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Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala

Introdução de crescimento, sob condições de tem-


peratura, luminosidade e fotoperíodo
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular A micropropagação é uma forma adequados.
batista@cenargen.embrapa.br vegetativa de propagação de diferentes Milhões de plantas são produzidas
Embrapa Recursos Genéticos e espécies de plantas por meio da técnica anualmente, em todo o mundo, por
Biotecnologia
denominada cultura de tecidos. Essa meio da micropropagação. Entretanto,
técnica requer laboratórios bem estru- esse método de multiplicação é alta-
turados e pessoal treinado. mente demandante de mão-de-obra e
Em resumo, o procedimento envol- só em condições especiais tal procedi-
ve os seguintes passos: inicialmente, é mento deve ser utilizado. Basicamente,
feita a escolha da planta matriz e do tipo a escolha da micropropagação frente a
de material a ser utilizado, tais como outras formas de propagação baseia-se
no valor venal da muda ou do produto
a ser obtido pela muda micropropaga-
da.
A metodologia tradicional de micro-
propagação baseia-se em cultivos em
pequenos frascos, com número reduzi-
do de plântulas por frasco, e uso de
meio nutritivo gelificado, o que acarreta
intensa manipulação das culturas, e en-
volve, com isso um grande contingente
de mão-de-obra especializada.
Biorreatores podem ser conceitua-
dos como equipamentos para cultivo
sob imersão temporária ou permanente
de células, gemas, embriões ou qual-
quer tipo de propágulo que possa ser
utilizado na micropropagação.
Os biorreatores utilizam meio de
cultura líquido, permitem a renovação
do ar durante o cultivo, bem como o
monitoramento de alguns parâmetros
essenciais ao crescimento do propágu-
lo, tais como pH, oxigênio dissolvido,
Figura 1. Sistema de biorreator gemas, segmentos nodais, folhas, flo- temperatura, concentração de íons, etc.
de imersão temporária, res, etc. Em seguida, o material é desin- Os primeiros biorreatores derivaram
desenvolvido pela Embrapa festado já em condições de laboratório dos equipamentos denominados fer-
Recursos Genéticos e em ambiente estéril, e introduzido em mentadores, os quais foram, há muitas
Biotecnologia, utilizando frascos igualmente estéreis, contendo décadas, desenvolvidos para cultivo de
tanque de ar comprimido meio de cultura esterilizado. Esse meio fungos e bactérias para fins industriais.
contém, todos os nutrientes necessários Assim, os primeiros biorreatores testa-
ao crescimento e desenvolvimento do dos para plantas continuaram sendo
material em cultivo, além de substâncias chamados de fermentadores, por serem
reguladoras de crescimento. Os frascos utilizados basicamente para o cultivo de
com o material são mantidos em salas células vegetais isoladas, de forma mui-

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mais comum a injeção de um fluxo de ar
a uma determinada pressão, combinada
com o movimento de uma hélice no
interior do frasco de cultivo (Takayama
& Akita, 1994). O ar que entra no
sistema é esterilizado ao ser forçado a
passar através de uma membrana com
poros de 0,22 a 0,44 micras de diâmetro.
O tamanho do frasco de cultivo
normalmente varia entre 1 e 20 litros,
embora volumes menores como 250 e
500 ml, ou maiores, 20 ou até mesmo 300
litros já tenham sido utilizados. Entre-
tanto, a maioria dos frascos utilizados
está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama
& Akita, 1994).

Principais tipos de biorreatores


Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares de utilizados para cultivo de hastes
frascos, utilizando bomba compressora de ar caulinares e embrião

Vários tipos de biorreatores têm sido


to parecida com o que era feito com os embriões somáticos, além da germina- desenvolvidos e utilizados ou têm po-
fungos e bactérias. ção das sementes sintéticas. tencial de uso em cultivo de gemas,
Inicialmente, os fermentadores fo- embriões e plantas. Esses biorreatores
ram empregados com pouca ou nenhu- Constituição básica são classificados pelo tipo de agitação e
ma modificação para o cultivo de célu- dos biorreatores construção do frasco (Takayama & Aki-
las vegetais. Para isso, pequenos ajustes ta, 1994).
foram feitos na taxa de renovação do ar A constituição dos biorreatores usa-
e nas formas de agitação das células. dos para cultura de embrião, gemas e Biorreatores tipo
Biorreatores para cultivo de células ve- hastes caulinares para fins de micropro- aerador agitador
getais foram bastante estudados, princi- pagação é fundamentalmente a mesma (“aeration agitation
palmente na década de 80, e uma série dos equipamentos utilizados para culti- bioreactor”)
de modelos específicos para plantas vo de fungos, bactérias e células vege-
foram desenvolvidos. tais (Takayama & Akita, 1994). Esse tipo de biorreator é o mais
Recentemente, os biorreatores co- Basicamente, os biorreatores tradici- parecido com os fermentadores con-
meçaram a ser utilizados para cultivo de onais apresentam os seguintes compo- vencionais. A agitação é basicamente
células, tecidos, gemas e plântulas, ten- nentes: frasco de cultivo, motor elétrico feita por meio de hélices conectadas a
do como objetivo final a produção de conectado a um eixo que se estende até um eixo giratório. É basicamente utiliza-
mudas em larga escala. o interior do frasco, bomba compresso- do para células e embriões somáticos
O primeiro relato sobre o uso de ra de ar, sensores de temperatura, pH e (Kessel & Carr ,1972; Preil et al., 1988). A
biorreatores para propagação vegetal oxigênio (Takayama & Akita, 1994). grande desvantagem desse modelo de
foi primeiramente feito por Takayama e O frasco de cultura é desenhado de biorreator é que, para haver uma boa
Misawa (1981) para micropropagação tal forma a permitir uma ótima aeração homogeneização do meio, é necessário
de begônia. Nesse caso, os autores do meio de cultura, bem como uma que a hélice gire em velocidades sufici-
utilizaram segmentos nodais de plântu- homogeneização satisfatória com um entemente elevadas, o que, regra geral,
las estabelecidas in vitro, seguindo pro- mínimo de dano mecânico do material causa dano mecânico acentuado ao
tocolos de cultivos convencionais em em cultivo. Os frascos podem ser feitos material em cultivo, principalmente em
meio gelificado. Procedimentos simila- de vidro, aço inoxidável, policarbonato, hastes e gemas.
res foram adaptados para uma série de polipropileno ou qualquer outro materi-
outras espécies vegetais (Noriega & al que suporte a autoclavagem a uma Biorreator tipo tambor rotató-
Söndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994). temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 rio (“roller drum bioreactor”)
Os biorreatores são aplicados igual- minutos. Freqüentemente, o frasco de
mente à produção de embriões somáti- cultivo apresenta um envoltório metáli- Nesse tipo de biorreator, o frasco de
cos (Tautorus et al., 1992; Denchev et co em forma de jaqueta, por onde cultivo gira suavemente em movimen-
al., 1992 e sementes sintéticas (Attree et circula água com temperatura pre-de- tos rotacionais sobre dois eixos, que
al., 1994; Onishi et al., 1994). Essa meto- terminada, para controle da temperatu- servem não apenas de apoio, mas que
dologia exige completo domínio sobre ra de cultivo (Takayama & Akita, 1994). também são responsáveis por imprimir
o processo de indução e seleção de A homogeneização do meio de cul- ao frasco de cultivo o movimento rota-
calos embriogênicos, bem como da di- tura e a aeração do material em cultivo tório. Nesse tipo de biorreator, o dano
ferenciação e encapslulamento dos são feitos de diversas formas, sendo a mecânico é mínimo e é adequado ao

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biorreator apresenta excelentes resulta-
dos no cultivo de células, tecidos e
órgãos porque não há dano mecânico
nem agitação via borbulhamento. O
inconveniente desse modelo é a não
renovação do ar interno do frasco de
cultivo, o que pode ser contornado com
a inclusão de um sistema de aeração via
injeção de ar estéril.

Biorretor de aeração por


membrana porosa ao oxigênio
(“oxygen permeable
membrane aerator
bioreactor”)

O frasco de cultura desse tipo de


biorreator contém uma canalização fina
em forma de espiral feita de material
Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com células embriogênicas poroso ao oxigênio, que pode ser de
de café em cultivo teflon, silicone, policarbonato ou poli-
propileno, através do qual o oxigênio
cultivo de embriões e plantas. Entretan- de biorreatores apresentam bons resul- passa para o meio de cultura. Esse
to, o nível de oxigenação só é adequado tados no cultivo de hastes caulinares, modelo de biorreator não apresenta
quando se utilizam meios de cultura bulbos, cormos e tubérculos (Takayama problemas relacionados com o dano
com alta viscosidade (Tanaka et al., & Misawa, 1981; Takayama et al, 1991). mecânico, uma vez que não há nenhum
1983). Esse modelo de biorreator foi desenvol- tipo de agitação, entretanto, a homoge-
vido e utilizado primeiramente na mi- neização do meio de cultura fica preju-
Biorreator tipo filtro rotatório cropropagacão, por Takayama & Misa- dicada (Luttman et al, 1994).
(“spin filter biorreactor”) wa (1981).
Biorreator do tipo
Biorreator de filtro rotatório apre- Biorreator do tipo sobre-aeração
senta um filtro conectado a um eixo levantamento de ar (“overlay aeration bioreactor”)
central, por onde o meio de cultura é (“air lift bioreactor”)
descarregado (Styer, 1985). Esse ele- Nesse modelo, a aeração é feita por
mento é responsável igualmente pela O meio de cultura nesse tipo de sopramento do ar estéril sobre o meio de
homogeneização, bem como pela aera- biorreator é movido de baixo para cima cultura. Eventualmente, esse tipo de
ção do material em cultivo. Esse tipo de dentro de um tubo situado verticalmen- aeração pode ser combinado com agita-
biorreator funciona satisfatoriamente te no interior do frasco pelas bolhas de ção suave do meio (Ishibashi et al.,
bem para propagação via embriogênese ar produzidas no fundo do frasco de 1987). Esse modelo apresenta deficiên-
somática (Wheat et al., 1986). cultivo. Esse modelo apresenta bons cia na aeração, o que pode comprome-
resultados, uma vez que há uma boa ter o crescimento, sobretudo, de células
Biorreator tipo borbulhamento aeração e homogeneização do meio de e tecidos.
(“air driven bioreactor”) cultura e pouco dano mecânico ao
material em cultivo (Park et al, 1989). A Biorreator de
O biorreator tipo borbulhamento única diferença desse biorreator para o imersão temporária
apresenta uma constituição muito sim- modelo anterior é que o borbulhamento
ples. A homogeneização do meio, bem de ar é feito dentro de um tubo centra- Em todos os modelos descritos ante-
como a aeração são feitos via borbulha- lizado no frasco de cultivo. riormente, com exceção daquele que
mento de ar no fundo do frasco. Pode utiliza um sistema de pulverização do
ser de dois tipos: aeração simples ou Biorreator do tipo fase gasosa meio, o material em cultivo permanece
coluna de bolha. (“gaseous phase bioreactor”) imerso continuamente no meio de cul-
tura. Essa imersão contínua causa pro-
Biorreator de aeração Esse modelo é equipado com um blemas de hiperhidratação dos tecidos,
simples e coluna de bolha suporte perfurado sobre o qual o mate- órgãos e plântulas. Dependendo da es-
(“bubble column bioreactor”) rial em cultivo é posicionado. O meio de pécie e do tipo de meio utilizado, a
cultura, pulverizado sobre o material em hiperhidratação dos tecidos pode cau-
A relação altura/diâmetro de 1 a 2 cultivo é, em seguida, drenado pela base sar distúrbios fisiológicos sérios, que
define o biorreator de aeração simples e de suporte e novamente bombeado e irão afetar o crescimento e desenvolvi-
se a relação é 3 ou acima, o biorreator é pulverizado a intervalos preestabeleci- mento do material em cultivo.
do tipo coluna de bolha. Esses modelos dos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de Visando a eliminar ou a minimizar

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nar esse problema, delinearam e cons-
truíram um equipamento que foi deno-
minado “auxophyton”, o qual movi-
mentava os frascos de cultura de forma
rotacional sobre uma roda, de tal forma
que, em determinado momento, os seg-
mentos de raiz eram expostos ao ar e, no
momento seguinte, submersos no meio
líquido, conseguindo, com isso, um
aumento da matéria fresca de 38,1 mg
em meio gelificado para 98,6 mg em
meio líquido, no “auxophyton”.
Posteriormente, um equipamento
desenvolvido por Harris & Mason (1983),
para cultivo de explantes de uva em
meio líquido em frascos tipo Erlen-
meyer, apresentava o mesmo princípio
Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imersão relatado por Steward et al. (1952). Nesse
temporária, em meio de multiplicação equipamento, o frasco tipo Erlenmeyer
era mudado automaticamente de posi-
esse problema, foi desenvolvido um meio em contato com o material em ção a intervalos predeterminados, de tal
modelo de biorreator chamado de imer- cultivo. O ar é expelido através de um forma que, em certa posição, o explante
são temporária (Alvard et al., 1993). orifício na tampa do compartimento se encontrava submerso e, em outra
Nesse tipo de biorreator, o meio de superior. Após um período preestabele- posição, não submerso. O estoque inici-
cultura permanece em contato com o cido, a pressão do ar no compartimento al de explantes era obtido através do
explante por um período predetermina- inferior é aliviada, o que, por gravidade, cultivo, por 28 dias, em meio gelificado
do. Em seguida, o meio é drenado e o faz com que o meio retorne ao compar- com agar. Após 90 dias de cultivo no
explante deixa de ficar em contato timento inferior, permanecendo aí até meio de imersão temporária, a produção
direto com o meio de cultura. que o ciclo recomece. de brotos foi sete vezes superior ao
O modelo desenvolvido por Alvard O modelo desenvolvido por Alvard rendimento obtido pelo mesmo período
et al. (1993) é constituído de um frasco
et al. (1993) foi modificado no que se em meio com agar.
de dois compartimentos, um superior e refere à construção, mas mantendo as Em 1985, Tisserat & Vandercook
um inferior, conectados entre si por ummesmas características de funcionamen- desenvolveram um sistema de cultivo
tubo. O meio de cultura é colocado no to, dando origem ao sistema de biorre- em imersão temporária, que consistia de
ator denominado RITA® (Teisson et al.,
compartimento inferior e o material a ser uma grande câmara de cultura, a qual
1995).
cultivado, no superior. O meio de cultu- era periodicamente cheia de meio de
ra passa do compartimento inferior para O sistema RITA® vem sendo utiliza- cultura. Embora o controle da troca
do para uma série de espécies vegetais,
o superior pela injeção de ar no compar- gasosa fosse insatisfatório, esse método
timento inferior. Quando todo o meio com diferentes tipos de explantes, apre- de cultivo por imersão temporária mos-
passa para o compartimento superior, sentando resultados muito bons (Alvard trou ser muito superior aos cultivos em
ocorre borbulhamento e aeração do et al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne meios gelificados.
et al., 1997; Cabasson et al., Atken-Christie & Jones (1987) utili-
1997; Etienne et al., 1999). zaram igualmente um sistema de cultivo
Na realidade, o princí- em imersão temporária na propagação
pio da imersão temporária de Pinus. Nesse sistema, o meio nutriti-
para cultivo de fragmentos vo líquido era colocado sobre o meio
vegetais relativamente gran- sólido sobre o qual estavam os explan-
des foi primeiramente des- tes. O meio permanecia em contato com
crito por Steward et al. o explante por 4 a 6 horas. Após esse
(1952) e relatado por Harris período, o meio era retirado através de
& Mason (1983). Segundo uma bomba de vácuo. Esse procedi-
Harris & Mason (1983), mento era repetido a cada semana.
Steward et al. (1952) de- Pouco tempo depois, Aitken-Chistie
monstraram que raízes de & Davies (1988) desenvolveram um sis-
cenoura imersos em meio tema semi-automático de cultivo sob
líquido não apresentavam imersão temporária, no qual plântulas
crescimento satisfatório e eram cultivadas em um grande recipien-
concluíram que o motivo se te com meio gelificado, com adição e
Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, após a tratava de deficiência de remoção automática e periódica do meio
multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de líquido.
imersão temporária, prontas para serem cultura. Visando a contor- Simonton et al. (1991) desenvolve-
aclimatadas
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c) o sistema foi desenhado para com-
portar diferentes números de fras-
cos de cultivo, o que é determina-
do pela extensão das tubulações,
bem como pela potência do com-
pressor ou da fonte de ar compri-
mido;

d) o equipamento pode ser montado


em diferentes ambientes de inten-
sidade de luz, fotoperíodo e tem-
peratura;

e) o equipamento pode ser utilizado


para cultivo em regime de imersão
temporária ou contínua.

f) no regime de imersão contínua, o


equipamento pode funcionar sob
regime de borbulhamento contí-
Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas em nuo com diferentes fluxos de ar ou
biorreator de imersão temporária sob borbulhamento temporário,
cujo período pode ser definido
ram um equipamento automático de ex., transformação de um modelo de pelo temporizador. Para isso, são
micropropagação, no qual o meio líqui- imersão contínua para imersão tempo- necessários pequenos ajustes no
do era injetado sobre as plântulas em rária e vice-versa; equipamento;
cultivo, de acordo com um esquema de c) de difícil manipulação durante as
tempo preestabelecido. Embora esse sis- fases de esterilização, carga, descarga e g) o equipamento permite fazer, ain-
tema tenha apresentado uma excelente troca do meio de cultura. da, uso de uma fonte de ar artificial
performance quanto ao preciso contro- Por sua vez, os modelos de imersão com dosagens específicas de oxi-
le da exposição do explante ao meio de temporária são mais simples na sua gênio, nitrogênio e gás carbônico;
cultura, alguns problemas foram identi- concepção, montagem e funcionamen-
ficados, como o uso de um frasco rela- to. h) o equipamento pode ser utilizado
tivamente grande, de difícil manuseio, tanto para cultivo de células e
além de alguns problemas de contami- Sistema de Biorreator embriões, quanto para gemas e
nação especialmente do tipo bacteria- desenvolvido pela Embrapa segmentos nodais e raiz.
na.
Uma modificação mais recente do A Embrapa-Recursos Genéticos e Nos primeiros ensaios, o sistema foi
modelo de biorreator de imersão tem- Biotecnologia desenvolveu e subme- testado para cultivo de microestacas de
porária foi feito por Lorenzo et al. (1998) teu ao INPI, para fins de patenteamen- batata para microtuberização e hastes
para micropropagação de gemas de to um sistema de biorreator tomando de abacaxi visando à multibrotação e
cana-de-açúcar e Escalona et al. (1999) como base o modelo desenvolvido por ao alongamento das mudas, sob regi-
para gemas de abacaxi. Esse sistema Alvard et al., (1993) e Lorenzo et al. me de imersão temporária. Em ambos
utiliza dois frascos, sendo um para culti- (1998), que permite uma grande versa- os casos, os resultados preliminares
vo do material vegetal e outro para tilidade de uso. O equipamento apre- foram excelentes. No momento, estão
estocagem do meio de cultura. O meio senta as seguintes características não em andamento testes definitivos com
de cultura é transferido de um frasco encontradas em outros modelos de hastes de abacaxi, em experimentos de
para o outro por meio de um vácuo de biorreatores: multiplicação para fins de comparação
250 mm de Hg. Entretanto, não foram a) o equipamento pode utilizar dife- com o cultivo em meio líquido estaci-
apresentados detalhes adicionais da rentes tipos de frascos, os quais onário e em meio gelificado. Estão
construção e funcionamento desse tipo podem variar em tamanho, forma- igualmente em andamento os primei-
de biorreator. to, constituição, tipo de tampa, ros testes de cultivo de células embrio-
Os modelos de biorreatores de imer- transparência, etc.; gênicas de café.
são contínua encontrados na literatura Por ser um equipamento recém-
científica, em termos gerais, são equipa- b) a montagem é simples e os com- desenvolvido, várias modificações es-
mentos: ponentes (válvulas solenóides, tem- tão sendo introduzidas no sistema,
a) complexos, do ponto de vista de porizadores, fonte de ar comprimi- como novos e mais adequados tipos de
montagem e funcionamento; do, filtros de ar, fluxômetro, cone- frascos e tampas e novos sistemas de
b) destinam-se apenas ao cultivo sob xões metálicas, mangueiras de sili- iluminação com vistas a ajustá-lo para
condições de imersão contínua, não cone, etc.) podem ser de fácil aqui- cultivo de explantes específicos, como
permitindo versatilidade no seu uso, por sição ou feitura; células e gemas, além de propiciar uma

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