A.

Kuantifikasi antigen dan antibodi Metode imunologik untuk mengukur kadar antigen dengan menggunakan antibodi monoklonal menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas yang cukup tinggi; sehingga digunakan sebagai metode standard dalam penerapan di klinik maupun dalam riset: Hampir semua metode imunokimia yang digunakan didasarkan atas adanya antigen atau antibodi . yang kadarnya dapat diukur dengan menggunakan suatu indikator yang dilekatkan pada antigen atau antibodi spesifik (labelling). Bergantung pada molekul indikator yang digunakan, dikenal berbagai teknik, misalnya teknik radioimmunoassay (RIA) bila indikator yang digunakan adalah radioisotop, dan enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) bila indikator yang digunakan adalah enzim.l Walaupun demikian; metode lain yang lebih sederhana misalnya

imunopresipitasi atau aglutinasi masih tetap digunakan walaupun metode ini kurang sensitif. a. Imunopresipitasi Teknik imunopresigitasi merupakan salah, satu cara yang masih banyak dipakai untuk menganalisis atau mengukur kadar antigen atau antibodi. Antibodi yang direaksikan dengan antigen spesifik. membentuk kompleks yang tidak larut (presipitat) yang dapat -dianalisis dengan berbagai cara. Reaksi presipitasi dapat dilangsungkan dalam media cair maupun media semisolid (gel). Dalam menerapkan teknik ini perlu dipertimliangkan beberapa keterbatasan. Hal yang paling menentukan adalah spesifisitas antiserum atau antibodi yang digunakan, dan larutan standard yang stabil dengan kadar yang pasti. Di samping itu ieaksi imunopresipitasi dipengaruhi oleh berbagai faktor, di antaranya aviditas antibodi. Aviditas antibodi menentukan deritjat stabilitas kompleks antigen-antibodi pada tempat pengikatan (antigen binding site). Kompleks antigen-antibodi yang terbentuk cenderung berdisosiasi bila antibodi mempunyai aviditas yang lemah, sebaliknya makin tinggi aviditas antibodi makin stabil kompleks yang terbentuk: Selain itu masih ada faktor-faktor lain yang b'erpengaruh misalnya stihu, pH dan molaritas larutan yang dipakai, dan yang tidak boleh diabaikan adalah perbandingan antara konsentrasi antigen dengan antibodi dalam reaksi.

b. Radioimmunoassay Bermacam-macam modifikasi teknik radioimmunoassay (RIA) telah dikembangkan untuk menyederhanakan dan memudahkan penggunaannya serta meningkatkan sensitivitas maupun spesifisitas. Dalam garis besar ada 2 macam metode; yaitu metode yang berdasarkan

nitroselulose. teknik non-kompetitif dengan cara meiekatkan . pada teknik ELISA harus ada antibodi atau antigen yang dikonjugasilCan dengan enzim dan substrat yang sesuai. dapat . yang dilabel 12 5 .menggunakan spektrofotometer biasa dan. Ertzyme linked -immunosorbent assay (ELISA) Prinsip teknik ELISA sama dengan teknik RIA. 1(Ag*) dengan antibodi (Ab) spesifik. Banyaknya Ab* yang terikat -merupakan ukuran untuk kadar Ag dalam spesimen: Teknik ini disebut teknik sandwich dan merupakan teknik yang banyak digunakan. kemudian kompleks Ab-Ag-Ab* dipisahkan dan diukur radioaktivitasnya. Apabila yang diuji adalah antigen. reagen mempunyai half life yang lebih panjang dibanding reagen RIA. ada juga.seolah-olah ditangkap oleh matriks yang dilapisi Ab. karena antigen dalam spesimen . untuk mengikat Ab membentuk kompleks Ag*-AbAg. Apabila kadar Ag* sebelum reaksi diketahui. c. mudah dilakukan automatisasi.adalah tidak mengandung bahaya radioaktif. Ag atau Ab pada suatu partikel kemudian tnereaksikannya dengan spesimen yang diuji. agarose.g Seperti halnya pada teknik RIA. Fase solid . diantaranya plastik. Enzim yang paling disukai . Di samping teknik kompetitif. maka sisa Ag* yang tidak bereaksi atau yang terikat pada kompleks dapat diukur radioaktivitasnya : dan hasilnya merupakan parameter kadar Ag dalam spesimen. yaitu mereaksikan antigen (Ag) yang tidak dilabel dan terdapat dalam spesimen.yang dapat digunakan bermacam-macam.reaksi antigen-antibodi dalam larutan (liquid phase) dan yang berdasarkan .atau partikel. Suatu modifikasi teknik sandwich adalah setelah spesimen direaksikan dengan partikel berlapis Ab. dan yang. kemudian direaksikan dengan spesimen: Setelah'itu ditambahkan Ab berlabel l"I (Ab*). Pada umumnya teknik RIA dalam iarutan menggunakan prinsip kompetitif. sehingga Ag berlabel (Ag*) dan Ag dalam spesimen akan berkompetisi. Kelebihan teknik ELISA adalah: cukup sensitif. baru kemudian dibubuhkan anti-Ig universal yang berlabel 1251. polyacrylamida dan dekstran. gelas.pada apa yang ingin diuji. ditambahkan Ab spesifik yang tidak berlabel. hanya saja pada teknik ELISA indikator (label) yang digunakan adalah enzim dan bukan radio-isotop. maka partikel dilapisi dengan Ab spesifik. -pada teknik ELISA juga dikenal metode kompetitif dan non-kompetiti£ Apabila: Ab digunakan untuk melapisi partikel maka metode ini sering disebut capture. bersama Ag.paling penting. Bergantung. reaksi antigenantibodi pada benda padat atau partikel (solid phase).

Enzim-enziiri ini mengiris-iris dsDNA hanya pada posisi sekuen nukleotidi} . DNA tersebut harus diiris-. mensintesis gen sesuai yang diinginkan. B. Untuk keperluan ini DNA yang terdapat dalam sel diisolasi atau diekstraksi terlebih dahulu.untuk digunakan adalah fosfatase alkali (AP) dan horseradish peroxidase (HRP) sedangkan substrat yang paling sering digunakan adalah o-phenylenediamine (OPD). ANALISIS STRUKTUR DAN EKSPRESI GEN Banyak kemajuan dalam imunologi dalam beberapa tahun terakhir dicapai bcrkat kemajuan teknologi yang mampu mengidentifikasi karakteri$tik struktur dan ekspresi gen. yaitu menyisipkan fragmen DNA tertentu pada plasmid bakteri yang kemudian dibiakkan untuk memperoleh fragmen DNA spesifik dalam jumlah besar yang akan digunakan sebagai probe. Southern blotting Sejak ditemukannya teknik Southern blot oleh Edwin Southern. sehingga apabila bagian . Kedua untaian tunggal DNA yang komplementer akan membentuk hibrid DNA untaian ganda (dsDNA) yang berlabel dan dapat diidentifikasi dengan autoradiografi. Perkemhangan teknik ini didasarkan atas spesifisitas pasangan basa (base pair) atau DNA komplementer serta penemuan enzim-enzim khusus pada bakteri (restriction enzymes) yang dapat mengiris molekul DNA pada bagian-bagian tertentu. teknik ini telah banyak digunakan untuk berbagai macam test dalam biologi molekuler. Penemuan teknik ini menghasilkan perkembangan teknologi lain yang disebut teknologi cloning. dan merekayasa gen dalam sel atau hewan percobaan.tertentu saja yang perlu dianalisis. sDNA)) yang diperoleh dengan cara denaturasi. Pada umumnya teknik ini digunakan untuk menentukan karakterisdk susunan DNA pada gen tertentu. DNA yang diekstraksi hiasanya sangat panjang dan terdiri atas banyak segmen. demikian pula DNA sasaran merupakan sDNA. dan tetramethylbenzidine (MM). a. yang digunakan untuk mengidentifikasi sekuen basa komplementer: Probe ini merupakan untaian tunggal DNA (single stranded. Probe DNA adalah fragmen DNA berlabel yang ukurannya mulai dari 'beberapa puluh pasang basa hingga beberapa kilobasa.iris (digested) terlebih dahulu menjadi fragmen-fragmen DNA dengan menggunakan enzim restriction endonuclease.

Northern blotting' Elektroforesis asam nukleat. Fragmen DNA tersebut disebut restriction sites dan setiap situs dikenal secara unik oleh enzim restriction endoncsclease tertentu. Posisi mRNA tertentu . blotting dan hibridisasi dengan probe DNA juga dapat diterapkan . Pengikatan probe RNA berlabel pada mRNA menghasilkan dsRNA yang tidak dapat dipotongpotong oleh RNAse. sehingga untuk keperluan klinik harus ditentukan terlebih dahulu. yang. Setelah RNA untaian tunggal dan probe RNA yang tidak terikat dipotong-potong oleh RNAse. mengindikasikan berat molekul mRNA. tetapi yang perlu diperhatikari adalah: a) digesti DNA harus lengkap. untuk menganalisis molekul mRNA. Posisi pengikatan probe. Karena mRNA yang diekstraksi dari sel sudah berupa untaian tunggal (single strands). dan panjangnya pengikatan probe berkorelasi den. Cara yang lebih sensitif untuk deteksi mRNA yang ditranskripsikan dari gen tertentu adalah RNAse b. a. maka mRNA dapat langsung dielektroforesis. RNAse dibubuhkan--pada'campuran RNA untuk memotong-motong untaian tunggal RNA. dsRNA yang berlabel dipisahkan dengan PAGE dan dianalisis dengan cara autoradiografi. Probe RNA berlabel ini mempunyai panjang tertentu dan komplementer terhadap sebagian sekuen gen yang dianalisis. karena digesti yang tidak lerigkap akan menghasilkan fragmen yang tidak sesuai dengan yang diharapkan dan mengakibatkari salah interpretasi. RNA sel dihibridisasi dengan probe RNA berlabel dalam jumlah berlebihan.panjangnya 6tip.gan banyaknya mRNA yang terdapat dalam sel. protection assay. Fragmenfragmen kontcol digunakan sebagai pembanding untuk pola fragmen-fragmerr yang dihasilkan pada test. Pada teknik ini. enzim mana yang diperlukan untuk memperoleh fragmen tertentu yang diinginkan. Prosedur mengiris-iris (digestion) DNA bermacam-macam.simetrik tertentu. b) menggdnakan kontrol positifr yaitu untaian DNA yang setelah didigesti'menghasilkan fragmen-fragmen tertentu yang susunannya telah d'iketahui. tetapi kondisi elektroforesis harus demikian rupa hingga hibridisasi internal dapat dicegah.l Enzim yang berbeda akan menghasilkan fragmen DNA yang berbeda.

-Teknik PCR memungkinkan untuk memperbanyak beberapa fragmen dari gen sekaligus yang diduga. c. setiap test selalu harus disertai. Kelemahan teknik ini adalah bahwa harus ada primer spesifik untuk setiap ujung segmen DNA sasaran yang akan di-amplifikasi.terbalik (reverse trancription) RNA menjadi cDNA dengan menggunakan enzim . sedangkan bila panjang sekuen DNA itu lebih dari 1000 basa efisiensi reaksi berkurang drastis. Untuk memperbanyak DNA spesifik diperlukan: template DNA untaian tunggal (ssDNA). dapat diidentifikasi dan diukur beberapa jenis mRNA sekaligus dalam satu sampel. Seperti disebut di atas. teknik PCR juga dapat digunakan untuk menganalisis mRNA. Template DNA untaian tunggal dapat diperoleh dengan cara denaturasi dsDNA yang mengurai dsDNA menjadi ssDNA.dapat digunakan sebagai template untuk membuat copy. Primer-primer inilah yang menentukan segmen mana yang akan mengalami siklus berulang-ulang agar jumlahnya berlipat ganda.sensitivitas metode ini sangat tinggi. Primer yang terdiri atas untaian tunggal DNA akan bergabung dengan untaian tunggai DNA template. misalnya beberapa jenis sitokin yang diproduksi oleh satu populasi sel Th dapat diidentifikasi dalam satu RNAse protection assay. Dengan menggunakan beberapa jenis probe RNA yang masingmasing komplementer terhadap sekuen=sekuen yang dianalisis. tetapi karena RNA tidak. menunjukkan kelainan. dan sintesis DNA selanjutnya dilakukan dengan bantuan enzim polimerase.pada gel ditentukan oleh panjang probe RNA dan intensitas pita dsRNA sesuai dengan banyaknya mRNA dalam sampel. kontrol untuk menghindarkan salah interpretasi . tetapi perlu diingat bahwa amplifikasi DNA dengan PCR baru memberikan hasil paling vbaik bila dilakukan untuk sekuen DNA dihawah 1000 basa. dan karena. ssDNA yang terjadi dapat bergabung dengan primer. Polymerase chain reaction Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu cara sederhana dan cepat untuk membuat multiple copies atau memperbanyak sekuen DNA spesifik yang diinginkan dengan meniru replikasi DNA in vivo.akibat kontaminasi dengan DNA eksogen. terlebih dahulu perlu dilakukan transkripsi.24'2s Selain untuk mendeteksi segmen DNA tertentu. untaian tunggal DNA diperoleh dengan denaturasi dsDNA dan setelah iienaturasi. Selain itu diperlukan dua primer oligonukleotida yang komplementer terhadap sekuen yang mengapit (terletak pada kedua ujung) fragmen DNA spesifik yang akan di-copy.

Gabungan kedua teknik disebut RT-PCR. baru kemudian dilakukan amplifikasi PCR. . .reverse transcriptase yang akan membuat cDNA dari mRNA bersangkutan. SUMBER: Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Labolatorium Edisi Keempat Kedokteran Universitas Indonesia oleh Siti Boedina Kresno.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful