu. 3) lub. 5. jak na przykład u Pseudomonas i bakterii pokrewnych. może ponownie wejść do szlaku Entnera-Doudoroffa poprzez glukoneogenezę (sekcja 6. 3. 2). Aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zostać przekształcony w kwas pirogronowy (podobnie jak w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa: rys.

może zostać wykorzystany do syntezy aminokwasów: cysteiny. 6). Wiele związków tworzonych na początku szlaków asymilacyjnych może służyć jako prekursory biosyntez. W pewnych przypadkach komórka może uniknąć biosyntezy składników de ηονο. Gdy zostaną pobrane z cyklu kwasów trikarboksylowych związki pośrednie. W reakcjach redukcji uczestniczy NAD(P)H lub FADH2. koenzym A (nośnik grup acetylowych i innych grup acylowych) oraz pirofosforan tiaminy (TPP) (biorący udział np. glicyny i seryny (składników białek . dzięki ponownemu wykorzystaniu swojego materiału budulcowego w szlakach wtórnego wykorzystania metabolitów (ang. to jakiekolwiek zaburzenie we wczesnych etapach przyswajania węgla powodowałoby poważne komplikacje w drogach biosyntezy. na przykład w pewnych warunkach kwas szczawiooctowy może powstawać bezpośrednio w wyniku karboksylacji kwasu pirogronowego lub fosfoenolopirogronianu. tylko bardzo nieliczne reakcje zachodzą spontanicznie. a bursztynylo-CoA — porfiryn — składników chlorofili i cytochromów. 1. 4. które są dogodnymi prekursorami w biosyntezie. Należy do nich np. Tego typu reakcje uzupełniające zwane są reakcjami anaplerotycznymi.sekcja 7. aldehyd 3-fosfoglicerynowy. bowiem gdyby do tego celu prowadził skomplikowany metabolizm.i 5-węglowych cząsteczek. 1).rozdz. Z punktu widzenia komórki nie jest to pozbawione sensu. to nie mogą być wykorzystane do regenerowania kwasu szczawiooctowego. Szlaki asymilacyjne zarówno u autotrofów. by pobieżnie przejrzeć pewne ogólne wiadomości dotyczące biosyntezy. do syntezy nukleotydów (składników DNA i RNA . Oprócz enzymów niezbędne też są inne czynniki. A więc np. złożonego związku będącego pochodną pterydyny. Związki pośrednie powstające w cyklu kwasów trikarboksylowych (rys. Służą do tego różne reakcje. Jednym z przykładów jest ponowne wykorzystanie podjednostek tripeptydowych peptydoglikanu (sekcja 5. 7). Jeden koenzym może wpływać na kilka różnych procesów metabolicznych. jeśli cykl ma zachodzić w ciągły sposób. Jest to dobrze widoczne na przykładzie tetrahydrofolianu (THF). 4. 6) oraz innych związków. że uczestniczy on w procesach ważnych dla 100 . 1). a rybozo-5-fosforan (szlak heksozomonofosforanowy) jest wykorzystywany np. Tu mamy jedynie tyle miejsca. W metabolizmie bakteryjnym ważną rolę odgrywają koenzymy. jak i heterotrofów dostarczają zwykle 3-. 10) też mogą zostać wykorzystane w biosyntezach. Metabolizm węglowy i energetyczny są zwykle ze sobą ściśle związane (sekcja 5. a do fosforylacji potrzebny jest ATP. w różnych reakcjach dekarboksylacji). w utlenianiu — NAD lub FAD. GTP lub fosfoenolopirogronian. salvage pathways). 5. pierwszy produkt powstający w cyklu Calvina (rys. Każdy etap reakcji biosyntetycznej jest zwykle katalizowany przez enzym. 3. acetylo-CoA bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych. niezbędnej do przeprowadzania reakcji anabolicznych. Zwróć uwagę. Na przykład kwas szczawiooctowy i α-ketoglutarowy są prekursorami pewnych aminokwasów. musi więc on być uzupełniany w jakiś inny sposób. kwasu p-aminobenzoesowego i kwasu glutaminowego. Również kwas pirogronowy (pochodzący ze szlaków Embdena-Meyerhafa-Parnasa i Entnera-Doudoroffa) jest prekursorem np. Niektóre funkcje THF przedstawiono w tabeli 6. różnych aminokwasów.ale również energii. 6.

glicerol czy pirogronian. Zjawisko wzajemnych przemian związków węgla dobrze ilustruje glukoneogeneza: synteza glukozo-6-fosforanu z substratów niewęglowodanowych. 2). może być metabolizowany w każdym z nich. 9). 3). ich wspólny związek pośredni (rys. Sam THF jest syntetyzowany w wyniku redukcji swojego prekursora. 6. 7) i syntezie białek. dzięki czemu przepływ węgla do różnych produktów może być regulowany zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. Obejście reakcji nieodwracalnych szlaku zachodzi w wyniku działania innych enzymów. 2 Wzajemne przemiany związków węgla W wielu szlakach poszczególne reakcje lub nawet ciągi reakcji mogą w zależności od warunków przebiegać w jednym z dwóch kierunków. w czasie replikacji chromosomu. Ponadto związki pośrednie (jak również produkty końcowe) mogą przechodzić z jednego szlaku do drugiego. Zasadniczo zachodzi to w wyniku przekształcenia substratu (gdy jest to konieczne) w związek pośredni glikolizy (rys. po którym następuje odwrócenie szlaku.wzrostu komórki: w syntezie dTMP i puryn (a tym samym syntezie DNA i RNA — rozdz. 3. które w ten sposób hamują funkcje zależne od THF. 3. wchodzącego w skład nukleotydów purynowych i pirymidynowych (sekcja 7. 5. 2). 6. gdyż synteza DNA wymaga wzmożonego wytwarzania rybulozo-5-fosforanu. W wielu przypadkach bakterie potrafią syntetyzować ogromną różnorodność cząsteczek z jednego źródła węgla. W szczepach niektórych bakterii można zahamować syntezę DHF (a tym samym i THF) za pomocą sulfonamidów (sekcja 15. to 6-fosfoglukonian. wykorzystywać związki pośrednie (a także produkty końcowe) w odwróconym szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa. jeśli to konieczne. 101 . Niektóre przykłady prostych szlaków biosyntetycznych przedstawiono na rysunku 6. E. Przedstawiamy tu tylko kilka krótkich przykładów wzajemnych przemian związków węgla. takich jak octan. 4. Gdy szlaki heksozomonofosforanowy i Entnera-Doudoroffa zachodzą w jednej komórce. Zwiększony metabolizm w pierwszym ze szlaków może być potrzebny np. Bakterie zdolne do glukoneogenezy (np. coli) mogą. kwasu dihydrofoliowego (DHF).

102 .

Następnie do UDP-MurNAc zostaje dodany łańcuch pięciu aminokwasów. 6. N10-metyleno-THF (patrz sekcja 6. a także różne składniki ściany i otoczek. z wytworzeniem dużej cząsteczki. L-asparaginianu (b) i L-seryny (c). często w formie łańcucha. Homopolimer powstaje. Biochemicy często podają wzór kwasu organicznego w formie niezjonizowanej. rys. 2). Potem. 6. 103 . tripeptydy są ponownie wykorzystywane do syntezy nowego peptydoglikanu (sekcja 5. gdy wszystkie małe cząsteczki są takie same. 3. nukleotyd Parka. koenzym N5. tj. coli N-acetyloglukozoamina i kwas N-acetylomuraminowy (rys. CH 3. Jednak. Glutamina spełnia to zadanie w syntezie L-tryptofanu. Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. Zwróć uwagę. 6). 3 Polimeryzacja związków węgla Polimeryzacja polega na chemicznym łączeniu małych cząsteczek. 7. że każda reakcja jest katalizowana przez swoisty enzym. zwanej polimerem. Niektóre antybiotyki hamują syntezę peptydoglikanu. który jest przenoszony (z uwolnieniem UDP) na długołańcuchową cząsteczkę lipofilową (baktoprenol) w błonie cytoplazmatycznej. wiążąc się z częścią pentapeptydową Rys. 1 i tab. W następnej reakcji. U bakterii w wyniku polimeryzacji są syntetyzowane pewne związki zapasowe. 2. 3. coli znacząca część peptydoglikanu jest rozkładana w czasie każdego pokolenia. Wreszcie podjednostki takie zostają przeniesione z błony cytoplazmatycznej do peryplazmy (z uwolnieniem baktoprenolu). 3 Niektóre proste szlaki biosyntetyczne — synteza aminokwasów: L-alaniny (a). Transglikozylacja i transpeptydacja zachodzą w wyniku aktywności enzymatycznej białek wiążących penicylinę (sekcja 2. Włączanie tego nowego peptydoglikanu do istniejącego już woreczka peptydoglikanowego zachodzi zgodnie z modelem 3-za-l (sekcja 3. białka i kwasy nukleinowe. 2. 1). 3. Peptydowe wiązania poprzeczne są tworzone w reakcjach transpeptydacji. jakby był solą — np. tworząc 2'-deoksyrybozę. Powstaje w ten sposób tzw. 1. 7. ale związek nazywają tak. w wyniku czego powstają łańcuchy glikanowe (rodzące się nici peptydoglikanu). CO. 1) dostarcza grupy metylowej (~CH3) w pozycji 5 uracylu (rys. 8). 1) działają na jej etapie końcowym. 6. (d) Urydyno-5'-fosforan (UMP) (w górnej części) został zsyntetyzowany w wyniku serii reakcji (nie pokazanych) z prostych cząsteczek prekursorowych — asparaginianu i karbamoilofosforanu. a heteropolimer — gdy są różne. ( N o t k a . UMP najpierw podlega reakcji w pozycji 2' — rybozy (patrz rys. U E. w wyniku działania wydajnego systemu odzysku. „Pi" to fosforan nieorganiczny. 2. 7) są syntetyzowane w cytoplazmie. a β-laktamy (patrz sekcja 15. 1 Synteza peptydoglikanu U E. ) W przykładach tych reakcja z udziałem glutaminianu wprowadza azot do cząsteczek prekursorowych nie zawierających tego pierwiastka. przekształcając w ten sposób uracyl w tyminę. Wankomycyna blokuje przenoszenie podjednostek z błony do cytoplazmy. w wyniku dodania UDP-GlcNAc (z uwolnieniem UDP). Tu są łączone w reakcji transglikozylacji. 3. 4. 4. powstaje podjednostka złożona z baktoprenolodisacharydopentapeptydu. w skrócie odpowiednio — UDP-GlcNAc i UDP-MurNAc. W następnym rozdziale są omówione dwa bardzo ważne (hetero)polimery.6. 3). 3. COOH = pirogronian. jako oddzielne pochodne UDP (urydyno-5'-difosforan).

104 należące do rodzaju Hyphomicrobium. Zwykle PHB (rys. Formaldehyd wytwarzany w czasie metabolizmu metylotrofów jest przyswajany w szlaku rybulozomonofosforanowym (szlak RuMP. Methylococcus. syntetaza PHB. przypisywanego Clostridium difficile. 11). będącego produktem metabolizmu metylotroficznego. Enzym polimeryzujący. Niektóre bakterie metylotroficzne mogą wykorzystywać grupy metylowe odłączone od pewnych większych cząsteczek. 2. Bakterie wykorzystujące tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii (karboksydobakterie — sekcja 6. Teikoplanina jest strukturalnie i funkcjonalnie podobna do wankomycyny. 1. Rokrocznie wytwarzano tysiące ton produktu o nazwie „Pruteen". W dalszych reakcjach dochodzi do regeneracji glicyny. ale zostały z nich wyłączone. 6. a 2-fosfoglicerynian bierze udział w biosyntezie. tworząc heksulozo-6-fosforan. 6. Synteza PHB została opisana w artykule przeglądowym o wytwarzaniu polihydroksykwasów [Poirier. Do metylotrofów (organizmów zdolnych do metylotrofii) zalicza się gatunki lus. Ten złożony antybiotyk glikopeptydowy jest bakteriobójczy dla różnych bakterii gramdodatnich. 3. 4. Następujące po tym reakcje regenerują cząsteczkę akceptora (RuMP) i dostarczają pirogronianu do biosyntezy. ale jest bardziej aktywna w stosunku do enterokoków. który charakteryzuje się: 1) wykorzystywaniem (względnym lub bezwzględnym) pewnych związków jednowęglowych (zwanych związkami C1) jako źródeł węgla i energii oraz 2) przyswajaniem formaldehydu. Oba są szlakami cyklicznymi. Z klinicznego punktu widzenia jest bardzo pożyteczny w leczeniu np. Bezwzględny metylotrof Methylophilus methylotrophus był kiedyś hodowany (na metanolu) na skalę przemysłową i wykorzystywany w żywieniu zwierząt. ribulose monophosphate pathway) lub szlaku serynowym. W pierwszym formaldehyd łączy się z rybulozomonofosforanem. Są one degradowane.baktoprenolodisacharydopentapeptydu. natomiast nie wnika do wnętrza bakterii gramujemnych. występuje na powierzchni granul. 3. Methylomonas i Methylophi- . Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150]. Stosuje się go też w przypadku rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy. tworząc serynę. 3) były niegdyś zaliczane do metylotrofów. gdy warunki wracają do normy. dopóki cena białka spożywczego nie spadła na tyle. 2 Synteza poli-β-hydroksymaślanu Kiedy zaczyna brakować niewęglowych składników odżywczych. przeciw szczepom MRSA (sekcja 15. PHB służy więc jako zapas węgla i/lub energii. metyloamina i metan. gdyż nie wytwarzają/przyswajają formaldehydu. W drugim szlaku formaldehyd łączy się z glicyną. że stało się to nieopłacalne. jako głównego źródła węgla. 4 Metylotrofia u bakterii Metylotrofia jest rodzajem metabolizmu tlenowego. ang. Związki C1 wykorzystywane w metylotrofii to metanol. wiele bakterii tworzy wewnątrzkomórkowe granule poli-β-hydroksymaślanu (PHB). 3) jest syntetyzowany z acetylo-CoA poprzez acetoacetylo-CoA i hydroksybutyrylo-CoA.

Dalsze utlenianie prowadzi do powstania formaldehydu. Można więc powiedzieć. z dostarczeniem energii. Wykorzystują one tlen (O2) i enzym monooksygenazę metanową (MMO. Bakterie metanotroficzne. występują np. . Utlenianie metanu przez metanotrofy w znaczący sposób wpływa na globalny bilans metanu. które są zdolne do wykorzystania metanu jako jedynego źródła węgla i energii. a część jest utleniana do dwutlenku węgla. którego część jest przyswajana dzięki szlakowi RuMP lub serynowemu. Ekologię gatunków metanotroficznych ostatnio badano metodami molekularnymi [Murrell i wsp. przy czym na ogół akceptorem elektronów jest NAD lub NADP. methane monooxygenase) do utleniania metanu do metanolu i wody. że metanotrofy mają swój udział w zapobieganiu globalnemu ociepleniu. Dzięki nim znacznie mniej tego gazu trafia do atmosfery. wodzie i osadach. Większość z nich to bezwzględne metanotrofy. do których zalicza się gatunki należące do Methylococcus i Methylomonas. ang. (1998) FEMSME 27: 1-3-114].Bakteriami metanotroficznymi [artykuł przeglądowy: Hanson i Hanson (1996) MR 60: 439-471] nazywamy takie metylotrofy. w glebie.

obie te funkcje są tematem badań biologii molekularnej. jak i zachowania się bakterii. DNA decyduje o życiu komórki dzięki kodowaniu wszystkich enzymów (w tym kontrolujących strukturę i metabolizm) i różnych cząsteczek RNA (zaangażowanych w syntezę białka i niektóre funkcje kontrolne).ROZDZIAŁ 7 Biologia molekularna I . Wynika stąd. Co więcej. Informacja zawarta w DNA reguluje oraz koordynuje wzrost i różnicowanie. Jak wiadomo. ang. DNA kontroluje własną replikację. 2. (1997) Science 277: 1453-1474]. DNA w trakcie replikacji powiela się zazwyczaj bardzo dokładnie. (1997) Nature 388: 106 . Cała informacja przekazywana jest do komórek potomnych podczas replikacji DNA i podziału komórki rodzicielskiej (sekcja 3. DNA i pokrewny polimer. kwas rybonukleinowy (RNA. Informacja jest zakodowana w sekwencji części składowych tych polimerów (tj. dla niektórych gatunków znana jest obecnie całkowita sekwencja nukleotydów w chromosomie — np. jak również jest przykładem systemu zdolnego do samokontroli — znane są różne mechanizmy wykrywające i reperujące zniszczony lub zmieniony DNA. Chromosomowy DNA niesie całą informację niezbędną do określenia zarówno struktury. Borrelia burgdorferi i gatunki Streptomyces) DNA jest liniowy. Przyczyna tego nie jest znana. Helicobacter pylori [Tomb i wsp. Skłonność komórek potomnych do dziedziczenia cech rodzicielskich — dziedziczność — jest głównym zainteresowaniem genetyki. ribonucleic acid). deoxyribonucleic acid). które mogą być nośnikami informacji. Escherichia coli [Blattner i wsp. informacja niesiona przez DNA jest zakodowana w sekwencji nukleotydów. W większości bakterii długa cząsteczka DNA tworzy zamkniętą pętlę. należą do grupy cząsteczek (kwasów nukleinowych). że kwas nukleinowy określa „normalne" życie komórki i dziedziczność.geny i ich wyrażanie się 7. 2. ang. czterech różnych nukleotydów). tak że cechy charakterystyczne dla gatunku nie zmieniają się w następnych generacjach. 1). w innych (np. 1) składa się głównie z polimeru zwanego kwasem deoksyrybonukleinowym (DNA. 1 Chromosomy i plazmidy Chromosom (sekcja 2.

3). (Pozostałe funkcje związane z obecnością plazmidów będą wspomniane w innym miejscu książki. 5) — są jednak w innych bakteriach z tej samej klasy (u tych. resistance plasmids) sprawiają. Plazmidy mogą kodować różne funkcje. zasadę azotową i grupę fosforanową (rys. Plazmidy są zwykle nieobecne w niektórych bezwzględnych patogenach z podklasy alfa Proteobacteria (rys. również nazywamy „plazmidami". Bartonella. plazmidy R (plazmidy opornościowe. ale mają zdolność do replikacji. 2). (1998) Nature 393: 537-544]. 1). 7. 2). (1997) Nature 390: 580-586] i Mycobacterium tuberculosis [Cole i wsp. Chlamydia zawierają plazmidy [Thomas i wsp. 4) umożliwiający pobranie cytrynianu. że gatunki Anaplasma. Zasada azotowa w każdym z nukleotydów jest albo pochodną puryny. 2. które nie integrują się z chromosomem gospodarza. Nukleotydy zawierające cukier D-rybozę — rybonukleotydy tworzą kwas rybonukleinowy (RNA). Niektóre kodują enzymy. natomiast nukleotydy zawierające 2'-deoksy-D-rybozę to deoksyrybonukleotydy tworzące kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) (rys. 16. Te tzw. Plazmid „Cit" koduje system transportu (sekcja 5. 5) w niektórych szczepach Halobacterium. albo pirymidyny (rys. Brucella i Rickettsia stały się bezplazmidowe. ang. zazwyczaj znacznie mniejszy od chromosomu. na przykład. burgdorferi) zawierają plazmidy koliste i liniowe. ale niektóre z nich są liniowe [patrz np. Niektóre (nie wszystkie) plazmidy kodują zdolność do samoprzenoszenia się z jednej komórki do innej w procesie koniugacji (sekcja 8.struktura Kwas nukleinowy jest polimerem złożonym z podjednostek zwanych nukleotydami. Plazmidy są powszechnie stosowane w biologicznych technikach związanych z otrzymywaniem zrekombinowanego DNA (sekcja 8. coli zawierające ten plazmid mogą wykorzystywać cytrynian jako jedyne źródło węgla i energii. że komórka staje się oporna na dany antybiotyk. Pewne bakterie (np. są zamkniętą pętlą). 2 Kwasy nukleinowe . a nawet większość plazmidów jest „kolistych" (tzn. chociaż. Hinnebusch i Tilly (1993) MM 10: 917-922]. ) Mimo że plazmidy często kodują pożyteczne funkcje. Pewne plazmidy kodują elementy strukturalne — np. nie są zazwyczaj niezbędne dla komórki gospodarza. ponieważ ich względnie stałe (wewnątrzkomórkowe) środowisko nie wymaga genetycznej różnorodności niezbędnej dla gatunków żyjących w bardziej zmiennych środowiskach [Moreno (1998) FEMSMR 22: 255-275].539-547]. 7. 5). zdolności tej nie mają zwykłe szczepy „dzikiego typu" E. Szczepy E. Każdy nukleotyd ma trzy części: cząsteczkę cukru. wakuole gazowe (sekcja 2. inaktywujące poszczególne antybiotyki. Dużo. Borrelia burgdorferi [Fraser i wsp. 7. Plazmidem nazywamy „dodatkowy" fragment DNA. zdolny do niezależnej replikacji. 7. Wiele bakterii oprócz chromosomu zawiera jeden lub więcej plazmidów. Profagi (sekcja 9. Przypuszcza się. Rybonukleotyd może zawierać 107 . B. 4. 2). coli. Z tego powodu niewłaściwa jest definicja plazmidów jako „małych cząsteczek kolistego DNA" (spotykana w niektórych podręcznikach i publikacjach naukowych). (1997) Microbiology 143: 1847-1854]. których byt związany jest z roślinami lub u zdolnych do fotosyntezy).

guaninę cytozynę lub uracyl. 2'. itd. to znaczy. (Cyfry 1. 4). brak jest atomu tlenu w miejscach 2' i 3'. 7. Deoksyrybonukleotyd może zawierać adeninę. a druga 3' do 5'. nie pokazanych na schemacie. deoksyryboza nie ma atomu tlenu w pozycji 2'. ). Dideoksyrybonukleotydy znajdują zastosowanie np. Specyficzność tworzenia się par zasad oznacza. DNA zazwyczaj jest złożony z dwóch nici połączonych wiązaniami wodorowymi utworzonymi między zasadami azotowymi. Dwie nici w dupleksie mają przeciwną polarność. a zatem. a tymina w deoksyrybonukleotydach. uracyl natomiast występuje jedynie w rybonukleotydach. a guanina z cytozyną (rys. jedna nić ma polarność 5' do 3'. 6. 1 Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) Nukleotydy tworzą w DNA nierozgałęziony łańcuch. Cząsteczki te różnią się jedynie resztami cukru (rybozy). 7. Ta dwuniciowa struktura DNA nazywana jest dupleksem (rys. Tworzenie wiązań wodorowych między zasadami azotowymi jest wybiórcze: adenina tworzy parę z tyminą. w którym reszty cukier-zasada i reszty fosforanowe są połączone naprzemiennie (rys. 7. Zasadą może być adenina. 6). 108 . 2. 7. w sekwencjonowaniu DNA — sekcja 8. guanina lub cytozyna w każdej z dwóch cząsteczek. 7. 5. że każda zasada w parze ma swojego komplementarnego partnera. (W dideoksyrybonukleotydach. każda nić DNA w dupleksie jest komplementarna do drugiej nici. przyjmując kierunek od lewej do prawej (ryc. Nazwy różnych nukleotydów i odpowiadających im nukleozydów zebrane są w tabeli 7. cytozynę lub tyminę. 1. odnoszą się do pozycji atomu tlenu w cząsteczce rybozy).adeninę. 5). guaninę. 5). Cechą charakterystyczną nici jest jej polarność: wyróżniamy koniec 5' i 3'.

Tymina występuje tylko w DNA. guanina i cytozyna znajdują się zarówno w DNA. a uracyl tylko w RNA.Adenina i guanina są purynami zawierającymi podstawniki. W nukleotydzie (rys. 2) puryna w miejscu 9 połączona jest z cząsteczką cukru. 7. adenina. pirymidyna łączy się z cukrem w pozycji 1. inne zasady to pirymidyny. jak i RNA. 109 .

Długość (liniowego) DNA B. 4 miliona pz. 110 . 7). w której podaje się długość dupleksu. 7 miliona par zasad. pylori — 1 . (a) Cytozyna (na lewo) tworzy pary z guaniną (na prawo). Długość DNA chromosomu Escherichia coli wynosi około 4.Przypominający drabinę dupleks DNA tworzy helisę (rys. ponieważ każdy nukleotyd w jakiejkolwiek nici odpowiada połowie jednej pary zasad w dupleksie. Budowa takiej podwójnej helisy została przedstawiona przez Watsona i Cricka w 1950 roku. gdzie odległość między poszczególnymi skrętami wynosi około 10 par zasad (10 pz). burgdorfeiri wynosi tylko 900 000 pz. Linie kropkowane oznaczają wiązania wodorowe. (b) Tymina (na lewo) paruje się z adeniną (na prawo). Możliwe jest również określanie długości jako liczby par zasad w dupleksie. (Uwaga: W RNA (sekcja 7. 7 miliona pz. 5) adenina tworzy pary z uracylem). 7. tuberculosis 4. H. jest zazwyczaj liczba nukleotydów w jednej nici. M. Wartością.

ang. Stopień superzwinięcia regulują enzymy zwane topoizomerazami. Kolisty dupleks może istnieć w różnych formach. a przed ponownym połączeniem się końców jeden z nich uległ skręceniu. 111 . 4. która temu zapobiega. że może tu odgrywać rolę wpływ środowiska na wewnątrzkomórkowe stężenie ATP. drugi zaś nie. W Escherichia coli ogólny stopień superzwinięcia zależy od przeciwstawnego działania dwóch enzymów: topoizomerazy II (=gyrazy) prowadzącej do negatywnego superskręcenia i topoizomerazy I. Mechanizm tej zależności nie jest jeszcze znany. nie ma wolnych końców 5' i 3')· Taki DNA nazywamy kowalencyjnie zamkniętym kolistym DNA (cccDNA. Naturalnie występujący DNA jest zazwyczaj „niedostatecznie zwinięty" (tzn. a oś helisy staje się helikalna. ) Na superzwinięcie mają również wpływ czynniki środowiska regulujące stan energetyczny komórki. (Gyraza stanowi cel działania niektórych antybiotyków: sekcja 15. zależnie od kierunku skręcenia). 1. Zrelaksowana pętla DNA teoretycznie może leżeć w jednej płaszczyźnie jak gumowa wstążka na stole. wiadomo bowiem. covalently closed circular). Załóżmy jednak. że aktywność gyrazy zależy od stosunku ATP: ADP. negatywnie superzwinięty). 6. to znaczy cała helisa zwija się tworząc helisę! Mówimy.Dupleks DNA w większości bakteryjnych chromosomów tworzy zamkniętą pętlę (tzn. że pętla jest przecięta. że taka cząsteczka jest superzwinięta. 3. Taka sytuacja może prowadzić do zwiększenia lub zmniejszenia liczby skrętów helisy (i powstania helisy nadmiernie lub niedostatecznie skręconej. W celu usunięcia naprężeń cała cząsteczka skręca się. patrz również Ccd w sekcji 7. Normalny wzrost jest możliwy jedynie w ograniczonym przedziale superzwinięcia DNA. W takiej cząsteczce istnieje duże naprężenie powodujące skłonność do utworzenia skrętu umożliwiającego rozluźnienie naprężeń cząsteczki. choć przyjmuje się.

1). i wymaga wielu różnych białek. Synteza DNA (replikacja) jest procesem skomplikowanym. 2. guaninę. 4). 7. Bakteryjny RNA (w przeciwieństwie do DNA) jest zazwyczaj jednoniciowy. 7. ang. 2. Sugeruje się. [Control of bacterial supercoiling: Drlica (1992) MM 6: 425-433. 1. 1). single-strand binding). Cząsteczka ta może mieć znaczenie ewolucyjne. w którym łańcuchy będące szkieletem polimeru są zmodyfikowanymi polipeptydami (a więc nie są zbudowane z jednostek cukrowo-fosforanowych). 2. białek wiążących jednoniciowy DNA (białek SSB. W zdenaturowanym regionie jednoniciowy DNA może być stabilizowany przez przyłączenie tzw. ang. 7. 9. Rybonukleotydy zawierają przeważnie adeninę. Wiadomo jednak. ] 7. tak aby każda komórka potomna mogła otrzymać dokładną kopię (replikę) cząsteczki rodzicielskiej. Niżej przedstawiono jedynie zarys typowej replikacji chromosomu E. PNA może hybrydyzować. indukując miejscowe „topnienie" DNA (tj. Istnieją jednak regiony dwuniciowe powstałe w wyniku tworzenia się par między komplementarnymi zasadami obecnymi w różnych odcinkach tej samej cząsteczki RNA. z utworzeniem helikalnego dupleksu podobnego do DNA [Witting i wsp. 5. 2. sekwencja zasad w chromosomowym DNA koduje informację określającą strukturę komórki i jej zachowanie. coli podczas cyklu komórkowego. poza tym DNA musi być superzwinięty. Duża liczba cząsteczek białka DnaA (prawdopodobnie jako DnaA ATP) wiąże się do specyficznych miejsc (sekwencji wiążących DnaA) w obrębie sekwencji oriC.Topoizomerazy III i IV mogą razem z gyrazą odgrywać rolę w dekatenacji chromosomów (sekcja 3. Niektóre z funkcji pełnionych przez RNA omówiono skrótowo w sekcji 7. 1 PNA (peptydowy kwas nukleinowy. rozdzielenie nici DNA) w części przylegającej do oriC. Ważną rolę w powstaniu i aktywności takich struktur odgrywają zazwyczaj jony metali (szczególnie Mg+2). jednak mogą w nich również występować zmodyfikowane zasady. zwanym origin (oriC). (1994) Nature 368: 561-563]. 2 Kwas rybonukleinowy (RNA) RNA jest liniowym polimerem złożonym z rybonukleotydów (rys. że runda replikacji rozpoczyna się w określonym regionie dwuniciowej cząsteczki DNA. 15). 3 Replikacja DNA Jak wspomniano poprzednio. peptide nucleic acid) PNA jest analogiem DNA. Mimo że rozdzielenie nici jest 112 . cytozynę lub uracyl. Przed podziałem komórkowym DNA musi być precyzyjnie podwojony. że kwasy nukleinowe istniejące przed powstaniem życia niekoniecznie musiały mieć szkielet cukrowo-fosforanowy (patrz również sekcja 8. W ten sposób powstają struktury trójwymiarowe. Co jest sygnałem do rozpoczęcia (inicjacji) rundy replikacji DNA? Tego nie wiemy (patrz sekcja 3.

że transkrypcja (sekcja 7. Fis wiąże się z oriC w sposób zależny od cyklu komórkowego [Classer. W tym procesie dwie końcowe grupy fosforanowe są odcinane. Grimwade i Leonard (1995) EMBO Journal 14: 5833-5841] i wydaje się. 8b). 7. Po rozpoczęciu replikacji. polimeraza RNA (sekcja 7. następnie zachodzi enzymatyczna polimeryzacja rybonukleotydów (ich kowalencyjne połączenie) w kierunku 5' do 3'. 5) konieczna jest do inicjacji replikacji DNA.pierwszym ważnym zdarzeniem replikacyjnym. W jednej ze zdenaturowanych nici DNA. którą katalizuje enzym polimeraza DNA III. Inna teoria przyjmuje. 8a. Phuong i Zyskind (1996) JB 178: 6006-6012]. Crooke i Sharstad (1996) NAR 24: 3527-3532] oraz wywiera słaby wpływ na promotor dnaAp2. rozdziela dwie nici dupleksu (działając jak zamek błyskawiczny). czy polimerazy RNA. Nie wiadomo. Fis ma kilka miejsc wiązania w oriC. Nić oryginalna określa sekwencje zasad w nowej nici i dlatego nazywana jest nicią matrycową. Rzeczywiście. 7. ponieważ polimeraza DNA nie może rozpocząć syntezy nici — może jedynie wydłużyć nić już istniejącą. 1) i ATP rozwija DNA. że rozpoczyna się ona w części oriC zawierającej sekwencje wiążące DnaA. 113 . że nić wiodąca wraz z jedną z nici pierwotnego dupleksu stanowią początkową część nowego dupleksu. Nie wiadomo. oba te enzymy zdolne są do syntezy RNA. tworzą się dwa widełki replikacyjne. 8a. prowadząc do utworzenia krótkiej nici RNA — startera (rys. tworzy się początek tzw. zasady odsłonięte wskutek rozdziału nici tworzą pary z komplementarnymi zasadami w cząsteczkach trifosforanów rybonukleozydów. ma w tym udział wiązanie białka DnaA w tym i w sąsiednich miejscach. nowo odsłonięte zasady tworzą pary z cząsteczkami trifosforanów deoksyrybonukleotydów i w ten sposób starter zostaje wydłużony w kierunku 5' do 3' przez nową nić DNA. górna część). że bierze udział w tworzeniu kompleksu zapobiegającego replikacji [Wold. Wydaje się. replikacja z pewnością nie zaczyna się w tym zdenaturowanym regionie. 7. Białko DnaB zawarte w każdym prymosomie jest helikazą — enzymem. Nieznany jest mechanizm. Z każdymi widełkami połączony jest prymosom — kompleks białkowy złożony z DnaB i DnaG. według którego białko Fis reguluje inicjację replikacji DNA. Być może. a reakcja ta dostarcza energii koniecznej do polimeryzacji. Jednym z czynników istotnych dla inicjacji replikacji DNA jest białko Fis (produkt genu fis). w jaki sposób następuje rozdzielenie się nici dokładnie w miejscu początku replikacji. 7. znajdujących się niedaleko miejsc wiążących DnaA. 2. który w obecności gyrazy (sekcja 7. wskutek rozdzielenia się nici DNA. 8a. W ten sposób dwa widełki replikacyjne poruszają się w przeciwnych kierunkach oddalając się od oriC. czy polimeryzacja RNA zachodzi pod wpływem działania białka DnaG (prymazy). 5) powoduje przejściową denaturację dupleksu DNA we właściwym punkcie regionu oriC. jak również pełni rolę w regulacji zgrupowania genów (dnaA-dnaN-recF) [Froelich. górna część). Na skutek tej polimeryzacji. górna część). tj. Aktywność polimeryzacyjna polimerazy DNA III wymaga startera RNA. do których produktów należy białko DnaA i podjednostka β polimerazy DNA III (rys. nici wiodącej DNA (rys. W trakcie dalszego rozdziału nici. Startery tworzą jedną z nici krótkich hybrydowych dupleksów RNA/DNA (rys. Trzeba zauważyć.

że synteza DNA nie może zachodzić w kierunku 3' do 5'). 114 . Rozdział nici postępuje w kierunku od lewej do prawej (w pokazanej połowie). która jest syntetyzowana w kierunku 5' do 3'. (Wszystkie startery zostają później zastąpione przez DNA). Drugi starter jest tworzony i następny fragment jest syntetyzowany dopiero po dalszym rozdziale dupleksu. Schemat przedstawia tylko połowę rozdzielonego regionu. drugie widełki replikacyjne (nie pokazane na schemacie) przesuwają się na lewo. Na jednej z odsłoniętych nici (górnej na schemacie) syntetyzowany jest starter RNA (objaśnienie w tekście). Na drugiej nici (dolnej na schemacie) pierwszy starter RNA jest rozciągany przez fragment DNA (fragment Okazaki) również w kierunku 5' do 3' (wiadomo. późniejsze dodanie deoksyrybonukleotydów prowadzi do wytworzenia „wiodącej" nici DNA.(a) Kolisty dupleks DNA rozdziela się miejscowo na dwie nici. Region zaznaczony kółkiem (widełki replikacyjne) przesuwa się na prawo w trakcie replikacji.

białko DnaG (prymaza) syntetyzuje pierwszy starter RNA w pobliżu widełek replikacyjnych.W temperaturze 37°C widełki replikacyjne poruszają się z prędkością 1000 nukleotydów na sekundę. 115 . opóźnionej nici (rys. UK. 2. czy przechodzą dwie. W wyniku replikacji powstają dwa superzwinięte dupleksy DNA tworzące katenat (sekcja 3. wszystkie startery są zastąpione przez DNA. Dwa widełki replikacyjne poruszające się w przeciwnych kierunkach spotykają się w miejscu chromosomu ter położonym w odległości 180° od oriC. Cambridge MA 0002138. dolna część). Westa. single-strand binding proteins) zanim posłużą jako matryca do syntezy nici opóźnionej. Starter ten jest następnie wydłużany przez polimeryzację deoksyrybonukleotydów w kierunku 5' do 3'. Zważywszy jednak. (b) Schemat widełek replikacyjnych (skala nieprzestrzegana). 7. 1). Jak dotychczas. wiodącej i opóźnionej. a DNA może być syntetyzowany jedynie w kierunku 5' do 3'. oraz dużą szybkość syntezy DNA zapewnia: fizyczne połączenie między dwiema cząsteczkami polimerazy DNA i powiązanie między polimerazami a helikazą — utrata wzajemnych powiązań prowadzi do bardzo dużego obniżenia aktywności helikazy [Kim i wsp. Kiedy obszar zdenaturowany w dupleksie DNA osiągnie pewną długość. Rysunek (b) pochodzący z Cell (1996) 86: 177-180 mógł być zamieszczony dzięki uprzejmości dr. Stephena C. że helikaza (rozwijająca dupleks) jest heksamerem (ma strukturę pierścienia złożoną z sześciu cząsteczek białka DnaB) [West (1996) Cell 86: 177-180]. nasze rozważania dotyczyły tylko tej nici dupleksu. Każdy fragment Okazaki ma długość około 2000 zasad (2 tys. Na rysunku pokazano. Zanim replikacja zostanie zakończona. Replikacja jest semikonserwatywna. za pozwoleniem Cell Press. że dwie nici dupleksu mają przeciwną polarność. Dwie cząsteczki polimerazy (jedna syntetyzująca nić ciągłą. że obie nici dupleksu przechodzą przez pierścień helikazy. połączenie aktywności z przesuwaniem się polimerazy. 8(b). USA. zasad). czy tylko jedna nić. ang. Należy zauważyć. kierunek syntezy DNA na tej nici matrycowej jest przeciwny do kierunku syntezy na drugiej nici (rys. ponieważ każdy dupleks DNA składa się z jednej nici pochodzącej z poprzedniego (rodzicielskiego) dupleksu i z jednej nowej (potomnej) nici. Imperial Cancer Research Fund. Pokazano również połączenia polimeraza-helikaza (helikaza jest heksamerem złożonym z sześciu cząsteczek białka DnaB). tj. Jednoniciowy DNA chroniony jest przez białka wiążące jednoniciowy DNA (SSBs. dolna część). nowa nić DNA (nić „opóźniona") jest syntetyzowana jako zbiór krótkich fragmentów (fragmentów Okazaki) w sposób opisany niżej. co prowadzi do utworzenia pierwszego fragmentu nowej. Jeden ze schematów widełek replikacyjnych pokazany jest na rysunku 7. 7. która służyła jako matryca nici wiodącej. Koordynację syntezy dwóch nici. w rzeczywistości nie wiadomo. następnie drugi fragment jest syntetyzowany. (1996) Cell 84: 643-650]. i tak dalej. Zacisk β (β jest podjednostką polimerazy DNA. A co z drugą nicią? Ona również jest matrycą. 8a. Rzeczywiście. 8a. a druga nic opóźnioną) pracują w przeciwnych kierunkach i są połączone ze sobą podjednostkami r. Podczas dalszego rozdziału nici tworzony jest drugi starter. produktem genu dnaN) wpływa na procesywność.

Polimeraza tworzy kowalencyjne wiązanie między dAMP (tab. że synteza DNA odbywa się zawsze w kierunku 5' do 3' (rys. że istnieją inne sposoby replikacji. Nawet w E. ponieważ ich usuwanie prowadziłoby do powstania jednoniciowych odcinków DNA na końcach dupleksu. 8). stabilna replikacja DNA (iSDR. która zaczyna się w innym origin (oriMs) i nie zależy od białka DnaA [Asai i Kogoma (1994) JB 176: 1807-1812]. 8). W zakażonej komórce replikacja DNA fagowego rozpoczyna się w dwóch końcach dupleksu. poczynając od tego początkowego nukleotydu. 2. Mechanizm toczącego się koła jest spotykany w replikacji niektórych fagów. po zaindukowaniu systemu SOS. Należy jednak podkreślić. ang. Replikacyjny starter (TP) i polimeraza rozdzielają się po spolimeryzowaniu dziesięciu nukleotydów. Na przykład. 7. jednak do syntezy każdego białka kodowanego przez plazmid i związanego z jego replikacją potrzebny jest aparat biosyntetyczny komórki. Inny model zakłada. ang. w komórkach zachodzi indukowana. Przy założeniu. dlaczego po replikacji nie zostają jednoniciowe końce 3'matrycowej nici? Istnieje kilka modeli wyjaśniających możliwość replikacji tych końców [patrz Chen (1996) TIG 12: 192-196]. a polimeraza nadal wydłuża krótki starter DNA. że nowa nić znajdująca się w tworzącym dupleks końcu cząsteczki usuwa 5'-końcową sekwencję nukleotydów matrycy. np. 3. Pewne bakterie mają liniowe chromosomy (i liniowe plazmidy). inducible. 1) zbudowanym z liniowego dsDNA znajduje się białko kowalencyjnie związane z każdym z końców 5' dupleksu (TP. białko TP zostaje kowalencyjnie związane z końcem 5' nowej nici. replikacja chromosomu może zachodzić według innego mechanizmu. których replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi z origin położonego wewnątrz cząsteczki DNA. Kodowana przez faga polimeraza DNA wiąże się z wolną cząsteczką kodowanego przez faga białka TP. Blanco i Salas (1997) EMBO Journal 16: 2519-2527]. 3. Replikacja opisana w poprzedniej sekcji jest typową replikacją chromosomu E. 7. która jest następnie przenoszona na (komplementarny) jednoniciowy DNA znajdujący się na drugim. λ (rys. że koniec 3' nici matrycowej owija się wokół siebie i tworzy strukturę dwuniciową wyznaczającą miejsce startu replikacji. [Protein priming of DNA replication in phage : Mendez. coli. a następnie kompleks ten zostaje umiejscowiony na końcu 3' każdej nici. powstaje pytanie.Inne sposoby replikacji DNA. W genomie faga (tab. coli. 9. 2). potomnym dupleksie (w ten sposób wypełniona jest jednoniciowa luka). 9. Genomy te nie mogą być replikowane z użyciem starterów zbudowanych z RNA (jak na rys. stable DNA replication). Taka inicjacja z udziałem białka jest tylko jedną ze strategii spotykanych w replikacji genomów liniowych. 1 Replikacja DNA plazmidowego Plazmidy kontrolują własną replikację. Dwa z nich sugerują. w pewnych warunkach. terminal protein). 2) i ΦΧ174 oraz różnych plazmidów (sekcja 7. 116 . w czym prawdopodobnie bierze udział jego wzajemne oddziaływanie z TP związanym w przyległym końcu 5'. M13 (sekcja 9. co pozwala na rozpoczęcie syntezy nici DNA w kierunku 5' do 3'. 1) a związanym z DNA białkiem TP. 1). 7. 7.

dimery wiążą się do promotorów własnych genów (hamując w ten sposób replikację).Szybkość replikacji zależy od szybkości jej inicjacji. który inicjuje replikację. które mogą wiązać się z iteronami. W kilku przypadkach (również w plazmidzie F) wykazano. czy cząsteczki kontrolne są syntetyzowane ciągle czy okresowo. kodowane przez plazmidy. 8. Wzrost ilości białka Rep powoduje zwiększenie replikacji. Zrozumienie zasad kontroli replikacji danego plazmidu wymaga informacji. korzystając ze startera RNA. 5). ctRNA — ang. Replikacja rozpoczyna się przecięciem określonej nici w miejscu origin przez białko Rep kodowane przez plazmid. Ogólnie. 1). 8). [Replication control in rolling circle plasmids: Rasooly i Rasooly (1997) TIM 5: 440-446]. co umożliwia replikację. Model postuluje. W niektórych plazmidach. w ten sposób tworzy się koniec 3' niezbędny do syntezy DNA. Jedna z nich (RNA II) może wiązać się z plazmidowym origin i pełnić rolę startera. Inny mechanizm zakłada. W plazmidzie ColEl. która następnie replikuje się do formy dsDNA. 7. Rozpoczęta replikacja plazmidu ColEl przypomina replikację chromosomu (patrz wyżej). a więc replikacja może być kontrolowana przez regulację syntezy i/albo aktywności Rep. prowadząc do utworzenia kompleksu nukleoproteinowego. W wielu plazmidach bakterii gramujemnych białko inicjacyjne Rep wiąże się do „prostych powtórzeń" sekwencji nukleotydowej (iteronów) w regionie origin replikacji plazmidu. chociaż przebiega w jednym kierunku od miejsca origin. że podczas gdy monomery Rep wiążą się z iteronami (pobudzając replikację). przez związanie krótkiego oligonukleotydy kodowanego przez plazmid. rozmieszczenie i skład. countertranscript RNA) wiążą się z rep mRNA i prowadzą do przedwczesnej terminacji transkryptu bądź do zahamowania translacji genu rep. W niektórych wypadkach małe. Istnieją różne sposoby kontroli inicjacji. replikacja plazmidów (i ich rozdział do komórek po117 . a to stanowi strukturalną podstawę aktywacji inicjacyjnych białek Rep [Giraldo. na przykład. kontrola jest związana z syntezą dwóch wolnych (nie połączonych ze sobą) nici RNA kodowanego przez plazmid. 6. A więc w plazmidzie ColEl inicjacja jest kontrolowana na poziomie startera (patrz również sekcja 7. Inna nić (RNA I) może temu przeszkadzać przez tworzenie par zasad z RNA II. że białko Rep jest inaktywowane już po jednorazowym wykorzystaniu. W plazmidzie tym iterony mają określoną liczbę. Rep może również hamować własną transkrypcję przez związanie się do odwróconych powtórzeń sekwencji. rys. ta zaś jest kontrolowana w różny sposób przez różne plazmidy. że dysocjacja dimerów prowadzi do powstania monomerów. Wiele małych plazmidów bakterii gramdodatnich (jak również niektóre plazmidy bakterii gramujemnych) replikują się według mechanizmu toczącego się koła (rys. Podczas jednej rundy replikacyjnej powstaje jeden komplementarny plazmid dsDNA i jego kolista kopia ssDŃA. Wynik oddziaływań RNA I-RNAII decyduje o zajściu replikacji. Andren i Diaz-Orejas (1998) EMBO Journal 17: 4511-4526]. które zachodzą na promotor. cząsteczki RNA (transkrypt syntetyzowany z komplementarnej nici. jak ich synteza/aktywność są regulowane i jakie inne czynniki/cząsteczki biorą udział w tym procesie. RepE (białko E) pełni tę funkcję w plazmidzie F (którego replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi według mechanizmu „typu Cairnsa". Badania inicjacyjnego białka RepA plazmidu pSC10 Pseudomonas zasugerowały model aktywacji tego typu białek Rep.

ColEl) mogą się replikować w tych warunkach i osiągnąć liczbę kopii znacznie przewyższającą ich liczbę naturalną. W ten sposób każdy szczep ma swoje. Niektóre plazmidy mają własne mechanizmy zapewniające ich stabilne utrzymywanie się w komórkach. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA U wielu (może wszystkich) bakterii po replikacji DNA następuje modyfikacja DNA. Replikacja takich plazmidów jest pod kontrolą zrelaksowaną. W jakim celu DNA jest metylowany? Metylacja chroni DNA komórki przed własnymi endonukleazami restrykcyjnymi (REs. Modyfikacja zachodzi za pośrednictwem specjalnych enzymów. 1. że replikacja takich plazmidów jest pod ścisłą kontrolą. 7. (Na liczbę kopii plazmidu mają wpływ mutacje — patrz np. chloramfenikol). jeśli do komórki gospodarza dodamy antybiotyk (np. ] 7. 1). właściwe dla niego metylazy i restryktazy. Mówi się. W sekwencjach tych grupa metylowa (-CH3) dodawana jest w pozycji N-6 adeniny i/lub w pozycji C-5 cytozyny (pozycje pokazane są na rys. który nie jest metylowany we właściwej sekwencji nukleotydów. ] W bakteriach liczba cząsteczek określonego plazmidu przypadająca na chromosom nazywana jest liczbą kopii. która jest neutralizowana przez CcdA stanowiące antidotum. F lub R6) mają liczbę kopii 1-2. metylotransferaz (= „metylaz"). Bahassi i van Melderena (1998) TIM 6: 269-275.tomnych podczas podziału komórkowego) zależą prawdopodobnie od pewnych powiązań między plazmidem a błoną cytoplazmatyczną [Firshein i Kim (1997) MM 23: 1-10. W związku z tym. dla których źródłem grup metylowych jest np. ang. CcdB hamuje bakteryjną gyrazę (sekcja 7. sekcja 7. Dupleks DNA nie jest cięty. 2. 1 Ścisła i zrelaksowana kontrola replikacji plazmidów Niektóre plazmidy (np. jeśli choć jedna nić jest metylowaną. Toksyna jest trwała. 6. Polega ona na modyfikacji niektórych zasad w określonych sekwencjach nukleotydów. Więcej informacji o operonie ccd można znaleźć w pracy Couturier. ale antidotum ulega stopniowemu rozkładowi przez proteazę Lon gospodarza. U różnych szczepów bakterii są metylowane inne sekwencje nukleotydów. S-adenozylometionina. Na przykład. CcdB i CcdA. plazmid F koduje dwa białka. dla innych plazmidów („wielokopiowych". Bezpośrednio po replikacji nowo syntetyzowana (niemetylowana) nić potomna jest zazwyczaj chroniona przed restrykcją przez (metylowaną) nić matrycową aż do momentu jej własnej metylacji. plazmid F) nie replikują się. takich jak ColEl lub R6K) liczba ta wynosi 10-30. 3. 7. po podziale komórkowym. szczepu bakteryjnego i warunków wzrostu. w każdej z nowo syntetyzowanych nici. Inne plazmidy (np. Białko CcdB jest toksyną (powodującą śmierć komórki). 118 . który hamuje syntezę białka. Niektóre plazmidy (np. 1. 3). każda komórka bez plazmidu F będzie zabita. ) Liczba kopii zależy od systemu kontroli replikacji plazmidu. restriction endonucleases) — enzymami przecinającymi każdy DNA.

W ten sposób zostaje wycięty mały kawałek DNA zawierający sekwencję rozpoznawaną. Enzymy te przecinają DNA z przesunięciem względem sekwencji rozpoznawanej w dwóch miejscach otaczających tę sekwencję. (Potrzeba związania się w dwóch miejscach przypomina wymagania enzymów koniecznych do rekombinacji zlokalizowanej — sekcja 8. ) Wiele szczepów bakteryjnych ma więcej niż jeden typ metylaz i restryktaz. co znaczy. że każdy z końców przeciętego dupleksu ma region jednoniciowy (w tym wypadku 5'-AATT) (patrz rys. Do swojej aktywności enzymy te wymagają Mg +2 i S-adenozylometioniny. 8. natomiast typ II restryktaz przecina między określonymi parami zasad w obrębie rozpoznawanej sekwencji. restryktazy należące do typu I przecinają DNA w miejscach przypadkowych. 1. 2. które niekoniecznie muszą się znajdować w jednej cząsteczce DNA. Inne przykłady restryktaz są podane w tabeli 8. „I" oznacza określony (z kilku istniejących) enzym ze szczepu R. Większość restryktaz może być zaklasyfikowana do typu I. 8. 2. szczep R. „Antyrestrykcja" ważna jest również w procesie koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. nazywa się sekwencją rozpoznawaną. Na przykład. ) 119 . Co więcej. Jaki jest cel restrykcji? Główna jej rola polega na ochronie komórki przed „obcym". antyrestrykcyjne białka (białka chroniące przed restrykcją) są kodowane przez niektóre plazmidy [Belogurov. [(1996) NAR 24: 3590-3592] — Bael (z Bacillus sphaericus). Delver i Rodzevich (1992) JB 174: 5079-5085]. 8. II lub III na podstawie wzajemnych relacji między sekwencją rozpoznawaną a miejscem cięcia. 11. Na przykład.z których każda rozpoznaje określoną sekwencję nukleotydów. którą rozpoznaje dana metylaza. szczególne fagowym DNA wchodzącym do komórki [artykuł przeglądowy o restrykcji: Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. (Patrz również metylacja Dam: sekcja 7. Mechanizm ten czasami zawodzi w ochronie przeciwko fagom: patrz sekcja 9. 6. 2. że w przytoczonym przykładzie nić komplementarna jest cięta następująco: 3'-CTTAA |G-5'. coli metylaza EcoRI metyluje wybiórczo resztę adeniny CH 3 5'-GAATTC-3' podczas. Nowy enzym należący do tej rodziny został opisany przez Searsa i wsp. którego wzory cięcia przedstawiono na rysunku 8. 3). gdy restryktaza EcoRI przecina (niemetylowaną) nić w pozycji: 5'-G|AATTC-3' gdzie „ |" oznacza cięcie. 4. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych obrazuje następujący przykład. 11). Wynikiem jest przesunięte cięcie. Niektóre restryktazy działają dopiero po jednoczesnym związaniu się do dwóch sekwencji rozpoznawanych. Mogą one chronić komórki biorcy przed restrykcją podczas procesu koniugacji. w E. Stosunkowo niedawno odkryto nowy typ enzymów restrykcyjnych. oddalonych od sekwencji rozpoznawanych. Sekwencja. Warto zauważyć. EcoRI: enzym z Escherichia coli. „Nietypowe" sposoby restrykcji.

którego pozycja określana jest jako +1. który jest nośnikiem aminokwasów i umożliwia ich polimeryzację w sposób określony przez RNA (sekcja 7. itp. ang. Cząsteczka antysensownego RNA może np. małych organelli. 3.. Inne typy cząsteczek RNA pełnią specyficzne funkcje kontrolne. „przed" transkryptem.1 . messenger RNA). transfer RNA). -3 itp. ang. ). lecz nie z tyminą. 1. Typ II restryktaz (wymagających Mg+2. trifosforany nukleozydów tworzą pary z nicią matrycową. tj. Synteza białka komórkowego wymaga uprzedniego kopiowania genu. RNA jest kopiowany z DNA na drodze kolejnego tworzenia się par zasad między pojedynczymi rybonukleotydami a odsłoniętymi zasadami na jednoniciowej matrycy DNA. ponieważ jest ona nośnikiem informacji zapisanej w genie. na których są syntetyzowane białka. tzn. Polimeryzację rybonukleotydów przeprowadza enzym. Do syntezy białek są również konieczne inne rodzaje RNA. -2. Transkrypcja genu wymaga. czyli pierwszy nukleotyd rozpoczynający transkrypcję. a więc jest restryktazą zależną od metylacji (w przeciwieństwie do enzymów opisanych wyżej). hamować aktywność innych cząsteczek kwasu nukleinowego po przyłączeniu się do swojej komplementarnej sekwencji (patrz np. DpnI przecina sekwencję 5'-GATC-3' między A i Τ tylko wtedy. jeśli adenina jest metylowana. (Nukleotydy leżące w przeciwnym kierunku. 6). którym jest jednoniciowy RNA — transkryptem. 2. 1). W komórce mogą się znajdować różne typy (klasy) promotorów dla różnych genów. ale nie ATP) znajduje powszechne zastosowanie w przecinaniu DNA w określonych miejscach (sekcja 8. 7. które są ważne dla oddziaływań 120 .Restryktaza DpnI ze Streptococcus (nieprawidłowa nazwa Diplococcus) pneumoniae jest przykładem enzymu przecinającego jedynie miejsce zmetylowane. Transkrypcja genu. na jednoniciowy RNA. aby polimeraza związała się ze specyficzną sekwencją nukleotydów.. 5. zaś produkt.transkrypcja W komórce funkcje kodowane przez DNA są przenoszone na różne typy cząsteczek RNA kopiowanych (transkrybowanych) z DNA. Synteza RNA na matrycy DNA nazywa się transkrypcją. Rybonukleotydy są polimeryzowane w kierunku 5'do 3'. 3). promotorem. Nukleotydy leżące „za" nim są numerowane +2. Rybosomowy RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów (sekcja 2. numerowane są . W syntezie białka bierze również udział transportujący RNA (tRNA. polimeraza RNA. 3). Podczas polimeryzacji adenina tworzy parę z uracylem. Restrykcja i modyfikacja w technologii rekombinowanego DNA. Podobnie jak w syntezie DNA. +3. a dwie końcowe grupy fosforanowe zostają odcięte w reakcji dostarczającej energii do polimeryzacji. 5 Synteza RNA . Zazwyczaj w obrębie tej sekwencji znajduje się miejsce startu. Miejsce +1 jest wygodnym punktem odniesienia do określenia pewnych regionów w sekwencji promotora. RNA I w sekcji 7. w dwuniciowym DNA na początku genu. sekwencji kodującej to białko. Powstałą nić nazywamy informacyjnym RNA (mRNA. różnice w sekwencji promotorów obserwuje się nawet w obrębie tej samej klasy.

wielkości 46-kDa każda) może zakończyć transkrypcję po rozpoznaniu określonego miejsca na transkrypcie. który pozwala na rozpoczęcie transkrypcji. ) do promotora. Szczegółowe informacje na temat oddziaływań polimeraza-promotor są zawarte w pracy: de Haseth. tym „silniejszy" jest promotor. Przedstawiono tu jedynie skrót dość skomplikowanego ciągu zdarzeń. W E. gdy istnieje potrzeba transkrypcji genów określonej klasy (patrz sekcja 7. Transkrypcja zatrzymuje się w określonej sekwencji nukleotydów (w miejscu terminującym. Wkrótce potem czynnik sigma odłącza się. występujących w naturze sekwencji tego typu. Podczas tzw. itp. 121 . nici DNA rozdzielają się w regionie startu. ). że im mniej różnią się heksamery -10 i -35 od swoich sekwencji consensus. Następne trifosforany rybonukleozydów tworzą pary (w pozycjach +2.z polimerazą RNA. co dostarcza energii do utworzenia wiązania fosfodiestrowego. Eσ32. której środek znajduje się w lub blisko nukleotydu -10. 8. czyli terminatorze) na nici matrycowej. Zupanic i Record [(1998) JB 180: 3265-3275]. a dupleks DNA zostaje odtworzony. (Sekwencja consensus jest teoretyczną „typową" sekwencją nukleotydów. natomiast rola polimerazy RNA w elongacji omówiona jest w artykule Mooney. „kompleks otwarty". Elongacja to proces obejmujący postępujące rozwijanie się dupleksu i kolejne dodawanie rybonukleotydów do wydłużającego się końca RNA. powstała struktura drugorzędowa może prowadzić do odłączenia się transkryptu i/lub polimerazy. Artisimovitch i Landick [(1998) JB 180: 3265-3275]. Przed przyłączeniem się do promotora polimeraza RNA musi wcześniej związać inne białko zwane czynnikiem sigma. itp. Pierwszy trifosforan rybonukleozydu tworzy parę z odsłoniętym deoksyrybonukleotydem „+1". W rho-zależnych terminatorach czynnik rho (w E. Można przyjąć. coli jest on helikazą złożoną z sześciu podjednostek. 9). często oznaczony jako Εσ70. ang. coli polimeraza RNA z czynnikiem σ70 może rozpocząć transkrypcję w większości promotorów komórkowych. w której każdy nukleotyd występuje w danym miejscu częściej niż trzy inne. które umożliwiają polimerazie wiązanie się z promotorami różnych klas. Nić RNA wydłuża się w trakcie polimeryzacji większej ilości rybonukleotydów. upstream element) między nukleotydami -40 a -60. Została opracowana przez analizę różnych. coli są to regiony: 1) sześcionukleotydowa sekwencja najwyższej zgodności (consensus) TATAAT. Komórka koduje więcej niż jeden typ czynników sigma. Niektóre z czynników σ są syntetyzowane tylko wówczas. rho-niezależnej terminacji w części transkryptu regionu terminatora tworzą się wewnętrzne pary zasad. W najczęściej występującym typie promotorów E. tworząc tzw. 3) odcinek oddzielający te sekwencje i 4) bogate w pary AT miejsce poprzedzające te regiony (element UP. Nić RNA odłącza się od matrycy. a zatem bardziej aktywny lub funkcjonalny jest gen. +3. 2) druga sekwencja consensus TTGACA ze środkiem w lub blisko nukleotydu -35. Po związaniu holoenzymu polimerazy RNA (= polimeraza RNA + czynnik σ. a polimeraza RNA kontynuuje syntezę pozostałej części nici. a każdy z nich jest cięty do monofosforanu.

5). (Wiązanie wymaga ATP). W badaniach wzajemnych oddziaływań białko — DNA użyteczne są techniki hybrydyzacji „Southwestern" i badanie „odcisku stopy" (ang. bliżej lub dalej od promotora. są zależne od rodzaju. Białko jest złożone z jednego lub kilku polipeptydów. co prowadzi do powstania aminoacylo-tRNA. Każdy polipeptyd jest zwinięty w trójwymiarową strukturę. Strukturę tę stabilizują wiązania wodorowe lub wiązania disulfidowe utworzone między aminokwasami leżącymi w różnych częściach łańcucha. Ta sekwencja zasad odpowiada jednej z definicji genu. Na przykład.inne czynniki W sekcji 7. Określone. Każda cząsteczka tRNA zawiera miejsce wiążące aminokwas i sekwencję złożoną z trzech zasad (antykodon) komplementarną do kodonu dla danego aminokwasu. Wpływ tych białek na transkrypcję może być pozytywny lub negatywny. trójwymiarowe struktury polipeptydu. W jaki sposób gen „rządzi" syntezą polipeptydu? Inaczej. Dla każdego polipeptydu. W istocie. 5 przedstawiono uproszczony obraz transkrypcji. nazywany jest informacyjnym RNA (mRNA). 1 Regulacja transkrypcji . który niesie informację zakodowaną w DNA. synteza białka obejmuje kilka etapów. footprinting) (sekcja 8. Przykładem białek wiążących DNA jest białko represora (regulatora) operonu lac (rys. 7. W ten sposób kolejność kodonów w mRNA koduje sekwencję aminokwasów w polipeptydzie. 6 Synteza białka Wszystkie białka komórkowe są kodowane przez DNA. 7. każda taka trójka nazywa się kodonem. Dana cząsteczka tRNA może więc związać określony aminokwas i przyłączyć go do właściwego kodonu w mRNA dzięki zdolności tworzenia par zasad między kodonem a antykodonem. 7. w jaki sposób gen jest wyrażany? W przeciwieństwie do nukleotydów. „Łącznikami" są małe cząsteczki RNA — transportujący RNA (tRNA). niezwykle ważne dla jego funkcji biologicznej. kodon UCA (uracyl-cytozyna-adenina) koduje aminokwas serynę (tab.7. 12). liczby i sekwencji aminokwasów. W cząsteczce mRNA grupy trzech kolejnych zasad kodują określony aminokwas. liczba i sekwencja aminokwasów są determinowane określoną sekwencją zasad w DNA. aminokwasy nie mogą się po prostu „ustawić" (i spolimeryzować) na matrycowej nici DNA. 2). Uczestnictwo w syntezie polipeptydu jest uwarunkowane uprzednim związaniem aminokwasu z cząsteczką „łącznika" właściwego zarówno dla aminokwasu. 15. Transkrypt genu (RNA). z których każda wiąże określony aminokwas. 5. rodzaj. Badanie syntezy białek pozwoliło zrozumieć. jak jest zakodowana informacja genetyczna i w jaki sposób działa kod genetyczny. Polipeptyd jest łańcuchem zbudowanym z aminokwasów kowalencyjnie połączonych wiązaniami peptydowymi (-CONH-). Po pierwsze gen jest transkrybowany (sekcja 7. Transkrypcja zazwyczaj jest związana z aktywnością białek zwanych czynnikami transkrypcyjnymi. które wiążą się do określonych sekwencji DNA. 122 . jak i własnego kodonu. 11).

coli formylometionina usuwana jest z około 50% białek. N-końcowego 123 . pierwszym kodonem podlegającym translacji) jest zazwyczaj AUG. To. Kodon inicjujący AUG u większości bakterii (włączając E. 3). na lewo od AUG na rys. 9. cząsteczki 16S rRNA. Należy podkreślić. Reakcja formylacji metioniny wymaga N10-formylotetrahydrofolianu (tab. W E. który transportuje N-formylometioninę. Uproszczony przebieg tego procesu jest schematyczne pokazany i wytłumaczony na rysunku 7. 9). 1). wchodzącej w skład rybosomu. coli) koduje zmodyfikowany aminokwas N-formylometioninę. Odpowiednie ustawienie AUG i rybosomowego miejsca Ρ umożliwia zazwyczaj określona sekwencja nukleotydów (sekwencja Shine-Dalgarno) umiejscowiona przed kodonem AUG na mRNA (tj. Inicjujący kodon tworzy parę z wyspecjalizowanym inicjujacym tRNA. Sekwencja ta tworzy pary zasad z częścią. 2. czy zostanie ona odcięta od określonej cząsteczki białka. Jak pokazano na rysunku 7.Synteza polipeptydu (proces translacji) zachodzi na rybosomie (sekcja 2. 9. zależy od przedostatniego. 7. albo cała formylometionina jest enzymatycznie usuwana z polipeptydu. kodonem inicjującym (tj. że po zakończeniu translacji albo grupa formylowa. 6.

124 .

Natomiast enzym deformylaza metioninowa odcina tylko grupę formylową. ang. Etapy d-f powtarzają się dla każdego kodonu. w kierunku 5' do 3' (translokacja). patrz sekcja 7. aminopeptydaza metioninowa (MAP. Pary zasad tworzone między kodonami mRNA i antykodonami tRNA zazwyczaj nie są stabilne w stopniu zapewniającym odpowiednią dokładność i wydajność translacji. Rys. 125 . UAA). a antykodon tRNA1 paruje się z kodonem AUG. a kodony są odczytywane zgodnie z kodem genetycznym (tab. Ma na to wpływ również rybosom. 7. że IF-2 i GTP są niezbędne do związania formylometionylo-tRNA do AUG w miejscu P. tworząc cały rybosom. 7. 4). d-e). (AA1 stanie się w ten sposób „końcem aminowym" lub końcem Ν łańcucha polipeptydowego). Gdy zostanie napotkany kodon stop (np. konkretnie rRNA [patrz np. Wszystkie trzy czynniki inicjujące odłączają się przed ukończeniem etapu (b) — rys. 9). (f) Trzeci aminoacylo-tRNA wiąże się do miejsca A. Inicjacja syntezy białka wymaga uczestnictwa trzech białek. Reakcję te nazywamy transpeptydacją. czynników inicjujących — IF-1. 6) (a) rybosomowa podjednostka 30S wiąże się z mRNA. Kodon inicjujący (AUG) mRNA zajmuje miejsce P. Ten tRNA wiąże się do podjednostki 30S przed dodaniem podjednostki 50S (tzn. 2). 7. Dipeptyd związany z tRNA zajmuje teraz miejsce P. ] Elongacja łańcucha polipeptydowego zachodzi przez kolejne dodawanie aminokwasów odpowiadających kodonom znajdującym się za AUG. między etapami (a) i (b) na rys. Uwalnia się gotowy łańcuch białka. methionine aminopeptidase) — przedstawiciel ważnych fizjologicznie enzymów [właściwości i funkcje aminopeptydaz opisano w artykule: Gonzales i Robert-Baudouy (1996) FEMSMR 18: 319-344]. 7. choć sposób i koordynacja ich działania nie są w pełni poznane. Po związaniu aminoacylo-tRNA następuje transpeptydacja (utworzenie wiązania peptydowego) i translokacja (przemieszczenie kompleksu) (rys. natomiast „akceptorowe" miejsce A naprzeciw trzeciego kodonu jest puste. (c) Drugi aminoacylo-tRNA zajmuje miejsce A. Szkaradkiewicz i Sprinzi (1998) MM 29: 409-417. (d) Tworzy się wiązanie peptydowe między grupą karboksylową pierwszego aminokwasu AA1 a grupa α-aminową drugiego aminokwasu AA2. Enzym ten stanowi cześć rybosomowej podjednostki 50S (oraz jest miejscem działania niektórych antybiotyków — patrz sekcja 15. Podjednostka 50S wiąże się. Reakcja transpeptydacji jest katalizowana przez enzym peptydylotransferazę. W E. Pierwszym etapem elongacji jest związanie aminoacylo-tRNA do pustego miejsca A (rys. a antykodon tRNA2 paruje się z kodonem AUG. IF-2 i IF-3. 7. Region 16S rRNA zdolny do rozpoznania kodonów zachodzi na miejsce „P" i „A". Formylometioninę odcina enzym. Etapy c-e powtarzają się w trakcie elongacji. etap C). 9. a połączenie się podjednostek 50S i 30S jest związane z hydrolizą GTP. 9 Synteza białek w bakteriach (schemat uproszczony. Im dłuższy jest łańcuch boczny tego aminokwasu. Schoeder (1994) Nature 370: 597-598].aminokwasu. [Bacterial initiation factors in protein synthesis (artykuł przeglądowy): Brock. Jest jednak powszechnie przyjęte. Podczas tworzenia kompleksu 70S. 4. tym mniejsze jest prawdopodobieństwo odcięcia formylometioniny. 9. 7. coli wiązanie jest uzależnione od GTP i czynnika elongacyjnego EF-Tu. (b) Pierwszy aminokwas (ΑΑ1) związany z tRNA (tRNA1) zajmuje miejsce P. IF-2 działa jak GTPaza. tRNA1 zostaje uwolniony. czynnik uwalniający białko hydrolizuje wiązanie estrowe między ostatnim tRNA a łańcuchem polipeptydowym. (e) Rybosom przesuwa się stopniowo po RNA na odległość jednego kodonu. 9.

W wielu przypadkach białko będące częścią błony lub transportowane przez błonę jest syntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją aminokwasów (sekwencją sygnałową). wieloraki). białka błony i różne białka wydzielane na zewnątrz. coli mostków disulfidowych zazwyczaj nie ma w białkach cytoplazmatycznych. (Mutacje białek Dsb mają charakter plejotropowy (tzn. 126 . gdy jeden z rybosomów przemieszcza się wzdłuż cząsteczki mRNA. 3) [Signal sequences (artykuł przeglądowy): Izard i Kendall (1994) MM 13: 765-773. a następnie zostaje enzymatycznie odcięta (patrz również sekcja 5. Funkcjonowanie białek zależy od właściwego zwinięcia (sfałdowania) łańcuchów polipeptydowych. białka rzęski. drugi może zająć puste miejsce inicjujące i rozpocząć translację innej cząsteczki polipeptydu. Jedna cząsteczka mRNA może być pokryta przez większą ilość rybosomów tworzących polirybosom (polisom) (rys. przez zależny od NADPH system tioreduktazy) [ale patrz również Stewart. a nawet dłuższą sekwencją [Tate i Mannering (1996) MM 21: 213-219]. W białkach znajdujących się w peryplazmie. np. że zasada znajdująca się za kodonem stop wpływa na wydajność terminacji. ponieważ mogą być redukowane enzymatycznie. Podczas. ] Zwijanie białek. Prowadzi to do hydrolizy wiązania peptyd-tRNA w miejscu Ρ i do uwolnienia polipeptydu. 10). Sekwencje sygnałowe. co jest spowodowane stabilizacyjnym wpływem mostków siarczkowych na liczne białka. coli jest katalizowana przez białka Dsb (produkty genów dsb A i dsbB). odpowiednio). Być może. 4. amber i opal. w błonie lub w białkach wydzielanych na zewnątrz sfałdowanie jest związane z utworzeniem mostków disulfidowych między określonymi aminokwasami w łańcuchu. istnieją jednak dowody sugerujące. (W E. który musi rozpoznać sygnał stop i oddziaływać bezpośrednio z mRNA. właściwy sygnał stop jest 4-zasadową. Tradycyjnie przyjmuje się. Aslund i Beckwith (1998) EMBO Journal 17: 5543-5550]. ) Synteza disulfidowych wiązań w peryplazmie E. np.Sygnałem terminacji translacji (zakończenia syntezy polipeptydu) jest obecność w miejscu A jednego z kodonów stop (kodonów nonsensowych): UAA. Terminacja jest związana z aktywnością czynnika uwalniającego. że sygnał stop stanowi trójka zasad (jak wyżej). białkowe czynniki wirulencji. Sekwencja ta pozwala wejść lub przejść przez hydrofobowy region błony. 7. a więc obniżać wirulencję patogenów [Disulphide bond formation (artykuł przeglądowy): Bardwell (1994) MM 14: 199-205]. UAG i UGA (ochre. W bakteriach patogennych mutacje takie mogą wpływać na wydzielane.

1169-1182]. właściwego sfałdowania mogą wymagać izomeraz peptydyloprolilowych. CpxA. ] 7. 1 Losy mRNA Po spełnieniu swej roli wiele rodzajów bakteryjnego mRNA istnieje w komórce krótko i szybko ulega degradacji do składników. niektóre antybiotyki. Jednak lipid obecny w błonie. 1). Aktywacja systemu Cpx wykazuje zgodność z obserwowanym in vivo zwiększeniem transkrypcji obu tych genów [Pogliano i wsp. szok cieplny. Aktywacja sensora. a nie przez rybosomy i cząsteczki RNA. 2. ułatwiają ich właściwe fałdowanie przez hamowanie niewłaściwych sposobów zwinięcia. Białka opiekuńcze mogą się wiązać z innymi białkami podczas translacji [patrz Fedorov i Baldwin (1997) JBC 272: 32715-32718] albo po translacji. 3) synteza ich wzrasta — prawdopodobnie ze względu na konieczność ponownego zwinięcia zdenaturowanych białek. (19970 GD 11. Takie antybiotyki (wytwarzane przez Bacillus brevis) działają przeciw bakteriom gramdodatnim. że transkrypcja genów związanych z fałdowaniem białka jest zależna od czynnika σΕ [Danese i Silhavy (1997) GD 11: 1183-1193]. 6) nazywany CpxA-CpxR. 8. Wczesne etapy zwijania tego białka (w błonie cytoplazmatycznej) są niezależne od lipidu. Zwinięcie nowo syntetyzowanych białek i ich przejście przez błony w stanie całkowicie lub częściowo zwiniętym jest ułatwione przez tzw. Każdy etap zwinięcia i translokacji może wymagać udziału więcej niż jednego białka opiekuńczego. w genach dsbA i ppiA. coli. fosfatydyloetanoloamina (PE. phosphatidylethanolamine. Są to cząsteczki. groEL i dnaK E. prowadzi do fosforylacji regulatora CpxR. 8. ich przykładami są produkty genów groES. sekcja 7. W ten sposób są syntetyzowane np. coli (sekcja 7. białka opiekuńcze (zazwyczaj nazywane chaperonami). 8) pełni rolę chaperonu dla białka LacY E. natomiast stadia późniejsze wymagają udziału lipidu PE [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264]. Proces ten ma duże znaczenie. 6. Pewna ilość bardzo krótkich peptydów syntetyzowana jest przez kompleks składający się z wielu enzymów. W E. np. ang. takie jak tyrocydyna (cykliczny peptyd złożony z 10 reszt aminokwasowych) i gramicydyna (liniowy peptyd). 2. najprawdopodobniej przez zmianę przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. który w następstwie tego zdolny jest do związania się z DNA przed miejscem startu transkrypcji. [Non-ribosomal biosynthesis of peptide antibiotics (artykuł przeglądowy): Kleinkauf i von Dohren (1990) EJB 192: 1-15. Chaperony są syntetyzowane konstytutywnie. Wydaje się. 8. Synteza przynajmniej kilku enzymów związanych ze zwijaniem białka jest z pewnością kontrolowana przez dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7. które mogą być ponownie użyte. inaczej cytoplazma zostałaby szybko 127 . ] Synteza peptydów bez rybosomów. coli kilka izomeraz tego typu (np. FkpA i PpiA) występuje w regionie peryplazmatycznym. 1. jednak w pewnych stresowych warunkach (np. sekcja 2. które wiążą się i stabilizują nowo syntetyzowane białka. Chaperony to zazwyczaj białka. [Protein folding and misfolding (some concepts and themes): Dobson i Ellis (1998) EMBO Journal 17: 5251-5254.Białka zawierające prolinę do swojego.

coli (który koduje polimerazę poli(A). że niektóre białka zawierają wewnętrzną sekwencję aminokwasów — inteinę. ang.inteiny W roku 1990 wykryto. że większość eukariotycznych mRNA ma „ogony" złożone z poliadenylanu (tj. 6. 3' egzonukleazy — fosforylazy polinukleotydowej. coli jest degradowany do odcinków długości około 10 nukleotydów (nie mniejszych) przez RNazę II i fosforylazę polinukleotydową.zapełniona „zużytymi" cząsteczkami mRNA. że nieznany dotychczas enzym RNaza* degraduje te odcinki do pojedynczych nukleotydów. że antysensowna cząsteczka RNA I jest zazwyczaj poliadenylowana. [Polyadenylation of bacterial mRNA (artykuł przeglądowy): Sarkar (1996) Microbiology 142: 3125-3133. których koniec 3' jest strukturą drugorzędową typu „pętli i łodygi" kodowaną przez rho-niezależny terminator transkrypcji (sekcja 7. 4). 2 Białka wewnątrz białek . a w E. PAPI) zmniejszają liczbę kopii np. a dwie końcowe części oryginalnego peptydu (eksteiny) łączą się. Na przykład w E. co prowadzi do utworzenia funkcjonalnego białka. (Zdarza się jednak. sugeruje się. może np. Wiadomo jest. Struktura pętli i łodygi jest zazwyczaj oporna na działanie niektórych enzymów degradujących RNA. pomagać w regulacji okresu półtrwania (stabilności) pewnych cząsteczek RNA. a to stabilizuje RNA I. że poliadenylacja pełni ważną rolę w stabilizacji mRNA. -A-A-A-A 3'). redukując liczbę jego kopii). Schematycznie: 128 . która katalizuje w białku wycięcie jego części. mRNA E. w ten sposób model degradacji mRNA zostaje uzupełniony [Cannistraro i Kennel (1991) JB 173: 4653-4659]. coli są przynajmniej dwa enzymy — polimerazy poli(A) (PAPs. Co ciekawe. W nowszych pracach podkreśla się. a zwiększona trwałość mRNA może być mechanizmem utrzymującym wyrażanie się genów podczas anaerobiozy [Georgellis i wsp. 8. które przecinają kwasy nukleinowe): endonukleaz (które przecinają wiązanie fosfodiestrowe w regionach środkowych) i egzonukleaz (odcinających nukleotydy od końca 3'). Znaczenie poliadenylacji nie jest znane. natomiast mało jest doniesień dotyczących poliadenylacji bakteryjnych mRNA. mutacje w genie pncB E. Degradacja zachodzi z udziałem nukleaz (enzymów. W tych warunkach szybkość syntezy mRNA jest znacznie mniejsza. W mutantach pcnB brak jest poliadenylacji. (1993) MM 9: 375-381]. ] 7. Na degradację mRNA mają wpływ warunki wzrostu. że poliadenylacja 3' struktury „pętli i łodygi" może ułatwiać degradację tych cząsteczek. ponieważ dostarcza dogodnego miejsca do wiązania enzymów degradujących — np. coli okres półtrwania przynajmniej niektórych cząsteczek mRNA jest bardzo wydłużony podczas wolnego wzrostu w warunkach beztlenowych (czas podwojenia liczby komórek = 700 min). Jednak takie mRNA istnieją. poly(A)polymerases) odpowiedzialne za poliadenylację. jednocześnie zwiększając jego hamujące działanie na RNA II i w rezultacie hamując replikację ColEl (tj. Wydaje się. Inteina jest wycinana (tworząc osobne białko). co ułatwia jej degradację. W jaki więc sposób mRNA może być ponownie syntetyzowany? Wydaje się. plazmidu ColE1. 5). że degradacja mRNA jest opóźniona — patrz sekcja 7.

Istnieje więc korelacja między szybkością wzrostu a szybkością syntezy rybosomów. Istnieje podobieństwo funkcji intein i pewnych intronów. Olsen i Adam (1997) 25: 1087-1093]. w genie recA Mycobacterium tuberculosis i wśród archeonów (np. 8. 2. Wytwarzanie rybosomów wymaga skoordynowanej syntezy rybosomowych białek i rRNA (sekcja 2. w którym kopiowany jest gen zawierający inteinę. które normalnie zajmowane jest przez DNA inteiny. należą do ruchomych elementów genetycznych. a to z kolei wymaga większej ilości rybosomów w komórce. z których każdy jest transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka z zakodowanym zestawem białek 129 . że niektóre z nich mogą regulować aktywność białka. 8). po przecięciu kopii następuje Insercja DNA inteiny w procesie (zwanym konwersją genu). że nie jest znana żadna pożyteczna dla komórki rola intein. Podczas wycinania powstaje produkt pośredni. wycięta inteina VMAl S. jak i inteiny. Ich zdolność autokatalitycznego wycinania jest potwierdzona brakiem wycinania w wyniku delecji regionu DNA kodującego inteinę i faktem „heterologicznej" ekspresji genu kodującego inteinę w organizmach. 6. Na przykład. Niektóre inteiny pełnią funkcję zlokalizowanych endonukleaz (tak jak niektóre ulegające translacji introny). W szczepie S. który jest rozgałęzionym polipeptydem (z dwoma końcami Ν i jednym końcem C).eksteina-inteina-eksteina -> eksteina-eksteina + inteina Zjawisko to po raz pierwszy obserwowano w eukariotycznym genie VMA1 (= TFP1) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. jaki tworzy się w organizmach eukariotycznych podczas przekształcania pre-mRNA w dojrzały mRNA (patrz rys. podobnie jak transpozony (sekcja 8. Geny kodujące około 50 rybosomowych białek są zgrupowane w kilkunastu różnych operonach (sekcja 7. 3). 7. które nie mają tego genu. Przecięcie zachodzi w miejscu. który nie ma sekwencji kodującej inteinę. 8. później wykryto je w bakteriach (np. Długość intein wynosi zazwyczaj 350-550 aminokwasów. cerevisiae specyficznie przecina gen VMA1. Inteiny. 3). sugeruje jednak. Co więcej. 1). Autor zaznacza. coli prowadzi do utworzenia zarówno gotowego białka. w genie polimerazy DNA gatunku Pyrococcus i Thermococcus litoralis). Nowa inteina pochodząca z cyjanobakterii została odkryta przez Pietrovskiego [TIG (1996) 12: 287-288]. wyrażanie się genu VMA1 w E. Przypomina to rozgałęziony mRNA. Zdolność inteiny do pobudzania wstawienia sekwencji ją kodujących do kopii genu nie zawierających intein (jak w przedstawionym wyżej przykładzie S. cerevisiae) nazywana jest powrotem inteiny. Inteiny były opisane w artykule przeglądowym Coopera i Stevensa [TIG (1996) 12: 351-356]. 3 Rybosomy a szybkość wzrostu Zwiększenie szybkości wzrostu jest w sposób oczywisty związane ze wzrostem szybkości syntezy białka. z którego pochodzą [Compilation and analysis of intein sequences: Perler. cerevisiae zawierającym gen VMA1 kodujący inteinę oraz kopie genu bez inteiny.

Rampersad i Fox (1999) NAR 27: 637-642]. nie enzymatyczna. że wolne białka rybosomowe mogą się wiązać z własnymi transkryptami i pełnić funkcję hamującą ekspresję. W E. z których wszystkie zawierają jedną kopię każdego z trzech rodzajów rRNA — z wyjątkiem operonu D. zależnie od warunków. 23S i 5S rRNA są transkrybowane wspólnie (w takim właśnie porządku). które przecinają wiązanie między cukrem a zasadą. Uważa się. Jeden z modeli opisujących kontrolę tych operonów postuluje. policistonowy mRNA). że jedno z białek kodowanych przez określony operon działa jak czynnik regulujący translację operonu. co z kolei sprawia.(tzw. 7. a przez to jest podatna na regulację. Ten DNA może być natychmiast rozpoznawany i reperowany przez aktywność korekcyjną komórki. Badania struktury AlkA sugerują. To zmniejszenie szybkości wzrostu jest prawie całkowicie zahamowane przez insercję plazmidowego genu 5S rRNA do chromosomu [Ammos. Synteza rRNA jest połączona z potrzebami translacyjnymi komórki. Glikozylaza DNA I (białko Tag). 7 Kontrolowanie i naprawa DNA Uszkodzony DNA może powstać na przykład w wyniku wstawienia nieprawidłowego nukleotydu podczas replikacji. przez zahamowanie translacji przynajmniej niektórych białek kodowanych przez policistronowy mRNA. Indukowana glikozylaza DNA II (= białko AlkA) wycina nie tylko te dwie nietypowo metylowane puryny. że model ten zakłada istnienie powiązań między syntezą białka a syntezą rRNA. Przeciwnie. Η). który ma dwie kopie genu 5S rRNA. wycina 3-metyloadeninę. 1. W E. ale również niektóre nienormalnie metylowane pirymidyny. błędna. delecja dwóch lub większej liczby kopii genu 5S rRNA w E. coli prowadzi do silnego zmniejszenia szybkości wzrostu (nie obserwuje się efektu kompensacyjnego). Mechanizm kontrolujący ekspresję jednego z tych operonów w E. coli nietypowe zasady są wycinane przez N-glikozylazy. Należy zauważyć. Na chromosomie znajduje się siedem kopii tego operonu (A-E. że szeroka specyficzność tego enzymu jest związana z nasyconą elektronami szczeliną. 8. 4) może prowadzić do powstania 3-metyloadeniny i/lub 7-metyloadeniny. coli 16S. z powodu mutacji) może być kompensowane przez podwyższenie ekspresji operonów rrn. Na przykład. że wraz ze zmniejszeniem szybkości wzrostu maleje ilość 16S i 23S rRNA dostępnego do syntezy rybosomów. spontaniczna metylacja przez S-adenozylometioninę (dawcę grup metylowych — patrz sekcja 7. Niektóre z białek regulujących translację danego operonu mogą się również wiązać do 16S i 23S rRNA. G. syntetyzowana w sposób konstytutywny. 3. Każde zmniejszenie ilości 16S lub 23S rRNA (np. jako jeden transkrypt operonu rrn. Polimeraza DNA III może odciąć „zły" nukleotyd z końca 3' rosnącej nici. zwiększając lub zmniejszając syntezę. a każda z tych na ogół występujących zasad purynowych może hamować funkcje DNA. co pozwala na zastąpienie go nukleotydem prawidłowym. bogatą w aromatyczne łańcuchy 130 . DNA jest podatny również na chemiczne zmiany zasad [Lindahl (1993) Nature 362: 709-715]. coli przedstawiony jest w sekcji 7.

1 Naprawa „mismatch" (pomyłek) (DDMR. 7. oraz egzonukleazy 5'-3'. ] Szczepy E. Spontaniczna. 1. Przyjmuje się. Exol. 3) do uracylu może być naprawiona na drodze usuwania uracylu przez enzym. że usunięcie tego odcinka wymaga helikazy II (MutU. prowadząc do powstania mutacji punktowej (sekcja 8. W niektórych przypadkach deaminacja cytozyny następuje po metylacji tej zasady w pozycji 5. ang. która może być oddalona nawet o 1000 nukleotydów od źle dopasowanej zasady. Spontaniczna deaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania typowej zasady. CG w dupleksie wyjściowym zostaje zastąpione przez TA w dupleksie potomnym. (UNG znajduje zastosowanie w technologii rekombinowanego DNA (sekcja 8. 7. coli wykrycie źle dopasowanej pary zasad przez białko MutS aktywuje nukleazę MutH. 3). które nie zostały naprawione przez aktywność korekcyjną polimerazy. (1996) Cell 86: 321-329]. nie wykazują zaburzeń w naprawie typu „mismatch" [Harris i wsp. Wycięcie przez glikozylazę (pierwszy etap naprawy) zmienionych chemicznie zasad zostawia miejsce apurynowe (bez puryny) lub apirymidynowe (bez pirymidyny). zwane miejscem AP (= pozbawione zasady). 1). N-glikozylazę uracylową (UNG. Jednoniciowa luka jest zapełniona przez polimerazę DNA (z wykorzystaniem nici oryginalnej jako matrycy) i sklejona przez ligazę. Jednak szczepy nie mające egzonukleazy 3'-5'. 1. Głównym zadaniem tego systemu jest naprawa błędów powstałych w trakcie replikacji DNA. W E. uracil-N-glycosylase). 4). (Zastąpienie jednej pirymidyny lub puryny odpowiednio przez inną pirymidynę lub purynę nazywamy tranzycją.boczne. MutL zapewnia koordynację między źle dopasowaną parą zasad a miejscem cięcia GATC. Po przecięciu przez MutH odcinek nici potomnej znajdującej się między miejscem cięcia a miejscem położonym za źle dopasowaną zasadą zostaje usunięty. 1. 4. 8. (1998) JB 180: 989-993]. „gorące miejsca" w DNA. 1 System naprawy przez wycinanie 7. 5. zostaje więc w DNA. co wynika z modyfikacji DNA (sekcja 7. ) 7. 1. która nie może być usunięta przez żaden enzym. Exo VII i RecJ. [Replication errors (bacterial and human) (artykuł przeglądowy): Jiricny (1998) EMBO Journal 17: 6427-6436. Dam-directed mismatch repair) Pomyłki. ang. tyminy (rys 7. Dalsze etapy procesu obejmują wycięcie zasady (sekcja 7. zachodząca z małą częstością deaminacja cytozyny (rys. 3). 7. a w następnej rundzie replikacji tworzy parę z adeniną. MutH przecina nową nić potomną (która charakteryzuje się przejściowym niskim stopniem metylacji) w miejscu 5' od (nie metylowanej) sekwencji GATC (Dam). zwanej również UvrD) i endonukleazy DNA. tzw. 4) przez system naprawy zwany mismatch. która może rozpoznawać każdą z nietypowo metylowanych zasad ubogich w elektrony [Labahn i wsp. rys. 7. mają szansę być naprawione wkrótce potem (przed modyfikacją: sekcja 7. 3). zastąpienie puryny pirymidyną lub odwrotnie — transwersją. 5-metylocytozyna wyznacza miejsca mutacji spontanicznej. coli pozbawione produktów genów mut mają defekt w naprawie DNA i charakteryzują się fenotypem mutatorowym (patrz również sekcja 131 .

Następnie wiązanie fosfodiestrowe z jednej strony miejsca AP zostaje przecięte przez „AP endonukleazę". UvrA zostaje zastąpione przez UvrC. Kompleks UvrBC katalizuje przecięcie z obu stron miejsca uszkodzonego. uvrB i uvrC. ) Homologia sekwencji między MutH a enzymem restrykcyjnym Sau3Al (tab. wielofunkcyjny enzym.8. 5. 7. którego struktura sugeruje. Do dimeru przyłącza się UvrB. Z kolei helikaza II (UvrD) usuwa UvrC razem z krótką sekwencją nukleotydów zawierającą miejsce uszkodzone. 7. (Warto podkreślić. 1) wskazuje na ich pokrewieństwo ewolucyjne [Ban i Yang (1998) EMBO Journal 17: 1526-1534]. 3 Naprawa przez usunięcie zasady (naprawa następująca po działaniu glikozylaz) Niektóre systemy naprawiają głównie uszkodzenia powodowane przez określone czynniki — np. Pierwszym etapem naprawy jest wycięcie zmienionej zasady. coli system enzymów zależnych od ATP (UvrABC. przecięcie po stronie 3' następuje wcześniej niż po stronie 5'. 7. 8. 2 Naprawa przez wycięcie nukleotydów (naprawa przez system UvrABC) W E. 7. Polimeraza DNA może następnie zastąpić sekwencją prawidłową uszkodzony nukleotyd. z utworzeniem miejsca AP (patrz wyżej). Dimery te powstają w rezultacie wytworzenia wiązań między dwiema sąsiednimi resztami tyminy w tej samej 132 . coli główną AP endonukleazą jest egzonukleaza III. W E. jak również inne. do przesunięcia się kompleksu UvrA2B do miejsca uszkodzonego. uszkodzenia oksydacyjne [Demple i Harrison (1994) ARB 63: 915-949] lub wynikłe z niewłaściwej alkilacji lub deaminacji zasad (patrz wyżej). „enzymy wycinające ABC") rozpoznaje i naprawia DNA uszkodzony/zniekształcony w wyniku naświetlenia promieniami ultrafioletowymi bądź z jakiś innych powodów. a ligaza kończy naprawę. 7. 1). 1. związane są z mutacjami w genach homologicznych do mutS i mutL. Naprawa wymaga energii (pochodzącej z hydrolizy ATP) np. jednocześnie usuwając UvrB. 1. że przecięcie wiązania fosfodiestrowego następuje w wyniku ataku nukleofilowego na wiązanie P-3'O [Mol i wsp. coli wycinane jest tylko dziesięć nukleotydów obejmujących bliskie sąsiedztwo miejsca uszkodzonego — stąd nazwa naprawa krótkiego odcinka. Białko UvrA jest ATPazą wiążącą cynk. 2 Fotoliaza Jeden z typów uszkodzeń DNA wywoływany przez promienie ultrafioletowe polega na utworzeniu dimerów tyminy. UvrABC składa się z trzech białek kodowanych przez geny uvrA. 5. (1995) Nature 374: 381-386]. a wraz z nim kilka nukleotydów leżących po stronie 3' od miejsca uszkodzenia [Sandigursky. Polimeraza zapełnia jednoniciową lukę. Początkowo dimer UvrA wiąże się do uszkodzonego DNA. W E. że u ludzi niektóre rodzaje nowotworów dolnych odcinków przewodu pokarmowego. 7. Ligaza kończy naprawę. a następnie UvrA2B przesuwa się dokładnie do miejsca uszkodzenia. Fryer i Franklin (1998) NAR 26: 1282-1287].

Jeden z modeli postuluje. że zmieniony DNA blokuje przesuwanie się polimerazy podczas transkrypcji. W warunkach braku określonego substratu komórka traciłaby energię na syntezę białek (np. A więc ekspresja genu regulowana jest wówczas „na poziomie transkrypcji". mdf (ang. natomiast słabe pozwalają jedynie na niski poziom wyrażania się genu (patrz również sekcja 7. zdolną wykorzystać do naprawy uszkodzenia energię pochodzącą ze światła widzialnego. 12). TRCF może następnie oddziaływać z systemem UvrABC i wpływać na naprawę [Miniprzeglądówka: Selby i Sancar (1993) JB 175: 7509-7514. choć istnieją również inne sposoby regulacji. Silne promotory ułatwiają transkrypcję. kodują enzym. coli. Na przykład. 8. Badania in vitro naprawy dimerów tyminy mogą być ułatwione przez zastosowanie nadmanganianu potasu (KMnO4) [Ramaiah i wsp. Geny są regulowane nie tylko przez czynniki zewnętrzne. geny mogą być „włączane" (indukowane) lub „wyłączane" (reprymowane). ale również wewnętrznie. 8. 1). Ekspresja genów związana jest zazwyczaj z syntezą białek (sekcja 7. enzymów) koniecznych do jego metabolizowania. bądź też ich wyrażanie się może się zwiększać lub zmniejszać. fotoliazę. że geny kodują np. takich jak temperatura (sekcja 7. 11) lub rytm dobowy (sekcja 7. ang. Rzeczywiście. Mutacja w operonie może wpływać na wyrażanie się innych genów położonych za genem zmutowanym. co zależy od siły własnego promotora. wiąże się w tym miejscu. tRNA i rRNA. włączając E. 3 Wybiórcza naprawa genów aktywnie transkrybowanych Intensywnie transkrybowane geny są naprawiane szybciej niż inne. 133 . Mutacja(e) (sekcja 8. jednak należy pamiętać. ] 7. Niektóre bakterie. Taka regulacja często zachodzi dzięki mechanizmowi. powodując uwolnienie polimerazy i niedokończonego mRNA. w wielu wypadkach poziom transkrypcji rozpoczynającej się w danym promotorze może być zmieniony w następstwie wiązania się określonych białek regulacyjnych w pobliżu miejsca promotora. 2. 1). Siła promotora nie jest jednak niezmienna. Niezakłócona transkrypcja zależy również od właściwego stopnia superzwinięcia DNA (sekcja 7. kodowany przez gen powodujący zmniejszenie częstości mutacji. 7. który zwiększa lub hamuje syntezę mRNA poszczególnych genów. 7. Wyrażanie się genu może również zależeć od innych czynników. 8. transcription-repair coupling factor). mutation frequency decline). (1998) NAR 26: 3940-3943]. zależnie od warunków.nici. 5). zmniejszenie negatywnego superzwinięcia prowadzi niejednokrotnie do zahamowania transkrypcji w wielu promotorach. 1) w kodującej sekwencji genu może wpływać na rodzaj i biologiczną aktywność jego produktu (rys. 6). 8 Regulacja ekspresji genów Nie wszystkie geny komórkowe są wyrażane przez cały czas. a czynnik łączący transkrypcję z naprawą (TRCF. Niektóre z nich zostały opisane w dalszej części rozdziału.

Te. znajdują się pod kontrolą negatywną. Geny te (araE i araFG) znajdują się w dwóch odległych miejscach chromosomu. Gen lacZ koduje enzym β-galaktozydazę rozszczepiającą laktozę na reszty glukozy i galaktozy oraz powodującą przekształcenie niewielkich ilości laktozy do formy allolaktozy. 1 i 7. ten zestaw genów (pobranie + metabolizm) stanowi regulon (sekcja 7. która umożliwia pobranie laktozy ze środowiska. Obecność allolaktozy może „zaindukować" operon lac (rys. 1. których ekspresja znajduje się pod wspólną kontrolą. Geny zlokalizowane we wszystkich trzech miejscach są kontrolowane przez wspólne białko regulatora — AraC (kodowane przez araC). jak i translacja) bliższa jest wzorom ekspresji genów eukariotycznych niż bakteryjnych [Bell i Jackson (1998) TIM 6: 222-228]. które umożliwiają metabolizm L-arabinozy do D-ksylulozo-5-fosforanu. 2). dopóki nie zostaną „włączone" przez białko regulatora. W nieobecności arabinozy AraC pełni rolę represora (kontrola regulonu jest negatywna. 11) koduje białka. 11). Geny leżące w tym samym operonie często kodują funkcjonalnie pokrewne produkty. ale czasami na poziomie translacji (sekcja 7. 2). Zbiór genów. 1. które nie są wyrażane. Gen lacY koduje permeazę β-galaktozydową. W ten sposób zmodyfikowane białko regulatora „włącza" system — jest to przykład kontroli pozytywnej. 8. Operony. 9) powoduje uszkodzenie mechanizmu wycinania. coli są również dodatkowe geny związane z pobraniem arabinozy (transport: sekcja 5. 1. 7. są pod kontrolą pozytywną. 8. nazywa się operonem. Ekspresja genów u Archaea (zarówno transkrypcja. 7. które umożliwiają pobranie i metabolizm laktozy (dwucukru złożonego z reszt glukozy i galaktozy).Mówimy wtedy o mutacji polarnej. który znajduje się pod kontrolą negatywną. W E. jeśli mutacja w intronie (sekcja 7. Geny araB. 134 . 1 Operony. enzymy tego samego szlaku metabolicznego. araA i araD kodują enzymy. Rysunek 7. jak w operonie lac). Produkt genu lacA (transacetylaza tiogalaktozydowa) prawdopodobnie nie jest istotna dla metabolizmu laktozy. Ze względu na istnienie wspólnego białka regulatora dla genów zlokalizowanych w różnych miejscach. 8. nawet gdy sekwencja kodująca pozostaje bez zmiany. którego produkcja może być mniej lub bardziej ciągła. W niektórych genach ekspresja może być zahamowana. 7. w których kontrolowany jest promotor W operonach tych rolę kontrolną pełni białko regulatora. 1. 11 tłumaczy regulację operonu lac. np. co umożliwia rozpoczęcie transkrypcji. Operon lac w E. Operony są kontrolowane przez różne mechanizmy. Arabinoza powoduje konwersję AraC do aktywatora. często na poziomie transkrypcji (sekcja 7. które są wyrażane dopóki nie zostaną „wyłączone" przez białko regulatora. 4). 3). 8. 1 Operony Bardzo często sekwencja genów jest transkrybowana z jednego promotora jako pojedyncza cząsteczka RNA. 8. coli (rys. 7. Określenie „operon ara" odnosi się zazwyczaj do operonu araBAD. 8.

1). że w warunkach represji operonu tetrametryczne białko regulacyjne wiąże się z głównym operatorem (O) i z O-2 (lub O-3) i tworzy w ten sposób pętlę DNA. lacY i lacA przez polimerazę RNA (na rysunku jest ona związana z promotorem P). 16) 135 . Po inaktywacji białka regulacyjnego trzy geny mogą ulegać transkrypcji i translacji. a białko regulacyjne ponownie „wyłącza" operon. induktor (allolaktoza) już się nie tworzy. 1). Operon lac jest również regulowany przez represję kataboliczną (sekcja 7. że związek ten indukuje operon. 8. produkt genu lacZ — β-galaktozydaza może być syntetyzowany w warunkach represji. Na schemacie przedstawiono jedynie zarys działania operonu lac. np. białko regulacyjne (produkt genu lacT) wiąże się do operatora O. 4) sprawia. 8. 2. Zahamowanie nie jest całkowite. co znaczy. 6. Wydaje się. w rzeczywistości proces ten jest o wiele bardziej złożony. (b) Obecność laktozy (pobranej przez komórkę na drodze symportu proton-laktoza. choć z mniejszym powinowactwem. 1). białko regulacyjne może się wiązać do dwóch innych miejsc nazywanych O-2 i 0-3. 8. Allolaktoza jest induktorem operonu lac dzięki swej zdolności do wiązania się z białkiem regulacyjnym. 6. sekcja 5. IPTG znajduje zastosowanie w technologii zrekombinowanego DNA (patrz rys. że β-galaktozydaza zmienia laktozę w allolaktozę (sekcja 7. ) Po zużyciu laktozy nie ma już konieczności dalszej transkrypcji operonu lac. co prowadzi do zmniejszenia transkrypcji genów lacZ. ale nie może być metabolizowany. mRNA ulega gwałtownej degradacji (sekcja 7. Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) jest „niepotrzebnym" induktorem operonu lac. co stabilizuje połączenia regulator-operator [Reznikoff (1992) MM 6: 2419-2422]. Kilka cząsteczek enzymów.(a) Gdy nie ma induktora. 1. a zatem — do jego inaktywacji. Pojedynczy transkrypt mRNA zawiera kodon inicjujący i terminacyjny dla każdego z trzech genów — patrz sekcja 7. Na przykład.

6) dla genu rpml. co zapobiega translacji zarówno rpml. 2 Operony. że regulacja translacji jest związana z wytworzeniem „pseudosupła" na RNA przed genem rpml. L20 może po prostu blokować przyłączenie rybosomów do mRNA lub może samo wiązać rybosom. coli. z utworzeniem nieaktywnego kompleksu. położony między regionem kodującym peptyd wiodący a pierwszym genem strukturalnym. Translacja L35 i L20 jest hamowana przez L20. kodującą mały peptyd (peptyd wiodący) bogaty w reszty aminokwasu. w którym zamknięta jest sekwencja Shine-Dalgarno (sekcja 7. 2 Regulony i inne globalne i wielogenowe systemy Regulon jest systemem. (Patrz również sekcja 7. rpml. Kontrola atenuacyjna zachodzi w operonie his (histydynowym) E. 8. Hamujące działanie L20 wymaga związania się tego białka do mRNA przed genem rpml. Milet i Springer (1996) EMBO Journal 15: 4402-4413]. Operony kontrolowane w ten sposób zawierają początkową sekwencję nukleotydów w transkrypcie mRNA (sekwencję wiodącą). W ten sposób hamowane jest wiązanie rybosomów. 1. W tej sytuacji dalsze odcinki transkryptu mogą tworzyć strukturę drugorzędową w sposób wykluczający powstawanie atenuatora. w którym dwa lub więcej nie sąsiadujących genów i/lub operonów (każdy z własnym promotorem) kontrolowanych jest przez tę samą 136 . Być może. którego synteza związana jest z tym operonem. wtedy geny strukturalne mogą być transkrybowane. rplT) w E. gdy napotka kodony właściwe dla danego aminokwasu. W sekwencji lidera znajduje się również rho-niezależny terminator (sekcja 7. coli podlega negatywnej kontroli w promotorze oraz kontroli atenuacyjnej. L20 stabilizuje taki pseudosupeł. 3 Regulacja operonu przez kontrolę translacyjną Kontrola translacyjna zachodzi w operonie IF3-L35-L20 (odpowiednio geny infC. w których kontrolowany jest atenuator Operony te są związane z syntezą aminokwasów. ) 7. 8. coli.7. 6) i kodon inicjujący (sekcja 7. 3. Badania in vitro sugerują. to znaczy że wewnątrzkomórkowe stężenie L20 reguluje wyrażanie się genów. Jeżeli w komórce jest dostateczne stężenie danego aminokwasu (a więc zbyteczna jest jego synteza). biorąc udział w translacji świeżo utworzonego transkryptu). Jego duże stężenie hamuje translację. ponieważ rybosomy podążają w bliskiej odległości za polimerazą RNA. Przy niedostatecznym poziomie aminokwasu (a więc wymagana jest jego synteza) rybosom syntetyzujący peptyd wiodący „zatrzymuje się". Mechanizm hamowania — represji nie jest znany. 7. 8. 5) — atenuator. 6. Operon ten (transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka — policistronowy mRNA) koduje dwa białka rybosomowe (L35 i L20) oraz czynnik białkowy związany z syntezą białka (IF3 — czynnik inicjacji translacji). 1. Operon trp (tryptofanowy) E. Istnieje jednak wytłumaczenie alternatywne. jak rplT (Chiaruttini. transkrypcja zatrzymuje się w atenuatorze. (Peptyd wiodący może być syntetyzowany.

[Various roles of cyclic AMP in prokaryotes (artykuł przeglądowy): Botsford i Harman (1992) MR 56: 100-122. „rozpuszczalną". Badania operonów lac i gal sugerują jednak. 5'-cykliczny monofosforan adenozyny) jest syntetyzowany z ATP przez enzym cyklazę adenylanową. cAMP wiąże się z białkiem CRP (ang. ruchomą). gdy są one łatwiej dostępne. 8. rys. pozwalając na ich wyrażanie się w obecności właściwych induktorów. 5. że obecność cAMP-CRP nie jest konieczna po etapie wytworzenia produktywnego „otwartego kompleksu" (sekcja 7. 137 . nawet w obecności arabinozy. nawet. cAMP (3'.cząsteczkę regulatora. 4) udowadnia. cAMP receptor protein. drugi spotykany jest prawie wyłącznie w bakteriach gramdodatnich. catabolite activator protein) i aktywuje je. zwane również CAP. Molekularne podstawy represji katabolicznej były niejasne aż do ostatnich lat. 12). 4. 1). Jeden z mechanizmów jest właściwy dla E. Wszystkie geny/operony mają podobne sekwencje regulacyjne rozpoznawane przez regulator. niezależnie od mechanizmu. 8. 8. Powstanie sygnałów kontrolnych. że składnik IIA tej permeazy jest cząsteczką cytoplazmatyczną (tzn. jest związane z systemem transportu PTS (sekcja 5. Glukoza również hamuje operon ara (sekcja 7. ara i innych operonów. Należy zauważyć. Jest to zjawisko powszechne wśród bakterii. W organizmach tych główną cząsteczką regulacyjną jest składnik IIA permeazy glukozowej z systemu PTS (rys. 7. 7. Modele obu mechanizmów przedstawione są niżej. że indukcyjny wpływ allolaktozy jest zahamowany przez obecność glukozy. 2. Obecny pogląd zakłada istnienie przynajmniej dwóch różnych mechanizmów. ]. 2). których komórki zużywają niektóre substraty węglowe/energetyczne chętniej niż inne. Rozkład cAMP do AMP zachodzi z udziałem fosfodiesterazy cAMP. To są tylko dwa przykłady represji katabolicznej („efektu glukozowego"). W nieobecności glukozy fosforylowana forma IIA (IIA~P) nie jest defosforylowana przez IIB. Kompleks cAMP-CRP działa jak transkrypcyjny aktywator: wiąże się do promotora operonu lac. 11). 1. 5). 1 Represja kataboliczna Wzrost dwufazowy (sekcja 3. coli i innych bakterii jelitowych. tzn. Dokładny mechanizm aktywacji transkrypcji przez cAMP-CRP nadal nie jest znany. 12). ang. W tych warunkach IIA-P aktywuje cyklazę adenylanową i w ten sposób stymuluje syntezę cyklicznego AMP (cAMP. a więc związek między cAMP-CRP i polimerazą RNA jest tylko przejściowy [Tagami i Aiba (1998) EMBO Journal 17: 1759-1767]. Represja kataboliczna w bakteriach jelitowych. że obecność laktozy niekoniecznie prowadzi do indukcji operonu lac (sekcja 7.

a więc opisane zjawisko nazywane jest wykluczeniem induktora. np. W obecności induktora i glukozy. Zasada działania systemu jest następująca. a więc białko regulatora nie jest hamowane. wyrażenie się operonu wymaga. Inne regulatory stymulują inicjację transkrypcji. które z białek PTS brało udział w fosforylacji. IIB~P przenosi grupę fosforanową raczej na cząsteczkę induktora niż do odpowiedniego miejsca PRD. co prowadzi do zahamowania ekspresji danego operonu. [PDR regulators (artykuł przeglądowy): Stulke i wsp. że białko regulatora jest nieaktywne. Każde białko regulatorowe ma dwie kopie miejsca specyficznej fosforylacji. Fosforylacja przez IIB prowadzi do inhibicji. że cukry te indukują odpowiadające im operony. Wobec jednoczesnego braku glukozy (lub innego łatwo rozkładanego źródła węgla). gdy jedno z miejsc PDR fosforylowane jest przez IIB-P. (1998) MM 28: 865-874. laktozy) w błonie. a więc operon nie jest wyrażany. W nieobecności induktora (substratu) składnik IIB danej permeazy jest fosforylowany i zdolny do przeniesienia grup fosforanowych do miejsca PRD w cząsteczce regulatora. W nieobecności β-glukozydów BglG jest fosforylowane (inaktywowane) przez składnik IIB białka BglF (permeazę β-glukozydową) i wtedy transkrypcja operonu bgl jest zablokowana. grupy fosforanowe z IIB-P i Hpr~P są zużywane do fosforylacji dwóch rodzajów cząsteczek wchodzących do komórki (tj. 5. Operon jest nieaktywny. salicyny. Niektóre z białek regulacyjnych zawierających miejsca PRD kontrolują operony działając jako antyterminatory zapobiegające przedwczesnej terminacji transkrypcji w strukturach RNA zwanych terminatorami. hamując ich pobranie. ale tylko przez Hpr~P (co zachodzi wyłącznie wtedy.W obecności glukozy niefosforylowany IIA wiąże się do permeaz różnych cukrów (np. zawierające miejsca PRD. 12). coli. coli operon bgl związany z katabolizmem β-glukozydów. induktora i glukozy). podlega regulacji przez białko nazywane BglG (antyterminator). a wtedy oba miejsca PRD w białku regulatora pozostają niefosforylowane. Hpr~P może fosforylować miejsce PRD w cząsteczce regulatora — w ten sposób stymulowane jest wyrażanie się danego operonu. PTS regulation domain). W obecności induktora. Kopie te nazywają się PRD (ang. Wiadomo. Każde miejsce PRD może być fosforylowane przez jeden z fosforylowanych pośredników systemu PTS: IIB lub Hpr (rys. gdy nie ma glukozy. ] 138 . W niektórych wypadkach mechanizm podobny do działającego w bakteriach gramdodatnich (patrz niżej) został wykryty w E. tj. że białko regulatora hamuje transkrypcję z odpowiadającego mu operonu. drugie zaś przez Hpr~P (brak induktora. aby jego regulator był fosforylowany. powoduje. którego aktywność zależy od jego fosforylacji oraz tego. Zgodnie z przedstawionym modelem. Represja kataboliczna w bakteriach gramdodatnich. W E. Brak stymulującej fosforylacji przez Hpr~P powoduje. brak glukozy) lub gdy oba miejsca nie są fosforylowane. Fosforylacja przez Hpr stymuluje transkrypcję. Transkrypcja niektórych katabolicznych operonów jest kontrolowana przez białko regulatora specyficznego dla danego operonu. a induktor jest obecny).

Aktywne RecA (oznaczone RecA*) funkcjonuje w sposób nie enzymatyczny jako koproteaza. RecA. gdy miejsce chi (χ) (sekcja 8. Uszkodzenie DNA powoduje aktywację białka RecA (mechanizm aktywacji nie jest znany). LexA. jest inaktywowane. W procesie tym RecA*. 1). zwiększyć aktywność naprawy DNA. co pozwala na kontynuację replikacji DNA (patrz część końcowa sekcji 7. W normalnych warunkach (DNA jest nieuszkodzony). UmuD' i UmuC. Dla każdego genu SOS miejsce wiązania LexA („SOS box") charakteryzuje konsensus 5'-CTGTN8ACAG-3' (Ns jest jakąkolwiek sekwencją złożoną z ośmiu nukleotydów). która ze względu na brak specyficzności tworzenia par zasad może wprowadzić niewłaściwą zasadę(y) do DNA. 3). 2. włączając tę zachodzącą z udziałem endonukleazy UvrABC (sekcja 7. 2 System SOS Ε. Produkt genu sulA należącego do systemu SOS hamuje tworzenie się septy (sekcja 3. 3) wymaga polimerazy III DNA. prawdopodobnie w formie dimeru. 8. Naprawa DNA. wpływać na metabolizm energetyczny i hamować restrykcję. dzięki swej aktywności koproteazy. Synteza ta (zwana syntezą „przez uszkodzenie") zachodzi z udziałem zmodyfikowanej polimerazy DNA (powstałej w wyniku indukcji systemu SOS). a LexA znowu hamuje system odpowiedzi SOS. że przecięcie LexA (i derepresja genów SOS) zachodzi szybciej. zjawisko to nazywamy mutagenezą SOS. 2. dimer pirymidynowy (dwie pirymidyny połączone kowalencyjnie). który bierze udział w mutagenezie SOS. Mechanizm powstawania mutacji w tym procesie nie jest znany. a w następstwie hamuje podział komórkowy. 2). 7. 7. która stymuluje autokatalityczne przecięcie LexA. Wyrażenie się systemu SOS może np. wiąże się w pobliżu promotorów genów SOS i hamuje ich transkrypcję. 2. W kontroli tej bierze udział białko LexA (produkt genu lexA). synteza DNA na nici matrycowej zawierającej miejsce pozbawione zasady (sekcja 7. 1) [SulA-FtsZ interaction: Huang. zatrzymać podział komórek. RecA. 1) znajduje się koło dwuniciowego przecięcia DNA. Wynik eksperymentu in vitro sugeruje. umożliwia autokatalityczne przecięcie UmuD. Pozwala to na wyrażenie się genów SOS. Błędna reperacja prowadzi nie tylko do naprawy DNA. Późniejsza naprawa uszkodzenia przez jego wycięcie i następująca po tym replikacja DNA prowadzi do mutacji. Komórki rosną wtedy w postaci filamentów nie mających sept. Cao i Luthenhaus (1996) JB 178: 5080-5085]. Model zakłada. co prowadzi do aktywacji RecA i przecięcia represora LexA [Anderson i Kowalczykowski (1998) Cell 95: 975-979]. 139 . coli System ten składa się z około 20 nie połączonych ze sobą genów wyrażających się. ale również do zwiększenia liczby mutacji (sekcja 8. Zahamowanie podziałów komórkowych jest fizjologicznie korzystne dla komórki — daje jej czas do reperacji uszkodzonego DNA. po naprawie uszkodzonego DNA. że obecność χ modyfikuje aktywność białek RecBCD i RecA. 1. ale zazwyczaj jest związany z reperacyjną syntezą DNA na nici matrycowej zawierającej „uszkodzenie" — np. In vitro.7. 1. przechodząca przez uszkodzenie. jest bardziej aktywna — geny uvrA i uvrB są składnikami systemu SOS. gdy DNA jest uszkodzony lub nie może się replikować w wyniku działania promieniowania ultrafioletowego lub niektórych związków chemicznych. z wytworzeniem aktywnego fragmentu UmuD'.

„downstream 140 . ustalonego poziomu — wyższego niż w niższej temperaturze. Proteaza Lon (produkt genu lori) degraduje uszkodzone i nietypowe białka. Indukowana temperaturą translacja mRNA rpoH jest związana ze zmianą „drugorzędowej struktury" mRNA powstałej w wyniku tworzenia par zasad między regionem znajdującym się zaraz za kodonem startu (ang. a więc powoduje zwiększoną syntezę białek HSP. 2. coli zwalczają uszkodzenia powodowane przez stres. osiągając maksimum w ciągu minut. Bahassi i van Helden (1998) TIM 6: 269-275]. Może być również indukowana przez takie czynniki stresowe jak promieniowanie ultrafioletowe. kwas nalidyksowy) i toksynę CcdB kodowaną przez plazmid F [Couturier. GroEL i DnaK (sekcja 7. rpoD i lysU. 1). 6) zapobiegają nieprawidłowemu zwinięciu białek i agregacji białek nie zwiniętych. a następnie maleje do nowego. Niektóre z 17 białek szoku cieplnego E. W tych warunkach populacja bakteryjna będzie czerpać niewątpliwe korzyści z wydajnej naprawy DNA. przez antybiotyki chinolonowe (np. białka opiekuńcze (molekularne chaperony) GroES. białek szoku cieplnego (HSPs. 8. Znajduje to odzwierciedlenie w lepszej zdolności do naprawy DNA. ang. heat-shock proteins). 3 Odpowiedź na szok cieplny Szok cieplny (nagłe podwyższenie temperatury) prowadzi do charakterystycznej odpowiedzi adaptacyjnej w różnych organizmach. Obniżenie restrykcji zwiększa również możliwość wykorzystania obcego DNA. W E. który jest (przejściowo) syntetyzowany w większej ilości po szoku cieplnym. RpoH to czynnik sigma (sekcja 7. Na przykład. 11. σ 32 . Może się również adaptować przez częstsze powstanie kombinacji genowych zwiększających zdolność do przeżycia. System SOS może być indukowany np. Przykładem innych białek opiekuńczych są produkty genów dna]. który został wprowadzony do komórki. genetyczna odpowiedź na niesprzyjające/inhibicyjne czynniki. niż ze zwiększonej transkrypcji rpoH). jak również w mutagenezie SOS prowadzącej do powstania korzystnych (ale również letalnych) mutacji. 5). że wyrażenie się systemu SOS aktywuje lizę bakterii lizogennych (patrz sekcja 9. Czynnik σ32 pozwala na bardziej wydajną transkrypcję z promotorów genów HSP. Główna funkcja systemu SOS może być określona jako adaptacyjna. etanol i wewnątrzkomórkowe nagromadzenie nieprawidłowych.Należy nadmienić. 7. Wzrost stężenia σ32 po szoku cieplnym wynika głównie ze zwiększonej translacji i stabilizacji (raczej. 5. 4 (d)). W wyniku podwyższenia temperatury synteza HSPs szybko zwiększa się. od bakterii do roślin i zwierząt. Odpowiedź ta związana jest ze wzrostem syntezy tzw. sekcja 8. heterologicznych białek (co może wynikać z ich nadprodukcji. coli odpowiedź na szok cieplny następuje po podwyższeniu temperatury od 30°C do 42°C. U E. coli kontrola regulonu szoku cieplnego jest związana z produktem genu rpoH (poprzednio nazywanego htpR). 2. Zahamowanie podziałów komórkowych może natomiast pomóc w oszczędzaniu energii i wykluczyć komórki potomne niezdolne do życia.

obejmujących CIRCE i czynnik podobny do σ32 [Narberhaus i wsp. U niektórych bakterii indukcja odpowiedzi na szok cieplny regulowana jest przez odmienne mechanizmy. a efekt ten jest zniesiony podczas szoku cieplnego [Yuzawa i wsp. 2) i innym regionem w sekwencji kodującej. że translacja σ rzeczywiście jest indukowana 32 wpływem temperatury na σ mRNA. a później znowu zostaje wznowiony (ale z mniejszą szybkością) po fazie zastoju trwającej około 4 godzin. w pewnych wypadkach sekwencja regulacyjna umiejscowiona jest za genami szoku cieplnego. 2. DnaJ i GrpE. hamuje transkrypcję w zwykłych. którego istnienie zostało stwierdzone w Bacillus. Na przykład. 5337-5346]. controlling inverted repeat of chaperone expression). zazwyczaj. Szok zimna charakteryzuje się między innymi: 1) indukcją /wzmożoną syntezą białek szoku zimna. ale wówczas ma krótki okres półtrwania (około 1 min) i tworzy połączenia z DnaK. (1996) EMBO Journal 15: 607-617]. 2) nieprzerwaną syntezą niektórych białek związanych z translacją (mimo ogólnego zablokowania syntezy białka). w następstwie czego jest degradowany przez proteazę FtsH. U E. Do białek szoku zimna zalicza się CspA — małe białko. Clostridium i w pewnych bakteriach gramujemnych. Szok cieplny w innych bakteriach. Faza zastoju jest spowodowana wybiórczym zahamowaniem translacji. (1993) Ν AR 21: 5449-5455]. Podwyższona temperatura destabilizuje strukturę drugorzędową. Wzrost zatrzymuje się. zgodnie z którą białko represora. Kontrola u Bradyrhizobium japonicum składa się z co najmniej dwóch różnych regulujących systemów. a wznowienie wzrostu jest jednoczesne ze wznowieniem syntezy białka. Wyżej przedstawiono ustalony pogląd na regulację bakteryjnych genów szoku cieplnego. 3) represją białek szoku cieplnego. 32 Czynnik σ jest syntetyzowany również w niższej temperaturze. fizjologicznych warunkach [Norberhaus (1999) MM 31: 1-8]. 8. które jest indukowane (natychmiast po obniżeniu się temperatury) na 141 . gdy temperatura obniży się z 37°C do 10°C (lub. co w rezultacie prowadzi do zwiększonej syntezy HSP [patrz np. funkcjonować jako czynnik σ. 11. złożone z 70 aminokwasów. 5. Gamer i wsp. 32 Ostatnie badania wskazują. Uważa się. a więc sam mRNA może odgrywać rolę sensora tempe32 ratury (= termometru RNA) dla wyrażenia się σ [Storz (1999) GD 13. (1996) JB 178. Niedawno doniesiono o istnieniu negatywnej regulacji. 633-636]. 4 Odpowiedź na szok zimna Gwałtowne obniżenie temperatury może powodować zmianę w wyrażaniu się genów u Prokaryota i Eukaryota. 7. że jest to odpowiedź adaptacyjna. spadek przekracza 13°C). Odpowiedź na szok zimna następuje. że ta drugorzędowa struktura hamuje translację w zwykłych warunkach. 32 Związanie DnaK pozwala σ. coli zjawisko to nazywane jest szokiem zimna. w połączeniu z działającą w pozycji cis sekwencją DNA.box" — patrz sekcja 8. Podczas szoku cieplnego DnaK wiąże się preferencyjnie ze zdenaturowanymi białkami. Sadzi się. Jest to odwrócone powtórzenie sekwencji zwane CIRCE (ang.

Odpowiedź jest spowodowana obecnością nie aminoacylowanego tRNA w miejscu A rybosomu (patrz rys. czego następstwem jest indukcja odpowiedzi na szok zimna [Jones i Inouye (1994) MM 11: 811-818]. mogą pełnić rolę regulacyjną. 9). czynnik odpowiedzi ścisłej). ponieważ białko to jest normalnie produkowane przez E. produkt genu relA. ppGpp i pppGpp (G — reszta guanozynowa. antybiotyki takie jak chloramfenikol. 2. Hou i Inouye (1997) JBC 272: 196-202]. (Samo białko CspA jest regulowane prawdopodobnie przez represor. Białko to. pirofosfotransferazę (= RelA. NusA funkcjonujące na etapie terminacji transkrypcji i podjednostkę α gyrazy DNA (topoizomerazy — sekcja 7. W rzeczywistości rola CspA może nie być ograniczona do niskiej temperatury. Prawdopodobnie działa ono jako: 1) aktywator translacji w niskiej temperaturze. Nie jest znany sposób regulacji genów szoku zimna. funkcjonuje w połączeniu z kwasami nukleinowymi. 2. Jak dotychczas. 5 Odpowiedź ścisła Głodzenie (np. 8. który traci aktywność w niskich temperaturach). co sugeruje. ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny) jest przykładem alarmonu. w warunkach niestresowych) [Brandi i wsp. że wspólny czynnik — zmniejszenie zdolności komórki do translacji — może pełnić ważną rolę w odpowiedzi na szok zimna. brak ważnego aminokwasu) wywołuje u bakterii odpowiedź ścisłą — polegającą na zmniejszeniu syntezy białek. Sugeruje się regulacyjną rolę CspA w aktywacji transkrypcji. Czynniki te (wiele z nich również zmniejsza stężenie (p)ppGpp) wywierają wpływ podobny jak obniżenie temperatury. coli podczas wczesnej fazy wzrostu wykładniczego w 37°C (tj. Spadek temperatury jest związany ze wzrostem syntezy niektórych białek szoku zimna. być może. Zgodnie z jednym z modeli. która gromadzi się w warunkach stresu i stanowi sygnał do zmiany metabolizmu komórkowego. małej cząsteczki. który uczestniczy w wiązaniu N-formylometionylo-tRNA do podjednostki rybosomu 30S w momencie startu translacji (sekcja 7. Drobne cząsteczki. co powoduje. (1999) EMBO Journal 18: 1653-1659]. 142 . 6). rRNA i różnych innych składników komórkowych oraz na zahamowaniu syntezy DNA. że może być ono istotne w translacji RNA w niskiej temperaturze [Jiang. 2) białko pomocnicze (dla RNA) działające w niskiej temperaturze. To stymuluje związany z rybosomem enzym. 1). erytromycyna i tetracyklina. Odpowiedź szoku zimna może być również wywołana przez niektóre inhibitory translacji. Stan ten sygnalizuje zmniejszenie stężenia (p)ppGpp. Do białek szoku zimna zaliczamy: RecA — inicjujący czynnik 2 (IF-2). obniżenie się temperatury powoduje.poziomie translacji. Po obniżeniu temperatury stężenie tych cząsteczek zmniejsza się. ρ — fosforan) z GTP (lub GDP) i ATP. i 3) czynnik hamujący translację określonych cząsteczek mRNA. zapobiegające tworzeniu się drugorzędowych struktur RNA. ρ — reszta fosforanowa). do syntezy ppGpp (G — guanozyna. nie wykryto indukowanych zimnem czynników σ. Odpowiedź ta pozwala oszczędzać energię i budulec. 7. że zdolność translacyjna komórki staje się zbyt mała w porównaniu z ilością aminoacylowanych tRNA (jest to stan przypominający obecność zbyt dużej ilości pokarmu). np. 7.

acid tolerance response) związaną z syntezą tzw. ang. 3. Wyrażenie się genów ASP kontrolują dwa białka regulacyjne: czynnik sigma σs (RpoS. mówimy. (Wyrażanie się tych genów. ppGpp może z pewnością zwiększać transkrypcję niektórych operonów związanych z biosyntezą określonych aminokwasów (np. co prowadzi do zablokowania wiązania kompleksu tRNA do rybosomu. 5). Powstająca pmf służy do syntezy ATP przez 143 . U Salmonella typhimurium odpowiedź ta jest procesem dwuetapowym [Foster (1991) JB 173: 6896-6902].ppGpp może hamować rozpoczęcie syntezy białek. że ppGpp hamuje zarówno syntezę białka. przez oddziaływanie z białkowym. y-Aminomaślan jest następnie eksportowany (przez transporter). Sądzi się. U Salmonella typhimurium i w innych patogenach przewodu pokarmowego adaptacja i przeżycie w niskim pH jest istotne dla ich chorobotwórczości. 7. gadB i gadC. histydyny). Inny model proponuje. produkt genu rpoS) i białko Fur (produkt genu fur). W komórkach z mutacją relA. zwiększenie syntezy ppGpp pozwala odzyskać równowagę przez zwolnienie syntezy białka i stymulację operonu his. jak również zwiększa przeżycie w niskim pH. W ten sposób ppGpp pomaga utrzymać właściwą równowagę ilości aminokwasów w komórce. Na przykład. Zarówno synteza. aby wywołać odpowiedź ścisłą. ponieważ infekcja następuje zazwyczaj przez żołądek (bardzo kwaśne środowisko). acid-shock proteins). jednak rola tego białka w ATR i w pobieraniu żelaza jest fizjologicznie i genetycznie odmienna [Hali i Foster (1996) JB 178: 5683-5691]. 6 Odpowiedź prowadząca do tolerancji na zakwaszenie Szok kwasowy wywołuje odpowiedź (ATR. komórki mogą przeżyć nawet w pH 3. niskim pH. Wykazano. typhimurium (sekcja 11. jeśli poziom histydyny jest dostatecznie niski. jak i rRNA [Svitil. jak i zahamowanie syntezy białek komórkowych zachodzi w stadium poprzedzającym szok (pH około 6). 2. że GadB i GadC są składnikami energotwórczego systemu dzięki swojej zdolności do transportu protonów. białek szoku kwasowego (ASPs. 8. coli szok kwasowy (lub brak tlenu) indukuje wyrażanie się genów kodujących: dekarboksylazę glutaminianową i hipotetyczny system transportu y-aminomaślanu (produktu dekarboksylacji glutaminianu) przez błony. kontroluje część genów ASP. jest regulowane przez czynnik σs Jeden z modeli zakłada. a to pozwala utrzymać równowagę pH. RpoS. które reguluje geny ASP niezależnie od (σs Co ciekawe. np. samo indukowane podczas odpowiedzi na szok kwasowy. inicjującym czynnikiem IF-2. W komórkach E. całkowicie znoszącą funkcje genu. Mutanty nie posiadające funkcji (σs mogą nadal częściowo odpowiadać na ten szok wskutek aktywności białka Fur. że odpowiedź ta pozwala naprawić uszkodzenia powodowane obecnością kwasów. 5. nie obserwuje się odpowiedzi ścisłej po głodzeniu aminokwasowym. typhimurium syntetyzuje przynajmniej 50 białek. Po zwiększeniu kwasowości środowiska S. Cashel i Zyskind (1993) JBC 268: 2307-2311]. że glutaminian jest pobierany i dekarboksylowany w reakcji zużywającej proton. że mutanty te są zrelaksowane. Fur reguluje również funkcje związane z pobieraniem żelaza przez S. a później w określonym. ang.

5) kodowanego przez geny klasy II. coli najwcześniej wyrażane geny (geny klasy I) kodują pewne aktywatory transkrypcji. [Possible function of gadCB products: Smali i Watreman (1998) TIM 6: 214-216]. Transkrypcja genów klasy III zależy od czynnika σ (sekcja 7. Jak widać. co znajduje odzwierciedlenie w kolejności wyrażania się odpowiadających im genów. 7. produkt genu fliA) jest przejściowo inaktywowany przez czynnik anty-σ (FglM. gdy zostanie zakończone składanie ciałka podstawowego i haka. Czynnik σ (białko FliA. co pozwala na aktywację transkrypcji genów klasy III przez FliA. 144 . rys. Genetyczna kontrola składania rzęski była opisana w przeglądowej pracy Shapiro [(1995) Cell 80: 525-527]. Składanie jest wysoce zorganizowane — poszczególne części dodawane są w ściśle określonym porządku. Zakończenie składania haka stanowi sygnał umożliwiający wydalenie FglM z komórki (przez kanał osiowy). 2. 1.ATPazę zlokalizowaną w błonie. geny kodujące ostami etap konstrukcji rzęski są kontrolowane bezpośrednio przez stan złożenia jej poprzednich części. które są prawdopodobnie potrzebne do wyrażania się genów kodujących części składowe ciałka podstawowego i haka. flagellinę). W E. 2. 3. 7 Składanie bakteryjnej rzęski Struktura i składanie rzęski (sekcja 2. produkt genu flgM) do czasu. Niektóre z istotnych genów są wymienione w tabeli 7. 14. 8) wymaga około 50 różnych typów białek. 2. 8. Wyrażenie się genów klasy I i II konieczne jest do wyrażenia się genów klasy III (do ich produktów zalicza się białko budujące podjednostki włókna.

AlpC jest podjednostką hydroperoksydazy alkilowej. Wewnątrzkomórkowa. co sugeruje istnienie dodatkowych miejsc działania antybiotyku. a tym samym aktywne białko OxyR umożliwia transkrypcję genów katG.7. KatG (katalaza) katalizuje reakcję 2H 2 O 2 -» 2H2O + O2. 5. 8. enzymu degradującego nadtlenki organiczne. W ten sposób nadmiar żelaza (przeciążenie komórki żelazem) w E. Do nich zalicza się dysmutazę ponadtlenkową (SOD. Czynniki związane ze stresem tlenowym wpływają również na wrażliwość M. ang. W innym regulonie indukowane. białkami i tłuszczami. włączając KatG. tuberculosis na ważny przeciwgruźliczy lek — izoniazyd. zawierające mangan białko SOD (produkt genu sodA) jest pozytywnie regulowane (w obecności nadtlenku) przez produkty genów soxR/soxS. rodnik hydroksylowy (·ΟΗ) czy ponadtlenek (-O2-). 3 Rekombinacyjna regulacja wyrażania się genów Patrz — zlokalizowana rekombinacja (sekcja 8. mechanizm tej regulacji nie jest znany. 8. 7. że niedobór żelaza może również wywołać stres tlenowy — być może przez obniżoną aktywność przeciwutleniających enzymów zawierających hem. Kontrola stresu tlenowego u mikobakterii jest słabiej poznana. Reaktywne formy tlenu wchodzą w reakcję z kwasami nukleinowymi. w wyniku nieprawidłowej regulacji metabolizmu żelaza. Utlenione. 2. stresem tlenowym i wrażliwością na izoniazyd nie są w pełni wyjaśnione [Dussurget i Smith (1998) TIM 6: 354-358]. 4. U E. Niektóre utleniające enzymy. takie jak nadtlenek wodoru (H2O2). kwasów mikolowych. Mutanty katG i ahpC charakteryzują się zwiększoną opornością na izoniazyd. Należy podkreślić. 8 Odpowiedź na stres tlenowy W pewnych warunkach bakterie mogą być uszkodzone lub zabite przez zewnętrzne lub wewnętrzne reaktywne formy tlenu (ROS. Bakterie patogenne są narażone na reaktywne formy tlenu w fagolizosomie (sekcja 11. Wewnątrzkomórkowe. zależna od obecności nadtlenków aktywność KatG zmienia izoniazyd w formę aktywną. reaktywne formy tlenu mogą powstawać np. U prądków wzajemne związki między regulacją żelaza. coli może katalizować powstanie rodników hydroksylowych z nadtlenku wodoru (reakcja Fentona) [Touati i wsp. tuberculosis. występują w Mycobacterium tuberculosis. 1). 5) prawdopodobnie zdolne jest także do pozytywnej regulacji niektórych enzymów przeciwutleniających. ale tylko nieaktywna forma genu pokrewnego oxyR została opisana w grupie M. 2. która hamuje enzymatyczny etap(y) syntezy ważnych składników ściany komórkowej. coli jeden z regulonów stresu tlenowego kontrolowany jest przez białko OxyR. Bakterie nie posiadające tych kwasów są również wrażliwe na izoniazyd. ahpC i innych. która degraduje ponadtlenek do H 2 O 2 . oraz katalazę i peroksydazę degradujące nadtlenki. Białko IdeR negatywnie regulujące syntezę syderoforów (sekcja 11. Niektóre bakterie odpowiadają na stres tlenowy przez zwiększenie syntezy enzymów przeciwutleniających. 145 . (1995) JB 177: 2305-2314]. reactive oxygen species). ang. supweoxide dismutase). 2).

5 Regulacyjna rola translacyjnej atenuacji w wyrażaniu się genów U niektórych gramdodatnich bakterii obecność chloramfenikolu (sekcja 15. ale nie ulega translacji. policistronowy mRNA). konieczną do syntezy pirymidyn. Przyczyną tego zjawiska jest. niektóre sekwencje trwają dłużej niż inne. tzn. Co ciekawe. Większość transkryptów pyrC syntetyzowanych w obecności dostatecznej ilości pirymidyn umożliwia parowanie się RNA-RNA w regionie sekwencji Shine-Dalgarno. Rozpoczęcie transkrypcji w określonym nukleotydzie zależy od dostępności pirymidyn w komórce (sensorem. Specjalne regiony stymulujące i hamujące rozpad policistronowego mRNA mogą być odpowiedzialne za obserwowaną różną szybkość rozpadu [Klug (1993) MM 9: 1-7]. Dlaczego translacja cat nie jest hamowana przez chloramfenikol (który hamuje syntezę białka)? Do indukcji cat wystarcza mniejsze stężenie chloramfenikolu niż jest konieczne do zahamowania syntezy białka. W ten sposób. 4. Transkrypt genu cat zawiera krótką sekwencję wiodącą. czyli czujnikiem jest stosunek CTP/GTP). 4) indukuje gen cat. (Przykład policistronowego mRNA był pokazany na rys. umożliwiając optymalną fotosyntezę i wzrost komórek. Regulacyjną rolę w indukowanej oporności na chloramfenikol pełni proces zwany translacyjną atenuacją. a w konsekwencji pozwala na translację sekwencji kodującej cat. co 146 . po której (w tym samym transkrypcie) następuje sekwencja kodująca cat. odpowiednie geny wyrażane są we właściwym czasie. „rozpad" oznacza enzymatyczną degradację (sekcja 7. 6. coli. Rogers i Lovett [(1993) JB 175: 5309-5313]. 1). Gen ten koduje acetylotransferazę chloramfenikolową — enzym. Taka regulacja była badana między innymi w operonie puf fotosyntetyzującej bakterii Rhodobacter capsulatus. różne części policistronowego puf mRNA rozpadają się z różną szybkością. co powoduje naprawę „zniekształconego" miejsca cat wiążącego rybosomy. który acetyluje chloramfenikol i inaktywuje go. 8. Transkrypcja pyrC może się rozpocząć w jakimkolwiek z kilku przyległych nukleotydów na matrycy DNA. a co za tym idzie kwasów nukleinowych. Geny puf (kodujące składniki aparatu fotosyntezy) są transkrybowane wspólnie jako pojedynczy transkrypt (tj. 4 Regulacja wyrażania się genów związana z szybkością rozpadu mRNA W niektórych przypadkach wyrażanie się bakteryjnych genów jest regulowane przez szybkość rozpadu odpowiadających im mRNA.7. 11). W nieobecności chloramfenikolu gen cat jest transkrybowany. Sekwencja wiodąca jednak (która ma własne miejsce wiązania rybosomów) ulega niezakłóconej translacji. ponieważ miejsce wiązania rybosomów jest „zniekształcone" przez miejscowe tworzenie się par zasad między rybonukleotydami. W obecności chloramfenikolu. 7. być może. udział samego peptydu wiodącego (jak również chloramfenikolu) w zatrzymaniu rybosomów [Gu. Gen ten koduje enzym. 7. dihydroorotazę. rybosomy zaangażowane w translację sekwencji wiodącej zostają zatrzymane. Inny przykład translacyjnej atenuacji stanowi regulacja genu pyrC w E. 8.

6). co stymuluje sensorową kinazę KdpD w błonie cytoplazmatycznej. EnvZ przenosi grupę fosforanową na białko regulacyjne. włączając syntezę czynników wirulencji u bakterii patogennych. regulując jej aktywność. 6 Regulacja wyrażenia się genów przez przekazanie sygnału Bakterie mogą wykryć wiele sygnałów środowiskowych (takich jak zmiany osmolalności) przez systemy sensorów zlokalizowanych w osłonie komórki. OmpR. 7. System ten (związany z błoną cytoplazmatyczną) składa się z kompleksu białek Kdp A. 8. które wówczas powoduje wzrost transkrypcji genu kodującego porynę OmpC (sekcja 2. Na przykład. 1. KdpB i KdpC (kodowanych przez operon kdp ABC). składników wyspy patogenności SPI-2. Po aktywacji. 147 . Na przykład. i w ten sposób wywołać odpowiedź na sygnał środowiskowy [Histidine kinases and signal transduction (artykuł przeglądowy): Alex i Simon (1994) TIG 10: 133-138]. Wzrost ciśnienia osmotycznego w E. jeśli osmolalność jest wysoka. Dwuskładnikowe systemy regulują wiele aktywności komórkowych. wykluczające tworzenie się par zasad. 2) i hamuje transkrypcję genu kodującego porynę OmpF. W obecności odpowiednich sygnałów środowiskowych. (Patrz również sekcja 10. Kdp. u Clostridium perfringens dwuskładnikowy system reguluje geny kodujące toksyny i odpowiedzialne za zgorzel gazową [Cheng i Rood (1997) RMM 8 (supplement 1): S25-S27]. charakteryzyjącego się dużym powinowactwem. 8) — np. Pierwszym składnikiem tego systemu jest kinaza histydynowa. która hydrolizuje ATP dostarczając energii do pobrania K+. coli zwiększenie osmolalności stymuluje aktywność kinazową sensora. co umożliwia syntezę enzymu. W obrębie komórki sygnały te działają po przekazaniu ich przez dwuskładnikowe systemy regulacyjne. np. KdpD przenosi grupy fosforanowe na KdpE — cytosolowy regulator białkowy zwiększający translację operonu. kinaza histydynowa przenosi fosforan na resztę asparaginianową drugiego składnika tego systemu — białka regulatora (odpowiadającego na sygnał). błona zewnętrzna zawiera więcej OmpC (które tworzy nieco mniejsze pory) niż OmpF. EnvZ. przez kontrolę ich transkrypcji. enzym. 9. białko regulatora może zmienić wyrażanie się niektórych genów. u E. Wyrażanie się operonu kdp jest zwiększone przy małym turgorze. których produkty są potrzebne do wewnątrzkomórkowego wzrostu patogena [Cirillo i wsp. Po fosforylacji. U Salmonella typhimurium system SSrA-SsrB reguluje transkrypcję genów. Kiedy poziom pirymidyn jest niski. który zdolny jest do ATP-zależnej autofosforylacji (w miejscu aktywnym zawierającym histydynę) i do przeniesienia reszty fosforanowej na inną cząsteczkę. umiejscowionego w osłonach komórkowych. (1998) MM 30: 175-188]. 1. coli prowadzi również do zwiększenia pobierania jonów potasowych ze środowiska (sekcja 3. Co za tym idzie. a więc kinaza jest sensorem. KdpB jest ATPazą. W niektórych wypadkach sygnał środowiskowy działa bezpośrednio na kinazę. na drodze indukowanego systemu transportu.blokuje związanie się rybosomów i wyrażanie się genów. 2. większość transkryptów ma odmienne miejsce startu. 2 i zwijanie białek w sekcji 7.

gdy stężenie wapnia zmniejszy się poniżej 2 μΜ. że zajście sporulacji zależy od wyniku zmagań między kinazami (pobudzającymi sporulację) a fosfatazami (hamującymi sporulację) [Perego (1998) TIM 6: 366-370]. sytuacja taka istnieje w szlaku chemotaksji E. A więc. 3. coli (patrz rys. czy utrzymać wzrost wegetatywny charakteryzujący się niskim poziomem metabolizmu. na drodze pośredniej. zarówno zewnętrznych. 13). 1 Początek tworzenia endospory u Bacillus subtilis Kiedy wzrost zaczyna być ograniczony z powodu niedoboru substancji pokarmowych. że sporulacja jest etapem bardzo ważnym. który reguluje aktywność kinazy. 14. Oczywiste jest. Wewnątrzkomórkowe stężenie Spo0A~P jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem w podjęciu wyboru między sporulacją a kontynuacją wzrostu wegetatywnego. przez wybiórczą defosforylację Spo0F~P. że rdzeń endospory zawiera duże ilości dipikolinianu wapnia (sekcja 4. Sygnały cząsteczkowe wykrywane są przez sensor.W niektórych wypadkach sensor (= receptor) i kinaza są różnymi cząsteczkami. Spo0F działa więc jako pierwszy łącznik przekazujący sygnały z różnych wewnętrznych i zewnętrznych źródeł. 1). 8. 7. nie pokazane na rysunku. pochodzącego ze środowiska zewnętrznego lub wewnętrznego. U B. jeśli sporulacja zaczęłaby się przy niedostatecznym stężeniu wapnia. Sygnały pobudzające sporulację są rozpoznawane przez przynajmniej dwa białkowe sensory: kinazę A (KinA) i kinazę Β (KinB). jak i wewnętrznych. subtilis przeniesienie sygnału podczas rozpoczęcia sporulacji związane jest z transferem fosforu (patrz sekcja 7. 6. 14). 7. Fosforylowana (tj. 7. Na przykład. a zanim ostateczna decyzja zostanie podjęta. 7. Przeciwnie. (W zrozumieniu znaczenia tego ograniczenia pomoże przypomnienie faktu. w czasie którego jednocześnie obserwuje się funkcje związane ze wzrostem i z przeżyciem [Transition state in B. same również podlegają regulacji (na poziomie transkrypcji) zależnej od fizjologicznego stanu komórki. W dalszych etapach transferu fosforu zachodzi fosforylacja białek Spo0B i Spo0A. Podczas procesu dostosowywania się do nowych warunków geny są indukowane i hamowane. Nie są znane sygnały aktywujące te kinazy. wydaje się. Na przykład. jednym z ważnych sygnałów jest stężenie wapnia — sporulacja jest zahamowana. czy rozpocząć sporulację. komórka musi zebrać i „zinterpretować" sygnały pochodzące z różnych źródeł. Spo0A~P jest regulowane negatywnie (defosforylowane) przez fosfatazę Spo0E. Inne fosfatazy. Po odebraniu odpowiedniego sygnału. RapA i RapB. aktywna) forma Spo0A oznaczona jest jako Spo0A~P. 14). subtilis (artykuł przeglądowy): Strauch (1993) PNARMB 46: 121-153]. 6. Jak pokazano na rysunku 7. W tym czasie zapada decyzja. 1 i rys. Nie obserwuje się gwałtownego przejścia od aktywnego wzrostu do aktywnej sporulacji. kiedy kinaza kontroluje dwa różne białka regulacyjne. 8. subtilis przestawia swój metabolizm. proces mógłby zostać przerwany w stadium pośrednim). Fosfatazy te. są także pomocne w regulacji stężenia Spo0A~P. 148 . kinazy ulegają ATP-zależnej autofosforylacji i przenoszą grupy fosforanowe na białko Spo0F — pierwszy składnik systemu transferu fosforu (rys. po wzroście wykładniczym (faza log) następuje okres przejściowy. B.

Zmiana ramki odczytu może również znieść działanie istniejącego kodonu kończącego translację. ] 7. Dam-metylacja w promotorze genu kodującego transpozazę na transpozonie Tn10 (transpozycja: sekcja 8. 8 Metylacja DNA jako mechanizm kontrolny Poreplikacyjna metylacja DNA (modyfikacja: sekcja 7. W ten sposób transpozycja Tnl0 jest zahamowana podczas replikacji DNA (a więc jest połączona z cyklem komórkowym). co powoduje przedwczesne zakończenie translacji (i utworzenie krótszego polipeptydu). 9e). natomiast nie zachodzi (kodon kończący translację nadal funkcjonuje). Jeżeli taka Dam-metylacja nastąpi w promotorze. 2. 3) hamuje syntezę transpozazy. 8. Zmiana ramki odczytu może prowadzić do powstania nowego kodonu nonsensownego. Oczywiście. [Translational frame-shifting (artykuł przeglądowy): Engelberg-Kulka i Schoulaker-Schwarz (1994) MM 11: 3-8. 4) chroni chromosom przed własnymi enzymami komórkowymi. coli metylaza Dam (kodowana przez gen dam) metyluje adeninę w pozycji N-6 w sekwencji 5'-GATC-3'. 8. Zmiana ramki odczytu jest potencjalnym mechanizmem powodującym powstanie nowych białek powierzchniowych. 8.7. gdy ilość polipeptydu jest wystarczająca. U E. Zazwyczaj jest to przesunięcie „+1" (przesunięcie do przodu. 1b). Określona sekwencja nukleotydów powoduje „przesunięcie się" rybosomów na transkrypcie. takie przesunięcie wpływa na wszystkie następne kodony transkryptu (porównaj z mutacjami prowadzącymi do zmiany ramki odczytu. ale przed zajściem metylacji DNA. 5. że po replikacji miejsce origin chromosomu (oriC) pozostaje początkowo przez jakiś czas hemimetylowane (tzn. rys. 1). W czasie replikacji DNA zahamowanie to jest przejściowo znoszone. w konsekwencji może to wpłynąć na wyrażanie się niektórych genów. gdy ilość polipeptydu jest mała. natychmiast po przejściu widełek replikacyjnych przez gen transpozazy (rys 7. 3). przeciwnie do kierunku transkrypcji). a w związku z tym przez większą część cyklu życiowego hamuje transpozycję (wbudowanego w chromosom) Tn10. 7. zgodnie z kierunkiem transkrypcji) albo „-1" (przesunięcie do tyłu. 8). tylko jedna nić jest metylowana). 7 Regulacja wyrażania się genów przez zmianę ramki odczytu Czasami synteza (lub skład) polipeptydu są regulowane na poziomie translacji (rys. a to prowadzi do zmienności antygenowej (sekcja 11. Sugeruje się. że zmiana ramki odczytu prowadząca do translacji całego transkryptu zachodzi. Znany jest wypadek. 149 . Na przykład. Czas potrzebny do metylacji drugiej nici (co jest konieczne dla funkcjonalności oriC) może pełnić rolę czynnika regulującego inicjację replikacji chromosomu podczas cyklu komórkowego (sekcja 3.

150 . na przykład. ryboza i niektóre inne cukry najpierw tworzą kompleks z pewnymi białkami peryplazmatycznymi.(a) Receptory — nazywane chemotaktycznymi białkami przyjmującymi grupę metylową (MCPs. Istnieją różne typy MCP. Związanie/uwolnienie chemoreceptorów z/od białek MCP reguluje wewnątrzkomórkowy sygnał kontrolujący częstość koziołkowania. tar. które są kodowane przez geny lap. ale. a każdy z nich rozpoznaje własny zasięg chemoefektorów/bodźców środowiskowych. asparaginian. W komórce istnieje kilkaset MCP. trg i tsr. Niektóre chemoefektory (np. a dopiero potem się wiążą. seryna) wiążą się bezpośrednio do MCPs. zaś ich regiony funkcjonalne znajdują się w peryplazmie i cytoplazmie. ang. metyl-accepting chemotaxis proteins) występują w błonie cytoplazmatycznej.

Cytoplazmatyczna strona MCP podlega metylacji przez metylotransferazę CheR. Kontrola chemotaksji jest tematem artykułu przeglądowego Eisenbacha [(1996) MM 20: 903-910]. (1998) EMBO Journal 17: 4238-4248]. W wiązaniu uczestniczy CheW.7. 7. 2. Po ponownym zmniejszeniu stężenia. W momencie zwiększenia stężenia Catr wiąże się do MCP. indukowany przez określone warunki stresowe. że stopień metylacji MCP w zaadaptowanych komórkach odzwierciedla wewnątrzkomórkowe stężenie chemoatraktanta. prowadzi do wyrażenia się określonych genów. 14). 3) i cf (produkt genu rpoS. Trzeba zauważyć. W niektórych wypadkach warunki stresowe (szok cieplny dla σ32 i np. a następnie rozważmy. Aktywność CheB zwiększa się po jego fosforylacji przez CheA. umożliwiając zwiększenie metylacji MCP. uwolnienie Catr stymuluje CheA i ułatwia rotację zgodną z ruchem wskazówek zegara (częstsze koziołkowanie). σΗ (produkt genu spo0H. CheA jest kinaza histydynową (patrz sekcja 7. sekcja 7. 8. czynnik regulacyjny. 6). CheA może przenieść grupę fosforanową z ATP do białka regulacyjnego CheY. gdy zostanie obniżona aktywność CheA do poziomu wyjściowego. a regulacja poziomu CheY~P wymaga białka CheZ. metylotransferaza CheB usuwa grupy metylowe. Zahamowanie CheA hamuje jednocześnie CheB. hamując CheA (hamując fosforylację CheY) i ułatwiając obroty rzęski przeciwne ruchowi wskazówek zegara (ruch prostoliniowy). 8. 5) są konieczne do transkrypcji określonych genów. σ 3 2 (produkt genu rpoH. 2. Do czynników sigma zaliczamy np. Podstawą przekazania sygnału jest więc przeniesienie fosforanu z CheA na CheY. następuje adaptacja do nowego. 9 Regulacja wyrażania się genów przez czynniki σ Specyficzne czynniki σ (sekcja 7. [Role of CheY: Silversmith i Bourret (1999) TIM 7: 16-22. w czasie wymaganym do adaptacji (wraz ze zmianą stężenia CheR. stałym stężeniu chemoatraktanta (Catr) częstość koziołkowania komórek jest stała. Na schemacie przedstawiono CheA związane z MCP. Poziom niektórych czynników sigma jest minimalny podczas normalnego wzrostu. ale dokładność adaptacji (zdolność do osiągnięcia poziomu koziołkowania równego temu przed działaniem bodźca) jest zachowana [Alon i wsp. (1999) Nature 397: 168-1711. działający w różnych warunkach stresowych). (c) W małym. Sygnał jest modulowany (regulowany) przez związanie/uwolnienie chemoefektora z/od MCP i przez stopień metylacji MCP. CheR) wskazują. że mogą one znajdować wyraz np. jak i CheB. 8. Zwiększenie metylacji zwiększa aktywność CheA. ]. stałego stężenia (MCP z prawej strony schematu). gdy jest on wymagany. Komórki adaptują się do nowego. Następuje równoczesna stymulacja CheB i demetylacja MCP do momentu. jak wspólnie regulują one przekazanie sygnału i częstość koziołkowania. CheB ulega autodefosforylacji. Taka adaptacja wymaga wydajnej defosforylacji CheY i CheB. odpowiednio do zmienionego poziomu aktywności CheA. szok osmotyczny dla σs) pobudzają zwiększenie syntezy czynnika sigma przez (b) Powstanie wewnątrzkomórkowego sygnału jest związane z białkiem CheA (kodowanym przez gen cheA). Stopień metylacji MCP zależy od aktywności zarówno CheR. Fosforylowana (aktywna) forma CheY (CheY ~P) zwiększa obroty rzęski zgodnie z ruchem wskazówek zegara (w ten sposób zwiększając częstość koziołkowania) przez oddziaływanie z pierścieniem C stanowiącym część motoru rzęski (z pewnością ze składnikiem FliM — patrz rys. w przybliżeniu stałego stężenia Catr (na schemacie MCP w środku). Eksperymentalne zmiany różnych składników systemu chemotaksji (np. Zależność ta pozwala komórce kontrolować synchronizację pewnych zdarzeń przez syntezę danego czynnika sigma tylko wtedy. 8). Rozpatrzmy każdy z tych czynników po kolei. Wyższy ich poziom. Przeciwnie. że w całkowicie zaadaptowanych komórkach około 30% wewnątrzkomórkowej puli cząsteczek CheY jest w pełni fosforylowane. która wykorzystuje S-adenozylometioninę jako dawcę grup metylowych. rys. [Alon i wsp. różnice czasu mogą być nawet większe niż 20-krotne). Wydaje się. 151 . Częstość koziołkowania wraca wtedy do wartości wyjściowej.

Czynnik sigma kodowany przez SpoIIA. 8. Spo0A~P ułatwia wyrażanie się niektórych genów sporulacyjnych (wymienionych w ramce z prawej strony środkowej części schematu). które hamują geny sporulacyjne podczas wzrostu wegetatywnego. 152 . W większości wypadków kontrola działa na poziomie transkrypcji. 6. symbol oznacza czynniki hamujące. Sporulacja wymaga nie tylko włączenia tych genów. Kinazy przenoszą grupy fosforanowe (symbol na określony ciąg białek: Spo0F -> Spo0B —> Spo0A. Wydaje się. 1) wymaga całej grupy białek. które nie są syntetyzowane w wegetatywnych (rosnących) komórkach. że mechanizm inicjujący sporulację rozpoznaje zarówno zewnętrzne (środowiskowe). 5).Utworzenie endospory (sekcja 4. 1) — pokazanych na schemacie jako KinA i KinB. co z kolei jest związane ze skoordynowanym wyrażaniem się różnych genów sporulacyjnych. koniecznym do transkrypcji genu spoIID i niektórych genów komórki macierzystej. SpoIIG (kodowane przez spoIIG) jest czynnikiem sigma (sekcja 7. σf. Wewnątrzkomórkowe stężenie fosforylowanej formy Spo0A . Hoch (1993) JCB 51: 55-61]. Proces ten nazywa się transferem fosforu [Strauch i Hoch (1993) COGD 3: 203-212. jak i wewnętrzne (wewnątrzkomórkowe) sygnały. jest niezbędny do transkrypcji niektórych genów w presporze. a symbol — czynniki stymulujące wyrażanie się jakiegoś genu.Spo0A~P wydaje się podstawowym czynnikiem w inicjacji sporulaqi. że sygnały te powodują autofosforylację niektórych kinaz (sekcja 7. ale również włączenia genów. Przyjmuje się. Na schemacie. 3. σΕ.

w połączeniu z innymi formami regulacji. 4. 2). Spo0A~P ułatwia wyrażanie się spo0H. 2) wykazały. na przykład. że odgrywa on regulującą rolę w odpowiedzi na różne stresy zarówno w fazie stacjonarnej. Spo0E jest negatywnym regulatorem transferu fosforu [Ohlsen i wsp. Enzym ten defosforyluje (a przez to inakrywuje) Spo0A-P. Dotychczas nie opisano mutacji wpływających na etap I (rys. 1) z promotora p2 różniącego się od promotora ftsZ. 6). Spo0A~P ułatwia ekspresję genów spo0F i spo0A (ramka lewa. σs i białko Fur regulują tolerancję na zakwaszenie (sekcja 7. że podczas sporulacji w komórkach dzikiego typu SpoIIE umieszczone jest w asymetyrycznej przegrodzie po stronie prespory (rys. Czynnik ten działa często. W badaniach dotyczących genetycznej kontroli sporulacji bardzo przydatne są mutanty z zablokowanymi poszczególnymi etapami tego procesu (rys. 5. Synteza czynnika σΗ znacznie się zwiększa po rozpoczęciu sporulacji. Niektórzy badacze nie traktują tego etapu jako wyodrębniony. Badania prowadzone z zastosowaniem białka fuzyjnego SpoIIE-GFP (sekcja 8. SinR (kodowany przez gen sinR wymieniony w dolnej ramce) hamuje ekspresję genów spoll (ramka prawa środkowa). Prepiak i Schneisser (1998) JB 180: 5327-5333].zwiększenie translacji odpowiadającego mu mRNA (raczej niż przez zwiększenie transkrypcji genu). dlaczego σF tworzony jest tylko w presporze (a nie w komórce macierzystej) [Wu i wsp. (Porównaj SpoIIE i FlbE w sekcji 4. Mutacje genów spoII mogą zapobiec rozwojowi spory na etapach następujących po wytworzeniu asymetrycznej septy. środkowa) według mechanizmu pozytywnego sprzężenia zwrotnego [Strauch i wsp. 2. To może tłumaczyć. że transkrypcja sinI jest również ułatwiona przez Spo0A~P. 2). Czynniki sigma pełnią również rolę w rozwoju fagów (patrz np. Sporulacja może być zahamowana przez mutacje genów spo0. dopóki połączony wpływ różnych (zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych) sygnałów nie wskaże na jej konieczność. Teraz wiadomo. SinR hamowane jest przez oddziaływania bialko-białko. FtsZ jest niezbędne do utworzenia asymetrycznej septy. który jest aktywny podczas wzrostu wegetatywnego. 4. (1994) PNAS 91: 1756-1760]. a więc w rezultacie może zapobiegać sporulacji. natomiast podczas szoku osmotycz+ nego (sekcja 3. 1. mutacja prowadząca do całkowitej utarty produktu danego genu lub jego funkcji w genie spo0B blokuje transfer fosforu. (1993) MM 7: 967-975]. 8) zwiększenie poziomu K i glutaminianu może mieć znaczenie w pobudzeniu transkrypcji z niektórych promotorów regulowanych przez σs [Ding i wsp. 1. Należy zauważyć. Zwiększenie translacji σ32 i σs jest następstwem wpływu. dzięki aktywności fosfatazy może uwalniać aktywne białko σF z nieaktywnego prekursora. 4. być może zawsze. Tak więc. Na przykład. Samo powstanie asymetrycznej septy nie jest w pełni wyjaśnione. Podczas sporulacji. 1. jak i wykładniczej [Hengge-Aronis (1996) MM 21: 887-893]. (1998) GD 12: 1371-1380]. gdzie. sekcja 3. 2. sekcja 9. Jednocześnie. że czynnik σs reguluje jedynie zdarzenia w fazie stacjonarnej. 1. 2) pozostający pod całkowitą kontrolą białka Spo0A [Barak. wskutek zahamowania abrB. σΗ jest potrzebny do transkrypcji genu ftsZ (patrz FtsZ. w tym wypadku białko SinI hamuje białko SinR. 2. Podczas wzrostu wegetatywnego. Kiedyś uważano. ) 153 . 2). (1995) MM 16: 649-656]. 1). że miejsce tworzenia się septy leżące w środku komórki (ważne dla podziału wegetatywnej komórki) jest zablokowane przez kompleks MinCD (sekcja 3. a wspomaga ekspresję genów spoII. 8. którego produkt (Spo0H = σΗ) jest konieczny do transkrypcji spo0F i spo0A (białko σΗ jest produkowane w małych ilościach podczas wzrostu wegetatywnego). Wyniki jednych badań pozwalają wnioskować. Podczas sporulacji Spo0A~P reprymuje abrB (ramka dolna) — w ten sposób hamuje ekspresję SinR. jaki wywierają warunki indukujące ekspresję na drugorzędową strukturę mRNA.

10 Regulacja wyrażania się genów przez zależną od tRNA antyterminację transkrypcji U Bacillus subtilis (i niektórych innych gramdodatnich bakterii) pewne geny. coli związane z zapaleniem miedniczek nerkowych wyrażają tzw. 2.7. że translacja (sekcja 7. co zapobiega wiązaniu H-NS do miejsc(a) dla siebie specyficznych. Rzeczywiście. co umożliwia zajście translacji. których produkty są konieczne do syntezy aminokwasów (i do związania aminokwasów z cząsteczkami tRNA). 11 Termoregulacja wyrażania się genów Odpowiedź na szok cieplny jest tylko jednym z przykładów reakcji bakterii na zmiany temperatury. (1997) Cell 90: 55-64]. ale nie wyrażają ich w 25°C. W E. w patogenach niektóre cechy odpowiedzialne za wirulencję mogą być wyrażone w temperaturze ciała gospodarza (np. Na przykład. indukowaną przez temperaturę oraz zmianę topologii/superzwinięcia DNA. [Thermoregulation of genes in bacteria: Hurme i Rhen (1998) MM 30: 1-6. co wpływa na jego wiązanie z DNA. Tominna i Leon (1998) JB 180: 5260-5262]. Tak więc. ale w 25°C mRNA tworzy strukturę drugorzędową. możliwe jest łączne działanie obu mechanizmów. [tRNA-directed transcription antitermination: Henkins (1994) MM 13: 381-387. ] 7. 2. Białko to hamuje również naprawę DNA u Shigella. H-NS. Nieacylowana cząsteczka tRNA wiąże się z wiodącym regionem mRNA i może powodować przejście struktury terminatora transkrypcji (utworzonej w warunkach wystarczającego stężenia danego aminokwasu) w strukturę antyterminatora — wtedy transkrypcja nie jest hamowana i aminokwas może być syntetyzowany. gdy niedobór danego aminokwasu prowadzi do pojawienia się w komórce nieaminoacylowanych cząsteczek odpowiadającego mu tRNA. Dimer TipA hamuje transkrypcję. 2) w temperaturze 37°C. 8. 8. Przypuszczalny mechanizm regulacji wyrażania się genów przez H-NS obejmuje: indukowaną przez temperaturę. Dobrym tego przykładem może być gen IcrF (związany z wirulencją gen Yersinia pestis). szczepy E. temperatura reguluje różnorodne geny. pilusy Pap (tab. 3). ale monomer (powstający po podwyższeniu temperatury) nie powoduje zahamowania [Hurme i wsp. Inny przykład jest związany z mRNA rpoH (sekcja 7. 6) zachodzi lub jest zahamowana. W Salmonella białko TipA (funkcja nieznana) działa jak temperaturowrażliwy regulator własnej transkrypcji. u człowieka — 37°C). a nie pojawić się — w temperaturach niższych. są włączane. w sposób zależny od temperatury [Palchaudhuri. Transkrypcja IcrF zachodzi z podobną wydajnością w temperaturze 25°C i w 37°C. ] 154 . zmianę samego białka H-NS. zależnie od temperatury. która hamuje translację. 8. coli represja syntezy pilusa Pap w temperaturze 25°C jest związana z białkiem wiążącym DNA. W jaki sposób bakterie „czują" temperaturę? W niektórych wypadkach zmiany temperatury zmieniają strukturę specyficznych mRNA w ten sposób. W 37°C struktura ta rozpada się.

rybozym RNaza Ρ (patrz wyżej) przecina koniec 5' cząsteczek tRNA. translację lub replikację — np. Podobnie do typowych genów eukariotycznych. niektóre geny bakterii. 24-godzinny „zegar biologiczny". że zmiany te są charakterystyczne tylko dla eukariotów. która po związaniu z transkryptem wpływa na transkrypcję. enzymatyczna forma RNA. [Johnson. • SRP RNA: cząsteczka biorąca udział w transporcie białek (sekcja 5. Każda część odpowiadająca intronowi musi być usunięta z transkryptu w celu utworzenia „dojrzałego" mRNA. teraz wiadomo. countertranscript RNA): RNA transkrybowany z nici komplementarnej. Wiele cząsteczek RNA ulega potranskrypcyjnej modyfikacji. Niektóre inne geny regulowane są odwrotnie. 9 Bakteryjny RNA Cząsteczki RNA (sekcja 7. 23S i 5S rRNA — razem z cząsteczkami tRNA — są transkrybowane w postaci jednej cząsteczki. które mogą wpływać na określoną funkcję(e) po związaniu się z określonymi miejscami. najsilniej zaś o świcie. zdolnego do prawidłowego kodowania produktu (patrz rys. • pRNA: bakteriofagowy RNA wykorzystywany do upakowania białek (sekcja 9. ). które nie kodują żadnej części produktu. gen psbA1 (kodujący składnik PSII — rys. mRNA. ] 7. 8. że zachodzą one przynajmniej w niektórych prokariotach. 5 godz. Są to przykłady antysensownych RNA: cząsteczek. • ctRNA (ang. Sugerowano. 2) mają różne formy i funkcje. 5. W jednokomórkowej sinicy. 1. cząsteczka. 7. która rozwija się w rdzeniu właściwie zwiniętej cząsteczki mRNA. przy nie zmienionej intensywności oświetlenia. np. Dla przypomnienia. 5. 6). Co więcej. które zachodzą we właściwościach organizmów żyjących w jednorodnych (stałych) warunkach środowiska. 6. Na przykład: • rRNA. fagów i archeonów zawierają introny — sekwencje nukleotydów. Na przykład niektóre bakteryjne RNA są poliadenylowane (sekcja 7. 3). że przynajmniej w niektó155 . która następnie musi być przecięta w określonych miejscach przez odpowiednie enzymy. tRNA: cząsteczki konieczne do syntezy białek (sekcja 7. Synechococcus. na synchronizację podziałów komórkowych wpływa wewnętrzny. 4).7. 11) najsłabiej wyraża się o zmierzchu. że nukleotydowa sekwencja intronu jest automatycznie „odcinana". 8). 12 Dobowa regulacja wyrażania się genów Mianem cyklu dobowego określa się cykliczne wahania (cykle około 24-godz. RNA I i inne regulatory replikacji DNA niektórych plazmidów (sekcja 7. 8. • RNaza P: rybozym. Golden i Kondo (1998) TIM 6: 407-410]. Poprzednio sądzono. 3. 1). dzięki enzymatycznej aktywności. 1). Introny bakteryjne są autokatalityczne: to znaczy. tj. nawet gdy średni czas podwojenia liczby komórek wynosi zaledwie 10. 16S. 4. [Molecular bases of circadian clocks (artykuł przeglądowy): Dunlap (1999) Cell 96: 271-290. 2.

. splicing zachodzi. Właściwości i rola dziesięciu sRNA z E. RNaza Ρ i SRP (o których wspominano poprzednio) to tylko dwie z większej liczby małych cząsteczek RNA (sRNA) pełniących funkcje regulacyjne. coli są opisane zbiorczo w pracy [Wassarman. Zhang i Storz (1999) TIM 7: 37-45]. gdy powstający transkrypt związany jest z rybosomami (rybosomy zatrzymują się podczas wycinania intronu) [splicing i translacja u bakterii (przegląd): Woodson (1998) GD 12: 1243-1247].rych wypadkach.

np. niektórych bakteriofagów (rozdz.zmienianie informacji genetycznej DNA może podlegać zmianom. 1 Mutacje Mutacja u bakterii jest trwałą. Zmiany dokonywane w DNA przez celową działalność człowieka (technologia rekombinowania DNA in vitro) są omówione w sekcji 8. Poza tym genom komórki (jej „podstawowy genetyczny program") może być uzupełniany przez plazmidy i inne fragmenty dodatkowego DNA nabytego w procesach transferu genów (sekcja 8. jak i sekwencji genów regulacyjnych oraz sekwencji rozpoznawanych przez różne czynniki komórkowe. niezależnie od poprawnie funkcjonującego systemu korekcyjnego i naprawczego (sekcja 7. dziedziczną zmianą sekwencji nukleotydów w DNA (u pewnych mikroorganizmów. 4). a taki mRNA może być przyczyną powstania zmienionego polipeptydu (tab. Na przykład. są to głównie błędy w replikacji i naprawie. 7). 8. 7).ROZDZIAŁ 8 Biologia molekularna II . 9). 2) ze zmienioną aktywnością biologiczną. mutacje mogą dotyczyć zarówno sekwencji kodujących polipeptydy. 4. Większe zmiany mogą być powodowane przez mutageny fizyczne i chemiczne (sekcja 8. 157 . ale pewne z nich są powodowane przez oddziaływania chemiczne (sekcja 7. Mutacje zachodzą z większą częstością. gdy w komórce uszkodzone są pewne geny. 1). Wu i Marinus (1999) TIM 7: 29-36]. 2. rekombinację (sekcja 8. Mutacje spontaniczne zdarzają się z małą częstością i bez żadnej oczywistej przyczyny. nawet podczas replikacji. 2) i elementy transpozycyjne (sekcja 8. Należy zauważyć. mniej więcej jeden na 108-109 nukleotydów w nowej (potomnej) nici jest podstawiony błędnie. że zmiana nawet jednej pary zasad (sekcja 7. 7. 3). tzw. genom zawiera RNA. Transkrypcja zmienionego DNA spowoduje utworzenie zmienionego RNA. Oczywiście. 1) zmienia sekwencję całej cząsteczki DNA. tak więc mutacje u tych mikroorganizmów będą dotyczyły RNA). geny „mutatorowe" [Horst.

a usuwanie powstających w takim przypadku dimerów tyminy przez naprawę „powodującą błędy" (sekcja 7. oraz związki chemiczne. a ponieważ uracyl nie jest normalnym składnikiem DNA. Promieniowanie ultrafioletowe może na przykład wywoływać krzyżowe połączenia między sąsiadującymi tyminami. 2). mutacje pojawiają się częściej w miejscach odleglejszych od oriC 158 . jego odmienna zdolność tworzenia par może wywołać włączenie innej zasady (adeniny zamiast guaniny) w potomną nić podczas następnej rundy replikacji. 5-bromouracyl). Krzyżowe połączenia mogą także powstawać w wyniku działania pewnych czynników alkilujących. które mogą być włączane w miejsce typowych zasad podczas replikacji DNA. 7.Zwiększenie częstości mutacji jest powodowane przez mutageny. u enterobakterii. takie jak promieniowanie ultrafioletowe i promieniowanie X. jak się wydaje. 8. z wytworzeniem uracylu. 2) może wywoływać powstawanie bardzo różnorodnych mutacji (patrz także sekcja 7. dwusiarczki. (Co ciekawe. jak czynniki alkilujące. hydroksyloamina. 2. kwas azotawy i analogi zasad (np. Mutacje w populacji bakterii na ogół powstają przypadkowo. deaminować cytozynę. Dwusiarczki i kwas azotawy mogą np. Mutageny działają w różny sposób. oddziałując na różne geny u poszczególnych osobników. czynniki fizyczne.

Biologiczna aktywność polipeptydu zależy od natury i położenia nieprawidłowo podstawionego aminokwasu. jest to tzw. to zamiast niego odczytywany jest następny. 1 Mutacje punktowe: ich wpływ na syntezę mRNA i polipeptydów. guanina zastąpiła adeninę. które uległo mutacji. produkt może wykazywać pewną aktywność biologiczną. mutacja taka jest nazywana mutacją zmiany fazy lub zmiany ramki odczytu. 2). 1. Zauważ. Jest to tzw. 8. 8. Efekt każdej mutacji punktowej jest wskazany jako gruba strzałka . 8. zmiany zwiększające oporność komórki na antybiotyki. 3). (e) W DNA. mimo to jej skutki mogą mieć daleko idące konsekwencje dla komórki (rys. Komórkę. (1989) Science 246: 808-810]). Gdy zdarzy się ona blisko końca genu. podobnie jak w (b) jest to mutacja typu zmiany ramki odczytu. Wskutek tego nie tylko UCG. Na przykład zmiana rybosomu uniemożliwiająca wiązanie się z nimi streptomycyny i hamowanie przez nią syntezy białek. 1). jest to tzw.[Sharp i wsp. w której nastąpiła mutacja. po prawej stronie pokazano możliwy skutek każdej mutacji (a) mRNA i polipeptyd syntetyzowany z normalnego (nie zmutowanego. która oczywiście na zmienia biologicznej aktywności polipeptydu 159 . że aminokwasy poniżej proliny nie są zmienione. Mutacje są często szkodliwe. 1). jeżeli większa jego część powstała przed natrafieniem w czasie translacji na kodon stop. ze jeżeli brakuje jednego nukletydu. zmieniony kodon zamiast seryny oznacza teraz prolinę. Mutacjami korzystnymi dla bakterii są np. jeżeli zmieniona zostanie sekwencja kodująca produkt lub funkcję niezbędną do życia. tymina zastąpiła guaninę. Ponieważ informacja genetyczna jest teraz w niewłaściwej fazie odczytu (w rejonie poniżej delecji). (d) W DNA. 7. taka „naturalna selekcja" odgrywa istotną rolę w ewolucji. Mutacje polepszające wzrost bakterii w tzw. „normalnych warunkach" mogą pozwolić komórkom mutanta zdominować wzrost subpopulacji komórek „dzikich" (niezmutowanych) i stać się frakcją dominującą w populacji. tymina zastąpiła cytozynę. Mutacja punktowa polega na utracie. ale i wszystkie następne kodony są zmienione: porównaj aminokwasy kodowane w (a) i (b). tak że większa część polipeptydu jest prawidłowa. Synteza polipeptydu zatrzymuje się przy kodonie UAG. zmiana sensu. tak więc Zmutowana komórka będzie wykazywała oporność na ten antybiotyk. cicha mutacja. skutki mogą być różne zależnie od konkretnego miejsca. zyskiwany. Zauważ. 8. czyli grupy trzech kolejnych są czytane jako kodony. zmieniony kodon jednak w dalszym ciągu koduje serynę (tab. nazywamy mutantem. (f) W DNA. mutacja nonsensowna. Jeżeli mutacja zmieniająca ramkę odczytu nastąpi w operonie (sekcja 7. 1 Rodzaje mutacji Mutacje powstają w różny sposób i mogą też różnie oddziaływać na informację genetyczną. tak że mRNA zawiera teraz kodon UCA zamiast UCG. zyskaniu lub podstawieniu pojedynczego nukleotydu. tak że mRNA zawiera teraz kodon CCG zamiast UCG. Rys. tak że teraz mRNA zawiera UAG (kodon „stop") zamiast UCG. (b) Delecja nukleotydu guaninowego z DNA spowoduje utratę cytozyny (C) z kodonu UCG w mRNA. Stosunkowo rzadko jest tracony. odwracany lub nawet translokowany cały fragment DNA (sekcja 8. dzikiego) genu. (c) Dodanie nukleotydu tyminowego do DNA spowodowało dodanie nukleotydu adeninowego do kodonu UCG w mRNA. a mogą być nawet letalne. polipeptyd może mieć pewną aktywność biologiczną.

Kiedy dany locus zawiera więcej niż jeden gen. 8. 160 . his i trp to loci dotyczące odpowiednio biosyntezy histydyny i tryptofanu. w populacji komórek wrażliwych na streptomycynę pojedyncza komórka zmutowała do streptomycynooporności (sekcja 8. Genotyp komórki jest jej genetycznym opisem (programem). każdy z nich jest dodatkowo oznaczany wielka literą. 1. które nie sąsiadują ze sobą na chromosomie. ara w sekcji 7. 8. System ten stosuje się. 1. Lac. locus his. Jak możemy wyizolować te nieliczne określone mutanty z olbrzymiej populacji bakterii? Jeżeli. czyli auksotrofla histydynowa. są oznaczane w analogiczny sposób (porównaj np.nomenklatura Konkretne. Cechy fenotypowe przedstawia się w następujący sposób: np. W celu zapisania genotypu określonego szczepu z zasady wymienimy tylko interesujące nas w danym momencie geny. 1). coli utrata zdolności do fermentacji galaktozy następuje przeciętnie raz na każde 1010 cykli podziałowych komórki. czy są one typu dzikiego czy też są zmutowane. Met. których wzrost jest hamowany przez streptomycynę. hisB. taki sposób selekcji może być wykorzystany. (Zauważ. 1). gen his A. 8. geny lac na rys. w liczbie mnogiej loci) jest oznaczane przez trzyliterowy symbol drukowany kursywą (lub podkreślany w rękopisie). locus his jest operonem (sekcja 7. podczas gdy odpowiadający mu gen Zmutowany jako his A (lub czasem hisA'). 3. Nawet w populacji poddanej działaniu mutagenu. hisA9 (mutacja w określonym miejscu genu hisA). 2 Izolacja mutantów Każda konkretna mutacja spontanicznie zdarza się w populacji bakterii z małą częstością. to jest z częstością 10~10. na przykład. geny i zmutowane geny . ale mają pokrewne funkcje. komórki z konkretną mutacją są wciąż w mniejszości w stosunku do komórek dzikiego typu i tych z innymi rodzajami mutacji. 11). funkcjonalnie zdefiniowane miejsce na chromosomie (= locus. nie wyrosną na takim podłożu. wszystkie inne komórki. itd. odzwierciedla on aktualną sekwencję nukleotydów w chromosomie. 1. 1. wskazując. że geny oznaczane w ten sposób niekoniecznie występują w obrębie locus w porządku alfabetycznym. jako hisA+. 2). His+ (prototrof histydynowy). 1) zawierającym wiele genów oznaczonych odpowiednio hisA. gdy niezmutowane komórki na zastosowanym podłożu selekcyjnym lub w zastosowanych warunkach rosnąć nie mogą.(niezdolność do wzrostu bez histydyny. porównaj np. sekcja 8. 1 Loci. 1.8. TcR (oporność na tetracykliny). ta komórka może rosnąć na stałym podłożu zawierającym streptomycynę i utworzyć kolonię (sekcja 3. na przykład w populacji E. Dziki typ genu jest wtedy oznaczany np. 7. Geny. Fenotyp komórki jest zbiorem jej aktualnie zauważalnych cech (właściwości). tak więc na przykład. na przykład..(auksotrof metioninowy).(niezdolność do wykorzystywania laktozy). Uogólniając. 1). kiedy odnosi się do konkretnego locus lub genu — np. His. Konkretne mutacje (w określonych miejscach) oznaczane są dodatkowo numerami: np..

minimalne podłoże musi być uzupełnione histydyną w małym stężeniu — pozwalającym na bardzo ograniczony wzrost auksotrofa. którym jest Salmonella typhimurium. 3 Test Amesa wykrywający czynniki rakotwórcze Większość znanych karcynogenów (czynników rakotwórczych) to jednocześnie mutageny. na której rosną zarówno kolonie prototrofów. to taki defektywny metabolicznie mutant (auksotrof) może rosnąć tylko wtedy. Po inkubacji wszystkie komórki wytworzą kolonie jednakowej wielkości. gdy zostanie ono uzupełnione czynnikiem. Testowy szczep S. Prototrofów poszukujemy w mieszaninie inkubacyjnej zawierającej komórki testowego szczepu. miejsca kolonii na płytce replikowej porównuje się z miejscami kolonii na płytce matrycowej. (Mutację. dodane enzymy stanowią „metaboliczny aktywator" niezbędny do przejawienia aktywności przez niektóre mutageny/karcynogeny.Jednakże. (Odpowiadający mu dziki typ komórki nazywamy prototrofem. 1. Najwygodniej jest tego dokonywać metodą replik płytkowych. a test Amesa określa poziom jego rewersji do prototrofii. pozwala także rosnąć prototrofom? Jedna metoda to użycie podłoża minimalnego. gdy dostarczymy mu odpowiedniego składnika. 8. który spełni jego specyficzne wymagania wzrostowe. nazywamy mutacją powrotną lub rewersją). krążek sterylnego welwetu przyciska się do powierzchni podłoża pełnego (płytki matrycowej lub wzorcowej). która znosi skutki pierwotnej mutacji. a nie pojawia się na płytce replikowej. pozostając małe. W celu zidentyfikowania kolonii auksotrofów konieczne jest przesianie każdej kolonii na podłoże minimalne. 8. która rośnie na płytce matrycowej. ). aminokwasu). który następnie odciska się delikatnie na sterylnej płytce podłoża minimalnego (płytka replikowa). jak i auksotroficzne. który jest potrzebny do wzrostu. 2. Kolonie tworzone przez komórki auksotroficzne szybko wyczerpią histydynę w swoim otoczeniu. Jeżeli zamierzamy wyizolować auksotrofa wymagającego histydyny. które umożliwia wzrost auksotrofom. określony auksotrof może rosnąć na podłożu minimalnym tylko wtedy. podczas gdy komórki prototrofów osiągną normalną wielkość. Mutagenność związków chemicznych ocenia się określając ich zdolności do wywoływania rewersji mutacji w testowym organizmie. 161 . zawierającą zarówno komórki prototroficzne. typhimurium jest auksotrofem histydynowym. Po inkubacji. W metodzie tej. które zawiera minimalny zestaw substancji odżywczych niezbędnych prototrofom. każda kolonia. to potencjalny auksotrof (rys. gdy komórka w wyniku mutacji utraciła zdolność do syntetyzowania określonego składnika (np. Zatem małe kolonie to potencjalne auksotrofy i powinny być testowane dokładniej. Test Amesa sprawdza potencjalną rakotwórczość substancji przez określanie ich mutagenności (zdolności do wywoływania mutacji). wysiewa się na podłoże pełne (kompletne). na którym będą rosły tylko prototrofy. Komórki z każdej kolonii przyczepiają się do welwetu. to jest takiego. ) Jak można więc wyizolować auksotrofy — wiedząc. W alternatywnej metodzie izolowania auksotrofów populację o małej gęstości. jak i auksotrofów. testowaną substancję oraz preparat enzymów z wątroby szczura. na którym mogą rosnąć oba typy komórek. że każde podłoże.

Na płytce matrycowej strzałka wskazuje kolonię potencjalnego auksotrofa. powstanie rozgałęziona struktura zwana strukturą Hollidaya. czyli regionów jednoniciowego DNA. że dwie dupleksowe cząsteczki wykazują znaczny obszar homologii. Obie nici formują następnie hybrydowy dupleks (heterodupleks). odpowiednikiem białka RecA jest RedA [Seitz i wsp. Ważną rolę w tym procesie odgrywa białko RecA (produkt genu recA). ) Na przykład. które jest zdolne do inicjowania różnego typu oddziaływań między cząsteczkami DNA. wymieniać między sobą nici.. 8. Innym wymogiem jest obecność w tych cząsteczkach jednego lub kilku nacięć (pęknięć w szkielecie fosforanowo-cukrowym). Każda nić może kontynuować oddzielanie się od swego macierzystego dupleksu i tworzyć specyficzne pary z ssDNA innego dupleksu. 8. umożliwiających rozdzielanie się nici. przez białko RecA. także tworząc heterodupleks. Jeżeli następnie wolne końce zostaną połączone. 2 Rekombinacja Przez „rekombinację" rozumiemy przegrupowanie (zmianę rozmieszczenia) sekwencji w obrębie cząsteczki lub cząsteczek kwasów nukleinowych: cząsteczki mogą być łączone. rozdzielane. tzn. gaps). wymianę nici między dwiema dwuniciowymi cząsteczkami DNA. gdy długa sekwencja nukleotydów w jednej nici jest bardzo podobna do sekwencji w drugiej nici. 2. jak i auksotrofów. w wyniku czego struktura Holli- 162 . w odpowiadającym jej miejscu na płytce replikowej nie ma kolonii (auksotrof nie może bowiem rosnąć na podłożu minimalnym). który może zawierać jedną lub kilka błędnie połączonych zasad. 1 Rekombinacja homologiczna (ogólna) Rekombinacja homologiczna może obejmować np. w którym dwa dupleksy są utrzymywane razem przez skrzyżowanie się pochodzących z nich pojedynczych nici.(a) Płytka matrycowa: podłoże pełne z koloniami zarówno prototrofów. Może to następować tylko wtedy. (1998) GD 12: 1248-1253]. region. (b) Płytka replikowa: podłoże minimalne wyłącznie z koloniami prototrofów. lub luk (ang. (U Archaea. wolny koniec ssDNA pochodzący z naciętego dupleksu może być zestawiony. z homologicznym ssDNA w innym naciętym dupleksie. podobnie wolny koniec odsunięty z drugiego dupleksu może tworzyć specyficzne pary z ssDNA w pierwszym dupleksie. a sekwencje w obrębie cząsteczki mogą zostać utracone lub odwrócone itp.

[Działanie rekombinazy specyficznej wobec miejsca: Stark. 8. a nacięte końce jednego dupleksu są ligowane (łączone) z naciętymi końcami drugiego dupleksu (patrz rys. 8. od ich zdolności do wiązania RecA [Tracy i Kowalczykowski (1996) GD 10: 1890-1903]. U przynajmniej niektórych organizmów chromosomy zawierają pewne sekwencje DNA (rekombinacyjne „gorące miejsca"). U E. Na przykład chromosom E. 8. Sugeruje to. każda helikaza jest heksamerem białka Ruv. że specyficzna aktywność (wzmagania poziomu rekombinacji w swoim sąsiedztwie) takich miejsc może zależeć. a także w koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. a zakres tego przemieszczania się zależy od całkowitej długość heterodupleksu. 4. 3 Transpozycja Transpozycja jest to transfer (przenoszenie) małych. że białko RecA wiąże się preferencyjnie z sekwencjami DNA bogatymi w GT — w tym z sekwencjami χ Ε. w takiej rekombinacyjnej regulacji. w regionie zbliżenia przyłącza się białkowy katalizator reakcji (rekombinaza). branch migration). zjawisko to nazywamy przemieszczaniem się ramion (ang. 8. 2. która nacina odpowiednie nici. coli przemieszczanie się ramion jest „napędzane" przez dwie pierścieniowatego kształtu helikazy (po jednej na każdym końcu struktury Hollidaya). zdarzenia SSR kontrolują włączanie i wyłączanie genu(ów) lub przełączanie ekspresji z jednego genu na inny (rys. coli. działają kooperatywnie [Gool i wsp. Boocock i Sheratt (1992) TIG 8: 432-439. 4). Rekombinacja homologiczna zdarza się także w pewnych przypadkach oddziaływania między plazmidem i chromosomem. ] SSR może kontrolować ekspresję genów. 3). ) Rozdzielenie struktury Hollidaya (czyli rozdzielenie dupleksów) wymaga działania endonukleazy RuvC. RuvB i RuvC. 3c). do miejsca w innym dupleksie w tej samej komórce lub (patrz koniugacyjne 163 . wpływ χ (zmniejszający się wraz z oddalaniem) obejmuje obszar około 10 kpz z każdej strony. przez które DNA się przesuwa. 1) z chromosomem E. 3c). 2. przynajmniej częściowo. coli. 2. (Porównaj z helikazą DnaB na rys. 8. 8.daya będzie się przesuwała w odpowiednim kierunku. specyficznych fragmentów DNA — lub ich „kopii" — z jednego miejsca w drugie w tym samym dupleksie. w mechanizmie replikatywnej transpozycji (rys. jak się wydaje. coli (rys. sitespecific recombination) dwie specyficzne sekwencje dupleksowego DNA zbliżają się do siebie. sekwencji chi (χ) — 5'-GCTGGTGG-3'. 7. które wzmagają rekombinację homologiczną w swojej bliskości. w pewnych przypadkach także w interakcjach między plazmidem i chromosomem [Campbell (1992) JB 174: 7495-7499]. Ostatnie badania in vitro wskazują. pozwalając na ich połączenie (ligacje) w obrębie każdego dupleksu. 2 Rekombinacja zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca) W podstawowej formie rekombinacji specyficznej wobec miejsca (SSR. 3b). U E. wprowadzane są naprzemienne nacięcia w każdym dupleksie. 8. (1998) EMBO Journal 17: 1838-1845]. która wzmaga rekombinację nawet 10-krotnie. ang. SSR uczestniczy także w integracji DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. coli zawiera około 1000 kopii tzw.

dwuniciowego) DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. Dół: między miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę nastąpiła rekombinacja (typu SSR). ale utrata represora H1 pozwala na transkrypcję z H1 — tak że rzęska jest teraz tworzona z produktu genu H1. lepkie końce nacięcia w chromosomie wytwarzają komplementarne połączenia z lepkimi końcami w DNA A. co powoduje. (c) Przykład rekombinacyjnej regulacji. 2. normalnie tylko jeden z tych genów jest wyrażany w danym czasie. Zmienność składu białkowego rzęsek Salmonella jest tylko jednym z przykładów bardziej ogólnego fenomenu zwanego zmiennością fazową. Góra: operon H2 jest transkrybowany. 14. 164 . Na lewo: dwie koliste cząsteczki dwuniciowego DNA z zestawionymi ze sobą „miejscami rekombinacyjnymi". czyli lepkich końców. w chromosomie E. w którym skład pewnych powierzchniowych komponentów komórkowych lub struktur ulega spontanicznym zmianom. 1) mogą być wytwarzane z jednego z dwóch różnych typów białek — kodowanych przez geny H1 i H2. 1) z chromosomem E. Na schemacie przesunięte cięcie jest przedstawione w postaci dwóch 4-nukleotydowych jednoniciowych regionów. (b) Integracja (kolistego. że komórki mogą mieć fimbrie lub nie i zmienić ten stan w wyniku rearanżacji fragmentów DNA. Jednakże. ten jednoniciowy region może mieć także długość 2 lub 6-8 nukleotydów. zależy od konkretnej rekombinazy uczestniczącej w procesie. Na prawo: DNA λ włączony do chromosomu E. W wielu szczepach Salmonella rzęski (sekcja 2. w poszczególnych komórkach E. coli wytwarzanie tzw. coli pokazane jest ono jako czarny kwadrat z boków oflankowany przez geny operonu gal (wykorzystywanie galaktozy) i bio (biosynteza biotyny). 2. z udziałem rekombinazy związanej z tym miejscami. fimbrii typu 1 podlega włączaniu i wyłączaniu. (Takie jednoniciowe regiony są czasem nazywane „lepkimi końcami"). coli. albo genu H2. wprowadzone w innym miejscu tego samego dupleksu lub w innej cząsteczce DNA. a represor H1 blokuje transkrypcję genu H1. W DNA faga λ miejsce rekombinacyjne (czyli specyficzną sekwencję nukleotydów w dupleksie) pokazano jako biały kwadrat. produkt genu H2 tworzy rzęskę. Na przykład. wprowadzane są przesunięte nacięcia każdego dupleksu. tak że rzęski są zbudowane albo z produktu genu H1. Promotor operonu H1 jest oflankowany dwoma specyficznymi miejscami które są rozpoznawane przez rekombinazę. Początkowo. sekwencja zawierająca promotor genu H2 została odwrócona. coli.(a) Przesunięte (o nierównych końcach) cięcie w specyficznym miejscu jednego dupleksu DNA i przesunięte cięcie (z reguły z udziałem takiej samej sekwencji nukleotydowej). Każdy jednoniciowy region w danym miejscu cięcia może tworzyć komplementarne pary z zasadami w obrębie jednoniciowego regionu drugiego miejsca cięcia. długość tych wystających odcinków. W procesie tym uczestniczy białko (rekombinaza). bez funkcjonalnego promotora operon H2 nie może być transkrybowany. po czym nici są ligowane.

w tym transpozazę (patrz niżej) potrzebną do transpozycji. Elementy transpozycyjne występują np. ang. tzn. Niżej podane są przykłady par terminalnych odwróconych sekwencji: 5'-CTGACTA 3'-GACTGAT TAGTCAG-3' ATCAGTC-5' Zauważmy. Obecność TE w określonym miejscu jest umownie oznaczana podwójnym dwukropkiem. Dwa podstawowe typy TE to sekwencja insercyjne (IS. zjawisko stosunkowo rzadkie. Sekwencja nukleotydowa wszystkich TE zawiera co najmniej jedną parę odwróconych sekwencji. gdy jest czytana od 5' (lub 3') końca w obu kierunkach. insertion sequence) i transpozony. np. 2. obecność Tn3 w genomie faga λ zapisuje się jako: A:: Tn3. Insercyjna sekwencja zawiera parę odwróconych powtórzeń. że chociaż Insercja może nastąpić w wielu różnych miejscach. są jednak pewne preferowane regiony włączania IS903 [Hu i Derbyshire (1998) JB 180: 3039-3048]. Tn7) miejsce docelowe (tarcza) jest ściśle określone. z wyłączeniem koniugacyjnych transpozonów). 165 . ang. 8. ponadto transpozon koduje inne funkcje — np. Klasa II transpozonów zawiera parę odwróconych powtórzeń otaczających inne geny transpozonu. Dla pewnych TE (np. powiązana z cyklem komórkowym (patrz sekcja 7. 4). ale dwa końce dupleksu mają odwrotne orientacje. Klasa I transpozonów zawiera parę sekwencji insercyjnych (które nie muszą być całkowicie identyczne) otaczających inne geny transpozonu. prawdopodobnie stanowią miejsce rozpoznawane przez transpozazę. Inne TE pozornie włączają się w przypadkowe miejsca. w tym insercje. enzymy. Odwrócone powtórzenia są niezbędne do transpozycji. chociaż ich miejsca docelowe wykazują pewien stopień selektywności [Craig (1997) ARB 66: 437-474]. Elementy transpozycyjne mogą być przenoszone przez „prostą" transpozycję lub przez transpozycję „replikatywną" (wyjaśnienie na rys. w DNA bakteriofagów (rozdział 9) i w plazmidach. że lewy koniec dupleksu ma taką samą polarność jak koniec prawy. jest jak się wydaje. 8). Transpozycja. Tnl0 z chromosomowej lokalizacji. może powodować różnorodne przegrupowania DNA (rearanżacje) w genomie. transposition element) lub skaczącym genem. które inaktywują określone antybiotyki.transpozony. Każdy z nich koduje białko(a). sekcja 8. przykładem jest transpozon Tn3. przykładem jest transpozon Tn10. sekwencja jest taka sama. Badania nad transpozycją sekwencji insercyjnej IS903 do dużego (55 kpz) plazmidu wykazały. Transpozycja. np. w chromosomach bakteryjnych. Niżej podane informacje odnoszą się do „klasycznych" elementów transpozycyjnych (tzn. każde o długości 10-40 nukleotydów otaczających transponowane geny. 8. Ten „mały specyficzny fragment DNA" jest nazywany elementem transpozycyjnym (TE. delecje lub odwrócenia sekwencji. 3) do dupleksu w innej komórce. 4.

miejsce to zostało zduplikowane podczas pierwotnego wbudowywania się transpozonu do cząsteczki dawcy (patrz dalej). Wprowadzane jest przesunięte nacięcie w obrębie miejsca tarczowego. (c) Rezultat „prostej" transpozycji. Pozostałe końce nici transpozonu zostały przecięte i zligowane w przedsta- 166 . po obu stronach którego znajduje się stare miejsce „tarczowe" . a wolne końce są ligowane z końcami w cząsteczce docelowej.(a) Dwie koliste. Cząsteczka dawcy zawiera transpozon (linia przerywana). W „prostej" transpozycji (np. tak jak to pokazano na schemacie. (b) Enzym (transpozaza — nie zaznaczona) pośredniczy w co najmniej początkowych etapach transpozycji. Cząsteczka docelowa (do której ma nastąpić wbudowanie transpozonu) ma pojedyncze miejsce tarczowe do którego nastąpi Insercja. przy transpozycji Tnl0) następny (i jednocześnie końcowy etap) jest taki jak pokazano w części (c). wykorzystując jednoniciowe odcinki miejsca tarczowego jako matrycę do syntezy nici komplementarnych . Nacięcie jest też dokonywane w każdej nici transpozonu (po jego przeciwnych końcach). Synteza DNA nastąpiła z każdego wolnego końca 3' w cząsteczce docelowej. dwuniciowe cząsteczki DNA.

1) następuje spontanicznie. Następny etap zachodzi z udziałem resolwazy — enzymu kodowanego przez transpozon. wiony sposób. transdukcja (wymagająca pośrednictwa bakteriofagów) jest opisana w rozdziale 9. Rieux i Baille (1994) JB 176: 1992-1996]. wysoki poziom wewnątrzkomórkowego cAMP (rys. 2). 7. za pozwoleniem 167 . że w tym modelu każdy produkt transpozycji zawiera część oryginalnego transpozonu (linia przerywana) i część nowo zsyntetyzowanego DNA (linia zygzakowata). U H. Zauważ. Koniec każdej nowej nici został połączony z wolnymi końcami w cząsteczce dawcy. gdy zawiera gatunki te wiążą DNA tylko w ograniczonej liczbie miejsc na powierzchni komórki. że miejsce tarczowe w cząsteczce docelowej zostało zduplikowane — porównaj z cząsteczką dawcy (a). mieć znaczący udział w rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotyki u bakterii patogennych [Davies (1994) Science 264: 375-382]. Warunek ten nie musi być spełniony u Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae. D. 4. zauważ. może ona np. p. Zdolność do wiązania i pobierania DNA. (d) „Replikatywna" transpozycja (zachodzi np. patrz sekcja 8. 1 Transformacja W procesie transformacji bakteria pobiera z otoczenia fragment DNA.8. (Menlo Park. influenzae kompetencja jest indukowana przez warunki wpływające hamująco na wzrost. quorum sensing. Struktura pokazana w etapie (d) jest kointegratem. 8. 1. Watson i wsp. linia zygzakowata wskazuje nowo syntetyzowany DNA. Resolwaza rozdziela kointegrat w procesie zlokalizowanej rekombinacji (SSR) (sekcja 8. subtilis i S. 1. (e) Zarówno dawca. U S. 4 Przekazywanie (transfer) genów Nowy DNA może wniknąć do komórki bakteryjnej przez transformację. J. jedna nić DNA pochodzącego z dawcy wnika do wnętrza komórki i może spowodować genetyczną transformację biorcy przez rekombinację z homologicznym regionem jego chromosomu. 4 wyd. Przygotowane w formie zmodyfikowanej wg Molecular Biology of the Gene. pneumoniae kompetencja jest także związana z procesem transbłonowego transportu wapnia [Trombe. U gatunków B. 4. (d) i (e). czyli regulacji przez „wyczuwanie liczebności". sekcja 10. jak również gęstość populacji bakteryjnej (jest to przykład tzw. uptake-signal sequences). W punkcie (d) nowa synteza DNA jest kontynuowana (z końca 3' w cząsteczce docelowej) poza miejsce tarczowe. jak i cząsteczka docelowa zawierają kopie transpozonu. 12). on pewne sygnałowe sekwencje pobierania (ang. koniugację lub transdukcję. coli. tworząc cząsteczki pokazane w punkcie (e). 336. ale z kolei Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae wiążą DNA wtedy. dzięki temu także cały transpozon ulega replikacji. kompetencja. Transformacja u różnych gramdodatnich i gramujemnych bakterii (chociaż nie u E. wykorzystując nici transpozonu jako matryce. w przypadku transpozonu Tn3) zawiera etapy (b). California: Benjamin/Cummings Publishing Company). które zdarzają się powtarzalnie w ich własnych chromosomach. 2). (1987). gonorrhoeae. Pozostała część cząsteczki dawcy może być nieaktywna i ulec dezintegracji („samobójczy dawca"). jest konstytutywna u N. pneumoniae na poziom kompetencji wpływają warunki żywieniowe. kompetencję wzmaga np. 2.

było to jedno z pierwszych wskazań na DNA jako element komórkowy niosący informację genetyczną. że to DNA uwolniony z zabitych komórek spowodował transformację żywych komórek. 4. u E. Zhu and Dean (1999) NAR 27: 910-911. Po inkubacji mieszaniny komórek i DNA w temperaturze 0°C (łaźnia lodowa) jest ona poddawana szokowi cieplnemu (42°C przez 1. coli DNA w formie liniowych dwuniciowych fragmentów (dsDNA) transformuje z bardzo małą wydajnością (lub wcale). coli przez plazmidowy DNA można uzyskać stosując elektroporację. koliste plazmidy mają tendencję do łatwiejszego wnikania do kompetentnych komórek niż duże. [High-efficiency electroporation. ponieważ jest degradowany przez enzym RecBC. przez ułamek sekundy. Małe. 8. 2 ml) zawierający 108-109 komórek E. 1. Sugeruje się. 8. a następnie dodaje roztwór DNA (10 μl). Częstość elektrotransformacji zmienia się liniowo w szerokim zakresie wartości wraz ze stężeniem DNA. coli) może być indukowana przez zastosowanie pewnych procedur zwiększających przepuszczalność osłon komórkowych. 5-2 min). pneumoniae stał się wirulentny po zmieszaniu z zabitym szczepem wirulentnym. że niepatogenny szczep S. 1 Kompetencja indukowana laboratoryjnie Kompetencja (np. najważniejsze czynniki to siła i czas trwania pulsu. 1. coli pochodzących ze środkowej fazy logarytmicznej chłodzi się w lodzie. ] Transformację po raz pierwszy zaobserwował Griffith w latach dwudziestych. U E. 5 za pomocą NaOH. gdyż nie wytwarzają one tego enzymu. Znacznie później wykazano. iż kompleksy te mogą formować transbłonowe kanały ułatwiające transport DNA i że dwuwartościowe kationy mogą działać przez wytwarzanie połączeń między DNA i fosforanami przy wlocie do takiego kanału [Huang i Reuch (1995) JB 177: 486-490]. 2 Elektroporacja Bardzo wysoką wydajność transformacji E. 0. ] 168 . Jednakże taka forma DNA transformuje wydajnie niektóre mutanty recBC. 4. coli kompetencji przez inkubację w schłodzonym roztworze chlorku wapnia przypisuje się obecności w jej błonie cytoplazmatycznej dużej ilości kompleksów poli-β-hydroksymaślanu z polifosforanem wapniowym. zależy także od stężenia (gęstości) komórek. ) Osiąganie przez E. tak aby końcowe stężenie DNA wynosiło w przybliżeniu 0. (LB — Luria-Bertani broth zawiera na 1 litr: 10 g tryptonu. 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl. mieszanina komórek i DNA plazmidowego jest poddawana działaniu pola elektrycznego o natężeniu nawet do około 16kV/cm. a następnie po krótkim schłodzeniu dodaje się 1 ml bulionu LB i inkubuje komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Mechanizm pobierania DNA indukowany przez impuls elektryczny nie jest w pełni zrozumiały.[Competence in transformation: Solomon and Grossman (1966) TIG 12: 150-155. Na przykład roztwór chlorku wapnia (około 50 mM. stwierdziwszy. 2 μg/ml. pH jest doprowadzone do wartości 7.

169 . Podobnie jak transformacja. Jednakże. Enterococcus (dawniej Streptococcus) faecalis. tak więc. potencjalny biorca wydziela niewielkie ilości krótkiego peptydu (feromonu). 1 Koniugacja u bakterii gramdodatnich Wyróżniamy dwa główne typy koniugacji zależnej od plazmidów: W szczepach takich jak np. 1. Biorca. który jest antagonistyczny wobec odpowiedniego feromonu. podczas gdy inne są uruchamiane tylko wtedy. jest nazywany transkoniugantem. 8. ] Taki rodzaj koniugacji zachodzi w płynnej (bulionowej) hodowli. łącznie z nabywaniem kodowanej przez plazmidy oporności na antybiotyki. np. który otrzymał DNA od dawcy. pewne systemy są indukowane przez odpowiednie antybiotyki. gdy komórka biorcy jest jeszcze nie dość blisko. 8. 2. gdy liczba komórek bakteryjnych osiągnie pewien określony poziom (kolejny przykład regulacji przez quorum sensing. 1) oraz koniugacyjne transpozony (patrz niżej) nadają swoim gospodarzom zdolność przenoszenia DNA do innych komórek w procesie zwanym koniugacją. w celu oszczędzania energii. ). Rolą takiego inhibitora może być zabezpieczenie przed przedwczesnym rozpoczęciem procesu koniugacji (tzn. 8. ] Najpierw zapoznamy się z koniugacją zależną od plazmidów (sekcja 8. odmiennie niż transformacja. następnie plazmid jest przekazywany z dawcy do przyłączonej doń komórki biorcy. 1. [Artykuł przeglądowy: Dunny i wsp. 2. 4. 2. wydzielanie zatrzymuje się po uzyskaniu przez komórkę odpowiedniego plazmidu. W procesie tym dawca (komórka męska) przekazuje DNA do biorcy (komórka żeńska) podczas bezpośredniego kontaktu partnerów.Elektroporacja była zastosowana do transformacji różnych bakterii [łącznie z np. Niektóre plazmidy kodują syntezę peptydu. 2). 4. 2 Koniugacja Niektóre plazmidy (tzw. koniugacyjne) (sekcja 7. koniugacja wymaga udziału szeregu wyspecjalizowanych komponentów komórkowych (patrz niżej). który powoduje rozpoczęcie syntetyzowania adhezyjnego czynnika powierzchniowego przez dawcę zawierającego plazmid. aby mogło nastąpić przypadkowe spotkanie partnerów. Helicobacter pylori: Lee i wsp. (1995) JB 177: 871-8776. [Control of conjugative gene expression: Zatyka and Thomas (1998) FEMSMR 21: 291-319. geny związane z koniugacją są wyrażane tylko w odpowiednich warunkach lub po otrzymaniu specyficznego sygnału. Z reguły. z których każdy jest specyficzny wobec określonego plazmidu. a warunkujące ją plazmidy zawierają często także geny odpowiedzialne za oporność na antybiotyki i syntezę hemolizyny. Szczep biorcy często wydziela kilka feromonów. 4. przed osiągnięciem odpowiednio wysokiego stężenia feromonu). a następnie z zależną od koniugacyjnych transpozonów. których komórka. 2. czyli wyczuwanie liczebności: sekcja 10. (1997) AEM 63: 4866-4871]. 4. koniugacja wywołuje ważne fenotypowe zmiany biorcy. zwykle nie syntetyzuje konstytutywnie.

wciąż nie jest w pełni jasne. Markusa B. poniżej którego komórki biorcy i dawcy mogą być utrzymywane w ścisłym kontakcie przez napięcie powierzchniowe. Fot. Szwajcaria. 8. Po zmieszaniu komórek F+ i F~. że komórki dawcy i biorcy są szybko (w ciągu kilku minut) przyciągane do siebie. Szwajcarscy naukowcy obserwowali koniugujące komórki przez połączony z kamerą wideo mikroskop świetlny oraz badali miejsce połączenia dawcy z biorcą w mikroskopie elektronowym [Durrenberger. komórki dawców mające pilusy są oznaczane jako F+. 1 Góra. które zaznaczają region kontaktu między dawcą i biorcą. Taka koniugacja występuje w szczepach z rodzajów Streptococcus i Staphylococcus. wymaga jednak umieszczenia mieszaniny komórek dawcy i biorcy na stałym podłożu. 3). 8 mm) umieszczona wewnątrz zakręcanej butli. podczas gdy komórki biorców (nie mające pilusów) to komórki F-. ciemno wybarwionych plamek to rybosomy. (Widoczne są też fragmenty rzęsek). Różne typy pilusów warunkują koniugację w różnych warunkach fizycznych oraz prawdopodobnie funkcjonują w różny sposób. Koniugujące komórki E. coli przebiegająca z udziałem plazmidu F. Lewa dolna część. Masy małych. mikroskopia świetlna wykazała.Drugi typ koniugacji zależnej od plazmidów nie jest związany z wytwarzaniem feromonów. wierzchołki pilusów oddziałują z powierzchnią komórek F~ (patrz fot. np. Prawa dolna część. na powierzchni filtra nitrocelulozowego. Komórkowe i molekularne mechanizmu transferu DNA w tego typu koniugacji są poznane w niewielkim zakresie. pilusy wydają się niezbędne do koniugacji u bakterii tej grupy. Aparat użyty w eksperymencie autora w celu badania koniugacji „obligatoryjnie wymagającej stałego podłoża" (patrz tekst) Wiązka 80 chemicznie czystych 73-mm szklanych rurek kapilarnych (wewnętrzna średnica około 0. 170 . Badacze amerykańscy twierdzili. 4. a warunkujące ją plazmidy kodują oporność na antybiotyki i są zazwyczaj niezbyt duże (do 15 kpz). 2 Koniugacja u bakterii gramujemnych U dawców gramujemnych plazmid koduje (oprócz innych białek) białkowe podjednostki strukturalne pilusa (sekcja 2. Koniugujące komórki Escherichia coli w kontakcie typu „ściana-ściana" (skala: 6 cm = 1 μm) Mikroskopia elektronowa pokazuje „koniugacyjne połączenie": elektronowo gęsta (ciemna) linia (pomiędzy ostrzami strzałek). 8. 2. porównaj koniugacyjne połączenie z miejscem podziału komórkowego (najbardziej na prawo). 14. coli Ten preparat był wybarwiony w celu uwidocznienia F-pilusa (strzałki) biegnącego od jednej komórki do drugiej. Plazmid F w komórce dawcy występuje zwykle jako niezależna od chromosomu kolista cząsteczka DNA. Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. 2. Górna komórka koniugująca jest tuż przed podziałem. że DNA może przechodzić poprzez pilus do komórki F~ [Harrington i Rogerson (1990) JB 172: 7263-7264]. 1: w prawej dolnej części). każda „nitka" ma na obu końcach menisk. Jednym z najlepiej poznanych typów koniugacji jest koniugacja u E. Villiger i Bachi (1991) JSB 107: 146-156]. Podczas potrząsania butlą podłoże koniugacyjne tworzy wielką ilość małych „nitek" płynu w rurkach kapilarnych. Co zdarza się w kolejnym etapie. 8. Durrenbergera. z Uniwersytetu w Zurichu.

171 .

a utworzony ścisły kontakt „ściana-ściana" jest utrzymywany przez następne 80 minut. Szybkie tworzenie bezpośredniego kontaktu następuje w wyniku wciągania pilusa, co zresztą było przez wiele lat ogólnie akceptowane. W mikroskopie elektronowym można było także zaobserwować specyficzne „koniugacyjne połączenie" między przylegającymi do siebie ściśle komórkami (fot. 8. 1: górna część). Z obserwacji tych i z kinetyki transferu DNA szwajcarscy badacze wyciągnęli wniosek że: „... DNA jest przekazywany raczej w czasie ścisłego kontaktu „ściana-ściana", niż... poprzez pilus wstępnie łączący komórki". Na pewnym etapie kontaktu jakiś (nieznany) koniugacyjny sygnał uruchamia proces przekazywania (transferu) DNA. Przekazywanie to zaczyna się od nacięcia DNA w specyficznym miejscu (oriT) w określonej nici plazmidu F; jest ogólnie akceptowane, że nacięcie to jest wprowadzane przez helikazę I, białko kodowane przez plazmid [Matson i Morton (1991) JBC 266: 16232-16237], która następnie pełni główną rolę w rozwijaniu dupleksu od końca 5'. Szczegóły tego procesu i sposób transferu DNA nie są jak dotychczas dokładnie poznane. Wolny koniec 5' może wniknąć do komórki biorcy lub może pozostać zakotwiczony w pobliżu połączenia partnerów, podczas gdy reszta nici w postaci pętli jest wprowadzana do biorcy. Do biorcy wnika tylko nacięta nić, która w jego komórce działa jako matryca do syntezy DNA; odtwarzana jest więc kompletna kolista forma plazmidu, w wyniku czego biorca staje się F+. Wewnątrz dawcy, utracona nić mogłaby być odtwarzana przez uzupełniającą syntezę DNA (dawcza koniugacyjna synteza DNA, ang. donor conjugative DNA synthesis; DCDS) przebiegającą według modelu toczącego się koła (rys. 8. 5), jednak pewne zastrzeżenia dotyczące niezbędności starterów do tego typu syntezy czyni to założenie niepewnym. Czasem, niezbyt często, plazmid F wbudowuje się do chromosomu komórki gospodarza. Proces taki, fuzja plazmidu z chromosomem, w pewnym stopniu przypomina integrację faga λ (rys. 8. 3), chociaż mechanizm obu zjawisk jest różny. W rezultacie powstaje dawca typu Hfr. Ponieważ komórka Hfr tworzy pilusy, może więc koniugować z komórką F~. Podczas krzyżówek Hfr χ F~ najpierw jest przekazywany DNA plazmidowy, następnie chromosomowy i wreszcie, jeżeli nić DNA nie ulegnie przerwaniu — pozostała część DNA plazmidowego. Można to łatwiej zrozumieć, jeżeli wyobrazimy sobie, że oriT jest ulokowany w środku wbudowanego plazmidu F. Jeżeli przekazany zostanie kompletny plazmid i chromosom, biorca staje się dawcą typu Hfr, lecz zazwyczaj helisa DNA w trakcie przekazywania ulega w pewnym punkcie przerwaniu i biorca, który nie otrzymuje kompletnego plazmidu, pozostaje F'. Zwykle biorca otrzymuje, oprócz części plazmidu, również różnej wielkości fragment chromosomo-

172

wego DNA dawcy i jeżeli geny zlokalizowane na tym fragmencie ulegną rekombinacji z chromosomem biorcy, informacja genetyczna zawarta w chromosomie biorcy zostanie zmieniona. To właśnie znaczna liczba zrekombinowanych komórek powstająca w wyniku krzyżówek Hfr χ F~ spowodowała nazwanie tego typu dawców Hfr (ang. high frequency of recombination). Plazmid F może także „opuścić" chromosom, w wyniku czego dawca typu Hfr staje się dawcą typu F + . Czasem plazmid podczas wycinania się z chromosomu może „zabrać ze sobą" przylegający fragment chromosomu, czego wynikiem jest powstanie plazmidu F' (F-prime). W krzyżówkach F' xF~ przekazany F' przekształca biorcę w dawcę (podobnie jak w przypadku F+), lecz przekazuje on także fragment chromosomu (tak jak Hfr), to jest ten, zwykle niewielki, fragment chromosomu, który plazmid zabrał do swego genomu podczas wycinania się. Plazmid F jest tylko jednym z wielu plazmidów koniugacyjnych, nie jest nawet typowym przykładem takiego plazmidu, gdyż np. jego zdolność do tworzenia stabilnych dawców typu Hfr nie jest cechą powszechną. W przypadku wielu plazmidów geny odpowiedzialne za tworzenie pilusa i inne geny związane z koniugacją są w stanie represji, a więc w populacji potencjalnych dawców tylko nieliczne komórki (z przejściowo zderepresjonowanymi genami plazmidowymi warunkującymi koniugację) aktywnymi dawcami. Jak wspominano wcześniej (sekcja 7. 1), plazmidy mogą kodować, a liczne z nich także przekazywać wiele różnych cech. Koniugacja „uniwersalna" i „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża". U bakterii gramujemnych koniugacja może być typu „uniwersalnego" lub „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża", zależnie od typu pilusa kodowanego przez plazmid koniugacyjny. Plazmid, który koduje długie, giętkie pilusy — tak jak np. plazmid F (sekcja 2. 2. 14. 3), warunkuje tzw. uniwersalną koniugację; czyli taką, która może równie dobrze zachodzić w podłożu płynnym (np. hodowli bulionowej), jak i na wilgotnym (lecz nie zanurzonym), stałym podłożu (np. na powierzchni płytki agarowej). Wyniki eksperymentów z koniugacją uniwersalną w podłożu płynnym wskazują, że jej wydajność może być zwiększona przez podwyższenie w nim stężenia elektrolitów [Singleton (1983) FEMSML 20: 151-153]. Plazmidy, które kodują pilusy krótkie, sztywne, podobne do gwoździa, warunkują koniugację bezwzględnie wymagającą stałego podłoża, która następuje tylko na wilgotnej powierzchni stałej, lecz nie zanurzonej całkowicie w płynie. Ten typ koniugacji, jak się wydaje, wymaga, aby koniugujące komórki znajdowały się pod lub wewnątrz cienkiej błonki płynu, nie przekraczającej grubości samych komórek; w naturze komórki spotykają takie warunki, gdy na przykład znajdują się na cząstkach gleby wysychającej w wyniku parowania. Prowadzano eksperymenty, aby stwierdzić, czy warunki odpowiednie do tego typu koniugacji istnieją pod cienką warstwą płynu na chemicznie czystym szkle (fot. 8. 1. dół, lewa strona); wyniki sugerują, że koniugacja taka wymaga lub jest wspomagana przez napięcie powierzchniowe [Singleton (1983) FEMSLT 19: 179-182]. 173

8. 4. 2. 3 Koniugacyjna transpozycja (koniugacja niezależna od plazmidu)

Koniugacyjna transpozycja, która zdarza się głównie między bakteriami gramdodatnimi, jest typem koniugacji zależnej od koniugacyjnych transpozonów w, bez udziału koniugacyjnych plazmidów. (Koniugacyjna transpozycja prawdopodobnie nie następuje między bakteriami gramujemnymi; niemniej jednak u pewnych gramujemnych bakterii (np. u Neisseria meningitidis) stwierdzono obecność DNA koniugacyjnych transpozonów, co sugeruje, że być może dostały się tam one na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) lub zostały wprowadzone jako część koniugacyjnego plazmidu. ) Koniugacyjne transpozony, podobnie jak te „klasyczne" (sekcja 8. 3), są ruchomymi elementami genetycznymi, które mogą się przemieszczać z jednej cząsteczki DNA do innej. Występują one np. w chromosomach i plazmidach, a ich wielkość zawiera się w zakresie od 18 kpz (Ύn916) do ponad 50 kpz; niektóre z tych większych (np. Tn5253) zawierają elementy podobne do Tn916 wbudowane do innego transpozonu, z których każdy może niezależnie ulegać transpozycji. Koniugacyjne transpozony, z których każdy niesie przynajmniej jeden gen warunkujący oporność na antybiotyki, są łatwo przenoszone w obrębie szerokiego wachlarza gatunków i rodzajów, będąc często odpowiedzialne za przekazywanie antybiotykooporności między bezplazmidowymi gramdodatnimi patogenami. Stwierdzono ich obecność w szczepach Enterococcus faecalis, E. faecium, i Streptococcus pneumoniae. Geny oporności na antybiotyki niesione przez te elementy często warunkują oporność na tetracyklinę (gen tet(M) znaleziono we wszystkich koniugacyjnych transpozonach u patogenów), chloramfenikol, erytromycynę i kanamycynę. Białko Tet(M), odmiennie od białka ΤΕΤ (sekcja 15. 4. 11), może oddziaływać bezpośrednio z systemem syntezy białek, redukując wrażliwość wiązania rybosomu z tRNA na tetracykliny [Burdett (1993) JB 175: 7209-7215]. Aktualny model koniugacyjnej transpozycji jest następujący. Kontakt między komórkami dawcy i biorcy powoduje wycięcie transpozonu wewnątrz dawcy; przy każdym końcu wbudowanego transpozonu powstają nacięcia w taki sposób, że po wycięciu jedna nić przy każdym końcu transpozonu ma przyłączonych sześć (najczęściej) nukleotydów z chromosomu gospodarza. Te jednoniciowe końcowe sekwencje są nazywane sekwencjami łączącymi (ang. coupling sequence). Wycinanie następuje z udziałem rekombinazy (produktu genu int) kodowanej przez transpozon. Wycięty transpozon ulega cyrkularyzacji w wyniku parowania (częściowo błędnego) zasad pomiędzy sekwencjami łączącymi. Wydaje się prawdopodobne, że do komórki dawcy przekazywana jest pojedyncza nić transpozonu i że w biorcy, przed insercją do chromosomu, jest syntetyzowana nić komplementarna. Insercja dwuniciowego transpozonu w miejsce docelowe (ang. target) w chromosomie biorcy nie jest specyficzna, ale nie jest też całkowicie przypadkowa. Każde miejsce docelowe zawiera sekwencje bogate w A (ang. A-rich) i Τ (T-rich), które są od siebie odległe o około 6 nukleotydów. Podczas insercji końcowe jednoniciowe sekwencje łączące tworzą pary z jednoniciowymi odcinkami utworzonymi w naciętej sekwencji docelowej; błędnie sparowane zasady są naprawiane w czasie pierwszej rundy replikacji DNA. Transpozon po wbudowaniu do chromo174

somu ma z jednej strony sekwencję łączącą z dawcy; jest ona tylko z jednej strony, ponieważ sekwencje łączące (jedna przy każdym końcu transpozonu) wbudowywane są w różne nici chromosomu gospodarza — w wyniku ich rozdzielenia się podczas, pierwszej po insercji, rundy replikacji DNA. Koniugacyjne transpozony są w nowym gospodarzu niewrażliwe na jego system restrykcyjny (sekcja 7. 4). Sugerowane wyjaśnienie tej cechy opiera się na odnalezieniu, w transpozonie Tn916, genu (orf18) kodującego produkt podobny do antyrestrykcyjnego białka kodowanego przez pewne plazmidy. Koniugacyjne transpozony różnią się od „klasycznych" transpozonów (sekcja 8. 3) tym, że: 1) pośredniczą w koniugacji, 2) nie duplikują sekwencji docelowej w genomie nowego gospodarza, 3) po wycięciu tworzą pośrednią formę w postaci cccDNA. [Artykuł przeglądowy: Scott i Churchward (1995) ARM 49: 367-397. ]

8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne techniki związane z analizą DNA
Kwasami nukleinowymi możemy manipulować, oddziaływać na nie in vitro, a następnie wprowadzać je do komórek, w których mogą podlegać replikacji i ekspresji. Taka technologia pozwala nam modyfikować komórki wysoce specyficznymi sposobami, na przykład bakterie mogą być „zmuszone" do syntetyzowania ssaczych białek, takich jak insulina. W istocie, mogą być w ten sposób syntetyzowane przez bakterie białka różnych gatunków, ponieważ techniki rekombinacji pozwalają wprowadzać do nich całkiem nowy materiał genetyczny. To wyjaśnia, dlaczego techniki rekombinacji in vitro mają przewagę nad technikami typu „mutacji i selekcji", za pomocą których możemy modyfikować jedynie geny już istniejące w komórce. Inną zaletą techniki rekombinowania genów jest to, że zmiany genetyczne mogą być kontrolowane i można nimi świadomie kierować (patrz np. mutageneza specyficzna wobec miejsca, zlokalizowana; sekcja 8. 5. 5. 2). Technologia rekombinowania DNA często wykorzystuje bakterie lub ich enzymy oraz plazmidy lub fagi. Sekcja 8. 5 wyjaśnia zasady pewnych technik i wprowadza wiele terminów, idei i strategii. Niektóre opisane metody, np. łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR, ang. polymerase chain reaction), znajdują zastosowanie w innego typu badaniach, łącznie z wykrywaniem, identyfikacją i taksonomiczną klasyfikacją bakterii oraz innych organizmów, stwierdzaniem oporności pewnych patogenów na antybiotyki itp. (sekcja 15. 4. 11. 2). N o t k a : Tematy poruszone w sekcji 8. 5 to: 8. 5. 1 Klonowanie i związane nim ogólne techniki — np. restrykcja DNA (cięcie); przeszukiwanie (ang. screening); izolowanie i oczyszczanie chromosomowego i plazmidowego DNA; wirowanie, tzw. blotting; wektory; linkery; dodawanie określonych końców do fragmentu DNA (ang. tailing); ligacja. 8. 5. 2 Fuzja genów i fuzja białek. 8. 5. 3 Sondy; znakowanie sond (łącznie z „przesunięciem nacięcia", ang. nicktranslation). 175

8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR), zastosowania i zmodyfikowane formy reakcji. 8. 5. 5 Mutageneza. 8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA (metoda Sangera terminacji łańcucha). 8. 5. 7 Wyrażanie się genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia. 8. 5. 8 Funkcjonalna analiza genomowego DNA. 8. 5. 9 Amplifikacja kwasów nukleinowych w łańcuchowej reakcji ligacji i NASBA. 8. 5. 10 Zrekombinowana streptokinaza; przykład technologii rekombinowania DNA. 8. 5. 11 Nadprodukcja zrekombinowanych białek. 8. 5. 12 Białka wiążące DNA; wybrane techniki (łącznie z tzw. genetycznym odciskiem stopy, ang. DNase I footprinting). 8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek. 8. 5. 14 Prezentowanie różnicujące. 8. 5. 15 Technologia „DNA~chip" Po ogólnym wstępie zapoznamy się z powszechną dziś technologią: klonowaniem (sekcja 8. 5. 1), przedstawione zostaną bardziej szczegółowo elementy różnych technik związanych z tą procedurą, z których wiele znajduje także zastosowanie w innych obszarach technologii rekombinowania DNA.

8. 5. 1 Klonowanie (klonowanie genu, klonowanie molekularne) — przegląd
Klonowanie służy do otrzymania wielu kopii danego genu (lub innego fragmentu DNA) — np. w celu analizy sekwencji lub otrzymania dużej ilości produktu kodowanego przez gen. Zaczynając od małej liczby kopii danego genu możemy amplifikować go (czyli powielić) do wielu milionów kopii. Najpierw włączamy kopie genu (in vitro) do tzw. wektora, którym często jest plazmid (sekcja 7. 1), czyli cząsteczka, która może „wnieść" gen do komórki bakterii i następnie replikować go w niej. Insercja DNA do plazmidu wektorowego jest przedstawiona na rysunku 8. 6; podczas tego procesu kopie genu są mieszane z plazmidem i odpowiednim enzymem, tak że gen zostaje z pewną częstością włączany do cząsteczki plazmidu. Hybrydowy plazmid, zawierający dany gen, może być wprowadzony na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) do komórki bakterii i będzie podlegał replikacji podczas jej wzrostu i podziałów. Populacja bakterii może osiągnąć bardzo dużą liczebność, dzięki temu możemy otrzymać wiele kopii hybrydowego plazmidu, z których każdy zawiera kopię sklonowanego genu. Na podstawie przestawionego schematu zakładamy, że podczas transformacji każda bakteria otrzymuje kopię plazmidu. W praktyce musimy mieć możliwość wyselekcjonowania tych komórek, które rzeczywiście otrzymały plazmid, ponieważ tylko te komórki są istotne w procesie klonowania. Jedną z powszechnie stosowanych metod jest użycie plazmidu wektorowego, który zawiera gen oporności na antybiotyk; bakterie po transformacji takim wektorem są wysie-

176

(a) Plazmid i „obcy" DNA. Obie cząsteczki zawierają sekwencję nukleotydową GAATTC, która jest rozpoznawana przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI (sekcja 7. 4; tab. 8. 1). EcoRI tnie między guanozyną (G) i adenozyną (A), jak wskazują strzałki. (b) W wyniku cięcia przez EcoRI, obie cząsteczki mają teraz „lepkie końce" (terminalne, jednoniciowe komplementarne sekwencje nukleotydów). (c) „Obcy" DNA połączył się z cząsteczką wektora w wyniku komplementarnego parowania zasad w regionie lepkich końców. (d) Enzym, ligaza DNA, utworzył fosfodiestrowe wiązanie (rys. 7. 4) między resztami cukru nukleotydów G i A, tworząc hybrydowy plazmid. Populacja hybrydowych plazmidów może być teraz wprowadzona do bakterii przez transformację (sekcja 8. 4. 1) w celu klonowania (sekcja 8. 5. 1). Zauważ, że gdy potrzeba, fragment może być następnie wycięty z wektora z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego.

177

wane na podłoże uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, dzięki czemu selekcjonujemy komórki zawierające plazmid. Należy jednak zwrócić uwagę, że komórka może rosnąć na takim podłożu, jeżeli: 1) jest mutantem (sekcja 8. 1. ) opornym na dany antybiotyk, lub 2) pobrała plazmid, w którym nie ma interesującego nas genu, gdyż podczas insercji nie został włączony do plazmidu (rys. 8. 6); do tej drugiej możliwości powrócimy później w sekcji 8. 5. 1. 5. W innej procedurze selekcyjnej (miareczkowanie represora) czyni się użytek z: 1) specjalnie skonstruowanego szczepu E. coli, którego chromosom zawiera gen oporności na kanamycynę pod kontrolą promotora /operatora lac (rys. 7. 11), i 2) wielokopiowego wektora plazmidowego (sekcja 7. 3. 1) zawierającego sekwencję operatora lac. Komórki nie zawierające wektorowego plazmidu nie będą zdolne do wzrostu na podłożu z kanamycyną (przy braku laktozy i IPTG), ponieważ transkrypcja z operatora lac jest blokowana przez białko represorowe LacI (rys. 7. 11). Komórki zawierające wielokopiowy plazmid będą miały wiele dodatkowych kopii lac operatora utworzonych pod kontrolą plazmidu, które będą współzawodniczyć z operatorem lac pochodzenia chromosomowego o represor LacI; w tych warunkach LacI nie zdoła spowodować represji genu oporności na kanamycynę, komórki będą więc rosły na podłożu z kanamycyną. Ponieważ wektor ten nie niesie genów oporności na antybiotyk (porównaj z poprzednią metodą), będzie mniejszy i w związku z tym bardziej wydajny w transformacji (sekcja 8. 4. 1. 1). [Repressor titration: Wiliams i wsp. (1998) NAR 26: 2120-2124. ] W celu odzyskania sklonowanego genu, komórki są lizowane i hybrydowy plazmid izolowany z nich np. przez wirowanie równowagowe (izopykniczne) (rys. 8. 12); lub alternatywnie, może być zastosowany protokół Qiagen (sekcja 8. 5. 1. 4; fot. 8. 2). Przy użyciu oryginalnych endonukleaz restrykcyjnych, zastosowanych uprzednio w klonowaniu, gen może być wycięty z hybrydowego plazmidu i oddzielony od DNA plazmidowego np. przez elektroforezę. 8. 5. 1. 1 Klonowanie genu bakteryjnego Interesujący nas gen musi być najpierw wyosobniony spośród innych genów w genomie. Możemy rozpocząć tę pracę od skonstruowania biblioteki genomowej danego gatunku (rys. 8. 7), a następnie odszukać w bibliotece odpowiedni gen. Poszukiwanie odpowiedniego genu (tzw. screening) jest procesem selekcji. Załóżmy np., że poszukiwany gen koduje enzym niezbędny do syntezy histydyny. Musimy sobie uzmysłowić, że ten szczególny, interesujący nas gen występuje w niewielkiej tylko frakcji cząsteczek składających się na daną bibliotekę (rys. 8. 7). Jak więc możemy wyizolować zrekombinowany wektor zawierający ten właśnie gen? Po pierwsze zastosujemy transformację (sekcja 8. 4. 1) w celu wprowadzenia całego zbioru (biblioteki) zrekombinowanych cząsteczek do komórek zmutowanych bakterii, z uszkodzonym genem, którego poszukujemy (np. niezdolnych do syntetyzowania histydyny). Te auksotrofy histydynowe (sekcja 8. 1. 2) nie będą rosły na podłożu bez histydyny, jednakże mutant transformowany cząsteczką wektorową z funkcjonalnym genem będzie zdolny do wzrostu i tworzenia kolonii na takim podłożu. Te wyselekcjonowane stransformowane mutanty są ponownie rozsiewane na minimalnym podłożu bez histydyny,
178

Najpierw z populacji bakterii danego szczepu izolowany jest DNA chromosomowy, a następnie poddawany działaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (sekcja 7. 4). Enzym wprowadza cięcia w specyficznych miejscach izolowanych chromosomów (w lewej górnej części), tworząc wiele fragmentów o różnej wielkości (w środkowej części na lewo). Populacja określonego plazmidu (w górnej prawej części) dostarcza cząsteczek wektorowych. Dobieramy taki plazmid, który może być cięty przez taki sam enzym jak zastosowany do cięcia chromosomu, jednakże takie miejsce musi on mieć tylko jedno, tak aby cięcie jedynie zlinearyzowało cząsteczkę wektora (w środkowej części na prawo). Chromosomowe fragmenty i zlinearyzowany plazmid są mieszane w obecności ATP i ligazy DNA, enzymu, który katalizuje wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych (rys. 7. 4). Pewne plazmidy (i fragmenty) mogą po prostu ulec recyrkularyzacji poprzez swoje lepkie końce, lecz koncentracja obu rodzajów fragmentów jest tak dobierana, aby plazmidy ulegały połączeniu z fragmentami — w sposób przypadkowy, poprzez lepkie końce (rys. 8. 6), z wytworzeniem dużej liczby cząsteczek zrekombinowanych, zawierających plazmid połączony z którymś z fragmentów chromosomu. (Wiązanie plazmidu z fragmentem może być wspomagane sposobem opisanym pod hasłem ligacja w sekcji 8. 5. 1. 6. ) Ponieważ fragmenty są różnych rozmiarów, również i zrekombinowane plazmidy będą różnej wielkości (dół schematu). Wspólnie zbiór cząsteczek zrekombinowanych plazmidów będzie zawierał cały DNA chromosomu, stanowiąc tzw. bibliotekę genomową. Z wykorzystaniem transformacji (sekcja 8. 4. 1) biblioteka może być wprowadzona do populacji bakterii — w ten sposób, że różne komórki otrzymają różne fragmenty chromosomu. Komórki te mogą następnie tworzyć indywidualne kolonie.

aby potwierdzić ich zdolność do wzrostu, co jest wskazaniem, że niosą one wektor zawierający poszukiwany gen. Musimy dodatkowo sprawdzić, czy wzrost ten nie jest spowodowany mutacją powrotną auksotrofa do prototrofii (sekcja 8. 1. 3). Komórki z potwierdzoną obecnością określonego genu przesiewa 179

się do podłoża płynnego w celu namnożenia. Po wyizolowaniu z nich plazmidowego DNA, fragment niosący sklonowany gen może być izolowany w sposób wskazany w sekcji 8. 5. 1 Alternatywną metodą odszukania genu jest zastosowanie hybrydyzacji kolonijnej (patrz niżej).

8. 5. 1. 2 Klonowanie genów eukariotycznych w bakteriach
Genomy eukariotyczne są znacznie większe niż prokariotyczne, tak że do tworzenia biblioteki genomowej muszą być cięte na stosunkowo duże fragmenty restrykcyjne, gdyż inaczej powstawałoby do sklonowania zbyt wiele fragmentów. Z kolei jednak, klonowanie tych większych fragmentów DNA wymaga zastosowania innego typu wektorów (sekcja 8. 5. 1. 5). Kolejny problem stwarza to, iż geny eukariotyczne zawierają tzw. introny, sekwencje, które nie kodują żadnej części produktu genu, lecz przerywają ciągłość sekwencji kodującej. W komórce eukariotycznej każdy odcinek mRNA, który był transkrybowany z intronu, jest później usuwany, tworząc dojrzały mRNA (rys. 8. 8), czyli nieprzerwaną kodującą sekwencję genu, ulegającą następnie translacji. Klonowanie genów z intronami nie stanowiłoby problemu, gdyby naszym celem było jedynie określenie sekwencji genu in vivo. Jednak gdyby takie geny (a nie dojrzałe cząsteczki mRNA) miały podlegać transkrypcji, nie mógłby powstać normalny produkt. Jednakże, potrafimy in vivo odtworzyć sekwencję DNA genu na podstawie sekwencji jego dojrzałego mRNA. Ta właśnie kopia, tzw. cDNA (ang. copy DNA lub complementary DNA), może następnie być sklonowana. Biblioteki cDNA. Klonowanie genu eukariotycznego rozpoczynamy od konstruowania biblioteki cDNA danego gatunku. Najpierw z komórek wyrażających interesujący nas gen izolujemy całkowity RNA (ang. total RNA). Całkowity RNA zawiera, między innymi, dojrzały mRNA wszystkich aktywnych (aktualnie wyrażanych genów). Wydawałoby się, że to ogromna ilość, ale ponieważ w określonym czasie ekspresji podlega tylko około 1% genów komórki, ograniczona jest jednocześnie liczba klonów, które musimy przebadać w celu znalezienia tego nas interesującego.

180

5. a następnie białko).Wyizolowanie mRNA spośród całkowitego RNA jest ułatwione dzięki temu. 1). mRNA jest następnie usuwany (z użyciem RNazy H) i zastępowany przez komplementarną nić DNA. który jest wyposażony w takie elementy regulacyjne. Ogon ten. probe) (sekcja 8. poli(A). jeśli może on w gospodarzu bakteryjnym ulegać ekspresji. uwolniony z nich DNA jest denaturowany (czyli jego nici są rozdzielane) i jednoniciowy DNA jest wiązany do powierzchni filtra. 8. Pełnej długości cDNA może być otrzymywany metodą Okayamy-Berga (rys. 1. Hybrydyzacja kolonijna zaczyna się (patrz rys. 8. Kiedy komórki zawierające takie wektory tworzą kolonie. promotor rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA (tak że syntetyzowany może być mRNA. 1. 9). 6) i biblioteka cDNA jest gotowa do włączenia do wektora i klonowania w bakteriach.. Dysponując wyizolowanym mRNA możemy przekształcić go (in vitro) w odpowiadający mu cDNA. znacznik sondy identyfikuje poszukiwany DNA na filtrze.. 9). 6. jeżeli wektor dostarcza niezbędnych elementów kontrolnych — jak np. Jednakże. że przez większość eukariotycznych mRNA ma poliadenylowany „ogon" (A-A-A-A. 5. Otrzymany tą metodą cDNA jest czasami niekompletną kopią mRNA. 5. które powstały z komórek transformowaych odpowiednią biblioteką genów (genomową lub cDNA). (Polimeraza I DNA nie jest wykorzystywana w tym przypadku. mogą być następnie analizowane w celu identyfikacji określonego genu. która jest szczególnie użyteczna. nazywany jest wektorem ekspresyjnym (patrz dalej). Kolonie. tak że mRNA może być wyizolowany przez zastosowanie chromatografii powinowactwa (sekcja (8.. 10) wykonaniem replik kolonii na filtr nitrocelulozowy z podłoża na płytce. ) połączonym z celulozą. 10. czyli oligonukleotydem (T-T-T-T. Identyfikacja genu jest łatwiejsza. Oczywiście bakteryjne geny zwykle mogą w tej sytuacji ulegać ekspresji (patrz sekcja 8. 5. a jednocześnie kolo181 . wiąże się w wyniku komplementarnego parowania zasad z syntetyczną. pozwalając enzymowi zwanemu odwrotną transkryptazą syntetyzować nić cDNA na matrycy mRNA. 4). 1. który wiąże się do ogona poli(A) na cząsteczce mRNA. ). ) przy końcu 3' cząsteczki (patrz rys. cDNA biblioteka ekspresyjna jest biblioteką cząsteczek cDNA sklonowanych w wektorze ekspresyjnym. 3). W jednej z metod krótka syntetyczna cząsteczka oligo(dT) stosowana jest jako starter. Wektor. Znakowana sonda (ang. mRNA można też izolować metodami magnetycznymi (sekcja 14. 1). oligo(dT)-celulozą. Jeżeli sklonowany gen lub cDNA nie jest wyrażany w bakteryjnym gospodarzu. jest następnie dodawana do filtra i po odmyciu niezwiązanej sondy. ekspresji mogą podlegać także pewne cDNA.. gdy klonowany cDNA ma następnie podlegać ekspresjii. gdyż jest mało wydajna na matrycy RNA [Ricchetti i Buc (1993) EMBO Journal 12: 387-396]. Do każdej cząsteczki mogą być następnie dodane lepkie końce (sekcja 8. czasem można zidentyfikować kolonię wyrażającą cDNA metodami przedstawionymi na rysunku 8. możemy przeszukiwanie prowadzić innymi metodami. z wytworzeniem ds cDNA. Poszukiwanie określonych genów w bibliotekach (screening). która może się wiązać ze specyficzną sekwencją w poszukiwanym genie lub cDNA. Kolonie na filtrze poddaje się lizie. 8.

a do jego końca 3' dodano (in vitro) „ogon" oligo(dT) (patrz dodawanie końców. który jest teraz gotowy do wprowadzenia do komórki bakteryjnej w celu klonowania. a polimeraza DNA syntetyzuje na jej miejsce nić DNA — kończąc w ten sposób (z pomocą ligazy) tworzenie dsDNA zrekombinowanego plazmidu (dół). „Ogon" Τ działa jako starter. mRNA i plazmid oddziałują między sobą (środkowa część na prawo) przez komplementarne parowanie zasad między „ogonami" A i T. usuwa nić mRNA. Do końca 3' nowej nici dodawany jest ogon oligo(dC). możemy „pracować od tyłu". razem z ligazą. nici DNA (linia przerywana) na matrycy mRNA. Określony plazmid (w górnej prawej części) został przecięty (czyli zlinearyzowany).Dojrzały. 1. Ponieważ 182 . nię na oryginalnej płytce. jest to ważne. a następnie posługując się kodem genetycznym (tab. 5. pozostawiając jeden „lepki koniec" — wystającą sekwencję 5'-AGCT. RNazaH. pełnej długości. mogą teraz cyrkularyzować plazmid. Specjalnie skonstruowany fragment (środkowa część na lewo). np. 5. 8. 6. zawierającą mało powszechne aminokwasy (jak metionina). dedukując możliwą sekwencję dojrzałego mRNA (i oczywiście DNA) na podstawie sekwencji białkowej. ponieważ tylko kompletna nowa nić może być wydłużana w ten sposób. że metoda ta zapewnia wbudowanie cDNA do plazmidu w znanej orientacji (porównaj rys. 1. gdy zrekombinowany plazmid koduje funkcje kontrolne potrzebne do ekspresji genu (patrz wektory. eukariotyczny mRNA (w lewej górnej części) pokazany jest z typowym poliadenylowym „ogonem" na końcu 3'. Na przykład znacznik radioaktywny może być wykryty w sposób przedstawiony na rysunku 8. ogon ten umożliwia następującą potem selekcję kompletnych. po czym enzym. „tailing". Następnie plazmid jest cięty przez HmdIII. sekcja 8. powinniśmy wybrać krótką sekwencję charakteryzującą się czymś szczególnym. 7. z udziałem odwrotnej transkryptazy. 5). 10. 2) zaplanować odpowiednią sekwencję mRNA. Jak wybieramy sekwencję nukleotydów odpowiednią do sporządzenia sondy? Jeżeli znamy sekwencję aminokwasową interesującego nas białka. sekcja 8. Zauważ. Pokazany jest ogon tylko na jednym końcu cząsteczki. umożliwiając syntezę. 6). gdzie DNA mógł być wbudowywany w obu orientacjach). cząsteczek cDNA.

wskazane jest zaprojektowanie więcej niż jednej sekwencji sondy. a filtr traktowany białkiem A — białko (otrzymane ze Staphylococcus aureus). Po wywołaniu kliszy (w dolnej prawej części) możemy zidentyfikować na oryginalnej płytce kolonię. po podniesieniu filtru pozostaje na nim replika (lustrzane odbicie) kolonii (w prawej górnej części).. Sekwencja aminokwasowa: Odpowiadający mRNA: Odpowiadający DNA: Odpowiadający mRNA: Odpowiadający DNA: Lys AAA TTC AAG TTC -Trp -Met -Lys -Glu -UGG -AUG -AAA -GAG -ACC -TAC -TTT -CTC -UGG -AUG -AAG -GAA -ACC -TAC -TTC -CTT -His -Phe -CAU -UUC -GTA -AAG -CAC -UUU -GTG -AAA Biblioteka cDNA.wiele aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon (tab. Białko A przed użyciem jest znakowane radioaktywnie. 183 . Kolonię tę można użyć jako inokulum do wyhodowania większej liczby identycznych komórek. Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane. Komórki na filtrze poddane są lizie. pozostawiając tylko białko A (małe kropki) związane do specyficznego kompleksu przeciwciało-białko (dolna prawa strona). a białka z tych komórek (łącznie z kodowanymi przez cDNA) pozostają przytwierdzone do filtra (w środkowej prawej części). przeciwciała wiążą się z tym białkiem (obecnym w jednej z kolonii). a potem wywołania kliszy. została wprowadzona do populacji bakterii. 1. 2). tak że jego obecność można wykryć autoradiograficznie. Filtr jest następnie poddawany działaniu przeciwciał (λ) specyficznych wobec odpowiedniego białka (w środkowej lewej części). np. w której cDNA koduje (i wyraża) odpowiednie. 7. która zawiera interesujący nas cDNA. niezwiązane białko A jest także wypłukiwane. w wektorze ekspresyjnym (sekcja 8. które wiąże się do przeciwciała. 5. wymaga to eksponowania filtru wobec kliszy fotograficznej. 2). Naszym zadaniem jest teraz odnalezienie kolonii. Na kolonie zawierające cDNA (w lewej górnej części) nakładamy filtr nitrocelulozowy. interesujące nas białko. które następnie wytworzyły na płytkach pojedyncze kolonie.

lecz pewne (np. 184 . tworząc „lepkie końce" (ang. sticky ends). 4). 1). usunięcie odpowiednio intronów lub sekwencji sygnalnych. w oddzielnych eksperymentach. że na zależność między białkiem a kodującą go sekwencją DNA mogą mieć wpływ takie czynniki jak potranskrypcyjna i potranslacyjna modyfikacja. 8. 3 Precyzyjne cięcie DNA DNA może być cięty precyzyjnie i w przewidywalny sposób przez endonukleazy restrykcyjne typu II (sekcja 7. które są enzymami tnącymi w obrębie (lub bardzo blisko) specyficznej rozpoznawanej przez siebie sekwencji nukleotydowej (tab. 1. np. 8. zauważmy. tak więc nie zawsze możemy precyzyjnie określić kodującą sekwencję dojrzałego białka z danych aminokwasowych.Każda z zaplanowanych sekwencji DNA może być użyta. Wiele RE (ang. (Jednakże. 5. restriction endonuclease) typu II powoduje tworzenie przesuniętych końców. jako sonda.

miejsce rozpoznawane przez BaeI jest podkreślone w górnej nici (N = dowolny nukleotyd). Sali) w nieoptymalnych warunkach reakcji. PstI. że pewne enzymy restrykcyjne. a także typ ciętego DNA (liniowe/superzwinięte). 1. (Zauważ. czyli dwa 5'-AGCT wystające końce. czyli osad otrzymany przez odwirowanie hodowli bulionowej. podczas gdy inne tworzą 5' wystające końce). U bakterii gramdodatnich ściana komórkowa może być zniszczona przez działanie lizozymem (patrz rys. Specyficzność cięcia pewnych ER może być zmniejszona przez takie czynniki. 8. Materiałem. dzięki czemu lizozym może łatwo Przesunięte cięcie (w lewej górnej części) przez HmdIII (tab. 2) jest zwykle niszczona przez chelatowanie stabilizujących ją kationów za pomocą zbuforowanego EDTA. 1. 5. 4). 1). Na aktywność enzymów restrykcyjnych ma wpływ pH. jak: niewłaściwe stężenie enzymu. co jest przydatne przy tworzeniu bibliotek genomowych (sekcja 8. (1996) NAR 24: 3590-3592] — jest to jeden z rodziny enzymów. 5. 8. powoduje. BamHI. które tną z obu stron rozpoznawanej sekwencji (patrz sekcja 7. 9. Niżej: miejsce cięcia BaeI [Sears i wsp. 11).ΗραI) tną równo poprzez obie nici tworząc „tępe końce" (ang. elektrolity. tworzą 3' wystające końce. np. 2). odtworzyć dupleks) lub każdy z nich może utworzyć pary z komplementarnym wystającym końcem innej cząsteczki. 5. 185 . 2. od którego rozpoczynamy pracę. 6). (Dla Staphylococcus aureus może być użyta lizostafina. a strzałki wskazują miejsca cięcia. te (komplementarne) wystające końce mogą się ponownie połączyć (tzn. Tak zwana aktywność z gwiazdką (*) (ang. Dlatego jest on stosowany do otrzymywania dużych fragmentów (o długości większej niż milion pz). 7). 2. 1. który przecina oligopeptydowe połączenia między szkieletowymi łańcuchami peptydoglikanu. ) U gramujemnych bakterii błona zewnętrzna (sekcja 2. HpaI (tab. że cięcie tym enzymem nie następuje często. 4 Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych Kwasy nukleinowe do badań in vitro są otrzymywane przez lizę komórek i oddzielenie od siebie różnych form DNA i RNA. sedymentacja komórek hodowli bulionowej wymaga wirowania przez 20 min przy 5000 g. blunt ends) (rys. do tępych końców można dołączyć linkery lub homopolimerowe ogony (sekcja 8. która nie jest zbyt powszechna w genomach. enzym. „Tępe końce" (w prawej górnej części) są tworzone przez np. Sekwencja 8-nukleotydowa rozpoznawana przez NotI. Endonukleazy restrykcyjne pochodzące z różnych gatunków i rozpoznające te same sekwencje nazywamy izoschizomerami. 8. stosowanie nieodpowiednich buforów i stężenie glicerolu większe niż 5% m/v. star activity) odnosi się do zmiany lub redukcji specyficzności cięcia pewnych endonukleaz restrykcyjnych (np. 1) utworzyło „lepkie końce". 8. są kolonie lub masa komórek.

cleared) lizatu (zawierającego plazmidy). 6. 1. Spośród różnych dostępnych metod. 12. 1) w lizacie. 5). 300-400 g).. (EDTA hamuje także nukleazy w lizacie komórkowym. kolumnach zwirowywanych (ang. Różne cząsteczki w próbce mogą być rozdzielone w wyniku przepuszczania jej przez odpowiednie stacjonarne podłoże. 12 Zarys protokołu izolacji plazmidów z bakterii (np. i co za tym idzie gęstość. oligo(dT)-celulozy w stałym wypełnieniu kolumny (patrz sekcja 8. szybka i prosta procedura. czyli pomaga chronić izolowany RNA. 5. Lizat jest następnie neutralizowany schłodzonym buforem o dużym stężeniu soli (i pH 5. 8. kompleksy soli z SDS wychwytują białka itp. podczas klonowania. wzrasta wraz z głębokością. zestaw pozwala izolować nawet do 10 mg DNA) Osad bakterii jest zawieszany w buforze Tris-EDTA zawierającym RNazę A. wytrącającym SDS. uwalniając rozpuszczalne składniki komórki (np. SDS niszczy błonę cytoplazmatyczną. NaOH denaturuje plazmidowy (i chromosomowy) DNA oraz białka. aby przyspieszyć przejście próbki przez kolumnę z np. plazmidy). Rys.oddziaływać na Peptydoglikan.. którego stężenie. białka. Przeprowadzane jest następnie wirowanie (przy np. W ten sposób np. ) Dodanie sacharozy (3 M) zapobiega gwałtownej lizie. dająca dobrze oczyszczony plazmidowy DNA. np. należy natomiast unikać gwałtownego mieszania. podczas której błona cytoplazmatyczna jest rozrywana przy pomocy SDS (detergent). jest opisana na rysunku 8. eukariotycznego mRNA w próbce i T-T-T-T-. E. większy. które zatrzymuje lub przepuszcza cząsteczki zależnie od ich fizycznych właściwości. związek ten hamuje także RNazę (sekcja 7. kontrolowanej lizie komórek. 1. tylko plazmidowy DNA. która mogłaby nastąpić w wyniku nagłego szoku osmotycznego.. 2). Często potrzebujemy izolować z bakterii. Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzność wiązania między pewnymi rodzajami cząsteczek — np. Wirowanie do stanu równowagi ustawia każdą cząsteczkę w próbce w tej części gradientu. RNA.. 13). RNaza A trawi zanieczyszczający RNA. Po tym etapie przeprowadzana jest kontrolowana liza alkaliczna przy użyciu NaOH i detergentu SDS (dodecylosiarczan sodu). tak aby pozwolić na maksymalne uwolnienie plazmidów z komórki bez uwalniania chromosomowego DNA i nie dopuścić do nieodwracalnej denaturacji plazmidów (gdyż zdenaturowane plazmidy są oporne na trawienie enzymami restrykcyjnymi).. u bakterii gramujemnych Tris-EDTA narusza błonę zewnętrzną. gradient gęstości). 2) może być oddzielony od DNA i od białek w gradiencie trifluorooctanu cezu. 16 000 g) w celu otrzymania klarownego (ang. Łagodne mieszanie zapewnia całkowitą precypitację SDS. Różne formy DNA mogą być rozdzielone w gradiencie chlorku cezu (patrz rys. używając go można izolować do 20 μg plazmidowego DNA (inny. która odpowiada jej własnej gęstości. coli) z użyciem zestawu Qiagen® (Qiagen® plasmid mini kit). spun column chromatography) wykorzystuje siłę odśrodkową (np. ściśle upakowanych drobnych cząstek wypełniacza. Chromatografia w tzw. czyli od menisku górnego w kierunku dna probówki (jest to tzw. Chromatografia. 8. Próbka jest nawarstwiana na powierzchnię roztworu. całkowity RNA (sekcja 8. aby nie dopuścić do pofragmentowania chromosomu i zanieczyszczenia supernatantu fragmentami chromosomowego DNA. ogona A-A-A-A-. Czas lizy musi być zoptymalizowany. działając tym samym ochronnie na kwasy nukleinowe. 5. 186 . polega ona na łagodnej. Wirowanie równowagowe (przy odpowiednich wartościach g) może oddzielić makrocząsteczki o różnych gęstościach. podczas gdy plazmidy ulegają renaturacji i pozostają w roztworze.

DNA plazmidowy jest następnie eluowany buforem zawierającym 1. Germany. białka itp. Pozwala to na stopniowa elucję i wydajne rozdzielanie cząsteczek z użyciem buforów o różnym stężeniu soli. Ponadto. a supernatant usuwa się. pH 7). aby wyeliminować zanieczyszczenia (oraz usunąć białka związane z DNA). nie są zatrzymywane. Złoże jest przemywane buforem (zawierającym 1 Μ NaCl. Przy określonym (małym) stężeniu elektrolitu i pH klarownego lizatu do złoża wiąże się tylko plazmidowy DNA — zdegradowany RNA. pH 8. i odwirowuje. resin) (a). co stwarza idealne warunki do wiązania kwasów nukleinowych.Klarowny lizat jest filtrowany przez kolumienkę Qiagen zawierającą jonowymienną żywicę (ang. Schematy zamieszczono dzięki uprzejmości Qiagen GmbH. Hilden. 187 . ma ona + dużą gęstość dodatnich grup anionowymiennych (odległość między sąsiadującymi N wynosi tylko 5A). po przemyciu 70% etanolem. różne typy cząsteczek wymywają się przy znacznie różniących się stężeniach soli — patrz profile elucji (b). 5). Żywica ta została przygotowana specjalnie do izolowania kwasów nukleinowych. 25 Μ NaCl. DNA jest suszony w strumieniu powietrza (5 min) i zawieszany w buforze. DNA wytrąca się (w temperaturze pokojowej) izopropanolem.

5. wykorzystująca tzw. Obie metody pozwalają izolować cccDNA w miligramowych ilościach. Inna metoda. a przyłożenie napięcia wywołuje przemieszczanie się cząsteczek poprzez żel w kierunku anody (+) lub katody (-). zależnie od ładunku cząsteczki. renaturacja (powrót do formy dwuniciowej) jest bardziej wydajna w superhelikalnych cząsteczkach niż w liniowych i kolistych naciętych — tak więc kolumna. i koliste superhelikalnie zwinięte cząsteczki (cccDNA) plazmidów. jeżeli DNA traktowany barwnikiem jest poddawany równowagowemu ultrawirowaniu (ang. 1.DNA izolowany ze zlizowanych bakterii może zawierać (góra) liniowe fragmenty chromosomów. superhelikalny DNA tworzy oddzielne pasmo poniżej pasma zawierającego mniej gęste liniowe i nacięte koliste cząsteczki (lewa strona). co powoduje wydłużanie szkieletu fosforanowo-cukrowego. Jeżeli DNA jest potraktowany barwnikiem — bromkiem etydyny. spowoduje. która silniej wiąże jednoniciowy DNA. Wysokie pH wywołuje rozdzielenie nici (denaturację) DNA. spun column chromatography) (sekcja 8. 1. w których jedna nić została przecięta (forma ocDNA). używa się do rozdzielania małych fragmentów DNA lub RNA (o długości około 5-500 nukleotydów). Do elektroforezy w żelu próbkę umieszcza się w tzw. po neutralizacji. isopycnic centrifugation) (sekcja 8. przez co ich gęstość zmniejsza się bardziej niż cząsteczek superhelikalnych. 4). chromatografię w kolumnach zwirowywanych (ang. Elektroforeza może rozdzielić zmieszane. dzięki temu. 5. koliste plazmidy. naładowane elektrycznie cząsteczki. że w wypływie pojawią się tylko superhelikalnie zwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (cccDNA) (prawa). mające gęste usieciowanie. 4) w gradiencie chlorku cezu. studzience (kieszonce) na jednym końcu żelu. jest szybsza i łatwiejsza. To zniekształcenie helisy zmniejsza gęstość DNA. Żele poliakryloamidowe. Cząsteczki małe i/lub niosące wysoki ładunek zwykle poruszają się szybciej niż duże i/lub słabo naładowane. 188 . cząsteczki barwnika mają tendencję do wbudowywania się między dwie przylegające pary zasad. Cząsteczki liniowe i koliste nacięte pobierają więcej barwnika niż cząsteczki superhelikalne.

tak aby jednoniciowe kwasy nukleinowe wiązały się z nim kowalencyjnie. Ten (silniejszy) sposób wiązania fragmentu DNA z podłożem pozwala na usuwanie związanej sondy i ponowne analizowanie badanego materiału z użyciem innej sondy. 1. 70°C w próżni. które po wybarwieniu in situ ujawniają się jako prążki lub plamy. Transfer metodą „Western blotting" odnosi się do przenoszenia białek na błonę. Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE (ang. 1. Ten skierowany ku górze strumień płynu niesie ze sobą fragmenty DNA z żelu do arkusza nitrocelulozy. W tym typie elektroforezy używa się dwóch pól elektry- 189 . 5. przez poddawanie działaniu specyficznych. Wewnątrz żelu fragmenty DNA są rozdzielane na określone prążki. Związanie przeciwciała z odpowiednim białkiem wskazuje na jego antygenowy charakter. „Immunotransfer" odnosi się do przenoszenia białek na odpowiednią błonę w celu poddania ich działaniu znakowanych przeciwciał. Przed użyciem APT jest chemicznie modyfikowany przez działanie diazopochodną. 12. pulse-field gel electrophoresis). Wiązanie się fragmentu z sondą (hybrydyzacja typu Southerna) jest wykrywane dzięki znacznikowi niesionemu przez sondę — identyfikuje ona bowiem określoną sekwencję danego fragmentu. Zamiast błony nitrocelulozowej można używać specjalnego papieru. zawierającego 2-aminofenylotrieter (tzw. w której do przenoszenia materiału na odpowiednie błony wykorzystuje się siły pola elektrycznego zamiast sił kapilarnych. Southern blotting). Mogą one być w razie potrzeby przenoszone na odpowiednie (podobne do papieru) membrany metodą Southerna (ang. 4). 5.żele agarozowe stosuje się natomiast do rozdzielania większych fragmentów DNA (o długości około 500-500 000 nukleotydów). ang. papier-AFT). patrz rysunek 8. zależnie od wielkości. Transfer metodą „Nothern blotting" odnosi się do przenoszenia fragmentów RNA z żelu na odpowiednią błonę. następnie żel jest przenoszony do neutralnego buforu i formowany jest zestaw do przenoszenia (jak pokazano na schemacie). Cząsteczki lokują się w żelu w odrębnych strefach (zgodnie z wielkością). wick). Transfer metodą „Southwestern blotting": patrz sekcja 8. Standardowa elektroforeza może rozdzielać fragmenty o długości do około 20 000 pz. w wyniku przeprowadzonej elektroforezy (sekcja 8. 5. co powoduje przytwierdzenie DNA do jego powierzchni. (Ułożenie fragmentów DNA na arkuszu nitrocelulozy odpowiada ich ułożeniu na żelu. PFGE rozdziela cząsteczki o długości nawet ponad 10 milionów par zasad. 3). lub przez elektrotransfer. przechodzi przez żel oraz przepuszczalną nitrocelulozę do stosu papierowych ręczników lub bibuły. 14. Fragmenty DNA mogą być następnie analizowane np. Fragmenty są najpierw denaturowane (przekształcane w formy jednoniciowe) poprzez działanie na żel zasadami. znakowanych sond (sekcja 8. nie jest wtedy potrzebne wiązanie DNA poprzez zapiekanie. W wyniku działania sił kapilarnych neutralny roztwór w dolnym naczyniu podsiąka do żelu przez porowaty materiał (knot. ) Arkusz nitrocelulozy jest następnie zapiekany w temp. „Elektrotransfer" jest szybszą metodą transferu.

natomiast gdy wektor insertu nie zawiera niosące. które nie byłyby wydajne w transformacji (sekcja 8. Dlatego też powinniśmy dysponować sposobem potwierdzenia pobrania wektora z insertem w celu uniknięcia pewnych wątpliwości zasygnalizowanych w sekcji 8. 4. replacement vector) są konstruowane przez usunięcie części DNA fagowego. niektóre komórki mogą nie otrzymać wektora. B) Academic Press. 1). ] 8. 15. jeżeli wektor „sygnalizuje" swoją obecność w komórce. W jaki sposób możemy zidentyfikować kolonie zawierające wektor z insertem? Pewne wektory zawierają geny oporności na antybiotyki. 1. 1. Inne wektory mogą zawierać gen kodujący wytwarzanie β-galaktozydazy — enzymu. 8. fragmenty przeznaczone do klonowania są włączane do genomu fagowego i ulegają replikacji łącznie z nim wewnątrz komórki. który rozszczepia laktozę (sekcja 7. w wektorze pochodzącym od faga λ może być klonowany fragment o wielkości około 20 kpz. Jest bardzo pomocne. użyć wektory fagowe (fagi: rozdz. możemy spowodować wbudowywanie fragmentów do tego genu (inaktywując go) po prostu przez wybranie miejsca cięcia enzymem restrykcyjnym w jego obrębie. który nie jest niezbędny do jego namnażania i zastąpienie go przez fragment przeznaczony do klonowania. Klonowanie dużych fragmentów. W tym przypadku. że wektor uległ recyrkularyzacji bez wbudowania obcego fragmentu DNA (patrz rys. przykład przedstawiono na rysunku 8.cznych. 2) klonowane w wektorach plazmidowych tworzyłyby bardzo duże cząsteczki. ISBN 0 12 101290 5. kiedy wektor zawiera insert. 5. 5. powstają białe kolonie (gen kodujący β-galaktozydazę jest zinaktywawany przez insert). Tak zwane wektory wymienne (ang. 1993. Jeszcze większe fragmenty (nawet do 40 kpz) mogą być klonowane w kosmidach (rys. Ten system indykatorowy jest oczywiście użyteczny tylko w przypadku. 1). 1. Następnie kolonie. 8. 15). podczas gdy w plazmidzie pBR322 — fragment nie większy niż 10 kpz. gdy konstruujemy bibliotekę (rys. w jakim cząsteczka ta może zmienić swój kierunek ruchu po zmianie kierunku przepływu prądu. 1) i może tworzyć niebieskozielony produkt przez rozszczepienie Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd). które wstrzykują swój DNA do komórki. mogą sygnalizować obecność bądź brak insertu na podłożu zawierającym Xgal. go komórki tworzą kolonie niebieskozielone (β-galaktozydaza jest obecna). na podstawie wyrażania oporności na antybiotyk). 5. Tak więc. Duże fragmenty DNA (sekcja 8. 5. kiedy komórki jako takie nie wytwarzają β-galaktozydazy. 1. Geny te mogą sygnalizować swoją obecność (i obecność insertu) przez ekspresję (lub jej brak) w komórce gospodarza. 1. [Użytecznym źródłem informacji jest: Pulsed Field Gel Electrophoresis (Birren. a wypadkowe tempo migracji określonej cząsteczki zależy od tempa. 7). 1. 9). z kolei pewne wektory mogą nie posiadać insertu — co wynika z tego. 8. 5. o których wiemy. 7). 1). że zawierają wektor (np. Możemy wówczas zamiast plazmidowych. ustawionych do siebie pod kątem. 190 . Na przykład kiedy populacja bakterii jest transformowana biblioteką genów (sekcja 8. 5 Wektory Wektory służą do wprowadzania DNA do komórek (sekcja 8. 8. 1.

W pBR322 origin replikacji (ori) pochodzi z plazmidu replikującego się pod zrelaksowaną kontrolą (sekcja 7. komórki zawierające wektor z insertem nie utworzą kolonii. Efekt ten jest wykorzystywany do tzw. ze względu na inaktywację genów oporności na tetracyklinę (komórki zawierające zrecyrkularyzowany wektor wyrosną na obu podłożach).Wektory plazmidowe są zazwyczaj małe (w zakresie wielkości 3-5 kpz). Wektor do klonowania musi oczywiście posiadać origin replikacji (sekcja 7.. od góry). ponieważ transformacja z użyciem małych plazmidów jest bardziej wydajna i są one mniej wrażliwe na uszkodzenia podczas izolacji z komórek. 2). amplifikacji liczby kopii wektora. 3. Tak więc pBR322 ma zdolność do replikacji w nierosnących (zahamowanych przez chloramfenikol) komórkach bakteryjnych. sztucznych chromosomach bakteryjnych. 1. Tak więc. 8. Schemat wektora pBR322 dzięki uprzejmości Pharmacia Biotech Inc. bacterial artificial chromosomes. Różnorodność miejsc restrykcyjnych pozwala na dużą dowolność konstruowania zrekombinowanych cząsteczek z użyciem DNA pochodzącego z różnych źródeł. Wisconsin. (ang. które replikują się w E. powodując ich inaktywację. Pokazano różne miejsca restrykcyjne (z podaniem ich odległości. 1. 4. 3). jeżeli konstruując bibliotekę z zastosowaniem pBR322 użyjemy enzym BamHI (rys. jak wskazują strzałki) pozwala stwierdzić obecność plazmidu w komórce oraz obecność insertu w plazmidzie. 191 . fragmenty będą włączane w obrębie genów kodujących oporność na tetracyklinę. Obecność genów kodujących oporność na ampicylinę i tetracyklinę (transkrybowanych w przeciwnych kierunkach. Pobieranie takich ogromnych cząsteczek przez komórki gospodarza następuje przy zastosowaniu elektroporacji (sekcja 8. BAC). jeżeli kolonie te będą następnie przereplikowane na podłoże z tetracykliną. 7). 1). coli. Każdy pokazany enzym restrykcyjny tnie pBR322 tylko raz (powodując linearyzację cząsteczki). Fragmenty osiągające długość nawet 300 kpz mogą być klonowane w tzw. A więc każda bakteria zawierająca plazmid może utworzyć kolonie na podłożu z ampicyliną. podczas gdy geny odpowiedzialne za oporność na ampicylinę pozostaną aktywne. USA. w kierunku zgodnym z kierunkiem ruchu wskazówek zegara. nawet do wielu tysięcy na komórkę. Molecular Biology Reagent Division. dużych kolistych cząsteczkach wektorowych skonstruowanych w oparciu o plazmid F. w pz. Milwaukee.

jeżeli w takiej cząsteczce odległość od jednego do drugiego miejsca cos wynosi około 40-50 kpz. do którego wbudowano miejsce cos (czarny kwadrat) faga λ (patrz rys. Kosmidy i fragmenty DNA łączą się przypadkowo. Wektor taki może bowiem nieść kompletne. co jest przydatne przy badaniu funkcji genów. genów oporności na antybiotyki. kodowanych przez plazmid. konstruowane in vitro. cos umożliwia zapakowanie plazmidu z insertem (in vitro) do główki faga λ. nawet bardzo duże geny eukariotyczne. 2). YAC stanowi użyteczną alternatywę dla bakteryjnych systemów klonowania i ekspresji genów eukariotycznych. yeast artificial chromosomes) mogą nieść insert o wielkości nawet 2000 kpz. Te liniowe cząsteczki wektorowe. a w pewnych przypadkach fragmenty DNA mogą być otoczone dwoma kosmidami (środek). Kosmidy są przecinane w pojedynczym miejscu restrykcyjnym. łącznie z sekwencjami promotorowymi i kontrolnymi. dzięki ekspresji.Kosmid (góra) jest małym plazmidem. Jego obecność w komórce można wykryć np. Cząsteczki po dodaniu ogonka mogą wstrzykiwać zrekombinowany DNA do odpowiedniej bakterii (tak jak zwykły fag). DNA wprowadzony w ten sposób do komórki cyrkularyzuje z wykorzystaniem miejsc cos i replikuje się tak jak plazmid. Enzymatyczne cięcie w miejscu cos (strzałka) powoduje powstanie lepkich końców i w obecności składników faga następuje pakowanie rekombinacyjnych cząsteczek. Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC. ang. 9. zawierają części drożdżowego (Saccharomyces cerevisiae) chromosomu konieczne do replikacji i segregacji w komórkach drożdży. Poszukiwanie specyficznych sekwencji prowadzi się w sposób podobny do stosowanego do przeszukiwaniu bibliotek w wektorach plazmidowych. aby mogła być zapakowana do główki faga λ. Wektory takie znalazły 192 . to sekwencja ta jest odpowiedniej wielkości. liniowe cząsteczki są mieszane w obecności ligazy z fragmentami DNA (przerywane linie) ciętymi tym samym enzymem.

Ekspresja może być kontrolowana na wiele sposobów. helper). i 4) origin replikacji nitkowatego faga (np. Wektory wahadłowe wyposażone są także w prokariotyczne i eukariotyczne markerowe geny selekcyjne. w pewnych systemach geny są włączane przez określone zmiany temperatury. Wektory ekspresyjne kodują elementy niezbędne do transkrypcji i translacji insertu (rys.też zastosowanie do sekwencjonowania genomu ludzkiego i mapowania genów. wycinany. ani ich genów „markerowych" (np. a wynikiem będzie tworzenie jednoniciowych kopii fagmidu (mechanizm procesu — patrz sekcja 9. coli. gapped). fl — tab. W razie potrzeby geny mogą być klonowane w bakteriach. Wektory wahadłowe (ang. Odpowiadający mu dziki typ genu. 18). jeżeli zainfekujemy komórkę bakterii zawierającą fagmid odpowiednim fagiem pomocniczym (ang. Mogą one kopiować in vivo określony Zmutowany gen drożdżowy. Komponenty eukariotyczne takich wektorów pochodzą z Saccharomyces cerevisiae. genów oporności na antybiotyki). np. 16. Sekwencje flankujące w wektorze łączą się z sekwencjami flankującymi Zmutowany gen. 9. 8. polilinker. Te jednoniciowe kopie będą pakowane w fagowy płaszcz białkowy (kodowany przez faga pomocniczego) i wydzielane do podłoża. który jest kopiowany (rys. na schemacie nie pokazano wektorowych punków startów ori. czyli z wyciętym genem. M13. na przykład geny oporności na antybiotyki wyrażane w bakteriach i geny kodujące zdolność do syntezy leucyny. ang. Istnieją wektory niosące Prokariotyczny origin replikacji i elementy niezbędne do kontroli ekspresji w eukariotach. np. Fagmid jest wektorem skonstruowanym in vitro. Fragment DNA może być włączony w obrębie MCS fagmidu. łącznie z otaczającymi (flankującymi) go sekwencjami chromosomowymi. a potem wyrażane w komórkach eukariotycznych. jest włączany do wektora. pozwalające im replikować się w obu typach komórek. shuttle vectors) mogą się replikować w różnych typach organizmów. Jednoniciowe kopie insertu po uwolnieniu z płaszcza fagowego mogą być wykorzystane do sekwencjonowa- 193 . 8. 2) tzw. 2). 8. czyli miejsce wielokrotnego klonowania (MCS. multiple cloning site) — patrz rys. gen oporności na kanamycynę). jaki i eukariotyczne sekwencje ori. Alternatywnie. 2. który może być następnie amplifikowany w E. Końcowy produkt jest kompletnym (kolistym) wektorem niosącym kopię zmutowanego genu. 1). 3) markerowy gen selekcyjny (np. tak aby w wektorze pozostały tylko sekwencje flankujące. Fagmid może być użyty do tworzenia dwuniciowych kopii insertu. aktywne w komórkach eukariotycznych. gen ten jest potem. replikacja będzie inicjowana z ori fagmidu. który zawiera: 1) plazmidowy origin replikacji. Taki „dziurawy wektor" (ang. [Artificial chromosomes (artykuł przeglądowy): Monaco and Parin (1994) TIBECH 12: 280-286. Odmianą wektorów wahadłowych są wektory zwane czasem „wektorami odzyskującymi" (ang. retrieval vector = gapped shuttle vector). wprowadzamy do komórki niosącej Zmutowany allel tego samego genu. tak jak w klonowaniu konwencjonalnym. z użyciem enzymów restrykcyjnych. Mogą one na przykład zawierać zarówno prokariotyczne. który jest następnie wprowadzany do bakterii przez transformację. 17).

Jeden ze sposobów właściwego zorientowania insertu jest pokazany na rys. 9).Promotor (Pr) jest zwykle silnym promotorem hybrydowym — takim jak np. 11). że po zajściu transkrypcji utworzony mRNA będzie zawierał sekwencję Shine-Dalgarno (sekcja 7. Trzy ważne zasady. które wiąże się z miejscem operatorowym (lacO) na plazmidzie. hamując transkrypcję. wtedy każdy lepki koniec fragmentu może się połączyć tylko z komplementarną sekwencją lepkiego końca wektora przeciętego dwoma takimi samymi enzymami. który ma być wyrażany. aby kodony insertu były w tej samej fazie co kodon inicjujący. Miejsce wiązania rybosomu (RBS) zapewnia. klonujemy w MCS. tzn. tak aby AUG mógł ustawić się poprawnie w stosunku do miejsca „P" na rybosomie (patrz rys. Aktywność może być włączona przez dodanie do podłoża izopropylo-β-tiogalaktozydu (IPTG). to: 1) insert musi być wbudowany we właściwej orientacji w stosunku do kierunku transkrypcji. promotor tac (skonstruowany in vitro z promotorów operonów trp i lac E. 7. 7. Alternatywnie. (Procedura ta zapobiega jednocześnie recyrkularyzacji wektora oraz insertu. możemy użyć wektora z wbudowanym genem lacI (rys. które należy spełnić. w innym przypadku wystąpi efekt analogiczny jak przy mutacji typu zmiany ramki odczytu (rys. Dla komórek. 6) musi być we właściwej odległości od RBS. sekwencją nukleotydów zawierającą wiele różnych miejsc restrykcyjnych (często zachodzących na siebie). musi być ona dostarczona w wektorze (powyżej insertu). odpowiadający insertowi mRNA był we właściwej ramce odczytu. 9. fragment takiego MCS może wyglądać następująco: DNA. 3) jeżeli w insercie brakuje sekwencji inicjatorowej. który ma być wyrażany. strzałki wskazują kierunek transkrypcji. 8. które nie syntetyzują białka regulatorowego operonu lac. 8. coli). dla zapewnienia maksymalnej wydajności translacji odległość ta powinna wynosić 5-13 nukleotydów. pozwalając dzięki temu na przebieg transkrypcji. 7. MCS (zwane także polilinkerem) jest miejscem wielokrotnego klonowania. zwiększając zatem efektywność włączania insertu do wektora). 2) odpowiednik kodonu inicjatorowego w insercie (transkrybowany jako AUG w mRNA — sekcja 7. 1b). 6) potrzebną do związania rybosomu (RBS to krótka sekwencja nukleotydów purynowych). który został wycięty z użyciem dwóch różnych enzymów restrykcyjnych nie mających komplementarnych lepkich końców. w takim przypadku należy zadbać. aby po transkrypcji. gen. duża liczba miejsc restrykcyjnych pozwala na znaczną dowolność wyboru enzymów do przygotowania insertu. 11). może być wyizolowany na fragmencie. Aktywność promotora jest (w tym przypadku) kontrolowana przez komórkowe białko regulatorowe operonu lac (patrz rys. 194 . IPTG wiąże się do białka regulatorowego i inaktywuje je..

11) — albo przez usunięcie jednoniciowych wystających fragmentów (np. linker — krótka. Nić związana z „niższą" (5'-do. który jej koniec połączy się (zliguje) ze modyfikowaną cząsteczką. nia (sekcja 8. 4). 17). 6 Linkery.3') nicią chromosomową działa jako starter (rys. że w naszym fragmencie nie ma miejsc rozpoznawanych przez ten enzym lub że są one przez metylację zabezpieczone przed cięciem (sekcja 7. W takim przypadku możemy zmienić końce jednej lub obu cząsteczek. Linkery są także używane do dopasowywania ramek odczytu (rys. 8. jeśli jest taka potrzeba. adaptory. Wiele fagmidów po obu stronach MCS (na przeciwnych niciach) zawiera sekwencje promotorowe. Adaptory są używane np. zauważ. a wolne końce nici wektora utworzyły połączenia z komplementarnymi sekwencjami w chromosomie. 7. 6). że nowo zsyntetyzowany DNA zawiera kopię zmutowanego genu. że będą też wyposażone w lepkie końce. Ponieważ linker jest sekwencją palindromową (tzn. obojętne jest. 5. sekwencja czytana w kierunku 5' do 3' jest taka sama na obu niciach). stosując endonukleazę S1). ligowanie Aby połączyć cząsteczki DNA. 5. Przed ligacją z wybranym linkerem niezbędne jest upewnienie się. który zastosowano do jego włączania. np.: 5'-GGAATTCC-3' 3'-CCTTAAGG-5' zawiera sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI (tab. co umożliwia w razie potrzeby transkrypcję insertu. pozwala ona na ponowne wycięcie insertu. dodawanie tzw. 1). Podobnie. zazwyczaj stosujemy metodę pokazaną na rysunku 8. do insercji jednego lub kilku miejsc restrykcyjnych do wektora. Możemy lepkie końce fragmentu DNA zamienić na tępe (rys. syntetyczna cząsteczka dsDNA zawierająca miejsce restrykcyjne. 8. 8. tzw. lecz zawierają więcej niż jedno miejsce rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne i mogą być tak zaprojektowane. 1. z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego. Cząsteczki mogą jednak nie mieć miejsc restrykcyjnych lub zawierać miejsca niezgodne. jeżeli dalsza część postępowa- 195 . z udziałem ligazy.W chromosomie drożdżowym nastąpiła separacja nici w regionie zmutowanego genu . Do powstałych tępych końców dołączany jest. 8. 8) do Syntezy DNA (linia przerywana). Tak więc po ligacji powstaje kompletny (kolisty) plazmid. Po przyłączeniu linkerów przecinamy je odpowiednim enzymem restrykcyjnym i otrzymujemy lepkie końce. „ogonów". albo przez dosyntetyzowanie komplementarnych nici na każdym końcu „wystającej" nici z końcem 5'. 6. synteza następuje od przeciwnego końca drugiej nici (linia przerywana). Adaptory są podobne do linkerów.

Aby mogło to nastąpić. Końce 5' fragmentu pozostają ufosforylowane. z wytworzeniem wiązania fosfodiestrowego (rys. tworząc wspólny transkrypt. Enzymem powszechnie stosowanym do przeprowadzania ligacji jest. 9). ligaza kodowana przez faga T4. 5. Jakie jest zastosowanie takiej techniki? Opisana fuzja może być wykorzystana do: 1) ułatwiania detekcji i izolacji produktu określonego genu. zależna od ATP. 8. 8. 5. Na przykład adaptor z lepkimi końcami EcoRI i wewnętrznym miejscem Smal pozwala wyposażyć wektor w dodatkowe miejsce Smal. 8.nia tego wymaga. rys. koniec 5' DNA musi być ufosforylowany oraz konieczne jest dostarczenie energii (w postaci ATP). 5. Ligacja to łączenie (kowalencyjne) zestawionych ze sobą ufosforylowanych -5' i hydroksylowych -3' końców DNA. niemożliwa jest także recyrkularyzacja cząsteczek. Takie homopolimerowe końce mogą być wykorzystane do łączenia tępo zakończonych cząsteczek DNA. 2) określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznych białek oraz 3) badania regulacji ekspresji genu. Proces przedstawiony na rysunku 8. 4). na przykład jeżeli jedna cząsteczka zostanie wyposażona w koniec poli (dC). 2 Fuzja genów i białka fuzyjne Wektory ekspresyjne (sekcja 8. Podczas ekspresji niektórych sklonowanych genów ilość tworzonego białka jest trudna do wykrycia i izolowania. Zaletą takiej techniki jest to. niższej temperatury i dłuższego czasu reakcji. Reakcja taka jest mniej wydajna w przypadku dsDNA niż ssDNA lub cząsteczki z wystającym końcem 3'. 6 to ligacja w obrębie jednej nici DNA w różnych miejscach cząsteczki. Zastosowanie takiej techniki utrudnia jednak ponowne rozcięcie połączonych cząsteczek. 7) możemy zapobiegać recyrkularyzacji wektora (zwiększając tym samym częstość wiązania wektora z fragmentem) przez defosforylację końców 5' przeciętego wektora. Poniżej podane są przykłady. Ligacja tępych końców (łączenie dwóch tępo zakończonych fragmentów dsDNA) wymaga większego stężenia enzymu. Wszelkie pozostałe jednoniciowe przerwy w łańcuchach DNA są następnie naprawiane przez systemy komórkowe. że wytworzenie specyficznych par może nastąpić tylko między zakończeniami różnych cząsteczek. stosując enzym — alkaliczną fosfatazę. Zazwyczaj dodawane są nukleotydy jednego rodzaju — z wytworzeniem ogona homopolimerowego (np. deoksytymidynowego (dT) — patrz rys. W takich przypadkach można wywołać 196 . gdyż sparowane homopolimerowe zakończenia nie zawierają miejsc restrykcyjnych. 7. tailing) to dodawanie nukleotydów do końca 3' DNA z użyciem terminalnej transferazy deoksyrybonukleotydylowej. 16) mogą zawierać sekwencje dwóch różnych genów mających swoje ramki odczytu w zgodnych fazach. Dodawanie „ogonów" (ang. 8. Obie sekwencje mogą być wtedy transkrybowane z tego samego promotora. a druga — poli (dG). 1. którego translacja powoduje powstanie hybrydowego lub fuzyjnego białka. Przy konstruowaniu bibliotek genów (rys. przez co jest faworyzowane kowalencyjne wiązanie wektora z fragmentem.

umieszczamy wtedy sekwencję tego genu poniżej silnie wyrażanego genu partnerskiego (tworzymy ich fuzję) w wektorze ekspresyjnym. 5. emituje światło zielone (λ = 508 nm) przy naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 395 nm. takimi jak bromocyjan (który przecina łańcuch białkowy przy reszcie metioninowej) lub hydroksyloamina (tnie między resztą asparaginy i glicyny). 7. 2. (W tym przykładzie GST jest fragmentem powinowactwa (ang. W tym celu tworzymy fuzję genu kodującego to białko z genem kodującym GFP. applications and protocols) ISBN 0471 17839 X. 21(a) [Britton.fuzja sekwencji tego genu z sekwencją innego genu (tzw. 4(b). 11). w celu utworzenia kompletnej sekwencji sms-gfp. ] W fuzji lacZ. 5. Na przykład. Po wyizolowaniu. 5). genu partnerskiego lub nośnikowego). Może to ułatwić izolację i oczyszczanie badanego białka lub uchronić je przez wewnątrzkomórkowymi enzymami degradacyjnymi — patrz np. 5. co pozwala na rozdzielenie produktów każdego z genów. przez insercję z udziałem pojedynczego crossing-over typu pokazanego na rys. jeżeli gen partnerski koduje S-transferazę glutationu (GST). Na przykład. którego produkt normalnie jest zlokalizowany wewnątrzkomórkowo. jeżeli normalnie jest on słabo wyrażany. affinity tail) białka będącego przedmiotem naszego zainteresowania. ) Gen. niekorzystnych modyfikacji tego białka. zwiększając jego rozpuszczalność lub stabilność. np. 8. green fluorescent protein). Fuzja genów może mieć także zastosowanie do otrzymania produktu genu. którego produkt jest łatwy do wykrycia i izolacji. W tych konkretnych badaniach. białko fuzyjne może być łatwo izolowane metodą chromatografii powinowactwa (sekcja 8. Powszechnie stosowanym partnerem fuzyjnym jest gen kodujący białko fluoryzujące na zielono (GFP. dzięki fuzji może być połączony z genem. Fuzja może być też przydatna do badania regulacji ekspresji genów. wektor (zawierający jeden koniec smc w fuzji z gfp) był wbudowany w gen smc chromosomu. 1. trud- 197 . 1. Fuzje z GFP są stosowane w różnorodnych badaniach dotyczących struktur wewnątrzkomórkowych [Margolin 91998) TIM 6: 234-238. występujące naturalnie w meduzach rodzaju Aequorea. białko fuzyjne może być przecięte enzymatycznie przez odpowiednią specyficzną proteazę. partnerski gen lacZ koduje β-galaktozydazę (patrz rys. 11. tak więc ekspresja tego genu (a jednocześnie genu nas interesującego) może być monitorowana na podłożu zawierającym Xgal (sekcja 8. Białko to. fuzja Smc-GFP była wykorzystana do monitorowania lokalizacji białka Smc w badaniach nad rozdzielaniem chromosomów (sekcja 3. 4) z użyciem kolumny zawierającej glutation. a fuzyjne białko wykrywamy następnie z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego. Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. Rozdzielenie białka fuzyjnego można także osiągnąć działając czynnikami chemicznymi. jeżeli ekspresja genu nie może być monitorowana (z powodu np. sekcja 8. Fuzja z GFP może być wykorzystana do wykazania wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznego białka. Problemy napotykane przy cięciu chemicznym to: 1) cięcie także specyficznych miejsc obecnych wewnątrz oczyszczanego białka i 2) wprowadzanie nieplanowanych. Dodatkowe informacje na temat GFP: Chalfie and Kain (1998) Green Fluorescent Protein (properties. którego produkt jest wydzielany do środowiska. 1). ang. Gen partnerski może też wpływać korzystnie na produkt fuzyjny.

Sonda znakowana radioaktywnym fosforem 3 2 P może być wykryta metodą autoradiografii (patrz np. którego produkt lub aktywność jest łatwa do monitorowania. label) obecny w sondzie. Ze względu na specyficzność parowania zasad. pozostaje tylko frakcja sondy specyficznie związanej z DNA unieruchomionym na filtrze. można określić aktywność promotora tego genu po dokonaniu jego fuzji z genem reporterowym (ang. W pośrednim nieizotopowym znakowaniu wiązane są kowalencyjnie z sondą małe cząsteczki. Znacznikiem może być cząsteczka fluoryzująca (np. rys. który może być rozszczepiany przez enzym. 4. Pavitt i Higgins (1994) JB 176: 2128-2132]. które uprzednio powinno być związane z fluoryzującym lub enzymatycznym znacznikiem. acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT) i zielono fluoryzujące białko. Biotyna jest wykrywana przy użyciu streptawidyny — białka (ze Streptomyces avidinii) wiążącego się silnie z biotyną. jako nieprzewidywalną komplikację oddziaływań między cząsteczkami zrekombinowanych DNA.: gen kodujący galaktokinazę. Chociaż z reguły opisane systemy eksperymentalne działają prawidłowo. Możliwość taką musimy uwzględniać interpretując wyniki. z wcześniej dołączonym znacznikiem w postaci alkalicznej fosfatazy. możliwa do zlokalizowania dzięki niesionemu znacznikowi. Po dokładnym usunięciu (przez odpłukanie) niezwiązanej sondy. Ostatnio powszechne stało się nieradioaktywne (= nieizotopowe) znakowanie sond. którą wykrywa się w świetle ultrafioletowym. 1) — antydigoksygeniny. fluoresceina lub rodamina). kawałka jednoniciowego DNA (lub RNA). 8. tj. nastąpi jej związanie z sondą w rejonach komplementarności zasad. czy dany plazmid. dana sekwencja (jeżeli jest obecna) może być zlokalizowana przez związanie się z komplementarną do siebie sondą. stwierdzono. reporter gene). 5. Digoksygeninę wykrywa się następnie przez dodanie odpowiedniego przeciwciała (sekcja 11. 8. 3 Sondy Załóżmy.ności w oznaczaniu produktu genu). Jeden ze sposobów to użycie tzw. sondę wyznakowaną alkaliczną fosfatazą możemy 198 . że chcemy się dowiedzieć. Na przykład. Geny reporterowe to np. takie jak biotyna lub digoksygenina. Znacznik enzymatyczny może być także wykrywany metodami chemiluminescencji. Kompleks ten (przeciwciało-znacznik) wiąże się z digoksygeniną i jest wykrywany przez dodanie substratu. krótką sekwencję nukleotydów. i została w jakiś sposób wyznakowana. W praktyce. sondy molekularnej (ang. Jeżeli specyficzna sekwencja jest obecna w badanym materiale. 2. badany (tarczowy) DNA jest w formie zdenaturowanej (jednoniciowej). z uwolnieniem barwnego produktu oznaczanego kolorymetrycznie. probe). związanej z powierzchnią filtra nitrocelulozowego. o czym poinformuje nas znacznik (ang. Znacznik w bezpośrednim nie izotopowym znakowaniu wiąże się kowalencyjnie z sondą. DNA na filtrze jest inkubowany z nadmiarem sondy. genom lub inna cząsteczka DNA zawiera określoną. 10). którego sekwencja jest komplementarna do sekwencji poszukiwanej. że pewne geny reporterowe oddziałują na aktywność niektórych promotorów [Forsberg.

Wykazano. 1). wyznakowane przez streptawidynę. wyznakowana jako część hybrydowego plazmidu. mogą dać wyniki porównywalne z otrzymywanymi z zastosowaniem sond radioaktywnych. Sondy mogą być przygotowywane przez klonowanie określonej sekwencji (sekcja 8. że krótkie (np. jest wycinana enzymami restrykcyjnymi. który po rozszczepieniu przez ten enzym emituje światło. 5. dideoksy (sekcja 8. USA). związaną z alkaliczną fosfatazą przed hybrydyzacją. 5. Jeżeli sondy zwiążą się obok siebie do komplementarnej nici tarczowej. Sklonowana sonda może być. oddziaływania piren-piren spowodują fluorescencję o charakterystycznych cechach. przesunięcia nacięcia (ang. Wolny koniec sondy zawiera strukturę spinki do włosów. jednoniciowe nacięcia w hybrydowym wektorze. Do substratów chemoluminescencyjnych zaliczamy: 1. ale także np. 199 . Z zastosowaniem endonukleazy wprowadzane są przypadkowo rozmieszczone.wykryć przez dodanie substratu. nick translation) wg następujących zasad. w specyficznych pozycjach wiązania. Molekularne sondy świetlne (ang. Jeden koniec sondy (ssDNA) jest komplementarny do nici przy jednym końcu fragmentu tarczowego dsDNA. Sonda jest dodawana łącznie z białkiem RecA (sekcja 8. rys. gdy analizie poddawane są tarczowe sekwencje DNA unieruchomione na membranach. każda sonda. polimeraza DNA I E. Po ligacji. [Paris. Langenhan i Kool (1998) NAR 26: 3789-3793]. następnie inny enzym (np. 5. ) Bezpośrednie sondowanie dwuniciowego DNA — nowa metoda [Fujiwara i Oishi (1998) NAR 26: 5728-5733). RecA pośredniczy w zastąpieniu końcowego odcinka tarczowego DNA przez (homologiczną) sondę. 10-nukleotydowe) 5'-biotynylowane sondy. które są dodane w nadmiarze do mieszaniny reakcyjnej. Niektóre najnowsze ulepszenia. 6). albo pośredni. 4) lub syntetyzowane bezpośrednio w postaci każdej zaplanowanej sekwencji nukleotydowej. 2. starterów przy sekwencjonowaniu DNA metodą tzw. Sondy mogą być też przygotowywane z wykorzystaniem PCR (sekcja 8. 9. wyznakowana metodą tzw. Badford. Przygotowywanie sond. wykrywane na kliszy fotograficznej lub odpowiednim aparatem. Massachusetts. 1. przed wycięciem z wektora. coli) usuwa nukleotydy z naciętej nici (poczynając od nacięcia) i zastępuje je nukleotydami znakowanymi. Przygotowywanie takich sond związanych z enzymem jest opisane przez Guerasomową. 8. Ivanov i Lehrach [(1999) NAR 27: 703-705]. 5. stabilizując dodatkowo wiązanie sondy z tarczowym DNA. to. beacon probes) były zastosowane w NASBA w celu monitorowania produktu tworzonego podczas fazy amplifikacji (patrz sekcja 8. 2. W metodzie tej alkaliczna fosfataza może być wykrywana jako znacznik bezpośredni. 6). 2-dioksetany CSPD i AMPPD (oznaczenia zastrzeżone przez Tropix. Określone sekwencje mogą być wykryte przez dwie sondy oligonukleotydowe znakowane pirenem (jedna znakowana przy końcu 3' a druga 5'). której końcowy nukleotyd wiąże się kowalencyjnie (z udziałem ligazy) do nieodsuniętej nici DNA tarczowego. Taki znacznik może być użyty do znakowania nie tylko sond.

Metoda opiera się na wykorzystaniu zdolności polimerazy DNA I do wydłużania startera przez syntetyzowanie DNA na nici matrycowej (sekcja 7. 7. która żyje w gorących źródłach. pH lub stężenia elektrolitów. pozwalając „obejść" lub zminimalizować wpływ obecności błędnie sparowanych zasad matrycy i starterów na przebieg reakcji (w takim przypadku startery mogą wiązać się tylko w takich łagodnych warunkach). że utrzymywanie wysokiej temperatury (np. zawiera C-końcową część białka wyrażanego w E. 8). „uniwersalnego" nukleotydu w miejsce jednego lub kilku nieznanych nukleotydów [Nichols i wsp. w związku z tym kluczowym składnikiem reakcji PCR jest termo stabilna polimeraza DNA. sekwencjonowania DNA) ważne jest. w RAPD (sekcja 16. wyższa temperatura). W takich warunkach możemy zastosować mniej rygorystyczne (łagodniejsze) warunki (ang. gdyż do pewnych celów (np. ze względu na niekompletne dane dotyczące sekwencji w tarczowym DNA). 24. ) Podstawy metody są przedstawione na rysunku 8. w której powtarzane cykle replikacji określonej sekwencji nukleotydów (tzw. temperatury. rekombinacyjna polimeraza z Thermotoga maritima. Przykładem takiego enzymu jest polimeraza Taq z Thermus aquaticus. rekombinacyjna forma tego enzymu (tzw. jeżeli ich sekwencje są w pełni lub niemal w pełni komplementarne. fragment Stoffela). amplikonu). 5. Gdy trudno jest zaplanować odpowiedni starter (np. Polimeraza Taq nie ma aktywności egzonukleolotycznej 3' do 5'. Im wyższy poziom rygorystyczności warunków (np. 2. 4). aby amplikon był kopiowany z największą dokładnością. 16. a także. zazwyczaj o długości poniżej 2 kpz. jak wykazano. pozwala osiągać bardziej powtarzalne wyniki w technikach opartych na PCR. Nie wszystkie polimerazy DNA mogą funkcjonować w takiej temperaturze. Należy zwrócić uwagę. 2. a jej optimum wzrostu przypada na temperatury 66-75°C. np. rys. tworzą miliony kopii w ciągu kilku godzin. np. (1994) Nature 369: 492-493]. czyli nie może odszczepiać nukleotydów od końca 3' rosnącego łańcucha. aby nici matrycowego DNA pozostawały rozdzielone podczas wydłużania starterów. nawet gdy nie jest do niej w pełni komplementarny. 3). co powoduje brak aktywności korektorskiej (ang. Jednym z takich enzymów jest polimeraza DNA UlTma™ (Perkin Elmers). która wykazuje udokumentowaną zdolność naprawy zasad błędnie podstawionych podczas PCR. Zmodyfikowana. co jest z kolei podstawą syntezy DNA na jednoniciowych matrycach (sekcja 7. (Technika PCR jest chroniona patentem będącym własnością Hoffmann-La Roche Inc. AP-PCR: sekcja 16. 4c) wymagane jest. proof-reading). Do pewnych celów (np. high-stringency conditions) pozwalają na wiązanie się sondy do sekwencji tarczowej tylko wówczas. W takich przypadkach konieczne jest zastosowanie termostabilnej polimerazy mającej aktywność korektorską. aby starter wiązał się z matrycą. 2. 72°C) jest niezbędne. Warunki o wysokiej rygorystyczności (ang. aby nastąpiło poprawne związanie startera. bakterii. Cecha ta jest bardzo ważna. 200 . 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR) PCR jest metodą kopiowania DNA. jest ona nawet bardziej termostabilna niż oryginalna polimeraza Taq. 19. rys. coli. co optymalizuje wiązanie. możliwe jest użycie tzw. low stringency conditions). tym konieczny jest większy stopień zgodności sekwencji między starterem i sekwencją tarczową.8. 3.

rys. (1998) NAR 26: 3614-3615. każdy o długości około 20-30 nukleotydów. W obu przypadkach. 2. Przejściowe schłodzenie do 45-60°C pozwala starterom (w lewej górnej części) przyłączyć się (ang. 3) Deoksyrybonukleozydotrifosforany wszystkich czterech rodzajów. Mieszanina reakcyjna podlega serii zmian temperatury. nadmiernej liczby nici matrycowych współzawodniczących o pozostałą ilość polimerazy. 2) Startery: małe fragmenty ssDNA. Mieszanina reakcyjna zawiera wiele milionów kopii startera. 7. Stosowana temperatura na etapie przyłączania starterów powinna być wyższa przy większej w nich zawartości par G+C (porównaj liczbę wiązań wodorowych w parach GC i AT. niepożądane sekwencje (tak jak i te właściwe) mogą być amplikowane. kopie tej sekwencji powstałe w wyniku PCR są także nazywane amplikonami. 6) — takie zaostrzenie wymagań (warunków) zwiększa specyficzność przyłączania starterów zawierających dużo silnych wiązań GC. 5. Początkowe ogrzanie do około 94°C denaturuje próbkę DNA (góra) do formy jednoniciowej. 4. Startery nie powinny zawierać sekwencji. Ważny jest wybór starterów. 5) Odpowiedni bufor. jest nazywana amplikonem. i. Ogólnie mówiąc. taki cykl zmian jest powtarzany około 20-30 razy — temperatura jest zmieniana automatycznie pod kontrolą elektronicznych urządzeń odpowiednio zaprogramowanego „termocyklera". Przy powtarzających się cyklach zmian temperatur nowo zsyntetyzowane nici (podobnie jak nici oryginalne) działają jako matryce. że amplikonem może być też sekwencja nukleotydowa zawarta wewnątrz dłuższej cząsteczki DNA. Specyficzna sekwencja nukleotydów (w próbce). ale czasem mogą być wyższe [np. są dwa typy starterów: jeden komplementarny do końca 3' jednej nici próbki DNA i drugi komplementarny do końca 3' drugiej nici. zabezpieczenia się przez skutkami mogącymi wyniknąć z dostania się obcego DNA do mieszaniny reakcyjnej. które umożliwiają im wzajemne wiązanie się ze sobą (jest to szczególnie ważne w wielomiejscowym PCR) lub wytwarzanie w obrębie startera struktur drugorzędowych. liczba kopii powstającą w czasie η cykli PCR wynosi teoretycznie 2". które są zdolne zadziałać jako startery dla niepożądanych sekwencji w naszej próbce DNA. która jest amplifikowana w PCR.Skład mieszaniny reakcyjnej. ale po około 25 cyklach tempo syntezy zmniejsza się w wyniku np. dzięki czemu powstaje miesza201 . 1) Próbka DNA. zasada jest taka sama — amplikon jest definiowany jako sekwencja nukleotydów ograniczona przez każdą parę starterów. annealing). co jest ważne. co wiąże się ściśle z doborem temperatury ich przyłączania (ang. Temperatury przyłączania starterów z matrycą zawarte są zazwyczaj w zakresie 45 do 60°C. anneal) do komplementarnych do siebie miejsc przy końcu 3' każdej nici matrycowej. Zauważ jednak. powodzenie reakcji PCR wymaga zwracania uwagi na wiele szczegółów. 63°C: Ye i wsp. (1997) JCM 35: 566-569]. Procedury różnych modyfikacji podstawowej wersji reakcji PCR opisano w sekcji 8. Obcy DNA może przez przypadek zawierać miejsca zdolne do związania stosowanych starterów lub sekwencje. 65°C: Talbot i wsp. Zmiana temperatury do 72°C pozwala na przebieg syntezy DNA (przerywana linia) od końca 3' każdego startera. 4) Termostabilna polimeraza DNA.

4. Jest to szczególnie przydatne w przypadku patogenów. a także 8. Inne techniki. i tych. Jeżeli amplifikujemy fragment DNA w tym właśnie celu. technika PCR jest użyteczna w diagnostyce pewnych chorób i w badaniach epidemiologicznych. Ponieważ dany produkt PCR jest zazwyczaj określonej długości (w sensie liczby nukleotydów). aby wydłużanie starterów następowało tylko wtedy. Alternatywnie. rosnących bardzo powoli (np. 1. 3) jako prążek o określonej lokalizacji w żelu. w której te właściwe mogą stanowić tylko nieznanej wielkości frakcję. że amplifikacja danej sekwencji nie informuje nas o obecności żywego patogena. 1. 1 Przykłady zastosowań PCR Technikę PCR stosuje się w dziedzinach tak różnych jak ekspertyzy sądowe i paleobiologia. W pewnych przypadkach technika PCR jest po prostu używana do stwierdzenia. może to być np. które nie mogą być hodowane (czyli nie rosną in vitro). 6. PCR ma szeroki wachlarz zastosowań. a następnie wykryta odpowiednim sposobem. (Patrz także sekcja 16. w celu określenia lub sprawdzenia jego sekwencji nukleotydowej. 5. Niektóre z zastosowań PCR w bakteriologii i biologii molekularnej wymieniono niżej. Mycobacterium tuberculosis). Jednym z wczesnych przykładów była szybka diagnoza gruźliczego zapalenia opon mózgowych [Kaneko i wsp. 5). 4. 8. 5. 2. jak w metodach konwencjonalnych). czyli występować tylko i wyłącznie w danym typie patogena. 8. 5. 14). gdy sekwencja tarczowa (poszukiwana) jest obecna w próbce klinicznej. 6). Zwróćmy jednak uwagę. PCR może potwierdzić przypuszczalną diagnozę choroby w ciągu godzin (zamiast tygodni. 5. 5. że technika PCR może być pomocna w wykrywaniu patogenów w materiale klinicznym poprzez identyfikację unikatowych sekwencji w ich DNA. 1. 4. w których 202 . 3. 5. może być łatwo zidentyfikowany w elektroforezie (sekcja 8. 4. 1. sekwencja kodująca unikatową toksynę. 3) i ustalenie. 1. 2. a o wykorzystaniu pewnych wariantów podstawowej techniki PCR wspomniano w sekcji 8. Pewne rozwiązania zabezpieczające przed takimi problemami są opisane w sekcji 8. Warunki reakcji muszą być tak dobrane. Szybko stało się oczywiste. asymetryczny PCR (sekcja 8. 4. PCR można zastosować do skopiowania określonego amplikonu. 2. 4. (1990) Neurology 40: 1617-1618]. 5. interesująca nas sekwencja nukleotydowa jest obecna w badanej próbce. Na skutek tego. w próbkach klinicznych) mogą hamować reakcję PCR (patrz sekcja 8. produkty mogą być analizowane metodą Southerna i hybrydyzowane ze specyficzną znakowaną sondą (rys.nina produktów. Produkt amplifikacji może być dodatkowo sprawdzony przez trawienie enzymami restrykcyjnymi (sekcja 8. że jeżeli sekwencja ta jest obecna. z których wybrane są zaprezentowane w sekcji 8. 5. 4. 5. produkty PCR możemy uzyskać stosując tzw. ) Do celów diagnostycznych startery muszą być oczywiście wysoce specyficzne. 1. czy też nie. Niektóre substancje (znajdujące się np. to zostanie zamplifikowana. czy jakaś szczególna. Założenie jest takie. czy powstały fragmenty o przewidywanej wielkości.

Produkty PCR mogą być użyte jako sondy (sekcja 8. W innym systemie mieszanina reakcyjna bez polimerazy jest pokrywana warstwą wosku (AmpliWax™. 20a. 2. 75-80°C i pozostawiony do zakrzepnięcia. 4 (także sekcja 8. 2. PCR z użyciem arbitralnie dobranych starterów (AP-PCR. Asymetryczna reakcja PCR (ang. następnie reakcja PCR przebiega normalnie. PCR jest stosowany w analizie różnicowania poziomu ekspresji (ang. 4. 5. Patrz rysunek 8. hot-start PCR). 11. ang. 1: 50). 2. jednakże ogromny nadmiar drugiej sondy spowoduje. 7. z użyciem „sond o szerokim zakresie występowania" (sekcja 10. 5.chodzi o badanie sekwencji. przez związanie ze specyficznym przeciwciałem. 6. [The future of PCR technology: White (1996) TIBTECH 14: 478-483. differential disply) (sekcja 8. 1. 2). 3. 2). Produkty PCR mogą być wbudowane do wektora ekspresyjnego (sekcja 8. Technika PCR jest przydatna w badaniach klasyfikacyjno-taksonomicznych (sekcja 16. zostanie ona zużyta po kilku cyklach reakcji PCR. 8). amplification refractory mutation system). 4. który został uprzednio stopiony w temp. 6) lub użycia jako sondy (sekcja 8. 5. 2. 19c i sekcja 15. 5. 5. Polimeraza nałożona powyżej warstwy wosku może działać tylko po osiągnięciu podczas kolejnych cykli odpowiedniej temperatury. 5. Metoda ta może być zastosowana np. 3). 11. zwiększa to specyficzność i czułość reakcji w wyniku uniemożliwienia wydłużania starterów związanych w niespecyficznych miejscach matrycy. 1. W jednym z systemów polimeraza jest hamowana w początkowym etapie reakcji ogrzewania aż do 70°C. 14). 14). ] 8. że jedna z nici matrycowego dsDNA zostanie skopiowana znaczącą ilość razy. póki nie zostanie ona ogrzana do temperatury powyżej optymalnej temperatury wiązania startera. 3). Perkin Elmer). Ten wariant reakcji polega na wstrzymaniu dodania lub zablokowaniu aktywności niezbędnego składnika mieszaniny reakcyjnej. jest wykorzystywany do badań przeglądowych dotyczących różnorodności gatunków w próbach środowiskowych. 2. W procedurze tej jedna z dwóch typów sond jest stosowana w znacznie mniejszym stężeniu niż druga (np. 2. 2. 6. 203 . PCR ze wstępnym podgrzaniem (ang. PCR. ang. 8. 8). 16. 5). prowadzącym do pierwszego etapu denaturacji. 4. asymmetric PCR). do przygotowywania jednoniciowego DNA do sekwencjonowania (patrz sekcja 8. „genetyczny odcisk palca" typu dideoksy (ang. 5. dideoxy fingerprinting) oraz test sondy liniowej (sekcja 15. arbitrarily primed PCR). 5. to SSCP (rys. Patrz sekcja 16. Inaktywacja polimerazy ustaje przy dalszym podwyższaniu temperatury. 4-16. 2 Pewne (spośród wielu) odmiany technik PCR System wykrywania mutacji poprzez niepodatność na amplifikację techniką PCR (ARMS. 4.

(a) Technika ARMS (ang. W procedurze tej kopiuje się DNA. planujemy starter z 3'-końcową guanozyną. Najpierw fragment jest cyrkularyzowany (środek). Następnie wprowadzane jest cięcie w miejscu restrykcyjnym (linia przerywana) w pozycji między końcami 5' dwóch starterów. Technika ta pozwala wykryć specyficzne mutacje punktowe w DNA. który otacza (flankuje) znaną sekwencję (a nie tę właśnie sekwencję). po połączeniu ze Zmutowana nicią starter może być wydłużany przez PCR — wskazując na obecność mutacji. (b) Odwrócona reakcja PCR. ang. Technika PCR może być zastosowana do otrzymywania próbek jednoniciowego DNA. że gdy zwiążą się z fragmentem. Startery PCR są tak planowane. która powinna pasować do potencjalnie zmutowanej zasady. single-strand conformation polymorphism). Schemat pokazuje liniowy fragment (góra). w którym znana sekwencja występuje w obrębie miejsca zaznaczonego kwadratem. (c) Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (SSCP. Metoda może być zastosowana np. Tą metodą mogą być wykryte nici. wykrywając różnice ich sekwencji przez ujawnianie różnic w ruchliwości elektroforetycznej w żelu poliakryloamidowym. do badania miejsca insercji znanej sekwencji do chromosomu lub plazmidu. którego sekwencja „dzikiego typu" jest nam znana. Na schemacie zaznaczona jest mutacja G do C (guanina do cytozyny) jako „C" w górnej nici cząsteczki (góra). W przypadku nici „dzikiego typu" (brak mutacji) (dół). ich końce 3' będą wydłużane w kierunku wskazanym przez strzałkę. jakie jest w standardowej PCR (dół). 204 . które różnią się nawet jedną zasadą. Opisana linearyzacja powoduje powstanie cząsteczki o takim ułożeniu starterów wobec matrycy. W analizie SSCP porównuje się różne (ale podobne) próbki jednoniciowego DNA. amplification-refractory mutation system). Aby wykryć tę mutację. starter nie będzie wydłużany ze względu na niemożność utworzenia pary pomiędzy dwoma nukleotydami guanozynowymi.

prowadzi się kolejnych 25 cykli PCR z użyciem pary starterów komplementarnych do subterminalnych sekwencji matrycy. reverse transcriptase PCR). Patrz rysunek 8. Rysunek pokazuje dwie pokrewne nici DNA. tworzonych metodą PCR lub otrzymanych w wyniku trawienia restrykcyjnego. [de Oliveira i wsp. 2. „topnienie" DNA (rozdzielanie nici) w części fragmentów (parowanie zasad jest silniejsze w regionach bogatych w pary GC) — co wpływa na ruchliwość elektroforetyczną i pozwala na rozdzielenie fragmentów w żelu. Muyzer and Ward (1966) AEM 62: 340-346]. dwuniciowych fragmentów DNA przez elektroforezę dwukierunkową. [Patrz także Birch i wsp. która pozostaje nieaktywna. 1. 205 . amplifikowanych metodą PCR. zależne od sekwencji. co z kolei powoduje powstawanie form konformacyjnych wpływających na ruchliwość elektroforetyczną. i do identyfikowania Rhizobium spp. 5. zespól wstrząsu toksycznego — sekcja 11. 20b. Początkowo. Następnie. Złożona lub wielomiejscowa reakcja PCR (ang. a co za tym idzie różną ruchliwość elektroforetyczną. nested PCR). sekwencji z ich genów kodujących 16S rRNA [Ferris. Patrz sekcja 16. aż w odpowiedniej temperaturze zostanie termicznie zaktywowana. do charakteryzowania organizmów przez porównywanie. Vijg (1995) Biotechnology 13: 137-139].Jeszcze inna metoda opiera się na zastosowaniu chemicznie zmodyfikowanej formy polimerazy DNA (AmpliTaqGold™DNA polymerase. denaturing gradient gel electrophoresis ) — służy do porównywania próbek pokrewnych. zwiększa zarówno czułość. inverse PCR). Podobna metoda — analiza w żelu denaturującym (DGGE. gdy różnice w ich sekwencji nukleotydowej wywołują różny poziom wewnątrzniciowego parowania zasad. 2. w nici położonej niżej zmiana w sekwencji nukleotydowej spowodowała utratę zdolności lokalnego wewnątrzniciowego parowania zasad — tak że dwie pokazane nici mają teraz różną konformację. DGGE stosowano np. w przypadku dostępności małej ilości tarczowego (tego. aby zapobiec zrywaniu wszelkich istniejących wewnątrzniciowych powiązań między zasadami. (Patrz np. ang. (1999) LAM 28: 137-41. PCR z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (rtPCR. Pokrewne nici DNA mogą mieć odmienną ruchliwość elektroforetyczną także wówczas. nPCR stosowano np. mocznik + formamid). (1996) Nature 381: 445-445. Wewnętrzna reakcja PCR (ang. Początkowo prowadzona jest standardowa reakcja PCR (przez około 25 cykli) (góra). następnie reakcja PCR jest prowadzona w typowy sposób. PerkinElmer Applied Biosystems). Kilka różnych par sond jest stosowanych jednocześnie. fragmenty są wstępnie rozdzielane (na podstawie wielkości) w pierwszej fazie elektroforezy. nPCR. Patrz rysunek 8. jak i specyficzność PCR. 5. który chcemy amplifikować) DNA lub gdy materiał wyjściowy był niezbyt dobrej jakości. REP-PCR (amplifikacja repetytywnych sekwencji). enzym odwrotna transkryptaza tworzy kopię cDNA próbki RNA (sekcja 8. co umożliwia amplifikowanie więcej niż jednej sekwencji w próbce. ] Odwrócona reakcja PCR (ang. multiplex PCR). na określonym poziomie gradientu następuje zlokalizowane. Żel używany w analizie SSCP jest niedenaturujący. 2). jak donoszono. Przy użyciu właściwych starterów technika ta może być zastosowana np. 20d. 11). W metodzie tej [patrz np. 9. 1). do wykrycia specyficznej cząsteczki mRNA lub obecności genomów pewnych RNA fagów w komórce bakteryjnej (tab. (d) Wewnętrzna reakcja PCR (nPCR). ang. w tym samym żelu fragmenty są przemieszczane elektroforetycznie pod kątem prostym w stosunku do oryginalnej ścieżki — tym razem poprzez wzrastający gradient czynników denaturujących DNA (np. Końcowym produktem jest więc zbiór wielu kopii sekwencji zawartej wewnątrz sekwencji oryginalnej (dół). wykorzystując część produktu jako matrycę. Następnie.

20c. proponowane rozwiązania Wspomniano wcześniej. który wymaga jednoniciowej matrycy DNA. W metodzie tej każda mieszanina reakcyjna zawiera enzym uracylo-N-glikozylazę (UNG). np. Zaktywowany izopsoralen wiąże kowalencyjnie dwie nici w dsDNA. wprowadza się dodatkowy etap. a tym samym nie mogą działać jako matryce w reakcji. Jednym z proponowanych rozwiązań tego problemu jest przeprowadzanie reakcji PCR rutynowo z użyciem trifosforanu deoksyurydyny (dUTP) zamiast trifosforanu deoksytymidyny. 5. Zauważmy. 365 nm/4°C/15 min). 15. które rutynowo testują próbki w kierunku obecności tylko jednego lub dwu amplikonów. co powoduje fotoaktywację izopsoralenu. ) Rutynowo. 11. podczas mieszania składników reakcji przed jej rozpoczęciem. 5. 2). (UNG należy do enzymów naprawiających DNA: sekcja 7. PCR na podłożu stałym (ang. W wyniku tego końcowymi produktami PCR są amplikony dsDNA. 7. solid-phase PCR). Po reakcji. Wysoka temperatura inaktywuje jednocześnie UNG. 2). 3 Problem obecności obcego DNA w reakcji PCR. (1999) JCM 37: 261-262. w którym UNG reaguje z zanieczyszczającymi pozostałościami DNA z poprzedniej reakcji. co zredukuje jej wydajność i specyficzność. próbka nowo wprowadzona do testowania jest narażona na zanieczyszczenie pochodzące z nagromadzonego DNA sekwencji tarczowych z poprzednich próbek. 1. „mis-priming") jest znacznie bardziej prawdopodobne w niższej temperaturze (mniej rygorystyczne warunki reakcji). [Optimal activation of isopsoralen: Fahle i wsp. ang. na przykład w laboratoriach klinicznych. po czym podczas pierwszego podwyższenia temperatury do 95°C przy starcie reakcji amplikony poddane działaniu UNG zostaną zniszczone w wyniku powstających dwuniciowych pęknięć. które nie mogą ulec denaturacji. mieszanina jest poddawana działaniu promieni ultrafioletowych (np. 4. tak że właściwa reakcja może być kontynuowana już przy braku UNG i zanieczyszczeń. 4. Patrz rysunek 8.Polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA (SSCP. 3. Jest to szczególnie ważne. który usuwa uracyl z dUMP w DNA. Inne rozwiązanie polega na włączeniu izopsoralenu do mieszaniny reakcyjnej PCR. nie może natomiast być użyta na przykład w ddF (sekcja 15. ] Ryzyko namnożenia niewłaściwych sekwencji w wyniku rozpoczęcia reakcji od błędnego startera (ang. dTMP. ponieważ każdy niespecyficzny produkt utworzony we wczesnym etapie będzie amplifikowany przez cały czas reakcji. że UNG nie wpływa na matrycowy DNA — który ma normalny (zawierający tyminę) nukletyd. przed rozpoczęciem właściwej reakcji. 206 . single-strand conformation polymorphism). kiedy w produktach reakcji chcemy wykryć daną sekwencję przez elektroforezę. 8. 4. 5. Tworzenie niespecyficznych produktów jest minimalizowane (a nawet eliminowane) w reakcji PCR typu „hot-start" (sekcja 8. Patrz sekcja 8. Metodę tę można stosować. że zanieczyszczenie obcym DNA może zagrażać pomyślnemu przebiegowi reakcji PCR. Jest to niezwykle poważny problem.

6) lub użycia jako sondy molekularnej. Kiedy tak się stanie. produktem PCR (w wyniku ligowania tępych końców — sekcja 8. 8. np. 4 Klonowanie tępo zakończonych produktów reakcji PCR Prosta i wygodna metoda klonowania produktów reakcji PCR. znajdującą się tylko w jednym z dwóch typów produktu. póki nacięty koniec nie ulegnie zligowaniu z fragmentem. religacji itd. 5. 1. „rzadko tnącej" endonukleazy restrykcyjnej (sekcja 8. Taki wektor można wprowadzić do bakterii przez transformację. ligacji. zawierającym mocznik w dużym stężeniu). 4. który hamuje tworzenie par między komplementarnymi nićmi. do mieszaniny reakcyjnej dodaje się streptawidynę (białko pochodzące ze Streptomyces cwidinii). wektor przestanie być podatny na działanie Srfi i może nastąpić połączenie wolnych końców wektora oraz fragmentu. a więc wektor ze sklonowanym fragmentem może być wprowadzony do komórki przez transformację i powielać się tam. 5. 3). można założyć. Wbudowanie insertu inaktywuje ten gen. 5 Przygotowywanie jednoniciowego DNA z produktów reakcji PCR Oczyszczony jednoniciowy DNA jest potrzebny do wielu celów. a więc jednoniciowe komplementarne produkty PCR nie mogą hybrydyzować. Oczyszczony ssDNA może być otrzymany z produktów reakcji PCR szybką i prostą metodą opisaną przez Pagratisa [(1996) NAR 24: 3645-3646]. 3). przed sekwencjonowaniem (sekcja 8. 5. 4. produkt i wektor inkubuje się w mieszaninie reakcyjnej z Srfi i ligazą łącznie. z wytworzeniem kolistej cząsteczki — wektora zawierającego insert. Aby włączyć produkt PCR do dwuniciowej kolistej cząsteczki wektora. podczas gdy zrecyrkularyzowany wektor. do sekwencjonowania (sekcja 8. 1. 1. 5. Miejsce Srfi ulegnie przecięciu (linearyzując cząsteczkę wektora). która wiąże się z biotyna.8. polega na użyciu tzw. spowoduje po transformacji zabicie swojego gospodarza (jest to przykład systemu. Przed reakcją PCR. 6). Mieszanina jest następnie poddawana elektroforezie w żelu denaturującym (np.. Ponieważ jeden z produktów jest związany 207 . 2). Srfi tnie DNA tworząc w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwencji tępe końce (sekcja 8. Wykorzystywany w tej metodzie wektor został skonstruowany przez insercję miejsca rozpoznawanego przez Srfi do genomu faga M13 (patrz sekcja 9. Srfi [Schlottere i Wolf (1966) TIG 12: 286-287]. że powstające produkty PCR w zasadzie nie zawierają miejsc rozpoznawanych przez Srfi. Ponieważ sekwencje takie występują rzadko. Po PCR. jeden z dwóch typów starterów jest znakowany biotyną. przecięciu. np. który niesie funkcjonalny letalny gen. Restryktaza Srfi (wytwarzana przez firmę Stratagen) rozpoznaje i przecina następującą sekwencję: 5'-GCCC/GGGC-3' 3'-CGGG/CCCG-5' W innej procedurze (z użyciem zestawu do „klonowania na tępe końce" — firmy Boehringer Mannheim) produkty reakcji PCR włącza się w tępo zakończone cięcie dokonane w obrębie letalnego genu wektora. 5. który umożliwia efektywną selekcję zrekombinowanego wektora). 5. 2. 6). 5.

zawiera także unikatowe miejsce wiążące odpowiednią sondę. 7 PCR — oznaczenia ilościowe W reakcji PCR możemy określić początkową liczbę sekwencji matrycowych (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. lecz region wiążący starter ma ona identyczny jak właściwy amplikon. cykl po cyklu. a startery — do sekwencji końcowych. Barwnik i wygaszacz są blisko siebie. Zamplifikowanie IC (co wykrywamy z użyciem sondy) świadczy o efektywności amplifikacji i braku inhibitorów. 1) to heparyna i hemina.. (1997) JCM 35: 995-998]. które są tak zaplanowane. Wtedy to polimeraza degraduje sondę (uwalniając barwnik i wygaszacz jako oddzielne cząsteczki) i kontynuuje syntezę komplementarnej nici amplikonu. annealing) przyłączają się do komplementarnych sekwencji w amplikonach. 5. Jeżeli od początku. 8. w wyniku czego drugi produkt utworzy w żelu dobrze oddzielony prążek. Zwróćmy uwagę. threshold cycle) i daje informację o początkowej liczbie matryc (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. IC jest nicią kwasu nukleinowego o przypadkowej sekwencji. sond TaqManR. tak więc w miarę przebiegu kolejnych cykli reakcji stopień fluorescencji będzie się zwiększał. internal controler) do każdej badanej próbki przed amplifikacją [Rosenstraus i wsp. Następnie polimeraza wydłuża starter aż do osiągnięcia miejsca sondy. Inhibitory w kale to pewne polisacharydy pochodzące z pożywienia [Monteiro i wsp. Inhibitory związane z krwią (sekcja 11. 5. można je usunąć stosując metodę preparatów DNA „uwięzionych" (zatopionych) w agarozie [Moreira (1998) NAR 26: 3309-3310]. tak że wolny (niezwiązany) starter jest niefluorescencyjny z powodu działania wygaszacza. aby hybrydyzować (wiązać się) do wewnętrznej sekwencji w amplikonie. a niewygaszany teraz barwnik staje się aktywny fluorescencyjnie. 4. jego ruchliwość elektroforetyczna (czyli tempo poruszania się cząsteczki podczas elektroforezy) jest znacznie zredukowana. 1. Na początku reakcji PCR mieszanina reakcyjna zawiera dużą liczbę sond. możemy zidentyfikować pierwszy cykl. Sondy TaqMan na etapie wiązania (ang. Reakcja może więc dać fałszywie negatywny wynik nawet w obecności specyficznej matrycy Jest to oczywiście szczególnie ważne w laboratoriach klinicznych. Jeżeli potrzebna nam jest określona nić. w którym fluorescencja przekracza poziom tła. 6 Inhibitory reakcji PCR Niektóre próbki zawierają substancje. które hamują reakcję PCR. W określonym amplikonie sonda wiąże się do sekwencji wewnętrznej. 8. że na każdy amplikon związany z sondą uwalniana jest jedna cząsteczka barwnika. 4. 8.z białkiem (streptawidyną). monitorujemy fluorescencję. Inhibitory można wykryć przez dodanie kilku kopii „wewnętrznego kontrolera" (IC. (1998) JCM 36: 191-197]. a każda sonda jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczem fluorescencji. przed reakcją PCR musi być biotynylowany starter drugiej nici. Jedna z metod wymaga użycia tzw. jest on nazywany cyklem progowym (ang. Im wyższa 208 . ang.

jeżeli numer cyklu progowego (1. 5 Mutageneza Jak już wiemy. 34. 7). 3. 1 Tworzenie przypadkowych (ang. 2. możemy ją ekstrapolować z tego wykresu. 8.. 35 itd. Mutageneza sklonowanego genu: szczepy mutatorowe. tym liczba matryc mniejsza. Jednym z takich szczepów mutatorowych jest Epicurian Coli® XL1-Red (firmy Stratagene). 1) mogą powstawać mutacje. ) wykreślimy wobec logarytmu początkowej liczby matryc. a mogą na nim wyrosnąć tylko komórki oporne. Takie podejście eksperymentalne było zastosowane np. podczas wzrostu i kolejnych podziałów nagromadzają się mutacje. Efektywną drogą wywoływania przypadkowych mutacji w sklonowanym genie jest wprowadzenie wektora (niosącego ten gen) do komórki mutatorowego szczepu bakterii. które uzyskały oporność na dany antybiotyk. Mutageneza (w tym także zaplanowane tworzenie mutacji) jest kolejną metodą oddziaływania na DNA. w różnych genach poszczególnych osobników (sekcja 8. W istocie. Jest to logiczne: im mniejsza początkowa liczba matryc. Z powodu braku normalnego systemu naprawczego.. występuje odwrotna zależność liniowa między numerem cyklu progowego i logarytmem początkowej liczby matryc. który w wyniku mutacji jest niezdolny do naprawiania uszkodzeń w DNA (sekcja 7. tworzenie fuzji itp. mutagenizowaną populację bakterii hoduje się na podłożu z tym antybiotykiem. tak więc otrzymamy linię prostą.wartość progowa. gdy nie znamy początkowej liczby matryc. w celu wyselekcjonowania zmutowanych komórek. random) mutacji Gdy bakterie są poddawane działaniu mutagenów. 8. w genomie bakteryjnym i w wektorze plazmidowym (lub innym) niosącym sklonowany gen. aby zmienić jego ekspresję. Na przykład. jak również w badaniach naukowych z zakresu biologii. Modyfikacje genów mogą znaleźć zastosowanie w medycynie i w przemyśle. 5. tak aby stał się on niefunkcjonalny lub nie kodował pierwotnego produktu. 2) zmodyfikowania genu. do ilościowego wykrywania Borrelia burgdorferi w próbkach zakażonej tkanki [Pahl i wsp. czyli szczepu. (1999) JCM 37: 1958-1963]. W szczepie tym mutacje nagromadzają się w tempie kilkanaście 209 . tym potrzeba większej liczby cykli do przekroczenia progowej wartości fluorescencji. 5. na kwasy nukleinowe można w różny sposób oddziaływać i manipulować nimi takimi metodami jak trawienie enzymami restrykcyjnymi i ligacja. Inaktywacja danego genu może być niezbędna do potwierdzenia jego roli w określonej funkcji przez porównywanie komórki z genem aktywnym i komórki zawierającej gen uszkodzony. 33. które uzyskują określony typ mutacji (i przejawiają dzięki temu jakąś zmienioną cechę lub funkcję). 5. Stosując odpowiednie warunki selekcyjne możemy izolować z mutagenizowanej populacji te komórki. Możemy ją przeprowadzić różnymi sposobami. Mutacje mogą być wywoływane w celu: 1) zinaktywowania genu.

4). Każda kopia ma nacięcie w jednej z dwóch różnych pozycji (pamiętajmy. 2) lub normalną transformację. nie są metylowane i nie będą podatne na działanie DpnI. coli. 1. Obie metody mogą być użyte do modyfikacji lub inaktywacji genu. a nawet rozleglejsze zmiany mogą być wprowadzane do DNA w dokładnie zaplanowane miejsca. a wektory ulegną replikacji. które wiążą się z odpowiednimi miejscami w insercie. W ten sposób mutacje powstają bez użycia zewnętrznego mutagenu. które były syntetyzowane in vitro. 8. 5. 4. Wektory niosące zmutowane inserty. Smc-GFP fusion: Britton. 2 Tworzenie mutacji specyficznych Mutacje specyficzne mogą być wykorzystane do badań ekspresji i funkcji genu oraz do modyfikowania w określony sposób produktu genu — np. Te dwa typy starterów są komplementarne do sekwencji na różnych niciach insertu. 21. który niesie zmienione sekwencje (mutacje). ich sekwencje zachodzą na siebie i obie zawierają zaplanowane mutacje (zmiany sekwencji). w związku z czym będą one podatne na działanie restryktazy DpnI (sekcja 7. 8. 21). Cząsteczki wektorów są najpierw mieszane z dwoma typami mutagennych oligomerowych starterów — analogicznych do tych. dodatkowo. które pokazano na rysunku 8. Następnie rodzicielskie (niezmutowane) wektory są eliminowane z użyciem endonukleazy restrykcyjnej Dpnl. 210 . po czym dodawane są startery. 1. Wektor niosący zmutowaną sekwencję wprowadzamy do komórki bakterii przez elektroporację (sekcja 8. Po wprowadzeniu ich do E. nacięcia zostaną naprawione in vivo. Wektory są termicznie denaturowane. a każda kopia posiadająca nacięcia zawiera insert. coli. Prostsza metoda (z użyciem zestawu Quick Change™ firmy Stratagene) mutagenezy specyficznej wobec miejsca nie wymaga jednoniciowej formy DNA (porównaj z metodą na rys.tysięcy razy większym niż w odpowiadającym mu szczepie dzikim. Zamiast tego stosuje się w niej dwuniciowe koliste wektory. 1). w celu ulepszania i zwiększania aktywności enzymów wykorzystywanych w przemyśle (przez zmiany określonych nukleotydów w kodujących je genach). Rodzicielskie cząsteczki wektorów replikowały się w E. Podczas kolejnych reakcji powstają kopie obu nici wektora zawierające nacięcia (przerwy). Rysunek 8. Mutacje punktowe (sekcja 8. Zasadę wprowadzania mutacji zwanych zlokalizowanymi lub specyficznymi wobec miejsca (ang. metoda (a) może posłużyć do przygotowania fuzji genowej [np. 5. Lin i Grossman (1998) GD 12: 1254-1259]. 21. Zmutowany lub zrekombinowany DNA może być wbudowany do chromosomu bakterii różnymi sposobami. Startery są wydłużane przez termostabilną polimerazę Pfu (z Pyrococcus furiosus). site-specific mutagenesis) (=mutageneza kierowana przez oligonukleotydy) pokazano na rysunku 8. 22 pokazuje dwie metody pozwalające następnie wbudować sekwencje wektorowe do chromosomu. że sekwencje startera są zachodzące). wytwarzając duże ilości zmutowanych insertów. każdy zawierający insert poddawanego mutagenezie fragmentu DNA. tak że dwie komplementarne nacięte kopie mogą hybrydyzować tworząc dwuniciową kolistą strukturę z nacięciami w różnych pozycjach. zawierającego sekwencje homologiczne do niesionych przez wektor.

Nawet bez udziału mechanizmów naprawczych replikacja dupleksu z błędnie podstawionym nukleotydem produkowałaby pewną liczbę cząsteczek z zaplanowaną dla mutanta sekwencją (po prawej na dole). jakie mogą się pojawić przy mutagenezie z wykorzystaniem plazmidów (sekcja 8. 4) DNA plazmidowego wewnątrz komórki bakterii oraz ewentualne niepowodzenia homologicznej rekombinacji. 5.Użycie wektora M13 pozwala na łatwe otrzymywanie jednoniciowych kopii danego genu. Jeden taki genom. 211 . hybrydyzację kolonijną (sekcja 6. niosący gen tarczowy (ten. 7) korygują błąd. Powstające cząsteczki dsDNA (każda z jednym błędnie podstawionym nukleotydem) są wprowadzane do bakterii na drodze transformacji. Każdy oligonukleotyd przyłączany jest następnie do kopii genu tarczowego (góra) i użyty jako starter do przeprowadzenia syntezy DNA in vitro (linia przerywana) (środek). do którego chcemy wprowadzić mutację). 1. W obrębie tej krótkiej sekwencji chcemy zastąpić deoksytymidynę (T) deoksycytydyną (C). 5. 2. Prostsze metody. Na schemacie pokazana jest (powiększona) 15-20-nukleotydowa sekwencja genu tarczowego. 3 Mutageneza transpozonowa Potencjalne problemy. to: możliwość restrykcji (sekcja 7. 5. czasem G na A. 5. opisano w sekcji 8. 2). 8. Aby to zrobić. najpierw syntetyzujemy kopię komplementarnej sekwencji (oligonukleotyd 15-20-nukleotydowy) zawierający jedną błędnie podstawioną zasadę (mis-match) w określonym miejscu. czasem zamieniając Τ na C. Drugi problem można ominąć dzięki zastosowaniu transpozonów (sekcja 8. czyli deoksyguanozynę (G) naprzeciwko deoksytymidyny (T). Najpierw gen (w postaci dwuniciowego fragmentu DNA) jest wbudowywany w kolistą. 2. 5. z użyciem znakowanych oligonukleotydów jako sond. 2). dwuniciową formę wektora M13 (patrz sekcja 9. 2). z użyciem dostępnych obecnie dwuniciowych wektorów. 5. 3). Komórki zawierające Zmutowaną sekwencję mogą być zidentyfikowane przez np. 5. jest pokazany na schemacie. Mechanizmy naprawcze wewnątrz komórki bakteryjnej (sekcja 7. replikacja M13 (w bakterii) tworzy jednoniciowe kopie genu wbudowanego do kolistej jednoniciowej formy M13 (ccc ssDNA).

insercja plazmidu spowoduje po prostu zastąpienie „dzikiego typu" końca genu przez Zmutowany fragment z plazmidu — rezultatem będzie więc powstanie kompletnego (tzn. tak aby rekombinanty można było łatwo wyselekcjonować na odpowiednim podłożu lub w odpowiednich warunkach. które mają plazmid wbudowany w interesujący nas gen chromosomowy. Jeżeli plazmid niesie dziką formę końcowej części genu tarczowego w postaci fuzji (w zgodnej ramce odczytu) z innym genem. Zapewnia to. w których niemożliwa jest autonomiczna replikacja plazmidu.. Plazmid jest wprowadzany na drodze transformacji do populacji komórek zawierających gen tarczowy. (Gdyby plazmid mógł replikować się autonomicznie. Proces wymaga pojedynczego crossing-over: powstania dwuniciowego pęknięcia zarówno w plazmidzie. prawy — białym. w dzielących się komórkach może on po wbudowaniu się do chromosomu replikować się tylko jako część chromosomu (w stanie zintegrowanym). iż selekcjonując komórki z wykorzystaniem markera plazmidowego będziemy identyfikować tylko te. Jeżeli plazmid niesie fragment wewnętrznej sekwencji kodującej genu tarczowego. czarny/biały). jak i genie tarczowym (w miejscu czarno/białego połączenia) oraz krzyżowego połączenia końców. że proces ten musi przebiegać w warunkach. iż chromosom będzie kodował białko fuzyjne (sekcja 8. lewy fragment genu zaznaczono czarnym kolorem. 2). góra plazmidu) oraz fragment DNA odpowiadający kodującej części sekwencji chromosomowego genu „tarczowego". 2) część kodującej sekwencji genu została zduplikowana (czarny/biały. nieprzerwanego) chromosomowego genu ze zmutowaną sekwencją (w chromosomie będzie znajdował się także cały DNA plazmidowy i zduplikowana sekwencja genu tarczowego). Jeżeli fragment niesiony przez plazmid zawiera Zmutowaną formę końca genu tarczowego. Gen markerowy może kodować jakąkolwiek cechę przydatną do selekcji (np. Zauważ. nie byłoby możliwe odróżnienie poprzez selekcję komórek niosących plazmid autonomiczny od wbudowanego w chromosom). że: 1) do chromosomu w obrębie sekwencji genu tarczowego wbudowany został cały plazmid. Insercja plazmidu spowoduje przerwanie sekwencji kodującej genu.. Insercja plazmidu może spowodować. aby pomóc w śledzeniu losów każdej części fragmentu DNA. Wewnątrz komórki następuje rekombinacja pomiędzy fragmentem w plazmidzie i odpowiadającą mu sekwencją (homologiczną) w chromosomowym genie tarczowym (także oznaczonym kolorami czarnym i białym). 5. Zauważ.(a) Kolisty plazmid skonstruowany in vitro niosący gen markerowy (pięć kropek. z wytworzeniem ciągłej struktury. oporność na antybiotyk). powodując jego inaktywację. z tego powodu proces jest czasem nazywany rekombinacją insercyjno-duplikacyjną (lub integracją typu Campbella). 212 .

Mutageneza z użyciem transpozonów stosowana jest na przykład do wykrywania sekrecyjnych i powierzchniowych białek bakterii patogennych. Błędne rezultaty w STM mogą wynikać z nieprzypadkowej intergracji danego genu wirulencji (i brakiem sposobu jego wykrycia). na obecność alkalicznej fosfatazy. transpozony te (TnphoA) wbudowują się przypadkowo w różne geny w obrębie populacji bakterii. Protokół dotyczący przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej w Haemophilus influenzae opisuje system nośnikowy posiadający specyficzną sekwencję sygnałową niezbędną do pobierania DNA na drodze transformacji (ang. 6). 213 . W ten sposób określona mutacja może być wprowadzona do wybranego genu. sekwencjonowaniu). uptakesignal system). każda kolonia dająca pozytywną reakcję (zmiana koloru) wskazuje na obecność fosfatazy wydzielonej poza komórkę lub związanej z jej powierzchnią. Taki klon mutanta można poddać testowi na wirulencję. a odpowiedni gen wyizolować i poddać dalszej analizie (np. że niezależnie od przypadkowości insercji transpozonu metoda ta jest selektywna w taki sposób. • sygnałowa sekwencja genu. Gen przerwany przez TnphoA jest teraz prawdopodobnie niefunkcjonalny. Ponieważ phoA nie ma promotora i sekwencji sygnałowej (sekcja 7. a jeżeli jest to gen wirulencji. Zasady metody są przedstawione na rysunku 8. wirulencja komórek zmutowanego klonu może być w znaczący sposób zmieniona. tworzenie pozakomórkowej fosfatazy przez komórki wskazuje. knock-out) fenotypów u tej bakterii [Kraib. Zmutowana sekcja genu będzie przeniesiona z plazmidu do genu tarczowego. Mutageneza typu STM (ang. chromosomowa sekwencja odpowiadająca temu fragmentowi jest pokazana jako biały region — poniżej. czego wynikiem będzie wymiana materiału pomiędzy plazmidem i chromosomem. Schlor i Reidl (1998) AEM 64: 4697-4702]. System ten może być przydatny do badania regulacji genów i „nokautowania" (ang. Po wysianiu na płytki. a odpowiednia „dzikiego typu" sekwencja — z chromosomu do plazmidu. Populacja badanego patogena jest mutagenizowana z użyciem transpozonów zawierających bezpromotorowy gen kodujący alkaliczną fosfatazę (phoA). umożliwia sekrecje fosfatazy. białka te są interesujące. fragment wbudowany w sekwencję kodującą genu tarczowego będzie zawierał plazmidowy gen markerowy (lub inny obcy DNA). że TnphoA wbudował się do genu kodującego sekrecyjne lub powierzchniowe białko. iż pozwala na identyfikację specyficznych (sekrecyjnych i powierzchniowych) białek i kodujących je genów. zawierający Zmutowany region (pięć kropek). jako że: • phoA jest w odpowiedniej ramce odczytu i jest transkrybowany z genomowego promotora. komórki z pojedynczych kolonii są testowane. W tym przypadku wymiana krzyżowa może nastąpić po obu stronach zmutowanego fragmentu. ponieważ często ich obecność ma związek z wirulencją. Ponieważ substrat jest dostępny tylko dla enzymów komórkowych. których ekspresja w patogenie jest konieczna do wzrostu wewnątrz komórki gospodarza. Jeżeli zamiast zmutowanego regionu genu. signature-tagged mutagenesis) może być wykorzystana do wykrywania tych genów wirulencji. (b) W tym przypadku plazmid zawiera fragment genu tarczowego (biały). nastąpi insercyjna Inaktywacja genu tarczowego. Zauważmy. do którego jest wbudowany phoA. 23. z użyciem chromogennego substratu.

Określona kolonia zawiera klon zmutowanych komórek. Płytka pokazana na rysunku ma 30 studzienek. Poszczególne kolonie są wykorzystywane do założenia oddzielnych hodowli (odpowiednio uszeregowanych) w studzienkach płytki serologicznej (używanej np. ale zwykle używa się płytek większych. 214 . Następnie z każdej studzienki pobiera się komórki i łączy w jedną pulę. wbudowywane są one przypadkowo. repliki te są przeznaczone do badań hybrydyzacyjnych. do testu ELISA). Mutagenizowane komórki są wysiewane na płytki w celu otrzymania pojedynczych kolonii. z których każda niesie taki sam unikatowo oznakowany etykietką transpozon w tym samym genie. Wykonuje się na membranach dwie repliki (poprzez „dot blotting") pierwotnej płytki. w różne geny w różnych komórkach.Unikatowa sekwencja („etykietka") o długości około 40 par zasad jest włączona do każdego typu transpozonu w populacji. Pula ta jest wykorzystywana do dwóch celów. Po pierwsze stanowi ona inokulum do zakażania zwierząt testowych. Każda z nich zawiera po obu stronach krótkie miejsca wiązania starterów. Transpozony są użyte do mutagenizowania patogena. w replikach komórki poddaje się lizie. Miejsca te są identyczne w każdym transpozonie. „etykietka" jest inna w każdym transpozonie. a ich DNA chromosomowy jest utrwalany i wiązany z membraną. tzn.

jak się okazało. jeżeli używamy zestawu „specjalnych" etykietek [Wren (1998) TIM 6: 51]. które w wyniku mutacji wywołanej przez transpozon nie są zdolne do zakażania zwierzęcia testowego. W „znokautowanych" myszach. mutagenizowanych komórek (w wyjściowej puli). 3) do jednej z replik na membranach. komórki tej puli poddaje się lizie. Inaktywacja różnych genów układu odpornościowego. odpowiedzialne za to geny (identyfikowane dzięki wbudowanemu do nich transpozonowi) mogą być izolowane i sekwencjonowane do dalszych badań. Ten proces wstępnego przeszukiwania (Replika 1) sprawdza wydajność amplifikacji unikalnych etykietek w puli (takie wstępne przeszukiwanie nie jest potrzebne. W replice tej (Replika 1) każda unikalna etykietka powinna hybrydyzować z DNA z komórki zawierającej odpowiadający jej transpozon. transpozon włączy się do „niewirulentnego" genu w komórce. Po drugie. 5. 4) z wyznakowanymi starterami w celu amplifikowania unikalnych etykietek wszystkich transpozonów w puli. a nie hybrydyzują wcale (lub słabo) do drugiej. 8. a nieobecne (lub nieliczne) w puli odzyskanej. gdy np. które rozwijają się w zwierzęciu testowym normalnie). 8. których wirulencja została obniżona. interesujące nas komórki to te. 2). że hybrydyzują do pierwszej repliki. Komórki mogą być zidentyfikowane dzięki temu. a ich DNA używa w reakcji PCR (sekcja 8. do identyfikowania wysp patogenności (sekcja 11. Takie komórki będą nieobecne (lub będzie ich bardzo mało) w puli „odzyskanej" (w porównaniu z liczbą komórek. która (przypadkiem) już zawierała mutację w genie wirulencji. ) Z każdego klonu o obniżonej wirulencji. (Jeżeli użyte były „specjalne" etykietki. Spośród wszystkich oryginalnych. komórki o obniżonej wirulencji byłyby zidentyfikowane przez brak hybrydyzacji w pierwszym etapie testu. 5. 5. 7) w Salmonella typhimurium. znakowane etykietki są następnie użyte jako sondy do hybrydyzacji z drugą repliką na membranie (Replika 2). Niemniej jednak system STM był użyteczny np. modyfikowała wrażliwość zwierząt na pewne bakterie (przykłady: tab. Otrzymane kolonie łączy się (tworząc „odzyskaną pulę") i stosuje reakcję PCR (ze znakowanymi starterami) w celu zamplifikowania etykietki każdego klonu w tej puli. czyli te.Fałszywie dodatni wynik można otrzymać. ) Następnie odzyskuje się patogena z testowanego zwierzęcia przez wysiew na płytki. 4 Mutageneza w genach gospodarza w celu badania interakcji między patogenem a jego gospodarzem Inaktywacja pewnych genów gospodarza dostarczyła cennych informacji na temat ich roli we wzajemnych oddziaływaniach między patogenem a jego gospodarzem. Zamplifikowane etykietki następnie stosuje się jako sondy (sekcja 8. 5. Skutkiem tego znakujące etykietki tych komórek o obniżonej wirulencji (atenuowanych) będą obecne w wyjściowej puli. 215 . Zamplifikowane. 5.

T. 2) — zamiast klonowania w wektorze M13 — z użyciem starterów komplementarnych do znanej sekwencji po którejkolwiek stronie sekwencji nieznanej. terminacja łańcucha może nastąpić w różnych miejscach na różnych kopiach nici matrycowej — tak że jako produkty powstają nici o różnych długościach. C. mieszanina Τ — ddT i mieszanina A — ddA. mieszanina C — ddC. 5). W genach eukariotycznych porównanie sekwencji genu z odpowiadającym mu cDNA może wskazać liczbę. sekwencjonowanie): metoda terminacji łańcucha wg Sangera (metoda dideoksy) (schemat) Fragment przeznaczony do sekwencjonowania musi być otrzymany w formie jednoniciowej — np. 7. 5. która je koduje). 24. tak więc mieszanina G zawiera frifosforan dideoksyguanozyny (ddG). 5). (Patrz także sekcja 8. uniemożliwia on dodanie kolejnego nukleotydu. 2. ponieważ 216 . 24 Określanie sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA (czyli tzw. tak że pierwszy nukleotyd dodawany do startera będzie tworzył parę z pierwszym 3' nukleotydem nieznanej sekwencji. 7. W celu sekwencjonowania przygotowuje się cztery oddzielne mieszaniny reakcyjne (G. który będzie się wiązał za nieznaną sekwencją (góra). 1) oraz polimerazę DNA. Ponadto każda mieszanina zawiera określony fosforan dideoksyrybonukleotydu (ddNTP) (rys. 8. dCTP. Po związaniu się z matrycą starter jest wydłużany w kierunku 5' do 3' przez dodawanie nukleotydów w kolejności określonej przez sekwencję matrycy. gdyż nie zawiera grupy 3'-OH niezbędnej do wytworzenia następnego wiązania fosfodiestrowego (rys. Jeżeli klonowanie było przeprowadzone w fagu M13. (Zauważmy jednak. W omawianym przykładzie nieznaną sekwencją jest TCT. z ddG (patrz schemat) powstają trzy produkty różnej długości.. co pozwala skonstruować znakowany starter (czarna kropka). dGTP i dTTP — tabela 7. startery. 5. Ponieważ dany ddNTP może tworzyć parę z każdą komplementarną zasadą w matrycy.8. Na przykład. Znając sekwencję nukleotydów możemy na przykład przewidzieć skład białka — identyfikując najpierw odpowiedniki kodonów inicjujących i terminacyjnych (sekcja 7. 8. 4. będzie więc otoczona (oflankowana) z każdej strony przez jednoniciowy fagowy DNA. 6 Sekwencjonowanie DNA Pierwotnym źródłem informacji w DNA jest sekwencja budujących go nukleotydów (sekcja 7. 2). Jednoniciowa matryca do sekwencjonowania może być przygotowana w asymetrycznej reakcji PCR (sekcja 8. 1. W danej mieszaninie reakcyjnej stężenie ddNTP jest takie. 2. gdzie został włączony dideoksyrybonukleotyd. 5. Tak więc wydłużanie startera zostaje zatrzymane (= terminacja łańcucha) w każdej pozycji. Możemy także badać promotory i inne sekwencje kontrolne oraz identyfikować takie cechy jak sekwencje REP (sekcja 16. 2. A) — każda zawierająca wszystkie wymienione wyżej składniki (łącznie z milionami kopii nieznanej sekwencji matrycy i starterem). 5. 1). 2 i rys. 5. 4. pozycję i sekwencje intronów (sekcja 8. 5. 20). Jedna z metod sekwencjonowania jest przedstawiona na rysunku 8. cztery typy trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP: dATP. przez klonowanie w fagu M13 (patrz sekcja 9. 1. Gdy do rosnącego łańcucha DNA zostanie dodany dideoksyrybonukleotyd. AGC (góra).. że pewne białka podlegają potranskrypcyjnym i potranslacyjnym modyfikacjom. 2). tak że skład dojrzałego białka nie musi dokładnie odpowiadać sekwencji DNA. nieznana sekwencja została wbudowana do jego genomu. że w większości rosnących nici synteza zostanie na pewnym etapie zahamowana w wyniku włączenia dideoksyrybonukleotydu. Syntezę DNA in vitro w laboratorium prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej: matryce. 6). ) Rys. Skutkiem tego DNA po AGC w kierunku 5' do 3' (linia przerywana) zawiera znaną sekwencję nukleotydów. Jednoniciowe matryce mogą też być przygotowane z wykorzystaniem wektorów fagmidowych (sekcja 8. 4).

wskazuje zasadę. W innej metodzie sekwencjonowanie jest prowadzone z użyciem starterów znakowanych biotyną. prążki produktów mogą być wykryte przez użycie chemiluminescencyjnego substratu. Analogiczne reguły mają zastosowanie do innych ddNTP. prążki produktów reakcji mogą być zlokalizowane w żelu autoradiograficznie: przez ekspozycję filmu fotograficznego wobec żelu i wywołanie go. Podczas elektroforezy małe produkty w określonym czasie wędrują dalej niż duże. Każdą z czterech reakcji poddaje się elektroforezie w oddzielnej ścieżce żelu poliakryloamidowego.podczas wydłużania startera ddG może parować z resztą cytozyny w trzech różnych regionach matrycy. który wędrował najdalej. że produkt ten pochodzi z mieszaniny G. aby wydedukować miejsce danej zasady w matrycy (patrz powyżej). tzn. ponieważ dalsza analiza polega na porównywaniu długości wszystkich wytworzonych nici w każdej reakcji. 5. zauważ. a to. np. London). a to wymaga. 217 . co hamuje parowanie między powstałymi powstałymi nićmi a matrycą. do lokalizacji prążka w żelu (gdyby tworzyły się jakiekolwiek wewnątrzniciowe połączenia zasad. Po elektroforezie żel jest suszony. czyli C. można rozróżnić produkty odmienne co do długości tylko o jeden nukleotyd. z którą wytworzyła parę G. produkty nie lokowałyby się w żelu w pozycji proporcjonalnej do ich długości). którą poddaje się działaniu alkalicznej fosfatazy skoniugowanej ze streptawidyną (streptawidyna ma silne powinowactwo do biotyny). Po elektroforezie materiał z żelu jest przenoszony (blotting) na membranę. Żel zawiera mocznik. z Molecular Medicine Unit. Analogicznie. że pierwszy nieznany 3' nukleotyd (C) jest identyfikowany przez najkrótszy produkt. Po zakończeniu reakcji nowe produkty są oddzielane od matryc przez działanie formamidem. Jest to ważne. Po prawej stronie na dole. wskazując na obecność G w matrycy. zauważ. 3). Część autoradiogramu żelu sekwencyjnego (dzięki uprzejmości Joopa Gakena. Hamuje on także wytwarzanie wewnątrznidowych struktur. CSPD (sekcja 8. że w tym przypadku długość danego produktu nici zależy od lokalizacji reszty cytozyny w nieznanej sekwencji. Jeżeli startery są znakowane 3 2 P. King's College. aby długość każdej powstałej nici była ściśle proporcjonalna do jej elektroforetycznej ruchliwości. następna nieznana zasada (G) jest kolejnym najkrótszym produktem pochodzącym z mieszaniny C. Położenie prążków (lewa strona na dole) wskazuje relatywną długość utworzonej nici. W ten sposób możemy kolejno określać położenie każdego nukleotydu w matrycy.

czyli metodą Sangera (sekcja 15. 2). 1.Odczytanie sekwencji do długości około 500 nukleotydów można przeprowadzić z jednego startera. Z wymienionych powodów badanie ekspresji genów musi być prowadzone w komórkach eukariotycznych. Dodatkowo. (umiejscowione delecje. 5. badania porównawcze jego odmiennych form mogą być przeprowadzane metodami wykorzystującymi sondy molekularne. na przykład — enzymatycznym cięciom lub dodawaniu oligosacharydów (glikozylacja) w określonych miejscach. 4. Bonin i Bujard (1994) TIBTECH 12: 58-62]. 5. 7 Ekspresja genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia Większość genów eukariotycznych nie może ulegać ekspresji (wyrażaniu) w bakteriach. na przykład geny dzikiego typu sklonowane w YAC mogą być wprowadzone do mutantów komórek eukariotycznych w celu badania komplementacji (czyli zdolności genów do kompensowania defektu odpowiadających im zmutowanych genów obecnych w tej samej komórce). metodą „dideoksy". 2). bakterie bowiem nie potrafią (na przykład) radzić sobie z ich intronami — stąd konieczność stosowania cDNA (sekcja 8. Proces ten może być powtarzany. Systematyczne podejście do funkcjonalnej analizy DNA z Rhodobacter capsulatus opisali Kumar. wiele eukariotycznych białek podlega potranslacyjnym modyfikacjom. 8 Funkcjonalna analiza DNA genomowego Sekwencjonowanie DNA genomowego z różnych gatunków pozwoliło ujawnić wiele nieznanych funkcji genów. W celu przezwyciężenia tego problemu do kontroli genów w komórkach eukariotycznych zastosowano pewne dobrze scharakteryzowane bakteryjne systemy regulacyjne [Gossen. jak to opisał Chee i wsp. 1. które zachodzą w komórkach eukariotycznych i są z reguły niezbędne do uzyskania normalnej aktywności biologicznej białek. co z kolei jest utrudnione za względu na złożoność ich systemów kontrolnych. 8. nested deletions) aż zostanie zsekwencjonowany cały fragment. 5. badanie ekspresji genów eukariotycznych może być przeprowadzane z użyciem sztucznych chromosomów drożdżowych. 5. Alternatywnie do stosowania systemów bakteryjnych. Dalsze sekwencjonowanie danego fragmentu może być dokonane przez usuwanie nukleotydów z dwuniciowego fragmentu w kierunku odczytywanej sekwencji (czyli skracanie go) i sekwencjonowanie następnego jednoniciowego fragmentu z nowego startera. 11. 8. Fonstein i Haselkorn [(1996) 218 . Oporność na antybiotyki u Mycobacterim tuberculosis wykrywano np. YAC (sekcja 8. [(1996) Science 274: 610-614]. Te specyficzne modyfikacje. nie mogą być przeprowadzone przez bakterie. zaadaptowaną do tego celu tzw. ang. Gdy cały genom (chromosom) został już raz zsekwencjonowany. 5).

25 razy. ligase chain reaction) Podobnie jak w PCR.. AC-5'. 5. Komplet prób (ang. 9. a powstające fragmenty (wielkości genów lub operonów) analizowano metodą tzw. ). Na przykład bakterie poddane szokowi cieplnemu (sekcja 7. Cykle reakcji są powtarzane np. w których jest faza ogrzewania — do rozdzielenia nici matrycy. że aby mogło się utworzyć wiązanie fosfodiestrowe. kiedy nici są już rozdzielone.. których zachodzące na siebie inserty sumarycznie pokrywają cały (3. capsulatus. W ten sposób specyficzne miejsca chromosomu mogą być korelowane z określonym fizjologicznym stanem komórki. do badania wzorów transkrypcji mutantów delecyjnych R. 16). Dwa inne oligomery będą się przyłączały do sekwencji tarczowej drugiej nici dupleksowego DNA i także ulegną zligowaniu (nie pokazano na schemacie). 7. 2) izolowany z takich komórek może być odpowiednio wyznakowany i użyty jako sonda (sekcja 8. 3) dawały inny wzór transkrypcyjny niż pochodzące z normalnych warunków. zostaną ze sobą połączone przez termooporną ligazę (ligacja: sekcja 8. high-resolution hybridization template) w celu wykrywania zmienionych wzorów transkrypcji w różnych warunkach fizjologicznych. 5. 8. 9 Metody amplifikowania DNA inne niż PCR 8. 5. że każdy fragment ma w chromosomie swój odpowiednik wielkości kosmidu.Nature 381: 653-654]. 8. 25). które są aktywne w badanych warunkach. 1 Łańcuchowa reakcja ligacji (LCR) (ang. do celów handlowych stosuje się bardziej złożoną formę LCR niż przedstawiona na schemacie. te 192 próby użyto jako „wysokiej rozdzielczości matrycę do hybrydyzacji" (HRHT. 8. 4). Całkowity RNA (sekcja 8. Wspólnie. 219 . dwa oligomery wiążą się z każdą nicią matrycy w taki sposób. 5. koniec 5' nukleotydu znajdującego się po prawej stronie musi być ufosforylowany (rys. 8. aby ich zasady parowały poprawnie z nukleotydami nici matrycowej (chociaż dopuszczalne są pojedyncze niedopa- Jedna z dwóch nici dupleksowego DNA zawierająca amplikon (czyli sekwencję tarczową) jest pokazana na górze schematu: 3'-AT. Metoda HRHT może być także zastosowana np. capsulatus. 5. Każdy kosmid był trawiony enzymem restrykcyjnym EcoRV. Zauważmy. 3) do identyfikowania różnych regionów chromosomu zawierających sekwencje. ang. 1. Jeżeli obydwa oligomery poprawnie sparują z amplikonem. Southern blotting (rys. zauważ. że oligomery na odpowiedniej nici pokrywają całą sekwencję tarczową (amplikon) (rys. że aby nastąpiła ligacja: 1) dwa oligomery muszą być tak ustawione obok siebie. 14) — wykonano więc 192 prób. Aktualnie. 8. również w LCR wykorzystuje się cykle termiczne. 2. Dwa oligomery (każdy zaznaczony ramką) przyłączają się na zasadzie komplementarności zasad do sekwencji tarczowej i zostaną zligowane. 7 mln pz) chromosom R. 6. blots) reprezentuje zatem cały chromosom w taki sposób. 1. Metoda ta wykorzystuje zestaw 192 kosmidów (rys.

W rejonie trzonka jedna nić zawiera barwnik fluorescencyjny. 220 . 2 Amplifikacja oparta na sekwencji kwasów nukleinowych (NASBA. 8. Co ciekawe. że barwnik i wygaszacz są rozdzielone. którego końce tworzą pary. Każda sonda jest jednoniciowym oligonukleotydem. chociaż może też amplifikować RNA. transcription-mediated amplification) jest wykorzystywany do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis (sekcja 16. Procedura jest opisana przez Walkera i wsp. a jej przebieg jest naszkicowany na rysunku 8. 6. al. Produkty NASBA mogą być wykrywalne. 5. gdy do początkowego etapu włączymy odwrotną transkryptazę. Tak więc pojedynczy błąd w parowaniu zasad między sondą i sekwencją tarczową może być tą metodą łatwiej zidentyfikowany. a druga — wygaszacz fluorescencji. 1. ] Takie sondy (typu „beacon probes") w porównaniu z konwencjonalnymi sondami liniowymi o równoważnej długości mają większą specyficzność. 41°C i nie wymaga cykli termicznych. podobnie jak w przypadku PCR. przez identyfikację metodą wybarwienia lub hybrydyzacji określonych prążków po elektroforezie w żelu. Termodynamiczne podstawy tej wzmożonej specyficzności są dyskutowane przez Bonnet i wsp. NASBA jest bardziej skomplikowana niż PCR.sowania zasad w oligomerze). Zajście ligacji i amplifikacji dowodzi obecności danej sekwencji tarczowej w próbce. ale przebiega w temperaturze np. strand displacement amplification) jest inną izotermalną (nie wykorzystującą cykli termicznych) metodą stosowaną głównie do amplifikacji DNA. i 2) koniec 5' jednego oligomeru w każdej parze musi być ufosforylowany. ang. Jednakże ostatnio wprowadzono metodę umożliwiającą wykrycie produktów podczas amplifikacji. Techniki te są omówione w artykule przeglądowym: [Chan i Fax (1999) RMM 10: 185-196]. formując sekwencję dwuniciowa. ang. Amplifikacja przez odsunięcie nici (SDA. molecular beacon probes). ang. sonda nie fluoryzuje. czyli komplementarna do sekwencji produktu — RNA. struktura sondy zmienia się tak. 1). Sekwencja w rejonie pętli jest taka jak sekwencja tarczowa. wiązanie sondy typu „beacon probe" do takiej sekwencji jest mniej stabilne niż sondy liniowej. [(1999) PNAS 96: 6171-6176]. NAR (1966) 24: 348-353]. Jeśli brak produktu w postaci RNA. (1998) NAR 26: 2150-2155. W metodzie tej wykorzystuje się tzw. [Molecular beacon probes in NASBA: Leone et. 26. molekularne sondy świetlne (ang. nucleic acid sequence-based amplification) Metoda ta jest przeznaczona głównie do amplifikacji specyficznych sekwencji w RNA. czyli sonda staje się aktywnym fluoroforem. w wyniku czego cząsteczka ma strukturę „trzonka i pętli". Tego typu sondy są włączane do mieszaniny reakcyjnej NASBA i amplifikacja sekwencji tarczowej może być monitorowana przez pomiar wzrastającego stopnia fluorescencji. 9. Podobny proces nazywany amplifikacją za pośrednictwem transkrypcji (TMA. [(1992) NAR 20: 1691-1696. Kiedy pętla sondy zwiąże się ze specyficznym produktem. amplifikację RNA w procesach NASBA/TMA zaplanowano opierając się na wzorze strategii replikacyjnej retrowirusów.

4. Zauważ polarność nici: jest ona komplementarna do amplikonu w wyjściowej próbce RNA (porównaj etap 5 z 1). Starter 2 związał się z nicią RNA. 2) starter. tzn. 1. Powstała nowa nić RNA. tak że powstał funkcjonalny (dwuniciowy) promotor. w kierunku 5' do 3'. Polimeraza RNA (O) przyłączyła się do promotora i będzie syntetyzowała nić RNA w kierunku strzałki. polimeraza RNA przyłączyła się do promotora i wytworzy nić RNA identyczną z tą pokazaną w etapie 5. Odwrotna transkryptaza (która także może syntetyzować na matrycy DNA) wydłużyła starter tworząc dwuniciowy cDNA. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę cDNA na nici RNA. a starter 1 przyłączył się do sekwencji amplikonu w cDNA. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę komplementarnej nici cDNA. 2. z utworzeniem nici cDNA. Powtarzanie się pokazanych cykli reakcji spowoduje powstanie wielu kopii amplikonu w formie komplementarnego RNA i cDNA. Pokazana jest nić RNA ze wskazaną sekwencją tarczową (amplikonem) odznaczoną dwiema krótkimi liniami pionowymi. 6. RNaza Η usunęła nić RNA. Koniec 5' tego startera jest oznakowany krótką sekwencją (•) zawierającą promotor (sekcja 7. Enzym odwrotna transkryptaza (sekcja 8. 8. Starter (starter 1) związał się z końcem 3' amplikonu. 5) polimerazy RNA. 7. 9. 221 . 3. 5. a drugi starter (starter 2) związał się z amplikonem w sekwencji cDNA.1. 5. Enzym RNaza Η zdegradował (usunął) nić RNA.

16). 8. 10 Rekombinacyjna streptokinaza — przykład technologii rekombinowania DNA Streptokinaza jest białkiem. który rozkłada włókna fibryny. co jest istotne w leczeniu np. które mogą otaczać (a więc lokalizować) uszkodzenia wywołane przez streptokoki. zakrzepicy. Zauważ. 4). (1992) Biotechnology 10: 1138-1142]. które w naturze jest wytwarzane przez pewne gatunki Streptococcus.. a gen kodujący streptokinazę (lecz bez sekwencji sygnałowej) powielany techniką PCR (sekcja 8. 5). izolowany jest ich genomowy DNA. Komórki Streptococcus equisimilis są lizowane. pojawi się jako 3'. 2. 10). coli (patrz rys. tworzy nić kodującą. po pełnym wydłużeniu przez PCR.. 2). trp jest promotorem operonu tryptofanowego E.. 11 Nadprodukcja białek rekombinacyjnych w Escherichia coli — strategie optymalizacji ekspresji genu „Nadprodukcja" odnosi się do syntezy w ilości ponad normę specyficznych białek — zazwyczaj białek heterologicznych („obcych"). (Patrz także notka 3 w tab. czyli ochre (jest to kodon stop.. 3. 5. 2) — wspomagając rozprzestrzenianie się infekcji przez ułatwianie lizy fibrynowych barier. 6). szkic technologii klonowania DNA [Estrada i wsp. natomiast możliwość wyrażania się genu streptokinazy w E. Rys. podczas transkrypcji genu (sekcja 7. 3' (starter SK2) i 5'-TGGATCCTTATITG. gen streptokinazy będzie otoczony (oflankowany) specyficznymi miejscami restrykcyjnymi (tab. kopiowane w nici kodującej. 7. 1). jak opisana wyżej streptokinaza (sekcja 8. Wykorzystując dotychczasowe źródło streptokinazy — streptokoki — uzyskuje się małą wydajność. 1). że ATG w starterze SK2. 5. na której jest wydłużany SK2. Po kilkunastu cyklach PCR wzrośnie liczba nici utworzonych w reakcji PCR i zacznie działać jako matryca. jest nicią kodującą („nić sensowna"). 8. Starter SK3.. 8. 5). tab. Startery do PCR to: 5'-GGAATTCATGATTGCTG. tworząc plazmid pEKG-3 (obydwa plazmidy dla uproszczenia przedstawione w formie jednoniciowej). 3' (starter SK3).. Tak więc podczas infekcji streptokinaza może działać jako agresyna (sekcja 11. enzymu. że sekwencja sygnałowa tego genu może powodować problemy z jego ekspresją w E. Wykorzystano to w procedurze stosowanej np. 222 . wcześniejsze badania sugerowały. TAC. 2. do produkcji czynników terapeutycznych. 5. 27) pozwala osiągnąć wydajność nawet ponad dziesięciokrotnie większą [Estrada i wsp. RBS miejscem wiązania rybosomu (rys. czyli SK2 po pełnym wydłużeniu utworzy nić komplementarną do nici kodującej. odpowiadającym mu mRNA będzie 5'-AUG-3'. 5. sekcja 7. 8. Zainteresowanie streptokinazą jako czynnikiem terapeutycznym wynika z jej zdolności do rozpuszczania fibrynowych komponentów skrzepów krwi. zauważ. Ma ono zdolność przemiany ludzkiego plazminogenu do plazminy (fibrynolizyny). coli. (1992) Biotechnology 10: 1138-1142]. 10). ) Sekwencja ATT (w starterze SK2) będzie odpowiadała leucynie. 5' (patrz parowanie zasad. 8.8. że matryca.. coli (sekcja 8. czyli kodon inicjujący (sekcja 7. w warunkach eksperymentalnych. a terminator to terminator transkrypcji (sekcja 7. Zauważ. 27 Ekspresja genu streptokinazy w E. 5. Dwie nici genu streptokinazy są pokazane w górnej części rysunku. Fragment zamplikowany metodą PCR (środkowa część rysunku) jest wbudowywany do plazmidu pTrp pomiędzy miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI. Ampr oznacza oporność na ampicylinę. a główny produkt PCR będzie taki jak pokazano w środkowej części rysunku. coli.. 7. że 5'-TTA-3' (w SK3) odpowiada w mRNA kodonowi UAA.

Podczas wzrostu W3110 maksymalną ekspresję genu streptokinazy otrzymywano. że tworzą TrpR. w obecności tryptofanu. coli w regulacji promotora trp uczestniczy białko represorowe (TrpR. coli W3110) jest jednym z tych. o których wiemy. szczep wybrany do wyrażania genu streptokinazy (E. 11).Szczep E. 1. Wybieranych jest kilkanaście kolonii. gdy liczba kopii plazmidu na komórkę wynosiła 420. 223 . 5. a transformowane komórki wysiewane na podłoże zawierające ampicylinę w celu wyselekcjonowania tych. przez użycie analogu tryptofanu. trp. w których sprawdza się obecność genu streptokinazy. jako induktora (porównaj z allolaktozą w operonie lac — rys. wydajność produkcji enzymu wynosiła 25% całkowitej ilości białek komórkowych. coli (mutanty) nie tworzą TrpR. czyli szczepem z „dzikim typem" allelu genu trpR. 4. kodowane przez gen trpR). W szczepie W3110 transkrypcja z promotora trp może być zaindukowana („włączona"). 4). 7. TrpR powoduje represję transkrypcji z promotora trp. gdy jest taka potrzeba. 1) plazmidem pEKG-3. coli. kwasu 3-β-indoloakrylowego). W pEKG-3 do kontroli transkrypcji genu streptokinazy wykorzystywany jest promotor operonu tryptofanowego. Pewne szczepy E. Po zlizowaniu komórek rekombinacyjna streptokinaza była oczyszczana z zastosowaniem chromatografii powinowactwa (sekcja 8. E. Zidentyfikowane geny mogą być następnie klonowane przez namnożenie komórek z kolonii zawierających właściwą sekwencję. W E. coli jest transformowany (sekcja 8. ze stałym nośnikiem (matriks) zawierającym ludzki plazminogen. Syntetyzowana streptokinaza pozostawała w formie wewnątrzkomórkowej (przypomnienie: gen został pozbawiony sekwencji sygnalnej). które pobrały pEKG-3.

nie jest optymalnym regulatorem stosowanym w nadprodukcji białek terapeutycznych. 6) wspomagających składanie. że białka takie mogą być później właściwie złożone in vitro. enhancer) translacji nazywany też „downstream box" — specyficzną sekwencję nukleotydów poniżej. w pełni zrozumiała. nie może być użyta do ekspresji każdego genu. Czynniki te powinny być uwzględniane przy konstrukcji efektywnego wektora ekspresyjnego. 11. w pewnych przypadkach składanie in vitro może powodować powstawanie. przez wirowanie). coli. induktor. a także stanowią ochronę przed degradacją przez wewnątrzkomórkowe proteazy. W odniesieniu do genów. 8. 7. Ustalono. Ścisła regulacja jest szczególnie ważna. powstawanie ciałek wtrętowych może być w pewnym sensie korzystne. 1 Optymalizacja transkrypcji Promotor danego genu powinien być silny (sekcja 7. 3 Problem ciałek wtrętowych Ciałka wtrętowe (w omawianym kontekście) są nierozpuszczalnymi agregatami niezłożonych lub niepoprawnie złożonych białek. 6) i liczba nukleotydów między sekwencją SD a kodonem startowym. 5. Powinien być także „ściśle regulowany".Chociaż E. 11). jak dotychczas. 5. małej ilości (lub niepowstawanie w ogóle) produktu aktywnego biologicznie. 5. uzyskanie opłacalnego. coli jest szeroko wykorzystywana w procedurach nadprodukcji. modyfikacjach pH i obniżaniu temperatury wzrostu. 11. pewne geny kodują wzmacniacz (ang. 5. 8. wysokiego poziomu ekspresji wymaga kontrolowania czynników mogących wpływać na końcową wydajność. tak więc np. który jest toksyczny dla człowieka. Regulator transkrypcji musi także być odpowiednio dobrany w zależności od celu. które mogą być wyrażane. 8. produkty pewnych genów eukariotycznych wymagają potranslacyjnej modyfikacji. 8. 11. gdyż ułatwiają one oczyszczanie białkowego produktu (np. 5. Dlaczego? Zazwyczaj komórki są hodowane do znacznej gęstości przed ekspresją danego genu w celu uzyskania maksymalnej ilości produktu. Przyczyna powstawania ciałek wtrętowych nie jest. ale blisko kodonu startowego. 2) w celu zwiększenia rozpuszczalności. Strategie radzenia sobie z tym problemem opierają się na: tworzeniu fuzji genów (sekcja 8. 7). która nie może zachodzić w prokariotach (patrz sekcja 8. 17). czyli gen nie wyrażany przed jego celową indukcją lub derepresją. chaperones) (sekcja 7. Jednakże właś224 . pewne z nich uwzględniono niżej. 2 Optymalizacja translacji Na wydajność translacji wpływa stopień zgodności sekwencji Shine-Dalgarno (SD) (sekcja 7. 8). które często tworzą się w cytoplazmie podczas nadprodukcji. (rys. Interesujący nas gen musi być oczywiście wbudowany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego (rys. Na przykład. Ponadto. Ekspresja genu przed odpowiednim momentem może jednak np. równoczesnej ekspresji białek opiekuńczych (ang. zmniejszyć tempo wzrostu i ograniczyć końcową ilość rekombinacyjnego białka. jeżeli produkt genu jest toksyczny dla E. IPTG.

kumulacja nietypowych białek włącza odpowiedź szoku cieplnego. Strategię zapobiegania lub minimalizowania proteolizy są następujące: (a) Produkt genu może być kierowany bezpośrednio do peryplazmy (gdzie jednak tych enzymów jest mniej) przez włączenie sekwencji sygnałowej (sekcja 7. poparty dobrymi referencjami. α-hemolizyny — sekcja 5. fenyloalanina. Szczegółowy. co może sugerować potrzebę „przekodowania" białka. Synteza proteazy Lon jest „włączana" przez produkt genu rpoH. coli z mutacją w genie rpoH.ciwe rozwiązania muszą być zazwyczaj ustalane empirycznie. co jest 225 . jak wykazano. (d) Można wykorzystać szczep E. lizyna. nie wszystkie fuzje genów partnerskich będą zwiększały rozpuszczalność danego białka. którego produkt jest transportowany na zewnątrz komórki. których N-końcowym aminokwasem jest arginina. 2. tak więc białkowy produkt genu powinien być niewątpliwie chroniony przed działaniem tych enzymów. Kumulacja „nienormalnych" lub heterologicznych białek w cytoplazmie (tak jak się dzieje podczas nadprodukcji) włącza odpowiedź szoku cieplnego (sekcja 7. Ale jak na taką sytuacje reagują same komórki? Jak wspomniano wyżej. Ze względów komercyjnych natomiast można to uznać za dobry wynik. produkuje w E. defektywny w wytwarzaniu białka RpoH. coli znacznie większe ilości białek heterologicznych. 6) staje się on aminokwasem końcowym. 8. tryptofan lub tyrozyna. wykazują tendencję do niestabilności (mają krótkie okresy półtrwania — ang. 3) — czego wynikiem jest wytwarzanie proteazy Lon. short half-lives). DsbA). 11. coli było komórce niepotrzebnych (to jest niefunkcjonalnych). 6) lub przez przeprowadzenie fuzji danego genu z genem białka peryplazmatycznego (np. 1. a również pewne z nich znajdują się w przestrzeni peryplazmatycznej. (c) Poszczególne miejsca w białku podatne na proteolizę mogą być eliminowane przez zmianę zapisu kodującej je sekwencji w taki sposób. 4. ponieważ po usunięciu końcowej N-formylometioniny (sekcja 7. degradującej nietypowe białka. natomiast mutant genu rpoH. coli zawiera wiele proteaz (enzymów degradujących białka). 11. 8. Białka. (b) Produkt genu może być zamieniany w produkt sekrecyjny przez fuzję jego genu z innym genem (np. 5 Odpowiedź komórki na nadprodukcję W przytoczonym przykładzie dotyczącym streptokinazy (sekcja 8. wyczerpujący opis możliwości optymalizacji ekspresji genów na wysokim poziomie przedstawił Makrides [MR (1996) 60: 512-538]. leucyna. 10) nawet do 25% białek syntetyzowanych przez E. 2). a białka opiekuńcze odpowiednie do wspomagania składania konkretnego białka będą musiały być może dobrane metodą prób i błędów. 5. 8. 5. że przedostatni N-końcowy aminokwas w białku bakteryjnym jest także ważny. 4 Zapobieganie proteolizie Cytoplazma E. aby nie wpłynęło to na funkcje białka. Zwróćmy uwagę. bo np. 5.

5). Fotografia pokazuje wzór elektroforetyczny sześciu eksperymentów „odcisku stopy" analizujących oddziaływania między próbką DNA i białkami w różnych kombinacjach: 1) podjednostka a polimerazy RNA. Na lewo od ścieżki m podane są liczby wskazujące lokalizację niektórych zasad guaninowych w próbce DNA. promotor Pl i miejsce wiązania białka CRP (=CAP) uczestniczącego w katabolicznej represji (sekcja 7. 8. fragmenty te (o różnej długości) poruszają się z różnym tempie. co powoduje specyficzne cięcie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy guaniną (G) a przylegającą zasadą (rys. zespół białek zawiera inne podjednostki polimerazy RNA oraz czynnik sigma. czyli jednostka zawierająca dwie cząsteczki białka CRP. poddawana działaniu DNazy I i analizowana elektroforetycznie. 5). Miejsce wiążące CRP znajduje się pomiędzy zasadami -41 i -42. 2) dziki (czyli normalny) CRP i 3) CRP HL159 (Zmutowana forma CRP). 4). W odpowiednich warunkach. a następnie piperydyny. Zwróć uwagę. próbkę DNA stanowi region regulatorowy operonu galaktozowego (gal) E. który zawiera miejsce startu transkrypcji (sekcja 7. Zauważ też. „drabinkę" widzianą w ścieżce m. otrzymamy fragmenty o szerokim zakresie długości. zawiera sekwencyjna drabinkę Maxama-Gilberta. Próbka na jednym końcu jest wyznakowana radioaktywnym fosforem (32P). na której -1 odpowiada pierwszej zasadzie od miejsca startu (patrz sekcja 7. celem analizy było zbadanie roli podjednostki α w aktywacji promotora P1 gał przez CRP. Badano interakcje tego DNA z podjednostką α polimerazy RNA i CRP (=CAP). Podczas elektroforezy. coli. że CRP wiąże się z DNA jako dimer. 7. W wyniku tego. Ponieważ 226 . Ścieżka m jest rodzajem kalibracji. W każdym eksperymencie próbka DNA była preinkubowana z białkami. iż cięcie nastąpi w różnych kopiach próbki DNA przy różnych guaninach. 1) operonu gal.W przedstawionym przykładzie. formując tzw. że podjednostka α i CRP są tylko częścią zespołu białek znajdujących się normalnie w miejscu promotorowym przy starcie transkrypcji in vivo. stanowi to użyteczną skalę. W celu przygotowania takiej drabinki. wiele kopii znakowanych na końcu próbek DNA poddanych było chemicznemu działaniu siarczanu dimetylu. A dokładnie. 2. każda z wielu kopii DNA będzie przecięta przy jednej tylko z obecnych w niej zasad guaninowych.

Ścieżka a pokazuje prążki fragmentów powstałych po cięciu próbki DNA przez DNazę I przy braku wiążących się białek. ponieważ przypuszczalnie przedostała się ona przez szczelinę między dwoma cząsteczkami dimeru CRP. w transkrypcji (sekcja 7. Obecność podjednostki rozszerza „odcisk stopy" w obie strony. że podjednostka a może wiązać się do miejsc po obu stronach dimeru CRP.wskaźnikiem stresu. Ścieżka e i f pokazują wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności zmutowanej formy CRP. Busby'ego z University of Birmingham UK. które zostało uszkodzone przez mutację. podobnie jak lokalizacja promotorów oraz miejsca wiązania CRP. Ścieżka c pokazuje „odcisk stopy" CRP (pomiędzy -29 i -54) (porównaj ścieżkę c ze ścieżką a). przy wysokim poziomie zbędnych białek bakterie zaczynają degradować swoje własne rybosomy i rRNA. co wskazuje na brak oddziaływania pomiędzy próbką DNA i podjednostką α przy braku innych białek. 5. 5. Znaczy to. a to może prowadzić do śmierci komórki [Kurland i Dong (1996) MM 21: 1-4) 8. czyli dążyć do zahamowania translacji. Sugeruje to. wiązanie się poniżej CRP interpretowano jako artefakt ze względu na brak ograniczającego wpływu innych podjednostek polimerazy. a białka rozdzielone w żelu są przenoszone metodą elektroblottingu na filtr nitrocelulozowy. że ta konkretna mutacja CRP hamuje wiązanie pomiędzy CRP i podjednostką — ponieważ wpływ podjednostki (widoczny w ścieżce d) został ograniczony. Fragmenty mają różną wielkość. okazuje się. Obecność CRP nie spowodowała ochrony całego regionu przed działaniem DNazy I. Informacje o takich oddziaływaniach mogą być użyteczne wobec zamiaru wprowadzania specyficznych zmian w DNA w celu manipulowania zdolnością wiązania białek do zmienionego DNA w badaniach nad regulacją ekspresji genów itp. 227 . Ścieżka d pokazuje działanie DNazy I na próbkę DNA w obecności zarówno CRP. związanie się powyżej CRP uznano za „prawdziwe" i ważne dla transkrypcji. Wyniki wskazują. w lizatach komórkowych. że wiązanie pomiędzy normalną (niezmutowaną) formą CRP i podjednostką następuje w miejscu CRP. Badana próbka jest poddawana elektroforezie. Powód wystąpienia „odcisku stopy" w regionie -80 do -90 nie jest więc jasny. (1994) Nucleic Acid Research 22: 4375-4380 za pozwoleniem Oxford University Press i dzięki uprzejmości profesora S. Jako że mutacja w CRP wydaje się hamować wiązanie podjednostki a. Niżej przedstawiono pewne metody służące do wykrywania takich oddziaływań oraz określania miejsc wiążących w DNA. 5. ponieważ DNaza I może ciąć w wielu miejscach w każdej próbce. że z dwóch części powstałych przez przecięcie fragmentu DNA w próbce w żelu wykrywalny będzie tylko jeden (ten wyznakowany). drabinka kalibracyjna może być łatwo wykorzystana do określenia położenia miejsc oddziaływania między DNA i białkami w eksperymentach „odcisku stopy". 12. 1 Metoda „Southwestem blotting" Technika ta pozwala wykryć białka wiążące DNA np. Wykrywalne będą jednak tylko fragmenty mające na końcu 3 2 P. Zdjęcie przedrukowano z Attey i wsp. Ścieżka b pokazuje wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności podjednostki α polimerazy RNA. Nie widać „odcisku stopy". odpowiednio z i bez podjednostki α polimerazy RNA. Powinowactwo sekwencja nukleotydowa całego regionu regulatorowego gal jest już znana. 1) i w inicjacji replikacji DNA. jak i podjednost ki α. 8. 12 Białka wiążące DNA — wybrane techniki Oddziaływania między białkami i DNA są ważne np. Istotnie. jednakże.

białka zasłaniają jedno lub więcej miejsc. 3 Technika „białkowego odcisku stopy" (ang. czy jakieś białko (w lizacie) może wiązać specyficzną sekwencję DNA. Jeżeli we fragmentach związanych z białkiem. Znakowany DNA danej sekwencji inkubujemy z lizatem. a jej położenie w żelu w odniesieniu do pozostałych subfragmentów wskazuje sekwencję wiążącą w DNA. footprint). znakowanych na końcach (jeden komplet związany z białkiem) — są trawione enzymatycznie (lub chemicznie) najlepiej w warunkach. gdy na powierzchni komórki bakteryjnej prezentowany jest produkt obcego genu. nie tnie w miejscach.danego białka do specyficznej sekwencji DNA może być następnie określone przez użycie znakowanych sekwencji DNA jako sond i wykrycie znacznika każdej sondy związanej z określonym białkiem.. 2 Badanie zmian ruchliwości elektroforetycznej (EMSA. 5. ang. 12. które wywołują cięcia DNA niezależne od sekwencji (niespecyficzne). do której związało się białko. może być on 228 . wszystkie niechronione wiązania fosfodiestrowe są wrażliwe na rozszczepianie przez ten czynnik. ruchliwość kompleksu białko-DNA będzie różna od ruchliwości wolnego DNA. Luka ta odzwierciedla ochronny efekt białka. Cięte fragmenty dają zbiór znakowanych subfragmentów o pewnym zakresie wielkości (w wyniku cięcia w różnych miejscach). 8. dwa komplety homologicznych fragmentów DNA. ponieważ DNaza I. może być wykryta jako region DNA chroniony przed enzymatycznym (lub chemicznym) rozszczepieniem dzięki osłanianiu go przez związane białko. 5. Lepszy rozkład miejsc wiążących można jednak otrzymać stosując tworzone in vitro rodniki hydroksylowe. aby umożliwić tworzenie kompleksów białko-DNA. jest białkowym odciskiem stopy (ang. będąc stosunkowo dużym białkiem. 12. tak że wzór elektoforetyczny zawiera prążki odpowiadające każdej nieosłoniętej pozycji w sekwencji. brak pewnej wielkości subfragmentów w próbie poddanej reakcji wiązania z białkiem przejawi się jako rodzaj luki (ang. Technika „odcisku stopy" z użyciem DNazy I (stosowanie DNazy I — patrz s. kiedy więc dwa komplety fragmentów są porównywane elektroforetycznie. 8. W praktyce. 5. Na przykład. w których każdy fragment jest cięty tylko w jednym z kilku potencjalnych miejsc cięcia. gap) w szeregu prążków widocznych w żelu. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek Specyficzne heterologiczne („obce") białka mogą być prezentowane na powierzchni bakterii (lub faga) w różnych celach. footprinting) W technice „odcisku stopy" sekwencja DNA. żaden z tych fragmentów nie będzie się kończył w tym miejscu. 226 i 227) ma tendencję do dawania większych i wyraźniejszych „odcisków". Następnie elektroforetycznie rozdzielamy niezwiązaną formę DNA od DNA związanego. które są bardzo blisko białka związanego z DNA. eiectrophoretic mobility-shift assay) EMSA pozwala określić np. 8.

Na przykład. 5). Jose i Meyer (1997) JB 179: 794-804. tak aby białko fuzyjne było wyrażane na powierzchni komórki. starterami lub sekwencjami tarczowymi. tylko niektóre z wielu mRNA w populacji poddawane są konwersji w jednym eksperymencie. Selekcji cząsteczek mRNA dokonuje się z użyciem startera 5'-TTTTTTTTTTGG-3'. differential display) DD jest metodą wykrywania genów. 1. jeżeli następnie użyjemy mutanta. Aby uczynić całe to zadanie łatwiejszym do wykonania. 2. przygotowujemy fuzję (sekcja 8. 15 Technologia „DNA-chip" „DNA-chipy" to mikrozbiory fragmentów cząsteczek DNA (nukleotydów) unieruchomionych na małych kawałkach (chipach) szkła. obecne w jednych. 4) wobec znanych immobilizowanych ligandów (np. (1995) Biotechnology 13: 336-372]. 2). (heterologiczna) α-domena nie będzie odszczepiana od β-domeny. 5. co zostało określone jako autoprezentacja. pozwalającym na konwersję tylko tych mRNA. ang.. 14 Wykrywanie zróżnicowania poziomu ekspresjii genów z wykorzystaniem PCR (DD. 2) nieznanego genu do genu bakteryjnego lub fagowego kodującego białko powierzchniowe.wtedy charakteryzowany przez chromatografię powinowactwa (sekcja 8. które są wyrażane tylko w pewnych szczególnych warunkach. Zamplifikowane fragmenty mogą być sekwencjonowane lub użyte jako sondy do przeszukiwania biblioteki. przeciwciał). „Chipy" produkuje się albo przez immobilizowanie preegzystujących cząsteczek. Najpierw mRNA z każdej populacji są przekształcane w cDNA (sekcja 8. Metoda DD jest dyskutowana przez Matza i Lukanova [(1998) NAR 26: 5537-5543]. Wzory z różnych populacji komórek porównuje się. 5. coli. oczywiście białko to musi dać bodziec immunologicznie poprawny. polega ona na porównywaniu cząsteczek mRNA izolowanych z dwóch lub więcej populacji komórek poddanych działaniu różnych warunków. a po nich jest „ogon" 3'-AAAA. albo syntezę „on-chip". W innej metodzie wykorzystuje się autotransportery (sekcja 5. Aby to wykonać. 4) i otrzymuje się ich wzór elektroforetyczny (fingerprint). 4. 1. fragmenty te mogą być sondami. a odpowiednie pasma (tzn. czyli bezpośrednio na powierzchni podłoża. 5. 5. można utworzyć fuzję obcego genu z DNA kodującym domenę β białka AIDA-I w E. 2. Następnie cDNA z każdej populacji są poddawane procedurze AP-PCR (sekcja 16.. 5. z uży- 229 . dzięki czemu będzie prezentowana na powierzchni bakterii [Maurer. 8. prezentowane białko może bowiem mieć swój udział w antygenowej stymulacji. w których w odpowiedniej pozycji występują reszty cytozyny (C). W jednym z rozwiązań eksperymentalnych tworzona jest fuzja obcego DNA z bakteryjnym genem kodującym flagellinę [Lu i wsp. Prezentowane białka mogą być także użyteczne do badań nad tworzeniem szczepionek. 8. który nie ma powierzchniowej proteazy OmpT. silikonu lub plastiku. a nie występujące w innych) odzyskuje z żelu i amplifikuje z użyciem tego samego „arbitralnego" startera.

które są poddawane działaniu roztworu zawierającego DNA. 2. DNA-chipy są dyskutowane przez Marshalla i Hodgsona [(1998) NB 16: 27-31] oraz omówione w artykułach przeglądowych [Ramsay (1998) NB 14: 40-44 i Graves (1999) TIBTECH17: 127-134]. na zastosowaniu elektrycznie wspomaganej hybrydyzacji sonda-tarcza i następnie różnicującym denaturowaniu dupleksów mających nawet tylko pojedynczą błędną parę. kopie tej sekwencji zamplifikowane ze zmutowanej komórki będą zatem hybrydyzowały tylko do pewnych sond zbioru. Hybrydyzacja może być w tej metodzie wykrywana z użyciem skaningowo-konfokalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. dysponujemy pulą cząsteczek immobilizowanego jednoniciowego cDNA. czyli w warunkach. . Takie postępowanie zapewnia większą specyficzność reakcji i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia. i odpowiednie odczynniki reakcyjne. 1. do wykrywania mutacji. Pewnym problemem w wiązaniu jednoniciowego DNA do chipów jest tendencja do parowania zasad w obrębie jednej nici.ciem specjalnych szybkich aparatów (robotów) zdolnych do syntetyzowania szerokiego zakresu kombinacji nukleotydów na pojedynczym chipie. Technologia DNA-chipów jest także wykorzystywana do badania zróżnicowania ekspresji genów. które hamują wewnątrzniciowe parowanie zasad. sondy znakowane fluoroforem pomogą nam „odnaleźć" te geny. Można to pokonać przez zastosowanie PNA (sekcja 7. może być zsyntetyzowanych ponad 65 tysięcy 8-nukleotydowych (kompletny zbiór [48]) kombinacji na kawałku szkła o powierzchni lcm2. Duży zbiór immobilizowanych sond może reprezentować wszystkie możliwe mutacje w danej sekwencji nukleotydów. [(1999) JCM 37: 49-55]. Postęp w technologii DNA-chipów polega np. Zastosowanie tej techniki w identyfikacji Mycobacterium spp. Tą drugą metodą. 1). gdyż tarczowy DNA znakuje się uprzednio fluoroforem. ponieważ hybrydyzacja DNA-PNA może zachodzić przy braku soli. W tym przypadku. co może utrudniać jej wiązanie z sekwencjami tarczowymi. Reakcja PCR na podłożu stałym (niedawno wynaleziona) wykorzystuje dwa komplety immobilizowanych starterów. na przykład. wskazując mutacje. DNA-chipy używa się np. opisał Troesch i wsp. które są aktywne w specyficznych warunkach.

W niektórych wypadkach fag wprowadza cechę patogenności. Wirulentne fagi namnażają się wewnątrz komórki gospodarza i powodują jej lizę. Jeszcze inne mogą się namnażać wewnątrz gospodarza nie powodując jego lizy. mogą zawierać dwuniciowy dsDNA. za uwolnienie toksyn podobnych do 231 . uraemic Syndrome). ponieważ zawiera specyficzne determinanty wirulencji. czego wynikiem jest śmierć i rozerwanie komórki.ROZDZIAŁ 9 Bakteriofagi Większość. a nawet wszystkie bakterie mogą być zakażane specyficznymi wirusami (bakteriofagami. w których zachodzi infekcja. jednoniciowy ssDNA. zależnie od gatunku. skrótowo fagami). a następnie mogą infekować inne komórki. jak i ich fagów. dsRNA lub ssRNA. Pewne z nich są zaopatrzone w ogonek. Jednak po wejściu do żywej komórki odpowiedniego gatunku. 9. Niektóre fagi są wielościanami. do pewnego stopnia. Na przykład. błonicę i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS. uwalniane są wówczas z żywych komórek. Wiele fagów składa się jedynie z kwasu nukleinowego otoczonego białkowym kapsydem („płaszczem"). w jaki są one uwalniane z bakterii. Łagodne (umiarkowane) fagi mogą utrwalić stałe nielityczne stosunki z komórką gospodarza (lizogenię). ang. a nawet. nie mający zdolności do niezależnego metabolizmu i namnożenia się. Zwraca się szczególną uwagę na regulację syntezy toksyn oraz na sposób. Zazwyczaj określony fag może zakażać komórki tylko jednego rodzaju. Genomy fagów. Nowo utworzone wirusy z komórki są uwalniane. gatunku lub szczepu bakteryjnego.1.1.1). faga. że zacznie ona syntetyzować jego cząsteczki. wirus może „zawładnąć" zdolnością komórki do syntez biologicznych i sprawić. 9. Na przykład. fot. rys. za pomocą którego wiążą się z powierzchnią bakterii (tab. Prowadzi się wiele badań w tym kierunku. Wynik infekcji fagowej zależy od bakterii. Wpływ fagowej infekcji na chorobotwórczą bakterię może być istotny dla organizmu zakażonego przez tę bakterię. z jednoczesnym uwolnieniem potomstwa faga. haemolytic. Wirusem nazywamy organizm pozbawiony struktury komórkowej. 9. od warunków. cholerę. Poznanie takich chorób wymaga znajomości zarówno biologii patogennych bakterii. toksyny kodowane przez fagi są odpowiedzialne za botulizm. inne mają budowę nitkowatą lub wielopostaciową.

] Zakażenie fagiem Shigella flexneri (bakterii wywołującej czerwonkę) może prowadzić do modyfikacji O-specyficznych łańcuchów w polisacharydach (sekcja 2.2). przez zwiększenie liczby kopii genu kodującego toksynę).5.] 232 . czy fag jest zdolny do namnożenia się wewnątrz bakterii zakażającej człowieka lub zwierzęta. 11. flexneri służących do produkcji szczepionki skutecznej przeciwko specyficznym lub wielu serotypom tego patogena. co wpływa na antygeny O określające serotyp (sekcja 16.9.1.1. W związku z tym. Na przykład. ponieważ może to wpływać na intensywność wytwarzania toksyny (np. fag CTXF kodujący toksynę cholery replikuje się wewnątrz bakterii bytujących w jelicie ssaków [Bacteriophage biology and bacterial virulence: Walder (1998) TIM 6: 6295-297.2). Trzeba również mieć informacje.toksyny shiga. [Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification in Shigella flexneri: Allison i Verma (2000) TIM 8: 17-23. związanych z zespołem HUS (kodowanych przez faga H-19B) z EHEC (tab.2). może być odpowiedzialne białko lityczne podobne do białka kodowanego przez gen S faga λ (sekcja 9.2.1). infekcja fagowa ma znaczenie przy opracowaniu szczepów S.

Kirsch i Louam (1998) JB 180: 5227-5230] niszczy chromosom komórki. 9. Następnie płytka podstawowa faga wiąże się z powierzchnią komórki. RNA i białka. 9.1. coli. Przejście DNA przez błonę cytoplazmatyczną wymaga siły protonomotorycznej. Jest on degradowany przez fagowe nukleazy do nukleotydów. „Wczesne" geny T4 zaczynają być transkrybowane i następuje translacja. które są zużywane do syntezy DNA faga T4.1 Cykl lityczny faga T4 w Escherichia coli Na początku zakażenia fag przyczepia się końcami włókien ogonka do specyficznych miejsc w błonie zewnętrznej bakterii (rys.9. Białko Ndd kodowane przez faga [Bouet. W ciągu 5 min od początku zakażenia komórka przestaje syntetyzować własny DNA. a kończy liza komórek i uwolnienie potomstwa faga. a skurcz ogonka sprawia.1). że wewnętrzny rdzeń faga przebija błonę zewnętrzną komórki E. 233 .1 Fagi wirulentne — cykl lityczny Cykl lityczny rozpoczyna adsorpcja wirulentnego faga na powierzchni wrażliwej komórki. umożliwiając przejście DNA przez kanał centralny do cytoplazmy.

Bakteriofagi T6. coli. 234 . 6. dwuniciowy DNA wielkości około 170 tys. ABCDEFGHIABCD-3' Sekwencja ta przedstawia (w porządku alfabetycznym) kolejność nukleotydów w jednej nici DNA genomu T4. Replikacja DNA faga T4 prowadzi do utworzenia jednoniciowych końców 3'. W transkrypcji bierze udział polimeraza RNA gospodarza po wprowadzeniu kilku zmian indukowanych przez faga. Bakteriofag T1 (odcinek = 50 nm). Nowo syntetyzowany DNA ulega poreplikacyjnej modyfikacji (sekcje 7. mały dwudziestościenny fag (ok. 3a. . Bakteriofag fd. które pozwalają jej rozpoznawać inne promotory. DNA charakteryzuje się kolistą permutacją i nadmiarem terminalnym (końcowym). 5. 25 nm średnicy). 3. za zgodą Elsevier Science. Jedną z takich zmian jest ADP-rybozylacja.Następnie transkrybowane są geny „pośrednie" i „późne". Synteza hydroksymetylocytozyny wymaga enzymów kodowanych przez faga. homologicznej sekwencji w innej dwuniciowej cząsteczce. niekurczliwym ogonkiem. Odpowiednio bakteriofagi T3 i T7 w tym samym powiększeniu (odcinek = 50 nm). Jednoniciowe końce atakują komplementarne sekwencje innych genomów fagowych. Szwajcaria. „nadmiar terminalny" oznacza. W innym genomie sekwencję można przedstawić jako: 5'-EFGH |ABCDEFGH . .1). Bakteriofag 029. Dzięki uprzejmości dr. Termin. a długi ogonek jest niekurczliwy. że te same sekwencje występują na dwóch końcach danej cząsteczki (co pokazano na schematach). 5(2) Copyright 1992. Uniwersytet w Bazylei.8) są syntetyzowane przez bakteryjną polimerazę RNA. że w genomach z kolistą permutacją. odpowiednio (wszystkie w tym samym powiększeniu). Znaczenie tych terminów przybliży analiza sekwencji: 5'-ABCD|EFGH . zawierający hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny. Reprodukowano z wybranych zdjęć mikroskopowych opublikowanych w M. Fagi te są morfologicznie bardzo zbliżone. długość odcinka 50 nm.1) 1. 9. . Genom faga T4 stanowi liniowy. Przyczyną tego jest brak możliwości syntezy ostatniego fragmentu Okazaki nici opóźnionej na matrycy liniowego DNA. Poza tym. różnią się jedynie miejscami receptorowymi (miejscami wiązania) na komórce E. Fot. Bakteriofag Qβ. Replikacja DNA faga rozpoczyna się 5 min po zakażeniu. Wydłużona główka (około 35-40 nm) ma białkowe włókna i jest połączona z krótkim. niekurczliwy ogonek. Bakteriofag lambda (λ). Pergamon Press plc. czyli przeniesienie reszt ADP-rybozylowych z NAD na polimerazę (rys. 9. że dwa końce faga fd różnią się. sekwencja wszystkich cząsteczek jest taka sama tylko jej początek jest różny. T4 i T2. Michaela Wurtza. 5. Oba bakteriofagi mają liniowy. ABCD|EFGH-3' Warto zaznaczyć. 8. 2. 7. nitkowaty fag zawierający ss cccDNA. Główka zawiera dsDNA. w transkrypcji późnych genów faga T4 bierze udział kodowany przez faga czynnik σ. 9.1 Wybrane bakteriofagi (patrz tekst i tab. co odbywa się np. natomiast w syntezie fragmentów Okazaki biorą udział białka kodowane przez faga.6). Na zamieszczonym niżej powiększonym zdjęciu wyraźnie widać. przez zastąpienie krótkiej.4 i 9. 4. 7. Startery niezbędne do syntezy nici wiodącej (rys. pz. Wurtz „Bacteriophage structure" MICRON Electron Microscopy Reviews vol. .

235 .

a prekursor główki odłącza się od błony i ulega dalszym przekształceniom konformacyjnym. ogonek oraz inne funkcje kodowane są przez geny „późne". zarówno bakterii gramujemnych. co zachodzi na wewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Główka. wspomagany przez fagowe białko lityczne.1. (1997) Microbiology 143: 179-185]. potem dodawane są włókna. a jej składanie rozpoczyna się od utworzenia specjalnej struktury zwanej „prekursorem główki".2). MS2 lub Qβ) genom fagowy pełni funkcję mRNA.1. Lizozym kodowany przez faga. na który składają się „białka tworzące rusztowanie" (określające kształt i wielkość struktury). Fagowe potomstwo jest uwalniane na drodze lizy osmotycznej. 4) Tworzenie konkatemerów podczas replikacji faga λ zachodzi na drodze mechanizmu toczącego się koła (rys.7 i sekcja 9. DNA pakowany jest do główki zgodnie z mechanizmem — „napełnić główkę". u niektórych zachodzi wiązanie z określonymi miejscami na pilusie: np.2 Cykl lityczny innych fagów Cykle lityczne innych fagów różnią się znacznie od cyklu faga T4. 2. rozgałęzionej sieci replikujących się genomów fagowych. można więc postawić pytanie. co umożliwia lizę komórek gospodarza i uwolnienie potomstwa fagowego we właściwym czasie.1) Nie wszystkie fagi wiążą się na początku ze ścianą komórkową.Ta aktywność rekombinacyjna umożliwia dalszą replikację (końce 3' pełnią rolę replikacyjnych starterów) prowadzącą do powstania złożonej. jak i gramdodatnich koduje enzym degradujący Peptydoglikan. poczynając od jej rdzenia. do których należy lizozym i endopeptydaza. 9. tak że mogą być wykorzystywane niektóre geny gospodarza. Główka składa się z produktów około 20 genów. noszą wspólną nazwę endolizyn. 3) W małych fagach zawierających ssRNA (takich jak M12. musi kodować przynajmniej część replikacyjnego systemu. Jeden koniec konkatemeru zostaje wprowadzony do główki. W ten sposób powstaje znaczna liczba konkatemerów. Z kolei RNA fagowy. w końcu DNA zostaje przecięty. aby był zdolny do replikacji. fag M12 wiąże się na powierzchniach bocznych (nie na końcu) pilusa F lub pilusów należących do grupy F. Struktura ta montowana jest wokół rdzenia. ponieważ żadna bakteria nie ma zdolności do syntezy RNA na matrycy RNA. a więc jego ekspresja wymaga tylko translacji. Następnie rdzeń jest usuwany.2). Polimeryzacja ogonka zachodzi na płytce podstawowej. a pozostały DNA jest do niej wpychany aż główka zostanie wypełniona. Wiele fagów. Gotowy ogonek łączy się spontanicznie z główką wypełnioną DNA. z których każdy składa się z dużej liczby genomów fagowych połączonych końcami (konkatemery są również tworzone podczas replikacji faga λ — ale według innego mechanizmu). Rozwój T4 w komórce E. Takie enzymy. Endolizyny nie mają sekwencji sygnalnej. w jaki sposób zdolne są do przejścia przez błonę cytoplazmatyczną do warstwy peptydoglikanu? Oprócz endolizyny niektóre z fagów kodują specyficzne białko lityczne 236 . osłabia osłony bakteryjne (rys. coli zależy od stanu jej fizjologicznego [Hadas i wsp. 9. 2) W pewnych przypadkach chromosom bakteryjny jest funkcjonalny przez jakiś czas.

Do główki dołącza się ogonek. Liniowy DNA jest wstrzykiwany do komórki (przez ogonek). Miejsca cos znajdujące się w konkatemerze są cięte enzymatycznie. każdy długości 12 zasad (górna część). których aktywności są wzajemnie przeciwstawne. Dwuniciowy odcinek powstały przez sparowanie lepkich końców nazywa się miejscem cos (czarny kwadrat). przez które endolizyna może dotrzeć do peptydoglikanu. długości około 49 kpz. W ten sposób do główki pakowany jest DNA znajdujący się między dwoma kolejnymi miejscami cos.(zwane również holiną) umiejscowione w błonie cytoplazmatycznej i tworzące „pory". uwolniony po lizie komórek. aż zostanie napotkane następne miejsce cos — wtedy następuje cięcie. a fag. 237 . jak i w otaczającym środowisku. Dwuniciowa cząsteczka DNA.8). a lepkie końce cos umieszczone są w główkach fagowych. na który mają wpływ warunki panujące zarówno wewnątrz komórki. gotowy jest do infekcji nowej komórki gospodarza. Zachodząca w komórce transkrypcja „wczesnych" genów fagowych prowadzi do syntezy białek regulacyjnych. 7. DNA wprowadzany jest do główki. jest lizogenia (sekcja 9.2) lub opisana niżej liza. Wynikiem. Takie kolejno powtórzone cząsteczki nazywa się konkatemerem. Początkowo DNA replikuje się według mechanizmu typu Cairnsa (rys. powodując powstanie długiego łańcucha złożonego z genomów fagowych połączonych końcami. Białka główki i ogonka faga są kodowane przez geny „późne" transkrybowane z kolistych cząsteczek DNA. Holina jest produktem genu S faga A. replikują się struktury koliste. Następnie replikacja zaczyna przebiegać według mechanizmu „toczącego się koła". ma komplementarne lepkie końce. tzn. Lepie końce umożliwiają utworzenie cząsteczki kolistej. W łańcuchu miejsce cos jest powtórzone w regularnych odstępach (środek). tę samą rolę pełni produkt genu l faga T4.

Fagi potomne z kolei mogą zakazić i doprowadzić do lizy sąsiednich komórek. zwanego łysinką. jest opisany przez Blasiego i Younga C(1996) MM 21: 675-682]. zazwyczaj kolistego przejaśnienia.4 Pakowanie DNA W rozdziale omawiającym łączenie się poszczególnych części faga T4 (sekcja 9.1) sprawia. Jeden z modeli postuluje. Łysinki powstają w każdym miejscu. że każdy fag zakazi i spowoduje lizę pojedynczej komórki.1. oddzielone od siebie przez jeden lub dwa inne kodony. mniej całkowitych cząstek fagowych byłoby uwalnianych w jednym cyklu (tj. że pierścień złożony z pRNA stanowi cześć aparatu. helikalnej) cząsteczki DNA do główki 238 . sześć pofałdowanych cząsteczek RNA tworzy pierścień wokół otworu. z której uwolni się wiele fagów potomnych. ponieważ liza powinna być indukowana dopiero po zakończeniu tworzenia się potomstwa fagowego w komórce. Łysinki przedstawione są na fotografii 16. 9. dłuższy pełni prawdopodobnie rolę inhibitora jej aktywności. Rezultatem tego jest powstanie widocznego gołym okiem. że holina musi być aktywna w określonym czasie po zakażeniu. Changand Young (1994) MM 13: 495-504]. 7. phage-encoded RNA) kodowanego przez faga. Prawdopodobnie. który obraca się (wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP) powodując wchodzenie „nitkowatej" (tj. Sposób.3. itp. „wielkość plonu" byłaby mniejsza). w niektórych fagach sekwencje kodujące holinę mają dwa kodony inicjujące syntezę białka. 9. 9.1) i fagów spokrewnionych. co sprawia. że są kodowane dwa łańcuchy polipeptydowe (nieznacznie różniące się wielkością). w jaki produkty tych dwóch genów regulują czas zajścia lizy. Najnowsze badania pozwoliły jednak zrozumieć pakowanie DNA faga (tab. przez który wchodzi DNA.Oczywiste jest.8b). Dodanie małej liczby cząstek fagowych do jednolitej warstwy wrażliwych komórek (sekcja 3. Mechanizm wprowadzania DNA faga T4 (jak również innych fagów) nie jest jeszcze znany. w mętnej warstwie jednolitego wzrostu. Jeśli liza wystąpiłaby wcześniej. że DNA jest wprowadzany do główki fagowej. czego wynikiem jest przejaśnienie gęstej. Co ciekawe. Krótszy polipeptyd to holina. Taka przedwczesna liza była obserwowana w przypadku faga λ zawierającego mutacje genu S Qohnson-Boar.1.1) wspomniano.3 Działanie fagów wirulentnych na hodowle bakteryjne Po dodaniu fagów wirulentnych do bulionowej hodowli wrażliwych bakterii większość lub wszystkie komórki ulegają lizie. (Taka struktura przypomina helikazę tworzącą pierścień złożony z sześciu cząsteczek białka DnaB i biorącą udział w przemieszczaniu się DNA podczas replikacji typu Cairnsa: rys. ang. Pakowanie DNA faga wymaga energii pochodzącej z hydrolizy ATP.1. a umieszczenie DNA w główce zależy od obecności specyficznych cząsteczek RNA (nazwanego pRNA.1. nieprzezroczystej hodowli. w którym początkowo wprowadzony fag zakaził komórki.

fagowe białko (produkt genu int) działa tu jak specyficzna rekombinaza. Na przykład. Mówimy wówczas. Jeden z mechanizmów odporności na superinfekcję obrazuje dobrze przykład lizogennej infekcji Salmonella typhimurium przez faga P22.2). które hamuje transkrypcję rozpoczynającą się w niektórych promotorach i sprzyja lizogenii. Rozstrzygający wpływ może mieć ogólna wewnętrzna kondycja komórki. że lizogenia jest zjawiskiem powszechnie występującym w przyrodzie. Lizogenna bakteria jest odporna na atak innych fagów tego samego typu (odporność na superinfekcję). że komórka gospodarza jest lizogenna. Rozpoczyna się transkrypcja „wczesnych" genów fagowych potrzebnych do lizy lub lizogenii.fagowej w sposób przypominający przejście trzpienia przez nakrętkę. profag zazwyczaj zachowuje zdolność do wirulencji.9. istnienie pRNA zostało stwierdzone w fagach typu pRNA może występować również w innych fagach lub. przeciwnie. natomiast liza jest bardziej prawdopodobna w komórkach zakażonych tylko jednym fagiem.] 9. kwasu nukleinowego. Zawsze jednak replikacja profaga i komórki gospodarza jest skoordynowana. hamującego transkrypcję genu cI. funkcja tych cząsteczek może być przejęta przez inne (być może złożone z białek) systemy. 9. ale istnieje w formie cząsteczki kolistej („plazmidu"). W populacji lizogennych bakterii indukcja może zachodzić spontanicznie w małej liczbie komórek. 9. Jak dotychczas. niezależnie od ilości substancji odżywczych. lizogenia ma większe szanse przy wielokrotnym zakażeniu komórki (tj. W nielicznych przypadkach (np. Utrzymanie stanu lizogenii wymaga syntezy białka represorowego kodowanego przez faga. Wydaje się. nielityczny rodzaj stosunku zwany lizogenią. Lizogenia wymaga wstawienia się genomu faga λ w chromosom gospodarza.3b).2) — w ten sposób niszczy własne miejsca receptorowe znajdujące się na powierzchni komórki.2. fag P1) profag nie łączy się z chromosomem. co zachodzi na drodze zlokalizowanej rekombinacji (rys.1 Lizogenia/liza na przykładzie faga λ i Escherichia coli DNA faga jest wprowadzany do bakterii w formie liniowego dsDNA i natychmiast po wprowadzeniu tworzy formę kolistą (rys. Fag ten powoduje glikozylację lipopolisacharydów komórki gospodarza (sekcja 2.2. zakażeniu jednej komórki dużą liczbą fagów) w środowisku ubogim w substancje odżywcze. zwanego profagiem) z chromosomem gospodarza. i białka cro. [Upakowanie DNA w bakteriofagach: Hendrix (1998) Cell 94: 147-150. tak że podczas każdego podziału komórka potomna bakterii otrzymuje profaga. Jak widać. Lizogenia najczęściej jest związana z połączeniem się (integracją) genomu faga (tj.2 Fagi umiarkowane — lizogenia Fag umiarkowany może wytworzyć z bakterią stabilny. Utrata aktywności represora prowadzi do indukcji cyklu litycznego. O zajściu jednego z tych procesów decyduje przewaga jednego z dwóch produktów wczesnych genów: białka cI. 8. 239 .

coli rosnącej w bogatym podłożu czynniki te mogą być wytwarzane w nadmiarze. Następnie cząsteczka ta ulega superskręceniu w wyniku działania komórkowej gyrazy (wtedy nazywana jest RFI). tym samym blokując ich przejście w formę RF. W wycięciu bierze udział fagowe białko xis. 240 . gdy czynny jest system SOS (sekcja 7. Badania prowadzone z użyciem zmodyfikowanej (zmutowanej) polimerazy RNA E. jeżeli zaburzona była transkrypcja niektórych czynników fagowych. W tych warunkach. Po wycięciu genom faga replikuje się. te pocięte i koliste cząsteczki ssDNA są pakowane do płaszcza białkowego. To sugeruje. 9. Jednocześnie. że lizogenia nie mogła zajść. Indukcję mogą wywoływać czynniki powodujące zniszczenie DNA. Ich końce łączą się w formę kolistą. tworząc w ten sposób potomne formy RF. Zmodyfikowane formy M13 stosuje się jako wektory do klonowania w celu wytworzenia jednoniciowych kopii DNA potrzebnych do sekwencjonowania (sekcja 8. 9. że (względnie) mała ilość czynników litycznych wytwarzana podczas wzrostu w uboższych pożywkach była ciągle wystarczająca do lizy. co prowadzi do indukcji cyklu litycznego. Nadprodukcja obserwowana podczas wzrostu w podłożach bogatych sugeruje. Czynniki konieczne do lizy były wówczas transkrybowane w ilości mniejszej niż normalnie.2.2). 9. a jej nić c zaczyna być transkrybowana. jednak liza nadal zachodziła w pożywkach bogatych. że synteza czynników litycznych zależy od ilości substancji odżywczych.8. następuje aktywacja białka RecA i przecięcie przez nie białka fagowego represora (białka cI).1). prowadząc do utworzenia replikacyjnej formy (RF) składającej się z ccc ds DNA. takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub antybiotyk — mitomycyna C.5). a w niezmutowanej E. 8.2 Replikacja DNA faga M13 Ml3 jest nitkowatym fagiem (którego genom stanowi ccc ssDNA) należącym do tej samej grupy co fag fl (tab.6) lub zlokalizowanej mutagenezy (sekcja 8. coli ujawniły. Następnie specyficzne białka kodowane przez faga gromadzą się w komórce i pokrywają nowo utworzone nici v. Enzymy bakterii. części składowe faga są syntetyzowane.5).5. a dojrzale fagi — wypychane na zewnątrz przez osłony żyjącego wciąż gospodarza. w ilości przewyższającej konieczną do lizy.Indukcja (przejście od lizogenii do wirulencji) zachodzi spontanicznie w nielicznych komórkach lizogennej populacji. Może to być podstawą strategii zachowania zdolności do namnożenia faga w warunkach ograniczenia substancji pokarmowych [Gabig i wsp. po jej zakażeniu.2. Cykl lityczny wymaga również wycięcia profaga w procesie stanowiącym odwrotność jego wstawienia. (1998) Microbiology 144: 2217-2224]. natomiast nie obserwowano jej w pożywkach ubogich. na matrycy jednoniciowego genomu faga (v lub „plus") syntetyzują nić komplementarną (c lub „minus"). Nić ν zostaje przecięta (przez enzym kodowany przez faga) i rozpoczyna się replikacja według mechanizmu toczącego się koła (rys.1) i fd (fot. Na początku ssDNA nici ν jest pocięty na odcinki odpowiadające jednej długości genomu.5. a po ich połączeniu i lizie komórki gospodarza cząstki fagów są uwalniane do środowiska.

Infekcja lityczna wymaga zajścia około 100. M12. Wszystkie genomy fagowe zawierają kawałki bakteryjnego DNA na każdym z dwóch końców. Insercja DNA faga Mu prowadzi do podwojenia się miejsca DNA długości 5 pz. jedynie rosną wolniej od komórek niezakażonych. obejmującą nawet 2-3% komórek.1 Bakteriofag Mu Insercja (wstawienie) DNA faga Mu do chromosomu zachodzi według mechanizmu konserwatywnej transpozycji (rys. Fagi te adsorbują się na bokach niektórych typów pilusów. 9. związanych z replikacją. W związku z tym. Szczepy nielizogenne nie wytwarzają tej toksyny i nie powodują błonicy (patrz również toksyna cholery w sekcji 11. z wyrażenia się fagowych genów w komórce lub z inaktywacji genów chromosomowych w wyniku wstawienia faga.3. a następnie pakowane na zasadzie mechanizmu „napełnić główkę". insercje.3 Fagi męskie Fagi męskie zakażają tylko bakterie zawierające koniugacyjny plazmid. 241 . Na przykład szczepy Corynebacterium diphtheriae powodujące błonicę są lizogenne i zawierają pewien typ faga kodującego silną toksynę. Lizogenia jest związana z aktywnością białka represorowego (produktu genu c). U Staphylococcus aureus wstawienie genomu faga L54a prowadzi do utraty aktywności lipazy wskutek inaktywacji odpowiedniego genu chromosomowego (patrz również Salmonella w Aneksie). konwersja lizogenna) może wynikać np. 8. fl i fd (tab.1).4a-c). czy następstwem infekcji jest liza czy lizogenia. Delecje. regulować syntezę transpozazy. itp. które adsorbują się specyficznie na końcach niektórych typów pilusów. Taka konwersja fagowa (konwersja bakteriofagowa. Genomy fagowe są wycinane. Jedną ich grupę stanowią fagi nitkowate ssDNA. Potomne fagi fl i fd są uwalniane po przejściu przez osłony komórkowe.4 Konwersja fagowa Bakterie lizogenne mogą mieć cechy. Komórki gospodarza pozostają żywe. która wiąże się z końcami fagowego DNA). których kapsyd ma budowę dwudziestościanu. f2 i Qβ są małymi fagami ssRNA. MS2. w które wstawił się fag. 9. których są pozbawione komórki niezakażone. stąd nazwa Mu (mutator). w których fag zachowuje się jak ogromny element transpozycyjny. które może np.4. np. Wstawienie faga zachodzi w dowolnym miejscu chromosomu. 9. Transpozycja zależy od działania fagowego produktu genu A (transpozazy. w populacji bakterii lizogennych zakażonych tym fagiem obserwuje się znacznie zwiększoną częstość mutacji. niezależnie od tego.9. transpozycji między różnymi częściami chromosomu. że fag Mu często wstawia się w genom bakteryjny prowadząc do jego inaktywacji. zaburzenia powstające w wyniku transpozycji w chromosomowym DNA wystarczą do spowodowania śmierci komórki.1). Przejście przez błonę komórkową może być związane z zanikiem pilusa.1.

Transdukcja jest użyteczna do szczegółowego mapowania chromosomów i plazmidów dawcy. Taki zrekombinowany genom fagowy może być następnie pakowany do główki i dal- 242 . Podczas wycięcia profag może niekiedy zabrać część otaczającego chromosomu. coli/fag λ profag jest ograniczony z dwóch stron przez geny gospodarza —gal i bio (rys. w których zachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza (patrz np. W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może: 1) być degradowany przez restrykcyjne endonukleazy (sekcja 7. W niektórych przypadkach każdy gen gospodarza ma podobną szansę przeniesienia. (W przypadku utworzenia kolonii przez poronnego transduktanta tylko jedna komórka w kolonii zawiera DNA dawcy). ani do lizogenii.5. 2) rekombinować z chromosomem (lub plazmidem). Odległość między genami określa się na podstawie częstości kotransdukcji.5 Transdukcja Przeniesienie chromosomowego (lub plazmidowego) DNA z jednej komórki do drugiej za pośrednictwem faga nazywamy transdukcją. proces ten nie prowadzi ani do lizy. W populacji bakterii zakażonych fagiem zdarza się czasami.4).2). Jednak w układzie Salmonella /fag P22 większą szansę przekazania na drodze transdukcji ma pewien region chromosomu bakteryjnego. czego wynikiem jest stabilne dziedziczenie niektórych cech dawcy (transdukcja pełna).1). W układzie E. Geny dawcy zawierające stabilny promotor mogą być wyrażane (zarówno w transduktancie pełnym. że podczas łączenia się części składowych faga. sekcja 9.3b). 8.4. że w rzadkich przypadkach nieprawidłowego wycięcia profag może zabrać geny gal lub bio. 3) trwać jako ustabilizowana. Zdarzenie to jest podobne (w ogólnych zarysach) do powstania plazmidu F' (sekcja 8. ale nie replikująca się cząsteczka (transdukcja poronna). z powodu braku DNA fagowego i zawartej w nim informacji. Takie nienormalne fagi mogą po uwolnieniu przylegać do innych komórek i wprowadzać do nich DNA. 9. ale. Jednoczesna transdukcja dwóch lub więcej genów (kotransdukcja) jest dowodem na ich chromosomowe sąsiedztwo. do główki pakowany jest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego. Wynika stąd. Przeniesienie genu bakteryjnego na drodze transdukcji ogólnej jest przypadkiem rzadkim. 9.9.2.1 Transdukcja ogólna W procesie tym każdy z licznych genów faga może być przeniesiony z jednej komórki bakterii do drugiej. Region ten przypomina sekwencję genomu faga związaną z pakowaniem DNA do główek fagowych. często zostawiając niektóre geny fagowe znajdujące się po przeciwnej stronie profaga.2 Transdukcja ograniczona W transdukcji ograniczonej biorą udział jedynie fagi umiarkowane.5. jak i poronnym).

specialized transducing particle) może utracić zdolność do replikacji (tj. W ten sposób zostaje zahamowana synteza białek fagowych. Fagi T-parzyste (T2. STP. ang. a przez to niewrażliwy na działanie endonukleaz. 9.sze składanie faga zachodzi bez zakłóceń. coli) są oporne na restrykcję. po infekcji fagami T-parzystymi niektóre szczepy E. Fag jednak koduje enzymy (z ligazą RNA włącznie) zdolne do naprawy tego procesu samozniszczenia. coli) nie zawiera wcale albo zawiera niewiele miejsc przecinanych przez endonukeazy gospodarza. które mogą być przeniesione podczas transdukcji. są geny otaczające profaga. DNA niektórych fagów (fag T7 E. Na przykład. a więc replikacja faga. W jaki więc sposób fagi zdolne są do replikacji w bakteriach? Wykorzystują w tym celu różne mechanizmy antyrestrykcyjne [Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450].6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? Głównym celem restrykcji w bakteriach (sekcja 7. Nawet w tym przypadku. Niektóre fagi kodują specyficzne inhibitory enzymów restrykcyjnych. a co za tym idzie — zdolność do przeniesienia genów dawcy (gal lub bio). Również w innych układach bakteria/fag jedynymi genami. coli wytwarzają enzym przecinający ich własny tRNA1ys (lizynowy tRNA). inne zaś kodują metylazy o specyficzności właściwej komórkom gospodarza. Miejsca te zostały utracone lub ich liczba zmniejszona w procesie selekcji (przeciwko zdolności do enzymatycznego przecięcia). może być wadliwy). Fag transdukcji ograniczonej (wyspecjalizowana cząstka transdukcyjna.4) wydaje się ochrona przeciwko „obcemu" DNA — szczególnie DNA fagowemu. . jednak zachowuje zdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy. ponieważ ich DNA jest glikozylowany. T4 i T6 E.

ale w tym rozdziale może być przedstawiony tylko krótki zarys niektórych z nich. powierzchnia roślin.4). Mikroorganizmy występujące zazwyczaj w określonym siedlisku nazywa się łącznie mikroflorą tego siedliska. które nie mogą efektywnie konkurować. które należy zniszczyć. W pewnych warunkach organizm może czynnie przeszkadzać przynajmniej niektórym konkurentom. glony. Bakterie zwykle występują jako członkowie mieszanego „kolektywu". które kolonizują dane siedlisko. są prawdopodobnie eliminowane z siedliska. może mieć nad innym przewagę we współzawodnictwie. Te organizmy. Mikroorganizmy. w skład którego mogą wchodzić grzyby. o tlen. który wytwarza antybiotyki (sekcja 15. jak: woda. o przestrzeń itp.ROZDZIAŁ 10 Bakterie w świecie ożywionym Bakterie są często uważane za szkodniki. pierwotniaki i inne organizmy. co oznacza. Zazwyczaj takie substancje skierowane przeciw mikroorganizmom są wytwarzane tylko w okolicznościach ograniczenia wzrostu wobec małej zawartości sub- 244 . lecz również dla zachowania równowagi w naturze. na przykład mikroorganizm. 10. wnętrze i powierzchnia ciała człowieka oraz zwierząt. wytwarzając substancje dla nich toksyczne — zjawisko to nazwano antagonizmem. że niekoniecznie tworzą one wyraźnie określone związki z innymi organizmami. oddziałują na siebie w rozmaity sposób: na przykład mogą współzawodniczyć o substancje pokarmowe występujące w niedoborze. Jednakże bakterie mają swoje własne życie poza laboratorium i wiele z ich aktywności jest istotnych nie tylko dla człowieka. gleba. Takie zespoły można znaleźć w rozmaitych naturalnych siedliskach. aby rozwijając się nie wpływały na inne organizmy lub by same nie ulegały wpływowi. mimo że w naturalnych warunkach stanowią część sieci wzajemnych powiązań i rzadko się zdarza. Ten aspekt bakteriologii obejmuje wiele zagadnień. lub też traktuje się je jak „torebki z enzymami" — przydatne do przeprowadzania doświadczeń.1 Zespoły mikroorganizmów Większość bakterii należy do organizmów swobodnie żyjących.

terapią antybiotykową — może stworzyć lepsze warunki dla patogenów i spowodować chorobę. a „stolce jak odwar ryżowy" mogą zawierać 109 komórek V. organizm wytwarzający kwas może sprzyjać powstawaniu dogodnych warunków dla innego organizmu.1. Obejmują one (lub mogą składać się głównie z) pewne sinice (cyjanobakterie) — szczególnie te. Obcy mikroorganizm ma zwykle trudności w usytuowaniu się w takiej wspólnocie. a nawet poprzez dopływ nowych substancji. a sam S. w wielu środowiskach zdarzają się okoliczności. cholerae w 1 mililitrze. Na przykład.5) — i/lub niektóre mikroorganizmy eukariotyczne. w jelitach zwierząt zasiedlanie przez patogeny mogą często utrudniać mikroorganizmy należące do naturalnej mikroflory. ponieważ zajmują przestrzeń (a więc blokują dojście) i są dobrze dostosowane do warunków jelit i z tego powodu mogą zwykle przerosnąć patogeny. w którym korzystne i antagonistyczne zależności osiągają stan równowagi.7).2. jednakże jakiekolwiek zakłócenie tej mikroflory — np. W jeziorach i innych zbiornikach wodnych pewne warunki mogą wspomagać obfity wzrost określonych organizmów. że jeden lub oba organizmy odnoszą korzyści. które wytwarzają wakuole gazowe (sekcja 2. co powoduje. Jeżeli środowisko pozostaje niezakłócone. przeciw którym są skierowane. Śmierć/uszko- 245 . do których należą kolicyny i mikrocyny (tworzone przez i skierowane przeciwko gramujemnym gatunkom) i lantybiotyki takie jak nizyna (tworzone przez i skierowane przeciwko gramdodatnim gatunkom). 10. mieszanych zespołów organizmów. że staje się niewrażliwy na lizostafinę. zakwit — widoczna na lub blisko powierzchni (często rzucająca się w oczy) warstwa organizmów. Zakwity mogą być stymulowane np. Bakteriocyny hamują/zabijają komórki. wpływając na syntezę kwasu nukleinowego lub białek. którego wzrost jest uzależniony od niskiego pH. gdy śmierć innych organizmów w siedlisku może być korzystna na skutek zmniejszenia konkurencji o substancje pokarmowe. 2. na przykład. przez nadmiar składników pokarmowych (takich jak azot wyługowany z nawozów rolniczych) i/lub przez termiczne uwarstwienie w wodzie. [Bacteriocins (artykuł przeglądowy): Baba i Schneewind (1998) TIM 6: 66-71]. Na przykład bakteriocyna lizostafina wydzielana przez Staphylococcus simulans uszkadza Peptydoglikan we wrażliwych szczepach gronkowców (patrz rys. chyba że zakłócenia w środowisku zburzą równowagę tego zespołu. rozwija się w nim stabilny zespół organizmów. Tworzy się wówczas tzw. kiedy jeden lub kilka gatunków przejściowo dominuje. Oczywiście bakterie muszą same się zabezpieczać przed własnymi bakteriocynami. Niektóre bakterie wydzielają związki przeciw mikroorganizmom zwane bakteriocynami. W przypadku cholery (sekcja 11. a żaden z nich nie ponosi szkody.stancji pokarmowych. Wzajemne zależności w środowisku mogą również polegać na tym. czy też uszkadzając błony.1) jelita pacjenta stają się żywym inkubatorem dla organizmu wywołującego chorobę Vibrio cholereae. simulans zmienia Peptydoglikan za pomocą enzymu kodowanego przez gen lif.3. a więc wtedy.1.1 Zespoły przejściowe W odróżnieniu od stabilnych.

podczas gdy w stanie wolno żyjącym (przy niskiej gęstości) nie wykazuje tej cechy lub tylko w nieznacznym stopniu. Jeśli gęstość komórek osiąga określone minimum liczebności (ang. ale do regulacji różnych genów. fischeri) autoinduktor należy do grupy laktonów N-acylo-L-homoseryny (AHLs) [AHL — based quorum sensing: Swift i wsp. kiedy „włączyć światło"? Sygnał właściwie rozwija się jako bezpośrednia konsekwencja wzrostu w populacji. Tak więc. Niektóre sinice powodujące zakwity (np. Jak pojedyncze komórki wyczuwają (ang. braku korzystnych czynników) może doprowadzić do znacznej utraty tlenu z wody. bakterie zaś odnoszą korzyść ze stabilnego siedliska. Anabaena i inne organizmy tworzące zakwity mogą wydzielać pewną substancję (geosminę). 10. Rozmaite bakterie mogą wytwarzać różne autoinduktory regulujące pewne ich właściwości. Ryby wykorzystują bakteryjną bioluminiscencję do sygnalizacji między sobą. W niektórych przypadkach można zapobiec zakwitowi poprzez pompowanie (krążenie) wody niedopuszczające do uwarstwienia i/lub stosując związki przeciw sinicom. czasem odmienne gatunki wytwarzają ten sam autoinduktor. w którym są aktywowane pewne geny w komórkach. cząsteczki te nagromadzają się do takiego stężenia. Nodularia) wytwarzają toksyny. Jako symbiot P. sense) gęstość populacji i skąd wiedzą. W wielu przypadkach (w tym przykład P.2. których nie mają te same komórki w populacji o niskiej gęstości („gęstość" rozumiana jako liczba komórek w jednostce objętości). która czasem nadaje ziemisty lub zatęchły posmak wodzie (i żyjącym w niej rybom). fischeri emituje niebieskozielone światło (=bioluminiscencja: światło pochodzące od żywego organizmu). Sygnalizująca cząsteczka (o małej masie cząsteczkowej) jest nazywana autoinduktorem (ponieważ komórki same ją wytwarzają). wszystkie komórki wydzielają specjalnego rodzaju cząsteczki sygnalizujące. Photobacterium fischeri (= Vibrio fischeri) może być albo organizmem swobodnie żyjącym (w populacji o niskiej gęstości) albo symbiontem (sekcja 10. takie jak dichloronaftochinon (dichlon). które regulują geny kodujące określone czynniki wirulencji. jeśli występuje w populacji o wysokiej gęstości — w „narządzie świetlnym" pewnych ryb świecących. Microcystis. W Pseudomonas aeruginosa są przynajmniej dwa systemy „quorum sensing" — las i rhl (wymagające różnych laktonów homoseryny jako autoinduktorów). ponadto wydaje się. zawsze jeden jest aktywowany przed drugim [Pesci i Iglewski (1997) TIM 5: 132-134]. że te dwa systemy współdziałają w układzie hierarchicznym. (1996) TIBS 21: 214-219].1.4). w tym przypadku geny lux.2 Wyczuwanie liczebności — „quorum sensing" W niektórych przypadkach komórki w populacji o wysokiej gęstości wykazują cechy. Na przykład. 246 . Niektóre bakterie wytwarzają kilka autoinduktorów kontrolujących wyrażanie się różnych cech. quorum). które mogą być śmiercionośne dla ryb i/lub innych zwierząt.dzenie organizmów tworzących zakwit (na skutek np. powodując czasem uduszenie się ryb i innych zwierząt wodnych. jakie znajdują w tych zwierzętach. dając w efekcie świecenie bakterii. gatunki Anabaena.

Koniugacja (sekcja 8. Mechanizmy działania ComX i CSF są różne. 10. które reguluje transkrypcję określonego genu(ów). Enzym ten z kolei fosforyluje i aktywuje czynnik transkrypcyjny — ComA. które defosforylują Spo0F~P i w ten sposób umożliwiają przenoszenie fosforu (rys.2 Drapieżniki Bakterie z rzędu Myxobacterales (bakterie śluzowe) są gramujemnymi pałeczkami żyjącymi w glebie.1).8. Trzeba przyznać. które pobierają składniki pokarmowe z obumarłej materii organicznej. Niektóre saprotrofy zużywają tylko związki rozpuszczalne.1 Saprotrofy Organizmy. który reguluje aktywność genu comS wymaganego do osiągnięcia stanu kompetencji. że zwykle działają dyfundując do komórki i po osiągnięciu wystarczającego stężenia łączą się z odpowiednim białkiem cytoplazmatycznym. Wydaje się. które nie mogą być sprawnie rozłożone przez zespół saprotrofów „pracujących w jednej drużynie". że jest bardzo niewiele biologicznych związków.2. są nazywane saprotrofami. Bez saprotrofów (heterotrofów) ustałby obieg węgla (rys. w gnojówce i na rozkładających się szczątkach roślin- 247 . Inny feromon — CSF jest pobierany przez system zależnej od ATP permeazy oligopeptydowej (transport) obecnej w błonie cytoplazmatycznej. 10. pewne zaś mają zdolność do rozkładu celulozy (sekcja 6. podobnie jak CSF (wyżej) feromony te są wprowadzane do wnętrza przez błonowy system permeaz [Peptide signalling (artykuł przeglądowy): Lazazzera i Grossman (1998) TIM 6: 288-294].AHLs są popularnymi autoinduktorami w bakteriach gramujemnych. 7.4.2) czy też innych polimerów poza komórką i przyswajają rozłożone produkty. w środowisku pozakomórkowym gromadzą się dwa typy feromonów — oznaczone jako ComX i CSF. ComX pobudza rozwój stanu kompetencji w transformacji (sekcja 8.6): powoduje autofosforylację kinazy histydynowej związanej z błoną (ComP). Kiedy wzrost Bacillus subtilis powoduje osiągnięcie dużej gęstości komórek. Tego typu współdziałanie jest istotne dla rozkładu. kolejno przez określone gatunki saprotrofów przeprowadzających jeden (lub kilka) etapów tego procesu.1) u Enterococcus faecalis jest związana z wydzielaniem feromonów przez komórki potencjalnych biorców. a zatem obiegiem materii organicznej w naturze.14). pasożyty. symbionty 10.2.2 Saprotrofy. 10. Bakterie gramdodatnie zwykle wykorzystują jako autoinduktony peptydowe cząsteczki sygnalizujące (= feromony). w cytoplazmie hamuje on aktywność niektórych fosforylaz. ComX aktywuje dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7.1). Złożone substraty mogą być rozkładane stopniowo.2.4. jak i obiegi innych składników materii. zaś CSF wydaje się jednym z czynników biorących udział w inicjacji sporulacji. drapieżniki.

Ciekawe. Pasożyty obligatoryjne. Oczywiście bakterie śluzowe nie są typowymi drapieżnikami. Nie wszystkie pasożyty są patogenami i nie wszystkie patogeny są pasożytami.1. Gospodarz może w różnym stopniu ponosić szkody — poczynając od nieznacznej niedogodności aż do śmierci. komensalem jest symbiont. 248 . Później znaczenie tego terminu było ograniczone tylko do tych okoliczności. w których wzajemne oddziaływania polegają na obopólnym odnoszeniu korzyści. ani strat z tego związku.3 Pasożyty Pasożyt to organizm.nych. Pasożyt. który w takim stopniu oddziałuje niekorzystnie na swojego gospodarza. że Bdellovibrio może wnikać do komórek E. 10. lecz dla innych jest on obligatoryjny. przykładem niepasożytniczego patogena jest Clostridium botulinum (sekcja 11.3. który żyje na/lub w innym żywym organizmie (gospodarz) i odnosi korzyści (w różny sposób) jego kosztem.4 Symbionty Początkowo symbiozę rozumiano jako każdy stabilny. że wywołuje jego chorobę lub śmierć. Jednakże obecnie jest tendencja (mimo możliwości pomyłek) powrotu do pierwotnego znaczenia. Stosując tę samą terminologię. fizyczny związek między różnymi organizmami (symbiontami) — niezależnie od rodzaju układów między nimi. Nazwa „Bdellovibrio" pochodzi częściowo od greckiego słowa oznaczającego „pijawkę". że ten ostatni nie doznaje ani korzyści. Inny niezwykły drapieżnik — Bdellovibrio (patrz Aneks) żyje wewnątrz komórek bakteryjnych.2. gdyż drapieżniki zwykle pobierają swoją ofiarę do wnętrza przed jej strawieniem.2). prawie we wszystkich przypadkach pasożyt otrzymuje substancje pokarmowe od swojego gospodarza. Pasożytnictwo można traktować jako alternatywny sposób życia niektórych wolno żyjących bakterii.2. są ściśle uzależnione od metabolizmu swoich gospodarzy i często nie mogą być hodowane w laboratorium. powszechne rozumienie symbiozy uwzględnia zarówno oddziaływania między symbiontami polegające na obopólnym odnoszeniu korzyści (mutualizm). jak i pasożytnictwo. który odnosi korzyści od drugiego symbionta w taki sposób. coli pomimo obecności grubej otoczki [Koval i Bayer (1997) Microbiology 143: 749-753]. Takie bakterie jak Mycobacterium leprae (wywołujące trąd) mogą rosnąć jedynie wewnątrz określonego typu komórek eukariotycznego gospodarza. Większość gatunków tego rzędu żeruje na innych mikroorganizmach: wydzielają one enzymy powodujące lizę innych bakterii oraz grzybów i rozwijają się zużywając rozpuszczalne produkty. 10. Tak więc. chyba że w specjalnych hodowlach żywych komórek. takie jak te przytoczone. nazywany jest patogenem.

Zamia) z ogrodu botanicznego wykazano. które wchodzą w skład żywych organizmów.) mają drobne narośla (brodawki) zawierające bakterie z rodzaju Rhizobium. owce. przemieniających celulozę w proste związki. Z jelitem tych owadów może być również związany rodzaj odrębnej organelli (mycetom). są dość powszechne.3. 10. wyspecjalizowane komórki (mycetocyty) w wyściółce jelita zawierają (wewnątrzkomórkowo) bakterie. Paulsrud i Lindblad (1999) FEMSME 28: 85-91]. Brodawki korzeniowe umożliwiają roślinom rozwój na glebie ubogiej w azot [Legume nodulation (artykuł przeglądowy): Albrecht.1 Symbiozy mutualistyczne Związki partnerskie między bakteriami i innymi organizmami. Głównym udziałem bakterii w biologicznym obiegu węgla (rys.2. 10. Geurts i Bisseling (1999) EMBO Journal 18: 281-288]. koniczyna itp. 6). obecność szczepu Nostoc należącego do sinic [Costa. składniki martwych organizmów muszą być ponownie użyte (włączane w obieg). W wyglądających jak korale korzeniach sagowców (Cycas.1 Obieg węgla Głównym składnikiem strukturalnym wszystkich żywych organizmów jest węgiel (rozdz. W środowiskach naziemnych martwa materia organiczna obejmuje szczątki roślinne i zwierzęce. W procesie tym kluczową rolę odgrywają bakterie i inne mikroorganizmy. podczas gdy Rhizobium zaopatruje ją w azot „wiązany" z atmosfery (sekcja 10. Z kolei mikroorganizmy odnoszą korzyść ze stabilnego środowiska.3 Bakterie a obieg materii Pierwiastki. U niektórych owadów. u której w specjalnych zagłębieniach występuje Anabaena azollae. 249 . 10. występują na Ziemi w ograniczonych ilościach. itp.4.2). dlatego też odzyskiwanie tego pierwiastka jest niezmiernie istotne. krowy. Do takich przykładów należą brodawki zawierające bakterie z rodzaju Frankia w korzeniach olchy (Alnus) i mała pływająca paproć Azolla. W układzie tym roślina dostarcza związki odżywcze i ochronę. dostarczają niezbędnych składników odżywczych gospodarzowi.10. fasola. przynajmniej w kilku przypadkach.). o optymalnej temperaturze i bogatego w składniki odżywcze (dostarczane przez zwierzę). Przykładem mogą być przeżuwacze (np. które nie tworzą enzymów trawiących celulozę zawartą w ich roślinnym pożywieniu. Bakterie wiążące azot tworzą również związki z roślinami innymi niż motylkowe. złożonej ze skupiska mycetocytów. Korzenie roślin motylkowych (groch. stosując metodę PCR. z których obaj partnerzy czerpią korzyści. Encephalatos.1) jest zużywanie i rozkład martwej materii organicznej przez (heterotroficzne) saprotrofy. W przewodzie pokarmowym posiadają natomiast komorę (żwacz) zawierającą znaczną ilość mikroorganizmów (w tym bakterie takie jak Ruminococcus). które mogą być wchłaniane przez zwierzę.3. Aby więc życie mogło być kontynuowane. które.

(Wzrost masy fitoplanktonu. wydaje się. mikroskopijnych fotosyntetyzujących (wiążących CO2) organizmów. glonów i lądowych roślin zielonych — wszystkich fotosyntetyzujących organizmów — jest razem określany jako produkcja pierwotna). W jeziorach często do puli węgla pochodzącego z fitoplanktonu dochodzi węgiel organiczny pochodzenia lądowego dostający się wraz z wodami wpływającymi z lądu.1.) oraz w łańcuchach pokarmowych przez ryby i inne zwierzęta. jest większa niż początkowo przypuszczano.4) należą bakterie zużywające metan. jest zużywana np. że również 250 . Biomasa mikroorganizmów. tj. przynajmniej częściowo. a przedstawiciele Archaea — jako metanogeny (sekcja 5. że ilość węgla ze związków rozpuszczalnych. Mikroorganizmy (w tym bakterie) są odpowiedzialne za niezbędną przemianę „martwych" organicznych związków węgla do biomasy i CO2. przez zwierzęta filtrujące (ostrygi itd. Ostatnio opublikowana praca wykazuje.2. z planktonu roślinnego (fitoplanktonu). Mimo że większość fitoplanktonu jest zużywana jako pokarm przez zwierzęta wodne. produkcji biomasy) i do oddychania. do metylotrofów (sekcja 6. zużytego przez bakterie w oddychaniu. W środowiskach wodnych węgiel w rozpuszczalnych związkach organicznych pochodzi.Bakterie mają znaczący udział zarówno jako autotrofy. jak i heterotrofy (rozdział 6). bez tego procesu obieg ustałby. pozostały dostarcza również węgla do wzrostu bakterii (tj. W otwartym oceanie prawie cały węgiel pochodzi z planktonu roślinnego. Ponadto. jako taka.2). Udział węgla elementarnego (wolnego) w ich obiegach jest minimalny (w porównaniu z azotem i siarką).

Bakteryjny rozkład wiązań eterowych został omówiony przez White.3. 10. głównie wbudowując grupę aminową (z amoniaku) albo do α-ketoglutaranu. Tak więc. U E. Russell i Tidswell (1996) [MR 60: 216-232]. gdyż tylko niektóre z nich mają taką zdolność (sekcja 10. coli szlak asymilacji amoniaku zależy od jego stężenia i zachodzi z zużyciem NADPH. albo do glutaminianu — tworząc odpowiednio glutaminian lub glutaminę. Te z kolei służą jako dawcy azotu w różnych reakcjach transaminacji w procesie syntezy innych związków azotowych. 6. glutaminian dostarcza azotu do syntezy. Oznacza to.6). że okresy autotroficznego zysku netto (kiedy wiązanie CO 2 przewyższa tworzenie CO 2 podczas oddychania) mogą się pojawiać w różnym czasie w ciągu roku.1). Większość organizmów nie wykorzystuje jednak tej jego formy. a ewolucja tego obiegu jest interesująca sama w sobie [Past and present cycle of carbon on our planet (artykuł przeglądowy): Schlegel (1992) FEMSMR 103: 347-354]. są jednak zespoły bakterii. W małych stężeniach amoniaku (np. że przynajmniej okresowo obieg węgla nie jest równomierny w różnych częściach oceanu. A to sugeruje. np. W dużych stężeniach amoniaku enzym dehydrogenaza glutaminianowa katalizuje redukcyjną aminację α-ketoglutaranu do glutaminianu. jakim jest lignina. Wiele bakterii przyswaja azot w formie amoniaku.1 Ksenobiotyki Wiele ksenobiotyków (zanieczyszczenia środowiska takie jak pestycydy. a glutamina jest dawcą azotu w syntezie puryn i pirymidyn (zasady w kwasach nukleinowych) oraz aminokwasów — histydyny i tryptofanu. która wykazuje trwałość w środowisku powodując powstawanie np. < 01 mM) reakcja zachodzi dwuetapowo. Najpierw syntetaza glutaminowa (GS) katalizuje tworzenie glutaminy z glut251 . dlatego też jest niezbędny dla wszystkich organizmów. Pomimo oporności ksenobiotyków na biodegradację. Azot gazowy (diazot — N 2 ) stanowi ponad trzy czwarte atmosfery Ziemi. inne związki chemiczne używane w rolnictwie i detergenty) trudno ulega biodegradacji z powodu obecności w ich cząsteczkach jednego lub kilku wiązań eterowych (C-O-C). węgla kopalnego. Przyswajanie amoniaku. Jest to szczęśliwe rozwiązanie.2. Pod tym względem przypominają one naturalny składnik. aby równoważyć zysk netto heterotrofii [del Giorgio.i tam. ponieważ taka działalność pomaga ograniczyć niepożądane gromadzenie tych składników w środowisku.3).3.3.1. 10.2 Obieg azotu Azot jest składnikiem białek i kwasów nukleinowych. Cole i Cimbleris (1997) Nature 385: 148-151]. L-alaniny i L-asparaginy (rys. które mają zdolność ich rozkładu. szybkość tworzenia CO2 w wyniku bakteryjnego oddychania przewyższa wiązanie CO 2 przez fitoplankton. gdzie pierwotna produkcja w wodzie jest mała. Znajomość obiegu węgla jest konieczna do zrozumienia „efektu cieplarnianego" (sekcja 10.

aminianu i amoniaku. podczas gdy szlak.1.1. coli szlak katalizowany przez dehydrogenazę glutaminianową jest istotny w warunkach ograniczonego dopływu energii (np. Nitryfikacja jest procesem tlenowym. wykorzystywane jako źródło azotu) przez wiele rodzajów bakterii — azotany są redukowane wewnątrzkomórkowo do amoniaku (asymilacyjna redukcja azotanów).2). jest zależny od ATP [Pathway choice in glutamate synthesis in E. w której glutamina (1 cząsteczka) i α-ketoglutaran (1 cząsteczka) tworzą glutaminian (2 cząsteczki). Azotany lub amoniak mogą być przyswajane (tj. Niektóre bakterie mają zdolność przyswajania azotu w postaci azotanów. rys. U E.2). coli: Helling (1998) JB 180: 4571-4575]. tym. 10.4). kiedy substraty energetyczne są ograniczeniem). a następnie w drugim etapie aminotransferaza glutaminowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT. ang.2). podczas gdy oddychanie azotanowe /denitryfikacja i wiązanie azotu są w zasadzie związane z warunkami beztlenowymi lub ubogimi w tlen (ale patrz sekcja 5. Amonifikacja jest częścią procesu mineralizacji (sekcja 10. 252 . syntaza glutaminianowa) katalizuje reakcję. glutaminę: 2-oxoglutarate aminotransferase.2.1. Przyswajanie azotanów. Jest to proces różniący się od oddychania azotanowego (sekcja 5.3. gdyż reakcja katalizowana przez ten enzym jest niezależna od ATP. że nie towarzyszy mu wytwarzanie energii.1.2) np.4. w którym uczestniczy GOGAT. 10. U niektórych sinic wiązanie azotu zachodzi w heterocystach (sekcja 4. azotan jest wtedy najpierw redukowany do amoniaku w procesie redukcji asymilacyjnej (rys.

amoniak w metabolizmie energetycznym.1 Wiązanie azotu Wiązanie azotu atmosferycznego (redukcja azotu — N2 do amoniaku) jest przeprowadzane tylko przez pewien typ bakterii i przez niektórych przedstawicieli Archaea. Redukcja azotu wymaga znacznej ilości energii — około 12-16 cząsteczek ATP na każdą cząsteczkę związanego azotu. a niektóre sinice proces ten przeprowadzają wewnątrz heterocyst (sekcja 4. W jednokomórkowych.Azotany. Wiązanie azotu w ciemności pozwala na uniknięcie tlenu. natomiast jest procesem ciągłym podczas 24-godzinnego naświetlania.1. Nostoc. Dysymilacyjna redukcja azotanów do amoniaku — DRNA (ang. 2. np.2. Tlenowce wiążące azot mają specjalny mechanizm ochraniający własną nitrogenazę. azotyny. dissimilatory reduction of nitrate to ammonia) jest procesem oddechowym przeprowadzanym przez niektóre bakterie (np.1.2. rys.2) i kolejno na nitrogenazę. gatunki Enterobacter i Vibrio) opisane jako występujące w takich siedliskach jak osady morskie. 10.2). dostarczającym energii. 10. Elektrony z takiego źródła jak wodór lub NADPH są przenoszone np. a także z rzędu Rhodospirillales. przez aminację glutaminianu do glutaminy. Nitryfikacja (rys. Znanych jest kilka szlaków tych przemian. w wyższych stężeniach następuje redukcja przede wszystkim do azotynów i odpowiednio w mniejszej ilości do amoniaku [Bonin (1996) FEMSME 19: 27-38].1.12).3. Do tych diazotrofów należą niektóre sinice. Wiele diazotrofów (np. Proces ten ma znaczenie dla upraw rolnych.1. ponieważ powoduje zubożenie gleby pod względem biologicznie użytecznego azotu (sekcja 10. pewne gatunki Bacillus i Clostridium. tlenowych. Wiązanie N2 jest katalizowane przez kompleks enzymatyczny — nitrogenazę. W zależności od gatunku organiczne lub nieorganiczne substraty mogą być używane jako dawcy elektronów w tego typu metabolizmie (test na redukcję azotanów jest opisany w sekcji 16.3. laseczki beztlenowe z rodzaju Clostridium) wiąże azot beztlenowo lub w warunkach małego stężenia tlenu (warunki mikroaerobowe). Nitrogenaza jest bardzo wrażliwa na tlen. Denitryfikacja jest procesem oddechowym (sekcja 5. na ferredoksynę (sekcja 5.2). wiążących azot sinicach z gatunku Cyanothece wiązanie azotu przebiega tylko w okresie ciemności podczas przemiennych 12-godzinnych cykli ciemności i światła. że DRNA zachodzi najaktywniej w małych stężeniach azotanów. w którym azotany lub azotyny są redukowane do form gazowych (głównie N2 i/lub tlenek azotu).1.2). w którym amoniak jest utleniany do azotynów.2) jest procesem zależnym od tlenu. 1.4. Klebsiella pneumoniae (niektóre szczepy) oraz przedstawiciele rodziny Azobacteriaceae i Rhizobiaceae. a azotyny do azotanów przez grupę chemolitotroficznych bakterii (sekcja 5. Azotany lub azotyny mogą być wykorzystywane przez niektóre bakterie jako akceptory elektronów w metabolizmie oddechowym. Anabaena. Sądzi się.2). Amoniak tworzony w procesie wiązania azotu może być asymilowany np. który 253 . 10.

jak koniczyna i lucerna. na gleby i nasiona przeciwdziałając butwieniu.2.1). której powstawanie towarzyszy wiązaniu azotu [Reddy i wsp.powstaje podczas fotosyntezy (sekcja 5. etridiazol. że w toku ewolucji rośliny włączyły organizmy prokariotyczne jako organelle (jak np. 10. Istnieją jednak inne rozwiązania. a również jest z niej tracony w procesach denitryfikacji i nitryfikacji.4). ale zdolność prokariotów do wiązania azotu rozwinęła się później w swobodnie żyjących organizmach. jest dodatkowo przydatny jako środek przeciwgrzybiczny i znajduje zastosowanie np. Jedno z możliwych dostrzega w tym rolę „zawiesiny ziaren".1). mitochondria). a jony azotanowe nie. przeciwdziałając rozwojowi warunków beztlenowych. Azolla (sekcja 10. A więc azotany są znacznie łatwiej wypłukiwane (wyługowane) z gleby przez deszcz czy powódź.3. Na przykład w płodozmian mogą być włączone „rośliny wiążące azot". [Nitrogen fixation by non-heterocystous Cyanobacteria (artykuł przeglądowy): Bergman i wsp. (1993) JB 175: 1284-1292]. Denitryfikacja zazwyczaj zachodzi najintensywniej w warunkach beztlenowych lub słabego dostępu do tlenu (mikroaerobowych). Zatem dzięki znajomości mechanizmów utraty azotu oraz możliwości wykorzystania jego wiązania można często podjąć odpowiednie działania w celu zwiększenia wydajności zbiorów. Nawozy azotowe mogą uzupełnić straty azotu. ale ciągła aktywność nitrogenazy podczas nie przerywanego naświetlania wymaga dodatkowych wyjaśnień. dlaczego na przykład nie w roślinach? Uważa się.2 Rolnictwo i obieg azotu Znajomość udziału bakterii w obiegu azotu może znaleźć zastosowanie w udoskonalaniu upraw rolniczych. Nitryfikacji można zapobiegać poprzez dodanie „inhibitora nitryfikacji" do nawozu. oraz wprowadzone rośliny tworzące „zielony nawóz". To właśnie.1. to jony amonowe adsorbują się łatwo do cząstek gleby (cząstki gliny zazwyczaj niosą ładunek ujemny). że mimo iż zarówno azotany. Szkodliwość denitryfikacji jest oczywista. ale są kosztowne. warunki spotykane np. w obecności azotanów i związków organicznych. Związki takie przede wszystkim hamują utlenianie amoniaku. intrygujące pytanie: dlaczego wiązanie azotu zachodzi tylko w niektórych prokariotach. Jest to praktyka po- 254 . w połączeniu z niedostateczną presją selekcyjną jest uważane za przyczynę wiązania azotu tylko przez prokarioty [Postgate (1992) PTRSLB 338: 409-416].2. Na zakończenie. a jeden z nich.2. Denitryfikację można więc ograniczać przez ulepszenie struktury i drenowanie gleby. Azot z gleby jest pobierany podczas wzrostu roślin i w czasie zbiorów. Diazotrofy występują jako organizmy swobodnie żyjące w glebie i wodzie lub też jako symbioty (sekcja 10. (1997) FEMSMR 19: 139-185]. Wydajność zbiorów płodów rolnych może być ograniczona brakiem w glebie dostępnego azotu. np. w związku z tym mało dostępne w krajach o największym na nie zapotrzebowaniu.4.2. w glebach uprawnych zalanych wodą. Dlatego też w nawozach azotowych lepiej stosować związki amonowe niż azotany. jak i amoniak są rozpuszczalne. ale dlaczego nitryfikacja prowadzi do strat azotu? Odpowiedź leży w tym.

gdzie powstające korzenie boczne penetrują korę pierwotną korzenia. Celem takich działań jest zmniejszenie zapotrzebowania na nawozy azotowe w rolnictwie. gdy roślina wytwarza korzenie boczne. W uprawach ryżu można np. aby np. muszą być zredukowane do siarczków w procesie asymilacyjnej redukcji siarczanów (rys. nieutlenione. Pewne bakterie mogą przyswajać siarczki bezpośrednio ze środowiska. Na tym etapie wzrostu bakterie wnikają w miejscach. stojące stawy) powstaje znaczna ilość siarczków w procesie oddychania siarczanowego. W niektórych siedliskach (np.) w niemotylkowej roślinie Parasponia (krzew subtropikalny) zasugerowało inne możliwości. że niektóre 255 . Próby wyrażenia bakteryjnych genów nif (wiązania azotu) w roślinach jak dotychczas nie powiodły się. szczególnie w zbożach takich jak ryż i pszenica. 10.2).1. Podjęto więc próby stymulacji rozwoju brodawek wiążących azot w niektórych niemotylkowych roślinach. Proces ten różni się od oddychania siarczanowego (sekcja 5.1.3.ferroxidans (patrz Aneks).1. 10.4.2) i kofaktorów takich jak koenzym A.3.3).wszechna w Azji Południowo-Wschodniej. 10. Siarczek może być z kolei wykorzystany jako dawca elektronów (utleniany jest do siarczynu i siarczanu) przez beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące (sekcja 5. „Inwazja" niektórych roślin motylkowych (tropikalnych) przez bakterie wiążące azot zachodzi wówczas. Przeprowadzano doświadczenia mające na celu stwierdzenie. wykorzystując metody manipulacji genetycznej. Rośliny zielone i wiele bakterii może przyswajać siarkę w postaci siarczanów dostępnych powszechnie w wystarczających ilościach w warunkach naturalnych. Azorhizobium caulinodans wprowadzono do ksylemu i merystemu korzeniowego (tj.1. Zanim siarczany zostaną wbudowane. Ten sposób inwazji bakterii jest nazywany „wejściem przez pęknięcie".2. (1997) PRS 264: 341-346]. W następstwie korzenie boczne przekształcają się w brodawki wiążące azot.3) podobnie jak asymilacyjna redukcja azotanów różni się od oddychania azotanowego (sekcja 10.3 Obieg siarki Siarka jest składnikiem np. aminokwasów — cysteiny i metioniny oraz ferredoksyn (sekcja 5. czy pszenicę można „zainfekować" bakteriami z gatunku Azorhizobium caulinodans wiążącymi azot.1.2. Tworzenie brodawek przez rośliny niemotylkowe. Najlepszym rozwiązaniem byłoby stworzenie. nie mających naturalnych brodawek. Wykazano. rys. uzyskując znaczący wzrost suchej masy i zawartości azotu w porównaniu z kontrolnymi roślinami nie zaszczepionymi [Sabry i wsp.2. obniżyć koszty produkcji zboża i wspomóc ograniczanie stosowania (nieprzyjaznych środowisku) tych nawozów (azotany). które tworzą brodawki na tropikalnej roślinie motylkowej Sesbania rostrata. zwiększyć plony stymulując do wzrostu swobodnie żyjące.2). wiążące azot sinice. roślin zdolnych do wiązania azotu bez pomocy prokariotów. ale znalezienie brodawek zawierających Rhizobium wiążące azot (sekcja 10. do wnętrza rośliny — endofitycznie). Siarka elementarna może być zużywana np. przez archeona Sulfolobus oraz przez Thiobacillus thiooxidans i T.

Thiobacillus spp. 256 . a następnie do tetrationianu. siarczki (S2~) i/lub siarkę elementarna.Wiele gatunków może zużywać siarczany (SO42-) jako źródło siarki (koniecznej np. za pomocą której przylegają do cząsteczek siarki w osadzie ściekowym. które zużywają siarczany (lub np. gatunki Thiobacillus tworzą włóknistą warstwę. Stałe uzupełnianie jonów żelazowych zachodzi dzięki. przez „bakterie redukujące siarczany" — organizmy. że jony żelazowe utleniają siarkę w pirycie początkowo do tiosiarczanu. Wydaje się.2). np. pokazane to jest na rysunku jako asymilacyjna redukcja siarczanów. który zużywa siarczki jako dawcę elektronów w beztlenowym fototroficznym metabolizmie (sekcja 5. aby utworzyć cysteinę. w którym utleniają np.1. a tiosiarczan jest odtwarzany w cyklicznej reakcji poprzez tritionian.1. siarczyny) jako ostateczne akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym (sekcja5. W procesie tym siarczan jest redukowany wewnątrzkomórkowo do siarczku. co jest związane ze szkodliwym dla środowiska tworzeniem kwaśnych wód kopalnianych. u Escherichia coli siarczek jest wbudowywany do O-acetyloseryny. że warstwa taka pełni w naturalnym środowisku ważną funkcję w kolonizacji i utlenianiu siarki [Blais i wsp. Oddychanie siarczanowe (=dysymilacyjna redukcja siarczanów) jest przeprowadzane np. (1994) PB 29: 475-482].1. W procesie tym powstają jony żelazowe (Fe III) jako skutek bakteryjnego utleniania jonów żelazawych (Fe II) w pirycie. Desulfuromonas zużywa siarkę elementarną jako ostateczny akceptor elektronów w oddychaniu beztlenowym. do syntezy niektórych aminokwasów). który jest wbudowywany na różnej drodze przez różne organizmy.2). Tiosiarczan i politioniany są ważnymi pośrednikami w bakteryjnym utlenianiu pirytu (siarczki metali). zazwyczaj przeprowadzają oddychanie tlenowe. Sugeruje się.2. Rhodopseudomonas sulfidophila jest jednym z gatunków.

a więc mają małą wartość naukową. 257 . w jego naturalnym środowisku. ponieważ bez tego plan doświadczenia mógłby być błędny. Do bakterii takich należą gatunki Erwinia. działając jak zawiązek. podlegają oczywistym zakłóceniom natury (czasem ekstremalnym). ice-nucleation) są często spotykane na powierzchni roślin i mogą wywołać uszkodzenia różnych płodów rolnych w czasie mrozu. W temperaturach poniżej (około) -5°C występowanie uszkodzeń może być ograniczone przez redukcję liczebności populacji bakterii „lodotwórczych" na roślinie działaniem na jej powierzchnię np. Taka przemiana materii organicznej na nieorganiczną jest nazywana mineralizacją. a tylko w obecności bakterii „lodotwórczych" są w tych warunkach uszkadzane. badania organizmu powinny być prowadzone in situ. że w krążeniu materii złożone związki organiczne są rozkładane do prostych związków nieorganicznych. tj. amoniak i azotany. 10.1.5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? W idealnej sytuacji. Każde znaczące badanie in situ wymaga zaznajomienia się z danym środowiskiem.3. które najwierniej odtwarzają ich naturalne siedlisko. 10. badania struktur wewnątrzkomórkowych wymagają pracy in vitro (w laboratorium). ale w tych przypadkach.1-10. Niektóre tkanki roślinne mogą przeżyć bez uszkodzeń oziębienie do kilku stopni poniżej 0°C. 10. antybiotykami jak streptomycyna czy oksytetracyklina. polegająca na działaniu odpowiednimi „nie-lodotwórczymi" bakteriami może również być skuteczna.towarzyszącemu tym procesom.4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody („lodotwórcze") W temperaturach nieco poniżej 0°C niektóre bakterie wspomagają przemianę wody w lód. gdy tylko jest to możliwe — „zachowanie" komórek najlepiej obserwować w warunkach. Biologia traktuje przede wszystkim o rzeczywistym żywym świecie. siarczan. [Sulphur chemistry of bacterial leaching of pyrite: Schippers. Kontrola biologiczna (sekcja 13. siarczek. np. Stosując łącznie kontrolę biologiczną i działanie antybiotykami w celu ograniczenia uszkodzeń wywołanych mrozem w gruszy otrzymano efekt będący sumą tych dwóch metod [Lindow i wsp.4 Mineralizacja Rysunki 10. wokół którego tworzą się kryształy lodu. Niektóre bakterie o zdolnościach „lodotwórczych" (ang. (1996) Phytopatology 86: 841-848]. Jozsa i Sand (1996) AEM 62: 3424-3431]. Niektóre dziedziny.3 pokazują. Pseudomonas i Xanthomonas. Niestety wiele z badań.2). jak: dwutlenek węgla. które uważa się za „in situ". metabolizmowi tlenowemu bakterii litotroficznych takich jak Thiobacillus ferrooxidans.

zawiesinę bakterii zamyka się w „komorach z filtrem membranowym". (1984) Oikos 42: 10-22] wykazały.4. Po zanurzeniu w rzece lub w kanale przez 24 godziny. Fry i Day (1987) JGM 133: 3099-3107]. Gdy taką komorę zanurzy się w wodzie w rzece.). wykonano badania pod kątem występowania transkoniugantów. ponieważ komora jest w nim po prostu zanurzona. że rzeczywisty epiliton składa się z komórek osadzonych we włóknistej.2) in situ — w rzece i w kanale Welsh. że zatrzymują badane organizmy. próbę traktuje się za umieszczoną w środowisku. szerokie plastikowe rurki zamknięte na obu końcach filtrem membranowym (wielkość porów 0. która może wykluczać makrocząsteczki? Ponadto. włóknista warstwa! Właściwa symulacja wymagałaby (oprócz warstwy podłoża) populacji komórek podobnej do autentycznej w epilitonie — o rzeczywistej proporcji dawców 258 . w rzekach. Są to.10. w górnej części)? Naśladowany epiliton nie może odpowiedzieć na żadne z tych kłopotliwych pytań. Jednak próba w takiej komorze ma ograniczony kontakt ze środowiskiem: otrzymuje ogólnie mniej światła i jest odgrodzona od zaburzeń naturalnych (zatem od zmian temperatury itp. ponieważ nie posiada istotnej cechy naturalnego epilitonu. można uważać. czy wobec obecności tej warstwy komórki biorcy i dawcy mogą osiągnąć bezpośredni kontakt ścian komórkowych (typu pokazanego na fot. że „możliwe jest przekazywanie plazmidów między bakteriami w epilitonie rzecznym" [Bale. które rosną na powierzchni podwodnych kamieni. 8. jest z konieczności krańcowo mała.2 Koniugacja in situ W podjętych próbach wykonania koniugacji (sekcja 8. przytrzymano filtrem z włókna szklanego i przytwierdzono razem do kamienia gumową opaską. w zasadzie.22-0. przez filtry z porami na tyle małymi. Filtr z osadzoną warstwą bakterii umieszczono tą warstwą do spodu. na płaskim kamieniu. że bakterie wewnątrz komory są zasadniczo w „naturalnych" warunkach.). zawiesiny dawców i biorców mieszano. warstwę bakterii na filtrze należało traktować jako epiliton: zespół osiadłych osobników.45 μm. wielocukrowej warstwie.1 Komory z filtrem membranowym W celu badania przeżywania bakterii np.5. A więc. Oczywiście. a następnie przesączano przez filtr membranowy. aby wyciągnąć taki wniosek. tj. Szybkość dyfuzji. czyż w autentycznym epilitonie miejsca receptorowe biorcy dla pilusów nie są ukryte w warstwie podłoża? Czy pilus może w ogóle dosięgnąć biorcy przez warstwę podłoża. Zdjęcia z mikroskopu elektronowego uwidoczniają komórki i mikrokolonie umiejscowione w podłożu i oddzielone od siebie przez substancję takiego podłoża. jaką jest wielocukrowa. Ponadto wnikanie lub wydostanie się cząsteczek (w tym zbędnych produktów z próby) na zasadzie dyfuzji zachodzi tu tylko przez bardzo małe pory w filtrze. Wykazanie obecności transkoniugantów pozwoliło na wyciągnięcie wniosku. Do jakiego stopnia „symulowany epiliton" przypomina epiliton naturalny? A więc również. w jakim stopniu wniosek z doświadczenia jest uzasadniony? Wcześniejsze badania innych autorów [Lock i wsp. 10.1.5.

Wydaje się możliwe. Takie doświadczenia mogą być zabawne. Badania Korner i Arnone [Science (1992) 257: 1672-1675] ukazały jednak mniej optymistyczny obraz. W interpretacji tych wyników wskazywano. ale nie wnoszą niczego do nauki. W szczególności rośliny uprawne wykazują poprawę wzrostu i wyższą wydajność. Z danych tych autorów wynika. Autorzy ci obserwowali wpływ zwiększonej ilości CO 2 na eksperymentalny ekosystem tropikalny i stwierdzili. Jednakże w opisanym eksperymencie na każdy centymetr kwadratowy filtra zostało nałożone 107 komórek dawcy dobrze wymieszanych z 108 komórek biorcy (o znanej zgodności). zwiększonym wiązaniem CO2)? W zbadanych roślinach do typowej reakcji na wzrost ilości CO 2 należy np. Eksperyment ten chociaż pozornie dotyczył „naturalnego siedliska". że niektóre głęboko tworzące się trawy pastwisk przeniesione do sawanny Ameryki Południowej gromadzą znaczne ilości węgla w swoim wyjątkowo masywnym systemie korzeniowym.1. a w konsekwencji do ocieplania naszej planety (efekt cieplarniany). że ona istnieje. ale jednocześnie równie dużo CO2 jest zużywane przez autotrofy fotosyntetyzujące (np. że w doświadczeniu tym kontakt dawcy z biorcą był zapoczątkowany podczas mieszania i filtrowania.6 Efekt cieplarniany W naturalnym obiegu węgla (sekcja 10. populacja na filtrze składała się wyłącznie z dawców i biorców i z niewytłumaczalnych przyczyn taką sytuację traktowano jako naśladującą naturę. rośliny zielone i sinice). tj.).1) znaczną ilość CO 2 tworzą zwierzęta. Nieco optymistyczne wydaje się. Czy wzrastający poziom CO 2 może być równoważony intensywnością fotosyntezy w roślinach (tj.3. Ogólnie. nawet przed umiejscowieniem filtra „in situ" w badanej lokalizacji w rzece lub kanale. prowadzące do wzrostu poziomu CO2. W naturze nie ma takiej sytuacji i niesłuszne jest udawanie. że znaczący przyrost korzeni był związany głównie ze stymulacją metabolizmu mikroorganizmów (w tym bakterii) w ryzosferze (środowisku gleby przylegającej do korzeni). wyższy stosunek węgla do azotu). przez zużywanie olbrzymich ilości paliw (nafta. Ponadto. Oczywiście. ta ważna równowaga między produkcją biologiczną i zużyciem CO2 jest dezorganizowana np. ale może prowadzić do szybszego obiegu węgla (cyklicznej wymiany) pomiędzy atmosferą i ekosystemami lądowymi [Plants and increasing levels of CO2: Murray (1997) Carbon dioxide and plant responses. 10. zwiększony przyrost korzeni i zmniejszenie ilości azotu w tkankach (tj. że wartości te przekraczały ponad 100-krotnie całkowitą liczbę żywych bakterii w autentycznym epilitonie. 259 . 10. w żaden sposób nie odpowiadał rzeczywistemu środowisku i był niczym więcej niż laboratoryjnym eksperymentem koniugacji przeprowadzanym poza laboratorium. że podwyższony poziom CO2 niekoniecznie musi powodować zwiększone odkładanie węgla. wszystkie lasy kuli ziemskiej są głównym naturalnym „zlewem" dla CO2. rys. Niestety postępująca wycinka lasów ciągle redukuje efektywność tego zbiornika. rośliny i mikroorganizmy podczas oddychania lub fermentacji. gaz itp.i biorców. ISBN 0863 80213 3].

Jednym z rozwiązań tego zagadnienia jest biologiczna kontrola: zaaranżowany mechanizm genetycznej „samodestrukcji". (1995) Biotechnology 13: 35-37]. Istnieje więc możliwość efektu pozytywnego sprzężenia. Dawniej wobec niepowodzeń w wyhodowaniu i izolacji nowego organizmu (np. Takie mechanizmy nie są w 100% skuteczne. jak mogą się zachować te organizmy lub jak mogą przekazać swoje geny w naturalnym środowisku. do kontroli biologicznej (sekcja 13.2) — wywołuje niepokój wynikający z niewystarczającej wiedzy o tym. że eliminacja większości komórek rekombinantów jest celem wartym zachodu [„Suicide microbes" (artykuł przeglądowy): Ramos i wsp. Wydaje się jednak. Inny cieplarniany gaz — metan (sekcja 5. Wiele gatunków pozostaje nieznanych przypuszczalnie po prostu dlatego. Startery komplemen- 260 . proporcjonalnej) zależności między wzrostem populacji ludzkiej i problemami środowiskowymi jest zbyt optymistyczne. komentując dane z antarktycznych i grenlandzkich rdzeni lodowych. że gen 16S rRNA zawiera. które istnieją pomiędzy różnymi formami degradacji środowiska. Obecnie metody biologii molekularnej umożliwiają nam zarówno wykrycie.4). widzianego pod mikroskopem) możliwa była tylko ograniczona jego charakterystyka. Podczas denitryfikacji (sekcja 5. Ponadto autor ten wskazuje na wiele współdziałań (synergii).7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku Zastosowanie bakterii otrzymanych metodami inżynierii genetycznej — np. iż globalne ocieplenie samo może powodować zwiększony poziom gazów cieplarnianych. że założenie o prostej. kiedy funkcje zrekombinowanego organizmu zostają spełnione. Przeczytanie artykułu Harta jest godne polecenia szczególnie tym.1.8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne Prawdopodobnie tylko nieznaczna część z istniejących gatunków bakterii została wyhodowana i wyizolowana w laboratorium. 10. Harte [(1996) BC 5:1069-1083].2. liniowej (tj.2) jest utleniany przez metylotrofy (sekcja 6. mutacji w zabijającym je genie. którzy uważają.2) tworzą się też gazy cieplarniane.Mogłyby one być pomocne w równoważeniu niektórych niebiologicznych emisji CO2 [Fisher i wsp.1. niektóre komórki rekombinantów przeżywają dzięki np. wskazał. (1994) Nature 371: 231-238]. w izolacji od środowiska jako całości. obok zmiennych obszarów różniących się u poszczególnych rodzajów i gatunków. ale pozostająca jego część przyczynia się do efektu cieplarnianego. że nie stworzono im właściwych warunków do wzrostu in vitro. 10. że szkody środowiskowe mogą być rozpatrywane kawałek po kawałku. tj. kilka „wysoce konserwatywnych" sekwencji nukleotydów — występujących powszechnie u przedstawicieli domeny Bacteria. co nie jest odzwierciedlane w tworzonych modelach przyszłych zmian klimatycznych. a również. działający automatycznie. jak i charakterystykę organizmu nie wyhodowanego — a nawet nie widzianego! Jedna z możliwości opiera się na tym.1.1.

Powielone geny mogą więc wskazać na obecność organizmu pokrewnego filogenetycznie do znanego gatunku lub grupy.) Stan VNC jest traktowany przez niektórych autorów jako normalna odpowiedź na stres bakterii nie tworzących form spoczynkowych. to niektórzy uważają. że gen 16S rRNA różnych organizmów może być powielany z różną wydajnością — taka wybiórczość powielania w PCR jest najwyraźniej zależna od oddziaływania DNA przyległego do powielanego odcinka [Hansen i wsp. W ten sposób mogą być badane również próby zawierające niejednorodną populację bakterii. lecz mogących przetrwać w „uśpieniu" [McDougald i wsp. Tak więc. komórki głodzone mogą doznać uszczerbku lub nawet zostać zabite na skutek wywołanego przez siebie tlenowego uszkodzenia [Bloomfield i wsp. dysmutaza ponadtlenkowa).. ale niehodowalne (VBNC. (1998) FEMSME 25: 1-9]. głodzenie) przestają rosnąć w podłożach laboratoryjnych. (1998) Microbiology 144: 1-3]. Chociaż takie „uśpione" komórki mogą egzystować. powielone różne 16S rRNA geny) i w celu określenia ich sekwencji oraz dalszej analizy konieczne jest klonowanie każdego z nich. Sekwencję produktów PCR można oznaczyć (sekcja 8. O2~). po stresie (np. W takich przypadkach w PCR tworzone są mieszane produkty (tj. W analizie zróżnicowanego zespołu organizmów.4) do powielenia każdego możliwego bakteryjnego genu 16S rRNA (np. komórki głodzone przeniesione do podłoża bogatego w składniki odżywcze i w warunkach natlenienia mogą tworzyć toksyczne/śmiercionośne wewnątrzkomórkowe rodniki (np. viable but non-cultivable). przynajmniej w niektórych przypadkach. (Niektóre patogeny. problemem jest to. w próbach klinicznych lub ze środowiska). Komórki takie nazwano: żyjące.5. że niepowodzenia w ich wyhodowaniu mogą być spowodowane. VNC. aktywność metaboliczną i utrzymującą się strukturę. dające się rutynowo hodować. . włącznie z Vibrio cholerae [Colwell (1996) Science 274: 2025-2031].1 „Żyjące. 10. z zastosowaniem PCR. anion ponadtlenkowy. (1998) FEMSME 26: 141-149].tarne do konserwatywnych sekwencji (startery o szerokim zakresie) mogą być użyte w PCR (sekcja 8.6) i porównać sekwencje zmiennych obszarów z bazą danych tysięcy znanych gatunków ze wszystkich głównych grup bakterii.5. Na przykład.8. ale to nie zachodzi w komórkach głodzonych (niezaadoptowanych). nieodpowiednimi podłożami/warunkami. ang. ale niehodowalne" bakterie Niektóre bakterie. Takie rodniki (powszechne produkty uboczne w tlenowym metabolizmie) są zazwyczaj unieszkodliwiane przez specjalne enzymy (np. ale wciąż wykazują cechy żywych komórek — tj. nie tracą zjadliwości.

mogą czasem. powodowany jest jedynie przez pewne szczepy Bacillus anthracis. O współzależności między tymi czynnikami świadczy to. Tego typu organizmy zwane są patogenami oportunistycznymi. Choroba nie zawsze musi być wynikiem zetknięcia się z danym „czynnikiem sprawczym". przykładem jest zgorzel gazowa. przykłady chorób powodowanych przez te ostatnie opisano w skrócie na końcu tego rozdziału.1 Bakterie jako patogeny Źródłem niektórych chorób są „błędy" w chemii organizmu. często występujące w jelicie. którą wywołuje jeden lub więcej różnych gatunków Clostridium. W istocie. W innych wypadkach przyczyną choroby może być jeden z wielu czynników. W niektórych chorobach związek między objawami a patogenem jest wysoce swoisty: daną chorobę może wywołać tylko odpowiedni gatunek lub nawet określony szczep należący do tego gatunku. na przykład. pewne są wywoływane przez grzyby.ROZDZIAŁ 11 Bakterie w medycynie 11. wystąpienie (lub nie wystąpienie) choroby zależy od różnych czynników — w tym odporności gospodarza oraz wirulencji (zdolności do wywoływania choroby) patogena. zwany jest patogenem. szczepy te zawierają plazmidy (sekcja 7. jeszcze inne przez pierwotniaki. powodować zapalenie otrzewnej. Na przykład. Wąglik. po przypadkowym urazie lub ingerencji chirurgicznej obejmującej dolną część przewodu pokarmowego. każdy drobnoustrój. a niektóre przez bakterie. inne przez wirusy. lecz w wielu przypadkach objawy chorobowe wynikają z działalności pewnych drobnoustrojów lub produktów przez nie wytwarzanych na powierzchni lub wewnątrz organizmu.). które kodują toksynę (cyklaza adenylanowa) oraz otoczkę chroniącą patogena.1).1. niektóre gatunki Bacteroides. Czasami choroba powodowana jest przez organizm zwykle nie zachowujący się jak patogen i który może nawet należeć do własnej mikroflory organizmu (tab. 262 . że organizmy będące słabymi patogenami (lub będące niepatogenne) mogą wywoływać ciężkie choroby u osób ze zmniejszoną odpornością. który (w sprzyjających warunkach) może powodować chorobę. Wśród wielu chorób wywołanych przez drobnoustroje. 11.

ukąszenia owadów itp. Błony śluzowe występujące w przewodzie pokarmowym. Choroba nabyta w szpitalu nosi nazwę infekcji szpitalnej [infekcje szpitalne (różnorodne aspekty): Emmerson i Ayliffe (red. układzie oddechowym i układzie moczowo-płciowym zwykle są bardziej wrażliwe niż skóra i to 263 . Powstałe rany mogą dopuszczać wiele różnych potencjalnych patogenów zdolnych do wywoływania chorób układowych (to jest chorób obejmujących całe ciało) lub schorzeń miejscowych. czynnik czynnik powodujący dżumę dymieniczą. mogą same w sobie być źródłem zakażeń. in.2 Drogi infekcji Skóra stanowi zwykle skuteczną barierę dla patogenów. przez skaleczenie.) BCID (1966) 3: 159-306]. Do bakteryjnych patogenów wnikających na drodze ukąszeń należy m. lecz może ona zostać uszkodzona np. w których występuje zagęszczenie chorych. zabiegi chirurgiczne.Szpitale. 11.

które wiążą się do błon śluzowych jelita. których rola polega na wiązaniu komórek gospodarza do takich 264 . coli.5. Na przykład. Adhezja przebiegająca przy współudziale fimbrii jest istotna na przykład w wirulencji enterotoksygennych szczepów E. na przykład. coli (ETEC. Do ssaczych receptorów dla adhezyn należą różnego typu cząsteczki powierzchniowe. ang. Gorman i Patrick (1966) RMM 7: 195-205] oraz cementu do kości impregnowanego antybiotykiem [Winniger i Fass (1966) AAC 40: 2675-2679]. fimbrie E. HMW2) „nietypowalnych" szczepów Haemophilus influenzae.1 Adhezja jako czynnik w infekcji W wielu chorobach występuje wczesna faza. podczas gdy fimbrie Ρ szczepów E. 11. co pozwala mu na uniknięcie przeciwbakteryjnej aktywności układu immunologicznego.2). filamentous haemagglutinin) Bordełella pertussis i białka adhezyjne o dużej masie cząsteczkowej (HMW1.2) wiążą się do reszt mannozy. [Wytwarzanie fimbrii przez patogeny jelitowe (artykuł przeglądowy): Edwards i Puente (1998) TIM 6: 282-287]. tab. Adhezja może też pozwolić patogenowi skuteczniej współzawodniczyć z naturalną mikroflorą gospodarza. są nieustannie omywane przez własne wydzieliny i mogą podlegać takim ruchom jak perystaltyka. coli typu 1 (tab.w tych miejscach często ma początek infekcja. Actinobacillus i Pasteurella (artykuł przeglądowy): Jacques i Paradis (1998) FEMSMR 22: 45-59. [Adhezyny Haemophilus.2. Tego typu adhezja ma również znaczenie na przykład w nawiązaniu pierwszego kontaktu między Haemophilus influenzae typ b a nabłonkiem układu oddechowego. kiedy zastanowimy się na przykład nad tym. coli powodujących schorzenia układu moczowego wiążą się do α-D-galaktopiranozylo-(l-4)-β-D-galaktopiranozydowych receptorów glikolipidów na nabłonku wyściełającym przewody moczowe. ang. Adhezyny często są fimbriami (sekcja 2. nie wytwarza fimbrii. to jest błony śluzowe. Możliwość zakażenia w czasie zabiegów chirurgicznych zwykle jest na ogół ograniczana dzięki przestrzeganiu skutecznie technik sterylnych. W krwiobiegu patogen ten. Adhezja zazwyczaj następuje za pośrednictwem swoistych struktur lub cząsteczek na powierzchni patogena — tak zwanych adhezyn (sekcja 11..13). podczas gdy w cholerze i durze brzusznym — od błony śluzowej wyściełającej przewód pokarmowy. nitkowata hemaglutynina (FHA. Konieczność adhezji staje się jasna. Integryny to rodzina ssaczych glikoprotein na powierzchni komórek.2. Dalsze kroki zapobiegawcze na przykład w ortopedii wiążą się z użyciem implantów z polimerów zawierających antybiotyki [Tunney. w której zachodzi adhezja patogena do określonych miejsc w organizmie gospodarza.6). które to czynniki utrudniają ustabilizowanie się patogena. 11. Niektóre patogeny wiążą się do specyficznych integryn.14.2). enterotoxigenic strains of E.] Do adhezyn nie będących fimbriami należą między innymi białka Μ paciorkowców (sekcja 2. 2. lecz wiązanie jest zwykle swoiste.2. w zapaleniu płuc i krztuścu (koklusz) infekcja zaczyna się właśnie na powierzchniach oddechowych. najprawdopodobniej w wyniku przypadkowej i odwracalnej zmiany genetycznej. że miejsca często będące początkiem infekcji.

(Zwróć uwagę. (Ciekawe natomiast jest to. Wówczas EPEC wiąże się za pośrednictwem białka zwanego intyminą do ufosforylowanej formy białka Hp90 gospodarza. 265 . Nie uważa się. 2. Nowszy pogląd [patrz Kaper (1968) TIM 6:169-172] wprowadza duże zmiany do tego rozumowania. gdy EPEC (ang. które zwiększają aktywność integryny drugiego rodzaju — wiążącej się do innego miejsca na FHA. Borrelia burgdorferi i Yersinia enterocolitica. integryny np. BFP. W przypadku Listeria monocytogenes adhezyna zwana internaliną wiąże się do E-kadheryny. 11. pertussis do integryny na monocycie inicjuje wewnątrz niego sygnały. Adhezyna intyminą może posiadać co najmniej dwa receptory. pertussis wykorzystuje wewnętrzny system sygnalny gospodarza do indukowania dodatkowych miejsc wiązania. że wstępne wiązanie EHEC (tab. które. Do patogenów wiążących się do swoistych integryn nabłonka należą Bordetella pertussis. coli) (tab. a nie na apikalnych. które zawierają EspA [Ebel i wsp. W ten sposób B. Zakłócenie przekazywania sygnałów wewnątrz komórki gospodarza prowadzi do utraty mikrokosmków.składników matriks. enteropathogenic E. (1998) MM 30: 147-161]. na przykład.2) (zwanymi również fimbriami tworzącymi wiązki. 11. zmiany układu aktyny poniżej miejsca związania powodują powstanie piedestału wnikającego do światła komórki. Z kolei. gdzie pełni rolę receptora. należącej do innej rodziny glikoprotein występujących na powierzchni komórek (kadheryn). białka te wpływają na przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki gospodarza i mogą być wstrzykiwane bezpośrednio poprzez system sekrecji typu III (sekcja 5. Następnie EPEC. jak kolagen i fibronektyna. za białko to. Na przykład. wydzielają kilka białek (tak zwana „sekrecja wywołana kontaktem"). z którym związana jest komórka bakteryjna (fot. związane z powierzchnią komórki. zwykle odgrywają rolę w adhezji do komórek gospodarza. na komórkach nabłonkowych i śródbłonkowych.4) kodowany głównie przez wyspę patogenności LEE (sekcja 11. wiązanie adhezyny FHA B. prowadząc do tworzenia mikrokolonii na błonie komórkowej gospodarza. fosforylacji białka Hp90 błony komórkowej gospodarza oraz zmiany układu białek cytoszkieletu. ang. zwane Tir (translokowany receptor intyminy). bundle-forming pili).1). a następnie integruje z błoną komórkową gospodarza.2) do komórek (ssaczych) HeLa wydaje się przebiegać za pośrednictwem bakteryjnych powierzchniowych wyrostków. Jednym z nich jest bakteryjne białko. Kaper i Finlay (1997) TIM 5: 109-114] przebiegało to następująco.7). 11. Adhezja może być bardziej złożona niż proste wiązanie między gospodarzem a patogenem. Złożone procesy mają miejsce. BFP mogą pośredniczyć w wiązaniu EPEC-EPEC (międzybakteryjnym). które zostaje wprowadzone do komórki gospodarza (za pośrednictwem systemu typu III). żeby rolę w nawiązaniu wczesnego kontaktu między EPEC a komórką gospodarza miały BFP (nie wykazano ich wiązania in vitro do tkanki z jelita cienkiego). że zgodnie ze swoją rolą w wiązaniu.5. między innymi EspA i EspB. pierwotnie uważano białko Hp90 gospodarza. w niej ulega fosforylacji. integryny występują.2) wiąże się do komórek nabłonkowych jelita. to jest skierowanych do światła jelita). Według wcześniejszego poglądu [Donnenberg. Wstępnie wiązanie zachodzi za pośrednictwem fimbrii typu 4 (tab. podobnie jak integryny. komórek nabłonkowych jelita występują na powierzchniach bazolateralnych.

266 .

środek). tworzy zewnątrzkomórkowe. to jest są związane z zewnętrzną powierzchnią komórek gospodarza. Należą tutaj O55. Mycobacterium tuberculosis. doprowadzając do zniszczenia dentyny. inne wnikają do jednego lub różnych rodzajów jego komórek (sekcja 11. Jest to błonka składająca się głównie z bakterii. 11. O114 i O128.1). coli. 267 . jak cytochalazyny. do tego typu patogenów należą gatunki Brucella i Chlamydia. ang. co umożliwia penetrację bakterii. „inwazja" jest procesem. produktów działalności bakteryjnej oraz substancji zawartych w ślinie. 2. coli (EIEC).2. (1990) MEHD 3: 51-57] (fot.Enteroinwazyjne szczepy Ε. Czasem zwane są też STEC dla określenia szczepów E. 11. ang. niektóre patogeny wnikają do komórek gospodarza. nierozpuszczalne w wodzie glukany. O8. O143 i O152. Salmonella typhi. Należą tu O6. Do tych szczepów należą O26 i O157:H7. W przciwieństwie do tego. [Detection and control of E. 6 Enteropatogenne szczepy E. zbędne produkty bakteryjnego metabolizmu (np. (1994) ΉΕ5 5: 179-185. coli wytwarzających toksyny Shiga-podobne. czas trwania wydalania O157:H7 z odchodami przez dzieci: Swerdlow i Griffin (1997) Lancet 349: 745-746|.2. 7 Enteroagregujące szczepy E. (patrz również sekcja 14.1. które hamują reorganizację cząsteczek aktyny w komórkach ssaczych. EHEC. Adhezja wydaje się również istotna w powstawaniu próchnicy zębów wypełnionych plombami. rzeżączce (Neisseria gonorrhoeae) i krztuścu (Bordetella pertussis). O63.1 Adhezja w próchnicy zębów Do próchnicy zębów przyczyniają się bakterie. Streptococcus mutans. O115 i O148.2.2). często występujący w płytce nazębnej. które pomagają w adhezji bakterii. coli. w którym bakterie indukują pobieranie (internalizację) swoich komórek przez gospodarza. wówczas patogen ulega adhezji do komórek będących celem jego działania — na przykład w cholerze (Vibrio cholerne). 5 Enterotoksygenne szczepy E. 3 4 Po adhezji.2 Bakteryjna inwazja komórek ssaczych W niektórych chorobach patogen zwykle pozostaje na powierzchni komórek gospodarza. z tego powodu pobieranie bakterii jest zwykle hamowane in vitro przez takie czynniki. coli O157:H7 in foods: Meng i wsp. jednak pobieranie zwykle wymaga czynnego udziału komórki gospodarza. z tego miejsca bakterie mogą penetrować kanaliki zębinowe. Często występującymi szczepami są O124. bakteryjna kolonizacja występuje w małej szczelinie między wypełnieniem a ścianą ubytku [Buchmann i wsp.1). coli (VTEC. kwas mlekowy) powodują miejscową demineralizację zębów. coli.1. coli. Zwykle wiąże się to ze zmianą organizacji mikrofilamentów aktyny w cytoplazmie poniżej miejsca przyłączenia bakterii.2. Legionella pneumophila. Inwazję poprzedza adhezja do komórek gospodarza (sekcja 11. verotoxic Ε. Listeria monocytogenes. Olll (lecz patrz EaggEC w tej tabeli). Werocytotoksyczne szczepy E. Shigella flexneri i Yersinia enterocolitica. tworząc płytkę nazębną. coli) noszą swoją nazwę od toksyczności dla komórek Vero {komórki nerkowe z afrykańskiego makaka). enterohaemorrhagic E. które na drodze adhezji przylegają do powierzchni zębów i brzegów dziąseł. coli. Sama inwazja zależy od patogena i rodzaju komórki gospodarza.6. enteroinwazyjna E. niektóre patogeny (w tym EPEC) pozostają na zewnątrz komórki.

Fot.2. S. USA. University of Maryland School of Medicine.1) Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. Donnenberga. Baltimore. M.1 Adhezja: dwie elektronogęste komórki EPEC (enteropatogenna Escherichia coli) ulegające adhezji za pośrednictwem piedestału do błony komórkowej komórki gospodarza (sekcja 11. 268 . 11.

(„Ogon" pozostaje w cytoplazmie gospodarza. Przed pochłonięciem. Wewnątrz komórek Μ bakterie mogą mieć dostęp do bazolateralnych powierzchni sąsiednich komórek nabłonka. GTPaza gospodarza. Następnie Shigella powoduje lizę błon i wnika do sąsiedniej 269 . kodowanego przez geny mxi-spa zlokalizowane na plazmidzie. transportuje bakteryjne białko(a) efektorowe. Wewnątrz wakuoli Salmonella może się namnażać.) Poruszająca się bakteria wpycha się do sąsiedniej komórki tworząc kieszeń. rozprzestrzeniać się wewnątrz warstwy nabłonka (istotna cecha czerwonki = dyzenterii). które indukują fałdowanie błony komórkowej gospodarza oraz pochłanianie komórki bakteryjnej. że Shigella jest pochłaniana przez fagocytarne komórki „M" w kępkach Peyera [komórki Μ w infekcji (artykuł przeglądowy): Jepson i Clark (1998) TIM 6: 359-365]. zamykającej w sobie również płyn zewnątrzkomórkowy.1 Inwazja nabłonka jelitowego Mechanizmy inwazji Inwazja salmonelli następuje poprzez apikalne (to jest zwrócone do światła) powierzchnie komórek nabłonka. Pobieranie komórki bakteryjnej jest poprzedzone sfałdowaniem błony komórkowej gospodarza. pchają one bakterię przez cytoplazmę w kierunku odwrotnym do rosnącego „ogona" z aktyny. o nazwie CDC42. ten system sekrecji być może również uczestniczy w translokacji białka(ek) efektorowych odpowiedzialnych za stany zapalne i sekrecję płynów [Galyov i wsp. Badania na zwierzętach wykazały. Inwazja wymaga uczestnictwa systemu sekrecji typu III (sekcja 5.3. Rolę w regulacji rozmieszczenia aktyny w komórce gospodarza i pochłanianiu salmonelli ma. Adhezyny są nieznane. oraz GTPazy Rho gospodarza (dla Salmonella — GTPaza CDC42). Shigella ucieka z fagosomu (do cytoplazmy gospodarza) po dokonaniu lizy błony.7). Shigella. albo otaczając się wakuolą (z podwójną błoną). adhezji bakterii towarzyszy podwyższone stężenie jonów 2+ Ca w komórce gospodarza. System sekrecji typu III u Salmonella (sekcja 5.3. podobnie jak Salmonella (p.4). IcsA indukuje polimeryzację włókien aktyny na jednym z biegunów bakterii. ponieważ są one konieczne do mobilizacji i rozmieszczenia aktyny w trakcie makropinocytozy.4). Ten mechanizm pochłaniania komórki nosi nazwę makropinocytozy. w skład receptora prawdopodobnie wchodzą integryny. a ciągłe odkładanie aktyny powoduje ruch bakterii. szybko otaczają i pochłaniają bakterię. w lizie bierze udział białko bakteryjne IpaB (patrz też sekcja 11. (1997) MM 25: 903-912] (patrz również sekcja 11. podtrzymywane od środka przez mikrowłókienka aktyny.5. wnika na zasadzie mechanizmu „spustowego" (ang.2. jak się wydaje. trigger). Rozprzestrzenianie się między komórkami zależy od obecności bakteryjnego białka błony zewnętrznej — IcsA (=VirG) kodowanego przez gen plazmidowy. kodowany przez zespół genów inv-spa zlokalizowanych w chromosomowej „wyspie patogenności" (sekcja 11. lecz proces ten odbywa się przez bazolateralne powierzchnie komórek nabłonkowych.5. wypustki błony komórkowej. która w ten sposób ulega internalizacji w dużej („obszernej") wakuoli (=fagosom).2). wyżej). jak się wydaje.2. niezbędny jest do inwazji i.11.1).

].komórki. należąca do rodziny glikoprotein (kadheryn) biorących udział w adhezji między komórkami. co jest istotnym czynnikiem w patogenezie dyzenterii (sekcja 11. że nawet kuleczki z lateksu opłaszczone intemaliną A ulegają internalizacji przez niektóre typy komórek ssaczych [Lecuit i wsp. Alternatywnie. (1997) INFIM 54: 5309-5319].2). U myszy (będących dobrym modelem do badania schorzeń człowieka) bakteria ta początkowo zostaje pochłonięta przez fagocytarne komórki Μ kępek Peyera.1). w której leukocyty polimorfonuklearne (PMN. W inwazji uczestniczy adhezyna występująca na powierzchni komórki. Wewnątrz cytoplazmy gospodarza L. 11. powoduje to napływ kolejnych integryn do tego miejsca. [Listeria monocytogenes (patogenność): McLaughlin (1997) RMM 8:1-14.2). zwanej listeriolizyną O.) Inwazja po interakcji między E-kadheryną i intemaliną A przypomina mechanizm „zamka błyskawicznego" w przypadku Yersinia enterocolitica (patrz niżej) (fot. Cząsteczki E-kadheryny występują na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonka. po pobraniu przez komórki M.2). Listeria monocytogenes ucieka z fagosomu (fot.3. In vitro. (Mutanty pozbawione aktywnego białka IcsA nie rozprzestrzeniają się i nie powodują dyzenterii). Bakteria po wepchnięciu do sąsiedniej komórki znajduje się w przedziale otoczonym podwójną błoną (po jednej błonie z każdej komórki). wewnątrzcytoplazmatyczna część cząsteczki E-kadheryny za pośrednictwem białek zwanych kateninami oddziałuje wzajemnie z aktynowym cytoszkieletem komórki. narażając je na dalszą inwazję przez Shigella. 11. Badania w hodowlach tkankowych sugerują. Toksyna ta należy do rodziny cytolizyn aktywowanych tiolem [Morgan. Shigella może zostać pochłonięta przez makrofagi (występujące pod komórkami M). co prowadzi do wielu połączeń między patogenem a gospodarzem (na zasadzie zamka błyskawicz- 270 . monocytogenes rośnie i rozprzestrzenia się do sąsiednich komórek wykorzystując napędzany aktyną ruch opisany dla Shigella — białko ActA odgrywa tę samą rolę co białko IcsA Shigella.3. Listeria monocytogenes. Receptorem jest E-kadheryna. Ucieczka z tego przedziału wiąże się z sekrecją enzymu lecytynazy (produkt genu plcB). (Patrz również sekcja 11. niektóre adhezyny patogena (inwazyna i białko YadA) wiążą się do integryn komórki gospodarza (sekcja 11. (Ciekawe jest to. zwana intemaliną A (produkt genu inlA).3.5. że patogen może z kolei dokonać inwazji sąsiadujących komórek nabłonka poprzez ich powierzchnie bazolateralne. w tym toksyny tworzącej pory. Yersinia enterocolitica. ang. które mogą powodować lizę błon komórek eukariotycznych zawierających cholesterol. który hydrolizuje lecytynę (fosfatydylocholinę) zawartą w błonie.2). Andrew i Mitchell (1996) RMM 7: 221-229].3. wywołując reakcję zapalną. polymorphonuclear leucocytes) migrują pomiędzy komórkami nabłonka i dostają się do światła jelita. Shigella może zabić makrofagi (sekcja 11.2. Interakcja pomiędzy E-kadheryną i intemaliną A sama w sobie wydaje się inicjować pobieranie bakterii.2) w wyniku sekrecji kilku białek. inwazja i ruch oparty na aktynie: Cossart i Lecuit (1998) EMBO Journal 17: 3797-3806. Ta migracja PMN najprawdopodobniej odsłania bazolateralne powierzchnie komórek nabłonka.

4. ang. Opsonizacja (sekcja 11.5. czas kontaktu między patogenem a makrofagiem (np.2. opuścić je (fot.2 Inwazja makrofagów Niektóre bakterie mogą dokonać inwazji makrofagów.4. Mycobacterium tuberculosis. tuberculosis. 11. Niektóre bakterie patogenne ulegają internalizacji po związaniu wielocukrów na ich powierzchni z lektynami w receptorze CR3 makrofaga. Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. Z kilku powodów. inne adhezyny i receptory.2. W porównaniu z fagocytozą (sekcja 11. intracellular multiplication) patogena. 11. oxidative burst) w makrofagu. w początkowych stadiach infekcji płuca istotną rolę może odgrywać wiązanie bez udziału opsonin (to jest wiązanie niezależne od dopełniacza i przeciwciał). 11. Chlamydia spp. enterocolitica może zachodzić jedynie na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonkowych. ponieważ tylko na tych powierzchniach występują integryny. Na inwazję/przeżycie mogą mieć wpływ: chemia powierzchni konkretnego szczepu M.1) może przebiegać jedną z czterech dróg aktywacji dopełniacza.. potrafią przetrwać wewnątrz fagolizosomu.4. Czasem przetrwaniu bakterii sprzyja brak inicjacji tzw. • nieliczne gatunki.4. w pierwotnej infekcji lub w trakcie rozprzestrzeniania się w organizmie). Yersinia enterocolitica przeżywa wewnątrz wakuoli.1. Segal i Shuman (1998) TIM 6: 253-255]. Mutacje w tych genach wpływają na zdolność patogena do namnażania się i zabijania makrofagów [patrz np. tuberculosisphagocyte interactions: Ehlers i Daffe (1998) TIM 6: 328-335]. wywołanego stanem zapalnym.1. w tym drodze lektynowej i C2a (unikania zabijania. In vivo. płuca). w tym małego stężenia dopełniacza w płynie pęcherzykowo-oskrzelowym.1) z udziałem układu dopełniacza (sekcja 11. rys. Patogen ten unika fagocytozy wykorzystując mechanizm krótko opisany w sekcji 11. wybuchu tlenowego (ang. 271 . W fagosomie wartość pH utrzymuje się blisko wartości obojętnej i patogen namnaża się. np. Coxiella burneti. tego typu inwazja przez komórki Y. defect in organelle trafficking). a po namnożeniu się. zwane również genami dot (ang.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49. ang. co pozwala na pochłonięcie komórek przed wystąpieniem. prawdopodobnie kodują system sekrecji i cząsteczki efektorowe uczestniczące w blokowaniu fuzji fagosomu z lizosomem.nego) oraz powoduje pochłonięcie bakterii do wakuoli niewiele większej od niej samej. Legionella pneumophila.1. miejsce infekcji (np.1. wzrostu poziomu dopełniacza [M. salvage) (sekcja 11.1) w procesie tym mogą uczestniczyć np. Pierwszy kontakt między patogenem i makrofagiem może decydować o przetrwaniu patogena.2.2). Legionella pneumophila i Mycobacterium tuberculosis fagosom nie ulega zakwaszeniu i fuzji z lizosomem. zabijając makrofagi. Geny icm (wewnątrzkomórkowego namnażania. Mycobacterium tuberculosis może się wiązać z receptorem za pośrednictwem β-glukanów. Po pobraniu: • u np.

272 .

Paris. France. (1995) INFIM 63: 4729-4737].2. INSERM U 411. Paracytozę w przypadku tego patogena badano w hodowlach tkankowych z komórek nabłonka płucnego [van Schilgaarde i wsp. Faculte de Medecine Necker-Enfants Malades. monocytogenes wewnątrz fagosomu w mysim makrofagu (strzałki wskazują na błonę fagosomu).(a) Dwie elektronowogęste komórki Listeria monocytogenes pobierane na zasadzie mechanizmu „zamka błyskawicznego" (sekcja 11.2. Institut Pasteur. Zdjęcie (a) z EMBO Journal (1998) 17: 3797-3806 za zgodą Oxford University Press i dzięki uprzejmości autorów (dr Pascale Cossart i Marca Lecuit). Unite des Interactions Bacteries-Cellules. Skala: 60 mm = 1 μm. 11. (d) Mycobacterium avium dzieląca się wewnątrz mysiego makrofaga — strzałki wskazują na błonę fagosomu. otoczona siecią włókien aktynowych (gwiazdki). Skala: 50 mm = 1 μm.2. Paris. (b) L.1). w której patogen przechodzi przez warstwę komórek przenikając pomiędzy nimi W ten sposób Haemophilus influenzae przechodzi między komórkami nabłonkowymi w płucach. Skala: 68 mm = Ιμm. (c) L. Zdjęcia (b)-(d) dzięki uprzejmości dr Chantal de Chastellier.2. monocytogenes wewnątrz mysiego makrofaga. France. 273 .3 Paracytoza Paracytoza jest formą inwazji. uciekająca z fagosomu i dzieląca się wewnątrz cytoplazmy.

5) podobny do białka specyficznego dla sporulacji oraz białek reagujących na stres. trudno wykrywalnej. Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].9. [Stan utajenia w gruźlicy: Parrish.222) i rozprzestrzenia się w organizmie. tuberculosis. nie zawsze można wykryć w tkankach bakterie kwasooporne stosując metodę Ziehl-Nielsena (sekcja 14.11. Miejsca przebywania utajonych komórek M.2.2. układ immunologiczny) gospodarza (sekcja 11. sekcja 11. gruźlica utajona przez całe życie niesie ryzyko rozwinięcia się choroby (ryzyko to zwiększa się np. Mechanizm stanu utajenia w gruźlicy jest nieznany. Stan utajenia występuje u około 60% osób zakażonych Mycobacterium tuberculosis.5) mechanizm jest nieznany. Niektóre wytwarzają toksyny (lub inne substancje).2. przez Mycobacterium tuberculosis.6). w którym pewne szczepy Opa Neisseria przechodzą przez warstwę komórek nabłonkowych bez naruszenia połączeń pomiędzy komórkami ssaczymi. które naruszają swoiste procesy fizjologiczne.3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby Jak patogen wywołuje chorobę? Różne patogeny czynią to rozmaitymi sposobami. kodującego czynnik sigma (sekcja 7. W pewnych przypadkach (np. że patogeneza wiąże się ze złożonymi interakcjami między bakterią patogenną a gospodarzem (sekcja 11. podczas gdy inne wnikają do pewnych komórek lub tkanek (gdzie również mogą wytwarzać toksyny).3. 274 . proces ten jest zapoczątkowany pochłonięciem komórek bakteryjnych po ich uprzednim związaniu ze swoistymi receptorami na komórce gospodarza [Dehio.] 11. lecz wyciszony w wyniku aktywności układu immunologicznego gospodarza (sekcja 11. + 11. powodowanej np. patogen pozostaje żywy. W infekcji utajonej.2). z czego u około 40% rozwija się czynna gruźlica.4 Transcytoza Transcytoza jest procesem. W przypadku pewnych chorób do rozwoju objawów chorobowych mogą się przyczyniać mechanizmy obronne (np. Możliwość istnienia formy sporopodobnej została zasugerowana w wyniku wykrycia genu sigF. występujące u innych bakterii. Molekularne badania chorób zakaźnych wskazują na to.2. tuberculosis nie są znane. czy też po prostu występuje w małej ilości. reakcja pacjenta na obecność patogena może być seropozytywna. że u co trzeciej osoby występuje infekcja utajona spowodowana przez M. Po pochłonięciu komórek przez makrofagi patogen przeżywa (sekcja W. czy patogen istnieje tam w formie niekwasoopornej lub w postaci przypominającej spory.4).3 Stan utajenia Patogen zazwyczaj albo powoduje chorobę. lecz nie stanowi on powodu choroby.2). Nie jest więc jasne. Dick i Bishai (1998) TIM 6: 107-112. Przypuszcza się. w przypadku infekcji wirusem HIV lub stosowania leków immunosupresyjnych).4. albo zostaje zabity przez układ obronny gospodarza.

). TC). Jest też prawdopodobne. Powstający wysoki poziom cAMP (rys.Wypływ wody do jelita powoduje charakterystyczne dla cholery wodniste stolce o wyglądzie odwaru ryżowego. toksyna może być potrzebna do modyfikacji syntezy (lub uwalniania) cytokin (tab.Niektórym chorobom zakaźnym towarzyszy uogólniona reakcja zwana posocznicą lub sepsą. 7.3 kPa Leukocyty > 12000/mm3. jak również infekcja. sepsis) ścisłego znaczenia. Do tego rodzaju chorób należy cholera. że w tego typu chorobach cytokiny odgrywają istotną rolę jako główne cząsteczki efektorowe lub czynniki niezbędne do aktywności toksyny [Henderson i wsp. wskazuje na obecność posocznicy. sekcja 11.] Przykłady patogenezy podano niżej oraz w tabeli 11. Ostatecznie posocznicę zdefiniowano jako zespół uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS.1. cholerne. 11. SIRS występuje.3.4). Podjęto próbę nadania terminowi „posocznica" (ang. 11. stolce praktycznie stają się wodniste.1.2. mogą powodować mniej groźne objawy będące wynikiem aktywności innych toksyn (Zot i Ace) kodowanych przez geny bakteryjne. tężec i błonica. 11. W niektórych schorzeniach toksyna może być tylko jednym z czynników patogenezy. botulizm. [Treatment of sepsis: Baumgartner i Calandra (1999) Drugs 57: 127-132. (1997) TIM 5: 454-458](patrz np. <4000/mm3 lub > 10% form niedojrzałych Przyczyny występowania SIRS mogą być różne. co jest warunkiem procesu chorobowego. ang. gdy pojawiają się co najmniej dwa z następujących objawów: Temperatura >38°C lub <36°C Tętno > 90 uderzeń na minutę Oddychanie > 20 oddechów na minutę. systemie inflammatory response Syndrome.] 275 . w tym niedokrwienie.6). TC działa na komórki śluzówki w jelicie cienkim. Infekcje wywołane szczepami V.3.1 Patogeneza z udziałem toksyn W niektórych chorobach większość lub nawet wszystkie objawy choroby można przypisać skutkom danej egzotoksyny. które nie wytwarzają TC. tj.3. które oddziałuje na konkretne miejsca w organizmie. [Mechanisms of action of enterotoxins: Sears i Kaper (1996) MR 60:167-215. Kiedy SIRS powstaje w wyniku infekcji.12) prawdopodobnie stymuluje sekrecję jonów chloru do światła jelita. uwalnianego przez bakterię patogenną. by można go jednoznacznie stosować do opisu prób klinicznych wykonywanych dla różnych terapii przeciw temu stanowi. gdzie stymuluje aktywność cyklazy adenylanowej. Sepsis/SIRS: JASC (1998) 41 (suplement A): 1-112]. martwica tkanek lub urazy. lub PaCO2 < 4. Patogen (pewne szczepy Vibrio cholerne) namnaża się w jelicie i wytwarza rodzaj egzotoksyny — enterotoksynę (toksynę cholery. Na przykład.1. Jako efekt towarzyszący występuje również utrata HCO3~ . Cholera Przebiegowi cholery towarzyszą wymioty i obfita biegunka. specyficznego białka o właściwościach toksycznych.

3. Geny kodujące TC i TCP podlegają wspólnej regulacji przez transkrypcyjne białka regulatorowe (ToxR.2 Botulizm Botulizm jest związany z paraliżem mięśni. która działa w miejscu połączeń między nerwami i mięśniami.Po dostaniu się V. kiełbasy i niewłaściwie konserwowane jarzyny. co prowadzi do spastycznego paraliżu.] 11. która działa na pewne komórki (neurony wstawkowe) w ośrodkowym układzie nerwowym. toxin co-regulated pili). Geny dla TCP występują w „wyspach patogenności" (sekcja 11. oraz TC. co powoduje zahamowanie uwalniania neuroprzekaźników [Me- 276 .3. Waldor i wsp.7). które często prowadzą do śmierci na skutek uduszenia lub wyczerpania. w których są warunki beztlenowe.5.4 Toksyna botulinowa i tetanospazmina: podobieństwa Chociaż tetanospazmina i toksyna botulinowa (jad kiełbasiany) wywołują bardzo odmienne objawy kliniczne.3 Tężec W przebiegu tężca występują niekontrolowane skurcze mięśni szkieletowych. Hamując uwalnianie neuroprzekaźnika (glicyny) przez te komórki. Stwierdzenie. przez patogenną bakterię Clostridium tetani.11.1. doprowadziło do poznania transmisji czynników wirulencji w warunkach in vivo (sekcja 11. 11. [Występowanie i leczenia botulizmu (artykuł przeglądowy): Roblot i wsp. obydwie te toksyny wykazują istotne podobieństwa. Patrz również „cholera" — w sekcji 11. Bakteria ta wytwarza neurotoksynę (tetanospazminę). że sygnały w środowisku jelita gospodarza mają zdolność indukowania syntezy TCP. a wynikiem np.1. jak: gotowane mięso.5. tak zwanych „pilusów koregulowanych z toksyną" (TCP. Nie jest więc konieczne spożycie z pokarmem samego patogena. [Waldor i Mekelanos (19967) Science 272:1910-1914. ang.1. (1997) MM 24: 917-926]. degradując specyficzne białka w komórkach nerwowych. (1995) RMM 6: 58-62. hamując uwalnianie acetylocholiny i — co zatem idzie — stymulację mięśni przez nerwy. Geny kodujące TC (jak również toksyny Zot i Ace) występują w genomie nitkowatego faga. kolonizacja jelita cienkiego oraz rozwój choroby zależą od dwóch głównych czynników wirulencji (sekcja 11. Choroba może powstać w wyniku dostania się wytworzonej toksyny do organizmu — zwykle ze skażoną żywnością.5): wyrostków uczestniczących w adhezji do powierzchni błony śluzowej. które pobudzają ekspresję TC i TCP po odebraniu sygnałów środowiskowych w przewodzie pokarmowym. niedowładu (mięśniowego) układu oddechowego może być śmierć.3. cholerne z pokarmem. 11. Choroba rozwija się po zakażeniu głębokich ran. ToxS i ToxT).8). Patogen (szczepy Clostridium botulinum) wytwarza rodzaj egzotoksyny — neurotoksynę. Wiążą się do komórek nerwowych. tetanospazmina pozwala na równoczesne kurcze w parze mięśni antagonista-protagonista. przez które są następnie pobierane (internalizowane) i wywołują objawy w wyniku aktywności enzymatycznej (są endopeptydazami cynkowymi).

2) mają podobny mechanizm działania. zmiany w ścianie następują w wyniku związania toksyny z Gb3.3. krwotocznym zapaleniu okrężnicy oraz w zespole hemolityczno-mocznicowym nie jest w pełni zrozumiała. Synsorb Pk to preparat złożony z syntetycznych analogów Gb3 — związanych z nierozpuszczalnymi cząsteczkami krzemionki. Możliwość neutralizacji toksyny stworzyła podstawy potencjalnego czynnika terapeutycznego skierowanego przeciw EHEC. Toksyna typu 1 Shigella dysenteriae. jak również podobne toksyny E. Wyjaśnienie enzymatycznego działania obydwu toksyn może się przyczynić do znalezienia specyficznych inhibitorów o możliwym zastosowaniu w chemioterapii botulizmu i tężca. Jednakże. że odruchy wymiotne mogą być wywołane przez stymulację jelitowych komórek zwojowych. histamin i leukotrienów z komórek tucznych. patogeneza może się wiązać z działaniem cytokin. ponieważ jego cząsteczka ma kształt rozgwiazdy (ang. 11. występują w jeszcze większej ilości w wyniku aktywności cytokin TNF-α i IL-1. wytwarzane przez niektóre szczepy Shigella i EHEC (tab. 11. in. coli O157:H7 i innych EHEC. aktywność ssaczego enzymu endopeptydazy cynkowej. W jednym z modeli uszkodzeń naczyniowych indukowanych przez EHEC. aktywowane makrofagi ulegają adhezji do zmienionych miejsc i są stymulowane (np. Enterotoksyny te (typy od A do H) wkrótce po spożyciu skażonej żywności zwykle powodują wymioty i często biegunki. można zneutralizować przez ich związanie z rozpuszczalnym w wodzie. 12.3. co z kolei indukuje uwolnienie m. że miejsca Gb 3 .2). lecz wydaje się. choć sądzi się.chanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins: Montecucco i Schiavo (1994) MM 13: 1-8]. konwertującego angiotensynę. coli O157:H7. Toksyny E. lek czasem stosowany w terapii nadciśnienia.3.3. powodując uwolnienie neuropeptydów. podobne do toksyn typu 1 S. węglowodanowym ligandem.5. hamowana jest przez kaptopryl. Podobnie.6 Toksyna Shiga i podobne toksyny (werotoksyny) Enterotoksyny te.1. Czynnik ten jest badany pod kątem możliwości jego wykorzystania do 277 . że powodują one uszkodzenia naczyń krwionośnych.4. które są bardziej liczne w małych naczyniach krwionośnych.1). zwanym STARFISH. przez toksynę) do sekrecji IL-1 i TNF-α. Mechanizm działania tych toksyn jest nieznany. są rozpoznawane przez receptory glikoproteinowe (oznaczone Gb3) na komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. 11. starfish). Wiążą się one do określonych miejsc w jelicie i są pobierane na drodze endocytozy przy współudziale receptorów. Ponieważ enterotoksyny są superantygenami (sekcja 11. Badania in vitro wykazały.5 Zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce Gronkowcowe zatrucia pokarmowe (tab. powodując miejscową proliferację miejsc Gb 3 i dalsze (w wyniku udziału toksyny) uszkodzenia [Tesh (1998) TIM 6: 228-232].1. ich rola w czerwonce (dyzenterii) (sekcja 11.2) są spowodowane enterotoksynami wytworzonymi przez pewne gatunki gronkowców (głównie Staphylococcus aureus). Toksyny te oddziałują na syntezę białka i hamują absorpcję NaCl. pod względem struktury przypominając Gb 3 . dysenteriae.

które aktywuje składnik osocza — plazminogen. w mukowiscydozie (patrz niżej).3.2 Patogeneza z udziałem innych produktów bakteryjnych Agresyny to produkty. aeruginosa niesie geny kodujące syntezę alginianu. jak może tworzyć gęsty alginianowy śluz. lecz u szczepów wyosobnionych ze środowiska geny te zwykle nie ulegają ekspresji. intensywna kolonizacja Stenotrophomonas maltophila (uprzednio Xanthomonas maltophila) [Denton (1997) RMM 8: 15-19]. Ta ostatnia bakteria . W chorobie tej prawdopodobnie znaczenie ma długotrwała. które pomagają patogenowi w procesach inwazji. przez hamowanie prawidłowej aktywności przeciwbakteryjnej [Smith i wsp. W przynajmniej niektórych przypadkach enzym ten może ułatwiać penetrację bakterii w miejscu zakażenia. (1996) Cell 85: 229-236]. Produkcja aktywatorów plazminogenu przez paciorkowce (i niektóre inne bakterie) wiązana jest z inwazyjnością tych bakterii [patrz np. 11. Niektóre bakterie.2. enzym. Jest to białko wydzielane zewnątrzkomórkowo. która niszczy fibrynę. który uczestniczy w trankskrypcji genów alginianowych. 11.1 Mukowiscydoza Mukowiscydoza [artykuł przeglądowy: Rosenstein i Zeitlin (1998) Lancet 351: 277-282] jest chorobą dziedziczną. W przypadku P. w której wadliwy transporter ABC powoduje zaburzenia transportu chloru przez błonę komórkową. co zapobiega jej pobraniu. Burkholderia cepacia i Pseudomonas aeruginosa.3. aeruginosa przeobrażenie szczepów niemukoidalnych w mukoidalne zachodzi po pojawieniu się swoistego czynnika sigma (sekcja 7. wytwarzają liazę hialuronianową. fibrolizyna). Większość szczepów P. co jest złym rokowaniem. który hamuje fagocytozę i sprzyja zastojowi.5. U pacjentów z mukowiscydoza warunki w płucach wydają się sprzyjać selekcji szczepów wytwarzających śluz (alginian) (mukoidalnych). AlgU może się stać konstytu278 prątki gruźlicy. W typowych przypadkach w płucach zalega gęsty śluz i mogą występować takie mikroorganizmy. Ta zdolność przeprowadzania lizy fibryny może ułatwiać patogenowi pokonanie bariery fibrynowej w ranach lub zmienionych chorobowo miejscach. Produkty bakteryjne mogą się również przyczyniać do patogenezy w sposób bardziej mechaniczny — np. (Patrz również sekcja 8. Lottenberg (1997) TIM 5: 466-467].10).5) zwanego AlgU. Duże stężenie soli (NaCl) na nabłonkach dróg oddechowych u pacjentów cierpiących na mukowiscydozę może sprzyjać bakteryjnej kolonizacji.wiązania (sekwestracji) toksyny w przewodzie pokarmowym. który hydrolizuje kwas hialuronowy będący składnikiem tkanki łącznej u zwierząt. a zatem dotarciu do miejsc wiązania na nabłonku wyściełającym naczynia [STARFISH: Nature (2000) 403: 669-672]. Inny przykład to streptokinaza produkowana przez paciorkowce. w tym Streptococcus pyogenes i większość koagulazododatnich gronkowców. tworząc plazminę (syn.

polimorphonuclear) do zainfekowanych tkanek.tywnie (trwale) aktywny w wyniku mutacji w genie mucA (aktywność AlgU jest hamowana przez związanie MucA).5).6. a mechanizm tego procesu z udziałem osobliwego białka efektorowego SopB został opisany dla S. Jeden z modeli przebiegu dyzenterii zakłada. Białko bakterii Shigella — IcsA kodowane przez gen niesiony na plazmidzie (funkcja: sekcja 11. EIEC: tabela 11. gorączką. 11. w kępkach Peyera). (oraz np. ani u EIEC i to wydaje się warunkiem ich patogenności [Nakata i wsp. która tnie/inaktywuje białko IcsA (VirG).2. 279 . dublin u cieląt) zwykle powoduje stany chorobowe ograniczone do jelit (stany zapalne.1). IL-65 i IL-8).5. Inwazja przez Shigella opisana jest w sekcji 11. zwiększając zakres inwazji oraz uszkodzenia tkanek (sekcja 11. (1997) MM 25: 903-912].1 Salmonelloza W pierwszych etapach zakażenia salmonellą następuje inwazja nabłonka jelitowego (sekcja 11. pęcherzyku żółciowym i trzustce. Geny enteropatogenności (w przeciwieństwie do salmonelloz układowych) znajdują się w wyraźnie wyodrębnionych wyspach patogenności (sekcja 11. wydzielanie płynów).7).2 Czerwonka (dyzenteria) Dyzenteria wywołana przez Shigella spp. wodnistą oraz (często) krwawą biegunką. że śmierć makrofagów (sekcja 11. Jednakże proteazy tej nie ma ani u Shigella. z bólem. Stan zapalny jelita może być tak intensywny (np. W przypadku niektórych bakterii w błonie zewnętrznej występuje proteaza (SopA u Shigella. [Mucoidy of Pseudomonas aeruginosa in CF: Schurr i wsp.1.3.2. S.1. ang.3. z migracją np.5.1). IL-1. typhimurium u ludzi. leukocytów polimorfonuklearnych (z segmentowanym jądrem. (1996) JB 178: 4997-5004]. S. perforacji i wystąpienia krwotoków. że prowadzi do miejscowej martwicy tkanki.2.3 Patogeneza przebiegająca ze zniszczeniem komórek lub tkanek gospodarza 11. typhi przenika do krwiobiegu (za pośrednictwem układu limfatycznego) i namnaża się w wątrobie.4.2.2. (1993) MM 9: 459-468].5. coli). W durze brzusznym S.3. dublin — patogena bydła [Galyov i wsp.3. Wtórne zakażenie następuje z pęcherzyka żółciowego. z wytworzeniem wrzodów.2.3.2.2.1) (jak również podobnego typu białko u EIEC) jest niezbędne dla patogenności. W przeciwieństwie do S. a zabicie makrofagów — w sekcji 11.2. Do objawów należą bóle jelitowe i posocznica (sekcja 11.3. (IcsA jest domeną a autotransportera —: sekcja 5. 11. Tego typu migracja wywoływana jest przez transnabłonkową sygnalizację przez patogena. PMN.2) sprzyja odpowiedzi zapalnej (tworzeniu TNF-a. co przyciąga PMN.2) przebiega ze zniszczeniem nabłonka jelita cienkiego/grubego. lecz ostatecznie prowadząc do zatrzymania infekcji [Zychlinsky i Sansonetti (1997) TIM 5: 201-204]. Rolę toksyny shiga omówiono w sekcji 11. OmpT u E.3). typhi wiele gatunków salmonelli (np.

11.9.11). 280 . Nadzieje są wiązane z niektórymi antybiotykami. pylori. które mogą zmniejszać ryzyko wystąpienia szoku septycznego.2).2. jest przenoszona przez muchy i rozwija się w erytrocytach oraz komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. stymulując wydzielanie pewnych silnie działających czynników fizjologicznych (cytokiny: tab.3.4.5 Choroby układu pokarmowego przypisywane Helicobacter pylori Helicobacter pylori (patrz Aneks) wiązany jest przyczynowo z występowaniem zapalenia żołądka i z chorobą wrzodową. Stwierdzono jednak. Próby zastosowania szczepionki zawierającej monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw endotoksynie były nieudane [Baumgartner (1994) RMM 5: 183-190]. Przebieg choroby często kończy się zgonem.5. W związku z tym endotoksyny zaklasyfikowano do grupy modulin (sekcja 11. Sugeruje to możliwość powstania reakcji autoimmunologicznej i stanu zapalnego w wyniku wiązania się przeciwciał skierowanych przeciw lipopolisacharydowi do antygenów Lewisa w śluzówce [Molecular mimicry of H. 11. ponieważ dominujący rodzaj przeciwciał skierowanych przeciw LPS. takich jak IL-1β i TNF-α. stwierdzany u wielu pacjentów zakażonych H. choroba występująca w niektórych rejonach Ameryki Południowej.2. który nie jest podobny do tych struktur w LPS H. po udanej chemioterapii skierowanej przeciw gramujemnemu patogenowi). Śmierć może być następstwem narastającego zaburzenia funkcjonowania narządów wewnętrznych. Endotoksyny działają na makrofagi i inne komórki układu immunologicznego. pylori LPS: Appelmelk i wsp. Kończący się często zejściem śmiertelnym szok septyczny jest związany z aktywnością endotoksyn przenoszonych przez krew (np. pylori.2) H. Toksycznym składnikiem LPS jest lipid A. odpowiada antygenowi.3 Gorączka Oroya Gorączka Oroya. chociaż szczegóły przebiegu patogenezy nie są do końca wyjaśnione.11. białka i fosfolipidy. Bartonella bacilliformis.3. charakteryzuje się wysoką gorączką i postępującą anemią. Wzrost bakterii prowadzi do zniszczenia krwinek czerwonych oraz wywołuje towarzyszące temu objawy. (1997) TIM 5: 70-73]. Bakteria wywołująca tą chorobę. przypominających antygeny Lewisa [Yokota i wsp. gdyż hamują szlak biosyntezy lipidu A (sekcja 15. (1998) INFIM 66: 3006-3011]. Hipoteza ta jest jednak kwestionowana.4 Szok endotoksyczny (septyczny) Endotoksyny bakterii gramujemnych to wielkocząsteczkowe kompleksy zawierające pewne składniki błony zewnętrznej: lipopolisacharyd (LPS — sekcja 2.3. 11.4). pylori zawiera antygeny identyczne z antygenami Lewisa χ i y występujących w błonie śluzowej żołądka u ludzi. znaczny spadek ciśnienia krwi) oraz blokowania naczyń krwionośnych przez leukocyty.9. Cytokiny te mogą „zwerbować" kolejne.3.4). że lipopolisacharyd (sekcja 2. co prowadzi do objawów szoku (np.

5.6 Reakcja Jarischa-Herxheimera Reakcja ta. są związane z kaskadą cytokin (np. de Bernard i Arico (1998) TIM 6: 128-129]. Dla każdego potencjalnego patogena zdrowy organizm gospodarza zawiera wiele przeszkód i barier. które zwilżają te tkanki. prowadząc do np.7) oraz niezwiązanym z nią (lecz często wspólnie wyrażanym) genem vacA. pylori do ścian żołądka (w przeciwieństwie do przebywania bakterii wewnątrz warstwy śluzu w żołądku) prawdopodobnie sprzyja powstawaniu autoprzeciwciał. Skóra. które działają przez cały czas. Patogeneza wydaje się związana z „wyspą patogenności" cag (sekcja 11. (1994) BCID 1: 65-74]. Crabtree i Wren (1998) TIM 6: 379-380].3. Wydzieliny. mogąca mieć przebieg śmiertelny. Cover (1998) TIM 6: 127-128. zwykle nie są kojarzone z ciężkim przebiegiem choroby. Białko VacA jest toksyną o nieznanym mechanizmie wnikania do komórek gospodarza. IL-8). Własne mechanizmy obronne mają również błony śluzowe. IL-6. na przykład. Ekspresja zarówno cagA.4. zarówno mechanicznym spłukiwaniem komórek bakteryjnych oraz przez obecność w nich sub281 . czasami występuje po pierwszej skutecznej dawce leku podanego do zwalczenia chorób powodowanych przez pewne bakterie (szczególnie krętki) lub pierwotniaki [artykuł przeglądowy: Griffin i wsp. Jej wewnątrzkomórkowym celem działania może być czynnik uczestniczący w regulacji rozwoju/dojrzewania wakuoli w komórce gospodarza [patrz np. (1996) NEJM 335: 311-315]. może zależeć od szczególnej kombinacji czynników w (genetycznie zróżnicowanych) populacjach patogena i gospodarza [Dorell. przypuszczalnie odpowiedzialnych za przynajmniej niektóre z objawów patofizjologicznych. Reakcji Jarischa-Herxheimera można zapobiec podając przeciwciała przeciw TNF [Fekade i wsp. jest czymś więcej niż prostą fizyczną barierą na drodze do infekcji. podczas gdy szczepy typu II. Objawy.Adhezja H. jak i vacA (w szczepach typu I izolowanych w środowisku szpitalnym) wydaje się skorelowana z ciężkim schorzeniem układu pokarmowego.1 Mechanizmy konstytutywne Mechanizmy konstytutywne (wrodzone) to nieswoiste mechanizmy obronne. a miejsca sprzyjające infekcji są zajmowane przez dobrze zaadaptowaną mikroflorę skóry. To.4 Mechanizmy obronne gospodarza 11. Mechanizm nagłego uwolnienia cytokin nie jest znany. by wytworzyć z nich kwasy tłuszczowe o działaniu przeciwbakteryjnym. utrudniają zasiedlenie przez patogena. 11. 11. chronicznego zapalenia żołądka. które nie mają cagA i nie wyrażają aktywności VacA. czy tego typu adhezja nastąpi w danym gospodarzu. Niektóre gatunki tych rezydentów wykorzystują lipidy wydzielane przez gruczoły łojowe. do których należy początkowy wzrost temperatury. Dla większości bakterii stanowi ona środowisko nieprzyjazne: brakuje w niej wody. TNF. Znane są również szczepy powodujące schorzenia o pośrednim przebiegu.

białka błonowe związane z lizosomem). Na przykład: • C3a i C5a powodują uwolnienie histaminy (tab. Wewnątrz tkanek oraz układu krwionośnego i limfatycznego wyspecjalizowane komórki (fagocyty) pochłaniają i niszczą cząsteczki „obcych" ciał — w tym wiele drobnoustrojów. Regiony Fab (rys. 11. W opsonizacji danej bakterii mogą więc uczestniczyć zarówno przeciwciała. rys.4. Istnieje też mikroflora rezydentów. W stanie zapalnym uczestniczą różne cząsteczki sygnałowe. które za jego pośrednictwem wiążą opłaszczoną bakterię.stancji przeciwbakteryjnych. Zbierają się również neutrofile i makrofagi. Fagolizosom ma charakterystyczny skład białek.2. z którą każdy potencjalny patogen musi współzawodniczyć. Stan zapalny.2. Bakterie mogą ulegać opsonizacji. Łzy np. która zostaje zamknięta wewnątrz otoczonego błoną woreczka (wodniczki). a w pewnym momencie fagosom ulega fuzji z lizosomem (woreczkiem zawierającym enzymy degradujące). Gdy fuzja między fagosomem i lizosomem zostaje zablokowana. W przebiegu typowej fagocytozy kontakt między bakterią a makrofagiem (który ułatwiony jest przez opsonizację — patrz niżej) zapoczątkowuje pochłanianie komórki bakteryjnej. 2.2). jak i układ dopełniacza. lysosome-associated membrane proteins. Niektóre z nich powstają w wyniku aktywacji układu dopełniacza (patrz niżej) przez patogena. a proces eliminacji drobnoustrojów nosi nazwę fagocytozy.3). 11. Te niespecyficzne objawy (spowodowane również przez urazy mechaniczne czy chemiczne) wiążą się ze zwiększonym przepływem osocza do uszkodzonej tkanki (stąd obrzęk).2. obrzęk. Dłużej utrzymujący się patogen może wywołać stan zapalny — miejscowe zaczerwienienie. tworząc fagolizosom. np. Histamina zwiększa przepuszczalność drobnych naczyń krwionośnych. jak układ dopełniacza i przeciwciała. przeciwciała slgA (sekcja 11. a inne blokują fuzję między fagosomem a lizosomem (sekcja 11.2). wzrost ciepłoty. Fagocytoza. Gdy patogen przedrze się przez zewnętrzne mechanizmy obronne. 2) mogą się wiązać do antygenu na jego powierzchni. zwanego fagosomem.1. Na powierzchni niektórych rodzajów fagocytów występują swoiste receptory dla C3b. Przeistoczenie się fagosomu w fagolizosom można prześledzić na podstawie zmian pH oraz składu towarzyszących białek. Opsonizacja. 11. W opsonizacji mogą też uczestniczyć przeciwciała (sekcja 11. Wewnątrz fagosomu następuje stopniowe obniżanie się pH. lecz niektóre patogeny przeżywają. W procesie tym następuje aktywacja dopełniacza oraz związanie pewnych składników. Wewnątrz fagolizosomu drobnoustroje zwykle giną. a wiele wydzielin zawiera np. Neutrofile zwykle pojawiają się w ciągu kilku minut. a fragment Fc przeciwciała — do swoistych receptorów dla Fc na powierzchni pewnych fagocytów.4. nie stwierdza się obecności LAMP.7) hydrolizujący wiązania mureiny w bakteryjnej ścianie komórkowej. Powoduje to miejscowy wzrost ilości czynników przeciwbakteryjnych.1).2. zwanych LAMP (ang. ból i utratę funkcji. C3b. stając się tym samym bardziej podatne na fagocytozę. zawierają enzym lizozym (rys. co pozwala na przepływ osocza i również sprzyja szybkiej ekspresji cząsteczek selektyny na powierz- 282 . czekają go mechanizmy wewnętrzne. Do komórek tych należą makrofagi.

które mogą nie zostać zabite w nieaktywowanych makrofagach. Powierzchniowe selektyny słabo wiążą się do leukocytów w układzie krwionośnym. 283 . Na pewnym etapie miejsce objęte stanem zapalnym może również zawierać cząsteczki uczestniczące w procesach naprawczych prowadzących do wyleczenia (patrz np. aktywuje makrofagi. czynnik martwicy nowotworu (TNF. Jedna z nich. to jest zespół różnych białek. • Aktywowane makrofagi wydzielają cytokiny. 11.3). w wyniku czego komórki te silnie wiążą się — za pośrednictwem integryn — do powierzchni nabłonka. IL-8). tumor necrosis factor) oraz interleukiny 1 i 8 (IL-1. Jak wspomniano wyżej. W wyniku aktywacji poszczególne składniki tego układu mogą spełniać specyficzne funkcje fizjologiczne (tab. IL-1 i TNF mogą aktywować syntezę selektyn. • Antygenowoswoiste komórki Τ mogą być stymulowane przez patogena do sekrecji cytokin (tab.4). w wyniku którego leukocyty opuszczają naczynia krwionośne i przemieszczają się do tkanek.4. ang.1 Dopełniacz Surowica zawiera dopełniacz. 11. uczestniczą w pewnych aspektach odpowiedzi adaptacyjnej (sekcja 11.1. 11. Te z kolei wydzielają zwiększone ilości niespecyficznych czynników przeciwbakteryjnych (jak H 2 O 2 ) i mogą zabijać niektóre typy pochłoniętych patogenów.4) wiąże się do komórek nabłonkowych i do leukocytów (już słabo związanych przez selektyny). Następnie leukocyty ulegają spłaszczeniu i toczą się wzdłuż nabłonka zgodnie z gradientem chemokiny.chni komórek nabłonkowych wyściełających światło naczynia.2) oraz w konstytutywnych mechanizmach obronnych. Jest to pierwsze stadium procesu.4. 11. y-interferon. np. IL-8 (chemokina: tab. powodując toczenie się tych komórek po powierzchni nabłonka. Martin (1997) Science 276: 75-81]. a następnie przechodzą między komórkami nabłonka do tkanki (diapedeza). Tego typu wiązanie aktywuje cząsteczki integryny w leukocytach. Stany zapalne mogą odgrywać ważną rolę w reakcji organizmu na patogeny. które w obecności pewnych cząsteczek przechodzą „kaskadę" reakcji polegającą na kolejno następującej aktywacji.

lipopolisacharyd (LPS) bakterii gramujemnych (sekcja 2. 2.1).2. która w pewnych przypadkach prowadzi do lizy komórki (cytoliza odpornościowa). tworzą one perforację w błonie zewnętrznej.Układ dopełniacza może być aktywowany w różny sposób. Gramujemna bakte- 284 . Aktywacja przez bakterię gramujemną może mieć szereg konsekwencji. jeśli składniki C5b-9 (kompleks atakujący błonę) zwiążą się z powierzchnią komórki. 2. wiązanie składnika czyni komórkę bardziej podatną na fagocytozę przez makrofagi. którą z czterech dróg będzie przebiegać (rys. 11. a aktywator determinuje.9) może zapoczątkować drogę alternatywną.6). Liza ta wynika nie tylko z przełamania bariery błony zewnętrznej. lecz również stwarza możliwość dotarcia lizozymu (rys. Na przykład. Co więcej.7) do warstwy mureiny tworzącej ścianę komórkową (rys. Na przykład.

2) w kompleksie antygen-przeciwciało (ag-ab). Kompleks C5b67 wiąże się do błony i po przyłączeniu kolejnych składników. określają poszczególne składniki układu dopełniacza. C2 itd. Droga C2a (ang. Cl.1) Każdy z czterech szlaków wywołuje podobne efekty fizjologiczne. 285 . to białka zwykle występujące w osoczu.1) może to prowadzić do lizy bakterii.4. jak również properdyna. C8 i C9. Czynniki Β i D. Z tego powodu.9.1.2. Droga lektynowa.1. C5a działa jako czynnik chemotaktyczny. i to mimo inaktywacji przez czynnik I. Ważne jest również występowanie charakterystycznej pętli amplifikacji C3. które hamują aktywność Cl i rozkładają/hamują aktywność C3b.2). Jeśli MAC powstaje np. prowadząc do jej lizy w razie utworzenia MAC. Histamina wpływa na przepuszczalność niektórych małych naczyń krwionośnych.1 Uproszczony schemat aktywacji dopełniacza (sekcja 11. Droga ta jest aktywowana np. Na dodatek. C3b ma krótki okres półtrwania. do których się wiąże. Taki kompleks może powstać np. przyciągający makrofagi i inne komórki do zmienionego chorobowo miejsca. ang. Na początku.4. nawet bez aktywacji dopełniacza. lecz fragment ten występuje zazwyczaj w małym stężeniu. Patrz tekst (sekcja 11. Konwertazy C3 i C5 uczestniczące w tej drodze aktywacji różnią się od tych w drodze klasycznej. Cl przyłącza się do tak zwanego fragmentu Fc przeciwciała (rys. Może też wiązać się do innej komórki w sąsiedztwie. Jeśli aktywacja została zainicjowana przez kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni komórki bakteryjnej. przyczyniając się do uwolnienia mediatorów procesów zapalnych. lecz jest zapoczątkowany w odmienny sposób. w wyniku niskiego. tworzy por lub kanał w tej błonie. ponieważ na powierzchni makrofagów i innych fagocytów występują specyficzne miejsca receptorowe dla C3b. Konwertaza C3 rozkłada C3 do fragmentów C3a i C3b).4. jak histamina.1.2. a C4b2 jest rozkładany przez Cl do C4b2a (konwertazę C3).1). przez lipopolisacharydy (LPS. schemat nie przedstawia wszystkich produktów degradacji — na przykład C4 ulega rozcięciu do fragmentów C4a i C4b. zwany jest kompleksem atakującym błonę (MAC. Ściana takiego kanału składa się z sześciu lub więcej cząsteczek C9.1). Fragmenty C3a i C5a. Patrz tekst (sekcja 11. salvage). w wyniku związania przeciwciała antygenem na powierzchni komórki bakteryjnej. Aktywowany składnik Cl rozkłada C4. Układ dopełniacza jest zdolny do wytworzenia czynników fizjologicznych o potężnym działaniu. Tego rodzaju liza zwana jest reaktywną Droga alternatywna. membrane attack complex). C4b wiąże C2. pozwalając na zwiększony wypływ osocza i komórek do zainfekowanych tkanek.2. Regulacja układu dopełniacza. Kompleks C5b67 może się wiązać do lub w pobliżu miejsca pierwotnej aktywacji dopełniacza. 11. C3b sprzyja fagocytozie takich komórek lub kompleksów. wystarczający do aktywacji (patrz wyżej). musi on podlegać ścisłej kontroli.Rys. a ponieważ na proces aktywacji składa się kilka różnych etapów amplifikacji. spontanicznego poziomu hydrolizy C3. lecz tylko fragment C4b jest tu rozpatrywany). Kaskada reakcji przebiega tak jak na schemacie. fragmenty C3b mogą się wiązać z fragmentem Fc przeciwciała i/lub do powierzchni bakterii. Linie kropkowane wskazują na enzymatyczną aktywność kompleksu rozkładającego niektóre składniki tego układu). C3b może również przekształcić się w kompleks będący konwertazą C5 (kolejna faza aktywacji). „a" i „b" określają fragmenty tych składników powstające w wyniku enzymatycznego degradacji w trakcie procesu aktywacji (dla jasności. 11. Aktywacja tej drogi może być zapoczątkowana przez wiele typów kompleksów antygen-przeciwciało (sekcja 11. Droga klasyczna.4. W niektórych przypadkach (patrz sekcja 11.1). cząsteczki.4. Wyjaśnia to dostępność C3b dla inicjacji alternatywnej drogi. Fragmenty te (nie pokazane na rysunku) zwane są anafilatoksynami.9. istnieją swoiste inhibitory kluczowych etapów procesu aktywacji — np. na błonie zewnętrznej bakterii gramujemnej (sekcja 2.2). Zwykle niski poziom C3b. mogą działać na komórki tuczne i bazofile. sekcja 2.

niezależnie od typu indukującego IFN.4. mannose-binding lectin) oraz proteazy serynowe związane z MBL. Po związaniu z komórkami zainfekowanymi wirusem indukują syntezę pewnych białek. Interferony te mogą działać na komórki zainfekowane wieloma różnymi wirusami. Układ ten jest aktywowany. jak i lizozymu w płynie obmywającym gałkę oczną. major histocompatibility complex). nieswoiste uaktywnienie układu immunologicznego jest często uważane za część obrony wrodzonej. [Mannose-binding lectin: Turner (1996) Immunology Today 17: 532-549]. których poziom jest podwyższony w doświadczalnym zapaleniu trzustki. mimo iż niektóre białka aktywowane przez IFN mogą być bardziej swoiste (np. które wzmagają odpowiedź typu komórkowego (sekcja 11. np. podczas gdy droga klasyczna jest częścią odpowiedzi nabytej (sekcja 11. lecz ma podstawowe znaczenie jako cząsteczka sygnalna w odporności 286 .2) skierowaną przeciw takim komórkom. to ogólne. Wiązanie do MBL może być jednakże hamowane przez obecność otoczki bakteryjnej w przypadku takich patogenów jak np. Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. ang.4.ria patogenna (jak np. może mieć duże znaczenie dla patogennych prątków.4. 11. Klasyczna droga dopełniacza jest aktywowana przez wiele rodzajów kompleksów antygen-przeciwciało.2. Dopełniacz jest wczesną. gdy MBL zwiąże się z odpowiednimi ugrupowaniami na powierzchni osłon bakteryjnych. trypsyna) degradują składniki dopełniacza. 11. Neisseria meningitidis. IFN-y. z wytworzeniem anafilatoksyn (podpis. Haemophilus influenzae) narażona byłaby więc na lizę z powodu obecności zarówno dopełniacza.1). (Większość przeciwciał — choć nie wszystkie — należy do „wiążących dopełniacz"). Droga lektynowa może być istotna szczególnie u niemowląt w wieku od 4-6 miesięcy (kiedy tracona jest osłona w postaci matczynych przeciwciał IgG) do około 18-24 miesięcy (kiedy rozwija się bardziej skuteczny układ immunologiczny). W związku z tym. W drodze tej składnik C2a po związaniu z powierzchnią prątka działa jako konwertaza C3 (rys.2). Interferon typu 2. 11.2 Interferony Interferony (IFN) są białkami wytwarzanymi przez pewne rodzaje komórek zwierzęcych w odpowiedzi na wirusy.4. szybką i potężną formą obrony. Droga C2a. Drogi alternatywna i lektynowa należą do obrony wrodzonej organizmu. IFN-α i IΡΝ-β.2.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49. ( U w a g a : niektórzy autorzy zamiast C2a stosują symbol „C2b"). Kaskada reakcji jest przedstawiona na rysunku 11. odgrywa mniejszą rolę jako czynnik przeciwwirusowy.1).1. ang. Niektóre enzymy trzustki (np. Interferony typu 1. są istotnymi czynnikami przeciwwirusowymi. cząsteczki klasy 1 głównego układu zgodności tkankowej (MHC. opisana w roku 1997. W drodze lektynowej uczestniczy szereg składników osocza: lektyna wiążąca mannozę (MBL. rys. białko Μx. które hamuje replikację wirusa grypy). Skutecznie omija fazę Cl klasycznej drogi.1. niektóre bakterie i antygeny (sekcja 11.

Tego rodzaju synteza wymaga transkrypcyjnej aktywacji przez pewne cytokiny (tab.5. • Stymulacja syntezy składnika C3 dopełniacza (rys.4. Zabijanie Mycobacterium tuberculosis przez aktywowane przez IFN-y mysie makrofagi jest hamowane przez iNOS.4) (np. IFN-y. które działają jedynie na komórki rosnące. ang.4). 8.nabytej (sekcja 11. enzymy zawierające żelazo.4.2. Hamowanie wpływu IL-4 na limfocyty Β (sekcja 11. tuberculosis. 11.1. co jest skorelowane z brakiem iNOS.1. tab.5.3 Sekwestracja jonów Bakterie patogenne wymagają jonów pewnych metali. jest sekwestrowane przez chelatory zarówno w osoczu. 11. Należy on do obszernego systemu cytokin (tab.2). 11. niszcząc np.9.4) przez zainfekowane komórki ssacze (jako mechanizmu hamującego metabolizm żelaza przez wewnątrzkomórkowe patogeny). Żelazo. wrzody). NO (który w połączeniu z wodą i tlenem tworzy szereg aktywnych pochodnych) może zabijać patogeny. W komórkach będących celem działania naruszona jest replikacja DNA oraz wiele ważnych procesów metabolicznych.5. w deacetylazie biorącej udział w biosyntezie lipidu A: sekcja 2. iNOS katalizuje zależną od NADPH oksydatywną deaminację L-argininy do L-cytruliny i tlenku azotu (NO).1.1) w pneumocytach typu II (komórkach pęcherzyków płucnych). Jest on chelatowany przez kalprotektynę — białko uwalniane przez neutrofile ginące w miejscach zapalnych (np. że genetyczna inaktywacja IFN-y (sekcja 8. Hamowanie syntezy receptorów dla transferyny (pobierania żelaza) na zainfekowanych komórkach ssaczych (zmniejszone pobieranie żelaza hamuje wzrost wewnątrzkomórkowych patogenów).4.4. Przy leczeniu wrzodów wpływ ten może być antagonistyczny w stosunku do tych antybiotyków. [Cynk w obronie przeciw drobnoustrojom: Sohnle (1997) RMM 8: 217-224].1). 11. • Indukcja syntezy tlenku azotu (sekcja 11. IFN-y jest wytwarzany przez komórki (limfocyty) Τ aktywowane antygenem.4.1).2) powoduje zwiększoną podatność na M. na przykład. w których stężenie tego metalu może być duże.4. Ponadto. nitric oxide synthase). 11. najprawdopodobniej w wyniku sekwestracji cynku. Do jego znanych lub prawdopodobnych funkcji należą: • • • • Aktywacja makrofagów (sekcja 11. inne badania na myszach wykazały. Indukcja cząsteczek MHC klasy II. Cynk występuje w niektórych enzymach (np. jak i w wydzielinach (patrz sekcja 11.4.2.5). TNF-α).4 Tlenek azotu Po odpowiedniej aktywacji wiele rodzajów komórek (w tym makrofagi i komórki nabłonkowe) syntetyzuje indukowalną formę enzymu — syntaza tlenku azotu (iNOS. 287 .2). a sekwestracja takich jonów przez gospodarza jest jedną z form obrony konstytutywnej. Kalprotektyna ma działanie bakteriostatyczne.

288 .

4. Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-8 wykazują aktywność przeciwzapalną. TNF-β jest podobny do TNF-α. które aktywują. łzach i na powierzchniach błon śluzowych). lecz głównie przez aktywowane makrofagi. lecz może służyć jako mechanizm zapobiegający niewłaściwej aktywacji leukocytów. Niektóre receptory wiążą tylko jeden typ chemokiny (np. Dłużej trwające wytwarzanie NO może niekorzystnie oddziaływać na gospodarza. 11. lecz inne mogą się wiązać do więcej niż jednego typu. Pojedyncza komórka może być rozpoznana na podstawie jej „chemicznego wzoru".IL-8 należy do podklasy cytokin zwanych chemokinami.2. Wytwarzany jest przez limfocyty. Jedną z jej funkcji jest zmniejszenie syntezy cytokin prozapalnych.1 Przeciwciała. produkcja przeciwciał i szczepienia Niezależnie od obrony konstytutywnej. W wyniku endotoksemii w peryferycznym układzie krążenia występuje podwyższony poziom rozpuszczalnych (uwolnionych) receptorów dla TNF. że pewne leukocyty (szczególnie niektóre subpopulacje limfocytów B) wytwarzają białka zwane przeciwciałami. Może to być mechanizm zmniejszający wpływ TNF na komórki. ζ których każdy rozpoznaje inny rodzaj antygenu i wytwarza odpowiadające mu przeciwciało). IgG (najliczniejsza klasa immunoglobulin w osoczu) i IgM (duża cząsteczka — pentamer — występująca prawie wyłącznie w układzie naczyniowym). Przeciwciało w sposób swoisty reaguje z antygenem. Receptory oznaczone p55 i p75 występują na wielu typach komórek. 8 Cytokina przeciwzapalna. NO w posocznicy i endotoksemii: Parrat (998) JAC 41 (suplement A): 31-39]. Tego rodzaju cząsteczki mogą działać jak antygeny. CXC-CKR2 jest specyficzny dla chemokiny IL-8 należącej do typu CXC).4. zależnie od gatunku i szczepu patogena. To wiązanie nie ma żadnej funkcji dla erytrocytu. Receptor na erytrocytach wiąże chemokiny zarówno CXC. ich obecność w organizmie może powodować.4. to jest takich cząsteczek jak lipopolisacharydy (LPS). w którym leukocyty przemieszczają się z naczyń krwionośnych do tkanek w stanie zapalnym (sekcja 11. Pięć głównych klas immunoglobulin to: IgA (występują głównie w ślinie. organizm może również reagować w sposób swoisty na danego patogena. IgE (głównie związane z komórkami tucznymi i granulocytami zasadochłonnymi). 7 Bakterie reagują na NO zwiększoną aktywnością enzymów uczestniczących w odpowiedzi na stres tlenowy (sekcja 7.1). Na podstawie różnic w strukturze i funkcjach chemokiny dzielą się na dwa typy (CXC i CC) Receptory dla chemokin na powierzchni leukocytów to cząsteczki z superrodziny rodopsyny. że przeciwciała wiążą się do antygenów 289 . Oporność na NO może być zróżnicowana. lecz co z tego wynika? Przypuśćmy.8.8). które są dla niej charakterystyczne. wiąże się do tych samych receptorów i wykazuje podobne właściwości. Przeciwciała zaindukowane przez danego patogena mogą się z nimi wiązać. który zaindukował jego powstanie (u osobnika dorosłego występują miliony różnych rodzajów limfocytów Β. IgD. 11. jak i CC. jak również siebie nawzajem. takich jak TNF-α i IL-1β.2 Odporność nabyta 11.2). Wszystkie przeciwciała są immunoglobulinami — białkami występującymi we krwi i innych płynach ustrojowych (rys. (NO (wpływ na patogeny i gospodarza): Piedrafita i Liew (1998) RMM 9: 179-189. Odgrywają ważną rolę w procesie. TNF-α i IL-β stymulują własną produkcję. tzn. Chemokiny wykazują chemotaksję do szczególnych subpopulacji leukocytów. 9 TNF-α jest wytwarzany przez wiele typów komórek.2.

Dwie stykające się ze sobą części łańcuchów ciężkich tworzą tak zwany fragment Fc. takich jak wielocukrowce pneumokoków (sekcja 11.Cząsteczka ta. Co więcej. to jest cząsteczką złożoną z pięciu promieniście ułożonych monomerów. nosi nazwę fragmentu Fab. które charakteryzują się powtarzalnym wzorem determinantów antygenowych.1) IgG. formując ramiona litery Y. lecz w płynach pozanaczyniowych. ślina. odcina (jako jeden kawałek) obydwa fragment Fab. lecz jedynie u tych.2. IgG.1). odpowiada za około 5-10% immunoglobulin w osoczu. Przeciwciała IgG zwykle dominują po zmianie klasy w odpowiedzi typu humoralnego na antygeny (sekcja 11. (takich jak lipopolisacharyd) na powierzchni komórki. Kiedy się to zdarza. większość kompleksów antygen-przeciwciało aktywuje dopełniacz (sekcja 11. w którym fragmenty Fc dwóch monomerów są połączone łańcuchem J oraz fragmentem wydzielniczym. wraz z regionem zawiasowym. IgM jest pentamerem. Wśród wszystkich przeciwciał (sekcja 11.4. co również sprzyja opsonizacji (sekcja 11.1). IgA w osoczu występuje głównie w formie monomeru o masie cząsteczkowej -160000. tworząc cząsteczkę o kształcie litery Y. Inny enzym.1). jak łzy. IgG. Przeciwciała IgM zwykle powstają jako pierwsze w odpowiedzi typu humoralnego i są główną klasą przeciwciał powstających przeciw antygenom grasiczoniezależnym.2. będąca glikoproteiną. Przeciwciała te mogą przejść przez łożysko. o masie cząsteczkowej -150000. 290 . Część ta nosi nazwę F(ab')2· Na wolnym końcu każdego fragmentu Fab występuje miejsce wiązania antygenu. komórka ta staje się bardziej podatna na fagocytozę (sekcja 11.4. które składa się z łańcucha lekkiego i części łańcucha ciężkiego. chroniąc płód i noworodka. Obydwa fragmenty Fab można odciąć od cząsteczki za pomocą enzymu papainy. wydzielinach w układzie oddechowym i pokarmowym (w którym jest dominującym typem Ig). IgM).1). U człowieka nie przekraczają one łożyska ani bariery krew-mózg. Rozchodzą się one w regionie zawiasowym.4. składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch identycznych łańcuchów ciężkich (dłuższe linie) oraz dwóch łańcuchów lekkich (krótsze linie). Dany allotyp nie występuje u wszystkich osobników danego gatunku. jak również w układzie krwionośnym. pepsyna. stanowi około 75% immunoglobulin w osoczu. które mają odpowiedni allel w swoim genotypie (allel jest jedną z kilku zmienionych form danego genu). Termin izotyp odnosi się do klasy immunoglobulin (np. z czego większość należy do podklasy IgG1. IgD i IgE mają opisaną wyżej formę monomeru. Termin idiotyp odnosi się zespołu determinantów immunogennych występujących w części zmiennej określonego przeciwciała. Cztery łańcuchy są ze sobą związane wiązaniami disulfidowymi (SS) oraz innymi. Allotyp określa zmienioną formę cząsteczki immunoglobuliny.1).4. o masie cząsteczkowej -970000. Każde ramię. Dany izotyp występuje u wszystkich zdrowych osobników danego gatunku. IgM.4. Przeciwciała IgG odgrywają ważną rolę jako opsoniny i antytoksyny w płynach pozanaczyniowych.4. ma charakter dimeru zwanego wydzielniczym IgA (s-IgA). Przeciwciała IgM szczególnie dobrze aglutynują LPS oraz inne substancje. połączonych swoimi fragmentami Fc.2.

Jednakże. Taki typ antygenu nosi nazwę grasiczoniezależnego (TI. Przeciwciała mogą wydać się mało istotne w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych. niżej. fizjologicznie czynnych substancji (jak histamina). z których wiele wiąże się do receptorów na komórkach tucznych i granulocytach zasadochłonnych. jak wielocukier otoczkowy Haemophilus influenzae typu b. Takie antygeny TI.1) przez Chlamydia lub Salmonella lub pośredniczyć w ADCC w przypadku Coxiella. antigen-presenting cell). W przypadku alergii na penicylinę pierwszy kontakt z tym antybiotykiem powoduje pojawienie się większego niż prawidłowy poziomu przeciwciał IgE. do których należą komórki dendrytyczne 291 . thymus independent). to jest uwolnienie różnych. ang.2). grasiczozależny antygen musi być najpierw pobrany i przetworzony przez komórki prezentujące antygen (APC. nie wywołują lub prawie nie wywołują odpowiedzi w postaci przeciwciał u niemowląt i dzieci do drugiego roku życia. 11. Najprawdopodobniej wynika to z niedojrzałości u nich limfocytów B. ang. Aby spowodować powstanie przeciwciała. Przy następnym kontakcie penicylina (antygen) wiąże się do tych przeciwciał IgE na powierzchni komórek tucznych i granulocytów zasadochłonnych. Przeciwciała skierowane przeciw toksynom (antytoksyny) mogą po związaniu się z nimi neutralizować ich aktywność.Inną konsekwencją wiązania przeciwciała do komórki bakteryjnej jest cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (sekcja 11. Ujemna strona przeciwciał widoczna jest w przypadku pewnych reakcji nadwrażliwości — w tym alergii na takie antybiotyki jak penicylina. nie indukują one limfocytów pamięci (patrz niżej).2. chociaż antygeny Ή powodują proliferację swoistych limfocytów Β i powstawanie przeciwciał. Jest to bardzo ważne w kontekście szczepień ochronnych — patrz szczepionki sprzężone. które mają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała. pozostawiając miejsca wiązania antygenu na powierzchni tych komórek.2). Mechanizm powstawania przeciwciał różni się zależnie od rodzaju antygenu.4. powodując ich degranulacje. ponieważ wewnątrz komórek gospodarza bakterie te są chronione zarówno przed przeciwciałami. które są pożyteczne działając przeciw patogenom przenoszonym przez krew. podczas gdy antytoksyny (patrz niżej) mogą neutralizować wydzielane toksyny [Casadevall (1998) TIM 6: 102-107].2. Niektóre duże cząsteczki o powtarzających się podjednostkach — np. a wytworzone przeciwciała są prawie wyłącznie klasy IgM (rys. Na przykład przeciwciała skierowane przeciw składnikom bakteryjnych osłon komórkowych mogą blokować wstępną adhezję (sekcja 11. Powstawanie przeciwciał. Jednakże przeciwciała są pomocne i w tym przypadku. wielocukry tworzące otoczkę bakteryjną — mogą powodować wytwarzanie przeciwciał przez swoiste limfocyty Β bez pomocy limfocytów T. Powstały kompleks toksyna-antytoksyna jest usuwany przez pewne leukocyty. ponieważ limfocyty Τ dojrzewają w grasicy. Większość antygenów — np. rozpuszczalne białka — są typu grasiczozależnych. mniejsze cząsteczki. Przyczyniają się one do wytwarzania przeciwciał przez limfocyty Β jedynie przy współudziale limfocytów T. jak i przed dopełniaczem. czego skutkiem może być nawet śmiertelny szok anafilaktyczny.

Τ helper. Presją selekcyjną najprawdopodobniej jest zmniejszające się stężenie antygenu. takiego. będącego wynikiem proliferacji po stymulacji antygenem.i makrofagi.). Przełączanie klas powstających immunoglobulin odbywa się w centrach rozrodczych grudek limfatycznych w śledzionie i węzłach limfatycznych. który nie zetknął się z odpowiadającym mu antygenem) może spowodować rozwój komórki w jednym z dwóch kierunków — zależnie od obecności swoistych cytokin. Τ pomocnicze. tzn. IL-2 i IFN-α. W procesie tym następuje selekcja mutantów z proliferujących. Ta wzmożona wtórna odpowiedź odzwierciedla np. ang. Limfocyt Τ rozpoznaje i łączy się z kompleksem przetworzonego antygenu i cząsteczki MHC klasy II — antygen wiąże się do receptora limfocytu Τ (TCR. W obecności IL-12 pochodzącej od makrofagów mogą się rozwinąć + cechy charakterystyczne dla subpopulacji Th1 limfocytów Τ typu CD4 . antygen łączy się z cząsteczką MHC klasy II (syntetyzowanej w komórce prezentującej antygen) i jest prezentowany na powierzchni komórki limfocytowi T. zazwyczaj IgG — aczkolwiek zachowują tę samą swoistość (nadal pasują do danego antygenu). Innym skutkiem interakcji między limfocytami Β i C jest to. 292 . Th. lecz później należą one do innej klasy. które mogą stymulować proliferację i różnicowanie niektórych (antygenowo swoistych) limfocytów B. że niektóre limfocyty Β stymulowane przez antygeny tworzą komórki pamięci. Limfocyty Τ biorące udział w powstawaniu przeciwciał należą do subpo+ pulacji CD4 (syn. w obecności IL-4 pochodzącej od limfocytów Τ mogą się rozwinąć cechy charakterystyczne dla komórek Th2. po pocięciu enzymatycznym). ang. które wydzielają np. Niektóre antygenowo swoiste limfocyty Β stają się komórkami plazmatycznymi. W takich przypadkach do wytworzenia przeciwciał mogą wystarczać wyłącznie pobudzone limfocyty Β i Τ oraz limfocyty Β prezentujące antygen.4). Τ cell receptor) wiążącego antygen. lecz trwają latami w postaci pobudzonej. stymulowanych antygenem. IL-5 i IL-10. która swoiście reaguje na dany antygen. która wiążąc się z cząsteczką MHC klasy II pomaga stabilizować kontakt między limfocytem Τ a komórką prezentującą antygen i uczestniczy w transdukcji sygnału po nawiązaniu kontaktu między komórką prezentującą antygen i limfocytem T. 11. Komórki te mogą wytwarzać np. Najpierw powstają przeciwciała klasy IgM. co prowadzi do syntezy różnych klas przeciwciał. Alternatywnie. Po przetworzeniu (to jest np. które związały dany antygen. limfocytów Β pod kątem wysokiego powinowactwa do antygenu. Tam. W odpowiedzi wtórnej komórki Β i Τ są już pobudzone na skutek wcześniejszego kontaktu z antygenem. + Stymulacja antygenowa dziewiczego limfocytu Τ typu CD4 (tzn. cytokiny pochodzące od limfocytów Τ uczestniczą w procesie zmiany ekspresji genów w limfocytach B. IL-4. istnienie rozszerzonego klonu (swoiście reaktywnych) limfocytów B. Grudki limfatyczne są również miejscem dojrzewania powinowactwa. wytwarzają przeciwciała pasujące do danego antygenu. mogąc szybko i skutecznie reagować na pojawienie się tego samego antygenu. CD4 jest cząsteczką na powierzchni (koreceptorem) umiejscowionym blisko TCR. Aktywowany limfocyt Τ wydziela cytokiny (tab. Komórki te nie wytwarzają przeciwciał.

Tego typu szczepionka powoduje powstawanie przeciwciał ochronnych już w czwartym miesiącu życia. Dlatego też rozwój szczepionek przeciw ETEC (tab. szczepionki sprzężone.2. ponieważ dzieci te nie reagują odpowiednio na antygeny w rodzaju wielocukrów (patrz powstawanie przeciwciał. gdy antygeny te działają za pośrednictwem układu immunologicznego nabłonka jelita. dobrą ochronę przed patogennymi bakteriami jelitowymi uzyskuje się jedynie wtedy. Na przykład. a obecnie ta nowa generacja szczepionek jest stosowana w Europie. zapalenie nagłośni) powodowanymi przez Haemophilus influenzae typ b (Hib). Szczepionka — zawierająca antygeny danego patogena (np.1). Cytokina IL-4 pochodząca z Th2 może powodować zmianę klasy przeciwciał na IgE. Przyszły kontakt z danym patogenem stymuluje energiczne wytwarzanie swoistych przeciwciał w wyniku odpowiedzi wtórnej (patrz wyżej). gdyż niemowlęta zwykle są chronione przez pierwszych sześć miesięcy życia przez przeciwciała pochodzące od matki.2). tzw. Celem szczepienia jest pomoc organizmowi w obronie w razie ataku ze strony danego patogena. rzadziej.4. podczas gdy 11-10 hamuje rozwój komórek Th1. a jednocześnie zapewniają taką samą ochronę. 11. wyżej). Organizm reaguje na szczepionkę wytwarzając odpowiadające jej przeciwciała. Do tych ostatnich należą szczepionki z inaktywowaną toksyną błoniczą oraz (zazwyczaj) składnikami fimbrii. Szczepienia. zabite komórki lub składniki komórkowe) — jest wprowadzana przez wkłucie lub. [Ten years' experience with Hib conjugate vaccines in Finland: Eskola i Kayjty (1996) RMM 7: 231-241]. doustnie [szczepionki doustne (problemy i rozwiązania): Dougan (1994) Microbiology 140: 215-224). gdyż dają niewystarczającą ochronę. zapalenie płuc. parapertussis [Willems i Mooi (1996) RMM 7: 13-21]. albo frakcję bezkomórkową. Jest to czas odpowiedni. Szczepionki przeciw krztuścowi (patogenem jest Bordetella pertussis) zawierają albo całe komórki.5. Nowe szczepionki bezkomórkowe wykazują znacznie mniejsze działanie uboczne (w porównaniu z komórkowymi).Znaczenie subpopulacji Thl i Th2 polega na tym. 293 . [Responsiveness of infants to capsular polysaccharides: Rijkers i wsp. II-2 z komórek Th1 może stymulować wzrost limfocytów T. Dają one jednak słabszą ochronę przed chorobami powodowanymi przez B. Dysponujemy skuteczną szczepionką sprzężoną do ochrony przez chorobami (np. aktywować makrofagi i wzmagać aktywność komórek CD8+ (sekcja 11. Szczepionki bezkomórkowe są w powszechnym użyciu w Japonii od roku 1981. (1996) RMM 7: 3-12]. podczas gdy IFN-α pochodzący od Th1 może aktywować makrofagi i powodować zmianę klasy przeciwciał na IgG w aktywowanych limfocytach B.2) jest ukierunkowany na doustny sposób ich podawania (a nie dojelitowo) [Gaastra i van der Ziejst (1996) RMM 7: 165-177]. Bakterie patogenne mające otoczki wielocukrowe mogą powodować różnego typu choroby u małych dzieci (sekcja 11. także nie są już zalecane dojelitowe szczepionki przeciw cholerze. Na przykład. Dla małych dzieci skutecznymi szczepionkami są wielocukry sprzężone z białkiem. Powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenom patogena może być stymulowane przez wprowadzenie tych antygenów do organizmu (szczepienie). że wytwarzając różne grupy cytokin wpływają na rozmaite aspekty odpowiedzi immunologicznej.

Poliwalentne szczepionki sprzężone (obejmujące większą liczbę serotypów) byłyby kosztowne. Jednakże. tężec) może nastąpić śmierć zanim organizm odpowiednio zareaguje przeciwciałami.1.5). by zapobiec chorobie. Anatoksyna indukuje zatem wytworzenie przeciwciał skierowanych przeciw toksynie. [Challenges in vaccinology: Poolman (1996) RMM 7: 73-81]. Szczepienie przeciw tego typu toksynie (jak tetanospazmina — sekcja 11. aczkolwiek nadal pozostają problemy z heterogennością antygenową dotyczącą różnych szczepów tego patogena [Ferreiros. Szczepionka zawierająca kilka tych białek (uczestniczących w różnych stadiach patogenezy) mogłaby zapewnić lepszą ochronę niż szczepionki obecnie dostępne [Paton (1998) TIM 6: 85-87]. która nie jest szkodliwa. Do zastosowanych antygenów należą powierzchniowe receptory dla syderofilin (sekcja 11.Wdrażane obecnie szczepionki sprzężone przeciw Streptoccus pneumoniae są skuteczne jedynie wobec niewielkiej liczby rozmaitych serotypów tego patogena. że białko Β Actinobacillus pleuropneumoniae wiążące transferynę może indukować przeciwciała. 294 . Połączenie toksyny z przeciwciałem znosi jej szkodliwe właściwości i pomaga eliminować ją z organizmu.3.1. Szczepienie często stymuluje tworzenie przeciwciał w organizmie pacjenta. Podobnie jak różne składniki patogena działają jako antygeny.3. Szczepionki sprzężone przeciw meningokokowemu zapaleniu opon mózgowych dały obiecujące rezultaty jedynie dla serogrupy C Neisseria meninigitidis. łącznie z toksynami. Szczepienia zwykle stosuje się profilaktycznie. Procedura ta zwie się immunizacją bierną. Jedno z wcześniejszych badań (u świń) wykazało. w pewnych chorobach wywoływanych przez toksyny (np. Białka receptorowe N. które blokują pobieranie żelaza przez patogena.5. atenuowanym szczepem Mycobacterium bovis podawanym podskórnie. W niektórych przypadkach podaje się przeciwciała preformowane.3) wiąże się z podaniem zmodyfikowanej formy toksyny. chroniąc zwierzęta przed zetknięciem się z homologicznym szczepem patogena. również w ten sposób mogą działać produkty bakteryjne. TbpB) są potencjalnymi antygenami dla szczepionki przeciw zapaleniu opon mózgowych.2) często do leczenia używa się surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała preformowane skierowane przeciw toksynie. meningitidis dla transferyny (TbpA. Jednakże. zwanej anatoksyną. Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37]. odzwierciedlając zróżnicowany stopień stykania się z prątkami w środowisku. Szczepionka przeciw gruźlicy.11) po delecji genów patogena kodujących niektóre czynniki wirulencji [Waldor i Mekelanos (1994) JID 170: 278-283]. BCG (franc. Dalsze badania są w toku. Skuteczność ochronna BCG w dużym stopniu zależy od położenia geograficznego. lecz zachowuje właściwości antygenowe. Jednak w botulizmie (sekcja 11. jest żywym. niektóre jednak białka (antygeny grasiczozależne) występują w osłonach komórkowych prawie wszystkich klinicznych szczepów dwoinki zapalenia płuc i charakteryzują się niewielką zmiennością antygenową. bacille Calmette-Guerin). Szczepionki. odzwierciedlają absolutny wymóg dotyczący tego pierwiastka. Są obecnie opracowywane żywe szczepionki przeciw szczepowi O139 Vibrio cholerae (sekcja 11.

Cząsteczki MHC klasy I występują na powierzchni większości komórek organizmu zawierających jądro. Jest to inaczej. mówi się. że podstawową rolą tych komórek jest reakcja na wewnątrzkomórkowe patogeny. których antygeny znajdują się na powierzchni komórki. 295 . i 2) indukując apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). pochodzi ze stymulowanych przez antygen limfocytów CD4+. (1997) JCM 35: 679-684].1) — chociaż odpowiednie czynniki mogą zaindukować ich obecność na niektórych innych typach komórek. a każda nich wiąże antygen swoisty dla jej receptora.1 pisaliśmy. gdy: 1) stanowi on część powierzchni komórki i 2) jest połączony z cząsteczką MHC.4. W ten sposób można otrzymać dużą populację identycznych (monoklonalnych) przeciwciał. ta metoda niszczenia komórek ogranicza rozprzestrzenianie się patogena do innych komórek. Cechy wiązania antygenów przez limfocyty Τ sugerują. By zabić komórkę gospodarza. które rozpoznają specyficzne antygeny. przez wykorzystanie „piętnowanych" monoklonalnych przeciwciał.2 Odpowiedź typu komórkowego Odpowiedź typu komórkowego to rodzaj reakcji immunologicznej. przez interleukinę 2 (IL-2). monoclonal antibodies) znajdują wiele zastosowań. lecz przeciwnie. [Monoclonal antibodies specific for E. Występowanie cząsteczek MHC klasy II zwykle ogranicza się do komórek prezentujących antygen (sekcja 11. Limfocyty T. Przeciwciała monoklonalne (mAbs. Ponieważ wiązanie limfocytów Τ jest ograniczone do powierzchni zawierających cząsteczki MHC.4. limfocyty Τ subpopulacji CD8+ wiążą się do. komórki gospodarza prezentujące antygeny pewnych patogennych bakterii połączone z cząsteczką MHC klasy I.2.4. tzw. Tego typu limfocyty Τ zwane są komórkami cytotoksycznymi (Tcyt).1). Niektóre limfocyty Τ typu CD4+ mogą mieć właściwości komórek cytotoksycznych. W przynajmniej niektórych przypadkach IL-2. Głównymi komórkami efektorowymi w odpowiedzi typu komórkowego są limfocyty T. 11. że odpowiedź limfocytów Τ podlega ograniczeniu (restrykcji) przez MHC (w sekcji 11. między innymi do wykrywania specyficznych drobnoustrojów. odpowiedzi typu humoralnego.2. w której efektorami są bezpośrednio komórki. wiążą antygen jedynie wtedy. ang. w przeciwieństwie do limfocytów B.4. [A kinetic view of Τ cell behaviour (krótki artykuł przeglądowy): Lanzavecchia. Lezzi i Viola (1999) Cell 96: 1-4]. która może się namnażać jak komórka nowotworowa i wytwarzać przeciwciała typu określanego przez limfocyt. coli O157:H7 LPS: Westerman i wsp. W istocie. że komórki CD4+ są ograniczone przez MHC II).Przeciwciała monoklonalne. cytotoksyczne limfocyty Τ muszą najpierw ulec aktywacji. w której uczestniczą wolne przeciwciała.2.2. np. które uległy zróżnicowaniu do komórek Th1 (sekcja 11. Cytotoksyczne limfocyty Τ niszczą komórkę docelową: 1) uwalniając czynniki letalne (w tym cząsteczki tworzące pory w błonie komórkowej — perforyny). Po fuzji limfocytu Β ζ komórką nowotworową powstaje hybrydoma. Są one zależne od MHC. niż w przypadku odpowiedzi. nie tylko nie wiążą wolnego antygenu. jak się wydaje. i zabijają. Ponieważ apoptoza nie jest związane z lizą.

takie geny mogą być „genami wirulencji". Powodem tego jest narastająca oporność bakterii na antybiotyki oraz powrót i nasilenie się starych problemów (takich jak gruźlica). bakterie opłaszczone przeciwciałami ulegają lizie przez pewne limfocyty. Można je badać np. które na swojej powierzchni posiadają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała (rys. U świnki morskiej i człowieka dojrzałe gruzełki mają serowaty. IVET wykrywa te geny patogena. 296 . technologii ekspresji in vivo (IVET. zdegenerowane miejsca infekcji) przynajmniej w części są spowodowane znacznym zagęszczeniem aktywowanych makrofagów wydzielających czynniki cytotoksyczne.5. Jednakże. z wykorzystaniem szczepów patogena z mutacją w badanym genie.Istnieją również dwie formy niszczenia komórek.3. których promotory są aktywne jedynie podczas infekcji gospodarza.5. monocyty i komórki cytotoksyczne. Stymulacja limfocytów Τ typu CD4+ przez specyficzny antygen może prowadzić do ogólnego uaktywnienia układu immunologicznego. uszkodzenia towarzyszące gruzełkom gruźliczym (miejscowe. odpowiedź immunologiczna na Mycobacterium tuberculosis może pomóc w niszczeniu komórek Listeria monocytogenes wewnątrz makrofagów — nawet wobec braku nabytej odporności na tę bakterię. ponieważ limfocyty nie penetrują do środka zmienionego miejsca. W cytoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał. w testach na zwierzętach. że peryferyczne rozmieszczenie limfocytów jest powodem centralnej martwicy obserwowanej w większych gruzełkach [Orme (1998) TIM 6: 94-97].3). W gruźlicy. Odporność typu komórkowego w niektórych chorobach nie potrafi zapobiec uszkodzeniu tkanek — lub nawet przyczynia się do tego. Zarys innej nowej metody. nekrotyczny (martwiczy) środek otoczony makrofagami oraz zewnętrzną okrywę z monocytów i limfocytów (fot. który aktywuje(niespecyficznie) każdego wrażliwego makrofaga w otoczeniu. Badania dotyczące patogenezy nabrały przyśpieszenia po wprowadzeniu nowych „molekularnych" metod. 11.) (sekcja 8. Na przykład. 11. lecz pozostają na zewnątrz. in vivo expression technology) przedstawiono na rysunku 11. że dogłębne poznanie przebiegu choroby wewnątrz gospodarza może stworzyć nowe cele dla chemioterapii lub zasugerować alternatywne metody działania. jak mutageneza transpozonowa i mutageneza typu signature-tagged (ang. przez IFN-y wydzielany przez limfocyty. Stymulowane limfocyty Τ wytwarzają IFN-α. Wydaje się. Sugeruje się więc. które rozpoznają komórki zainfekowane przez wirusy oraz komórki nowotworowe.2). ang. Podczas powstawania uszkodzenia. stężenie IFN-y w środkowych częściach dużego gruzełka może być zbyt małe. Wśród komórek tych znajdują się neutrofile (granulocyty obojętnochłonne). które nie są zależne od MHC. 11. by aktywować makrofagi (które prawdopodobnie wtedy giną). W innym procesie uczestniczą naturalne komórki cytotoksyczne. makrofagi są aktywowane np.3).5 Patogen — czynniki wirulencji Patogenność bakterii (szczególnie mechanizmy in vivo) jest obecnie przedmiotem niezwykle intensywnych badań.

serowatej masy martwicznej tkanki. Warstwa makrofagów nabłonkowych jest otoczona zewnętrzną warstwą ciemno wybarwiających się limfocytów. które pomagają patogenom zadomowić się w gospodarzu i uniknąć jego układów obronnych. Produkty bezsprzecznie agresywne. są oczywiście czynnikami wirulencji. 297 . Jest to wielojądrzasta komórka. Gruzełek klasyfikowany jest jako zmiana ziarniniakowa. Niektóre z tych czynników omówione są niżej. Każda olbrzymia komórka Langhansa tworzy się w wyniku fuzji wielu makrofagów.Typowe części gruzełka są wskazane niżej. Centrum gruzełka składa się z bezpostaciowej. Jednakże. takie jak toksyny. takimi czynnikami są też te produkty i strategie. w której jądra są rozmieszczone peryferycznie w cytoplazmie. Zachowanie bakterii wewnątrz gospodarza oraz metodologia jego badania została omówiona przez Smitha [(1998) TIM 6: 239-243].

1. gen CAT czasem zwany jest genem reporterowym). że promotor jest aktywny 298 . Jeśli promotor jest aktywny w hodowli. 8. że gen.4. jeśli wytwarza acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT). któremu do pokarmu dodano antybiotyk chloramfenikol (sekcja 15.4. W tych warunkach zrekombinowana komórka rośnie. który w zwykłych warunkach jest pod kontrolą promotora. czy promotor kontrolujący gen CAT jest czynny jedynie wewnątrz badanego zwierzęcia. Tego typu gen jest obiektem zainteresowania.Rysunek przedstawia jedną z kilku form IVET (inne są opisane na końcu legendy). będą się wbudowywać do różnych miejsc chromosomowych w różnych komórkach.1. które nie wytwarzają CAT.5. jeśli promotor jest aktywny. powyżej promotora. Aby dalej zbadać aktywność promotora. tworzy się β-galaktozydaza (sekcja 8. a kolonie będą niebieskozielone. odzyskiwane bakterie wysiewa się na podłoże pozbawione chloramfenikolu. obydwa geny ulegną transkrypcji. że β-galaktozydaza (i CAT) powstają jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym.4). że dany promotor ulega aktywacji nie tylko w zwierzęciu laboratoryjnym.5). Musimy wiedzieć. Biała kolonia (lac) świadczy o tym. tworząc heterogenną populację zrekombinowanych komórek.1) do populacji komórek patogena. co oznacza. że jej gen CAT jest pod kontrolą promotora aktywnego wewnątrz badanego zwierzęcia (ponieważ synteza CAT odzwierciedla aktywny promotor. W niektórych z tych komórek. Ponieważ cząsteczki wektora zawierają różne fragmenty chromosomu. zgodnie z ramką odczytu. ulega indukcji podczas infekcji. i wszystkie powinny wyrosnąć. co świadczy o tym. W takich komórkach. strona prawa) są wprowadzane na drodze transformacji (sekcja 8. wskazuje to. gdy patogen jest namnażany np. Komórki wytwarzające CAT tworzą duże populacje znacznie liczniejsze niż te. gdyż może mieć związek z wirulencją. IVET wykrywa te geny patogena.5. Zrekombinowane komórki wykorzystuje się do infekcji zwierzęcia laboratoryjnego. Cząsteczki wektora (część górna. że dana zrekombinowana komórka rośnie. W każdej komórce jakiś fragment chromosomu z wektora wbudowuje się do odpowiadającej mu części chromosomu patogena (na zasadzie mechanizmu insercji-duplikacji: rys. czy jest też aktywny.21a). dwa geny pozbawione promotorów będą wstawione. na podłożu agarowym. Jeśli jest aktywny jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym. to jest jeśli gen CAT (w wektorze) jest pod kontrolą aktywnego promotora.5). oznacza. które są indukowane (włączone: podczas infekcji gospodarza zwierzęcego. Zatem fakt. lecz zawierające X-Gal (sekcja 8.

13) oraz zbudowana z kwasu D-glutaminowego otoczka Bacillus anthracis.1) i 3) fagocytozą. przynajmniej in vitro. wyłącznie podczas infekcji zwierzęcia. Na przykład.1 Unikanie fagocytozy W przypadku niektórych patogenów ich fagocytozie zapobiega obecność otoczki (sekcja 2. Jedno z tych białek. Wycięty transpozon nie ulega replikacji. transposaza jest syntetyzowana i następnie wycina transpozon. Yersinia spp. U gronkowca złocistego białko A będące składnikiem ściany komórkowej wiąże się do części Fc przeciwciał (rys.2). oxidative burst). geny pozbawione promotorów kodujące transpozazę (sekcja 8. 299 . Otoczki te zazwyczaj nie chronią przed fagocytozą u dorosłych i starszych dzieci z prawidłowym układem immunologicznym.1). Conner i Mahan [(1997) TIM 5: 509-513]. np.5. można sklonować. i zbadać jego rolę w wirulencji. dla niektórych szczepów Streptococcus pyogenes otoczka zbudowana z kwasu hialuronowego (składnik tkanek zwierzęcych) jest rodzajem „kamuflażu". która zwykle wiąże się do receptora Fc na powierzchni fagocyta.1. Przykłady zastosowań IVET można znaleźć w pracy: Heithoff.2. aktywność β-galaktozydazy wykorzystywana jest do wykrycia promotorów nieczynnych w hodowli. zsekwencjonować itp. Neisseria meningitidis i Streptococcus pneumoniae. struktury tworzone przy współudziale aktyny [The Yersinia Yop regulon: Cornelis and Wolf-Watz (1997) MM 23: 861-867]. (1998) MM 27: 953-965]. narusza. YopH. unika fagocytozy w inny sposób.11. Inna wersja IVET wykorzystuje auksotroficzną populację (sekcja 8. Haemophilus influenzae typ b (Hib).1.3) oraz β-galaktozydazę.2. Zasada metody jest podobna jak opisano wyżej.2) patogena. Innymi inhibitorami fagocytozy są białko Μ paciorkowców (sekcja 2. który zwykle jest pod kontrolą tego promotora. Obydwa te geny są pozbawione promotorów.4. Białko YopJ wpływa na obniżenie poziomu syntezy pewnych kinaz i tym samym hamuje wytwarzanie prozapalnej cytokiny TNF-α W makrofagach [Palmer i wsp. Tak jak wyżej. 11. Gen. Każda cząsteczka wektora niesie geny kodujące dany czynnik wzrostowy i β-galaktozydazę.2.4. Inne wydzielane białko. Jednak niemowlęta i małe dzieci słabo reagują przeciwciałami na wielocukry i w tej grupie wiekowej wymienione patogeny mogą powodować zapalenie opon mózgowych oraz infekcje dróg oddechowych. 2) wzmożoną opsonizacją za pośrednictwem dopełniacza (sekcja 11. wytwarza otoczki wielocukrowe. prowadząc do powstania klonu komórek wrażliwych na tetracyklinę. Po kontakcie z fagocytem bakteryjny system sekrecji typu III (sekcja 5. który defosforyluje pewne białka gospodarza. wykorzystując równolegle podłoża pozbawione tetracykliny i zawierające ten antybiotyk. W kolejnej wersji IVET. Komórki te można wykryć metodą replik (sekcja 8. która 1) rośnie jedynie na podłożu agarowym wzbogaconym w odpowiedni czynnik wzrostowy. YopE. to jest do tej części. o ile nie jest obecny odpowiedni czynny gen.2). jest enzymem.11). który reaguje: 1) produkcją przeciwciał skierowanych przeciw wielocukrom. wybuchu tlenowym (ang. każda cząsteczka wektora zawiera transpozon kodujący oporność na tetracyklinę.4) wstrzykuje do niego kilka białek.1. Jeśli promotor jest aktywny w zwierzęciu laboratoryjnym. Wiele bakterii. Stało się to przyczyną rozwoju i wprowadzenia szczepionek sprzężonych (sekcja 11. Białka te w formie ufosforylowanej uczestniczą w procesie fagocytozy oraz tzw. lecz 2) nie rośnie w organizmie zwierzęcia laboratoryjnego.

2. Na przykład. W przypadku B. szczególnie PMN.3. HlyA w dużym stężeniu może powodować lizę różnych komórek. Gronkowcowa leukocydyna Pantona-Valentine'a powoduje swoistą lizę makrofagów i leukocytów PMN (ang. które mogą zmieniać ramki odczytu w genach opa. IpaB wiąże się do. U Helicobacter pylori zmienność antygenowa wiąże się z rekombinacją między genami o zbliżonych sekwencjach.3. polymorphonuclear leucocytes). a bakterie izolowane z krwi podczas każdego nawrotu gorączki mają inne antygeny powierzchniowe. coli. (1996) EMBO Journal 15: 3853-3860].4).7). i aktywuje.8. (1997) Nature 388: 539-547]. Toksyna RTX Pasteurella hemolytica (czynnik sprawczy chorób układu oddechowego u krów) wywołuje lizę bydlęcych PMN.5.11.2). w durze powrotnym (powodowanym przez gatunek z rodzaju Borrelia) zachodzi kilka cykli gorączki i remisji. przeprowadza nieczynną IL-1β do formy aktywnej i inicjuje apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki) w makrofagu [Chen i wsp. Rekombinacja tego typu odpowiada za zmienność fazową u Salmonella (rys. Możliwe jest też. które wydzielają niektóre gronkowce i paciorkowce. Zmienność fazowa adhezyn Opa Neisseria wiąże się z rearanżacjami w DNA. w którym bierze udział białko IpaB kodowane przez plazmid. kodujących różne białka powierzchniowe. 8.2) — między poszczególnymi plazmidami w danej komórce. Sekwencje charakterystyczne dla tego typu mechanizmu zostały odnalezione w genomie tej bakterii [Tomb i wsp. Patogen jelit Shigella flexneri po fagocytozie może wydostać się z wakuoli i zabić makrofaga za pomocą mechanizmu. Enzym ten. Do tak zwanych patogenów toksyn RTX gramujemnych należy hemolizyna HlyA E.3c). z kolei. w uniknięciu skutków działania swoistych przeciwciał. Zmienność antygenowa jest najprawdopodobniej wynikiem rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8. Może to być pomocne dla bakterii.5. Białko to jest wydzielane przez system sekrecji typu III (sekcja 5.2 Komórki cytotoksyczne układu immunologicznego Fagocyty mogą być zabijane przez pewne substancje (leukocydyny). 11. enzym makrofaga przekształcający IL-1β. 300 . hermsii antygeny podlegające zmienności są kodowane przez wielokopiowy plazmid liniowy. uszkadzając ich błonę komórkową. choćby przejściowo.3 Zmienność antygenowa Niektóre bakterie patogenne mogą zmieniać skład chemiczny swoich struktur powierzchniowych i co za tym idzie — swoje antygeny. Toksyny RTX w niższych stężeniach mogą hamować tworzenie przeciwciał i sprzyjać patogenezie poprzez wywoływanie szkodliwych stanów zapalnych [RTX toxins (artykuł przeglądowy): Coote (1996) RMM 7: 53-62]. że zmienność jest wynikiem zmiany ramki odczytu w translacji (sekcja 7. Aktywowana IL-1β może indukować odpowiedź zapalną (wytworzenie pewnych cytokin) w patogenezie czerwonki (sekcja 11.

3.3. W wyniku aktywacji. Ponieważ cytokiny mają szeroki zakres funkcji (tab. Superantygeny mogą aktywować zarówno komórki DD4+.4 Moduliny Moduliny to czynniki wirulencji. Tego typu wiązanie powoduje proliferacje limfocytów Τ oraz wydzielanie cytokin. TNF-α i IFN-α są indukowane w komórkach jednojądrzastych przez białko A. ang. superantygeny (sekcja 11. W przypadku gryzoni anergia wobec danego antygenu może trwać miesiącami.11.4.) na komórce prezentującej antygen (sekcja 11. Wynikające z tego masywne uwolnienie cytokin (z limfocytów T. tak jak na przykład w szoku endotoksycznym (sekcja 11. Białko A działa również jako czynnik antyfagocytarny wirulencji.1) i toksyny podobne do toksyny shiga (które indukują TL-1α. to jest aktywacja wielu różnych typów limfocytów C. Poszczególne superantygeny mogą preferencyjnie wiązać się do odmiennych łańcuchów Vb (wpływając w ten sposób na różne subpopulacje limfocytów T). 301 . IL-1β i IL-6 w monocytach). IL-6 i TNF-α w makrofagach). odpowiedź zapalną). tak by był obecny cały zakres odmiennych antygenów. Są zatem potrzebne do skutecznej ochrony przed patogennymi drobnoustrojami.4.2.4) i są ważnymi czynnikami fizjologicznymi.) może prowadzić do stanu zwanego zespołem wstrząsu toksycznego (TSS. Poole i Wilson (1996) MR 60: 316-341]. Cytokiny 11-1. Do modulin należą endotoksyny (sekcja 11. Do możliwych terapeutycznych zastosowań superantygenów należy supresja swoistych subpopulacji limfocytów Τ lub aktywacja limfocytów Τ ο aktywności przeciwnowotworowej. silnie wiążącym się do tych limfocytów T. a zwierzę przejawia (przejściowo) brak reakcji (anergię) na dany antygen.4. które występuje na powierzchni większości szczepów Staphylococcus aureus. które zazwyczaj koordynują aktywność różnych składników układu immunologicznego (np.4). efektem jest aktywacja poliklonalna.5. patrz też sekcja 11.1). IL-6. lecz u ludzi zjawiska tego nie obserwuje się. i równocześnie mogącym wiązać się do cząsteczki klasy II głównego układu zgodności tkankowej (MHC. Na przykład u gryzoni większość komórek danej subpopulacji następnie zamiera. ang. 11. IL-4. wiążąc część Fc przeciwciał IgG. Ponieważ populacja limfocytów Τ wyrażających dany łańcuch Vb obejmuje wiele indywidualnych klonów (z których każdy jest specyficzny dla danego. toxic shock Syndrome) (sekcja 11.5. ich niewłaściwa aktywność może prowadzić do efektów patologicznych. Cytokiny są białkami sygnałowymi. które mogą być szkodliwe dla gospodarza z powodu indukowania nieodpowiedniej aktywności różnych cytokin [Henderson.11) oraz prawdopodobnie również do zespołu Kawasaki.6).5.1 Superantygeny Superantygen A jest białkiem wydzielanym przez pewne patogeny. komórek prezentujących antygen itp. unikalnego antygenu). wiążąc się do łańcuchów Vb w miejscach będących poza rejonem wiązania antygenu.3. jak i CD8+.4. fragmenty mureiny (peptydoglikanu) ściany bakteryjnej (które indukują np. których receptory wyrażają dany łańcuch Vb. 11. komórki danej subpopulacji ulegają proliferacji. major histocompatibility complex.

Jednakże.2.5.4) zaproponował Leoni i wsp. lecz może ono być trudno dostępne w organizmie gospodarza. [(1996) JB 178: 2299-2313]. wiążącymi się do łańcucha VH receptora na tych limfocytach. (1998) MM 29: 527-543]. Aerobaktyna skutecznie konkuruje z transferyną [Accjuisition of transferrin-bound iron by pathogens (artykuł przeglądowy): Cornelissen i Sparling (1994) MM 14: 843-850]. streptococcal superantigen A). siderofor z klasy hydroksamatów. które wiążą kompleks żelazo-syderofor. Salmonella typhimurium koduje syderofor z grupy katecholamin — enterochelinę. wiele patogenów koduje własny system pobierania żelaza w postaci syderoforu. u E. ang. Gen kodujący TSST-1 znajduje się na mobilnej wyspie patogenności (sekcja 11. in. coli siderofor zwany enterocheliną (syn.5. Do superantygenów należą enterotoksyny Staphylococus aureus (enterotoksyna F = toksyna 1 zespołu wstrząsu toksycznego) (TSST-1. zwana paciorkowcowym superantygenem A (SSA. Na przykład w układzie krwionośnym ssaków glikoproteina gospodarza o właściwościach chelatujących żelazo. np. toxic shock Syndrome toxin 1) oraz pewne toksyny paciorkowców grupy A. w tym paciorkowcowa egzotoksyna A. Aby poradzić sobie z tym problemem.8.7) i sugerowano. ang. wiąże żelazo i przekazuje je do komórek. tak zwana transferyna. oraz receptorów na powierzchni komórki bakteryjnej. W cytoplazmie żelazo uwalniane jest dopiero po rozszczepieniu sideroforu przez 3+ 2+ esterazę. typhimurium białko Fur jest również regulatorem odpowiedzi o charakterze tolerancji na kwasowość środowiska (sekcja 7. że owa mobilność może być przyczyną rozprzestrzeniania się toksygenności TSST-1 u Staphylococcus aureus [Lindsay i wsp. do syntezy niektórych enzymów i/lub cytochromów. coli (np. który po związaniu żelaza łączy się z receptorem w błonie zewnętrznej. enterobaktyna) najpierw wiąże się do receptora (białko FepA w błonie zewnętrznej).„Superantygeny limfocytów B" są analogicznymi cząsteczkami. Patogenne. aeruginosa. W przypadku Pseudomonas aeruginosa brak żelaza inicjuje syntezę zielonożółtego fluoryzującego sideroforu — piowerdyny. kliniczne znaczenie superantygenów dla limfocytów T: Michie i Cohen (1998) TIM 6: 61-65].5 Patogenność i żelazo Patogeny wymagają żelaza m. a następnie zostaje przeniesieny do wnętrza komórki. te. pozajelitowe szczepy E.6). jest związana z regulacją przez białko Fur. Fe ulega redukcji do Fe . podobnie jak w przypadku piowerdyny P. które wywołują zapalenie opon mózgowych u noworodków) często wytwarzają aerobaktynę. który stymuluje wzrost patogena nawet w obecności transferyny. Teoretycznie. 11. 302 . niskocząsteczkowego chelatora jonu żelazowego wydzielanego przez patogena. której ekspresja. [Superantygeny (artykuł przeglądowy): Fleischer (1995) RMM 6: 49-57. Mechanizm regulowanej przez żelazo indukcji piowerdyny (rys. siderofory mogłyby po prostu przenosić żelazo ze środowiska do receptorów na powierzchni komórki. 11. U S.

(b) Gdy stężenie żelaza jest niewystarczające. Co więcej. Actinobacillus pleuropneumoniae. Receptor na powierzchni komórki bakteryjnej składa się z dwóch białek — TbpA i TbpB. który jest niezbędny do transkrypcji innych genów uczestniczących w biosyntezie piowerdyny. a nie u ludzi. Jednakże. hamując transkrypcję genu pvdS. Egzochelina odbiera żelazo od chelatorów gospodarza (syderofilin: transferyny i/lub laktoferyny) i przekazuje je do mykobaktyny. Do innych sposobów zdobycia żelaza przez patogeny należą: asymilacja hemu po lizie erytrocytów oraz wykorzystanie wewnątrzkomórkowego żelaza gospodarza. Szczepy tych patogenów. są wirulentne jedynie w tych gatunkach gospodarza. w których receptory są efektywne. Produkt pvdS (PvdS) jest czynnikiem sigma (patrz sekcje 7. pozwalając na transkrypcję pvdS. że patogen namnaża się jedynie w gospodarzach/tkankach/komórkach.(a) W odpowiednich stężeniach żelaza. Z kolei zaś.5 i 7. Niektóre patogeny uzyskują żelazo bezpośrednio z syderoforów gospodarza. jak również rodzaje wrażliwych tkanek/komórek. laktoferyna w wydzielinach. Listeria mono- 303 . zwanym mykobaktyną. kiedy organizm ten wnika pomiędzy komórki jego ściany. Neisseria gonorrhoeae ma receptory dla ludzkiej transferyny.9). Transferyna występuje w osoczu. ma receptory powierzchniowe dla transferyny świńskiej. Metody do zdobycia żelaza przez danego patogena określają. w których ma dostęp do odpowiedniej ilości żelaza. gdy znajduje się w świetle żołądka. Fur nie wiąże się do obszaru Fur.8. jedynym źródłem żelaza jest hem. jakie gatunki gospodarza są podatne na zakażenie przez tego patogena. Mycobacterium tuberculosis do wzrostu zewnątrzkomórkowego wykorzystuje syderofor egzochelinę oraz związany ze ścianą bakteryjną lipidowy związek. który wiąże się do specyficznych receptorów w błonie zewnętrznej. które nie potrafią wiązać siderofilin (z powodu braku receptorów). Dzieje się tak dlatego. białko Fur (produkt genu fur) silnie wiąże się do wysoce konserwatywnego regionu DNA (obszaru Fur). są awirulentne. Helicobacter pylori uzyskuje żelazo z laktoferyny. meningitidis wiąże transferynę człowieka i niektórych innych naczelnych. szczepy. przynajmniej częściowo. a N. która uczestniczy w internalizacji. które wytwarzają receptory. na przykład. represor transkrypcji. a więc organizm ten powoduje zapalenie płuc u świń.

[Gaastra i van der Zeist (1996) RMM 7: 165-177].14.1). występujących w środowisku oraz w ssaczych gospodarzach. W wielu przypadkach adhezyny są fimbriami (sekcja 2. inwazyna (Yersinia enterocolitica). to jest plazmidach. Adhezyna TCP Vibrio cholerne jest ważna nie tylko z powodu uczestnictwa w procesie adhezji. Absolutne wymagania patogenów dotyczące żelaza doprowadziły do badania możliwości wyprodukowania nowych szczepionek stymulujących wytwarzanie przeciwciał skierowanych przeciw powierzchniowym receptorom dla siderofilin (patrz sekcja 11.5. lecz również jako receptor dla faga. która rozpoznaje wszystkie te rodzaje chelatorów. 11. wykazują powinowactwo do składników zewnątrzkomórkowej matriks komórek ssaków.2) dysponują ponad 10 rodzajami fimbrii działających jako adhezyny. jak kolagen i fibronektyna [Foster i Hook (1998) TIM 6: 484-488]. tj. Niektóre adhezyny mają popularne nazwy. zwane są adhezynami.4. internalina (Listeria monocytogenes).2.cytogenes powoduje schorzenia bydła. nie musi zatem wytwarzać osobnych receptorów dla każdego chelatora.2.1).2. które przyczyniają się do adhezji. Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495]. reduktazę żelazową. Struktury czy cząsteczki na powierzchni komórki bakteryjnej. Wyspy te charakteryzują się 304 . ponieważ ma zdolność wykorzystywania syderoforów innych bakterii. Wyspy takie występują w chromosomie i/lub w pozachromosomowych elementach.2) i często są kodowane przez plazmidy. Patogen ten najprawdopodobniej wykorzystuje enzym związany z powierzchnię jego komórki. oraz kilkoma rodzajami adhezyn nie będących fimbriami. intymina 11.2. owiec i ludzi. Patrz: Dehio.5. a dana bakteria może wytwarzać kilka ich rodzajów.5. Istnieją różnego typu adhezyny. EPEC). 11.8). jak również różnych związków chelatujących żelazo.6 Adhezyny Zdolność patogena do adhezji na specyficznych komórkach w tkankach gospodarza jest często ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11. Adhezyny białkowe Staphylococcus aureus. Wszystkie patogenne szczepy z rodzaju Neisseria kodują adhezyny białkowe zwane Opa. Do tych ostatnich należą też paciorkowcowe białka Μ (sekcja 2. który promuje rozprzestrzenianie się wśród szczepów patogena genów kodujących tę toksynę (sekcja 11. Szczepy ETEC (tab. Rolę żelaza w patogenezie wyczerpująco omówiono w artykule Weinberga [(1998) RMM 9: 171-178].13). jak (szczepy EHEC.7 Wyspy patogenności Wyspa patogenności [artykuł przeglądowy: Groisman i Ochman (1996) Cell 87: 791-794] to zbiór lub „kaseta" kilku do wielu genów kodujących zespół czynników wirulencji. które zazwyczaj są związane z peptydoglikanem (mureiną) ściany komórkowej.

11. Jednakże. w koniugacji). że ich nabywanie następuje w wyniku „horyzontalnego transferu genów" (np. że czynnik. położony jest poniżej genu selC (który koduje selenocysteinylo-tRNA).3. wydajność konwersji lizogennej tych szczepów przez CTXO (pocho+ dzącego z koinfekującego szczepu CT ) jest o prawie milion razy większa. kodujący czynniki. coli (UPEC) zawiera inną wyspę patogenności (PAI-1 o wielkości 70 kz kodującą np. infekuje niektóre szczepy V.1) w odpowiedzi na sygnały w środowisku jelita. który koduje toksynę cholery (sekcja 11. który w warunkach laboratoryjnych wydaje się nie przenosić.1. W warunkach in vitro (laboratoryjnych) fag CTXO. Jednakże.2). przy pomocy których patogen wytwarza charakterystyczne zmiany — „ang. Do innych (chromosomowych) przykładów należą wyspa kodująca TCP u Vibrio cholerae (sekcja 11.5. Region ten.3. Do ciekawostek należy to.1) oraz wyspa cag u Helicobacter pylori [Tomb i wsp. 305 . 11. że sygnały wewnątrz organizmu ssaka będącego środowiskiem dla bakterii mogą sprzyjać transferowi toksygenności pomiędzy szczepami infekujących bakterii. które następnie służą jako receptory dla faga CTΧΦ. Kaper (1998) TIM 6: 169-172].zazwyczaj inną zawartością par GC niż w chromosomie danej bakterii.1. attaching and effacing lesions" (sekcja 11. że procent GC w zespole genów wirulencji Listeria monocyłogenes jest podobny do tego w pozostałej części chromosomu.2. Ciekawe jest. Gen toksyny zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1) Staphylococcus aureus znajduje się na mobilnej wyspie patogenności [Lindsay i wsp. Kilka wyraźnych wysp patogenności występuje u Salmonella. coli może po nabyciu wyspy LEE lub PAI-1 przeistoczyć się odpowiednio w EPEC lub UPEC.1). Wydaje się przeto. co sugeruje. locus of enterocyte effacement) [patrz np. której miejsce integracji w chromosomie jest dokładnie takie samo.1). gdyż importowane geny muszą funkcjonować w zespole genów całego chromosomu. że uropatogenny szczep E.8 Wpływ środowiska gospodarza na transfer czynników wirulencji pomiędzy infekującymi bakteriami Niedawne badania wskazują. że niepatogenny szczep E.3. (1997) 388: 539-547]. Jednym z przykładów jest region chromosomów wielkości 35 kz w szczepach EPEC (tab.1. cholerae CT~ z bardzo mała częstością. samo nabycie wyspy patogenności nie gwarantuje zmiany w patogenie. Ta zwiększona wydajność konwersji wydaje się wynikiem indukcji pilusów TCP (sekcja 11. Przykład ten jest dobrą ilustracją ogólnego rozprzestrzeniania się czynników wirulencji. bowiem jest wysoce prawdopodobne. a jedna z nich jak się wydaje. (1998) MM 29: 883-891]. wyspa patogenności LEE (ang. wewnątrz jelita myszy. hemolizynę). specyficznie przyczynia się do enteropatogenności (w przeciwieństwie do salmonellozy układowej) [Wood i wsp. w środowisku in vivo czyni to z łatwością [patrz Mel i Mekalanos (19966) Cell 87: 795-798]. (1998) MM 29: 527-543].

powodowana przez krętka Treponema pallidum. które monitorują ekspresję genów patogena podczas infekcji zwierząt będących gospodarzem.1.2). Podobną indukcję fimbrii.7 Rozprzestrzenianie się choroby W niektórych chorobach patogen zazwyczaj nie przechodzi od jednego osobnika do drugiego.2).1).4. • Fosforylacja przez gospodarza białka wydzielanego przez bakterię — białko to następnie ulega insercji do błony komórkowej gospodarza. że przebieg patogenezy może być znacznie bardziej złożony niż wcześniej myślano.5. Wilson i Wren (1997) TIM 5: 454-458]. który nie może przetrwać dłuższy czas poza organizmem.2.5. Do przykładów znanych lub proponowanych interakcji należą: • zwiększona synteza miejsc receptorowych komórek gospodarza w wyniku wstępnego związania Bordetella pertussis (sekcja 11. w tym np. 8. Inne choroby bezpośrednio lub pośrednio przenoszą się między osobnikami (ludźmi lub lub zwierzętami).3). • Bakteryjna indukcja cytoszkieletowych rearanżacji w komórce gospodarza przed inwazją (sekcja 11. 11. co powoduje wzrost podatności gospodarza z powodu zwiększonej syntezy miejsc receptorowych wiążących toksynę (sekcja 11. Jest teraz jasne.1). Informacji dotyczących aktywności patogenów wewnątrz ich gospodarzy dostarczają różne nowe metody. a sprawcą zazwyczaj jest patogen. że patogeny często „manipulują" funkcjami komórek gospodarza oraz że niektóre bakterie chorobotwórcze mają wspólne mechanizmy jego eksploatacji [artykuł przeglądowy: Finlay i Cossart (1997) Science 276: 718-725].3.5.2). Jedynie stosunkowo rzadko przeniesienie choroby wymaga bezpośredniego kontaktu między osobnikiem zakażonym i zdrowym. Geny gospodarza uczestniczące w interakcjach między patogenem a nim samym zbadano przy pomocy myszy z „nokautami" genowymi (sekcja 8. Przykładem może być choroba weneryczna kiła. Przykładami są tężec i zgorzel gazowa.5. Zdolność toksyn do wpływania na populację cytokin gospodarza jest dość częsta [Henderson. w warunkach in vivo. W schorzeniach tych patogen zazwyczaj pochodzi z gleby. • Indukcja specyficznych adhezyn na powierzchni Vibrio cholerae przez sygnały płynące z jelitowego środowiska gospodarza (sekcja 11. • Indukcja cytokin za pośrednictwem toksyn. • Indukcja „samobójstwa" (apoptozy) komórki gospodarza przez patogena (sekcja 11.22) i IVET (rys.11.2. STM (rys. gdzie pełni funkcję receptora dla patogena (sekcja 11.6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa Badania na poziomie molekularnym wykazały. tab.6). 11.8).2. 306 . 8. a nie od innego zakażonego osobnika. opisano dla szczepu ETEC kodującego STb.

2). można zbadać stosując procedurę amplifikacji wykorzystującą PCR.1. Przykładami chorób przenoszonych w ten właśnie sposób są gruźlica. krztusiec i błonica.3). o ile występowały one na powierzchniach układu oddechowego.3.2 i 13. czerwonka.Większość chorób przenosi się pośrednio z jednej osoby na drugą w sposób.3). dżumę dymieniczą (gruczołową) (powodowaną przez Yersinia pestis) przenoszą pchły. Kiedy ktoś kaszle lub kicha lub nawet głośno mówi. choroba Whipple'a (sekcja 11. Taka najwyraźniej zdrowa osoba. Określenie „durowa Mary" jest czasami używane w odniesieniu do rzeczywistego lub potencjalnego nosiciela duru brzusznego lub innych chorób. Tradycyjne metody badań i opisów są nadal powszechne. czy też jest przeciek ścieków do źródła wody pitnej (patrz też sekcje 12. zanim została zidentyfikowana. Niektóre bakterie patogenne są przekazywane od jednej osoby do drugiej za pośrednictwem wektora. który na ogół wiąże się z najczęstszą drogą infekcji (sekcja 11. zwykle przenoszą się z zakażoną wodą lub żywnością. patrz np. W ten sposób zwykle rozprzestrzenia się zapalenie żołądkowo-jelitowe. będąca źródłem patogennych organizmów. Często można prześledzić przechodzenie patogena — poprzez żywność lub wodę — do osobnika(ów) cierpiących na daną chorobę. które zakażają poprzez przewód pokarmowy. Czasami źródłem patogena jest osoba. a nie dające się wyhodować w laboratorium. Niektóre z nich w zarysie przedstawiono niżej. drogą kropelkową.1. dur brzuszny i cholera. Ponieważ najmniejsze z tych kropelek utrzymują się w powietrzu przez dłuższy czas. będąc zatem przenosicielami patogena.5. Może się to zdarzyć. a tularemię (wywoływaną przez Francisella tularensis) — gryzące muchy lub kleszcze.3. Na przykład. Tego typu roznoszenie choroby na ogól jest związane z zanieczyszczeniem wody lub żywności przez kał pacjenta cierpiącego na dana chorobę. Kropelki te mogą zawierać organizmy patogenne. zwana jest nosicielem. Kolejny przykład to gorączka Oroya (sekcja 11. 307 . patogeny. zaraziła prawie trzydzieści osób. gdy mucha domowa siada na przemian na kale i żywności. Jedna „sławna" nosicielka. która nie choruje.8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium Szybkie wykrycie. kucharka Mary Mallon. Patogeny zakażające poprzez układ oddechowy często są rozprzestrzenianie tzw.11). Na przykład. dur wysypkowy (Rickettsia prowazekii) — wszy. Bakterie podejrzane o spowodowanie choroby. lecz jest gospodarzem dla patogena i tym samym rezerwuarem infekcji. kiedy osoba pracująca przy żywności ma ślady kału na rękach. mogą być wdychane przez inne osobniki. identyfikacja i typowanie patogena jest szczególnie ważne w niektórych chorobach i niekiedy bywa możliwe z użyciem technik wykorzystujących kwasy nukleinowe: sekcja 16. przez pewien czas w powietrzu pozostają zawieszone drobniutkie kropelki wydzielin błon śluzowych wydostające się z ust.6.3. 11.

np.5.1. bulionu tryptozowo-sojowego. metodą Eleka (sekcja 11. np. Do skutecznej izolacji 308 .1 Hodowle krwi Hodowle krwi wykorzystuje się np. Do wykrycia lub identyfikacji organizmów w hodowlach krwi można stosować metodę PCR (sekcja 8. Próbkę kału można zawiesić w roztworze Ringera. Do hodowli stosuje się podłoże wzbogacające (sekcja 14.1. do wykrywania drobnoustrojów przenoszonych przez krew. W niektórych przypadkach bakteriemii izolowane są beztlenowce (np.11. SPS hamuje PCR i jego usunięcie z próbek stosowanych do PCR ułatwia wykrycie bakteryjnego DNA w podłożach do hodowli krwi [Fredericks i Relman (1998) JCM 36: 2810-2816]. a następnie część zawiesiny użyć jako inokulum.6) w podłożach beztlenowych.8. 2) obecność. w takich chorobach jak dur brzuszny. Można w ten sposób uzyskiwać szybkie wyniki oraz wykrywać bakterie nie dające się wyhodować lub uszkodzone przez antybiotyk.2).3. Świadczą o tym choćby dane dotyczące częstości występowania bakteriemii powodowanej przez bakterie beztlenowe.8.8. Tego typu podejście sprzyja również identyfikacji fakultatywnych tlenowców (sekcja 3. Podłoże zwykle uzupełniane jest czynnikiem hamującym krzepnięcie krwi. zakażona żywność) podejrzane o obecność egzotoksyny bada się za pomocą różnych metod (patrz np. inhibitorów PCR. Problemami w tej metodzie są: 1) konieczność stosowania tradycyjnych hodowli do badania podatności na antybiotyki (dopóki nie stanie się dostępna technologia wykorzystująca do tego celu kwasy nukleinowe). Zaszczepione podłoże inkubuje się i codziennie bada robiąc wysiewy na odpowiednie podłoże stałe. 3) niemożność określania intensywności bakteriemii (to jest miana bakterii w próbce krwi) techniką PCR.8. jak heparyna. moczu lub kału. a otrzymany osad użyć jako inokulum. mocz można odwirować.3) do 50-100 ml podłoża. Problemem jednak jest to. ropy. Hodowlę Corynebacterium diphtheriae można zbadać pod kątem toksykogenności (zdolności do wytwarzania toksyny) np. By założyć hodowlę. heminy. Bacteroides fragilis).1. oraz czynników przeciwzakrzepowych. Wybór podłoża oraz warunków inkubacji zależy od inokulum i rodzaju prawdopobnego patogena.1. Wprowadza się 5-10 ml krwi pobranej sterylnie od pacjenta (sekcja 14. gdzie to możliwe) podejmowane są próby wyhodowania patogena z próbki np.1. Niektóre handlowe podłoża do hodowli krwi mogą zawierać polianetosulfonian sodowy (SPS) jako czynnik zapobiegający krzepnięciu krwi oraz anty-dopełniacz.1 Wyhodowanie patogena i wykrycie toksyny Często (tam.1). Zarys procedury hodowli w krwi podano w sekcji 11.1). a czasem również enzymami inaktywującymi antybiotyki przeniesione wraz z krwią. chociaż ten problem może da się rozwiązać stosując techniki rozcieńczania. w związku z czym pożyteczne są próby równoczesnego wykrywania tlenowców i beztlenowców. śliny. że obecnie stosowane podłoża do hodowli krwi nie są idealne do tego celu.4) poprzez amplifikację bakteryjnego DNA z użyciem starterów swoistych dla danego gatunku.2. w hodowlach krwi. przede wszystkim bakterii. 11. Próbki (np. sekcja 12.1.

1. w którym światło ultrafioletowe skierowane jest na obiekt od góry.beztlenowców powinno się stosować podłoża redukowane. Na wytwarzanie toksyny przez dany szczep wskazuje powstanie po inkubacji białawych linii precypitatu. Próbkę surowicy najpierw ogrzewa się (56°C/40 min).1.4. odzwierciedlającą ilość swoistego przeciwciała w próbce surowicy. 11. 11. Wynik odczytuje się po 25-48 godzin inkubacji. jeśli po dodaniu do mieszaniny swoistego antygenu i dopełniacza surowicy zajdzie wiązanie.9) zawierającym mieszaninę drobnoustrojów. Światło widzialne pochodzące od związanych. w 4°C.4. a następnie wykonuje się serię rozcieńczeń. (1997) JCM 35: 495-498].3. Zatem. Obecność przeciwciał przeciw konkretnemu patogenowi może wskazywać na trwające lub przeszłe zakażenie tą bakterią. fluoresceiną). Konieczne jest stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej.8. Sposób przygotowania testu jest pokazany w fotografii 11. to jest toksykogennych i nietoksykogennych szczepów C.2.1) jest wiązany przez większość typów kompleksów antygen-przeciwciało (sekcja 11.8. ang. część dolna) pozwala na odczyt już po 16 godzinach [Engler i wsp. tzn.8. Ulepszona forma tego testu (fot. preparat ogląda się pod mikroskopem epifluorescencyjnym. sterylizowane w warunkach beztlenowych [Anaerobic blood culture: Goldstein i wsp. Precypitat ten jest wynikiem połączenia toksyny i antytoksyny. (1997) RMM 8: (suplement 1) S87-S89]. oznacza się za pomocą CFT.1) swoiste dla danego organizmu są najpierw chemicznie wiązane z fluoryzującym barwnikiem (np. 11. Obecność/brak oraz ilość swoistego przeciwciała 309 .1). Po spłukaniu niezwiązanego koniugatu. Test wiązania dopełniacza Test wiązania dopełniacza (CFT. by zniszczyć własny dopełniacz pacjenta. Efekt taki oraz jego wielkość.2.4 (część górna). Przeciwciała (sekcja 11. Dopełniacz (sekcja 11. Do każdego rozcieńczenia dodaje się standardową ilość swoistego antygenu i całość inkubuje się przez 18 godz.4. 11. fluoryzujących przeciwciał widziane jest tak jak zwykle. complement-fixation test) może być wykorzystany do wykrywania swoistych przeciwciał w próbce surowicy. oznacza to. które dyfundują z linii wzrostu oraz paska papieru. za pośrednictwem obiektywu mikroskopu.4.2 Mikroskopia immunofiuorescencyjna Technika ta pozwala na wykrycie specyficznego typu organizmu w rozmazie (sekcja 14. Koniugat (zawiesina przeciwciał połączonych z barwnikiem) zostaje dodany do rozmazu. że zawiera ona przeciwciała pasujące do antygenu.2 Wykrywanie toksyny błonicznej — płytka Eleka Metodą tą wykrywa się toksynę bloniczną Corynebacterium diphtheriae. diphtheriae. Wiązanie w danej mieszaninie reakcyjnej powoduje zmniejszenie ilości wolnego dopełniacza.

8. diphtheriae szczep NCTC 10648 jest mocną kontrolą pozytywną. Po 24-48 godz. diphtheriae: pięć szczepów testowych. W środku płytki umieszcza się krążek nasączony antytoksyną. C. że szczep obok pozytywnej kontroli wytworzył linie precypitatu.1.2). UK. Zwróć uwagę. 310 . Tego rodzaju „linie identyczności" wskazują. które zlewają się dokładnie z kontrolą. Przed inkubacją. Szczep pozytywny jest u góry. Central Public health laboratory. Ta forma testu jest oparta na metodologii stosowanej w Rosji i na Ukrainie. ulegający dyfuzji produkt. a szczepy badane i kontrolne (pozytywne i negatywne) nanoszone są wokół niego. na obecność szczepu toksygennego wskazuje cienka linia białawego precypitatu toksyny-antytoksyny (sekcja 11.Część górna: metoda standardowa. Public Health Laboratory Service. Zwróć również uwagę. tak jak na fotografii. a NCTC 10356 jest kontrolą negatywną. równolegle. Τ to toksynogenny szczep (dwukrotnie na tej samej płytce). London. że szczepy kontrolny i badany tworzą podobny. że ostatnia linia wzrostu (kontrola negatywna) nie tworzy linii precypitatu. siedem szczepów C. na podłoże położono pasek bibuły filtracyjnej impregnowanej antytoksyną (surowicą zawierającą przeciwciała przeciw toksynie błonicznej). jeden kontrolny szczep pozytywny (toksygenny) i jeden negatywny (metoksygenny). Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Kathryn H. NCTC jest szczepem słabo pozytywnym. Część dolna: metoda zmodyfikowana. Na odpowiednie podłoże wzrostowe wysiano rysą. negatywny u dołu. Engler. inkubacji.

Zapewniają one wysoką czułość przy ograniczonej rozdzielczości będącej wynikiem drogi rozpadu cząsteczek radioaktywnych w emulsji fotograficznej. jak i w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie. wszystkie erytrocyty ulegają lizie w największym stężeniu surowicy. że po utworzeniu kompleksu z antygenem cały dopełniacz został związany. co jest szczególnie istotne w przypadku długiego czasu wzrostu (np. Wadą metodologii wykorzystującej radioizotopy są jednak związane z nimi zagrożenia oraz koszty.3) często można wykryć patogenne bakterie in situ — wewnątrz zakażonej tkanki. Postały dopełniacz oznacza się przez dodając do każdego rozcieńczenia system hemolityczny. to nie zawiera ono już dopełniacza i nastąpiło maksymalne związanie antygen-przeciwciało. Wykonując CFT należy pamiętać o odpowiednich kontrolach. 311 . Bezpośrednie wykrycie patogenów za pomocą ISH (ang. Po drugie. 11. przy tym rozcieńczeniu surowicy stężenie przeciwciał było na tyle wysokie. Początkowo do badań wykorzystywano radioizotopy. to jest zawiesinę „uczulonych" erytrocytów. przeciwciała nie muszą być wykrywalne na każdym etapie infekcji. Jeśli.w danym rozcieńczeniu surowicy określa się na podstawie ilości wolnego (nie związanego) dopełniacza.5 Hybrydyzacja in situ (ISH) i hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (FISH) Stosując znakowane sondy (sekcja 8. że surowica ta zawierała cały dodany dopełniacz. ISH rozróżnia wirulentne i niewirulentne szczepy patogena na podstawie sond wykrywających geny kodujące swoiste czynniki wirulencji.5. Dobrym przykładem CFT jest klasyczny test Wassermana wykrywania kiły. Sondy zawierają sekwencje nukleotydów specyficzne dla danego szczepu lub gatunku. AIDS).4 Test immunoenzymatyczny Test immunoenzymatyczny (ELISA. Inaczej mówiąc.8. które w obecności dopełniacza ulegają lizie. in situ hybridization) ma dwie główne zalety. ogólnie rzecz biorąc. u których słaba reakcja immunologiczna może wykluczyć stosowanie testów serologicznych ukierunkowanych na przeciwciała przeciw konkretnym patogenom. Co więcej. Oznacza to. to test jest ujemny. Mycobacterium leprae).5. 11. które hybrydyzują z komplementarnymi sekwencjami w DNA lub RNA patogena.8. tygodnie dla Mycobacterium tuberculosis) lub jeśli w ogóle nie daje się go hodować (np. Jeśli w danym rozcieńczeniu surowicy nie następuje liza erytrocytów (komórki sedymentują). a zatem brak w niej wykrywalnych przeciwciał. enzyme-linked immunosorbent assay) jest bardzo czułym sposobem wykrywania swoistych antygenów lub przeciwciał. Zasada tego testu jest przedstawiona na rysunku 11. ang. ISH może być użyteczny w diagnozie u pacjentów z niedoborem układu immunologicznego (np. z kolei. Gatunki z rodzaju Mycobacterium wykryto metodą ISH zarówno w świeżo zamrożonych skrawkach zakażonej tkanki. Po pierwsze ISH wykrywa patogena zanim da się go wyhodować.

USA). Jest oczywiste. (b) Pojedyncze. Charakterystyka patogena Czysta hodowla patogena może być badana za pomocą metod i testów zarysowanych w rozdziale 16. są następnie wymywane. że każdej chorobie.1). Wykrycie enzymu polega na dodaniu odpowiedniego substratu..11. które nie związały się. związane przeciwciało jest wykrywane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciw immunoglobulinie. powodując jego wyznakowanie przez enzym. Wykrycie enzymu pozwala na stwierdzenie tego przeciwciała.1). na wewnętrznej powierzchni probówki z tworzywa sztucznego. często można stworzyć metody mające zapobiec lub ograniczyć jej rozszerzanie się. ulegający amplifikacji na skutek ciągłej aktywności enzymatycznej. Eugene. sekcja 16. Molecular Probes Inc. fluorescence in situ hybridization) oraz znakowania sond oligonukleotydowych są łatwo dostępne (np. dla których antygenami są również specyficzne przeciwciała. Zestawy do FISH (ang. tzn. Zazwyczaj pozwalają one na identyfikację do poziomu gatunku (lub serotypu. takich.1. jak rozprzestrzenia się dana choroba. Przeciwciała.4. Obecnie szeroko wykorzystuje się znakowanie fluorescencyjne (oraz mikroskopię epifluorescencyjną). Różne aspekty metodologii ISH i FISH są omówione w specjalnym wydaniu Histochemical Journal [(1995) 27: 1-99].8.5. każde przeciwciało antyimmunoglobulinowe jest chemicznie sprzęgnięte ze szczególnym enzymem. Kompleks przeciwciało antyimmunoglobulinowe-enzym (trójkąt) wiąże się do pojedynczego związanego przeciwciała. a następnie wprowadzony w kontakt z surowicą.(a) Specyficzny antygen (pełne kółka) jest immobilizowany np.9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych Gdy już wiemy. który w obecności enzymu daje wykrywalny produkt. 11. której rozprzestrzenianie się następuje poprzez bezpośredni 312 . Podatność danej bakterii patogennej na pewien zakres antybiotyków (tak zwany antybiogram) często określa się za pomocą testu dyfuzji krążkowej (sekcja 15. 11. Przed użyciem.6. Pojedyncza cząsteczka specyficznego przeciwciała wiąże się z odpowiadającym jej antygenem.

użycie maski na twarz) jest mało praktyczne.4. gotowaniem lub środkiem dezynfekującym. np.1). W przypadku innych chorób zakaźnych. kiedy już nie stanowią potencjalnego źródła patogena. 3) ochrona wody pitnej przed zakażeniem przez ścieki oraz skuteczna ochrona komunalnych zapasów wody przez np.7). takie jak antybiotyki. 4) odkażanie niewielkich ilości wody przed spożyciem. Liczne z nich wykazują oporność na wiele anty- 313 . na które kiedyś były niezmiennie wrażliwe (sekcja 15. w durze plamistym i dżumie dymieniczej.11). w zapaleniu opon mózgowych) chemioterapia zostaje zainicjowana przez potwierdzeniem etiologii. Pewne patogeny są obecnie oporne na antybiotyki. Co więcej. Prawdopodobieństwo to określa się na podstawie takich czynników. jak dur brzuszny i cholera może być zahamowane przez odpowiednie środki. jak: 1) poprawa higieny osobistej — np. to jest terapię wykorzystującą związki chemiczne. gdy patogen oraz jego podatność na antybiotyki znane są przed rozpoczęciem leczenia. izolowanie i leczenie nosicieli (sekcja 11. Zazwyczaj trudniej jest poradzić sobie z chorobami rozprzestrzeniającymi się drogą kropelkową. Skuteczna może też być izolacja (kwarantanna) chorych do momentu. a głównym środkiem zapobiegawczym w takich chorobach jak błonica jest szczepienie (sekcja 11. Rozprzestrzenianie się takich chorób. jeśli ich stosowanie nie uwzględnia specyficzności i farmakologii.10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii Dostępność szerokiego zakresu antybiotyków (sekcja 15. • Lokalne występowanie szczepów opornych na antybiotyki. np. chlorowanie. Fizyczne wykluczenie kropelek (np. Idealna jest sytuacja. Tego typu kontrola znajduje zastosowanie np. że do wielu chorób wywołanych przez bakterie można stosować chemioterapię.4.kontakt fizyczny. lecz w niektórych przypadkach (np. np. mycie rąk po wizycie w toalecie.4) oznacza. 2) ochrona żywności przed muchami i innymi owadami mogącymi przenosić patogeny oraz zmniejszenie ilości tych przenosicieli przez stosowanie środków owadobójczych.2. Do czynników wpływających na wybór antybiotyku należą: • Skuteczność wobec danego patogena. 5) wykrycie. Skuteczność antybiotyków można zaprzepaścić. jak: lokalne występowanie konkretnego gatunku lub szczepu patogena oraz wieku pacjenta [przykład (zapalenie opon mózgowych u dzieci): Schaad (1997) RMM 8: 171-178]. można zapobiec po prostu unikając zakażonych osobników. zapobieganie lub kontrola może się wiązać z zablokowaniem drogi zakażenia. Choroby przenoszone przez wektory można kontrolować eliminując wektor lub ograniczając jego liczebność. Wówczas chemioterapia jest ukierunkowana na prawdopodobne patogeny. zastosowanie nieodpowiednich antybiotyków może zniweczyć szansę wyleczenia choroby i przyczynić się do pogłębienia problemu oporności na te związki. halazon. 11.

4. Sulfonamidy (sekcja 15. Po 314 . W pewnych chorobach (botulizm.2. ampicylina). Fizykochemiczne właściwości antybiotyku mogą mieć wpływ na jego dotarcie do konkretnej tkanki daną drogą. Usuwanie penicyliny przez proksymalne kanaliki nerkowe można zahamować stosując inny lek. Na przykład. • Możliwość teratogenności w trakcie ciąży. Jednakże. gdy jej przepuszczalność zostaje zmieniona na skutek stanu zapalnego. minimum bactericidal concentration). Na przykład. stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego. co pozwala na stosowanie jej do dezynfekcji (sterylizacji) jelita przed chirurgią. lecz większość z nich powodują jedynie bakterie. antybiotyk. Inne pokonują tą barierę jedynie wtedy. błonica) leczenie może się wiązać z równoczesnym podaniu antytoksyny — preparatu zawierającego przeciwciała przeciw odpowiedniej toksynie. • Antagonizm w stosunku do innych antybiotyków (sekcja 15. aby był skuteczny.1). musi w danej tkance osiągnąć odpowiednie stężenie. 11. stężenie antybiotyku w płynie mózgowo-rdzeniowym musi dziesięciokrotnie przewyższać jego minimalne stężenie bakteriobójcze — MBC (ang. W niektórych przypadkach czas działania antybiotyku można przedłużyć hamując jego usuwanie z organizmu. • Farmakokinetyka. a niektóre — tylko bardzo specyficzne patogeny. antybiotyki o pewnych cechach molekularnych nie mogą pokonać bariery krew-mózg. o nazwie probenicyd. Niektóre z tych chorób (np. to jest groźba uszkodzenia płodu.11 Niektóre schorzenia bakteryjne Podane niżej zwięzłe opisy mają dać pojęcie o zakresie rodzajów zakażeń powodowanych przez bakterie. brak absorpcji może być czasem korzystny.4. potęguje działanie pewnych ssaczych enzymów degradujących hormony (np. Podane dożylnie. np.4. W pewnych wypadkach poziom antybiotyku powinien być dużo wyższy niż przewidywany na podstawie testów in vitro. Jak widać. • Możliwe działanie uboczne. na przykład. Leczenie zgorzeli gazowej — poza lekami — obejmuje usuwanie martwej/zakażonej tkanki i stosowanie (czasami) tlenu pod zwiększonym ciśnieniem. które są łatwo usuwane z organizmu z moczem. zapalenie spojówek) mogą być wywoływane przez inne czynniki niż bakterie. Na przykład. Ryfampicyna. amoksycylina) są absorbowane z jelita dużo łatwiej niż inne (np. gdyż pobranie neomycyny w znacznych ilościach do krwiobiegu mogłoby stworzyć ryzyko uszkodzenia słuchu (zależne od stężenia uszkodzenie ósmego nerwu czaszkowego). estrogeny) i może zatem mieć niekorzystne skutki podczas stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych.biotyków i w niektórych przypadkach możliwość chemioterapii jest praktycznie wyczerpana. w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowych. neomycyna podana doustnie jest bardzo słabo pobierana z jelit.9). W tym przypadku słaba absorpcja ma duże znaczenie.10) lub innych czynników chemioterapeutycznych. alergia na penicylinę (sekcja 11. Niektóre penicyliny (np. nie docierają do płynu mózgowo-rdzeniowego.

wodnista biegunka (sekcja 11. botulinum [Sonnabend i wsp. Brucella sp. Nagły początek. artretyzm z objawami neurologicznymi lub kardiologicznymi lub bez. który zwykle dotyczy tkanki łącznej. Ukąszenia przez zakażone kleszcze. która może trwać latami. Choroba Tyzzera. Corynebacterium diphtheriae (szczepy wirulentne). [V. problemy z widzeniem. Rozległy i rozszerzający się stan zapalny. (1997) JINF 34: 211-213]. Do niedawna cholerę wywoływała jedynie grupa serologiczna Ol (wyróżniona na podstawie antygenów O).3. Infekcja przez rany. kotów i małpek rezus. żółtaczką i bliznowaceniem. U źrebiąt: nekrotyzujące zapalenie wątroby i okrężnicy. Infekcja drogą pokarmową. Tworzenie w okolicach migdałków nalotów. Clostridium piliforme. Gorączka.1.nazwie schorzenia podana jest: 1) nazwa czynnika chorobotwórczego.7). (1999) Drugs 57: 157-173]. paraliż układu oddechowego (sekcja 11. Ostatnio.5) i przeważają procesy „redukcji" niż zazwyczaj. spojówki lub rany. botulinum.1) i odwodnienie. 2) charakterystyczne objawy i 3) droga zakażenia. gryzoni. niepasteryzowane mleko). (1996) RMM 7: 43-51]. Znane jest nosicielstwo (sekcja 11. Choroba z Lyme (borelioza). Infekcja jelitowa. Żadna inna ze 137 znanych grup serologicznych nie powoduje cholery. Błonica. w niektórych przypadkach. Zakażenie poprzez jamę ustną (np. Cholera. U zwierząt choroba zwykle dotyczy układu rozrodczego. Często: wysypka. w południowych Indiach pojawiła się nowa grupa serologiczna (nie Ol) oznaczona O139 Bengal. zwykle przez zakażoną wodę. które utrudniają oddychanie i/lub przełykanie. cholerae Ol nie chroni przed O139. Obfita. pH>4.2). powracająca gorączka.7) lub poprzez zakażoną żywność — mleko itp. Brucelloza. Cuchnąca wydzielina. złe samopoczucie. Infekcja drogą kropelkową (sekcja 11. 315 . Clostridium botulinum (szczepy wirulentne). U dzieci: toksykoinfekcja. Borrelia burgdorferi. [Microbiology and epidemiology of diphtheriae: Esfratiou i George (1996) RMM 7: 31-42]. Vibrio cholerae (szczepy zjadliwe). cholerae O139 Bengal: Nair i wsp. Rzadko zakażenie ran przez C. W wymazach występują charakterystycznie zmienione komórki (komórki nabłonka pochwy opłaszczone gramzmiennymi pałeczkami).1. Choroba również dotyczy np. z towarzyszącą gorączką i. a śmierć może nastąpić nawet w ciągu kilku godzin lub dni. botulinum wytwarza toksynę w układzie pokarmowym. Botulizm. Bakteryjna waginoza. lecz trwają prace nad uzyskaniem szczepionki anty-O139. [Treatment of early Lyme disease (artykuł przeglądowy): Loewen i wsp. Najczęściej szczepy Staphylococcus lub Streptococcus. Toksyna może powodować zapalenie mięśnia sercowego. Ogólne osłabienie. U dorosłych: najczęściej pochłonięcie gotowej toksyny. Odczyn w pochwie jest mniej kwasowy (np. w której C. do której należą: biotyp cholerae (klasyczna) i El Tor. Pochwa zawiera zwiększoną liczbę przedstawicieli z rodzajów Bacteroides. rzadziej: infekcja jelitowa toksygennym szczepem C. Jedną z pożytecznych metod diagnostycznych jest barwienie oranżem akrydyny oraz mikroskopia fluorescencyjna [Nunns i wsp.3. Cellulitis. często występują poronienia. Ból głowy. (1987) Lancet i 357-360]. Gardnerella i Mobiluncus oraz mniej (zwykle występujących) bakterii mlekowych. jeśli jest znana. Odporność na V.

(1997) Lancet 350: 1738-1742]. bovis. Infekcja przez układ pokarmowy. stan zapalny jelit.3). wodę (dyzenteria nie bakteryjna może być wywoływana przez amebę Entamoeba histolytica lub orzęska Balantidiwn coli). (1996) JIM 157: 1271-1278]. Obecnie występują problemy ze szczepami o wielorakiej lekooporności (MDR. Przenoszona drogą kropelkową. gorączka. zapalnie powiększone. gruczołowa). lecz mogą też objąć ośrodkowy układ nerwowy.4. np. zakażoną żywność. S. Dur brzuszny. transfuzje krwi itp.3. Mycobacterium tuberculosis wydaje się sprzyjać infekcji przez HIV [Goletti i wsp. Forma ostra: np. [Miniprzeglądówka: Raoult (1996) JMM 44: 77-78]. Rickettsia prowazekii.2) i rozprzestrzeniać się do różnych części ciała poprzez układ krwionośny lub limfatyczny.1.2. Dżuma (dymienicza.2. Rosnącą częstość występowania w USA przypisuje się: 1) czynnikom społecznym.2. Gorączka. objawy oddechowe. Coxiella burnetii.1 i 11. forma chroniczna: zapalenie wsierdzia. zapalenie osierdzia. zapalenie szpiku kostnego. Salmonella typhi. po których następuje biegunka krwawa lub śluzowa.7).6. Gruźlica wywoływana przez M.2). Czerwonka (dyzenteria) (bakteryjna). Shigella spp. która może krwawić. Bóle głowy. (1996) Virchovs Archiv 429: 335-343]. bóle mięśniowe. 11. picie zakażonego mleka. EHEC. Występuje nosicielstwo (sekcja 11. Dur plamisty (klasyczny. Gorączka. Gruźlica jest istotną przyczyną zgonów. Droga ustna infekcji — przez skażoną wodę lub żywność. poronienia. wodniste stolce (często gorączka i złe samopoczucie).Choroba Whipple'a. 11. Infekcja przez inhalację. Diagnoza polega głównie na histologicznych badaniach tkanek [Histology in Whipple's disease: von Herbay i wsp. Patogen może przetrwać w makrofagach (sekcja 11. Testy oparte na DNA (sekcja 15. Wdychanie. bóle mięśniowe. Możliwe też wdychanie wysuszonych. Gorączka Q. której dotychczas nie udało się wyhodować). ang. 316 . Yersinia pestis. utrzymująca się gorączka oraz wysypka. posocznica i np. powodująca zejścia śmiertelne. krwotoki. prowazekii. przebieg może być ukryty (sekcja 11. Infekcja jest przenoszona przez pchły.3) lub aktywny.2. zapalenie opon mózgowych. Diagnoza potwierdzana jest metodą PCR z wykorzystaniem tkanki z dwunastnicy lub [diagnosis and treatment of Whipple's disease: Singer (1998) Drugs 55: 699-704]. której czasami towarzyszy martwica tkanek i krwawienie wewnątrzjelitowe. Patogeneza: patrz sekcje 11. Gruźlica (płucna). Postać płucna: przebieg z ciężkim zapaleniem płuc. EIEC (tab. przejściowa wysypka.2. martwicze węzły chłonne. skażonych odchodów wszy. Tropheryma whippelii (gramdodatnia laseczka. przejście bakterii z matki do płodu (rzadko). Zakażenie rany lub ukąszenia odchodami wszy. [Mycobacterial disease (artykuły przeglądowe): BCID (1997) 4: 1-238]. zawierającymi R.2) mogą być pomocne w wykryciu lekooporności. Objawy dotyczą głównie jelit — złe wchłanianie substancji odżywczych. W płucach powstają gruzełki (fot. epidemiczny). Bóle jelitowe. 2) nieskutecznym programom leczenia oraz 3) zwiększającej się liczbie osób z AIDS [Epidemiological aspects of tuberculosis: Bloom i Murray (1992) Science 257: 1055-1064]. posocznica. została opisana u pacjentów chorych na AIDS [Guerrero i wsp. Zwykle Mycobacterium tuberculosis. typhi zazwyczaj umieszcza się w pęcherzyku żółciowym. multidrug-resistance). biegunka.11.. Odwodnienie.

Zakażenie drogą kropelkową. Infekcja przez zatarcie itp. typowa granuloma. Zależnie od rodzaju trądu — owrzodzenia obejmujące różne tkanki (zwykle łącznie ze skórą) oraz uszkodzenie nerwów peryferycznych powodujące utratę czucia i funkcji motorycznych. Bordetella pertussis. Bakteria występuje w wodzie zakażonej moczem chorych zwierząt. bóle mięśniowe. którym towarzyszy charakterystyczne „pianie" przy wdechu. biegunką. powiększeniem wątroby. Infekcja poprzez rany. Listeria monocytogenes (szczepy wirulentne. Utrzymujące się bezwolne skurcze mięśni (sekcja 11. jest to jedna z nielicznych patogennych bakterii. Listerioza. Łagodniejszy przebieg niż w cellulitisie. Trąd typu gruźliczego: rzadkie wrzody skórne. Infekcja poprzez rany lub błony śluzowe. ból głowy. Neisseria gonorrhoeae (gonokok). Trąd. a w przypadku niepodjęcia leczenia — po miesiącach czy nawet latach nacieki guzkowe w sercu. Wydzieliny z układu moczowo-płciowego. Leptospira interrogans (krętek). Twardy wrzód w miejscu infekcji (zazwyczaj śluzówka narządu rodnego).Jaglica. liczne wrzody skórne ulegają zlaniu. [Listerioza: McLaughlin (1997) RMM 8: 1-145].1. Chlamydia trachomatis. rzadkie prątki. poronienie. Droga kropelkowa. Streptococcus pyogenes. żółtaczką. Infekcja w wyniku bezpośredniego kontaktu. Zapalenie spojówek. globalna eliminacja trądu (perspektywy): Gillis i Krahenbuhl (1998) RMM 9: 39-48]. nabrzmiałe szyjne węzły limfatyczne. Zakażenie poprzez produkty żywnościowe. czasami zapalenie żołądkowo-jelitowe. Mycobacterium leprae.1). połączone z wymiotami. uszkodzenie rogówki przez rzęsy wywinięte w kierunku gałki ocznej. patrz również Aneks). Właściwości te są odzwierciedlone w szerokim zakresie chorób wywoływanych przez tę bakterię: zapalenie opon mózgowych (szczególnie u osób z niedoborem odporności). Trąd typu guzowatego: słaba odpowiedź immunologiczna typu komórkowego. Zwykle wyraźnie oddzielone obszary róży. choć może się pojawić gdzie indziej. wirusowe zapalenie wątroby: wymienione wyżej objawy. Częstość zgonów najczęściej przekracza 20%. szczególnie płciowego. picie zakażonego mleka itp. gorączka. 317 . Płonica. de Wit i Klatser (1996) FEMSML 136: 221-230. Róża. Kiła.3). U zwierząt występują poronienia (infekcja przez paszę: patrz sekcja 13. Napady kaszlu. Łagodny przebieg: gorączka. Treponema pallidum. Infekcja zazwyczaj przez zakażone rany. która potrafi pokonać barierę krew-mózg oraz łożysko. posocznica. którym mogą towarzyszyć inne objawy. Kontakt seksualny. zatarcia. Clostridium tetani (szczepy zjadliwe).1. wyczerpanie i posocznica. co prowadzi do bliznowacenia. wtręty na powiekach. wrzody. ośrodkowym układzie nerwowym itp. krwotoki. często na twarzy. Tężec. [Epidemiology: van Beers. Często u dzieci: ból gardła.3. Często. Leptospiroza.1. zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Ostry przebieg (choroba Weila. wysypka. później wysypka. Mogą występować: gorączka. liczne prątki w tkankach. Rzeżączka. Streptococcus pyogenes (grupa A). Ksztusiec (koklusz). w typowych przypadkach zakłócona praca nerek.

Wąglik. Infekcja: w dół od nerek lub (częściej) w górę od cewki moczowej. difficile wytwarza toksyny A (enterotoksyna) i Β (cytotoksyna). [Laboratory diagnosis of C. Zapalenie błon osłaniających mózg i rdzeń kręgowy. Escherichia coli (szczepy wytwarzające fimbrie typu Ρ przylegają do nabłonka dróg moczowych). Ostre zapalenie żołądka i jelit. np. wdychanie. Neisseria gonorrhoeae (w rzeżączce). inne gronkowce. including conjunctivitis (artykuł przeglądowy): Willcox i Stapleton (1996) RMM 7: 123-131]. wymioty. Zapalenie spojówek. rzadziej. Zakażenie drogą kropelkową. Zwykle biegunka (lecz może jej nie być lub tylko ograniczona w przypadku gronkowcowego zatrucia pokarmowego oraz powodowanego przez jeden typ B. Zapalenie płuc. Zatrucie pokarmowe. pobranie z pokarmem. kaszel. Potencjalnie śmiertelna choroba. Bacillus anthracis (szczepy zjadliwe). z gorączką i zapaleniem naczyń. Haemophilus influenzae typu b (częsta przyczyna u niemowląt i małych dzieci). Często infekcja w wyniku kontaktu seksualnego. Zespół Kawasaki.Tularemia. Występuje u niemowląt i małych dzieci. Różne bakterie. [Prevention of meningococcal meningitis (perspektywy): Ferreiros. C. Zapalenie opon mózgowych. Streptococcus pneumoniae. Często występują mdłości i wymioty. Różne. pseudomembranous colitis). ukąszeń pcheł lub much. Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37]. Gorączka. np. Zapalenie pęcherza moczowego. Salmonella typhimurium. rany głowy itp. cereus). lub w niespecyficznym gonokokowym zapaleniu — Chlamydia trachomatis. coli i Proteus spp. Choroba zwykle jest poprzedzona terapią antybiotykową (przede wszystkim w wypadku stosowania klindamycyny). Lokalne pryszcze na skórze lub. Streptococcus pneumoniae. trudności z oddychaniem. Staphylococcus aureus. Ból. infekcja płucna lub jelitowa. Infekcja drogą kropelkową. Mycoplasma hominis. Zapalnie spojówki (śluzówki oka). np. gorączka. Haemophilus influenzae typu b. Zapalenie cewki moczowej. Proteus spp. np. ból głowy. Klebsiella pneumoniae. Różne. Escherichia coli. Vibrio parahaemolyticus. Neisseria mengitidis. Różne. Wykazano kiełkowanie endospor B. Różne bakterie. Dreszcze. Francisella tularensis. Staphylococcus aureus. wyczerpanie. Streptococcus pneumoniae. Clostridium perfringens. np. a czynnikiem powodującym chorobę jest zwykle lub zawsze Clostridium difficile. [Ocular bacteriology. Brazier (1995) RMM 6: 236-245]. Droga zakażenia przez przewód pokarmowy. Zakażenie poprzez rany. Zespół PMC — rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (ang. Różne organizmy. Czasami ostre objawy żołądkowo-jelitowe/posocznica. Staphylococcus aureus. Toksyna A prawdopodobnie stymuluje powstawanie wysięków po uszkodzeniu komórek przez toksynę Β [Sears i Kaper (1996) MR 60: 167-215]. patogen lub toksyna pobrane z żywnością (patrz sekcja 12. gorączką i rzekomymi błonami powstającymi z wysięku zapalnego. mdłości. Campylobacter jejuni. Czasem przebieg śmiertelny. difficile-associated disease. Infekcja w wyniku ran. Haemophilus influenzae.3). przebiegająca z wodnistą biegunką. np. bóle klatki piersiowej. uszkodzenia błony śluzowej. głównie na błonie śluzowej okrężnicy. W tym ostatnim przypadku najczęściej zapalenie powodują E. Etiologia choroby nieznana. anthracis oraz wyrażanie się genów kodujących toksyny wewnątrz mysich makrofagów pęcherzykowych [Guidi-Rontani i wsp. (1999) MM 31: 9-17]. Zapalenie pęcherza. Bacillus cereus. lecz 318 . Yersinia enterocolitica.

złuszczającą (ET. ang.5. exfoliative toxin). oparzenia. TNF-β. W typowych przypadkach — Clostridium perfringens (typ A). Nie leczona prowadzi do śmierci spowodowanej toksemią i szokiem.4.przynajmniej w niektórych przypadkach przyczyną może być superantygen (sekcja 11. Bakteriemia jest rzadka (gronkowcowy TSS) lub częsta (paciorkowcowy TSS). Działanie ET najprawdopodobniej polega na aktywacji proteazy serynowe]" w naskórku lub aktywności superantygenowej (sekcja 11.C and F superantigen genes of Staphylococcus aureus: Schmitz i wsp. toxic shock Syndrome). U niemowląt i dzieci zakażenie przez np. Zespół oparzonej skóry. TNF-α. [Artykuł przeglądowy: Rago i Schlievert (1998) RMM 9: 9-15]. W przypadku kobiet często w związku ze stosowaniem tamponów podczas miesiączki. U małych dzieci często mogą się pojawiać objawy zapalenia mózgu w wyniku przejścia cytokin przez barierę krew-mózg. W fazie ostrej występuje więcej np. (1995) MM 15: 191-202]. C lub F (sekcja 11. Stosunkowo wysoka śmiertelność.1). (1998) JMM 47: 335-340]. Zakażenie ran i odtlenionych tkanek. aureus) lub wysypka. septicum i/lub C. .1).1) oraz paciorkowce grupy A wytwarzające enterotoksynę A. Szczepy Staphylococcus aureus wytwarzające superantygen B. Zespół wstrząsu toksycznego (TSS.4. które zawierają pęcherze gazu tworzonego w wyniku metabolizmu bakteryjnego. z następującą utratą powierzchniowych warstw skóry. głównie z grupy fagowej II. Szczepy Staphylococcus aureus. IFN-y).5. C. novyi. produkujące toksynę tzw. Zgorzel gazowa. ang. Postępująca martwica tkanek. biegunka. obniżone ciśnienie. komórek Vβ2 Τ i podwyższony poziom cytokin (np. Toksyna α Clostridium perfringens (która hydrolizuje lecytynę i ma również aktywność sfingomielinazy) wydaje się główną letalną toksyną [Awad i wsp.5. Paciorkowcowy zespół wstrząsu toksycznego często przebiega z martwicą tkanek i prowadzącym do martwicy zapaleniu powięzi [Multiplex PCR for detection of the B. Gorączka. Na ogół u noworodków i małych dzieci: wypełnione płynem pęcherzyki (zawierające S. IL-4. wymioty. zmiany skórne.4. IL-2.

Sery powstają w wyniku koagulacji i fermentacji mleka.) 12.1 Przetwory mleczarskie W produkcji masła. słodkim. i/lub Leuconostoc cremoris .6) powstaje masa. Kwas mlekowy i diacetyl nadają masłu typowy dla niego aromat.1. Masło nazywane śmietankowym. Lactococcus (Streptococcus) cremoris i/lub L. Wykorzystuje się także hodowle starterowe kon320 .1). w wyniku której laktoza ulega przekształceniu do kwasu mlekowego. co prowadzi do destabilizacji globulek tłuszczu. a masło. (Udział bakterii w wytwarzaniu karmy dla zwierząt hodowlanych omówiono w rozdziale 13. W wyniku procesu fermentacji (pH wówczas spada do około 4. wytwarza się bez zastosowania hodowli starterowej. np. produkcji octu. Bakterie biorące udział w produkcji żywności Bakterie stosuje się w przemyśle spożywczym: 1) do przeprowadzenia fermentacji w przetwórstwie mleczarskim. często zasolone. 2) w produkcji kawy i kakao. mleko krowie. w temperaturze -25°C. 4) w innych procesach. (S. którą schładza się i „ubija". diacetilactis.ROZDZIAŁ 12 Bakteriologia stosowana I — żywność 12. np. Tak zwane masło śmietankowe powstaje w wyniku traktowania pasteryzowanej śmietany hodowlą starterową zawierającą różne bakterie mlekowe.1.główny producent diacetylu. można długo przechowywać np. Fazę wodną (maślankę) odsącza się. Różnice między gatunkami serów są związane z rodzajem surowca (np.1. Decydującą rolę w produkcji odgrywają stosowane drobnoustroje — najczęściej bakterie z gatunków Lactococcus i Lactobacillus. sera i jogurtu mleko poddaje się fermentacji homomlekowej (sekcja 5.1. kozie) oraz innych jego właściwości (mleko pełne.) lactis subsp. Diacetyl tworzy charakterystyczny zapach i smak świeżego produktu. odtłuszczone). 3) do wytwarzania dodatków poprawiających smak żywności.

gdzie konieczne jest kontrolowanie rozwoju patogennej" bakterii Listeria monocytogenes. pH spada wówczas do około 4. stosowane do ich produkcji). np. Fermentację prowadzi się 12. Bakterie współdziałają ze sobą: L. typu Emmentaler i Gruyere. podlega oddzieleniu od fazy wodnej — serwatki. Kok i Luchensky (1988) AEM 64: 4842-4845]. Oprócz drożdży (są to jednokomórkowe grzyby) rolę odgrywają także bakterie pektynolityczne — np. szczepów Corynebacterium glutamicum hodowanych beztlenowo na takich podłożach jak melasa lub hydrolizowana skrobia. uwolnione nasiona poddaje się fermentacji. Owoc jest torebką zawierającą do 50 nasion zlepionych białym śluzem.1. zastosowano właśnie tak zmodyfikowaną hodowlę starterową [Buyong. Bacillus i Erwinia. W czasie trwającej tydzień fermentacji nasiona pozbawione śluzu ciemnieją. nadaje kwas propionowy wytwarzany przez Propionibacterium spp. bogatego w składniki stałe. dodatkowo inne produkty fermentacji (np. nasiona płucze się. a następnie kawa jest „opalana".struowane metodami inżynierii genetycznej. 12. który podlega przekształceniu do kwasu octowego. Bakterie te wytwarzają kwas 321 . Gdy warstwa zewnętrzna zostanie rozerwana. Otoczka śluzowata zostaje uszkodzona w wyniku oddziaływania enzymów rośliny oraz z udziałem egzoenzymów wytwarzanych przez drobnoustroje. który jest głównym producentem kwasu mlekowego. Śluz poddawany jest fermentacji z udziałem drożdży wytwarzających etanol. suszy. Jogurt jest zazwyczaj wytwarzany z mleka pasteryzowanego. następnie są suszone i „opalane". a w dalszym procesie jest przekształcany. przez solenie. Kwas mrówkowy wydzielany przez S. thermophilus.1.2 Kawa i kakao Wytworzenie kawy z surowych nasion kawowych wymaga wstępnego usunięcia lepkiego i śluzowatego mezokarpu (osłony) łączącego dwa nasiona w każdym owocu. Mleko zostaje zaszczepione hodoww temperaturze 35-45°C. Kakao wytwarza się z nasion (fasolek) rośliny kakaowca.3 Środki dodawane do żywności Glutaminian monosodowy jest powszechnie stosowany jako środek wzmacniający smak produktów żywnościowych. thermophilus nasila rozwój L. przez kilka godzin. kwas octowy i propionowy) zapewniają charakterystyczny aromat. Otrzymuje się go z niektórych bakterii. dojrzewanie — aż do uzyskania produktu dojrzałego. (Typowy zapach serom szwajcarskim. W wyniku fermentacji obniża się pH. lami Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. bulgaricus powoduje rozkład białek do aminokwasów i peptydów — które stymulują rozwój S. Dzieje się to za przyczyną niektórych bakterii tlenowych i innych drobnoustrojów obecnych w środowisku. W serze cheddar. bulgaricus. to jest wytrącone białko i tłuszcz. sporządza się odpowiednie mieszanki.3. o niskiej zawartości tłuszczu. co wstępnie prowadzi do koagulacji białka mleka. a białka mleka zostają wytrącone. Ser. Po zakończeniu fermentacji. np.

1 Pasteryzacja i procedura UHT Pasteryzację przeprowadza się działając podwyższoną temperaturą na takie produkty jak mleko. sączeniu. substancja gumopodobna. by zapobiec hamowaniu zwrotnemu syntezy kwasu glutaminowego. Ocet. co wymaga zastosowania specjalnych metod. bez udziału bakterii. np. jest wytwarzany na drodze chemicznej (np.glutaminowy z kwasu α-ketoglutarowego.1. Jest to ściśle kontrolowany proces polegający na utlenieniu etanolu przez różne gatunki z rodzaju Acetobacter. Pasteryzacja niszczy bakterie patogenne. karbonylacji metanolu). Jest produktem tańszym niż uzyskiwany z wykorzystaniem bakterii. z wina.2. rys. Ksantan. zagęszczacz i środek hamujący krystalizację niewskazaną w niektórych środkach spożywczych.10).2 Środki zapobiegające psuciu się żywności Znane są i stosowane różnorodne metody zapobiegające lub opóźniające psucie się żywności. że bezpieczniejsze są metody fizyczne (np. należy zwiększyć przepuszczalność osłon komórkowych. Aby umożliwić wydobycie się kwasu z bakterii. Muszą być także brane pod uwagę środki.4 Ocet Produkcję octu. piwa.2. Znajduje wielorakie zastosowanie. przedłużają czas bezpiecznego przechowywania we wskazanych warunkach. Produkt może być poddawany dojrzewaniu. odpowie322 . jako substancja żelująca. zamrażanie) niż chemiczne traktowanie żywności. ocet. 5. butelkowaniu i pasteryzacji. które przeciwdziałają wytwarzaniu toksyn. pasteryzacja HTST. zwaną fermentacją octową przeprowadza się z surowców zawierających etanol. glutamicum nie metabolizują kwasu α-ketoglutarowego w cyklu kwasów trikarboksylowych (TCA. ang. Przemysłowe szczepy C.1. przez przynajmniej 15 sekund (jest to tzw. 12. w celu zabicia niektórych patogenów i innych drobnoustrojów odpowiedzialnych za psucie się żywności.1 Metody fizyczne zabezpieczania środków spożywczych 12. Metody te pozwalają na zachowanie wartości spożywczych. dzięki czemu gromadzi się w dużych ilościach kwas glutaminowy. 12. jest śluzem wydzielanym pozakomórkowo przez niektóre szczepy Xanthomonas campestris. stabilizator żelu. high temperature. będących źródłem zatruć pokarmowych. jak również wynikające z innych przyczyn. 12. Mleko podgrzewa się do minimum 72°C. short time — polegająca na stosowaniu wysokiej temperatury przez krótki czas). Jest to także niezbędne. nazywany u nas zazwyczaj spirytusowym. Przypuszcza się. zarówno powodowane działalnością drobnoustrojów. soku jabłkowego.

Prawdopodobieństwo zakażenia przez C.1). np. Brzeg wieczka jest wywinięty wokół obrzeżenia górnej strony puszki. zamyka w sposób hermetyczny zaciskając wieczko. w tej samej temperaturze. Aby to osiągnąć. (1) wieczko (2) ściana boczna puszki.1. umożliwiając określenie wartości parametrów D. kremów i innych lepkich środków spożywczych. Wskazuje on działanie temperatury na populację komórek lub endospor. „wartość botulinum". przez 3 sekundy. Unieczynnia także niektóre enzymy bakteryjne. marchew. dający szybki wynik (patrz sekcja 12. czego nie pokazano na rysunku. 12.3. Pasteryzacja HTST nie zabija niektórych zarazków. mają w kilku miejscach poprzeczne wyniesienia blachy w celu zmniejszenia nacisku w czasie podgrzewania konserwy. to jest ogrzewania przez czas 12-krotnie dłuższy niż stosowany jako czas D dla endospor C. system Lumac. Mleko oznakowane UHT jest pakowane aseptycznie i może być przechowywane poza chłodnią przez około 6 miesięcy.1. usuwa się z nich powietrze.2) zdolnej do wzrostu i wytwarzania toksyn w warunkach przechowalnictwa. w temperaturze około 141°C.2. Odpowiednio przygotowane konserwy w puszkach nie mogą zawierać bakterii Clostridium botulinum (sekcja 11. 12. W tym celu wykonuje się testy. Tak zwana procedura UHT (ang.3. Ta procedura jest szczególnie przydatna w produkcji np. jak również większość niepatogennej mikroflory mleka. powodujące psucie się produktu. gdyby zacisk nie był dostatecznie szczelny (rys. stosując np. by nie dopuścić do zakażenia pokarmu. 12. Boki puszki. 323 .2). lipazy. W metodzie alternatywnej ciepło wprowadza się do mleka w postaci pary pod ciśnieniem. pobiera się kontrolne próbki wykluczające ich zakażenie. Ważnym problemem jest ustalenie właściwego czasu i temperatury przygotowania konserw.3. z i F istotnych w przemyśle spożywczym. botulinum po takim traktowaniu określa się jako nieistotne. ultra-heat treated) polega najczęściej na wtłaczaniu mleka pomiędzy rozgrzane płyty. sterylną wodą. np. botulinum. sprawcy gorączki Q (Coxiella burnetii).1).2 Konserwy Odpowiednio przygotowany pokarm umieszcza się w metalowych pojemnikach (puszkach). Posłużymy się w tym celu wykresem (patrz rys. Następnie puszki podgrzewa się do co najmniej 100°C. W trakcie przechowywania pasteryzowanych produktów. grzyby) wymagają zastosowania co najmniej 12D (tzw. tak by grubość w tej części wieczka była pięciokrotnie większa od grubości blachy. w magazynach. poziom ogrzewania należy dostosować zależnie od wartości pH i typu produktu spożywczego oraz od sposobu przechowywania.dzialne za salmonellozy i gruźlicę. np. Produkty „naturalne" (takie jak ziemniaki. Puszki schładza się zimną.

dla komórek/przetrwalników tego samego typu. by osiągnąć D = 0. w czasie 2 minut ginie 900 organizmów. jeśli. w której określa się wartość D (wyznaczona doświadczalnie). czas penetracji ciepła w głąb puszki wypełnionej określonym produktem spożywczym. epidermidis wynosi około 3 minut. Posługując się pojęciem „śmierci wykładniczej" możemy określić trzy ważne parametry wykorzystywane w przetwórstwie żywności. dla populacji określonego typu bakterii lub przetrwalników. znajduje się zazwyczaj we frakcji dolnej. w teorii. 2 i F stanowią podstawę określenia odpowiedniego (tj. natomiast dla Escherichia coli D 6o zazwyczaj tylko kilka minut. jak na wykresie temperatura konieczna do zabicia określonych komórek lub przetrwalników wskazuje D = 2. tj. 324 . Tak więc stała pozostaje proporcja komórek/przetrwalników zabitych w danym czasie. lecz w innej temperaturze (określonej odpowiednią wartością D).W sytuacji idealnej. np. W praktyce występują odchylenia od odpowiedzi liniowej. 10°C. Na przykład. o 1/10 tej wartości). w ciągu 2 minut ginie 9000 bakterii lub przetrwalników. a dla S. gdy liczebność organizmów maleje z 10 000 do 1000. Dzieje się tak w części początkowej i końcowej (wykresu). że w części liniowej wykresu rzeczywista liczba zabitych organizmów w określonym czasie zależy od początkowej liczebności populacji. niezbędny do zmniejszenia o 90% liczby form żywych (to jest o jedną jednostkę w skali log10. Gdy liczebność populacji maleje z 1000 do 100. Dla komórek Staphylococcus aureus wartość D 7 0 jest zazwyczaj mniejsza niż 1 minuta (ale znacznie większa dla niektórych szczepów). Należy brać pod uwagę również inne czynniki. w liniowej części wykresu. skutecznego) działania ciepła. jeśli sporządzi się go w skali logarytmicznej. W części liniowej wykresu liczebność populacji zmalała o 1 jednostkę log w czasie 2 minut. D 7 0 = wartość w 70°C. Te jego fragmenty oznaczono linią przerywaną. Wartość D: czas (w minutach). Na przykład. o ile temperatura (°C) musi zostać podwyższona.1°C. wówczas wartość 2 równa się wzrostowi temperatury niezbędnemu. aby uzyskać wartość D obniżoną o 90% (tj. przyjmując wartość 2 wynoszącą np. Należy zauważyć. tak więc w tym przypadku D = 2. określony z czasu niezbędnego do osiągnięcia podobnego efektu. liczba komórek przeżywających maleje wykładniczo w czasie i w określonej temperaturze. Wartości D. D60 wynosi 1 godzinę w przypadku Salmonella seftenberg. Wykres wówczas jest liniowy. np.2. w określonej temperaturze. Temperatura. Wartość z: oznacza. Wartość F: czas w minutach konieczny do skutecznego działania temperatury 121. Wartości F służą do porównywania efektu działania ciepła w różnych temperaturach.

można zabezpieczać przed psuciem ogrzewaniem w stosunkowo niskiej temperaturze. 281: 398-399] opisujące wzrost i produkcję toksyn na podłożu laboratoryjnym (a więc nie w żywności) w pH obniżonym do wartości 4. zagęszczone.6 wymagają niższych wartości D. W tabeli 12. zawierające mało kwasu) należy podgrzewać powyżej minimalnej wartości botulinowej. konserwowane mięsa (między innymi szynka). np. Produkt może być nawet skwaśniały. które mogłyby powodować psucie się puszkowanej żywności. przez kilka minut. a puszki nie wykazują typowych wzdęć. jeśli tylko temperatura przechowywania jest powyżej 30°C. 325 . transportowane w pojemnikach. Puszki dużych rozmiarów.1 podano warunki termiczne stosowane przy produkcji konserw w puszkach zawierających różne produkty spożywcze. sekcja 3. np.0. Jednakże przyczyną psucia są często enzymy zwane ciepłostałymi lub niektóre bakterie i endospory niewrażliwe na wysoką temperaturę. botulinum nie rośnie i nie wytwarza toksyn.Środki spożywcze o wartości pH poniżej 4. Bezpieczeństwo (brak wzrostu i wytwarzania toksyn przez C. gdyż. botulinum) jest w tym przypadku warunkowane połączonym działaniem temperatury (niskiej) i konserwujących soli. 70°C (w centralnej części puszki).1. Wysoka temperatura na ogół inaktywuje przynajmniej niektóre enzymy. gdyż duża zawartość cukru (mała aktywność wody. Wówczas produkt może być przechowywany bezpiecznie.3) hamuje wzrost większości bakterii. Na przykład endospory Bacillus stearothermophilus mogą przeżyć wartość botulinową. jak się powszechnie sądzi. w takich warunkach C. Mleko słodzone. Psucie się puszkowanej żywności. po zamknięciu w puszkach nie jest podgrzewane. Znane jest jednak jedno doniesienie [Raarjes i Smelt (1979) Nature. Produkty spożywcze o wysokim pH (tj. Tak przygotowane puszki muszą być jednak przechowywane w chłodni. Mogą także wywołać psucie się konserw z małą zawartością kwasu.

elektrony o wysokiej energii.2 Inne sposoby zapobiegania psuciu się żywności 12.1. stosowane np. Zamrażanie (stosowane w celu przechowywania przez długi czas) może zabijać niektóre drobnoustroje.2.2. Listeria monocytogenes. wytwarzanym przez bakterie z rodzaju Lactobacillus lub Leuconostoc. np.2. Narażone są na nią np. truskawek. redukuje także dostępność wody (sekcja 3. 12.1. Stosuje się w tym celu kwas benzoesowy (do ochrony przed psuciem soków. miodów pitnych). Yersinia enterocolitica zachowują aktywność nawet Odwodnienie produktu redukuje ilość dostępnej wody (sekcja 3. octowy. Obniżenie pH uzyskuje się dodając kwasy. a także wydzielanych przez nie enzymów.2.Żywność w puszkach może być zazwyczaj przechowywana przez kilka lat.1. lub jedne i drugie. 12.1. surowce mięsne. Antybiotyk 326 . w którym drobnoustroje zakażające nie mogą się już rozwijać.2.5 Promieniowanie jonizujące Promieniowanie jonizujące (np.4) mogą także w tych warunkach zachować swą szkodliwą działalność. ryb.3 Chłodnictwo Temperatury w zakresie 0-8°C powodują zahamowanie metabolizmu i wzrostu drobnoustrojów.2 Środki ochronne Środki do ochrony żywności są chemikaliami. rozwijają swoją niszczycielską działalność niektóre grzyby.2. 12. lub promieniowanie gamma) stosuje się w niektórych krajach w celu zapobiegania psuciu się drobiu. które zabijają np. Ten rodzaj przechowywania stosowany przez krótki czas opóźnia psucie się produktów spożywczych. 12. kapusty.3) do punktu. W temperaturach poniżej zera.3). mlekowy. Jednak organizmy psychotropowe (sekcja 3. azotyny i kwas sorbowy.4 Odwodnienie np. Stan taki uzyskuje się przez odparowanie. albo w niektórych przypadkach przez wywoływanie fermentacji np.2. drożdże lub bakterie. przypraw. Produkty takie nazywane są piklami lub marynatami. W wyniku fermentowania powstają kiszonki naturalnie zakwaszone kwasem mlekowym.1 Zakwaszanie Tradycyjnym sposobem ochrony przetworów spożywczych jest obniżenie pH.1. Niektóre bakteryjne patogeny. w odpowiednich warunkach. do produkcji suchego (sproszkowanego) mleka. w temperaturze 4°C. -5 do -10°C. Zawartość dostępnej wody zmniejsza się także przez dodanie chlorku sodu (solenie ryb) lub stosując syropy (w przechowalnictwie owoców). 12.2. np.1.

327 . Produkt wędzony zostaje również nasycony substancjami pochodzącymi z dymu. wykazującymi właściwości przeciwdrobnoustrojowe. rozmnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności. lub nawet mniej niż 100 komórek Campylobacłer. np.peptydowy. gdy chorobę wywołuje już niewielka liczba bakterii. np. np. 12.2).1.3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych Zatruciami pokarmowymi nazywamy zazwyczaj ostre zapalenia przewodu pokarmowego spowodowane spożyciem pokarmu zanieczyszczonego czynnikami patogennymi lub ich toksynami (tab. np. Zalicza się tu również przypadki botulizmu (zatrucia jadem kiełbasianym) (sekcja 11. działa aktywnie przeciw bakteriom gramdodatnim.3. Najczęściej jednak zakażenie żywności następuje w czasie pomiędzy surowcem a momentem spożycia. Zakres i rodzaj stosowanych chemicznych środków ochronnych jest regulowany zarządzeniami odpowiednich władz. zwany nizyną. Niemniej. Listerioza (sekcja 11. sprawcy zatruć są już w samym produkcie wyjściowym. należący do grupy lantybiotyków.3.1 Bakterie źródłem zatruć pokarmowych Jakie są źródła zakażenia żywności potogenami? W niektórych przypadkach. W kuchni czynniki patogenne są często przenoszone z jednego pokarmu na drugi. choroba ta często kończy się śmiercią. w niektórych serach i wędlinach. związkami fenolowymi. który w odpowiednich warunkach hamuje wzrost bakterii i kiełkowanie endospor. Nichterlein i Kretschmar (1994) TIFS 5: 185-190]. Tradycyjna metoda peklowania. zaledwie 100 pałeczek czerwonki (Shigella). i dopiero gdy ilość zarazków lub wytwarzanych przez nie toksyn osiągnie pewną wartość progową. a główną przyczyną infekcji jest spożycie skażonego pożywienia. ryb itp. zapobiegając również przejściu endospor w formy wegetatywne. polega na traktowaniu produktu. dotyczy to np.11). Chociaż obecność Listeria monocyłogenes stosunkowo często stwierdzana jest w żywności różnego typu. tj. dokładne określenie ryzyka listeriozy utrudnia obecność słabo patogennych lub niepatogennych szczepów [Hof. jaj. Najczęściej zarazki przedostają się z surowego mięsa lub drobiu na przygotowany pokarm. Nizynę stosuje się przy produkcji niektórych serów oraz pewnych produktów spożywczych puszkowanych. produkt poddaje się przez kilka godzin (a nawet kilka dni) działaniu dymu pochodzącego z palonego drewna. mięsa wieprzowego. może po ich spożyciu dojść do choroby. w temperaturze 4°C. 12. Rozmnożenie zarazków nie jest jednak konieczne. W ten sposób zmniejszana jest aktywność wody. W procesie wędzenia bekonu. Czasem czynnik patogenny musi się rozwinąć.11) nie odpowiada opisowi typowego zatrucia pokarmowego (wyżej). drobiu. 12. skorupiaków. roztworem chlorku sodu (redukującym aktywność wody) i azotynem sodu.2 i 11.

.

Ryzyko zatrucia pokarmowego jest zależne od następujących czynników: 1. który powinien być poszukiwany także wewnątrz produktu spożywczego. Sposobu przerabiania surowca. coli O157) mogą wywołać infekcję nawet wówczas. 12. W rzeczywistości.3. Początkowego stopnia zakażenia produktu. po uboju. ludzie starzy. jak łatwo zarazek może się dostać i namnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności w całym cyklu przygotowania produktu oraz od możliwości unieszkodliwiania drobnoustrojów. gdy dawka (liczba bakterii lub toksyn) wywołująca zatrucie jest mała.1). wrażliwość na zarazki nie jest wartością stałą. różni się w znacznym stopniu zależnie od wieku. z którymi wiąże się ryzyko wywołania zatrucia.1 Wykrywanie patogenów i toksyn w żywności Często pojedynczy przypadek zatrucia pokarmowego zostaje wyjaśniony zanim zarazek mógłby być wyhodowany z podejrzanego produktu spożywczego czy z chorego organizmu. Jest to szczególnie ważne. Relacja wielkości dawki zarazka do reakcji w postaci choroby. Do wykazania obecności toksyn gronkowcowych przydatna jest aglutynacja (czułość około 329 . W etapach późniejszych. stanu odporności. często jest oparte na badaniach epidemiologicznych. przechowywania i form podania do spożycia. mniej niż 100 bakterii). Do grupy dużego ryzyka należą dzieci. proces eliminacji zarazków jest już trudniejszy.Zatrucia pokarmowe mogą przebiegać jako stan zapalny jelit lub jako skutek działania toksyn (zatrucia pokarmowe toksyczne). konieczne jest stosowanie bardzo czułej metody. Do uzyskania lepszej wykrywalności zarazków z różnych próbek żywności (patrz również tab. Jest rzeczą oczywistą. na farmie. Dlatego też. Mimo to podejmuje się badania w celu dokonania ustaleń epidemiologicznych lub dochodzeń sądowych. 3. gdy możliwe jest eliminowanie patogenów już na miejscu hodowli. kobiety ciężarne. gdy dawka zakaźna jest mała (np. 14. Ryzyko zatrucia pokarmowego zależy od tego.1. W przypadku mięsa i drobiu idealna jest taka sytuacja. Microbiology 140: 687-695)]. W gotowych już produktach spożywczych zakażenie żywności może być powyżej lub poniżej poziomu niezbędnego do wywołania choroby. W celu wykrycia małej zawartości toksyn wywołujących zatrucia pokarmowe również niezbędne jest stosowanie bardzo czułych metod.2) przydatny jest rozdział immunomagnetyczny (sekcja 14. że podłoża wzrostowe muszą być dobrane zależnie od rodzaju zarazka. tym mniejsze jest prawdopodobieństwa ograniczenia zagrożenia do poziomu bezpiecznego — w samym procesie obróbki. ogólnej kondycji. gdy badania są wykonane pod kątem poszukiwania tego typu zarazka. 2.6. w nieznacznym stopniu na wynikach doświadczeń i na zgodności poglądów [żywność a ryzyko mikrobiologiczne: BairdParker (1944). W procesie produkcyjnym przetworu im bardziej zakażony jest surowiec. E. chorzy z obniżoną barierą odporności (w tym chorzy na AIDS). Ponieważ relacja — dawka czynnika patogennego: „odpowiedź organizmu" jest zmienna. określenie stopnia zainfekowania żywności. Niektóre zarazki (np. a więc po zniszczeniu struktury próbki.

Alana Curry.Zarazek występuje u zwierząt i na produktach pochodzenia zwierzęcego. Manchester. dzięki uprzejmości dr.3.1). szczególnie na drobiu. PHLS. 330 . Withington Hospital. Fotografia. UK. Częstym sposobem przenoszenia zarazka jest krzyżowe zanieczyszczenie innych przetworów spożywczych (sekcja 12.

pałeczek Salmonella z drobiu. gdy warunki przechowywania nie były właściwe. Zakażenie przeniesione przez muchy itp. z którego wykonuje się.5 ng/ml. Może wówczas dojść do przeniesienia np. Polega to między innymi na zabiegach dotyczących surowców (selekcja mięsa zwierząt. drób).3. Dotyczy to często zatruć pokarmowych wywoływanych przez paciorkowce. co prowadzi do namnożenia się patogenów do niebezpiecznego poziomu. mięso. za pomocą którego można wykryć obecność toksyn gronkowcowych w stężeniu 0. produkty gotowe do spożycia. drobiu. Oto przykłady: 1. by powietrze mogło swobodnie przepływać wokół półek.5). 11. gdy surowiec nie jest należycie odmrożony przed gotowaniem. ale tak. a następnie bez starannego umycia — do potraw przygotowanych już do spożycia. a więc w temperaturze chłodni. [Wykrywanie toksyn gronkowcowych: Tranter i Brehm (1994) RMM 5: 56-64]. 5. 7. Źródłem zakażenia mogą być brudne ręce (droga: odchody-usta) przygotowującego pokarm. Najniższa temperatura w odpowiednim miejscu urządzenia chłodniczego powinna wynosić 0-5°C.3.3 Higiena żywności — warunki przemysłowe Wiodącą zasadą higieny w produkcji jest eliminacja patogenów i redukcja zakażeń do bezpiecznego (akceptowalnego) poziomu. Stosuje się także test oparty na zasadzie ELISA (rys. 4. Zdarza się to wówczas. Niedogotowanie zakażonego mięsa lub drobiu. Chłodnie nie powinny być przeładowane żywnością. co umożliwia namnożenie się zarazków do niebezpiecznego poziomu. Nieodpowiednie gotowanie jaj przechowywanych w chłodni. Spożywanie żywności przeterminowanej lub nawet przed datą bezpiecznego użycia. Przechowywanie żywności w zbyt wysokiej temperaturze. gdy żywność jest pozostawiana w temperaturze pokojowej. nie dając nawet żadnych objawów wskazujących na nieprzydatność do spożycia (nie zmieniony smak. których źródłem są handlarze żywności. Stosowanie noży do obróbki surowca. ryb) pocho331 . 2. Zakażenie surowca patogenami. Jest to szczególnie groźne wówczas. dobry zapach. Brudne ręce mogą zakażać surowiec (np. 6. 3. Takie jaja są bardziej zimne niż jaja (nieodpowiednio) trzymane w temperaturze pokojowej i muszą być gotowane dłużej. że Yersinia enterocolitica (i Listeria monocytogenes) mogą rozmna- 12. Pamiętajmy. lub nawet mniejszym. 12. Część zamrażająca musi mieć temperaturę nie wyższą niż -18°C. 8.1 ng/ml) krwinek czerwonych (lub cząstek lateksu) pokrytych antytoksyną (drobiny toksyny działają jako „mostki" pomiędzy krwinkami lub ziarenkami lateksu).2 Higiena żywności — w domu W samej kuchni zdrowa żywność może ulec zepsuciu. żać się w temperaturze 5°C lub nawet niższej. prawidłowy wygląd).

Pomimo opóźnienia na skutek preinkubacji próbki. Oznaczenia bakteriologiczne w CCP mogą wykazać obecność lub stopień zainfekowania. mogą również wykryć występowanie drobnoustrojów patogennych i w ten sposób wyznaczyć niezbędność szybkiej reakcji korygującej. szczególnie oparte na liczeniu kolonii. który niszczy błony cytoplazmatyczne wszelkich zakażających organizmów. proces produkcyjny może być kontynuowany. to jest tych etapów procesu. tak by możliwy był wzrost zakażających mikroorganizmów. Po takim zabiegu z komórki wycieka ATP. 2) identyfikację krytycznych punktów kontrolnych (CCP. wykrywany jest w następujący sposób. Obecność ATP.). Jedną z metod zapewnienia bezpieczeństwa spożycia jest stosowany na szeroką. w celu oznaczenia w obecności hydrolizującej ATPazy (wartość tła ATP). przemysłową skalę. Konieczne jest jedynie przechowywanie partii (transzy) poddanej analizie. System ten oparty jest na wykrywaniu zanieczyszczeń mikrobiologicznych w próbkach mleka UHT itp. wytwarzana na dużą. który pochodzi z żywych zakażających drobnoustrojów. co pozwala na wykonanie testu w ciągu 15-20 minut. Holandia). Cała procedura jest zautomatyzowana. 50 ml) przenosi się do kuwety bez ATP. w czasie których działalność prewencyjna lub korygująca może zapobiec zagrożeniom.3.1 System analizy krytycznych punktów zagrożenia (HACCP) System HACCP (ang. Żywność niepewna. jeśli taka jest wskazana. Produkty. stąd też sposoby produkcji i sprzedaży podlegają regulacjom prawnym. z których pobrano próbkę do oznaczeń. Analiza ta może obejmować również źródła surowca i rozprowadzenie (sprzedaż) gotowego produktu. Jego ilość określa się stosując reakcję lucyferyny z lucyferazą.2). światową skalę tzw. 12. Badane próbki preinkubuje się (30°C przez 48 godz. wywołującej pojawienie się światła (chemiluminescencja) w obecności nawet minimalnej ilości ATP. aby można było szybko interweniować w nowoczesnym procesie produkcyjnym. Wyemitowane światło mierzy się na fotopowielaczu (miernik światła). Landgraaf. Następnie próbkę traktuje się odczynnikiem.dzących od zwierząt zdrowych (niezainfekowanych) oraz na stosowaniu odpowiednich metod przechowywania i zapobiegania infekcji (sekcja 12. Metody tradycyjne. są zbyt powolne. a wynik przedstawia się jako wartość cyfrową. Oto niektóre szybkie metody: Lumac® Autobiolicznik Μ 4000 (Perstorp Analytical LUMAC. hazard analysis critical control points) sprowadza się w zasadzie do szczegółowego nadzoru nad procesem produkcyjnym i kontrolą dających się przewidzieć zagrożeń na poszczególnych etapach przeróbki surowca. Po inkubacji określoną objętość (np.3. może zagrażać licznym populacjom ludzkim. trafią do dystrybucji. Zasada wiąże się z oznaczeniem ATP w próbce. critical control points). Obejmuje on następujące fazy: 1) obiektywne oznaczenie momentów zagrożenia poprzez analizę wykresu ciągu produkcyjnego pokazującego wszystkie aspekty procesu. 3) monitorowanie na etapach CCP w celu oznaczenia. gdy wyniki oznaczeń są zadowalające. czy proces przebiega w granicach z góry określonej tolerancji. 332 . System HACCP. ang.

Limulus amoebocyte lysate).1) jest szczególnie przydatna do badania zakażeń mleka. ang. Za pomocą tego testu oznacza się ilość lipopolisacharydu (LPS).5. (patrz sekcja 2. Intensywność metabolizmu. tj. W niektórych przypadkach stopień zakażenia drobnoustrojami określa się mierząc wytwarzanie dwutlenku węgla. Metoda bezpośredniego oznaczania epifluorescencji na filtrach (DEFT. Przyjmuje się założenie.2. Zasada testu polega na koagulacji przez LPS krwinek (ameboctów) kraba Limulus polyphemus. gdy nie można zastosować oznaczania zmian oporności. direct epifluorescent filter technicjue) (patrz sekcja 14. że liczba bakterii w badanym materiale jest proporcjonalna do poziomu metabolizmu wykrywanego w pożywce. Pozwala na wykrycie zawartości LPS w minimalnej ilości.5. jak można założyć.5. oznacza się mierząc spadek oporu elektrycznego (wzrost przewodnictwa) w zależności od czasu. mniejszej niż 10-9 g/ml.9. Za pomocą testu LAL wyznacza się zawartość LPS zarówno żywych jak i martwych bakterii. pod warunkiem jej odpowiedniej specyficzności w stosunku do poszukiwanego drobnoustroju.Oznaczenie oporności.4). Oznaczenia z użyciem sond DNA. za pomocą którego wykrywa się określone bakterie stosując specyficzne startery — podobnie jak w diagnostyce bakterii chorobotwórczych (sekcja 8. a bliżej nieokreślone czynniki mogą hamować normalny metabolizm innych drobnoustrojów. ang. Próbkę żywności przenosi się do odpowiedniej pożywki wzrostowej.1).2) bakterii gramujemnych. jest spowodowany metabolizowaniem dużych cząsteczek i wzrostem liczebności jonów. Są jednak pewne problemy utrudniające interpretację: drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenie żywności mogą nie rosnąć w zastosowanej pożywce. . Modyfikacją tej metody jest test PCR (sekcja 8. Metoda ta jest szczególnie przydatna. Wyznakowana sonda DNA (sekcja 8.8. Spadek oporu.4. Określenie zawartości dwutlenku węgla. jego poziom.3) wykrywa określone gatunki bakterii w próbkach żywności. Test z wykorzystaniem lizatów amebocytów Limulus (LAL.

1. W procesie sporządzania kiszonek stosuje się różnorodne dodatki. W niedostatecznie sfermentowanych kiszonkach. Pozwala to na zachowanie wartości odżywczych zbiorów. Wytworzony kwas mlekowy gwałtownie obniża pH (do około 4. Bakterie fermentujące przetwarzają cukry roślinne (fruktozę. Bakterie.1 Kiszenie paszy i białko z jednokomórkowców 13. a jest to bakteria potencjalnie chorobotwórcza.1). monocytogenes rozmnaża się.różnorodne aspekty 13. lub jako pasza wpływają na przyrost masy karmionych nimi zwierząt. sacharozę) głównie na drodze fermentacji mlekowej (sekcja 5. W produkcji kiszonek na dużą skalę używane są wielkie czarne worki plastikowe zamiast silosów. Umożliwia to podawanie zwierzętom odpowiedniej paszy także w zimie. zabijając te bakterie (szczególnie z rodzaju Clostridium). w warunkach beztlenowych. L.1. z rodzaju Lactobacillus. które powodowałyby gnicie. Zakwaszenie powoduje także zahamowanie rozwoju Listeria monocytogenes.ROZDZIAŁ 13 Bakteriologia stosowana II . które przyspieszają kwaszenie.1. Zasada sporządzania kiszonek polega na fermentacji.1. żyją na powierzchni roślin i zatem również w zbiornikach (silosach).1.0). wywołująca np.1). ochrona roślin Bakterie nie tylko oddziałują na żyzność gleby (rozdział 10). glukozę. 334 . np. wobec niedostatku pokarmu roślinnego. gdy pH jest wyższe niż 5. poszatkowanej trawy. w których zakwasza się masę roślinną. 13. Powszechne jest również wzbogacanie kiszonki szczepami bakterii mlekowych wywołujących homofermentację (sekcja 5. lecz także mają swój pożyteczny udział w karmieniu zwierząt hodowlanych i ochronie niektórych zbiorów.1.1 Kiszonki Zakwaszanie jest tradycyjnym sposobem przechowywania traw (i niektórych innych roślin uprawnych).1 Karmienie zwierząt. poronienia lub obumarcie płodu.5.

wykorzystywanej przez człowieka. coli. rozpoczęto produkcję tysięcy ton białka bakteryjnego stosowanego jako paszę. które hamują rozwój grzybów w warunkach tlenowych. Stanowią one źródło białka paszy dla zwierząt i w diecie człowieka. CryIII. ang. 7.2 Kontrola biologiczna — inne zastosowania bakterii Termin „kontrola biologiczna" używany jest zwykle do określenia. 13.4) hodowany na podłożu metanolowym. Szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają różne typy owadobójczych kryształów białkowych (ICP. u których zablokowane jest stadium fosforylacji (rys. lub biopestycydami.14). oznaczanych symbolami Cry typu I-IV (z różnymi podtypami). gdy kiszonki są gotowe do skarmiania zwierząt. We wczesnych latach osiemdziesiątych.14). Większość białek ICP powstaje w czasie wytwarzania przetrwalników. aby osiągnąć efekt. Kryształy. stąd zabieg trzeba powtarzać. takich jak σΈ analogiczny do σΕ Bacilus subtilis (patrz rys. gdy cena białka była wysoka. drożdży i jednokomórkowych glonów) hodowanych na dużą skalę. którymi potraktowano plony. gdyż odpowiednie geny ICP podlegają transkrypcji z udziałem specyficznych czynników sigma. wykorzystywanie szczepionek zawierających bakterie fermentacji heteromlekowej.1. wytwarzające lotne kwasy tłuszczowe. właściwości bakterii ograniczającej liczebność lub aktywność biologiczną innych organizmów. podlegają transkrypcji w stadium wegetatywnym wzrostu. Udało się jednak zmodyfikować 335 . której obecność zwiększała asymilację amoniaku. podlegają szybko degradacji. FEMSMR 19: 53-68]. Rozważa się także możliwość modyfikowania bakterii metodami inżynierii genetycznej. Synteza ICP jest związana ze sporulacją. [Regulacja wytwarzania ICP: Baum i Malvar (19995) MM 18: 1-12]. metylotrof (sekcja 6. w celu nadania szczepionce właściwości rozkładu wielocukrów.2 Białko z organizmów jednokomórkowych (SCP) SCP (ang. 7. Do genomu tej bakterii wbudowywano gen E. odpowiedzialny za wytwarzanie dehydrogenazy glutaminianowej.W zależności od potrzeb bierze się pod uwagę dodawanie szczepów bakterii dostosowanych do rozkładu surowca roślinnego. Na dużą skalę właściwość ta znajduje zastosowanie między innymi w rolnictwie i leśnictwie.1. Mają one szerokie zastosowanie wobec licznych owadów — szkodników plonów. Geny odpowiedzialne za wytwarzanie tych białek zwykle umiejscowione są na plazmidach. Bakterią wykorzystywaną do tego celu był Methylophilus methylotrophus. Bakterie takie (lub ich toksyny) nazywa się bioinsektycydami. 13. single-cell protein) uzyskuje się z komórek niektórych drobnoustrojów (bakterii. jako kryształy umiejscowione wewnątrz komórki w sąsiedztwie endospor. insecticidal crystal protein). Geny dla ICP. a ich silne wyrażenie występuje u mutantów.1. Polega ona na wprowadzaniu do środowiska określonych drobnoustrojów lub ich toksyn w celu zabicia ewentualnie uszkodzenia owadów stanowiących zagrożenie dla upraw. wówczas gdy surowiec roślinny zawiera mało rozpuszczalnych węglowodanów [nowe tendencje w szczepieniu kiszonek: Weinberg i Muck (1996).

z ubogich rud zawierających chalkopiryt (CuFeS2). elektrolizę. To powoduje wypłukiwanie siarki.Β. Pseudomonas fluorescens może zmniejszać straty niektórych upraw wywoływane przez mróz. co prowadzi do powstania żelaza rozpuszczonego. Żelazo (Fe2+) wypłukiwane z rudy jest utleniane przez bakterie do Fe3+. B. Ługowanie miedzi przy bardzo niskim pH. Pożywkę dla bakterii stanowi albo stosowany w procesie płyn wymywający. Szacuje się. Podejmowane są wysiłki. thuringiensis. wykorzystując składniki odżywcze niezbędne dla bakterii „lodotwórczych" powodujących powstawanie kryształków lodu (sekcja 10. uzyskać odmiany bakterii toksycznych dla komarów przenoszących zarazki takich chorób jak malaria. Zastosowanie bakterii gramdodatnich w procesach kontroli biologicznej omówione zostało przez Emmermeta i Handelsmana (1999) FEMSML171. Jony żelazowe (Fe3+). (1995) Biotechnology 13: 67-71]. Niektóre szczepy B. Jedna ze stosowanych metod polega na recyklicznym przepuszczaniu roztworu z kwasem siarkowym przez pokruszoną rudę z zawartymi w nim bakteriami chemolitotroficznymi. Metabolizm litotroficznych bakterii przepro336 . odgrywają aktywną rolę zarówno w utlenianiu pirytu.2 Biokopalnictwo (bioługowanie) Od wielu łat bakterie chemolitotroficzne (gatunki np. jak i tiosiarczanów. Metabolizujące bakterie utrzymują temperaturę około 40-50°C. a produkty rozkładu zwierają tiosiarczany i politioniany. Davidson i Liu (1993) MR 57: 838-861]. a konwekcja powietrza zabezpiecza niezbędne warunki tlenowe. lub bioługowaniem) ma jeszcze większe znaczenie w związku z wyczerpaniem się zasobów niektórych bogatych rud.6). albo sama ruda. uzyskuje się stosując odpowiednie szczepy Thiobacillus thiooxidans i Leptospirillum ferrooxidans. między innymi (wykorzystując techniki inżynierii genetycznej).1-19]. New York: McGraw-Hill]. W celu oznaczenia bakterii przeprowadzających ługowanie bada się region DNA zawarty między genami dla 16S i 23S rRNA (patrz sekcja 16. że biologiczne wypłukiwanie pirytu przebiega w sposób cykliczny. wytwarzane w wyniku 2+ utleniania jonów Fe przez bakterie. korzystne. tak by substancja toksyczna dla owadów gromadziła się wewnątrz toksykogennych bakterii — wykazując w tej formie wysoką aktywność [Lereclus i wsp. filarioza i żółta gorączka [Porter. Leptospirillum ferrooxidans (utleniacz żelaza) i Thiobacillus thiooxidans (utleniacz siarki) mogą przeprowadzać te procesy. że roczne odzyskiwanie miedzi metodami mikrobiologicznymi przekracza 1 milion ton [Ehrlich i Brierley (1990) Microbial Mineral Recovery. sphaericus i Clostridium bifermentans 13. która jest utleniana do siarczanu. gdyż zapobiega precypitacji Fe 3+ . Dziś takie biokopalnictwo (zwane też biogórnictwem.4). Z badań nad przemianami siarki w procesie ługowania wynika. DNA potrzebny do badań ekstrahuje się z substancji wyługowanych [Vasquez i Espejo (1997) AEM 63: 332-334]. Miedź można odzyskać np. Thiobacillus) stosowano na skalę przemysłową w celu wydobywania (ługowania) niektórych metali z ubogich rud. Z materiału wyługowanego usuwa się periodycznie miedź (do 5 gramów na litr) — stosując np. thuringiensis. by. wytwarzają toksyny zabijające komary.

1).3) oraz innych organizmów. substancje rozpuszczone i koloidalne. które wydobywa się traktując cyjankami. ścieki komunalne.wadzających ługowanie utrzymuje stały poziom tych jonów [Schippers. a jego stabilność jest niezależna od Ca 2+ . gdyż piryt i arsenopiryt zawarte w rudzie chronią złoto przed cyjankami. Uaktualniony przegląd głównych typów bakterii w przemysłowych procesach bioługowania podaje Rawlings. Mogą na przykład stać się źródłem infekcji. W ich skład wchodzą zawiesiny. cyjanki — utlenione do dwutlenku węgla i mocznika. dla których tlen jest niezbędny. Bakterie. gdyż proszki do prania zawierają zazwyczaj związki chelatujące między innymi jony wapnia usuwane w celu zmiękczania wody. których produkty metabolizmu zawierają 337 . z urządzeń sanitarnych). znajdujące się w dużych ilościach w ściekach. między innymi w Afryce Południowej. np. Rozkruszona ruda jest poddawana działaniu bakterii (fot.4 Oczyszczanie ścieków Ścieki zawierają zarówno zanieczyszczenia z mieszkań i domów (tzw. Jozsa i Sands (1996) AEM 62: 3424-3431]. Inny ważny problem stanowią związki organiczne w ściekach. licheniformis. uzyskiwany z B. hydrolizuje większość wiązań peptydowych białek i niektóre wiązania estrowe lipidów. szkodliwe działania. Wytwarzają je gatunki Bacillus. Drobnoustroje w kopalnictwie (artykuł przeglądowy): Rawlings i Silver (1995) Biotechnology 13: 773-778].2 i rys. Powstające warunki beztlenowe umożliwiają wzrost bakterii redukujących siarczany (sekcja 5. odsłaniając złoto. 13. 13. cholery. metabolizują substancje organiczne. jako podstawową metodę wydobywania złota z tzw. to jest za pomocą cyjanków. szybko wykorzystując dostępny tlen na obszarach wodnych. przez adsorpcję na węglu. Ścieki zrzucone do rzek i jezior mogą wywierać różnorakie. jak również pochodzące z działalności przemysłowej i rolniczej. Ta druga właściwość jest ważna.1. zwany „subtylizyna Carlsberga". W ostatnich latach zastosowano bioługowanie. ubogich rud arsenopirytowych. Złoto oddziela się z kompleksu z cyjanem. Tributsch i Hansford [(1999) Microbiology 145: 5-13]. nie jest możliwe. szczególnie w wodach nieruchomych lub wolno płynących. Płyn pozostały po ługowaniu może być oczyszczony przez bakterie. Enzym ten jest stabilny w szerokim zakresie pH. [Mikrobiologia ługowania metali (sprawozdanie z konferencji): FEMSMR (1993) 11:1-267. Jeden z tych enzymów.3 Biologiczne proszki do prania „Biologiczne" (zwane u nas enzymatycznymi) proszki do prania zazwyczaj zawierają enzymy nazywane subtylizynami. a arsenopiryt (FeAsS) podlega upłynnieniu przez utlenianie (do FeAsO4 i H2SO4). a mocznik utleniony do azotanu. 13. Oznaczać to może śmierć ryb i innych zwierząt.1. Z tego typu rud wypłukiwanie złota metodami zwykle stosowanymi. Brazylii i Australii. 10.

kwasem i pożywką dla bakterii. stanowiące tzw. w którym usuwane są cząstki nierozpuszczalne. Mieszaninę przepuszczono przez szereg nawietrzanych tanków bioutleniających zaszczepionych bakteriami chemolitotroficznymi.1 Tlenowe oczyszczanie ścieków Surowe (to jest poddane oczyszczaniu) ścieki wprowadza się w celu wstępnej obróbki do zbiornika sedymentacyjnego. złożonymi z drobnoustrojów. złożach zraszanych. Podstawowe cele oczyszczania ścieków to. Fotografia — dzięki uprzejmości A.Arsenopiryt został roztarty na pyl. Bakterie upłynniają arsenopiryt — odsłaniając zawarte w nim złoto. jest usuwany. stapiania (utleniania w wysokiej temperaturze) i ługowania pod ciśnieniem. napowietrzanym.4. osad. które teraz może być ekstrahowane za pomocą cyjanku. po pierwsze — wyeliminowanie lub zmniejszenie liczby drobnoustrojów patogennych. W wyniku bioługowania ilość odzyskanego złota może być dwukrotnie większa niż bez tego zabiegu. Bioługowanie nie wymaga dużej energii w porównaniu z tradycyjną metodą uzyskiwania złota z rud ubogich. BZT w ściekach. siarczki i inne trucizny. 338 . Jego nadmiar wraz z opadłymi kłaczkami. to jest zmniejszenie biologicznego zapotrzebowania tlenu. po drugie zmniejszenie zużywania tlenu przez ścieki. W tej fazie wstępnie oczyszczone ścieki poddawane są drugiemu etapowi na przykład na tzw. w środowisku zakwaszonym. zmieszany z wodą. tzw. 13. np. Hartleya.

13.3. Wraz z rozproszonymi ściekami na złoże dostaje się tlen w postaci rozpuszczonej.2.2. Błonki składają się z dużej ilości pierwotniaków (orzęski) i licznych bakterii tlenowych. dół. głównie bakterii (np. Alcaligenes spp. w porównaniu ze zwykłym urządzeniem filtrującym o podobnych rozmiarach. ameby). wprowadza się do zbiornika (reaktora) zawierającego osad czynny będący zbiorowiskiem różnych organizmów. Zita i Hermansson (1998) Microbiology 144: 519-528]. osadu czynnego. Drugim sposobem oczyszczania tlenowego jest stosowanie tzw. lub innego zbiornika wodnego nie zużywa w nich tlenu — odmiennie niż ścieki przed oczyszczeniem.. [Olofsson. to jest agregacji występujących organizmów. z których wycieka przez umieszczone w nich otwory. Proces flokulacji jest ułatwiony hydrofobowością powierzchni komórek. Przepływając przez złoże. 10. Rezultatem jest znaczne obniżenie wartości BZT. umieszczonych w postaci grubej warstwy w zbiorniku. prowadzącą do łączenia się ich w tzw. Pełne oczyszczenie wymaga skutecznej flokulacji. dół).. Substancje organiczne zawarte w ściekach podlegają biologicznemu utlenieniu. jako rezultat rozmnażania się drobnoustrojów. rys. [Structure of microbial communities in sewage treatment plants: Amann. Osad podlega rozproszeniu za pomocą obracających się rur.4). w błonkach biologicznych rozwijają się także bakterie nitryfikacyjne (sekcja 5. ścieki wchodzą w kontakt z tzw. wiciowce. ponieważ nitryfikacja jest pierwszym 339 . Urządzenie zasadniczo zbudowane jest z zanurzonego złoża. Całkowicie oczyszczone ścieki odpływają z urządzenia oczyszczającego po przepłynięciu przez osadnik usuwający osad. W czasie oczyszczania metodą osadu czynnego jego objętość zwiększa się. Jest to korzystne. Ścieki.2). a tym samym napowietrzanie znaczne. Zoogloea ramigera) i pierwotniaków (orzęski.2. które później osadzają się tworząc osad. 13. składającego się z małych granulek. Powoduje to utlenienie substancji organicznej lub jej asymilację w postaci komórek biomasy. Usuwany oczyszczony ściek ma już znacznie obniżone zapotrzebowanie na tlen i zrzucony do rzeki. Acinetobacter spp. 13. wstępnie oczyszczone przez sedymentację. Dochodzi w ten sposób do mineralizacji materii organicznej zawartej w ściekach (sekcja 10. Lemmer i Wagner (1998) FEMSME 25: 205-215]. błonkami biologicznymi otaczającymi rozdrobnione kamienie. Gdy przepływ ścieków jest odpowiednio duży. dzięki drobnoustrojom w błonkach biologicznych. Ścieki dostają się do wnętrza kłaczków przez kanały (pory w obrębie kłaczków). góra). Duże ilości bakterii w błonkach biologicznych stają się pokarmem dla pierwotniaków. wstawka). a część zostaje zachowana w celu ciągłego stosowania w procesie oczyszczania kolejnych partii ścieków. pokrytych błonką biologiczną (fot.2. W ostatnim dziesięcioleciu udoskonalono proces oczyszczania ścieków stosując technologię napowietrzanych filtrów biologicznych (fot.będących rodzajem filtra biologicznego (fot. Tego typu złoże zawiera do pięciu razy więcej biomasy w postaci błonki biologicznej. takich jak Zoogloea ramigera.1. Unowocześnione reaktory zajmują więc mniej miejsca. Powietrze wtłaczane jest od dołu złoża. a zastosowanie drobnych granulek powoduje odsączanie małych cząstek zawartych w ścieku oraz mineralizację w ściekach substancji organicznej. kłaczki dostrzegalne gołym okiem. Właściwe złoże składa się z rozkruszonych kamieni. Sphaerotilus natans. Płyn i osad energicznie miesza się i napowietrza przez 6-12 godzin.

340 .

2). a powstające cukry są fermentowane (przez bakterie z rodzaju Bacteroides i Clostridium).1. Francja. pozostałości po oczyszczaniu w warunkach tlenowych.1) Góra — złoża zraszane. a głównym nitryfikatorem jest Nitrosomonas [Logemann i wsp. np. przepuszczając wodę w odwrotnym kierunku.2 Tlenowe oczyszczanie ścieków.5 g azotu na litr. (1994) FEMSME 14: 71-78]. rys. Zbiorniki oczyszczające okresowo przemywa się. Procesy te przeprowadzają liczne bakterie. Produktami fermentacji są octany. 13. nawet wówczas. których metabolizm odbywa się bez udziału tlenu. Exeter. Większość węgla zostaje usunięta ze ścieków w postaci dwutlenku węgla i metanu. 13. UK. Polimery.2 i 10. częściowo już oczyszczony.1. znaczne ilości azotu zostają usunięte z urządzeniach złożonych z reaktorów naprzemiennych: tlenowych i beztlenowych. 11000x) na powierzchni złoża „dwuwęglanowego".2 Beztlenowe oczyszczanie ścieków Ścieki zawierające w dużej ilości zanieczyszczenia stałe. może zostać poddany procesowi denitryfikacji (sekcja 5. Fotografie z mikroskopu elektronowego bakterii na cząstkach dwuwęglanu — uprzejmość Anjou Recherche — OTV. np. Proces ten został przedyskutowany przez Kuenena i Robertsona [(1994) FEMSMR 15: 109-117]. w ten sposób zmniejszając koszt. Urządzenie to pracuje w temperaturze 35°C.etapem usuwania azotu ze ścieków. Jednym z ostatnich osiągnięć jest zastosowanie reaktora. Do denitryfikacji można również wykorzystywać bakterię. Fotografie złoża — dzięki uprzejmości B. etanol. gdy zawartość amoniaku jest wyższa od 0. wielocukry. Compagnie Generale des Eaux. gdyż używany jest tylko jeden reaktor. Konwalia. South-West Water. (1998) FEMSME 27: 239-249]. Maisons Laffitte.2.1. co prowadzi do zanieczyszczeń zbiorników wodnych.4. Usunięcie soli amonowych ze ścieków przeciwdziała eutrofizacji w odbieralnikach wodnych. która przeprowadza ten proces tlenowo [Patureau i wsp. Część dolna (wstawka): bakterie (pow. Jeśli nitryfikacja jest skuteczna.4. w Bodmin. ABIPP. Fot. są trawione przez egzoenzymy. 341 . Termin eutrofizacja oznacza nadmierne wzbogacenie wody w substancje odżywcze wykorzystywane przez glony i sinice (cyjanobakterie) do wzrostu. Lessware'a. odpady z ferm. wypływający ściek. UK. w którym proces nitryfikacji przebiega z dużą wydajnością. w którym przebiega nitryfikacja i denitryfikacja.3. Trzy podstawowe metody oczyszczania ścieków w warunkach tlenowych przedstawiono w tabeli 13. propioniany. mleczany. mogą być poddane procesom beztlenowym. Rozkład ścieków przebiega zwykle w temperaturze około 35°C. Ponieważ metoda ta może także być zastosowana w warunkach beztlenowych (co sprzyja denitryfikacji). Po oczyszczeniu związki amonowe są prawie zupełnie utlenione do azotynów. Wówczas wielkocząsteczkowe związki organiczne podlegają rozkładowi do substancji prostych i gazów. stosowanego w niektórych oczyszczalniach typu BAF. 10. ok. dwutlenek węgla i wodór. wg starej i nowej technologii (patrz sekcja 13.

aby wyeliminować z niej zarazki. Jest to tylko pozornie najtańszy sposób pozbycia się zanieczyszczeń ściekowych. 13. w podziemnych zbiornikach wodnych. Ważne jest także. 342 . lub zmniejszenie do bezpiecznego stopnia ilości substancji szkodliwych. Na przykład Kanada i Szkocja wykorzystują przede wszystkim wody powierzchniowe. W tej postaci może być stosowany w rolnictwie jako nawóz.4. Wody powierzchniowe są z reguły bardziej zanieczyszczone. cholera). Proces uzdatniania wody pitnej ma też drugi cel — usunięcie. Cena niszczenia środowiska jest olbrzymia. Produkt gazowy (tzw. podczas gdy Austria.Końcowy produkt oczyszczania beztlenowego jest prawie bezwonny i bogaty w biomasę złożoną z drobnoustrojów. Dania i Portugalia — głównie zasoby podziemne. bez smaku i zapachu. 13. by końcowy produkt był klarowny. zależnie od położenia geograficznego jej użytkowników. Stopień wykorzystywania wód powierzchniowych jest różny.3 Wpływ oczyszczania ścieków na środowisko Technologia właściwego oczyszczania ścieków jest znana i stosowana od wielu lat. powodujące choroby (np. Mimo to nadal buduje się systemy rurociągów.5 Skąd pobieramy wodę? Słodką wodę pobieramy głównie z rzek (woda powierzchniowa) i podziemnych cieków wodnych zalegających między skałami. Jest to źródło energii wykorzystywane w procesie oczyszczania. biogaz) zawiera ponad 50% metanu. Woda przeznaczona do spożycia powinna być odpowiednio uzdatniona. którymi część ścieków usuwa się wpuszczając je do zbiorników wodnych mórz i oceanów.

przesączania przez „szybkie" filtry piaskowe i dezynfekcji (patrz niżej). 13. Powoduje to usunięcie z piasku cząstek. Pozostałe drobne cząstki różnych substancji usuwa się dodając koagulanty (np. składają się z warstwy piasku o mniejszych ziarenkach. która zawiera już tylko bardzo drobne cząstki oraz substancje rozpuszczone. może być poddawana dalszemu oczyszczaniu na tzw. jak i podpowierzchniowa (gruntowa) zawiera tlen czasem w niewielkich stężeniach.1 Uzdatnianie wody na dużą skalę — do spożycia w miastach Woda. zlepione zazwyczaj śluzem. w górnej swej części stwarzają warunki rozwoju błonki biologicznej złożonej z bakterii i glonów — dzięki temu filtr piaskowy działa nie tylko jako sito mechaniczne. Im jej początkowa jakość jest gorsza. Usuwają również toksyny wytwarzane przez sinice. Woda zarówno powierzchniowa. o średnicy ziaren około 1 mm. W praktyce stosuje się zabiegi w różnych kombinacjach.5. szybkich filtrach piaskowych. tworzą warstwę. a płyn znad osadu bywa poddawany odsączaniu w bębnach z nierdzewnej stali.1 Uzdatnianie wód gruntowych Wody gruntowe (podziemne) pobierane są ze studni głębinowych i ze źródeł. Konieczne jest natomiast specjalne oczyszczanie wówczas. gdy woda gruntowa zawiera znaczne ilości azotynów (patrz niżej). Mają one zazwyczaj dobrą jakość i wymagają jedynie słabego napowietrzania. lecz także pełni funkcję oczyszczania biologicznego. zanim zostanie poddana procesowi oczyszczania. tak że musi być wówczas napowietrzana.2 Uzdatnianie wód powierzchniowych Zanieczyszczona woda. siarczan glinu).5.13.1. za pomocą urządzeń kaskadowych lub rozpylających. Woda. mineralizując substancje organiczne i usuwając częściowo azot i fosfor. z zanieczyszczonych rzek. Tanki klarujące wodę działają w procesie ciągłym. Złoże piasku oczyszcza się tłocząc od dołu powietrze.1. Z nich — czysta woda podawana jest do dalszej obróbki. Woda spływa poprzez warstwę piasku. np. Pod ich wpływem zanieczyszczenia łączą się w duże kłaczki. zanim trafi do systemu rozprowadzania i pobierania jej. może być pozostawiona w zbiornikach sedymentacyjnych. Filtry piaskowe. Filtry piaskowe powolne mogą również eliminować substancje psujące smak i nadające wodzie niemiły zapach. które następnie muszą być oddzielone od wody.5. Jest to konieczne. zwane powolnymi. poddawana jest różnorodnym zabiegom. działających na zasadzie mechanicznego sita. o wielkość otworów około 30 μm). zapewniających dobry kontakt wody z powietrzem. 343 . nad którą znajduje się klarowna woda. W tym celu wodę pompuje się do górnej części urządzenia. które zostały oddzielone od wody w procesie filtracji. tym procesy uzdatniania muszą być bardziej złożone. w którym kłaczki. W tych warunkach niektóre drobne cząstki osadzają się na dnie. a następnie wodę. aby zapewnić skuteczność dalszego oczyszczania. 13.

jak Anabaena. Skuteczność dezynfekcji zależy jednak na połączonym działaniu rodników. choroby wątroby i inne przypadłości u człowieka i zwierząt [Bell i Codd (1994) RMM 5: 256-264].1). której pH jest niższe od 7. 344 . HClO i CIO-. durowi brzusznemu i wielu innym chorobom. Dezynfekcja.5 mg/litr).1) dodatek chloru do wody powoduje powstanie wolnych rodników. W odpowiednich warunkach drobnoustroje te żyją w różnych zbiornikach wodnych. gdy woda została odpowiednio napowietrzona. aby osiągnąć ten stan. coli oraz różne gatunki Campylobacter. Nadmiar chloru jest w tym przypadku usuwany przez dodatek dwutlenku siarki. Działanie dwutlenku siarki przerywa się. związku chloru najbardziej skutecznego w dezynfekcji. ale bardziej trwałe niż chlor. uwalniając chlor. Powolne filtry piaskowe nie są oczyszczane przez odwrotny przepływ wody. Po osiągnięciu punktu załamania (rys. Dlatego też zabieg chlorowania zapobiega cholerze. które reagując z wodą dostarczają Cl2. Chlor. Są one mniej skuteczne. Do tego rodzaju niebezpiecznych toksyn należą substancje występujące w tzw.5 części na miliom (ppm) ( = 0. które rozkładają się wolno. Chlorowanie dużymi dawkami. tzw. Clostridium. W tych warunkach dysocjacja kwasu podchlorowego. Aphanizomenon. dalsze chlorowanie jest źródłem wolnych rodników chloru. Chlor działa skuteczniej w wodzie. Prowadzi to do zmniejszenia zawartości związków chloru. Celem tego zabiegu jest eliminacja zapachu i złego smaku wody przeznaczonej do picia. 13. zakwitach sinic. Są to między innymi takie bakterie jak E. Gdy ten poziom „zapotrzebowania" chloru przez system zostanie osiągnięty. Salmonella.1. Jeśli woda zawiera amoniak. Microcystis. Zalecanym poziomem wolnych związków chloru jest około 0. a następnie złoże piaskowe jest uzupełniane świeżym piaskiem. Przed dezynfekcją (zazwyczaj na drodze chlorowania) pH wody może wymagać skorygowania metodą chemiczną. Są one substancjami dezynfekującymi. zwykle za pomocą chloru. który działa szczególnie skutecznie na bakterie patogenne pochodzące z odchodów. a wytwarzane przez nie toksyny mogą powodować stany zapalne przewodu pokarmowego. sulfonację. Błonka biologiczna zawierająca także bakterie nitryfikacyjne (patrz sekcja 5. jest słabsza.które mogą żyć w wodach. Część chloru zostaje od razu związana i unieczynniona w wyniku tego procesu. dawka chloru musi przekroczyć punkt załamania (rys. będąc silnym czynnikiem utleniającym. 13. Dalsze dodawanie chloru powoduje utlenianie chloramin. Zwiększanie zawartości chloru w wodzie zwiększa zawartość chloramin do maksimum (zależnego od początkowej zawartości amoniaku). wraz z chlorem. Tak więc. reaguje on z chlorem tworząc chloraminy. Shigella i Vibrio. w wyższym stopniu niż na zawartości wolnych rodników. jedynie górna warstwa piasku jest od czasu do czasu usuwana. Nodularia i Oscillatoria. gdyż kwasowość ma wpływ na skuteczność chlorowania. Nieliczne stacje uzdatniania wody stosują dodawanie amoniaku. gdy zostanie osiągnięty normalny resztkowy poziom chloru.2) działające w warunkach tlenowych. Z tej przyczyny powolne filtry piaskowe spełniają swe funkcje tylko wówczas. reaguje i jest pobierany przez różnorodne zanieczyszczenia wód. Woda przeznaczona do spożycia jest dezynfekowana.

Ozon (w porównaniu z chlorem) jest silniejszym środkiem dezynfekującym.1. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO). W tabeli 13. że chlorowanie wody nie usuwa wszystkich zagrożeń zakażenia. po zadziałaniu ozonem można stosować chlorowanie małymi dawkami.2). Oznaczanie zawartości wolnego chloru. a następny odcinek określa spadek skuteczności chlorowania. Byłoby działaniem niepraktycznym badanie próbek na obecność poszczególnych. Zawartość wolnego chloru w wodzie odczytuje się na podstawie intensywności czerwonej barwy powstającej w wyniku reakcji DPD z chlorem. Niektóre wirusy (np.2 podano wykaz niektórych obowiązujących norm. grubościenne oocyry Cryptosporidium) mogą przeżyć rutynowe chlorowanie. Oznaczenie skuteczności dezynfekcji. Gdy związane pozostałości (chloraminy) osiągną najniższy poziom (poziom załamania).Chlor wprowadzony na początku może utleniać różne związki i jony. gdyż określony patogen 345 . chloru i produktów jego reakcji z wodą (sekcja 13. tj. w którym zaczyna on utleniać chloraminy (do N2 i HC1). oraz agencje krajowe określają normy jakości bakteriologicznej wody pitnej. wirus Norwalk) i pierwotniaki (np. Niektóre bakterie. lecz działa krócej. Dodając dalej chlor osiąga się punkt. Należy pamiętać. Powstałą barwę porównuje się z wzorcową skalą barw. albo też na późniejsze skażenie. szczególnie bakterii z grupy coli (patrz Aneks) i „paciorkowce kałowe" — są wskaźnikami zanieczyszczenia odchodami. związane pozostałości chloru) widoczny jest na krzywej jako wzrost zawartości resztkowego chloru.Ν-dietylo-p-fenylenodiaminy (tabletki DPD). dalsze dodawanie chloru prowadzi do gromadzenia się wolnych resztek chloru. Pałeczki okrężnicy i paciorkowce kałowe są organizmami wskaźnikowymi ze względu na ich obfitość w jelitach. Wówczas ich zawartość (jako pozostałości chloru) maleje.5. tworząc monochloroaminę (NH2C1). Ich obecność w uzdatnionej wodzie pitnej wskazuje na niewłaściwy stopień oczyszczania wody. Początkowy odcinek krzywej wskazuje na zapotrzebowanie chloru przez system. jak również Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (USEPA). Test można przeprowadzić na przykład za pomocą Ν. Aby osiągnąć wysoki stopień odkażenia wody. Wzrost poziomu chloramin (tj. Ich obecność w próbkach wody wskazuje na możliwość skażenia ściekowymi drobnoustrojami chorobotwórczymi. Wzrost zawartości chloru prowadzi do pojawienia się dichloroaminy (NHCl2). Dodany chlor reaguje z amoniakiem. podobnie jak Komisja Europejska (EC). licznych zarazków mogących występować w ściekach.

1). należy wykonać dwa dodatkowe testy (przeprowadzane w temperaturze 44°C/24 godz. coli. w których gromadzi się gaz powstający w wyniku fermentacji cukru.może przebywać tam jedynie przejściowo. 346 . Test probówkowy. gdy badaniu poddaje się próbki wody chlorowanej. bakterie wskaźnikowe występują w jelitach w znacznie większych ilościach niż zarazki (np. E. gdyż bakterie wytwarzające spory są bardziej oporne na ten zabieg niż pałeczki okrężnicy. 14. Jednym z tradycyjnych testów na wykrycie bakterii wskaźnikowych jest metoda sączenia przez filtry membranowe (wielkość por około 0. Umożliwia to również wykrycie nawet bardzo małych zanieczyszczeń wody odchodami. uzyskuje się potwierdzenie obecności E. oraz wytwarzanie indolu z tryptofanu. zbierającego się w rurce Durhama.1. Błąd tego typu jest szczególnie prawdopodobny. Dla potwierdzenia.). W tym ostatnim z każdej „pozytywnej" probówki dokonuje się posiew na podłoże (np. gdyż podobny rezultat otrzymujemy w przypadku obecności w próbce pewnych bakterii przetrwalnikujących. E. że w próbce jednak znajdowały się pochodzące z odchodów bakterie coli. coli — około 108 komórek na gram odchodów). W rzeczywistości wynik podaje jedynie przypuszczalną liczbę bakterii coli. Następnie filtry suszy się i nasącza odpowiednim podłożem bakteriologicznym. bulion MacConkeya — tab. Liczbę dodatnich i ujemnych probówek porównuje się z tablicą statystyczną.2. W probówkach. Jest to podłoże selekcyjne. umożliwiające wytworzenie kolonii na filtrze jedynie określonym bakteriom. które zawiera czynnik powodujący zahamowanie wzrostu bakterii przetrwalnikujących. Równe objętości wody dodaje się do szeregu probówek zawierających pożywkę z laktozą (np.2 μm). test wypadnie pozytywnie i wykaże fermentację laktozy oraz wytworzenie gazu. w których znalazła się przynajmniej jedna pałeczka coli (w określonej objętości). które także fermentują laktozę i wytwarzają gaz. Jest to test indolowy (patrz sekcja 16. bulion tryptozowy z laurynianem i laktozą). z której odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL) pałeczek coli w próbce wody. np.5) oraz test Eijkmana. Dlatego też identyfikacja tych właśnie bakterii w badanej próbie jest łatwiejsza. które są tolerancyjne na podwyższoną temperaturę. Co ważniejsze. Inkubując podłoże w 44°C i wykrywając fermentację laktozy z produkcją gazu. W podłożu umieszcza się małe probówki (rurki) Durhama. coli w badanej próbce wody.

że na wzrost drobnoustrojów ma wpływ zawartość fosforu. Duża liczba E.1. Wykrycie źródeł skażenia wody odchodami może ułatwić informacja dotycząca spektrum oporności na antybiotyki paciorkowców kałowych. do której dostały się odchody ludzkie lub zwierzęce [Wiggins (1996) AEM 62: 3997-4002]. Górna. Welch i Smith (1996) AEM 62: 2201-2211]. Vartiainen i Martikainen (1996) Nature 381: 654-655].5.Woda należycie chlorowana nie powinna zawierać bakterii wskaźnikowych. Jednakże ostatnio. niekiedy miesza się z wodą o małej zawartości. Problem azotanów. Taka sytuacja może prowadzić do złożonych interakcji wielu przeróżnych parametrów (ponowny wzrost pałeczek coli w wodzie pitnej [LeChevallier. która zawiera azotany w dużym stężeniu. coli we wspomnianych testach wskazuje na znaczne zanieczyszczenie ujęć wodnych. izolowanych w przypadku zakażeń wywołanych spożyciem wody. Można również taką wodę przetrzymywać przez dłuższy czas w stacji uzdatniania. Azotany występują w wodach powierzchniowych i ostatnio coraz częściej w wodach gruntowych. jako skutek używania nawozów w rolnictwie. gdy dotyczy to rur wodociągowych. 13. 347 . Pestycydy i niektóre inne toksyczne substancje można usuwać poprzez adsorpcje na węglu aktywowanym. Zarazki mogą się dostać do wody gotowej już do picia poprzez uszkodzone rury. wieże ciśnień. mogą obniżać jakość wody i ograniczać wydajność jej pompowania. Usuwanie wspomnianych wyżej substancji szkodliwych określane jest jako trzeci stopień oczyszczania. Manz i Szewzyk (1997) FEMSME 22: 265-279]. wykazano. zawory i inne urządzenia. Wodę. pestycydów i innych substancji. którego dostępność zwiększa się działaniem chloru i ozonu.3 Problemy związane z systemami rozprowadzania Masowe namnażanie drobnoustrojów i wytwarzane przez nie śluzy. jeśli poziom resztkowy środka dezynfekującego jest nieodpowiedni. Wówczas możliwa jest denitryfikacja (patrz sekcja 10. dopuszczalna granica zalecana przez Unię Europejską/Wlk. lub wtórne zanieczyszczenie uzdatnionej już uprzednio wody. [Drinking water biofilms: Kalmbach. Nawet wówczas gdy zawartość węgla w wodzie jest duża. np. Brytanię (NO3/litr) wynosi 50 mg/litr.3.2). i mogą się w nich namnażać. dzięki badaniom prowadzonym w Finlandii. Wartość zalecana przez USEPA (str. Niewielka liczba pałeczek okrężnicy sugeruje słabsze lub wcześniejsze zanieczyszczenie. Praktykuje się również usuwanie azotanów na drodze jonowymiennej. namnażanie drobnoustrojów zostaje ograniczona w warunkach deficytu fosforu. Usunięcie fosforu z wody może stanowić ważny czynnik ograniczający koszt działań zapobiegających zjawisku bujnego rozmnażania się drobnoustrojów w rurach wodociągowych i w urządzeniach towarzyszących [Miettinen. będącymi środkami utleniającymi. Zjawisko nadmiernego rozmnażania się drobnoustrojów w systemie rozprowadzania wody wiązany był z obecnością węgla organicznego. pompy. 345) wynosi 44.29 mg/litr (to jest 10 mg/litr w formie N).

Prowadzi to do ograniczenia funkcji mięśni i ich paraliżu. nazwa handlowa firmy Zeneca. W niektórych krajach rozwijających się wprowadza się nowe metody poprawiania jakości wody przeznaczonej do picia na terenach wiejskich. jad kiełbasiany) blokuje wydzielanie neuroprzekaźnika . tetani wytwarzają groźne neurotoksyny. Działanie to znacznie zmniejsza występowanie cholery w takich krajach jak Bangladesz [Huq i wsp. albo traktowana tabletkami halazonu (p-karboksylo-N. [Neurotoksyna botulinowa (zastosowania medyczne) Schantz i Johnson (1992) MR 56: 80-99. np. Jeśli podłoże uzupełni się odpowiednimi składnikami.1). zeza.5. np. białego proszku. które podlegają oczyszczeniu do postaci drobnego. uwalniając chlor. Polimery (albo PHB. Homopolimer (PHB) jest wytwarzany w odpowiednich warunkach hodowli. sekcja 2. wiejskie ujęcia wody. W Kenii do dezynfekcji wody do celów spożywczych stosuje się ciepło pochodzenia słonecznego. Woda w małych ilościach (np.6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka Takie zarazki jak Clostridium botulinum i C. 13. Kontrola składu podłoża wpływa na proporcję obu składników w polimerze. Alternatywnym sposobem jest dezynfekcja przefiltrowanej wody za pomocą podchlorynu wapnia (tabletek) w urządzeniu zwanym „chlorynatorem". 13. 1994].N-dichlorobenzenosulfonamid).2. Jankovic i Hallett: Therapy with Botulinum Toxin. które mogą wywoływać choroby kończące się zgonem. bakteria ta wytwarza kopolimer złożony z hydroksymaślanu i hydroksywalerianianu. można dezynfekować naświetlaniem promieniami ultrafioletowymi. albo kopolimer) tworzą wewnątrzkomórkowe ziarenka.Biopol Materiałem zapasowym bakterii jest polimer poli-β-hydroksymaślan (PHB. polyhydroxybutyrate.13. ang.7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego . Ta naturalna substancja jest materiałem wyjściowym dla wielu tworzyw termoplastycznych podlegających biodegradacji („Biopol". Filtr taki zatrzymuje większość planktonu. New York: Marcel Dekker. ze strumieni i studni. Toksyna botulinowa (tzw. gdy Alcaligenes eutrophus korzysta z glukozy jako jedynego źródła węgla. (1996) AEM 62: 399-402]. które potwierdzą skuteczność tej metody w zapobieganiu biegunkom dziecięcym w społeczności Masajów [Joyce i wsp. Jednakże ta właśnie toksyna jest wykorzystywana w leczeniu niektórych neurologicznych chorób mięśni. w którym znajdują się zarazki cholery. Można wodę sączyć przez wielowarstwowy filtr z dostępnych na miejscu włókien. 348 . Tabletki ulegają stopniowemu rozpuszczaniu. po uprzednim przepuszczeniu wody przez odpowiedni filtr z włókien. w czasie wypraw) może być gotowana.4.2 Rozprowadzanie wody na małą skalę Małe. Trwają badania kliniczne. Wielka Brytania).acetylocholiny. (1996) AEM 62: 2508-2512].

przynajmniej teoretycznie. by utworzyć transgeniczną formę rośliny Brassica napus (rzepak) do przemysłowej produkcji biologicznych tworzyw. każde zanieczyszczenie typu organicznego powinno dać się zdegradować dzięki odpowiedniemu doborowi drobnoustrojów. że jest ona skuteczna i niezawodna w środowisku. (1996) AEM 62: 2381-2386]. W celu powszechniejszego zaakceptowania bioremediacji. Pożyteczny artykuł przeglądowy dotyczący biologicznych tworzyw: Lee (1996) Biotechnologu and Bioengineering 49: 1-14). Ponadto. mikrobiologiczna degradacja zanieczyszczeń potencjalnie prowadzi do prostych związków nieorganicznych. 2) określenie trwałości produktów degradacji zanieczyszczeń. Ostatnio zmodyfikowano geny A. Stabilny w czasie normalnego użytkowania. [Bioremediation: towards a credible technology (artykuł przeglądowy): Head (1998) Microbiology 144: 599-608]. metody biologiczne często mogą mieć nieznany. podczas gdy inne formy technologiczne (np. Na przykład biodostępność czynnika zanieczyszczającego. 13. Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150]. . powodując wytwarzanie przez nią.8 Bioremediacja Termin bioremediacja oznacza biotechnologiczne (z udziałem drobnoustrojów) usuwanie zanieczyszczeń ze środowiska. Jednakże. 3) chemiczne oznaczenie poziomu/stanu składników środowiska i 4) poznanie specyficznych genów drobnoustrojowych uczestniczących w katabolizmie zanieczyszczeń [patrz np. jak CO 2 i woda. podczas gdy metody fizyczne są zazwyczaj szybkie. form. może być zmniejszona w wyniku jego adsorpcji do składników gleby. wykorzystany — po odpowiednim potraktowaniu — jest w pełni degradowalny.: 1) określenie stopnia podatności na degradację biologiczną wszystkich zanieczyszczeń w określonym miejscu. Drobnoustroje są wysoce zróżnicowane metabolicznie.Biopol może być wykorzystany do produkcji pojemników. Obecnie czynione są wysiłki. nieprzewidywalny czy też niewymierzalny wpływ na środowisko. należy wykazać. Skuteczność bioremediacji można ocenić przez np. Bogan i wsp. eutrophus kodujące enzymy szlaku biosyntezy PHB i wyrażono je w plastydach rośliny Arabidopsis thaliana. a ich przebieg najczęściej przewidywalny. włókien i warstw powierzchniowych oraz obrabiany w procesach wydmuchiwania i wstrzykiwania. tak że. Może to pozwolić na wykorzystanie tego typu roślin transgenicznych do przemysłowej produkcji tworzyw sztucznych [artykuł przeglądowy: Poirier. a to może ograniczyć lub nawet wykluczyć bioremediację. to jest jego dostępność dla populacji drobnoustrojów. dekontaminacja metodami fizycznymi) może po prostu spowodować przeniesienie problemu z jednego miejsca w inne.

Czasami prace bakteriologiczne prowa- 350 . Jedzenie. Szczególnie ważne są następujące zasady: 1. Nie noś tego fartucha na zewnątrz laboratorium. Podczas pracy noś czysty fartuch laboratoryjny. wybieraj samoprzylepne. Jeśli konieczne jest stosowanie etykiet. Do pipetowania stosuj gumową gruszkę lub specjalne urządzenia mechaniczne. 6. wśród których mogą być właściwe lub potencjalne patogeny. Dobra bakteriologia to bezpieczna bakteriologia. przy dodawaniu jednego płynu do drugiego lub kiedy kropla płynu spada na stałą powierzchnię — sytuacje te mogą się zdarzać w trakcie pracy bakteriologicznej (patrz np. aktywnym płynie dezynfekującym przed ich umyciem i sterylizacją. wkładając je (nie wrzucając) do odpowiedniego pojemnika. że na co dzień ma do czynienia z żywymi bakteriami. picie czy palenie w laboratorium jest potencjalnie niebezpieczne. rys. wdychane przez osoby w otoczeniu. aerozole tworzą się podczas pękania pęcherzyków. Cząstki o średnicy mniejszej niż kilka mikrometrów mogą pozostać zawieszone w powietrzu przez dłuższy czas. 4. Aerozol składa się z bardzo drobnych (niewidocznych) cząsteczek płynu lub ciał stałych rozproszonych w powietrzu. by ochronić własne ubranie.ROZDZIAŁ 14 Nieco praktycznej bakteriologii 14. 3. Nie wkładaj do ust niczego. 2. Aerozole mogą być potencjalnym źródłem zakażenia. 5. szkiełka podstawowe itp. 2). Zostawiaj zakażone pipety. Utrzymuj stoły laboratoryjne. nie używaj ust. 16. czysto i schludnie. w odpowiednim. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium Student spotykający się po raz pierwszy z bakteriologią powinien sobie zdawać sprawę z tego. tak jak całą resztę laboratorium. Unikaj skażenia środowiska aerozolami zawierającymi żywe bakterie lub ich przetrwalniki. należy więc poznać zasady bezpieczeństwa w laboratorium przed przystąpieniem do jakichkolwiek czynności manualnych. Usuwaj wszystkie zakażone materiały.

by uniknąć ryzyka zakażenia aerozolami. bijou ma pojemność 5-7 ml. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyj ręce. w których następnie krzepnie. (Metody sterylizacji podłoży są przedstawione w rozdziale 15. (Przewietrzana płytka Petriego ma trzy małe uwypuklenia w równych 351 . które wyrosły (i nadal rosną) na lub wewnątrz tego podłoża. przechowywania lub przenoszenia bakterii. 3) lub w szklanej butelce z zakrętką. Podłoże płynne można stosować w probówce (zamkniętej korkiem ze sterylnej waty lub metalowym kapturkiem) — patrz np. rys. 2) o średnicy wieczka około 9 cm. to znaczy nie może zawierać żywych organizmów. O wszystkich wypadkach i rozlanych płynach natychmiast poinformuj opiekuna sali lub asystenta. Płyn taki może być zestalony. Najlepiej to uczynić posługując się opisem prostej czynności laboratoryjnej. 1) jest cylindryczna. Do podłoży zazwyczaj używa się plastykowe szalki (płytki) Petriego (rys. a proces dodawanie jej do podłoża — inokulacją lub szczepieniem. żywe komórki tego gatunku. o pojemności około 25 ml. 7. bakteriolog stosuje odpowiednie sterylne podłoże i dodaje do niego małą ilość materiału składającego się. 3 do 14. Ta „mała ilość materiału" nazywana jest inokulum. (Narzędzia i procedury stosowane do inokulacji opisano w sekcjach 14. Podłoże zwykle zawiera wszystkie niezbędne składniki odżywcze. 5. wilgotności itp. zwanej po prostu termostatem. Większość podłoży stałych to galaretowate substancje składające się z roztworu substancji odżywczych „zestalonych" agarem (złożony wielocukier uzyskiwany z pewnych glonów). Podczas inkubacji bakterie rosną i dzielą się tworząc hodowlę. Podłoże w stanie ciekłym (rozpuszczonym) rozlewa się do szalek Petriego. 16. Aby wyhodować taki organizm jak E. Przed użyciem podłoże musi zostać wysterylizowane. ) Zaszczepione podłoże jest następnie inkubowane. ) Przed omówieniem poszczególnych podłoży pomocne będzie wyjaśnienie znaczenia kilku terminów często stosowanych w bakteriologii. coli. Butelka uniwersalna (rys. 14. 2 Podłoża bakteriologiczne Podłoże (pożywka) to każdy płyn przygotowany do hodowania. to jest trzymane przez pewien czas w odpowiedniej temperaturze. podczas gdy tzw. częściowo po to. lub zawierającego. Zatem hodowla to podłoże zawierające bakterie. tworząc podłoże stałe. 8. 14. 16. Inkubację zwykle przeprowadza się w termostatowej szafce.dzi się w specjalnych komorach (opisanych w dalszej części).

14. pozwalając na utrzymanie równowagi między powietrzem/gazami wewnątrz i na zewnątrz płytki. Tego typu podłoża nazywane są wzbogaconymi. jak żółtko jaja. 14. Wiele bakterii nie rośnie w podłożach podstawowych. 2. dopóki nie zostaną uzupełnione takimi substancjami.odstępach na wewnętrznej krawędzi wieczka. krew lub surowica. Heterotrofom o niezbyt dużych wymaganiach pokarmowych (jak E. coli) wystarczają powszechnie występujące związki organiczne w najczęściej stosowanych podłożach (tab. które utrzymują wieczko zamkniętej płytki nieco nad denkiem. 352 . 1). 1 Rodzaje podłoży (pożywek) Dla wielu bakterii chemolitoautotroficznych podłożem może być prosty roztwór soli nieorganicznych (źródłem węgla jest CO2).

Agar z krwią jest podłożem z dodatkiem 5-10% krwi. coli (EHEC/VTEC). Wykorzystywane jest do wzrostu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych. większość szczepów Salmonella) są bezbarwne. które w równym stopniu podtrzymywałoby wzrost wszystkich rodzajów bakterii. Używa się go do wykrywania patogennego szczepu O157 E. na przykład. które podtrzymuje wzrost pewnych bakterii w przeciwieństwie do pozostałych. 14. przypomina agar McConkeya. nie topi się w 37°C. gdyż wytwarzają kwaśne produkty (z laktozy). wzrost w odpowiednim podłożu wzbogacającym może zwiększyć proporcję danego gatunku (wzbogacić go) w stosunku do pozostałych. zestalone agarem. ) Podłoże wzbogacające pozwala. takiego jak żelatyna czy agar. lecz nie hamują wzrostu gatunków jelitowych. by pewne gatunki bakterii rosły szybciej niż inne. lecz zamiast laktozy zawiera sorbitol. które trudno wykryć wśród ogromnych ilości niepatogennych bakterii jelitowych. 1) danego gatunku. a ponadto rozkładają ją niektóre bakterie. Wiele podłoży stałych to po prostu podłoża płynne. jak Bordetella pertussis (powoduje krztusiec). (Żelatyna natomiast w tej temperaturze staje się płynna. 14. gdyż nie ma takiego podłoża. Agar MacConkeya z sorbitolem. typhi wzrośnie do poziomu.Podłożem selekcyjnym jest takie. gdyż zdecydowana większość bakterii nie rozkłada go. bakterii powodującej dur brzuszny. Agar jest najczęściej używanym związkiem żelującym. Agar „czekoladowy" uzyskuje się po podgrzaniu agaru z krwią w temp. to jest takiego. oraz do wykrywania hemolizy (sekcja 16. w którym będą znacznie łatwiej wykrywane. który nie fermentuje sorbitolu. Jeśli jednak inokulum próbki zostanie wsiane do bulionu z selenianem. Przypuśćmy. a zatem na tym 353 . podłoże ogólnego przeznaczenia. Przykładem jest bulion MacConkeya (tab. Na podłożu MacConkeya bakterie jelitowe (jak E. Można również wzbogacać i czynić selektywnym dodając do niego różne substancje. by uzyskać kolonie (sekcja 3. 14. albo poprzez hamowanie wzrostu innych. 1. które zostały zestalone przez dodatek czynnika żelującego. które wykorzystuje się do hodowania wielu typów bakterii. Neisseria gonorrhoeae) niż zwykły agar z krwią. typhi w próbce kału od pacjenta z podejrzeniem duru. 70-80°C do barwy czekoladowobrązowej. na przykład. Agar taki lepiej nadaje się do hodowli niektórych patogenów (np. Agar MacConkeya jest przykładem podłoża różnicującego. Próbka może zawierać jedynie kilka komórek S. typhi. Jeśli zatem inokulum zawiera tylko kilka komórek interesującego nas gatunku (w dużej populacji organizmów zbędnych). coli) zdolne do wykorzystywania laktozy tworzą czerwone kolonie. 1) — w którym sole żółci hamują wzrost bakterii niejelitowych. Podłoże to może być stosowane do izolacji bakterii jelitowych z mieszaniny bakterii jelitowych i niejelitowych w inokulum. ) Jednym z często stosowanych podłoży jest agar odżywczy (tab. na którym różne gatunki bakterii można od siebie odróżnić na podstawie wyglądu ich kolonii itp. albo poprzez sprzyjanie wzrostowi danego gatunku. (W pewnym sensie wszystkie podłoża są selektywne. lecz nie hamuje Salmonella typhi. Kolonie bakterii jelitowych nie wykorzystujących laktozy (np. 1). 3. Na przykład. coli). 1). że chcemy wykryć S. bulion z selenianem hamuje wiele rodzajów bakterii jelitowych (w tym E. w której to temperaturze inkubuje się wiele rodzajów bakterii. procent komórek S. na które reaguje wskaźnik pH w podłożu. Podłoże stałe używane jest.

[(1999) JCM 37: 748-752]. (Większość szczepów E. 2 Przygotowanie podłoży Większość podłoży produkuje się przemysłowo w postaci bezwodnego proszku. których dokładny skład jest zwykle nieznany. 14. które występują w śladowych ilościach. W badaniach wrażliwości na antybiotyki określa się zdolność danego szczepu do wzrostu w pożywce wzbogaconej określonym antybiotykiem o znanym stężeniu. Czasami zachodzi potrzeba stosowania podłoża. Tego typu podłoże zdefiniowane przygotowywane jest ze znanych ilości czystych substancji. Podłoża takie zwykle rozpuszcza się w określonej objętości wody. gdyż ich wzrost bywa przeszkodą w przetrwaniu z powodu powstających zbędnych produktów. Pożywki tego typu mogą być używane do wykrywania M. Jedno z takich podłoży. coli fermentuje sorbitol i kolonie są różowe. aminokwasów itp. 1) nadaje się dla bakterii zaliczanych do beztlenowych oraz dla „delikatnych" bakterii. Niektóre podłoża stałe nie zawierają ani agaru. które ma być zbadane pod kątem obecności konkretnego organizmu(ów). 14. Podłoże zdefiniowane może być użyte do określenia wymagań pokarmowych danego gatunku bakterii.podłożu tworzy bezbarwne kolonie. woda wodociągowa). Na przykład. pozwala na określanie wzrostu prątków na podstawie fluorescencyjnego systemu monitorowania stopnia zużycia tlenu. Zadaniem takiego podłoża jest jedynie utrzymanie drobnoustrojów przy życiu. ) Dodatek cefuksymu (cefalosporyny trzeciej generacji) oraz telurynu potasu zwiększa częstość izolacji szczepu O157. wymazu). w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. łącznie z tymi. ani żelatyny. gdyż zahamowany jest wzrost innych bakterii nie fermentujących sorbitolu (jak Proteus). sterylizuje 354 . tuberculosis i badania podatności wyizolowanego szczepu na antybiotyki. soli nieorganicznych. podłoże transportowe Stuarta (tab. pepton. Jeden z typów BACTEC niedawno wprowadzony do użytku. Wcześniej stosowane systemy były oparte na radiometrii (wzrost określano badając pojawianie się znakowanego dwutlenku węgla powstającego w wyniku wykorzystania radioaktywnego substratu w podłożu). 1. Podłoże Dorseta powszechnie stosuje się do przechowywania Mycobacterium tuberculosis. 2. Podłoże transportowe stosuje się do przenoszenia (lub tymczasowego przechowania) danego materiału (np. W pożywkach tych patogen rośnie nieco szybciej (1-2 tygodnie) niż na podłożach stałych. glukozy. są określone ilościowo. 2. BACTEC MGIT 960. podłoże jajowe Dorseta uzyskuje się przez podgrzanie (i skoagulowanie) homogenizowanych jaj kurzych w soli fizjologicznej. Wiele podłoży zawiera substancje (np. np. którego wszystkie składniki. jak Neisseria gonorrhoeae. a następnie „przechowywania" danego organizmu. Podłoże to wykorzystywane jest do namnażania. 14. System ten został dokładnie przetestowany i opisany przez Hanna i wsp. 1 Systemy BACTEC do hodowli prątków Systemy BACTEC™ (Becton Dickinson) to płynne pożywki służące do hodowli powoli rosnącego patogena Mycobacterium tuberculosis.

około 45-50°C) z 5-10% objętości krwi (np. 5. Do takich podłoży należy np. z nieco zsuniętym wieczkiem. Aby przygotować skos z agaru odżywczego (rys. By przygotować płytkę. z cytrynianem) przed wylaniem płytek. co się dzieje w trakcie naszej pracy. podłoży itp. jest należy pozwolić na odparowanie nadmiaru wilgoci powierzchniowej. 3 Techniki aseptyczne Narzędzia i podłoża muszą być sterylne przed użyciem (sekcja 15. w czasie manipulacji bakteriologicznych instrumenty i wszelkie materiały muszą być chronione przed zakażeniem przez organizmy zawsze obecne w środowisku. Przygotowując tego typu podłoża. 1). gdy z hodowli pobierane jest inokulum lub gdy zaszczepia się sterylne podłoże. 1. lub butelki zawierającej czystą hodowlę) jego krawędź krótko opala się w palniku gazowym. 2) powierzchnia świeżo wylanej płytki musi być przesuszona. gdyż niektóre z ich składników mogą ulec zniszczeniu w temperaturze osiąganej w autoklawie. przed ich użyciem oraz unikania ich kontaktu z nie sterylną materią. 14.i rozlewa do odpowiednich sterylnych naczyń. ). tzn. sekcja 14. przez filtrację (sekcja 15. Robi się to zawsze. wysiew. 14. Ryzyko zakażenia w laboratorium można jeszcze bardziej zmniejszyć przemywając powierzchnię stołów itp. Opalanie stosuje się również tuż przed zamknięciem naczynia. Do uzyskania większości podłoży zawierających agar (np. odpowiednim czynnikiem dezynfekującym oraz filtrując powietrze w celu usunięcia komórek i form przetrwalnych bakterii 355 . Poza tym. pozostawiając do skrzepnięcia po ustawieniu naczyń skośnie do poziomu. schładza do około 45°C. na około 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37°C. z wyjątkiem krótkiego czasu potrzebnego na dostęp do nich. np. Techniki aseptyczne wymagają sterylizacji wszystkich narzędzi. Przed otwarciem naczynia (np. DC A (tab. które jest sterylizowane w parze (aparacie Kocha). 1). 1. w tym palców. której nie należy ruszać aż agar zestali się. roztwór cukru przed dodaniem do (autoklawowanego) podłoża sterylizuje się osobno. naczyń. agar odżywczy) proszek miesza się z wodą. roztopione podłoże agarowe wlewa się do probówek lub buteleczek. Do niektórych celów (np. oraz podłoże zawierające glukozę lub inne cukry wrażliwe na wysoką temperaturę. Można również suszyć płytki obsiane (sekcja 14. powierzchni stołu itp. Płytki z krwią przygotowuje się mieszając roztopione podłoże agarowe (o temp. Zwykle nie stosuje się opalania w pracy z szalkami Petriego. Jeśli nie mamy co do tego pewności. podgrzewając mieszaninę aż do rozpuszczenia agaru. by zapobiec dostaniu się do naczynia żywych organizmów. 1). 2. Naczynia ze sterylną zawartością są zamknięte. to nie będziemy wiedzieć. Pewnych rodzajów podłoży nie można sterylizować przez autoklawowanie. to jest do temperatury. a nie autoklawowane. w której jeszcze nie krzepnie. a nigdy — gdy zawartość naczynia jest łatwopalna. Jednak niektóre podłoża rozlewa się do naczyń przed sterylizacją. 14. które mogłyby zakazić zawartość. 13). Często uzyskuje się to zostawiając szalkę. 5. 3). około 15-20 ml płynnego podłoża z agarem wlewa się do sterylnej szalki Petriego. Podłoże następnie sterylizuje się w autoklawie (sekcja 15. sterylnej butelki.

i grzybów. 14. 2). Czasami pewne prace bakteriologiczne wykonuje się w specjalnych komorach. W komorze klasy II sterylne (filtrowane) powietrze stale spływa na powierzchnię roboczą. po czym przechodzi na zewnątrz po dodatkowej filtracji (ryc. Komora klasy III to szczelna komora. Prace prowadzi się przez otwarty panel w przedniej części komory. w której powietrze jest filtrowane zarówno 356 .

Komory typu II są częste w laboratoriach uniwersyteckich. Podczas opalania ezy z pozostałością inokulum może nastąpić pryskanie. Z tego powodu często opalanie przeprowadza się za pomocą specjalnego (gazowego) palnika Bunsena wyposażonego w płaszcz ochronny. osadzony w metalowej oprawce o długości 10-12 cm. a następnie przed użyciem schładza. 357 . Ciekłe lub stałe inokulum przenoszone przez oczko ezy lub igłę może być użyte do inokulacji (zaszczepienia) ciekłego lub stałego podłoża (sekcja 14.przed wejściem do niej. a bezpośrednio przed użyciem na pipetę nakłada się małą gumową gruszkę. jak i przed odprowadzeniem do środowiska. które mogą służyć jako inokulum. np. to po jej wyciągnięciu druciane oczko zatrzymuje małą błonkę cieczy zawierającą komórki bakteryjne. jak i igłę należy zawsze zaraz po użyciu opalić w płomieniu. lecz zwykle nie ma to większego znaczenia. małych ilości wzrostu bakteryjnego z kolonii. 5). Wszelkie prace wykonuje się przez gumowe rękawice zamocowane w przednim panelu. 14. Mniejsze objętości można przenosić za pomocą prostej igły. (a) Eza: platynowy. z cieńszą częścią o wewnętrznej średnicy około 1 mm. Wielkość tego inokulum zależy od stężenia komórek w zawiesinie oraz rozmiarów oczka ezy. Kalibracja pipety pasterowskiej opisana jest w podpisie do rys. Grubszy koniec przed sterylizacją zatykany jest watą. 01 do 0. 14. Gdy sterylną ezę zanurzy się w zawiesinie bakterii. 4 Narzędzia bakteriologa W większości przypadków prace z bakteriami można prowadzić posługując się prostymi przyrządami (rys. Zarówno ezę. która może przenosić od 0. Drucianą część przyrządu ogrzewa się do czerwoności w płomieniu palnika. które mogą być kontrolowane. 3). zaś komory klasy III stosuje się do prac z bardzo patogennymi drobnoustrojami. a dostęp do wnętrza komory jest poprzez osobną dwudrzwiową komorę sterylizacyjną/dezynfekcyjna. Ezy i igły można używać do pobierania drobnych próbek materiału stałego. niklowo-stalowy lub chromowy drutu z zagięciem na końcu. tworzącym oczka. 005 ml cieczy. Ilość pobieranego materiału przylegająca do igły jest nieznana. (b) Igła lub prosty drut: w metalowej oprawce osadzony jest drut długości 5-8 cm. są to oczywiste dwa czynniki. tworząc aerozolie. (c) Pipeta pasterowska: rurka otwarta z obu końców. Można również wykonywać tę czynność wewnątrz bezpiecznej komory. która do niej przylega. by nie zanieczyściły stołu laboratoryjnego ani środowiska. 14. Ezę lub igłę sterylizujemy przez opalenie bezpośrednio przed użyciem. zatrzymującej jedynie bardzo znikomą ilość cieczy. 6.

14. czwartym. ich wzrost prowadzi do powstania tzw. zwykle przy trzecim. po wykorzystaniu wrzuca się je do słoja zawierającego środek dezynfekujący. Pipety pasterowskie zwykle są jednorazowego użytku. to jest pokrycia całej powierzchni zlewającym się wzrostem bakteryjnym (sekcja 3. Jeśli inokulum wylane czy rozprowadzone po powierzchni płytki zawiera odpowiednio dużo komórek. mikrotlenowych lub beztlenowych części podłoża. dolną. a następnie wyciąga. Czasem zalewa się całą powierzchnię płytki agarowej płynnym inokulum. by uniknąć zakażenia dalszej części pipety. 14. Procedurę tę stosuje się do zaszczepienia głębokich. a następnie usuwa nadmiar płynu sterylną pipetą pasterowską. Kalibrowane pipety natychmiast po użyciu zanurza się w środku dezynfekującym aż do czasu ich umycia. rozprowadzając następnie wprowadzone inokulum po całej powierzchni płytki za pomocą sterylnej szklanej „głaszczki". a nawet piątym „rozcieńczeniu" (rys. pipetą automatyczną. np. Pipety zwykle sterylizuje się (partiami) w metalowych tubusach lub w „kopertach" z grubego papieru. Wysiew redukcyjny (rys. Murawkę otrzymuje się wysiewając. 1 ml) na powierzchnię płytki. w np. Można również użyć pipety pasterowskiej. 4) stosuje się. 14. 358 . Po inkubacji. grubą część skosu pionowo wbija się igłę lub prosty drut. 1). 3. 1 Inokulacja podłoża płynnego W celu zaszczepienia podłoża płynnego płynnym inokulum po prostu zanurza się w podłożu ezę (lub igłę) zawierającą materiał bakteryjny. Końce pipet stosowanych do prac bakteriologicznych przed sterylizacją zwykle wypełnia się watą (rys. Przy wyjmowaniu pipety z tubusa należy chwycić jedynie koniec wypełniony watą. by na przynajmniej niektórych częściach płytki pozostały pojedyncze komórki. sterylizacji i ponownego użycia. z każdej komórki dobrze oddzielonej od pozostałych wyrasta pojedyncza kolonia. by mieć pewność. 05-0. niewielką objętość płynnego inokulum (np. 5. inokulum (na końcu igły lub drutu) zostaje wtedy rozprowadzone wzdłuż linii wkłucia. 5 Metody inokulacji 14. 0. gdy potrzebne są dobrze oddzielone od siebie kolonie. można lekko potrzeć ezę lub igłę o wewnętrzną ściankę naczynia zawierającą podłoże. zależnie od planowanego celu. 4). 2 Inokulacja podłoża stałego Podłoża stałe można szczepić w różny sposób. W metodzie tej inokulum jest stopniowo „rozcieńczane" w taki sposób. a inokulum zawiera bardzo dużo komórek. 14. murawki.Większe objętości cieczy można przenosić za pomocą pipet pasterowskich lub kalibrowanych. że część inokulum pozostanie po wyciągnięciu przyrządu. 3) w celu uniknięcia zakażenia z gruszki lub z urządzenia mechanicznego podczas ich użycia. W inokulacji przez wkłucie w podłoże stałe. Jeśli inokulum jest stałe. 14. 5. Płyn wsysa się za pomocą gumowej gruszki lub urządzenia mechanicznego — nigdy ustami.

wyrasta „murawka" (1. Następnie wacik przeciąga się lekko po powierzchni odpowiedniego podłoża. coli z próbki ścieków (która zazwyczaj zawiera wiele organizmów jelitowych i nie-jelitowych). Komórki dobrze od siebie oddzielone dają początek koloniom (5). Sterylny wacik stosuje się do pobierania drobnoustrojów z określonych miejsc (np. Wacik może służyć do wysiania bakterii na całą powierzchnię płytki lub tylko na jej część. 14. na których wysiano wiele komórek. z której dalej bakterie rozprowadza się ezą. jak również po ostatniej. 4 i 5 z opalaniem i schładzaniem ezy między każdą z nich. gardła). tak by wszystkie jego powierzchnie zetknęły się z nim. Następnie ezę opala się w płomieniu. tak jak w punkcie 1. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów Niektóre z podstawowych technik bakteriologicznych można prześledzić na przykładzie prostej procedury polegającej na wyizolowaniu konkretnego szczepu lub gatunku z mieszaniny drobnoustrojów. (b) Po inkubacji na tych częściach szalki. We właściwej orientacji (dolna część rysunku) oczko — będące w lekkim kontakcie z powierzchnią podłoża — poruszane jest w kierunku do patrzącego i z powrotem.(a) Oczko ezy zawierające wysiewany materiał delikatnie przeciąga się tam i z powrotem po powierzchni peryferycznej części szalki. 2 i 3). Podany przykład dotyczy izolacji E. drewnianego czy plastikowego pręcika. 359 . ściśle zbitej waty na końcu cienkiego. tj. Podczas wysiewania rysą za pomocą ezy płaszczyzna oczka nie powinna być pionowa. Podobnie wykonuje się czynności 3. schładza i przeciąga sterylne oczko po podłożu jak w punkcie 2. Czasami bakterie wysiewa się na płytkę za pomocą wacika.

1).Próbkę ścieków pobraną oczkiem ezy wysiewa się na szalkę z podłożem MacConkeya (sekcja 14. 14. z których przynajmniej jedna jest kulturą E. często wygodniej jest dotknąć powierzchni takiej kolonii końcem sterylnej igły lub nawet wykałaczki. (Szalki często są inkubowane odwrócone do góry dnem. aby uniknąć skapywania na podłoże wody skondensowanej na wieczku i rozmycia inokulum). Po usunięciu niepotrzebnego materiału. Powyższą procedurę można na wszelki wypadek przeprowadzić jeszcze raz. coli. czerwone kolonie o średnicy 2-3 mm. Kuleczki te (Dynabeads®. Przed przystąpieniem do identyfikacji należy zadbać. wykazują właściwości magnetyczne jedynie w polu magnetycznym. Ponieważ niektóre bakterie tworzą bardzo drobne kolonie. zawiera komórki dwóch odmiennych gatunków. Kuleczki miesza się z próbą (w warunkach określonych w przepisie). 6. 1 Dynabeads® oraz rozdział immunomagnetyczny Rozdział magnetyczny to technika pozwalająca na wydzielenie z mieszaniny różnych rodzajów komórek (lub cząsteczek) tych które swoiście absorbujących do powierzchni specjalnie opłaszczonych kuleczek. które następnie są przyciągane w polu magnetycznym do jednej ze ścian naczynia. tak by zostały rozprowadzone w całej jej objętości. W następnym etapie wybiera się kilka takich kolonii. 2. co nadaje im właściwości superparamagnetyczne. by każda z wybranych kolonii zawierała jedynie komórki jednego gatunku. Każdą czystą kulturę badana jest następnie tak jak opisano w rozdziale 16. określając w ten sposób ich zastosowanie do konkretnego celu (to jest rodzaju komórki lub cząsteczki mającej absorbować na ich powierzchni). to powinniśmy otrzymać wiele czystych kultur. Zawsze istnieje możliwość. nazwa handlowa firmy Dynal z Norwegii) to jednolitej wielkości mikroskopijne paciorki zawierające mieszaninę tlenków żelaza. Zdarzy się tak. gdy podczas wysiewania dwie różne komórki przypadkowo znajdą się w bezpośrednim sąsiedztwie na powierzchni podłoża agarowego. którą następnie inkubuje się 18-24 godzin w 37°C. Jednak nie wszystkie tak wyglądające kolonie będą tworzone właśnie przez komórki E. Kuleczki te można opłaszczyć dowolnym typem liganda. że kolonia. Aby nie było wątpliwości. coli jest w ściekach częsta. nawet dobrze oddzielona od pozostałych. powstaną pojedyncze kolonie. komórki/cząsteczki można przemyć przed dalszym 360 . sterylną pożywkę. Podczas inkubacji. Po 24 godzinach na agarze MacConkeya E. z dobrze oddzielonych komórek jakiegokolwiek gatunku rosnącego na podłożu. Po okresie inkubacji wyrosłą zawiesinę bakterii ponownie wysiewa się (w opisanym przypadku) na płytkę sterylnego podłoża MacConkeya. Komórki/cząsteczki absorbują na powierzchni kuleczek. tzn. Ponieważ E. a następnie wysiać inokulum rysą na powierzchni świeżego podłoża stałego. do dalszego badania. daną kolonię lekko dotyka się sterylną ezą i zaszczepia nią świeżą. przynajmniej jedna z wybranych kolonii będzie wytworzona przez komórki tej właśnie bakterii. które następnie są przesuwane w polu magnetycznym. coli. coli tworzy okrągłe. Jeśli każda czerwona kolonia była utworzona przez komórki jednego gatunku.

Ponadto. przemywanie kompleksu kuleczka-DNA pomaga usunąć inhibitory procesu PCR. 4). kuleczki opłaszczone przeciwciałami można stosować do uzyskiwania konkretnych komórek eukariotycznych z mieszaniny komórek. ang. ) Kuleczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami można stosować do izolacji konkretnych patogenów — (np. Niektóre zastosowania Dynabeads są podane w tabeli 14. 5. immunomagnetic separation). niż rozpraszania w objętości próby. Po zagęszczeniu otrzymanego DNA procedura ta zwiększa czułość PCR. 2). kompleks kuleczka-patogen wysiewa się na odpowiednie podłoże. ) z żywności i innych prób (patrz fot. Salmonella spp. 2. coli O157. Podobnie. Kuleczki Dynabeads można również opłaszczyć ligandami dla kwasów nukleinowych. 5. 361 . Technika ta nosi nazwę rozdziału immunomagnetycznego (IMS. (Istotne są cechy stosowanych kuleczek — gdyby miały trwałe momenty magnetyczne. 14. wykazywałyby raczej tendencję do zbijania się razem. 1. Na przykład Dynabeads Oligo (dT)25 wiążą ogony poli-A cząsteczek mRNA i są pomocne do rozdzielenia mRNA od całkowitego RNA w przygotowywaniu bibliotek cDNA (sekcja 8. Dynabeads® DNA DIRECT™ wiążą genowy DNA w nieoczyszczonych preparatach.użyciem. E. tym samym dostarczając próbek do techniki PCR (sekcja 8. Listeria monocytogenes. 1).

przezroczystego tworzywa sztucznego. Na wewnętrznej stronie wieczka umieszczone jest opakowanie z gazy zawierające katalizator (np. gdyby były odwrócone denkami do góry. podłoże agarowe mogłoby w warunkach próżni zostać oderwane). szczelnie zamykany płaską pokrywką. a wieczko mocuje śrubą. Po kilku minutach zawór zostaje zamknięty. śrut aluminiowy opłaszczony palladem). Po włożeniu szalek do słoja. podłączone jest do pompy próżniowej. Warunki takie można uzyskać w pojemniku anaerobowym. który w obecności katalizatora wiąże cały tlen w słoju. następnie szybko wkłada się je do słoja. za pośrednictwem jednego z dwóch zaworów w wieczku. Inny (bardziej współczesny) typ słoja anaerobowego to cylinder z mocnego. płaskim wieczkiem. który przyśpiesza chemiczną reakcję między wodorem a resztkami tlenu. do małego opakowania zawierającego specjalne odczynniki wlewa się nieco wody. bezpośrednio przed zamknięciem. szczelnie zamkniętym okrągłym. Naczynie to. Naczynie inkubuje się przez odpowiedni czas (szalki wewnątrz naczynia są umieszczone denkami do dołu. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych Bakterie beztlenowe inkubuje się w warunkach braku tlenu. Czynności te można powtórzyć kilka razy. który jest mocnym cylindrem z metalu. szalki można umieszczać w słoju do góry denkami. np. aby uniknąć kondensacji wody na powierzchni agaru.14. 362 . Przez drugi zawór wprowadza się wodór. Do naczynia wkłada się zaszczepione szalki. Ponieważ w tym przypadku nie powstaje próżnia. a następnie zawór zamyka. w naczyniu McIntosha i Fildesa. Odczynniki wyzwalają wodór.

1. ang. by np. Próbka badana znajduje się w probówce o grubości i wielkości zbliżonej do tych. które czasem dodatkowo po zaszczepieniu i przed zamknięciem znajdują się w warunkach beztlenowych. Probówki oznacza się od 1 (przezroczysta) do 10 (nieprzejrzysta). 1 Całkowita liczba bakterii Całkowitą liczbę bakterii w płynnej próbce (np. po sterylizacji w autoklawie. ewentualnie w litrze.Większość naczyń anaerobowych zawiera wskaźnik redoks. (W przypadku DEFT mleko jest najpierw wstępnie przygotowane do badania. Następnie filtr naświetla się promieniowaniem ultrafioletowym. 14. zwaną techniką bezpośredniej epifluorescencji na filtrze (DEFT. 1). 14. Wartości zwykle określają liczbę komórek w mililitrze. hodowli w bulionie) można określić stosując komorę do liczenia (rys. direct epifluorescent filter technique) stosuje się do liczenia drobnoustrojów w mleku. 8. Niektóre beztlenowce mogą rosnąć (bez naczynia beztlenowego) w takich podłożach jak podłoże mięsne Robertsona (mielony bydlęcy mięsień sercowy. Podłoże to. pepton (1%). a w przypadku słojów plastykowych — poduszeczka nasączona wskaźnikiem jest zwykle widoczna przez ścianę naczynia. Dopasowuje się optycznie gęstość próbki do gęstości w konkretnej probówce i odczytuje się stężenie z tabeli towarzyszącej probówkom. L-cysteina lub tioglikolan). Dostęp do przedmiotów wewnątrz komory jest za pośrednictwem gazoszczelnych rękawic umieszczonych w przednim panelu. Inną metodę. który sygnalizuje stan beztlenowości w słoju. rozbić kropelki tłuszczu. W naczyniach metalowych wskaźnik znajduje się w małym szklanym ramieniu bocznym. wilgotności i stężeniu CO 2 . 8 Liczenie bakterii Licząc komórki bakteryjne w danej próbce można określić wszystkie komórki (to jest żywe i martwe) lub tylko komórki żywe. 5%) oraz czynnik redukujący. a (fluoryzujące) komórki widziane są w mikroskopie w postaci jasnych cząstek na ciemnym tle. przechowywane jest w butelkach ze szczelną zakrętką. 363 . chlorek sodu (0. 14. w której znajdują się zawiesiny wzorcowe. Komory beztlenowe pozwalają na inkubację i pracę z próbkami czy hodowlami w warunkach pozbawionych tlenu oraz w stałej temperaturze. np. a komórki zatrzymane na powierzchni filtra barwi się barwnikiem fluoryzującym. ekstrakt wołowy (1%). 5). ) Całkowitą liczbę bakterii można również określić porównując zmętnienie próbki ze zmętnieniem w serii probówek (probówki Browna lub McFarlanda) zawierających rosnące stężenia zawiesiny siarczanu baru. które mogłyby zatkać filtr. Dla danego gatunku bakterii gęstość w jednej z probówek odpowiada gęstości zawiesiny komórek o znanej liczbie komórek w mililitrze. Mleko sączy się przez filtr membranowy. (Patrz też beztlenowe hodowle z krwią w sekcji 11. 8.

Instrument pokazany z boku (a), składa się z prostokątnej płytki szklanej, w której centralna płaszczyzna leży dokładnie 0, 1 mm niżej niż części boczne. Płaska część centralna jest oddzielona od części bocznych rowkami, a sama podzielona jest na dwie części dodatkowym płytszym rowkiem (widocznym w b). Na powierzchni każdej z tych części wyryta jest siateczka (c) tworząca kwadrat podzielony na 400 małych części o wielkości 1/400 mm2. Szkiełko nakrywkowe nakłada się jak w części (b) i silnie przyciska do części bocznych. By zapewnić właściwe przyleganie, podczas przyciskania szkiełko można lekko przesunąć. O dobrym przyleganiu szkiełka świadczy pojawienie się barwnego wzoru (pierścienie Newtona) pokazanego w postaci czarnych linii w (b). Stosowanie komory. Pipetą pasterowską pobiera się małą objętość płynu (nie więcej niż do wysokości 10 mm), a następnie dotyka się nią centralnej płaszczyzny, tak by brzegiem dotykała szkiełka nakrywkowego. W tej pozycji, płyn na zasadzie sił kapilarnych przechodzi z pipety pod szkiełko nakrywkowe. Płyn nie powinien przelewać się do rowków (czasem konieczne jest lekkie stuknięcie końcem pipety, by płyn zaczął się przesuwać). Jeśli jest taka potrzeba, w drugiej części komory do liczenia można zbadać kolejną próbkę. Komorę zostawia się na 30 minut, by komórki osiadły na dnie, a następnie pod mikroskopem liczy się je. Ostrość nastawia się na siatkę. Dokładnie znana objętość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym pozwala na precyzyjne obliczenie komórek w jednostce objętości. Przykład liczenia. Ponieważ każda mała kratka utworzona przez siateczkę ma wymiary 1/400 mm2, a odległość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 1/10 mm, objętość cieczy na każdą kratkę jest 1/4000 mm 3 tj. 1/4000000 ml. Przypuśćmy np., że po przejrzeniu wszystkich 400 kratek znaleziono 500 komórek. Dałoby to średnią 1, 25 na kratkę, tzn. 1, 25 komórki w 1/4000000 ml. Próbka musiała zatem zawierać 1, 25x4 000 000 komórek w ml, czyli 5 x 106 komórek w ml. Można w ten sposób zbadać kilka powtórzeń próbek i wyliczyć średnią. Jeśli próbka była rozcieńczona przed zbadaniem (gdyż była zbyt gęsta), otrzymaną liczbę komórek należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia; np., jeśli została rozcieńczona dziesięciokrotnie, liczba komórek powinna być pomnożona przez 10. Opisane wyżej urządzenie nazywa się komorą Thoma. W komorze Helbera odległość między powierzchnią a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0, 02 mm.

364

14. 8. 2 Liczba bakterii żywych
Większość metod określania liczby żywych bakterii polega na wysianiu danej próbki (lub jej rozcieńczeń) na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji, liczbę komórek w inokulum określa się na podstawie liczby kolonii powstających na podłożu lub w jego głębi. Zakłada się, że każda kolonia powstaje z pojedynczej komórki. Liczba komórek, z których powstają kolonie, przynajmniej w części zależy od rodzaju zastosowanego podłoża oraz warunków inkubacji. W metodzie płytkowej (powierzchniowej) na całej powierzchni sterylnego podłoża z agarem rozprowadza się około 0, 05-0, 1 ml próby, jak opisano wcześniej. Po okresie inkubacji płytki określa się liczbę żywych komórek bakteryjnych w próbce na podstawie: 1) liczby kolonii, 2) objętości inokulum oraz 3) stopnia rozcieńczenia wysiewanego materiału. Jeśli są podstawy, aby przypuszczać, że próbka zawiera dużo komórek, np. 106 komórek/ml, można przygotować szereg dziesięciokrotnych rozcieńczeń, a następnie wysiać np. 0, 1 ml z każdego rozcieńczenia na oddzielne płytki, wówczas przynajmniej jedno z rozcieńczeń da policzalną liczbę kolonii. W metodzie płytek lanych płynne inokulum miesza się z rozpuszczonym podłożem agarowym (o temperaturze około 45°C), następnie wylewa się do płytek Petriego, w których podłoże krzepnie. W czasie inkubacji kolonie wyrastają w głębi podłoża (oraz na jego powierzchni) i liczbę żywych komórek określa się jak wyżej. Kolejny sposób liczenia żywych bakterii to metoda Milesa i Misry'ego (rys. 14. 6). Jeśli w badanej próbce przypuszczalnie powinno się znajdować niewiele bakterii (np. w wodzie z czystej rzeki), przesącza się ją przez sterylny filtr o wielkości porów np. 0, 2 μm. Komórki bakteryjne zostają na powierzchni filtra. Po przesączeniu np. 100 ml próby filtr kładzie się — do góry powierzchnią z komórkami — na powierzchni odpowiedniego podłoża. Substancje odżywcze dyfundują przez filtr, na którym wyrastają kolonie. Liczbę żywych bakterii w próbce określa się na podstawie: liczby kolonii na filtrze oraz objętości przesączonej próbki.

14. 8. 3 Liczenie komórek wewnątrz (lub na) ciał stałych
Czasami konieczne jest określenie liczby bakterii w próbce materiału, żywności itp. W tym celu cząstki np. żywności należy rozkruszyć i bakterie oddzielić od próby. Agregaty bakterii również powinny być rozbite. Próbkę i płyn do rozcieńczeń (np. roztwór Ringera) można szczelnie zamknąć np. w sterylnym plastikowym woreczku, który następnie poddawany jest mechanicznym wstrząsom. W ten sposób przynajmniej część bakterii można przeprowadzić w zawiesinę.

14. 9 Barwienie
Barwienie często wykorzystywane jest do wykrywania, klasyfikacji lub identyfikacji bakterii, jak również do obserwowania składników komórek bakteryjnych. Najczęściej bakterie przed wybarwieniem zabija się i utrwala.

365

Próbkę zwykle najpierw rozcieńcza się np. 1/10, 1/100... itd. Jedną kroplę (o znanej objętości) każdego rozcieńczenia nakłada się na różnych częściach powierzchni odpowiedniego, lekko przesuszonego podłoża. Po wyschnięciu kropli, płytkę inkubuje się aż do widocznego wzrostu bakterii. Z kropli, które zawierały dużą liczbę bakterii, powstanie „murawka", podczas gdy z tych, w których było mniej niż około 15 komórek, wyrosną drobne, policzalne kolonie. Zakładając, że każda kolonia powstaje z oddzielnej komórki, to z liczby tych kolonii, objętości kropli oraz współczynnika rozcieńczenia można wyliczyć liczbę żywych bakterii w próbce. Do nakroplenia próbek można użyć tej samej pipety pasterowskiej, pod warunkiem że zaczniemy od największego rozcieńczenia, posuwając się w stronę najmniejszego. Pipetę pasterowską można wykalibrować, tzn. zmierzyć objętość podawanych przez nią kropel. W tym celu do pipety wystarczy nabrać znaną objętość wody (np. 1 ml) oraz policzyć krople powstające podczas wypuszczania pobranej cieczy. Jeśli 1 ml „schodzi" np. w 30 kroplach, to objętość każdej kropli wyniesie około 1/30 ml.

Barwnikiem zwykle zalewa się bardzo cienką warstwę komórek na mikroskopowym szkiełku podstawowym. Komórki z czystej kultury można obejrzeć stosując następującą procedurę. Na szkiełko podstawowe nanosi się oczkiem ezy kropelkę wody, a następnie nieco materiału bakteryjnego pobranego ezą miesza się z tą kroplą, tworząc zawiesinę komórek. Używając ezy rozprowadza się materiał na powierzchni 1-2 cm2 i pozwala, by wysechł, otrzymując rozmaz. Wyschnięty rozmaz utrwala się przeprowadzając szkiełko podstawowe szybko dwa razy przez płomień palnika, po czym rozmaz jest gotowy do wybarwienia i obejrzenia pod mikroskopem. Rozmaz można również wykonać bezpośrednio np. z osadu odwirowanego moczu lub ropy z rany.

14. 9. 1 Barwienie Grama
Teoria leżąca u podstawy tego barwienia podana jest w sekcji 2. 2. 9. Przebieg barwienia opisany niżej jest jedną z wielu stosowanych wersji. Utrwalony rozmaz (patrz wyżej) barwi się przez 1 minutę roztworem fioletu krystalicznego. Następnie przemywa się go pod bieżącą wodą, traktuje przez minutę płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) i ponownie przemywa. 366

Z kolei przeprowadza się odbarwianie rozmazu komórek bakteryjnych za pomocą etanolu (95%), acetonu lub roztworu jodu w acetonie. Ten etap barwienia jest bardzo ważny: rozpuszczalnik spływa po pochylonym szkiełku tylko tak długo, jak barwnik spływa z niego swobodnie (około 1-3 sekund). Następnie należy rozmaz natychmiast przemyć bieżącą wodą. Na tym etapie komórki gramujemne będą bezbarwne, a gramdodatnie fioletowe. W ostatnim etapie rozmaz traktuje się barwnikiem kontrastowym, np. rozcieńczonym roztworem fuksyny karbolowej, aby komórki gramujemne zabarwić na czerwono. Po krótkim spłukaniu wodą, rozmaz delikatnie osusza się bibułą i ogląda w mikroskopie z użyciem obiektywu immersyjnego (powiększenie około 1000x). Niektóre gatunki bakterii w barwieniu Grama nie barwią się jednoznacznie lub nie zawsze barwią się tak samo. Czasami reagują dodatnio, czasem ujemnie. O takich bakteriach mówimy, że są gramzmienne. Aby uniknąć problemu gramzmienności w taksonomii, wiele bakterii opisuje się jako typu gramdodatniego lub typu gramujemnego, zależnie od tego, czy struktura ich ściany komórkowej jest gramdodatnia czy gramujemna (sekcja 2. 2. 9).

14. 9. 1. 1 Barwienie Grama żywych komórek
Reakcję Grama żywych komórek można określić za pomocą różnicującego procesu barwienia (LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit: Molecular Probes, USA). Bakterie z logarytmicznej fazy wzrostu hodowli traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników, z których każdy jest selektywny dla kwasów nukleinowych. Barwnikami są SYTO® 9 i jodek heksydyny. W przypadku bakterii gramdodatnich kwasy nukleinowe wybiórczo wybarwia jodek heksydyny, który skutecznie współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania. Kwasy nukleinowe bakterii gramujemnych wybarwiają się SYTO® 9, ponieważ tylko ten barwnik przenika przez ich błonę zewnętrzną. W promieniowaniu o długości fali około 480 nm, związany jodek heksydyny fluoryzuje na pomarańczowo, zaś związany SYTO® 9 — na zielono.

14. 9. 2 Barwienie Ziehl-Neelsena (barwienie kwasooporne)
Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wybarwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegają odbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu. Do bakterii tego typu należy np. Mycobacterium tuberculosis. Rozmaz utrwalony podwyższoną temperaturą zalewa się roztworem fuksyny karbolowej i podgrzewa się szkiełko podstawowe do momentu, gdy roztwór zaczyna parować. Nie powinien się gotować. Szkiełko utrzymuje się w temperaturze bliskiej wrzenia przez około 5 minut, schładza w powietrzu, a następnie spłukuje bieżącą wodą. Odbarwianie przeprowadza się zanurzając szkiełko podstawowe w mieszanie kwasu i alkoholu (np. 3% stężonego kwasu solnego w 90% etanolu), za każdym razem zmieniając roztwór na świeży. Po spłukaniu wodą rozmaz barwi się kontrastowym barwnikiem, np. zielenią malachitową, ponownie spłukuje wodą i suszy. Bakterie kwasooporne barwią się na czerwono, pozostałe na zielono.

367

14. 9. 3. Barwienie otoczek
Obecność otoczek bakteryjnych można wykazać na przykład barwieniem negatywowym (fot. 2. 3: środek, strona prawa). Komórki miesza się na szkiełku podstawowym np. z roztworem nigrozyny naniesionym oczkiem ezy i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. W mikroskopie z obiektywem immersyjnym lub zwykłym o dużym powiększeniu (np. 40x) otoczka jest widoczna jako przejrzysta, jasna strefa między komórką a jej ciemnym tłem.

14. 9. 4 Barwienie endospor
Patrz sekcja 16. 1. 1. 4.

14. 9. 5 Rozróżnianie żywych bakterii od martwych przez barwienie
Bakterie żywe i martwe można odróżnić na przykład prostym barwieniem z użyciem zestawu LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, USA). Bakterie traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników, z których każdy łączy się z kwasami nukleinowymi. Barwniki te to SYTO® 9 (fluorescencja zielona) i jodek propidyny (fluorescencja czerwona). Jodek propidyny wnika tylko do komórek z uszkodzoną błonę cytoplazmatyczną (cecha charakterystyczna martwych komórek), nie wnika do zdrowych, żywych komórek. SYTO® 9 wnika zarówno do komórek żywych, jak i martwych. W mikroskopie fluorescencyjnym żywe komórki fluoryzują na zielono, a w martwych jodek propidyny współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania i takie komórki fluoryzują na czerwono. [Metody pozwalające na określenie żywotności drobnoustrojów zostały szczegółowo opisane przez Lloyda i Hayesa (1995) FEMSML 133: 1-7. ]

14. 10 Mikroskopia
W bakteriologii często zachodzi konieczność stosowania dużych powiększeń (np. 1000x), do czego mikroskop musi być wyposażony w obiektyw immersyjny (powiększenie około 100x) oraz odpowiedni okular (około 10x). W obiektywie immersyjnym przestrzeń między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym (lub, jak się czasem zdarza, między obiektywem a rozmazem bakteryjnym) wypełnia kropla olejku immersyjnego. Po co jest ten olej? Silna soczewka obiektywu ma bardzo krótką ogniskową i światło przechodzące przez obiekt musi wnikać do soczewki pod bardzo dużym kątem. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy przestrzeń między obiektywem a obiektem wypełnia płyn o odpowiednim współczynniku załamania (rys. 14. 7). Maksymalne użyteczne powiększenie uzyskiwane w danym obiektywie immersyjnym wynosi tysiąckrotność jego apertury numerycznej (rys. 14. 7).

368

W schemacie badany (cienki) preparat znajduje się między szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem nakrywkowym, a promienie biegną z jednego punktu w preparacie w kierunku soczewki obiektywu. Kiedy przestrzeń pomiędzy soczewką a szkiełkiem nakrywkowym wypełnia olej o współczynniku załamania 1, 5 (prawa strona schematu), promienie światła przechodzące przez szkiełko nakrywkowe wnikają do środowiska o współczynniku załamania podobnym do szkła (mniej więcej 1, 5). Każdy promień będzie zatem dalej biec w tym samym kierunku (nie załamując się), jak gdyby wciąż biegł w szkle. Schemat pokazuje taki promień, który wnika do soczewki. Zwróć uwagę, że promienie wnikają do soczewki nawet pod największymi kątami. Kiedy między obiektywem z szkiełkiem nakrywkowym znajduje się powietrze o współczynniku załamania 1, promień biegnący pod kątem podobnym do tego pokazanego w prawej części schematu nie może opuścić środowiska szkła — odbija się od górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego. Promienie biegnące pod mniejszym kątem w porównaniu z pionem wnikają do soczewki obiektywu. Ogólnie, do soczewki trafia mniej światła i zatem mniej promieni przechodzących przez obiekt. Apertura liczbowa (AL) to cecha charakterystyczna soczewki: gdzie η — współczynnik załamania środowiska między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym, θ — połowa maksymalnego kąta, po którym promienie wnikają do soczewki. W schemacie θ jest kątem a w powietrzu, zaś a' kątem w olejku immersyjnym. Maksymalna zdolność rozdzielcza obiektywu zależy od jego apertury liczbowej.

369

14. 10. 1 Oświetlenie Kohlera
W celu otrzymania najlepszego obrazu obiekt musi być równomiernie oświetlony, i to niezależnie od nierówności w źródle światła. Oświetlenie Kohlera, które jest optymalne, wykorzystuje lampę zaopatrzoną w soczewkę kondensacyjną oraz regulowaną przesłonę, która determinuje średnicę wiązki oświetlającej. Kiedy jest poprawnie ustawiona, na niższej płaszczyźnie ogniskowej kondensatora pod stolikiem widać obraz włókna lampy i promienie z każdego punktu tego obrazu przechodzą przez kondensor w postaci równoległych promieni, które oświetlają obiekt i wnikają do soczewki obiektywu (rys. 14. 8).

14. 10. 2 Mikroskopia kontrastowo-fazowa
Zwykły mikroskop świetlny może ujawnić szczegóły budowy, gdy poszczególne części obiektu pochłaniają różne ilości światła lub (czasem na skutek barwienia) absorbują różne barwy. Komórki nie barwione też czasem są widoczne, lecz nie na tyle dobrze, by widać było szczegóły ich budowy. Mikroskopia kontrastowo-fazowa pozwala dostrzec szczegóły budowy w przezroczystych/przejrzystych, nie barwionych, żywych komórkach dzięki wykorzystaniu różnic fazy między światłem biegnącym przez obiekt, ulegającym i nie ulegającym dyfrakcji (rys. 14. 9).

Wewnątrz przezroczystego lub przejrzystego obiektu światło oświetla region, który powoduje jego ugięcie; fale ugięte (linie przerywane) ulegają opóźnieniu o około jednej czwartej długości fali (1/41). Gdyby fale ugięte oraz bezpośrednie ulegały interakcji w normalnym mikroskopie (z jasnym polem), to amplituda fali wypadkowej byłaby zbliżona do fal tła i obserwowany obiekt nie byłby dobrze widoczny. Oba rodzaje fal nieznacznie różniłyby się fazą, lecz oko ludzkie nie potrafiłoby tego wykryć. W mikroskopie kontrastowo-fazowym kondensor w przedniej płaszczyźnie ogniskowej ma pierścieniową przysłonę powodującą powstanie pustego stożka światła, który skupia się (w postaci jasnego małego pierścienia) na płytce fazowej umieszczonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu (patrz schemat). Płytka fazowa jest wykonana ze szkła, na który naniesiony jest pierścień z np. fluorku magnezu o takiej grubości, że opóźnia np. o 1/4λ przechodzące przez niego światło. Pod nieobecność obiektu całe światło przechodzi przez pierścień fazowy. W trakcie badania jakiegoś obiektu (np. niezabarwionej komórki bakteryjnej) fale tła (linie ciągłe) przechodzą przez pierścień, podczas gdy fale ugięte (linie przerywane) przechodzą przez płytkę fazową przez strefy na

370

zewnątrz pierścienia. Opóźniając fale tła o 1/4λ, pierścień fazowy sprowadza wszystkie fale do tej samej fazy. W płaszczyźnie obrazu interakcja między falami ugiętymi i falami tła powoduje powstanie widocznego obrazu, gdyż wypadkowa fala ma amplitudę większą niż fale tła (tj. fala tworząca obraz jest jaśniejsza niż fale tła). Taki rodzaj mikroskopii kontrastowo-fazowej nosi nazwę „ujemnej" („negatywowej") lub „jasnej". Efekt odwrotny — obraz ciemniejszy niż tło — powstaje w kontraście fazowym „dodatnim" („pozytywowym") lub „ciemnym". Lepszy obraz uzyskuje się, gdy kondensor jest wyposażony w zielony filtr. Należy stosować mocniejszą lampę niż w mikroskopii w jasnym polu, gdyż jedynie część mocy lampy jest wykorzystywana do tworzenia obrazu. Należy też pamiętać, aby przesłona pierścieniowa w kondensorze była zgodna z używanym obiektywem kontrastowo-fazowym. Mały jasny pierścień na płytce fazowej musi się dokładnie zgadzać z pierścieniem fazowym (patrz schemat). Jeśli trzeba, kiedy kondensator jest we właściwej pozycji, a obiekt jest maksymalnie ostry, należy dokonać regulacji. W tym celu należy usunąć okular i zastąpić go specjalnym „mikroskopem pomocniczym". Mikroskop ten należy skupić na płytce fazowej i używając odpowiednich śrub centrujących w kondensorze (zależnie od modelu mikroskopu) zmienić położenie jasnego pierścienia

14. 10. 3 Mikroskopia immunofluorescencyjna/epifluorescencyjna
Patrz sekcje 11. 8. 2 i 11. 8. 5

ROZDZIAŁ

15
Człowiek przeciwko bakteriom

Bakterie mogą być uciążliwe, a nawet niebezpieczne w wielu codziennych sytuacjach, dlatego potrzebne są nam sposoby eliminowania ich lub hamowania ich aktywności. Czasem niezbędne jest całkowite zniszczenie wszystkich form żywych na jakimś obiekcie, jak na przykład podczas przygotowywania do użycia narzędzi chirurgicznych. W innych sytuacjach wystarczające może być jedynie wyeliminowanie potencjalnie szkodliwych organizmów. Szczególny problem stwarza konieczność inaktywacji patogennych bakterii na lub wewnątrz żywych tkanek.

15. 1 Sterylizacja
Każda procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów — łącznie z ich endosporami (sekcja 4. 3. 1) oraz wirusów — jest nazywana procesem sterylizacji (jałowienia). (Ponieważ sterylizacja zabija wszystkie organizmy, wyrażenie takie jak „częściowa sterylizacja" jest bezsensowne. ) Idealnie byłoby, gdyby metody sterylizacji były wydajne, szybkie, proste i tanie i aby mogły być zastosowane dla szerokiego wachlarza materiałów (nie uszkadzając ich). Sterylizację zazwyczaj przeprowadza się z zastosowaniem czynników fizycznych — powszechne jest ogrzewanie do odpowiednio wysokiej temperatury.

15. 1. 1 Sterylizacja przez ogrzewanie
Komórki poszczególnych gatunków bakterii różnią się wrażliwością na ogrzewanie, a endospory są znacznie bardziej wytrzymałe niż komórki wegetatywne. Komórki wegetatywne giną gwałtownie we wrzącej wodzie, podczas gdy endospory mogą w tych warunkach przetrwać przez długi czas. Sterylizująca skuteczność ogrzewania zależy nie tylko od temperatury, ale także od takich czynników jak czas, wilgotność oraz liczba i stan fizjologiczny 372

zapobiegając nadmiernemu zwiększaniu ciśnienia i temperatury. 15. mogą być sterylizowane i niszczone przez spalenie. 15.niszczonych mikroorganizmów. Po osiągnięciu określonego ciśnienia otwiera się odpowiedni zawór. aby możliwy był jego dostęp do wszystkich przedmiotów poddawanych sterylizacji. ewentualnie para wciąż dopływa z zewnętrznego źródła. 3 Sterylizacja gorącą parą wodną: autoklaw Para wodna może sterylizować w niższych temperaturach (przez krótszy czas) niż stosowane w sterylizatorach. 15. Wewnątrz urządzenia powietrze powinno być w obiegu. 1). 1) lub w przypadku większych autoklawów jest ona wpuszczana przewodami z zewnętrznego tworzącego ją urządzenia (bojlera). W warunkach takich następuje denaturacja białek. póki komora nie wypełni się czystą parą — następnie zawór jest zamykany. 1 Płomień Płomień stosuje się np. powinny więc one być tak rozmieszczone. Wewnątrz komory w wyniku wrzenia wody powstaje para (rys. powietrze jest wypychane przez otwarty zawór. strzykawki itp. Gdy sterylizujemy przy użyciu gorącej pary wodnej. Jednak w wielu przypadkach stosuje się mniej radykalne metody. 1. 1. 15. (sekcja 14. odwodnienie cytoplazmy i utlenianie różnych składników wszelkich obecnych organizmów. 2 Sterylizatory wykorzystujące gorące powietrze Aparaty te używane są np. szczelnej komorze (zwanej autoklawem). 1. Kiedy jednak znajduje się pod podwyższonym ciśnieniem. para ma temperaturę tylko 100°C. czyli taką. 4). tym dłuższy czas będzie potrzebny do uzyskania sterylności w danej temperaturze. 1. do szybkiej sterylizacji powierzchni. W tzw. aby wszystkie znajdującego się w autoklawie ładunki materiałów osiągnęły właściwą do sterylizacji temperaturę i pozostawały w tej temperaturze aż wszystkie mikroorganizmy zostaną zabite. automatyczna regulacja pozwala na utrzymanie wcześniej zaprogramowanego ciśnienia na stałym poziomie przez określony czas. 373 . aby nie utrudniać przepływu gorącego powietrza. ilustruje to rysunek 12. czyli pary nie zawierającej żadnej domieszki powietrza. do sterylizacji przedmiotów odpornych na wysoką temperaturę. sterylizatorach utrzymywana jest przez 60-90 minut temperatura 160-170°C. Ciśnienie i temperatura pary zwiększają się. przedmioty przeznaczone do sterylizacji umieszczamy w mocnej. 1. Czas sterylizacji musi być tak dobrany. 15. gdyż podgrzewanie trwa nadal (rys. 1. Należy zauważyć. 3. 14. podczas gdy jednorazowe materiały takie jak ochronne ubrania chirurgiczne. 2. Im wyższe jest ciśnienie. może osiągać wyższe temperatury. metalowej. takich jak czyste szkło laboratoryjne. że im wyższa jest początkowa liczebność populacji bakterii. oczek inokulacyjnych (ez) itp. Przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym. tym wyższa temperatura. w której endospory mogą przeżywać przez długi czas. w istocie istnieje określona zależność między ciśnieniem i temperaturą czystej pary wodnej.

element grzewczy jest wyłączany. W tekście znajdziesz uwagi na temat pewnych zasad bezpieczeństwa. lub 134°C (2. a autoklaw schładza się powoli. 02 bara [103 kPa. wypychając z niej przez otwarty zawór całe powietrze. czyli sumę ciśnienia atmosferycznego i ciśnienia pary wodnej. 7 lb/cal2 = 760 mmHg). tzn. zawierać tak dużo wody w formie pary jak jest to możliwe dla danej temperatury i ciśnienia. 2 2 15/lb/cal ]) przez 15-20 minut. 121°C (1. że manometr autoklawu może wskazywać ciśnienie jako ciśnienie powyżej atmosferycznego (jak w podanych powyżej przykładach) lub jako ciśnienie całkowite. obecność powietrza w komorze zaburzyłaby zależności ciśnienia i tempe- 374 . para wodna musi być nasycona.Woda znajduje się na dnie komory. Materiały przeznaczone do sterylizacji są umieszczone na perforowanej tacy. Zauważ. 1). 1. Pokrywa z zaworem (kranikiem) do usuwania powietrza i pary jest przymocowana do kotła specjalnymi klamrami. Standardowe warunki (kombinacja temperatury i czasu) zalecane do pow2 szechnego stosowania to: 115°C (przy ciśnieniu 0. 10 lb/cal ] powyżej ciśnienia atmosferycznego przez 35 minut. Podczas dalszego podgrzewania woda paruje powodując wzrost ciśnienia (i temperatury) wewnątrz komory. Zwróć też uwagę. Po osiągnięciu odpowiedniego ciśnienia jest ono utrzymywane na stałym. Para wodna wypełnia komorę. 30 lb/cal ]) przez 4 minuty. póki ciśnienie wewnątrz komory nie spadnie do poziomu ciśnienia atmosferycznego. jest on zamykany. że odliczanie czasu zaczyna się od momentu osiągnięcia sterylizującej temperatury przez każdy element ładunku. Element grzejny jest włączony i woda gotuje się. 04 bara [207 kPa. 68 bara [=69 kPa. gumowa uszczelka zapewnia szczelność zamknięcia. zaprogramowanym wcześniej poziomie. która utrzymuje je powyżej poziomu wody. Po upływie odpowiedniego czasu (patrz tekst). Czas może być różny. Teraz można odkręcić zawór i otworzyć pokrywę komory. zależnie od rodzaju ładunku i stopnia zakażenia (patrz sekcja 15. Gdy czysta para wodna zaczyna wydobywać się przez zawór. Także urządzenie pomiarowe może być wykalibrowane w innych jednostkach niż podano w przykładzie (w przybliżeniu 1 bar = 101 kPa = 14. Aby sterylizacja była skuteczna.

promienie X — sterylizują przez dostarczanie energii do zajścia wielu letalnych reakcji chemicznych w zanieczyszczających organizmach. Płyn może być przeciągany przez filtr do sterylnego 375 . wazelina) mogą być sterylizowane w sterylizatorze z suchym gorącym powietrzem (15. W niektórych modelach para wodna jest dostarczana od góry komory. takich jak ubrania. 15. 1. a czynniki takie jak czas. promienie gamma. jednorazowe plastikowe płytki Petriego. pościel itp. używane w szpitalach.. jednorazowe strzykawki itp. U w a g a d o t y c z ą c a b e z p i e c z e ń s t w a : Aby uniknąć ryzyka wybuchu butli zawierających płyny itp. Pewne materiały nie mogą być sterylizowane przez autoklawowanie. Tak więc przed zamknięciem zaworu całe powietrze z komory autoklawu musi być usunięte. 2). mających tendencję do zatrzymywania powietrza. W dużych autoklawach. Niektóre materiały ulegające zniszczeniu w warunkach autoklawowania mogą być sterylizowane przez działanie mieszaniny pary wodnej i formaldehydu w niższej temperaturze (np. 2. gdyż w stosowanych warunkach para jest lżejsza od powietrza. 1. jak np. Sterylizacja promieniami jonizującymi Promienie jonizujące — np.ratury. tak że powietrze jest wypychane w kierunku dolnym. substancje takie jak wazelina i substancje lotne lub niszczone przez wysoką temperaturę. para jest zwykle dostarczana ze źródła zewnętrznego. wełnianych koców itp. jest to bardziej efektywny system niż przy odwrotnym kierunku dopływu pary (jak to jest w małych autoklawach). Sterylizacja przez filtrację Płyny. plastikowych węży. 3. 80°C). 1. W innym typie autoklawu powietrze jest usuwane z komory przez pompę próżniową przed dostarczeniem pary. pozwala to na szybką i dokładną penetrację pary do wszystkich porowatych sterylizowanych materiałów. metoda ta zabija endospory w ciągu 2 godzin i jest stosowana do sterylizacji wrażliwych na temperaturę narzędzi chirurgicznych. np.: pozostaw nie dokręcone korki przed wstawieniem do komory oraz pozwól płynom schłodzić się do temperatury ~80°C przed otworzeniem komory. ciśnienie i jakość pary są kontrolowane automatycznie. gdyż mieszanina pary i powietrza ma w tym samym ciśnieniu niższą temperaturę niż czysta para wodna. Pewne z tych substancji (np. 15. które chcemy pozbawić nawet najmniejszych mikroorganizmów (np. Małe przenośne autoklawy laboratoryjne odpowiadają budową i działaniem domowym szybkowarom. 1. wirusów). Promieniowanie gamma (zazwyczaj jego źródłem jest kobalt-60) stosuje się do sterylizacji materiałów do pracowni biologicznych i medycznych. takich jak np. możemy sterylizować przez przepuszczenie go przez filtr membranowy (o odpowiedniej wielkości por) zatrzymujący także wszystkie inne mikroorganizmy. promienie beta (elektrony).

jak np. do pewnych celów bardziej odpowiednie są metody fizyczne. 8°C i tworzy wybuchową mieszaninę z powietrzem. poliwęglanu lub podobnego materiału. 1. pościeli. zwykle nie ma żadnego (lub jedynie niewielki) wpływu na endospory bakteryjne. który reaguje z różnymi grupami w białkach i kwasach nukleinowych. Metodę tę wykorzystuje się do sterylizacji niektórych narzędzi medycznych (np. Ważne są warunki procesu. pewne plastiki. wielkość porów może wynosić nawet tylko 0. 2 μm. takimi jak dwutlenek węgla lub azot. Tlenek etylenu (C2H4O) — rozpuszczalny w wodzie cykliczny eter — jest gazem w temperaturze powyżej 10. jakkolwiek termin ten czasem używamy w odniesieniu do antyseptyków (sekcja 15. 15. obecności celulozy lub zawilgocenia ładunku. Inne przykłady chemicznych środków sterylizujących to aldehyd glutarowy i β-propiolakton. 3). 4 Sterylizacja z użyciem czynników chemicznych Związki chemiczne stosowane do sterylizacji muszą być wysoce reaktywne i uszkadzające żywe tkanki. Filtr jako taki to cienki płatek membrany z octanu celulozy. obecności lipidów. Terminem „gas plasma" określa się proces. wilgotność. jest więc rozcieńczany innymi gazami. a temperatura. Chociaż chemiczna dezynfekcja jest szeroko stosowana. w którym nadtlenek wodoru wstrzykiwany jest do komory sterylizującej (suche powietrze pod zmniejszonym ciśnieniem) i energia o częstotliwości fal radiowych zamienia nadtlenek wodoru w reaktywny czynnik powodujący sterylizację.pojemnika z zastosowaniem podciśnienia lub przepychany z użyciem np. Filtrację stosuje się np. 376 . czas i stężenie czynnika muszą być dokładnie kontrolowane. roztworów antybiotyków wrażliwych na temperaturę i roztworów zawierających cukry nietrwałe w podwyższonej temperaturze. niezbędne jest więc ostrożne obchodzenie się z nimi. „Dezynfekcja" zwyczajowo odnosi się do stosowania pewnych środków chemicznych w celu zmywania niektórych powierzchni i nieżyjących obiektów. materiałów wrażliwych na ogrzewanie. endoskopów). Stosuje się go do sterylizacji czystego sprzętu medycznego. Wskazane jest stosowanie ich tylko w odpowiednio wyposażonych instytucjach przez przeszkolony w tym zakresie personel. inaktywacji lub usunięcia potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów — niekoniecznie wpływająca na inne obecne organizmy. 2 Dezynfekcja Dezynfekcja to każda procedura prowadząca do zniszczenia. tłoka strzykawki. Tlenek etylenu jest czynnikiem alkilującym. Do sterylizacji mieszanina taka jest używana w specjalnych komorach. 15. nieskuteczna sterylizacja może wynikać z: niskiej temperatury (<42°C). do sterylizacji surowicy (na użytek laboratoryjny).

niezdysocjowana forma HOCl jest silnie bakteriobójcza. do dezynfekcji sprzętu w zakładach przetwórstwa spożywczego (w tym mleczarskiego). są nazywane bakteriobójczymi. podchloryny) są raczej niestabilne. gdyby środki dezynfekujące powszechnego użytku zabijały szeroki wachlarz rzeczywistych i potencjalnych patogenów. a ponadto aktywność ta może zależeć od takich czynników jak stopień rozcieńczenia. 1 Dezynfekcja środkami chemicznymi Najlepiej byłoby. są one bakteriostatyczne w małych stężeniach. 1 Testowanie środków dezynfekujących Skuteczność dezynfekujących środków fenolowych można określić tzw. czyli antybakteryjną aktywnością danego środka 377 . chociaż jego aktywność maleje w obecności substancji organicznych lub innych. obecność związków organicznych lub detergentów. olejki sosnowe) do uzyskania aktywności muszą być używane w formie rozpuszczonej. 5% zabija on w ciągu 15 minut wiele patogenów nie wytwarzających spor. 2. Spośród wielu będących w użyciu środków dezynfekcyjnych omówimy niżej tylko kilka najpopularniejszych. „Czwartorzędowe związki amonowe" (QACs. Jako stabilizator dostępnych w handlu dezynfekujących środków podchlorynowych używany jest zazwyczaj wodorotlenek sodu. temperatura. dany środek dezynfekujący jest zwykle bardziej aktywny wobec określonych organizmów. aby w ogóle był aktywny. Inne jedynie hamują (zatrzymują) wzrost bakterii. odpowiedniego stężenia i czasu działania. które zabijają bakterie. Środek dezynfekujący. Środki dezynfekujące. współczynnikiem fenolowym. W małym stężeniu niektóre środki nie tylko tracą aktywność. pH. a bakteriobójcze w wyższych. pewne kationy (Ca2+. mydło. quaternary ammonium compounds) są kationowymi detergentami stosowanymi np. 2. niektóre gatunki Pseudomonas mogą rosnąć w rozcieńczonym roztworze kwasu karbolowego (fenolu). 1.15. Podchloryny są wysoce aktywne wobec wielu bakterii (także endospor). bakterie mogą na nowo podjąć wzrost. w stężeniu 0. Chlor jest powszechnie używany do dezynfekcji wody wodociągowej oraz wody w basenach kąpielowych. a ich aktywność jest hamowana przez np. z którymi może reagować. ale endospory mogą przeżyć nawet w 2% lizolu przez wiele dni. uszkadzają błonę cytoplazmatyczną. Działa on (bezpośrednio lub w formie kwasu podchlorawego) jako efektywny czynnik dezynfekujący. niskie pH i substancje organiczne. jeżeli zostaną one zinaktywowane (np. takie jak krezole i ksyleny) mogą w odpowiednich stężeniach działać bakteriobójczo. Pewne środki (np. potrzebuje określonych warunków. Po rozcieńczeniu środek bakteriobójczy może stać się bakteriostatycznym. Fenol i jego pochodne (np. przez rozcieńczenie lub chemiczną neutralizację). Takie środki dezynfekujące są nazywane bakteriostatycznymi. a inne (np. Jednakże. 15. ang. QACs są bardziej aktywne wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych. Lizol jest mieszaniną metylofenoli z mydłem. co wynika głównie z ich wpływu na przepuszczalność błony cytoplazmatycznej. ale mogą być metabolizowane przez pewne bakterie — np. Mg2+).

boksy do pracy w warunkach sterylnych itp.w odniesieniu do fenolu (w wystandaryzowanych warunkach). że jest najbardziej oporny na testowany czynnik. sale operacyjne. 15. 1. ) Dezynfekcja mleka przez pasteryzację i proces UTH opisano w sekcji 12. Test zawiesinowy Chicka-Martina określa współczynnik fenolowy w obecności substancji organicznej (np. 2. Salmonella typhi NCTC 786) w tempie równoważnym do standardowych rozcieńczeń fenolu. które zabija testowy organizm (np. 1. Test zawiesinowy Rideala-Walkera określa rozcieńczenie badanego czynnika. ponieważ środek dezynfekujący może być inaktywowany przez substancje organiczne. drożdży). o którym wiadomo. Współczynnik fenolowy może być oznaczony w teście zawiesinowym (ang. 378 . Test pojemnościowy Kelseya-Sykesa określa skuteczność środka dezynfekującego w warunkach symulujących spotykane w praktyce. 15. suspension test). spośród różnych testowych organizmów (np. capacity test) określający zdolność danego czynnika do zachowywania aktywności przy wzrastającej liczbie bakterii. Test nośnikowy (ang. 2 Dezynfekcja czynnikami fizycznymi Naświetlanie promieniami ultrafioletowymi wywołuje uszkodzenia DNA i może być letalne dla bakterii przy zastosowaniu odpowiednich warunków. może być stosowana profilaktycznie (czyli w celu zapobiegania infekcjom) lub terapeutycznie (do leczenia infekcji). UV ma niewielką zdolność penetracji (jest łatwo pochłaniane przez stałe podłoża). ale lampy ultrafioletowe (o długości fali około 254 nm) są z powodzeniem używane do dezynfekcji powietrza i odkrytych powierzchni w zamkniętych pomieszczeniach (np. Staphylococcus aureus NCTC 4163) wybiera się ten. który uprzednio został sztucznie zakażony mikroorganizmami. Procedury testowania środków dezynfekujących są obecnie weryfikowane. Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749. dla różnych środków dezynfekujących. Do stałej objętości badanego czynnika dezynfekującego dodaje się okresowo bakterie. to jest w warunkach symulujących spotykane w praktyce. jest to ważne. ze szczególnym zwracaniem uwagi na skuteczność ich działania w praktycznie występujących sytuacjach. 2. w którym różne rozcieńczenia badanego czynnika w płynnym podłożu działają w określonej temperaturze i przez określony czas na odpowiedni organizm testowy. carrier test) określa zdolność badanego czynnika do dezynfekcji obiektu (nośnika). wynik jest przedstawiany jako współczynnik Rideala-Walkera. Ogólnie. 3 Antyseptyka Antyseptyka jest to w istocie dezynfekcja żywych tkanek. a następnie w pewnych przedziałach czasowych pobierane są próbki w celu oznaczenia liczby żywych bakterii. stosuje się test „pojemności" (ang.

zarówno gramdodatnich. antybiotyki mogą mieć działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne. który często występuje w kremach antyseptycznych. otrzymując antybiotyk półsyntetyczny mogący mieć znacząco różne spektrum aktywności. W pewnych przypadkach naturalny antybiotyk (to jest wytwarzany przez drobnoustrój) można chemicznie zmodyfikować w laboratorium. jest on bifenolem (czyli cząsteczką zawierająca dwie grupy fenolowe) Jest on bardziej efektywny wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych. QACs (sekcja 15. Jodyna (w roztworze wodnym lub alkoholowym) jest silnym bakteriobójczym i zabijającym spory antyseptykiem. czyli środków chemicznych używanych do celów antyseptyki Dettol jest fenolowym antyseptykiem ogólnego stosowania używanym w rozcieńczonej formie.Ogólne uwagi na temat środków dezynfekujących (sekcja 15. pomagają jednakże usuwać bakterie ze skóry łącznie ze zmywanym brudem i tłuszczem. miejsce to może się znajdować w ścianie komórkowej. Zależnie od antybiotyku. błonie cytoplazmatycznej. zaś bakteriostatyczne w mniejszym. Heksachlorofen był stosowany w antyseptycznych mydłach. 1) stosują się też do antyseptyków. 1) zawierają bromek cetylotimetyloamonowy (Cetrimide. Mieszanina etanolu i wody (70: 30) jest powszechnym środkiem aseptycznym do odkażania skóry. jak i gramujemnych. Jest inaktywowana przez mydła. przeciwko MRSA (sekcja 15. Cetavlon itp. nie jest sporobójcza. 11). 2. a inne działają na szerokie spektrum organizmów. 4 Antybiotyki Pierwotnie słowo „antybiotyk" określało jakikolwiek produkt wytwarzany przez drobnoustroje. Niektóre wykazują aktywność w stosunku do wąskiego zakresu gatunków. anionowe detergenty i niskie pH. enzymem uczestniczącym w syntezie kwasów nukleinowych. który nawet w bardzo małych stężeniach hamował wzrost lub zabijał pewne mikroorganizmy. chociaż pewne szczepy MRSA wykazują wobec niej oporność kodowaną przez plazmid [patrz np. a niektóre z nich mogą być bakteriobójcze w większym stężeniu. Ponieważ b