P. 1
apostila_monitoramento_microbiologico

apostila_monitoramento_microbiologico

|Views: 48|Likes:
Published by tatianapv

More info:

Categories:Topics, Art & Design
Published by: tatianapv on Mar 10, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

03/10/2011

pdf

text

original

DY5EDY57PXIW PQI730HCH0AG 375ED"BCA 398675¤34 YEY`QW55 RR Q7C0CGFF 7VU0@@ 9T7¤S22 D 5D 5 PI PI 3HHA 3 5D BA 38 6 5 3 Métodos de análises e monitoramento microbiológico em laboratório

de destilaria
Depto. Tecnologia Agroindustrial e Sócio-Economia Rural Centro de Ciências Agrárias – Campus de Araras 

!©  ( ' & $ §  ! © §  § §   £ © § £ ¡ 1'0)%¨%#"  ¨¦¥¤¢ 

Profª Sandra Regina Ceccato Antonini – Doutora no Depto.Tecnologia

Agroindustrial e Sócio-economia Rural, CCA/UFSCar, com pós-doutorado em genética molecular de leveduras na Universidade de Sheffield, Inglaterra.

Endereço: Depto. Tecnologia Agroindustrial e Sócio-Economia Rural Centro de Ciências Agrárias Universidade Federal de São Carlos Via Anhanguera, km174 – C.Postal 153 13600-970 – Araras - SP Fone/fax: (19) 3543-2614 e-mail: antonini@cca.ufscar.br

A presente apostila se refere ao curso de treinamento ministrado nas unidades de Iguatemi-PR, no período de 19 a 21 de fevereiro de 2004, e de Ivaté-PR, no período de 16 a 18 de fevereiro de 2004, pertencentes à Usina de Açúcar Santa Terezinha Ltda.

Fevereiro/2004 1

INDICE

1. Introdução…………………………………………………………………

03

2. Monitoramento microbiológico........................................................... 05 3. Leveduras..............................................................................……….. 08 4. Bactérias.....................................…………………………...………….. 10 5. Métodos microbiológicos para controle em processos industriais de produção de álcool.........…………………………………………………... 5.1. Leveduras..………………………………………………………... 5.1.1. Contagem direta e determinação da viabilidade celular em leveduras.......................…………………....……………………………… 5.1.2. Plaqueamento e diluição em série....…………………………… 5.1.3. Meios diferenciais/seletivos para detecção de leveduras selvagens............................................................................................... 21 5.2. Bactérias..……………………………………………………………. 5.2.1. Plaqueamento e diluição em série....…………………………… 26 26 15 19 15 15

5.2.2. Coloração de Gram................................................................... 27 6. Preparo de meios de cultivo e soluções ........................................... 30 7. Bibliografia......................................................................................... 33

2

1. INTRODUÇÃO

Fermentação alcoólica é um fenômeno através do qual os açúcares são transformados em álcool e gás carbônico, por ação das leveduras. A fermentação dos mostos realiza-se em três fases distintas: pré-fermentação, fermentação principal e pós-fermentação. A pré-fermentação se inicia quando o fermento (leveduras) é adicionado ao mosto devidamente preparado, e se caracteriza por ativa multiplicação das células e elevação lenta e gradual da temperatura do meio. Após 5 a 6 horas, com pouca espuma, inicia-se a fermentação principal, que é reconhecida pela elevação rápida da temperatura, queda da densidade do mosto por causa do desaparecimento dos açúcares e da formação equivalente do álcool. A acidez eleva-se abaixando o pH. Essa fase termina quando as espumas desaparecem, durando de 9 a 10 horas. A pós-fermentação é caracterizada pela diminuição lenta e gradual da temperatura do mosto, diminuição do desprendimento do gás carbônico e não se formam mais espumas. Essa fase dura de 6 a 8 horas; e deve durar o mínimo possível para evitar a infecção do vinho e do pé-de-cuba, que será utilizado em nova fermentação. O mosto totalmente fermentado é denominado vinho. O processo de fermentação é o seguinte:

C6H12O6 → 2 CH2OH + 2 CO2

A Figura 1 mostra um esquema do processo fermentativo para produção de etanol.

3

Figura 1. Esquema representativo do processo fermentativo para produção de etanol

4

2. MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO

Além da escolha e da preparação do fermento, algumas condições ótimas devem ser mantidas durante o processo industrial no sentido de obter produtividade máxima de etanol a partir dos açúcares fermentescíveis. Entre os parâmetros a serem considerados, devem figurar, entre outros, o teor de fermento na dorna, a viabilidade celular, a ocorrência de infecções, o pH, a temperatura e a concentração de açúcar redutor total no mosto. Há, dessa forma, necessidade de um rigoroso controle do processo de fermentação, envolvendo a avaliação dos rendimentos práticos e simultaneamente o monitoramento microbiológico. O caldo de cana, principalmente na fase de extração, permite o desenvolvimento de uma série de microrganismos, pois tem concentração de açúcares, pH e temperatura favoráveis. Os produtos de metabolismo destes microrganismos são incorporados ao caldo, encontrando-se substâncias como álcoois, ácidos orgânicos e polissacarídeos que alteram a sua composição química, podendo causar sérios transtornos nos processos de fabricação. Tanto a reprodução dos microrganismos como a formação dos metabólitos se fazem às custas do açúcar inicialmente presente na cana, representando perdas não desprezíveis, na forma de degradação de açúcar e de álcool não produzido. Entre os contaminantes que mais aparecem nos processos fermentativos, ocorrendo inclusive na etapa da fermentação alcoólica,

predominam as bactérias gram-positivas dos gêneros Lactobacillus, Bacillus e Leuconostoc. A sacarose consumida por esses microrganismos deixará de ser transformada em álcool ou cristais de sacarose, provocando assim perdas do açúcar recuperável, o qual será transformado em ácidos orgânicos e dextrana, por exemplo. A determinação do número e tipos de bactérias presentes no processo são parâmetros importantes para o controle da infecção. Técnicas têm sido propostas para estimar a população bacteriana de amostras coletadas nas diferentes fases do processo: contagem direta ao microscópio e semeadura em placas (plaqueamento). O emprego de um ou outro método vai depender das 5

condições e instalações do laboratório da indústria, além de um treinamento específico aos laboratoristas. Estudos já realizados revelaram que uma concentração bacteriana da ordem de 109 UFC/mL leva a uma queda no rendimento alcoólico, chegando a atingir 100% com Lactobacillus e 60% com Leuconostoc, e redução na viabilidade das células de leveduras a cerca de 10%. Existem também bactérias que induzem a floculação de

Saccharomyces cerevisiae, tendo sido observados aumento no tempo de fermentação e redução de aproximadamente 15% no rendimento fermentativo como conseqüência desta floculação. Essa acontece provavelmente devido à presença de uma capa protêica de natureza gelatinosa sobre as bactérias,

acarretando assim a fixação mecânica nas células de leveduras ou através de uma ponte entre íons de cálcio e polímeros aniônicos da superfície da levedura. Essas bactérias indutoras de floculação do fermento estão restritas a linhagens de Lactobacillus, mais particularmente L. fermentum. A utilização de agentes antimicrobianos reduzem os danos causados pelos contaminantes, além de medidas como limpeza das moendas, tubulações, instalações da fermentação e vários outros procedimentos, tais como descarte de fundo de dorna, returbinação do fermento e tratamento ácido. Porém, o eficiente controle só é conseguido com o uso de antimicrobianos adequados e na dosagem correta, pois a aplicação racional desses produtos deve visar apenas a população de bactérias e não a de leveduras. O uso contínuo de antibióticos pode levar ao desenvolvimento de linhagens resistentes, as quais se tornam cada vez menos sensíveis à sua ação, além do alto custo. É importante que cada laboratório industrial utilize técnicas para detecção de sensibilidade das bactérias aos agentes antimicrobianos que sejam adequadas às suas condições operacionais, permitindo desta forma, verificar quais são exatamente os antibióticos ou biocidas mais eficientes para a aplicação industrial.

6

Se para o controle da contaminação bacteriana é possível a utilização de agentes antimicrobianos, o mesmo não pode ser dito em relação às leveduras selvagens ou “invasoras”. Algumas unidades industriais têm se deparado com problemas atribuídos à presença de leveduras contaminantes que, altamente competitivas dentro das condições existentes, passam a predominar na população de células presentes. Essas podem vir de fontes como melaço, caldo, água de lavagem de cana e o próprio solo. A ocorrência dessas leveduras tem sido freqüentemente associada a ocasiões em que se verificam reduções significativas da eficiência industrial, com queda no rendimento fermentativo, maior tempo de fermentação e maior formação de espumas pelo aumento da viscosidade. A instalação dessas leveduras na fermentação pode acarretar também sérios problemas operacionais. Nos processos de batelada e bateladaalimentada, os inconvenientes eram mais facilmente contornados, ao passo que para os processos contínuos, passaram a constituir um sério problema. A eliminação dessas linhagens invasoras, quando se detecta prejuízo considerável ao processo, consiste na substituição do fermento por fermento adaptado, aliado a uma melhoria na assepsia das tubulações, na qualidade da água utilizada na diluição do mosto, na eficiência do tratamento térmico/químico do caldo e controle da temperatura de fermentação. O permanente monitoramento microbiológico e o aperfeiçoamento de seus métodos permite o acompanhamento da qualidade do fermento e a detecção das leveduras selvagens, ou seja, a diferenciação entre a levedura do processo e a levedura contaminante (selvagem), que nem sempre é muito fácil. Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e quantificação de populações de leveduras contaminantes baseiam-se em características fisiológicas comuns às leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens do processo, iniciadoras da fermentação. Dentre essas, destacam-se as nutricionais (variações nas fontes de carbono, nitrogênio e nos fatores de crescimento) e resistência a certos compostos como antibióticos e corantes. Entretanto, um único meio não é totalmente satisfatório para a avaliação de todas 7

as leveduras presentes, sendo portanto necessário o emprego de vários tipos de meios quando se pretende detectar a maioria das leveduras presentes. Somente com um certo nível de conhecimento da flora e identificados os tipos predominantes, é possível propor métodos de controle eficientes e econômicos, ou ainda modificar os processos para impedir a reinfecção.

3. LEVEDURAS

Leveduras são microrganismos cujo crescimento dominante é na forma unicelular. A reprodução é assexuada por brotamento multilateral e polar ou por fissão, e sexuada por meio de ascósporos. As características morfológicas das leveduras determinadas por microscopia mostram formas esférica e ovóide, pera, cilíndrica e mesmo alongadas em pseudomicélio (Figura 2). Em geral, as células de leveduras são maiores do que as bactérias, mas as menores leveduras não são tão grandes como as maiores bactérias. Esses microrganismos variam consideravelmente, no que se refere às suas dimensões, com limites desde 1 a 5 µ de largura e 5 a 30 µ de comprimento. Cada espécie tem uma forma característica, mas, mesmo em culturas puras, há consideráveis variações de tamanho e de forma das células individuais, dependendo da idade e do ambiente. As leveduras não possuem flagelos ou outros órgãos de locomoção. Apresenta partes visíveis como parede celular, citoplasma, vacúolos, glóbulos de gordura, grânulos e núcleo (Figura 3).

8

Figura 2. Morfologia das células de leveduras (Saccharomyces cerevisiae). A, células brotantes; B, células dispostas em cachos; C, asco e ascósporos (esporos) característicos; D, pseudomicélio. Todas as fotos foram tiradas ao microscópio em aumento de 400X (As fotos C e D foram fornecidas por C.D.Tosta).

9

Figura 3. Esquema de uma célula de levedura.

4. BACTÉRIAS

Embora existam milhares de espécies bacterianas diferentes, os organismos isolados apresentam uma das três formas gerais: elipsoidal ou esférica, cilíndrica ou em bastonete e espiralada ou helicoidal (Figura 4). As bactérias medem aproximadamente 0,5 a 1,0 por 2,0 a 5,0 µ. O exame da célula bacteriana revela certas estruturas definidas por dentro e por fora da parede celular, esquematizadas na Figura 5. As estruturas externas à parede celular compreendem os flagelos, os pelos (fímbrias) e a cápsula. A parede celular é uma formação rígida que dá forma à célula. A rigidez pronunciada da parede celular pode ser facilmente demonstrada, submetendo-se bactérias de formas diferentes a condições físicas extremas, tais como pressões osmóticas muito elevadas ou muito baixas ou

10

Figura 4. A diversidade de bactérias. A, Pseudomonas aeruginosa, um bastonete flagelado; B, Streptococcus, células esféricas dispostas em cadeias; C, Spirillum volutans, célula espiralada; D, Chondromyces crocatus, as células em forma de bastonete movem-se juntas, formando uma estrutura que carrega os esporos; E, Chroococcus, uma cianobactéria na qual os indivíduos ficam aderidos numa cápsula gelatinosa (Retirado de Raven & Johnson, 1990). 11

Figura 5. Representação esquemática da organização estrutural de uma célula bacteriana (Retirado de Pelczar et al., 1980).

temperatura abaixo de zero seguidas de aquecimento; as células manterão sua forma original. As paredes celulares bacterianas parecem ser indispensáveis ao crescimento das bactérias e à sua divisão. Células cujas paredes foram removidas especificamente, isto é, protoplastos, são incapazes de efetuar divisões ou crescimento normais. Substâncias químicas interessantes são encontradas na parede celular das bactérias, como por exemplo, o ácido diaminopimélico (DPA), o ácido murâmico e o ácido teicóico. Essas substâncias são típicas das bactérias e de microrganismos que com ela se relacionam estreitamente. O componente da parede celular que determina a forma da bactéria é, em grande parte, o 12

peptoglicano, polímero insolúvel que é um constituinte de todas as paredes celulares bacterianas. A parede celular das células gram-negativas é quimicamente mais complexa. As paredes dos organismos gram-positivos possuem menor quantidade de aminoácidos, mas os ácidos teicóicos são característicos dessas células. O conteúdo lipídico das bactérias gram-negativas é consideravelmente maior do que o dos organismos gram-positivos (Figura 6). Imediatamente abaixo da parede celular existe uma fina membrana, ou cobertura, chamada membrana citoplasmática, às vezes também conhecida como membrana protoplasmática ou, simplesmente, membrana plasmática. As formações da membrana como as intrusões e extrusões, desempenham papel variado nos processos de metabolismo e de reprodução, envolvendo-se, por exemplo, na formação do septo durante o processo de divisão celular das bactérias. O material celular, contido dentro da membrana citoplasmática, constitui o citoplasma, onde podem ser identificados depósitos concentrados de certas substâncias, como volutina, ácido, entre outros. As células bacterianas não contém o núcleo típico das células de animais e vegetais superiores. Possuem, contudo, dentro do citoplasma “corpúsculos” que são encarados como estrutura nuclear, confinando o DNA da célula bacteriana a esta área. Não há evidência de uma membrana nuclear separando o núcleo do citoplasma, o que é característico das células eucarióticas. Algumas bactérias têm a capacidade de produzir um corpo oval de parede espessa (um por célula), que é uma célula altamente resistente. Essas formas resistentes são chamadas de endosporos, ou, mais comumente, esporos. São extremamente resistentes aos agentes físicos e químicos adversos.

13

Figura 6. As paredes celulares bacterianas e a coloração de Gram. A camada de peptoglicano é mais grossa nas bactérias gram-positivas, permitindo a retenção do corante cristal-violeta e corando-se assim de púrpura. As bactérias gram-negativas não retém esse corante e assim exibem a coloração vermelha do contracorante (safranina). Além disso, a concentração de lipídeos nas bactérias gram-negativas é maior que nas gram-positivas. (Retirado e adaptado de Raven & Johnson, 1990).

14

5. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA CONTROLE EM PROCESSOS INDUSTRIAIS DE PRODUÇÃO DE ÁLCOOL

5.1. Leveduras

5.1.1. Contagem direta e determinação da viabilidade celular em leveduras

Não existe um método absoluto para determinação da viabilidade celular de uma população de células de levedura. Para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou observação microscópica têm sido utilizados. Os métodos de contagem direta são rápidos e simples, exigem um mínimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a morfologia celular. Este aspecto é extremamente importante porque a tolerância da levedura ao seu produto de fermentação, o etanol, é bastante significante em relação à eficiência de produção de álcool em fermentações em escala industrial. Tem sido verificado também que a presença de álcoois superiores (n-butanol, isoamílico), ácidos graxos e seus ésteres mesmo em baixas concentrações, juntamente com o etanol, agem de maneira sinergística intoxicando a célula da levedura, levando-a à morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular. No controle da viabilidade celular nos processos de produção de levedura (fermento prensado) e fermentação alcoólica (álcool), a coloração das células da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento são os mais empregados. A técnica de coloração com azul de metileno consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) apresentar-se-ão coloridas de azul (Figura 7). A porcentagem ou o número de células viáveis é determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a câmara 15

de Neubauer. Trata-se de uma lâmina especial, precisamente dividida em quadrados de 1 mm2 de área (Figura 8); a lâmina é coberta com uma lamínula, que deixa um volume, sobre cada quadrado, de 10-4 cm3 ou 0,1 mm3 (equivalente a 1 mL).

Figura 7. Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno. As células coradas de azul são células mortas enquanto as incolores são células viáveis (A foto foi cedida por C.D. Tosta).

16

Figura 8. A Câmara de Neubauer. A. O círculo indica a área aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscópio (10X ocular e 10X objetiva) de uma câmara de contagem padrão. B. Aspecto de um

quadrado integrante do quadrado médio, mostrando que devem ser contadas as células que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado. 17

Procedimento

1- Fazer a diluição conveniente em um tubo de ensaio. 2- Após a diluição, transferir 0,3 mL para um tubo de ensaio e adicionar 0,3 mL da solução de azul de metileno-citrato de sódio. 3- Homogeneizar a mistura em agitador de tubos. 4- Colocar a lamínula na Câmara de Neubauer e com auxílio da pipeta Pasteur, transferir um pequeno volume da amostra preparada. 5- Levar ao microscópio óptico e com a objetiva de 40X, fazer a contagem das células nos campos : 5 campos na segunda coluna e 5 campos na quarta coluna (total de 10 campos), ou os 4 retículos centrais em cada um dos 25 campos (total de 100 retículos). Contar aproximadamente 40 células por campo ou 3 células por retículo. No primeiro caso, escolher 2 limites em cada quadrado nos quais serão desprezadas as células que forem encontradas em cima desses limites. Por exemplo, contar as células que estão nos limites superior e lateral esquerdo do quadrado e desprezar as do limite inferior e lateral direito. 6- Com o contador, marcar o número de células viáveis (células que não se colorem com azul de metileno) e células inviáveis (células coloridas de azul intenso).

Viabilidade (%)= (Número de células vivas / Número total de células) X 100 No. total de células/mL = no. células nos 10 campos X 2,5 X diluição X 104

ou No. total de células/mL = no. células nos 100 retículos X 4 X diluição X 104

18

5.1.2. Plaqueamento e diluição em série

A semeadura em placas ou plaqueamento revela o número de células de leveduras capazes de se multiplicarem e formarem colônias em meios de cultivo apropriados e sob condições de incubação adequadas. Cada colônia desenvolvida é suposta ter sido originada a partir de uma unidade viável, a qual pode ser um organismo ou muitos. Como para uma maior precisão da análise somente deverão ser contadas as placas com número de colônias entre 30 e 300, uma diluição da amostra deverá ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura (Figura 9).

Procedimento

1- Tomar 1 mL da amostra (suspensão de células) e transferir para um tubo de cultura com 9 mL de água ou solução salina esterilizada (diluição 1:10 ou 101

).

2- Homogeneizar em agitador de tubos. 3- Pipetar 1 mL da diluição anterior para outro tubo com 9 mL de água ou solução salina esterilizada e ter-se-á uma diluição 1:100 ou 10-2. Diluições maiores podem ser obtidas tomando-se 1 mL de cada diluição sucessiva e colocando em tubos com 9 mL de água ou solução salina, até se atingir a diluição desejada. 4- Fazer a semeadura em placas de Petri, pipetando 1 mL e adicionando-se o meio de cultivo adequado liquefeito e resfriado a uma temperatura de 45-46oC. Agitar a placa com movimentos horizontais para distribuir as células com uniformidade (plaqueamento em profundidade). Semear no mínimo 2 placas de cada diluição e escolher 3 diluições. 5- Incubar a 32oC por 24-48 horas.

19

Cálculo: número de colônias na placa X índice de diluição da amostra = número de bactérias/mL (Por exemplo, considerando-se que a placa que recebeu a diluição de 1/10.000 contém 32 colônias, pode-se estimar que existem 32 X 10.000 = 320.000 bactérias/mL da amostra ou 3,2 X 105

Figura 9. Contagem em placa e diluições seriadas. Na diluição seriada, o inóculo é diluído em uma série de tubos de diluição. No exemplo apresentado, cada tubo de diluição subseqüente conterá um décimo do número de bactérias presentes na anterior. Posteriormente, as amostras destes tubos serão transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura onde ocorrerá o crescimento das colônias e a contagem. O número de colônias será utilizado na determinação da quantidade de bactérias presentes na amostra original (Retirado de Tortora et al., 2003).

20

6- Alternativamente, pode-se inicialmente colocar o meio de cultura (WLN) nas placas de Petri, esperar a solididificação e a seguir, pipetar 0,1 mL espalhando o inóculo com alça de Drigalsky (plaqueamento em superfície). A Figura 10 mostra a metodologia utilizada para contagem em placas, comparando as técnicas de plaqueamento em superfície e em profundidade (´pour-plate´). Fazer a contagem de cada placa e para estimar o número de colônias, escolher as placas que apresentem de 30 a 300 colônias. Calcular a média das colônias das duas placas e multiplicar pelo fator de diluição para se obter o número de colônias. Se for utilizado o plaqueamento em superfície, multiplicar por 10. A Tabela 1 traz as regras para interpretar e reportar a contagem em placas.

5.1.3. Meios diferenciais / seletivos para detecção de leveduras selvagens

Embora a diferenciação entre a levedura alcoólica (processo) e a levedura contaminante (selvagem) não seja muito fácil, a presença desta pode ser detectada utilizando-se meios diferenciais/seletivos, isto é, o meio empregado deve permitir somente o desenvolvimento da levedura contaminante. Entretanto, um único meio não é totalmente satisfatório para a avaliação de todas as leveduras presentes, sendo portanto necessário o emprego de vários tipos de teste quando se pretende detectar, senão todas, mas a maioria das leveduras contaminantes presentes. De um modo geral, os meios seletivos ou diferenciais podem ser classificados em:

a- meios para detecção de leveduras contaminantes não Saccharomyces b- meios para detecção de leveduras contaminantes (selvagens)

Saccharomyces 21

Figura 10. Metodologia utilizada para a contagem de colônias em placa (Retirado de Tortora et al., 2003).

22

23

Os meios diferenciais (seletivos) para isolamento e quantificação de populações de leveduras contaminantes baseiam-se em características

fisiológicas comuns às leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens utilizadas em processos fermentativos para a produção de álcool. Dentre essas características, destacam-se as nutricionais (variações nas fontes de carbono, nitrogênio e nos fatores essenciais de crescimento) e resistência a certos compostos como antibióticos, corantes, etc. Vários são os meios propostos para a detecção de leveduras contaminantes, Saccharomyces ou não Saccharomyces, entretanto, todos apresentam variações, o que demonstra que para se conhecer melhor a presença de leveduras contaminantes durante o decorrer de uma safra, o uso de um só meio diferencial não será suficiente, principalmente quando se trata de leveduras contaminantes pertencentes ao gênero Saccharomyces. Como exemplo de meios seletivos (Figura 11), pode-se citar:

Meios

Saccharomyces cerevisiae

Outras

Não

Saccharomyces Saccharomyces (-) (+) (-) (+) (+) (+)

WLN + actidione (WLD) LWYN Meio de Lisina

(-) (-) (-)

Em trabalho realizado por Ceccato-Antonini & Silva (2000), concluiuse que os meios acima citados foram eficientes no isolamento de leveduras selvagens, embora o meio de Lisina tenha propiciado o isolamento de Saccharomyces e o meio LWYN, de outros gêneros, como não era esperado. A contagem de colônias nesse último meio mostrou-se difícil, devido ao grande número de microcolônias desenvolvidas, possivelmente resistentes à

concentração de cristal-violeta utilizada.

24

Figura 11. Meios seletivos/diferenciais para isolamento de leveduras selvagens. Aspecto das placas inoculadas com fermento em meio WLD, diluição 10-1 (A); WLN, diluição 10-7 (B); Lisina, diluição 10-1 (C) e LWYN, diluição 10-1 (D).

25

Procedimento

1- Coletar as amostras em frascos estéreis e mantê-las sob refrigeração até o processamento. 2- Os frascos das amostras serão homogeneizados por agitação cuidadosa, sendo transferidos 10 mL das amostras para tubos de centrífuga estéreis, assepticamente. 3- Centrifugar-se-á a 3000 rpm por 5 minutos, sendo os sobrenadantes

descartados, adicionando-se em seguida solução salina estéril para ressuspensão das células. 4As amostras serão novamente centrifugadas, desprezando-se os

sobrenadantes e ressuspendendo-se as células a um volume final de 10 mL com solução salina estéril. A partir da recomposição do volume inicial, as amostras serão submetidas a diluição em série. 5- Os plaqueamentos serão realizados em duplicata para duas diluições, de cada amostra, em cada um dos meios a serem analisados. WLN – diluições 10-7 e 10-8 WLD – plaqueamento direto e 10-1 Lisina Ágar – plaqueamento direto e 10-1 LWYN – plaqueamento direto e 10-1 6- Utilizar-se-á a técnica de espalhamento de 0,1 mL da suspensão de células em superfície e a incubação das placas a 28ºC por 72 horas, quando serão feitas as contagens das colônias.

5.2. Bactérias

5.2.1. Plaqueamento e diluição em série

Proceder como descrito no ítem 5.1.2., utilizando-se o meio Ágar Nutriente. 26

5.2.2. Coloração de Gram

A coloração de Gram é um método muito utilizado na identificação de bactérias. É um método de coloração diferencial que utiliza um corante primário (cristal violeta) e um contracorante (safranina). Após o uso do cristal violeta, segue-se a aplicação de uma solução de lugol, o qual é chamada de mordente, pois se combina com o corante para formar um composto colorido insolúvel. Após a descolorização com álcool, aplica-se o contracorante safranina. Os organismos que resistem à descolorização e retem o comlexo cristal-violeta apresentam cor púrpura e são chamadas Gram-positivas. Aquelas células que descolorizam e perdem o complexo cristal violeta-iodo, aceitam o corante safranina e ficam vermelhas. São as Gram-negativas. A maioria das células vivas, incluindo tecidos animais, são Gramnegativas. É a característica Gram-positiva que é distintiva. Algumas bactérias, leveduras e alguns fungos fillamentosos são Gram-positivos.

Procedimento

1- Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de vidro. 2- Com a alça de platina, retirar assepticamente uma pequena porção da cultura e emulsioná-la na gota, a fim de obter uma suspensão uniforme. Espalhar suficientemente para obter um esfregaço fino. Não esquecer de anotar na lâmina a procedência do esfregaço. 3- Secar a preparação ao ar ou na chama do bico de gás. 4- Fixar o esfregaço, passando a lâmina três vezes diretamente na chama. 5- Antes de corar, deixar que a lâmina esfrie completamente. 6- Para a coloração, seguir o procedimento da Figura 12.

27

Figura 12. Procedimento da coloração de Gram. 1- Um esfregaço de cocos e bacilos fixado com calor é primeiramente coberto com um corante púrpura básico (coloração primária) como a violeta-genciana ou cristal-violeta, e então o corante é lavado. 2- O esfregaço é coberto com iodo (um mordente) e lavado. Neste momento, ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas adquirem cor púrpura. 3- A lâmina é lavada com etanol ou uma solução de álcool-acetona (um descolorante) e então lavada com água. Agora, as células grampositivas estão púrpuras e as gram-negativas estão incolores. 4- Na etapa final, a safranina é adicionada como contracorante, e a lâmina é lavada, seca e examinada microscopicamente. As bactérias grampositivas retêm o corante púrpura, mesmo após a lavagem com álcool. As bactérias gram-negativas aparecem de cor rosada, pois adquirem o contracorante safranina (Retirado de Tortora et al., 2003).

28

7- Examinar ao microscópio com objetiva de imersão e determinar se as culturas são Gram-positivas (células coradas de roxo) ou Gram-negativas (células coradas de vermelho), Figura 13. Utilizar sempre um padrão de bactéria gramnegativa (por exemplo, Escherichia coli) e um padrão gram-positivo (por exemplo, Bacillus thuringiensis) para comparação com a bactéria-teste.

Figura 13. Microfotografia de bactérias coradas pelo Gram. O Staphylococcus aureus (púrpura) é gram-positivo, e a Escherichia coli (rosa) é gramnegativa (Retirado de Tortora et al., 2003).

29

6. Preparo de meios de cultivo e soluções

WL Nutrient Medium (WLN) – meio de cultivo para enumeração de leveduras totais -extrato de levedura ............................. -caseína hidrolisada ............................... -glicose.................................................... -fosfato monopotássico*.......................... -cloreto de potássio*................................ -cloreto de cálcio*.................................... -sulfato de magnésio*.............................. -cloreto férrico*........................................ -sulfato de manganês*............................. -verde de bromocresol............................ -ácido nalidíxico*..................................... -ágar ....................................................... -ampicilina*.............................................. -água destilada q.s.q. ............................. 0,4 g 0,5 g 5,0 g 55,0 mg 42,5 mg 12,5 mg 12,5 mg 0,25 g 0,25 g 2,2 mg 5,0 mg 2,0 g 5,0 mg 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco devem ser incorporados ao meio na forma de soluções previamente preparadas. Esse meio pode ser adquirido da Acumedia (referência 7488 A).

WL Differential Agar (WLD) – meio de cultivo para enumeração e isolamento de leveduras resistentes à cicloheximida. O meio WLD é obtido por adição do agente antifúngico cicloheximida, na forma de solução, ao meio WLN, para uma concentração final de 5 ppm.

30

Meio de lisina – meio de cultivo para isolamento de leveduras não pertencentes ao gênero Saccharomyces . -bacto yeast carbon base...................... -lisina...................................................... -ágar ....................................................... -ácido nalidíxico....................................... -ampicilina .............................................. -água destilada q.s.q. ............................. 1,17 mg 0,10 g 2,0 g 5,0 mg 5,0 mg 100 mL

Os antibióticos serão incorporados ao meio na forma de soluções.

Lin Wild Yeast Medium (LWYN) – meio de cultivo para enumeração e isolamento de leveduras selvagens do gênero Saccharomyces. -extrato de malte...................................... -extrato de levedura................................ -peptona.................................................. -glicose .................................................. -fosfato de potássio bibásico................... -cloreto de amônio .................................. -ágar ....................................................... -violeta cristal * ....................................... -mistura fucsina-sulfito ........................... -ácido nalidíxico * ................................... -ampicilina * ........................................... -água destilada q.s.q. ............................ 0,20 g 0,40 g 0,20 g 1,00 g 0,10 g 0,05 g 2,00 g 0,6 mg 0,01 g 5,0 mg 5,0 mg 100 mL

Os ingredientes assinalados com asterisco serão incorporados ao meio na forma de soluções. A mistura fucsina-sulfito é composta de 1 parte, em peso, de dextrina, 4 partes de fucsina básica e 25 partes de sulfito de sódio anidro.

31

Ágar Nutriente – meio de cultivo para isolamento e enumeração de bactérias -peptona…………………........................ -extrato de carne..................................... -cloreto de sódio...................................... -ágar........................................................ -água destilada q.s.q. ............................. 5g 3g 1g 20 g 1000 mL

Todos os meios de cultura serão esterilizados em autoclave a 120ºC por 20 minutos, a 1 atm.

Solução de azul de metileno-citrato de sódio -azul de metileno...................................... -citrato de sódio........................................ -água destilada q.s.q. ............................. 0,01 g 2g 100 mL

Dissolver o corante numa pequena porção de água, adicionar os outros ingredientes e completar o volume.

Solução salina -cloreto de sódio....................................... -água destilada q.s.p................................ 8,5 g 1000 mL

Cristal violeta (Gram) Solução A -cristal violeta........................................... -álcool a 95%........................................... Solução B -oxalato de amônio..... ............................. -água destilada......................................... Misturar as soluções A e B. 32 0,8g 80 mL 2g 20 mL

Lugol (Gram) -iodo....... …………………........................ -iodeto de potássio................................... -água destilada q.s.q. ............................. 1g 2g 300 mL

Dissolver o iodeto numa pequena porção de água, adicionar o iodo e completar o volume.

Safranina (Gram) -safranina em solução alcoólica a 2,5%. -água destilada q.s.q. ............................. 10 mL 100 mL

7. Bibliografia

CECCATO-ANTONINI, S.R. Guia prático de microbiologia. Araras: UFSCar, 1996. 58 p. (Apostila)

CECCATO-ANTONINI, S.R., SILVA, D.F.

Eficiência de meios diferenciais no

isolamento de cepas de leveduras de processos industriais de fermentação alcoólica. STAB, Piracicaba, v.18, n.4, p.40-46, 2000.

PELCZAR, M., REID, R., CHAN, E.C.S. Microbiologia. São Paulo: McGraw-Hill, 1980. 566p. vol.1 RAVEN, P.H., JOHNSON, G.B. Biology. Dubuque: WCB, 1990. 1310p.

TORTORA, G.J. FUNKE, B.R., CASE, C.L. Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2000. 827p.

33

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->