ANGGA ZAKHARIA

108114100

PEWARNAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN NEGATIF

A. Pewarnaan Bakteri Gram Positif

Organism yang dapat menahan kompleks pewarna primer gentian violet
sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram
positif.
Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri Gram positif menyusut oleh
perlakuan alcohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel
menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada langkah
pemucatan. Bila sel-sel gram positif diberi perlakuan dengan enzim lisozim untuk
menyingkirkan dinding sel setelah pewarnaan dengan kompleks UK-Y (ungu kristal
yodium), maka struktur yang dihasilkannya itu akan terwarnai oleh kompleks UK-Y.
namun, mereka tidak mudah dipucatkan oleh etanol. Semua ini merupakan bukti
bahwa dinding sel pada bakteri gram positif merupakan situs tempat zat warna ungu
Kristal tertahan.

B. Pewarnaan Bakteri Gram Negatif

Organism yang kehilangan kompleks warna ungu Kristal pada waktu
pembilasan dengan alcohol (sehingga bila diperiksa ternyata kosong) namun demikian
terwarnai oleh pewarna tandingan, fuchsin/safranin (sel-sel tampak merah muda),
disebut Gram negative.
Sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada
dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Larutnya
lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan Gram diduga memperbesar
pori-pori dinding sel sehingga proses pemucatan pada sel-sel Gram negative
berlangsung lebih cepat.
Dinding sel bakteri gram negative mengandung peptidoglikan jauh lebih
sedikit, dan peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang yang jauh kurang ektensif
dibandingkan dengan yang dijumpai pada dinding bakteri gram positif. Karenanya,
 maka pori-pori pada peptidoglikan bakteri gram negative tetap cukup besar sekalipun
setelah perlakuan etanol sehingga memungkinkan ekstraksi kompleks UK-Y (Ungu
Kristal Yodium). UK-Y terperangkap di dalam dinding, yang tampaknya mengurangi
diameter pori-pori pada peptidoglikan dinding sel.

C. Mekanisme Pewarnaan
Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal
violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru
pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat
senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang
oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna
merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil
warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru .

 Pembuatan Film
Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu
bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang
kurang jelas di bawah mikroskop.

 Cara membuat film:

1. Bersihkan gelas objek dengan kapas beralkohol untuk menghasilkan lemak dan
mikroba yang menempel, lalu keringkan di udara.

2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film dengan pensil
gelas.

3. Ambil satu ose suspense bakteri secara aseptic, yaitu dengan membakar ose di atas
lampu spiritus sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu tempelkan pada bagian
dalam dan tabung biakan sebelum mengambil suspense bakteri.

4. Buat film setipis mugnkin di atas gelas objek di dalam batasan lingkaran tadi.
 5. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film langsung di atas api secara cepat dua
sampai tiga kali. Maksudnya ialah untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak
mengalami perubahan bentuk. Di samping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada gelas
objek.

Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan

pengecatan.

 Pengecatan:

1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang sesuai, yaitu untuk
carbol fuchsin 15 – 20” (detik), carbol geantin violet 30 – 45”, dan methylene blue 3- 5‘
(menit).

2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol
semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai,

3. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelkan perlahan ke atas film yang
telah diwarnai. Jangan menggosok film tadi dengan kertas saring.

4. Tambahkan satu tetes minyak imersi

5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x)

6. Catat dan gambar morfologi bakteri.