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GUÍA DE PRÁCTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA ESPECIALIDAD: LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

INMUNOLOGIA I

Autor: Lic. CARLOS ALBERTO BALTODANO HONORES

AGRADECIMIENTOS: William Cornejo Medina Pilar Alva Betalleluz Víctor Raúl Arrunátegui Correa

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Rev. Junio 2007

INTRODUCCIÓN Los animales superiores son atacados por microorganismos y partículas extrañas. Pero poseen sistemas defensivos frente a tales patógenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo extraño La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a estos agentes externos extraños. Se adquiere al nacer, y va madurando y consolidándose durante los primeros años de vida. La Inmunología es la ciencia biológica que estudia todos los mecanismos fisiológicos de defensa de la integridad biológica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificación de lo extraño y su destrucción. La inmunología también estudia los factores inespecíficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales. La respuesta inmune frente a los agentes extraños es la actuación integrada de un gran número de mecanismos heterogéneos de defensa contra sustancias y agentes extraños. En general, a las sustancias extrañas se las denomina como antígenos, y son ellos los que desencadenan en el organismo una serie de eventos celulares que provocan la producción\n de los mecanismos de defensa. Como veremos, los mecanismos de respuesta tienen una componente celular y otra molecular. Por lo mencionado, un alumno debe de ser capaz al finalizar la asignatura de comprender el significado de las defensas orgánicas del ser humano, en especial del sistema inmune, su organización, la dualidad de su respuesta y sus mecanismos celulares y moleculares. Otro objetivo fundamental es que los alumnos, en el desarrollo de su ejercicio profesional futuro, puedan aplicar estos conceptos generales al diagnóstico inmunológico de las enfermedades infecciosas y parasitarias de los seres humanos, y que cuenten con los conocimientos suficientes para permitir su solución. La parte práctica del curso se desarrolla en dos grupos de práctica (aproximadamente 10 estudiantes) en el laboratorio de Inmunología de la facultad de Ciencias de la Salud Hay un total de 14 prácticas a desarrollar a lo largo del semestre y se cuenta esta una guía de laboratorio que los estudiantes deben manejar de forma individual para orientar cada práctica. Las prácticas de laboratorio buscan establecer una relación entre los conceptos teóricos y las herramientas diagnósticas en inmunología, disponibles en el laboratorio con el fin de correlacionar la teoría con la interpretación clínica del laboratorio.

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I. PRÁCTICA No. 1 Construcción y Elaboración de grupos de prácticas. Generalidades técnicas en inmunología 1.1 Marco teórico La inmunología es una rama amplia de las ciencias biomédicas que se ocupa del estudio del sistema inmunitario en todos los organismos, entendiendo como tal al conjunto de órganos, tejidos y células que en los vertebrados tienen como función biológica el reconocer elementos extraños o ajenos dando una respuesta (respuesta inmunológica). La ciencia trata, entre otras cosas, el funcionamiento fisiológico del sistema inmunitario tanto en estadios de salud como de enfermedad; las alteraciones en las funciones del sistema inmunitario en los desórdenes inmunológicos (enfermedades auto inmunológicos, hipersensibilidades, deficiencia inmunológica, rechazo a transplante); las características físicas, químicas y fisiológicas de los componentes del sistema inmunológico in vitro, in situ, e in vivo. La inmunología tiene varias aplicaciones en numerosas disciplinas científicas. 1.2 Competencias Conocimiento de Normas, organización y manejo de aparatos en el laboratorio de Inmunología. Conocimientos previos indispensables en Inmunología. 1.3 Materiales y equipos Pizarra Material impreso 1.4 Procedimiento Breve explicación del curso a desarrollar, brindando a los alumnos los diferentes conceptos prácticos sobre los diferentes métodos a usar durante el desarrollo del curso. Breve repaso de las normas de seguridad, Manejo de micro pipetas, preparación de diluciones, obtención de un suero a partir de una muestra de sangre extraída de un animal 1.5 Resultados Inventario de los equipos de laboratorio, formación de los grupos de práctica 1.6 Cuestionario Que impresión tuvo del laboratorio de prácticas? Ud cree que necesita más equipos? Cuáles? 1.7 Fuentes de información http://medicinausach.iespana.es/fisiopat/inmgen.htm

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II. La capacidad inmunógena de los antígenos se debe a: . F-CV3-3B-2 Rev. y 26”. Sin embargo existen otros factores que pueden intervenir y modular la respuesta inmune: .La dosis . en una relación de 10 volumenes de sangre por 1 volumen del anticoagulante. Los solubles se emulsionan con adyuvante y los particulados se inoculan sin adyuvante.El estado del inmunógeno . 23.Debe de tener epítopos capaz de ser reconocidos por los anticuerpos de los L B. Algodón. Los anticuerpos circulantes tienen un alto titulo de Ig G específica. carbohidratos.El uso de adyuvantes . se debe hiperinmunizar al conejo. 2. Estas características son las tres propiedades químicas intrínsecas que se necesitan para que una molécula estimule una buena respuesta de anticuerpos.Debe ser metabolizable .Un conejo en buen estado de nutrición (conejos Nueva Zelanda de 2-2. son de alta afinidad y de muy elevada diversidad.5 Kg de peso -Suero fisiológico tamponado -Gradilla y tubos de prueba de 13x100 -Jeringas y agujas descartables de 3 ml x aguja 21. no contaminada. -Alcohol yodado. inoculando el antígeno en más de una dosis.Vía de inoculación Se inocularán antígenos a conejos a fin de obtener anticuerpos circulantes.3 Materiales y equipos -Eritrocitos: las suspensiones de eritrocitos son usados con frecuencia como agentes inmunizantes en la preparación de sueros para tipificar sanguínea. es decir.ser reconocida por CMH de clase II y ser reconocido por receptores de membranas de los linfocitos . . Los mejores resultados se logran al provocar al animal una respuesta inmune humoral secundaria. . Junio 2007 .1 Marco Teórico El sistema inmune de los seres vertebrados solo puede ser evidenciado cuando se le coloca sustancias extrañas a EL que permitan el reconocimiento y desencadenar una respuesta inmune contra el antígeno que lo ha desencadenado.2 Competencias • • Reconocer las formas de inoculación en los animales de laboratorio Reconocer los productos de inoculación Obtener muestras del animal de laboratorio con cantidad suficiente de anticuerpos • 2. Por su naturaleza química los antígenos pueden ser proteínas.Sangre humana del tipo “O” extraídos con ACD o citrato de sodio al 10%. ácidos nucleídos y lípidos. Los antígenos a inocularse pueden ser solubles o particulados. PRACTICA Nº 2 Inoculación de animales de Laboratorio 2. Solo usar sangre fresca.

7 Fuentes de información . Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 1981.0 1.Animales frecuentes de inoculación? .V E. Se usan las dosificaciones según tabla adjunta.V Material inoculado Sangre total Grupo “O” “ “ “ “ G. 2ºed. si el titulo no satisface se inocula nuevamente dosis E.5 2.0 1. . Examenes de Laboratorio. 1975. Junio 2007 .”O” al 20% en sol. Alva P.01% Una buena inoculación se evidencia por la ausencia de edema en la zona de inoculación. Sujetar la oreja del animal y frotar la región marginal con algodón embebido en alcohol. esperar unos segundos y después retire la aguja.V. 2. Barcelona. Si aparece sangre en la jeringa..0 1.V E.0 Sangría de prueba Vía I. J. -Al terminar la inoculación.2. F-CV3-3B-2 Rev.V E.6 Cuestionario . inocular el antígeno lentamente.85% con sulfato Magnesio al 0.Cornejo W. Editorial Jims. Técnicas en Inmunología. Methods Enzymol 73: 46-52. Día 1 3 5 7 9 12 15 18 21 23 25 2. y Peltier. Salina 0.D I.85% con sulfato de magnesio por vía endovenosa.R. con una concentración alta de anticuerpos.0 1.5 1. Colocar un trozo de algodón sobre el sitio de inoculación y esperar hasta que se coagule la sangre. Productión of antisera with small doses of immunogen: multiple intradermal injections.5 Resultados Dosis 0. 2007.D I. Q. se obtienen títulos más altos de anticuerpos. -Insertar la aguja en la vena.0 1.V E. Al final del proceso de inoculación se tendrá un conejo hiperinmunizado.D E.Cuales son las Sustancias que producen mejor respuesta inmune? 2.D I.0 2.4 Procedimiento Inocular conejos con sangre total por vía intracutanea seguida de glóbulos rojos al 20% en solución salina 0.Vía de inoculación más frecuente? . Desplazar el embolo hacia arriba.Pillot.Vaitukaitis JL. .D I. UNMSM. -Retirar al conejo de su jaula y colocarlo en la mesa de trabajo -Cargar la suspensión en la jeringa según protocolo -Inmovilizar al conejo.5 1.

en la vida adulta. la médula ósea con una respuesta lenta pero más prologada de producción de anticuerpo llega a ser responsable de aproximadamente el 80 % de la respuesta secundaria. por encima del corazón. donde maduran los linfocitos T. Es por esta razón que debe de incluirse dentro de los órganos secundarios aunque también juegue un papel fundamental como órgano primario. sigue habiendo maduración de linfocitos T en otros lugares. sitio de linfopoyesis y maduración de los linfocitos B. F-CV3-3B-2 Rev. los ganglios linfáticos que lo hacen de los existentes en los tejidos y por último tenemos el tejido linfoide asociado a mucosa. Junio 2007 . aunque paulatinamente se ve Substituido por la médula el cual es el otro órgano primario que por su importancia en la Hematopoyesis será tratada en capítulo correspondiente a este tejido conjuntivo Especializado. Varia mucho su volumen de acuerdo a con la cantidad de de sangre que retenga en su interior y según la actividad hematopoyética que realice. y va involucionando con la edad.III. Este órgano está lleno de células linfoides denominadas timocitos. al nacer. la producción de linfocitos T en el timo decae bastante. En cambio.1 Marco teórico Órganos Linfáticos. Es una víscera blanda y muy friable. El bazo es el mayor de los órganos linfoides ubicado dentro de la cavidad abdominal. que se encarga de realizar esta función en las mucosas de los órganos como el pulmón. También se debe de tener en cuenta que en la respuesta secundaria la médula ósea se comporta como un órgano secundario. el papel que desempeña la medula ósea en la respuesta secundaria. Desarrollo y evolución del timo. de modo que en la vejez (> 60 años) pesa entre 10 -15 g. Bazo. donde se produce linfopoyesis de célula T que permanecen en el epitelio intestinal o migran a la lámina propia. distribuidas en una corteza de gran densidad celular y una médula de menor densidad celular. Es un órgano localizado en el tórax. En etapas tempranas del Desarrollo fetal. Medula ósea. Por lo tanto. cuando el timo ha involucionado. en el suministro de las células que intervienen en la defensa del organismo. pero durante poco tiempo. lo cual tiene importancia para los traumatismos abdominales. aunque siempre existe una actividad residual. En la fase adulta. el cual procesa los antígenos que transitan en la sangre. Su color purpúreo se debe a la gran cantidad de sangre que contiene. el hígado asume estas funciones. y participan en la maduración y selección de los timocitos hacia células T maduras. época en la que llega a pesar 30-40 g. principalmente en el epitelio intestinal. los órganos secundarios "clásicos" responden rápidamente. Ganglios linfáticos. el timo pesa 10-15 g. Órganos secundarios Los órganos secundarios están representados por el bazo. Órganos primarios Como órganos primarios tenemos al timo. PRÁCTICA No. Durante esta respuesta. y la médula Ósea. Timo. las vías digestivas y el tracto urinario. alcanza su máximo desarrollo en la adolescencia. 3 Identificación de órganos linfoides 3. Durante mucho tiempo no fue tenido en cuenta. Las células no linfoides del estroma expresan en sus superficies moléculas MHC de tipo I y/o II. En humanos.

. cruzando la nuca. jeringas y agujas para insulina. ganglios y timo) 1. no importa el sexo. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas y tenderán a morder instintivamente. Extracción de órganos linfoides (bazo. lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños innecesarios al animal.Vaso de precipitado de 1000 cc .Es la primera estructura linfoide organizada que se encuentra un antígeno que proceda de los espacios tisulares y están especialmente diseñados para retener antígenos. . que vienen en la linfa la cual al circular por su interior pone en contacto a los antígenos con los linfocitos y las otras células inmunocompetentes.Ratones adultos.Papel toalla . bisturí.Tampón PBS pH 7.3. En esta práctica se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en Inmunología. Cortar por la línea media con tijeras. .Etanol 70% .Tubos de ensayo de 5 ml y gradilla. Materiales y equipos . tijeras. 2. Girar al animal para exponer su flanco izquierdo. . 3. tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona hacia abajo en la nuca.Placas de petri . Junio 2007 . 3. Esterilizar con alcohol la zona de la línea media. F-CV3-3B-2 Rev. .4. Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al animal.Tubo de 50 ml con tapa. 3.Eter dietílico anestésico . responsables de iniciar la respuesta inmune específica. En este órgano se llevar a cabo una respuesta inmunológica específica. pinzas.Contenedor para material cortante. 5.Papel aluminio . 4. Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.2 Competencias Conocer los órganos linfoides de ratones que tienen semejanza con los órganos linfoides de los seres humanos.Suero fisiológico . Bazo: 6.Material de disección: Guantes.Pipeta pasteur 3. . Retirar la piel con los dedos. frente a la entrada de un antígeno al organismo y se debe tener en cuenta que estos eventos acontecen de manera dinámica cambiando la morfología del ganglio en dependencia de la actividad funcional en que se encuentra en el momento que se extrae y procesa para su observación.2 . Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las orejas. Se llevarán a cabo extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a partir de estos tejidos sólidos. Procedimiento En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio.Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas.

Alva P. cortando el tejido conectivo. La fagocitosis (del griego phagein. con tijeras. Lowe J. . desde el xifoides hasta el cuello. Abrir las costillas con las pinzas. 14.. http://www. Dando lugar al fagosoma. 3.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2. 2ºed.4 Fagocitosis 4. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. Barcelona-España. 2007. 1992. Colocar el bazo en una placa petri con 1 ml de PBS. Junio 2007 .7 Fuentes de información Stevens A. 13. UNMSM.1 Marco Teórico. depositar en una placa petri y limpiar de tejido graso y conectivo. 8. Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas. Abrir el tórax mediante una incisión. 15. englobando al microorganismo. Extraer el timo con las pinzas y colocar en una placa petri con 1ml de PBS. PRÁCTICA No. 'célula'). Timo: 12. 'comer' y kytos. es un tipo de endocitosis por el cual algunas células (neutrófilos y macrófagos) rodean con su membrana citoplasmática a un antígeno y lo introducen al interior celular. La unión se realiza mediante la emisión de pseudopodos por parte del macrófago. Tumbar al ratón de espaldas. Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras. Extraer. Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático. Mosby/Doyma Libros. 11.6 Cuestionario 3. En la posterior - F-CV3-3B-2 Rev. Ganglios: 10.htm IV. Añadir 1ml de PBS.Cornejo W.5 Resultados 3.med. 9.uva.7. Texto y atlas de histología.

. por vía intraperitoneal.4 Procedimientos Media hora antes de la práctica. . -Retirar la piel traccionando con los dedos índice y pulgar de ambos manos en direcciones opuestas.Conocer la importancia de los PMN como primera línea de defensa del huésped 4. depositándolas en laminillas no usadas.destrucción del microorganismo intervienen los lisosomas. sacrificar al animal con cloroformo en una cámara mortuoria. Introducir la aguja hacia un costado de la cavidad abdominal. los ratones habrá recibido 0.Reconocer la fagocitosis como parte del sistema inmune innato .1 ml de eritrocitos por vía intraperitoneal. Junio 2007 . con anticoagulante -Colorante para células. Mediante la liberación de enzimas tipo hidrolítico que destruirán los microorganismos. mojar la piel del animal con alcohol y con la ayuda de una pinza levantar la piel y hacer una incisión en la línea ventral. . En esta activación interviene la ruta alternativa del complemento. b) Mecanismos independientes del oxigeno.Extraer el líquido peritoneal y colocarlo sobre las laminillas de la placa petri. Las pruebas in vitro miden la capacidad de los leucocitos PMN y de los macrófagos de ingerir partículas o bacterias.1 ml de solución Hanks y retirar mas células. 4.Pasar un algodón impregnado en alcohol por el musculo abdominal. Colocar al ratón en posición ventral sobre una tabla de disección. formando una especie de bolsa con el líquido peritoneal.2 Competencias . la eritrofagocitosis y la prueba de reducción del azul de tetrazolio. la activación de esta ruta produce la liberación de radicales que son toxicos para los microorganismos. En Inmunología las pruebas de función fago citica pueden ser in vitro o in vivo. Giemsa o Leishman -Agua tamponada -Metanol -Cloroformo -Alcohol etílico al 70% -Placas petri con laminillas -Pipeta pasteur con tetina Jeringa de 1 ml con aguja Nº 25 -Pinzas y tijeras -Tabla de disección y alfileres -Algodón -Papel filtro -Microscopio y aceite de inmersión 4. Esta destrucción puede llevarse a cabo: a) Por mecanismos dependientes de oxígeno.Después de 10 minutos.3 Materiales y equipos -Ratones adultos -Eritrocitos de carnero al 20% -Solución Hanks. El bisel de la aguja debe de estar hacia el interior de la cavidad peritoneal. Al activarse rutas metabólicas que consumen oxigeno. Para que se pueda producir la fagocitosis es necesario que el macrófago se una al microorganismo y activarse para poder emitir el pseudópodo y englobarlo. . Si es necesario. sin romper la pared muscular. F-CV3-3B-2 Rev. Las pruebas mas comúnmente usadas son el ensayo microbicida. lavar la cavidad peritoneal con 0.Inocular 1 ml de solución Hanks al ratón.

medición de volumen y tiempo. Cap. que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.Retirar las laminillas d3e la placa petri y lavarlas a chorro directo con la solución de hanks. En todo momento se debe saber sobre cual superficie se han adherido los macrófagos. 4. F-CV3-3B-2 Rev. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo.5 Resultados Se considera fagocitosis positiva cuando al menos un eritrocito fue incorporado al citoplasma del macrófago. E.. 32. nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un antígeno secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada.Cornejo W. para secarlas. Weir D M (ed). 1967. 2ºed. montar la preparación con una gota de glicerina entre lámina y laminilla. temperatura. Comparison of a classical phagocytosis assay and a flow citometry assay for assessment of the phagocytic capacity of sera from adults vaccinated with pneumococcal. Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de un paciente. Alva P. 2007.. en ocasiones. Junio 2007 .Stuart a. . 4. La aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra. involucra a un gran número de variables. Repetir 2-3 veces.7 Fuentes de información .La fagocitosis pertenece a la inmunidad innata o adquirida? 4. Techniques for the study of phagocytes. .La fagocitosis solo se da en humanos? .Janses WTM y col. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. -Para la observación bajo el microscopio de luz. con el fin de reducir los costes del ensayo. -Introducir la laminilla en la placa con colorante y dejar colorear por 1-5 minutos. Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo.Qué importancia tiene la fagocitosis? . 8:245-250. Luego. V. sobre papel filtro.1 Marco Teórico ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay. La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Handbook of experimental immunology.Incubar las células a 37ºC durante 1-2 horas para favorecer la adherencia de los macrófagos al vidrio de la laminilla. Blackwell Scientific Publications. UNMSM. Clin Diag Lab Inmunology 2001. Un resultado positivo indica que el anticuerpo está en la sangre e implica que la persona ha contraído una determinada enfermedad. tales como selección de reactivo.6 Cuestionario . PRÁCTICA Nº5 CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR ELISA 5. colocar las laminillas en posición casi vertical. .

7. 6. Incube por 1 hora a temperatura ambiente.Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil. Leer las placas en un lector de ELISA.2 Competencias • Conocer los principios básicos de cuantificación de anticuerpos mediante el uso de la técnica de ELISA. clasificación de anticuerpos en isotipos. 5. • Conocer la utilidad de la prueba de ELISA en la detección de anticuerpos. mediante el uso de la fase sólida. detección viral. 3. 2. una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. 5. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico.3 5. Junio 2007 .4 (A) Un ELISA indirecto. búsqueda de anticuerpos monoclonales. 8. la producción de color indica la cantidad de un anticuerpo para un antígeno especifico F-CV3-3B-2 Rev. Lave 4 veces los pocillos con PBS-Tween 20. Lave la placa. etc. robusto. Bloquee el atascamiento no específico usando el 1% BSA/PBS e incube por 30 minutes en la temperatura ambiente. Agregue los estándares y 100uL de muestras diluidas a los pocillos apropiados. Materiales y equipos Lector de ELISA Kit para ELISA Placas de ELISA Micropipetas Puntas Procedimiento 1. simple en su realice. 5. Cubrir la placa de ELISA con el antigeno diluido e incubar durante la noche en 4c. 4.5 Resultados 5. Agregue 100uL del substrato a cada pocillo e incube a temperatura ambiente por 30 minutos. Agregue la dilución apropiada 100 ul del anticuerpo secundario conjugada con la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa (HRP) e incube por 30 minutos.

Incluso hoy en día estamos en continua lucha por seguir encontrando mas opciones de cura para otras enfermedades que nos afligen. Barcelona. y les realizamos una serie de pruebas en las cuales el producto final es el antisuero.6 Cuestionario Los anticuerpos detectados por la prueba de ELISA son de tipo G o M? La prueba de Elñisa solo sirve para detectar anticuerpos? El método ELISA es difícil de realizar en los diferentes laboratorios de salud pública? 5. Madrid.org/wiki/ELISA VI. 2000). lo cual era causante de muchas muertes por enfermedades que podían ser tratadas o evitadas con solo una inyección de este antisuero. Esta obtención de antisuero es gracias a un procedimiento que se les realiza a las bacterias o agente infeccioso causante de la enfermedad. T. 5ª ed. 6. pero para eso necesitamos saber las técnicas adecuadas de inoculación para estos animales y la diferencia entre cada técnica para tener una acción más confiable del producto final que es el antisuero. http://en. Kuby Immunology. Freeman and Company.(B) En ELISA sandwich. 2007. A. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas.2 Competencias • Adquirir conocimientos sobre las técnicas a utilizar en el laboratorio de • • Inmunología y saber con que tipos de animales podemos realizar estas técnicas. teniendo en cuenta que en algunas se quiere mantener vivo al animal(sangría parcial o de prueba). Kindt. 4th ed. A. F-CV3-3B-2 Rev. la producción de color indica la cantidad de antígeno 5.7 Fuentes de información o Abbas AK y Lichtman AW (2004) Inmunología celular y molecular. PRÁCTICA No. En este proceso tornarnos el antígeno bacteriano ya sea cápsulas. El sistema inmune en condiciones de salud y enfermedad. flagelos. B.] o Cornejo W.1 Marco teórico El en área de la Inmunología encontramos una gran variedad de procedimientos para lograr diversos objetivos.wikipedia. Walport M y Shlomchik M (2003) Inmunobiología. McGrawHill – Interamericana.. o R. Alva P. 162. claro y especifico para determinada enfermedad. Para verificar la eficacia de estos.. se procede a la separación de la muestra y la obtención de los antisueros que gracias a ellos es que podernos contar hoy en día con las vacunas. Aprender las bases sobre cómo se obtiene un antisuero Obtener un conocimiento previo teórico sobre las áreas donde se deben realizar las punciones en los animales. Junio 2007 . p. 2ºed. necesitarnos un animal de prueba al cual se le llevara un seguimiento de la acción del antisuero. Janeway CA Jr. Después de lograr la sangre del animal mediante técnica adecuada de punción. J. 6 Sangría de animales de Laboratorio 6. Osborne. UNMSM. Masson. Goldsby. Travers P. mientras que en otras ocasiones se extrae el máximo de sangre posible(sangría total o en blanco). (W. Para cada animal de experimentación se utilizan técnicas de sangría diferentes. proteínas entre otros. gran avance que en tiempos pasados no se tenía. 5ª ed.. H.

5 Resultados . la evidencia que la aguja está en la vena es el flujo continuo de sangre.Agitar al animal.3 Materiales y equipo En los conejos inmunizados en las prácticas anteriores se les harán sangrías para detectar la presencia de anticuerpos circulantes.Repetir el procedimiento una o mas veces.Se puede usar suero hemolizado para pruebas de laboratorio? . Materiales: F-CV3-3B-2 Rev. . 2007. En las sangrías parciales es generalmente. Cap 5.El mejor animal para inocular es el conejo? Porque? -Cuanto de suero es lo ideal para una buena sangría? 6.Cornejo W. . retirar la aguja y depositar la sangre en los tubos de prueba.4 Procedimiento SANGRIA DE PRUEBA .Dejar coagular la sangre obtenida. se procederá a la sangría total. SEPARACIÓN DEL SUERO La detección o cuantificación de anticuerpos séricos generalmente requiere de una muestra de suero transparente y libre de contaminación.(La sedación del animal facilitará la tarea) 6.6. colocarlo en posición ventral sobre una superficie lisa horizontal. 2ºed. Alva P. cuidando no hemolizarlo y evitando su contaminación. Junio 2007 . Antibodies: A laboratory manual. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas.Agujas de 20x1 -Algodón y alcohol 6. colocar un trozo de algodón sobre el area de sangría y extraer la aguja. .La sangría total de un conejo rendirá entre 60-120 ml de sangre. . dejar evaporar el alcohol y luego introducir la aguja en la vena.Colectar 3 ml de sangre en un tubo de prueba. UNMSM.Harlow E. . New York. . 1988. 6. sujetándolo por las patas anteriores y posteriores.Para terminar la sangrí.Introducir la aguja hacia el corazón. suficiente 3-10 ml de sangre. Por lo tanto. Presionar ligeramente sobre la vena hasta que coagule la sangre. Cold Spring Harbor Laboratory.. la evidencia de que la aguja está en el corazón es el flujo continuo de sangre. a fin de obtener la mayor cantidad posible de sangre.Conejos inmunizados . .Extraer la jeringa.Jeringas de vidrio de 20-50 ml -Agujas de 18x1 ½ . .Palpar los latidos del corazón y desinfectar el area. Lane D.6 Cuestionario . el suero deberá obtenerse 1-2 horas después de extraída la sangre.Tubos de 13x100 mm . luego. SANGRÍA TOTAL .7 Material de referencia .Desinfectar el area donde se localiza la vena central de la oreja. si se decide que el nivel de anticuerpos es el adecuado. . en una inclinación de 45º y hacia el centro de la cavidad toráxica.

-Tubos 10x75 mm . ligeramente inclinados.2ml • Sol..Con una pipeta pasteur. luego trasladarlos a 4ªC para que liberen el suero.El suero no hemolizado es incoloro o presenta un color ligeramente amarillo..05-0. ← ← ← ← ← ← ← VOLUMENES DE SANGRE QUE SE PUEDEN OBTENER DE VARIAS ESPECIES ANIMALES F-CV3-3B-2 Rev. ← Preparar en volúmenes iguales el suero con la glicerina y repartirlos en alícuotas.. ← ← ← Solución Madre: Con una de las alícuotas preparada.5 ml de suero por cada criotubo.Centrífuga Procedimiento ← Dejar los tubos con sangre..Dependiendo del volumen de suero obtenido.. ← El suero problema se puede guardar en congeladora solo o se le puede agregar solución para conservar mejor los anticuerpos y evitar la contaminación bacteriana... colectar el suero y colocarlo en un tubo de 10x75 mm ← . ← . Rotular convenientemente y guardar a -20ªC.. envasándolo y conservándolos en congelador a -20ªC..Centrifugar el suero a 2500 rpm durante 5-10 minutos.. ← Resultados ← .94 ml • Fenol al 5% en suero fisiológico………4 ml ← Esto se conserva estable en refrigerador sin congelar.Pipetas pasteur con chupón . ← .. ← -Colocar los tubos en estufa de 37ªC por 30 minutos.Criotubos .Colectar el suero libre de eritrocitos y envasarlo en criotubos. ← . hasta que coagule.85%.. repartir entre 0.. Junio 2007 . Salina tamponada 0.. preparar una dilución 1/100 de la siguiente manera: • Hemolisina al 50% en glicerina……….

2 5 0.2 Competencias .2 0. 7.2 Dilución 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 Se colocan en baño maría a 37ªC por 2 horas y en refrigeración a 4ªC por 18 horas.2 ml. Madre Hemolisina 1/50 2 0.2 0.20 ml al tubo siguiente hasta el tubo 7.2 0.2 0.Bocal con lejía . La medición de anticuerpos se lleva a cabo titulando seriadamente el suero problema en diluciones al doble en presencia una cantidad constante de antígeno.2 Mezclar el contenido del tubo 1 y pasar 0. El titulo alcanzado por el suero es un indicador para establecer si hay una relación causal entre los anticuerpos anti-eritrocitos de carnero(hemolisina) contenidos en el suero de un animal hiperinmunizado.”O” 1% 0.2 6 0. G.2 0.1 Marco Teórico La forma habitual de evaluar la respuesta inmunitaria humoral en personas o en animales de laboratorio consiste en la detección o medición de inmunoglobulinas.2 Mezclar 3 0. Salina Sol.2 0.2 4 0. Junio 2007 . anticuerpos y proteínas del complemento por técnicas serológicas. Usar controles de GR.realizar correctamente diferentes diluciones de muestras 7. TITULACION DEL SUERO ANTIGLOBULOS ROJOS HUMANOS “O” 1 Reactivo Sol.3 Material y equipos -Hemolisina diluida 1:5(Solución madre de hemolisina1/50) . Descartar 0.7 Titulación de Suero(Hemolisina) 7. F-CV3-3B-2 Rev.4 Procedimiento Se hace preparando una serie de tubos de hemólisis en los cuales se mezclan volúmenes iguales de diluciones crecientes de hemolisina en suero fisiológico y una suspensión al 1% de hematíes humano “O” lavados y no sensibilizados.Solución salina -Tubos 10x15 mm -Pipeta de 1 ml -Puntas para micropipeta .2 0.2 0.Eritrocitos 1-2% .R.Especie Volumen total de sangre promedio(ml/Kg) Volumen disponible en la sangría total(ml/Kg) Volumen máximo de seguridad en una sangría parcial(ml/Kg) Caballo Bovino Cabra Carnero Perro Conejo Cobayo 75 60 70 60 90 70 75 40 30 30 25 45 35 35 8 7 7 6 9 7 7 VII. PRÁCTICA No.conocer como se realiza una titulación de anticuerpos en muestras de sueros .Baño maría 7.2 7 0.

Of Sanit Panam. receptores de complemento y receptores Fc de IgE. un racimo de eritrocitos rodea al linfocito. UNMSM. IX. Fife E H. PRÁCTICA Nº9 Determinación de Linfocitos en sangre: Rosetas T 9. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas.La primera dilución que no presenta aglutinación visible. Desde el punto de vista morfológico. Junio 2007 .7 Material de referencia . marcados con fluoresceína. se encuentra poca diferencia entre los linfocitos pequeños B y T. reacciones de injerto contra huésped. Alva P. 1976. al cual se unen mediante el fragmento Fc de la IgG. examinados al microscopio óptico o al electrónico. menos quizás el 3 al 10 %.No se deben usar tubos controles en la titulación? Porque? 7. El titulo es la inversa de la dilución donde ocurre la máxima hemaglutinación. 2º ed. los eritrocitos forman una malla la aglutinación es positiva. posteriormente aparece el receptor CD3. 1976. Métodos de fijación del complemento estandarizado cuantitativamente para la evaluación crítica de antígenos preparados con Trypanosoma cruzi. 2ºed. Pub. En las células T humanas pueden ser inducidas a formar las llamadas rosetas espontaneas con simples eritrocitos de carnero. Cientif. fácilmente detectables y se los reconoce por formar rosetas con eritrocitos de carnero (rosetas E). Estos receptores se demuestran por la formación de rosetas con eritrocitos recubiertas con anticuerpo IgG. Una gran proporción de células B llevan IgD e IgM. de linfocitos en sangre periférica. Incline ligeramente el tubo de prueba. es considerada la dilución a usar para la sensibilización. Al madurar los linfocitos todavía en el timo le aparecen los marcadores CD4 y CD8 entre otros receptores y es en el timo donde se lleva a cabo una selección de los linfocitos T. pero una parte se tiñen con antisueros dirigidos contra la parte Fc de otras clases de inmunoglobulina. La maduración de los linfocitos T en el timo. reacciones de hipersensibilidad retardada. da cuenta de este modo del total. pero se han utilizado marcadores de superficie para diferenciar las poblaciones. que se unen a los receptores para la región Fc de la inmunoglobulina que poseen algunas células T. si los eritrocitos caen a manera de lágrima es porque están sueltos(aglutinación negatica).6 cuestionario . F-CV3-3B-2 Rev. 2007. 7. usando técnicas de inmunoflorecencia y reactivos tales como sueros anticadenas ligeras de inmunoglobulinas. pero no de los T.1 Marco teórico Las células indiferenciadas que migran al timo encuentran el microambiente para su diferenciación en linfocitos T. carecen de antígenos Ia. si por el contrario. Las inmunoglobulinas son fácilmente demostrables en la superficie de los linfocitos B.El titulo es lo mismo que la dilución? . en la superficie. Tales células T representan aproximadamente del 72 al 92 % de los linfocitos en sangre periférica.Se puede usar cualquier GR para la titulación? .Cornejo W. La inmunoglobulina no es un producto procedente de las células T. 7. Estas células pueden participar en ciertos mecanismos inmunológicos como el rechazo de injertos.5 Resultados La aglutinación se lee en el fondo del tubo según la manera que se han depositado los eritrocitos.. Las técnicas de laboratorio en brucelosis. JonesL. . que les recubre. 319. su primer marcador que aparece en la superficie es el CD2 (receptor para glóbulos rojos de carnero). o en proceso de regulación de la respuesta inmune. parte de las células T se tiñen para inmunoglobulinas.Alton G G. . OPS.Almeida J O. La división amplia de los linfocitos en células B y T típicas. si no que es absorbida del exterior y probablemente representa complejos inmunes. defensa contra virus y células tumorales.M. OMS. Las células T sanguíneas normalmente típicas. El titulo de la hemolisina va a estar dado por la máxima dilución donde acurre la hemaglutinación. una propiedad que no comparten con los linfocitos B.

Resuspender las células. . laminillas y parafina solida calentada. CD(Cluster of differentiation) 9. evitando así la coagulación de la sangre.Manguera para hacer torniquete .4 Procedimiento .Colocar un torniquete por encima del codo de la persona cuya sangre se va a extraer y pedirle que cierre y abra la mano para aumentar la circulación.Tubo de 16x150 mm .5% en SS .2 Competencias .Laminas.La sangre fluirá dentro de la jeringa espontáneamente.Tubo de 13x100 mm con 1.0 ml de PBS.Seleccionar la vena por inspección y palpación.Pedir al voluntario que cierre la mano e introducir la aguja en la vena . . Descartar el sobrenadante y agregar 0.Agregar 3 ml d PBS para diluir la sangre 1:4. .Retirar el torniquete.Suero de ternera fetal al 2% .Reconocer la presencia de los L T mediante la roseta T. colocar la tapa de jebe y rotar el frasco suavemente durante 5-7 min. .Bocal con lejía 9. Mezclar bien y depositar en zona. 3 ml de sangre en el tubo que contiene 1. El Ficoll-Hypaque es una mezcla de 12 partes de Ficoll al 9% y 5 partes de Hypaque al 34% . agitando suavemente. Extraer de 5-6 ml de sangre .Colocar un algodón y presionar de 3-5 min. utilizando anticuerpos monoclonales. .Diferenciar los L B de los LT 9.Puntas para pipeta -Jeringa de 2-3 ml con aguja Nº21 -Algodón y alcohol yodado .0 ml de PBS.Separar suavemente el anillo de linfocitos con la pipeta pasteur y transferirlos al tubo de 10x75 mm. . La fibrina queda atrapada en las perlas de vidrio. . lavados al 0. También se puede hacer la determinación mediante inmunofluorescencia o técnica de rosetas. marcados con una sustancia fluorescente.5% en BPS .Rapidamente retirar la aguja de la jeringa y depositar la sangre en el frasco de penicilina con perlas de vidrio.Existen varios métodos para cuantificar los linfocitos. pedir a la persona que abra la mano. extraer la aguja .R.5 de Ficoll-Hypaque .5-1.G.Azul de Toluidina al 0. Junio 2007 .Tomar 1 ml de sangre defibrinada y depositarla en u tubo de 16x150 mm . .Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos. se puede usar por citometría de flujo.Tubo de 10x75 mm .Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos .5-1.Desinfectar el area con alcohol yodado y dejar evaporar el alcohol -Preparar y probar la jeringa y aguja .Ficoll-Hypaque de 1077 de densidad .5 ml de PBS.Pipeta de 1 ml . Esto se hace para lavar los linfocitos y retirar restos de Ficoll-Hypaque.Resuspender las celulñas en aproximadamente 0. Agregar 0.3 Materiales y equipos .Frasco de penicilina con perlas de vidrio y tapa de jebe . agregando una gota de suero de ternera fetal F-CV3-3B-2 Rev.5 ml de Ficoll-Hypaque .Centrifugar nuevamente a 800 rpm durante 3 minutos y descartar el sobrenadante. Separación de Linfocitos Los linfocitos se obtienen de sangre defibrinada y se separan de los eritrocitos pasándolos a través de Ficoll-Hypaque de 1077 de densidad.Buffer salino fosfato(PBS) .

Junio 2007 . . UNMSM.6 Cuestionario .Fukusaki I.Observar al microscopio - 9.Pharmacia Fine Chemicals. separar y descartar una gota del sobrenadante. 9. Alva P.Centrifugar a 800 rpm x 1minuto . tomar las células del fondo y colocarlas en una lámina con una gota de azul de toluidina. formando rosetas. Marcadores de linfocitos T y B humanos en sangre periférica.Bach J.Se pueden usar G. 1975. Cubrir con la laminilla y sellar con parafina licuada .5% . 1977.humanos para observar las rosetas T? . Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas.Con la pipeta pasteur con tetina.Cuidadosamente. . Las rosetas T solamente se forman alrededor de células vivas. Tesis de bachiller en Ciencias Biológicas.Formación de Rosetas T 6 La suspensión de linfocitos debe tener de 1-10x10 células x ml y debe contener 80-90% de células vivas. Folleto “Ficoll-Hypaque for in vitro isolation of lymphocytes.5 Resultados Observar que alrededor de algunas células (linfocitos T) hay adheridos eritrocitos de carnero. Transplant Rev 16: 196:217.R.Cornejo W.F. .Depositar dos gotas de la suspensión de linfocitos en un tubo de prueba 7x100 mm . 2ºed. 2007. el numero de eritrocitos tendrá que ser mayor de tres.7 Material de referencia .. Evaluation of T-cells and thymic serum factors in man using the rosette technique. . 1973.Las rosetas T se observan en los LB? .Colocar 2 gotas de eritrocitos al 0. F-CV3-3B-2 Rev. Para que sea considerada una roseta. sin resuspender las células del fondo del tubo .El ficoll-Hypaque se necesita para separar solo los anticuerpos? 9. UNMSM.

Gradilla para tubos . PRÁCTICA Nº10 Actividad lítica del complemento 10. Esta señal de reconocimiento produce una rápida respuesta de destrucción.Eritrocitos humanos grupo A o B al 2% . peces y algunos invertebrados también lo poseen.25 0. Tras la unión inicial de proteínas del complemento al microbio.X. aumentan la permeabilidad vascular y opsonizan (recubren) la superficie del patógeno. el mismo no sólo se presenta en los mamíferos. 10. que también son proteasas.2 Competencias . Contiene más de 20 proteínas diferentes y recibe ese nombre por su capacidad para complementar la destrucción de patógenos iniciada por los anticuerpos.Tubos de 13x100mm en gradilla . Esto produce una cascada catalítica que amplifica la señal inicial por medio de una retroalimentación positiva controlada. incubándolo a 56ºC en baño maría por 30 minutos -Rotular 3 tubos y repartir los reactivos como se indica: reactivos Suero humano inactivado ml Eritrocitos ml Complemento ml Suero humano no inactivado ml Solución salina ml Tubo 1 0.25 0.25 2 0.conocer como actúa el complemento en la reacción antígeno-anticuerpo .50 La cascada origina la producción de péptidos que atraen células inmunitarias.25 0.25 . aquéllas activan su capacidad proteásica. El sistema del complemento es el mayor componente humoral de la respuesta inmune innata.25 0.25 3 0.Pipetas de 1 ml .25 0. Esta deposición del complemento puede también matar células directamente al bloquear su membrana plasmática.1 Marco teórico El sistema del complemento es una cascada bioquímica que ataca las superficies de las células extrañas. La velocidad de la respuesta es el resultado de la amplificación de la señal que ocurre tras la activación proteolítica secuencial de las moléculas del complemento.25 0.Incubar los tubos a 37ºC durante 30 minutos -Centrifugar los tubos a 1500 rpm durante 3 minutos F-CV3-3B-2 Rev.Inactivar el suero humano.conocer la presencia del complemento en las muestras de los pacientes 10.3 Material y equipos .Complemento .Centrifuga 10. grupo “O” . que a su vez activa a otras proteasas del complemento y así sucesivamente.Baño maría a 37ºC .Baño maría a 56ºC .Suero humano.4 Procedimiento . sino que las plantas. Junio 2007 . Muchas especies tienen sistemas de complemento. esta respuesta es activada por la unión de proteínas del complemento a carbohidratos de las superficies de los microorganismos o por la unión del complemento a anticuerpos que a su vez se han unido a los microorganismos. marcándolo para su destrucción. En los seres humanos.Suero fisiológico .

R. Determinación de la actividad hemolítica del complemento 11.Baño maría a 37ºC .La reacción antígeno-anticuerpo es necesaria para destruir al germen? 10. unidades de Proteínas del Sistema Complemento por mililitro.El complemento es útil en las defensas del huésped? .35 0. 1976.Espectrofotómetro .3 Materiales y equipos . Añadir: Suero problema ml Buffer Barbital ml G. 2ºed. Rinehart and Winston.Pipetas de 100 uL .Buffer barbital sódico 0.15 0.90 0.5 . Alva P.40 0.El complemento es una proteína que lisa GR? .1 Marco Teórico. 2º ed.Cornejo W.4 Procedimiento .60 Positivo 0.Conocer la función del complemento dentro del sistema antígeno-anticuerpo 11. midiendo el porcentaje de lisis celular.60 4 0.A.Centrifuga .60 3 0.60 2 0.Suero problema . sensibil.← 10. UNMSM. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. New York.Puntas .Kabat E.Colocar en una gradilla sobre hielo una serie de 14 tubos.25 0. y 1/75 del suero a titular . . Junio 2007 . El tubo c no debe mostrar hemolisis. XI.Tubos de 13x100 mm .025M.7 Material de referencia . Structural concepts in inmunology and inmunochemistry.75 0.Pipetas de 1 ml .6 Cuestionario .60 F-CV3-3B-2 Rev.Preparar en buffer sódico 2 ml de las diluciones 1/25. ml 1 0.65 0. Este método se basa en la actividad de la vía clásica del complemento para producir hemólisis de eritrocitos sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpos antieritrocitarios(Hemolisina) Es un ensayo de las Proteínas del Sistema Complemento circulantes. que es la Dilución de Suero necesaria para lisar el 50 por ciento de los Eritrocitos en la prueba.Agua destilada .Bocal con lejía 11. Los valores se expresan por el llamado CH50.. Holt.60 Negativo 0. 1/50.Conocer la importancia del complemento en la hemolisis de los hematíes .55 0.Eritrocitos de carnero sensibilizados al 1% .2 Competencias .5 Resultados La actividad lítica del complemento se evidencia por el enrojecimiento del medio(hemolisis) en los tubos de ensayo que contienen complemento(tubos a y b). PH 7. 11. 10. 2007. Práctica XI. Las muestras de Suero diluido se añaden a Eritrocitos recubiertos con Anticuerpos.50 0.

Se basa en el hecho de que los pacientes que poseen dicho factor aglutinan los eritrocitos previamente sensibilizados.2 Competencias F-CV3-3B-2 Rev.5 ml de buffer 4ºC a todos los tubos. obteniéndose resultados idénticos. La reacción sale positiva en pacientes con artritis reumatoide o ciertas colagenosis. Junio 2007 .Leer la D. 2007. primero sangre humana total del grupo "O" por vía intracutánea. muchas veces son hallazgos serológicos en pacientes con enfermedades reumáticas sistémicas. excepto al control positivo. .En papel semilogaritmico.6 Cuestionario .Centrifugar todos los tubos a 1500 rpm durante 5 minutos . Thompson R A ed. y.Añadir 0. .O. Los autoanticuerpos son anticuerpos dirigidos contra antígenos del propio organismo. 1977.Agitar bien los tubos y colocarlos en baño maría a 37ºC por 30 minutos . Blackwell Scientific Publications. con la cual nos permite obtner altos títulos de suero hemolítico. Agitar suavemente. al cual se añade 1. En el presente trabajo se expone una técnica sencilla y fácil de realizar por personal capacitado.1 Marco Teórico.Preparar series idénticas para las diluciones 1/50 y 1/75. La prueba de Waaler Rose es una prueba inmunológica que se utiliza para poner de manifiesto el factor reumatoideo. al inyectar a un conejo.Valores esperados en suero de adultos: 80-100 UH. La obtención de una hemolisina anticarnero de alto poder es una necesidad para mejorar el sistema hemolítico. .Trazar la mejor recta e interpolar para cada dilución del suero problema el volumen que produce el 50% de hemólisis. .Los controles permiten verificar el correcto actuar del sistema? 11. Complement and complement fixation. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. Oxford. la posibilidad de los laboratorios pequeños para contar con un bioterio adecuado de donde obtener fácilmente los glóbulos rojos de carnero. Calcular las UH en 1 ml y multiplicar por la dilución correspondiente. 4. PRACTICA 12..Cornejo W.(Densidad Optica) de los sobrenadantes a 550 nm utilizando como blanco el control negativo. Aglutinación de hematíes de cordero (previamente sensibilizados en contacto con un suero de conejo anticordero) por suero humano privado de sus heteroaglutininas naturales. 11. incluyendo los tubos controles .Brown D. Posteriormente se realizó una técnica distinta utilizando glóbulos rojos "O" humanos sensibilizados con el suero hemolítico obtenido. Alva P. Techniques in clinical immunology. en dosis crecientes para luego continuar inyectando por vía endovenosa glóbulos rojos "O" al 20%. Cap. solo algunos tienen importancia en el diagnóstico de las enfermedades reumáticas y pueden considerarse como marcadores serológicos.Se necesita medir esta prueba a los pacientes para medir su inmunidad? . UNMSM. 11. graficar los porcentajes de hemólisis (ordenada) contra el volumen de suero diluido(abscisa) que se añadió a cada tubo.. Prueba de Waaler Rose modificado 12. La aglutinación para una dilución superior a 1/32 es casi característica de enfermedad del colágeno.+ XII. De los anticuerpos identificados hasta ahora.7 Material de referencia .Cual es la importancia de esta prueba? . Otros son característicos de una enfermedad determinada pero no son específicos. 12.4 ml de agua destilada. Este volumen corresponde a una unidad hemolítica (UH) 50%.5 Resultados .

Fernando. Junio 2007 .sens.Puntas para pipetas .Suero fisiológico . La mezcla se incuba a 37ºC por 1 hora agitando cada 10 minutos.2 ml. tomó conceptos de otras ciencias Biológicas y químicas a las cuales F-CV3-3B-2 Rev. 1985.La prueba sólo usa glóbulos rojos de carnero? .. Lima.Conocer las pruebas de hemaglutinación para el diagnóstico de enfermedades reumatológicas. se retira 0.2 0. XIII.7 Material de referencia .2 de suero problema diluido ¼ al primer tubo.2 0.2 7 1/512 0.2 0. Ignacio. Rev.2 0. 1 1/8 0.4 Procedimiento La sensibilización de los G.2 0.2 de suero diluido al ¼ y después de mezclar se descarta 0.2 0. Se añade seguidamente 0.2 3 1/32 0. Rodríguez.R.2 9 0.2 0.Pipeta de 1 ml . Arturo. y así sucesivamente hasta llegar al tubo 8 del que se extraen 0.13 METODOS DE DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGIA 13. A los 9 primeros tubos se le añade 0.Efectuar modificaciones en las diferentes pruebas de un laboratorio de inmunología 12.2 6 1/256 0.3 Materiales y equipos .1% G.2 0.2 0. . Al tubo 10 se añade 0. Los tubos son agitados vigorosamente e incubados 2 horas a 37ºC.2 0.R. PRÁCTICA No.2 5 1/128 0.2 ml y se añade al segundo tubo.85% SP 1/4 G.2 8 1/1024 0. sensibilizados 1% .2 0.Pipeta de 100 uL . luego a 4ºC toda la noche.no sens.G.2 10 0.1 Marco teórico El laboratorio en la inmunología diagnóstica Paulatinamente la inmunología se ha convertido en una ciencia individual y como todas las ciencias modernas.2 4 1/64 0. así como un testigo de hematíes sensibilizado sin suero y otro de suero más hematíes no sensibilizados. Para cada suero problema se prepara una serie de 10 tubos de hemólisis en los cuales se vierten 0.Tubos 13x100 mm .R.Es recomendable hacer esta prueba en los laboratorios de salud pública? 12. Benites.Suero problema .2 ml de suero fisiológico.Carazas.6 Cuestionario . Tubos Dilución SF 0.2 0.R.2 ml de hematíes sensibilizados al 1%. Sanidad FFPP.2 12. Tenemos de este modo una serie de diluciones del suero desde 1/8 hasta 1/1024. Utilización de hematíes humanos "O" en la prueba de Waaler-Rose. Juan. se realiza por la mezcla de volúmenes iguales de la suspensión al 2% de hematíes “O” lavados y del inmunosuero de conejo diluido en suero fisiológico a la dilución determinada con anterioridad.2 y se descarta.5 Resultados Los dos testigos deben ser negativos La reacción se considera positiva cuando hay aglutinación al 1/32 o más 12.Gradillas 12.La prueba de Waaler Rose es la única para enfermedades reumatológicas? .2 2 1/16 0. El suero problema debe inactivarse a 56ºC por 30 minutos. Ramos.

La detección. como inmunidad. pero si no es posible. la medicina. F-CV3-3B-2 Rev. y determinar su capacidad funcional. Actualmente podemos clasificar las técnicas diagnósticas en: a) cuantificación y detección de anticuerpos o antígenos específicos mediante interacciones antígeno-anticuerpo. incluyendo a la microbiología. La serología como tal se convirtió en un elemento con fines meramente diagnósticos. como pruebas de estimulación linfocítica a mitógenos y a antígenos específicos. se deberá aplicarse al menos en los transplantes de médula ósea. c) ensayos de inmunidad celular. y el conocimiento del HLA (clase I y II) le ayudaría al médico a estimar el grado de rechazo y la sobrevida del órgano transplantado. tanto clase I como clase II. la bioquímica. pretende determinar la concentración de los componentes individuales del complemento (C3. podemos hablar de subdivisiones de la inmunología. La inmunología de transplantes ha tomado mucha importancia en los últimos años dentro de los laboratorios de inmunología. marcadores tumorales y la cuantificación de linfoquinas. (CH50 o CHl00). genéticas y moleculares de la respuesta inmune. la inmunoquímica y la inmunobiología se han dedicado al estudio del conocimiento de la estructura de los antígenos. ya que la mayoría de los análisis son IgG e IgM específicos contra agentes infecciosos. la determinación de los antígenos de HLA. Por otro lado. Ia determinación de HLA clase I por técnicas serológicas de micro-citotoxicidad y Ia determinación de HLA clase H por PCR. se recomienda realizar las pruebas cruzadas. enumeración y fraccionamiento de celulas inmunocompetentes prácticamente se realizan en forma exclusiva mediente citometría de flujo. así como las pruebas cruzadas son casi imprescindibles tanto en los transplantes de órganos sólidos como en los de medula ósea Lo ideal seria poder identificar los antígenos de HLA por técnicas moleculares aplicando Ia tecnología de la reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR). entre otras. determinación de marcadores de infección como la Proteína C Reactiva. y aunque actualmente se destina gran parte de los esfuerzos de investigación a la mejora de vacunas y de las técnicas de inmunización. en los cuales Ia compatibilidad de HLA entre receptor y donador no sea tan relevante. enumeración y fraccionamiento de celulas inmunocompetentes. La cuantificación y detección de anticuerpos o antígenos específicos mediante interacciones antígeno-anticuerpo. Dado que las líneas divisorias entre estas áreas de la inmunología son poco claras. Evaluar los componentes del complemento y su función. determinación de inmunoglobulinas totales (IgA. C1q. d) evaluación de los componentes del complemento y su función y e) inmunología de transplantes. automatizar las técnicas existentes. b) detección. De una manera un poco simplista. determinación de autoanticuerpos. inmunología e inmunidad eran prácticamente sinónimos y se enfocaba en forma casi exclusiva a la prevención de las enfermedades infecciosas mediante vacunación. así como al estudio de las bases biológicas. la patología y la biología molecular. En aquellos transplantes de órganos sólidos. la química del complemento y otros componentes del sistema inmune. C4. inmunoquímica e inmunobiología. lo que hace imprescindible una relación estrecha entre el laboratorio de inmunología y el laboratorio de citometría de flujo. Junio 2007 . e IgE alergenos específicos. deberá involucrar técnicas que permitan evaluar la respuesta inmune. es definitivamente el área más importante dentro de un laboratorio de inmunología. IgG e IgM) y las subclases de IgG. Durante los primeros años de esta ciencia. sino también mejorar y sobre todo. hasta pruebas sumamente especificas como la evaluación de la función fagocítica y de la capacidad microbicida de los fagocitos (NBT) así. un laboratorio de inmunología diagnóstica moderno. actualmente no sólo se busca descubrir nuevas pruebas en serología especificas para cada enfermedad. inhibidor de Cl). inmunoglobulinas. serología.también ha enriquecido. la genética. La evaluación de la respuesta celular en un paciente involucra desde pruebas muy sencillas y prácticamente rutinarias como son las intradermoreacciones. las diferencias entre ambas son tangibles.

Ejemplos representativos.Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula. méd v.3 Materiales y equipos Multimedia Pizarra acrílica 13.21 n. Junio 2007 . Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. no sólo desde el punto de vista de adquisición de los reactivos.Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo). El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. costarric. 14 PCR y Citometría de flujo. Las autoridades en Salud deben impulsar el uso rutinario de estas técnicas no solamente con fines diagnósticos. sino también promoviendo la investigación para el desarrollo de las diferentes áreas de la inmunología diagnóstica. Mostrativo 14.5 Resultados 13. cienc. Fundamentos de la técnica.1 Marco teórico La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.6 Cuestionario 13. sin embargo. 13. pero hay que reconocer que nuestro país cuenta con el equipo humano capaz de trabajar cualquiera de estas técnicas modernas. sino también en cuanto a infraestructura necesaria. Estos parámetros son: .7 Fuentes de información Rev.1-2 San José jun. . como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma. 2000 XIV.2 Competencias Conocer las técnicas utilizadas para la generación de conocimiento 13. cada día son más las técnicas moleculares y genéticas que están a disposición y es por ello. Aplicaciones. PRÁCTICA No. F-CV3-3B-2 Rev. que el personal profesional y técnico debe estar actualizado constantemente.4 Procedimiento Análisis detallado de los procedimientos diagnósticos más utilizados en la practica 13.Las técnicas utilizadas en el laboratorio de inmunología diagnóstica varían a gran velocidad. la incorporación de algunas de estas novedosas técnicas resulta costoso.

Socarrás FerrerI. CD4+. Vianed Marsán SúarezI. La lectura se realizó en un clitómetro de flujo FaCScan (Becton-Dickinson ). CD4.1-3 La incidencia global de los linfomas cutáneos de células T (LCCT) es de alrededor de 0. y según su origen se clasifican en T o B. CD7. CD8. Bertha B. Lic. Ruby Alonso RamírezII. El inmunodiagnóstico se realizó por inmunofluorescencia directa con un panel de anticuerpos monoclonales que incluyó marcadores linfoides B y T: CD2. Junio 2007 .3 Materiales y equipos Multimedia Proyector 14.4. CD19. Las presentaciones clínicas más reportadas son la micosis fungoides (MF) y el síndrome de Sézary (SS). Cada marcador se consideró positivo si un porcentaje mayor al 20 % de los linfocitos expresaba el antígeno. CD3.2 Competencias Entender las bases de la citometria de flujo. Cuba. CD8-). que nos permite un diagnóstico de certeza y la aplicación de una terapia efectiva.2 veces más frecuentes en el sexo masculino que en el femenino. CD22 y CD25. 14. CD5. citometría de flujo. Dra. Palabras clave: linfomas cutáneos T. Lic. atendidos en la consulta de Hematología del Instituto de Hematología e Inmunología.4 Procedimiento Lectura y comprensión de un artículo científico Aplicación de la citometría de flujo en el diagnóstico inmunológico de los linfomas cutáneos T Lic. Cuba. INTRODUCCIÓN Los linfomas cutáneos (LC) son procesos linfoproliferativos malignos cuyo órgano diana es la piel. Dra.36 casos por 100 000 habitantes al año. Lázaro O. RESUMEN Se comunican las características inmunofenotípicas de 7 pacientes (5 del sexo masculino y 2 del femenino) con el diagnóstico clínico-morfológico de linfomas cutáneos de células T. Se corrobora que la citometría de flujo es un procedimiento más rápido y menos laborioso que otros métodos de inmunofenotipaje celular. la técnica de diagnostico de proteínas 14. La edad de los pacientes osciló entre 17 y 88 años. del Valle PérezI . II Centro de Inmunología Molecular.5 Estas neoplasias aparecen fundamentalmente entre los 45 y los 65 años y son 2. Nuestros resultados mostraron que en la mayoría de los pacientes predominó el patrón general de los linfocitos T con función auxiliadora (CD3+. Consuelo Macías AbrahamII I Instituto de Hematología e Inmunología. Miriam Sánchez SeguraI. lo que constituye una proporción pequeña dentro de los linfomas no hodgkinianos.Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad. DraC.5-9 F-CV3-3B-2 Rev.

CD4-.3%). CD4+. CD5. En la minoría (1 paciente) se expresan los marcadores con función citotóxica CD3+. CD7. el diagnóstico de cualquier lesión cutánea está basado en criterios clínicos e histopatológicos. con diagnóstico clínico-morfológico LCCT. se apreciaron cifras de CD4 superiores al 90 % y disminución de las células CD3. En la mayoría de los pacientes predomina el patrón general de los linfocitos T con función auxiliadora CD3+.4. que son entidades que aunque difieren en sus manifestaciones clínicas se cree que son variantes de un mismo trastorno linfoproliferativo del linfocito T CD4.40 %).3.3%).La MF es la forma más común de LCCT y a la vez.10. hiperqueratosis palmoplantar y pérdida de pelos y uñas. El análisis se realizó por citometría de flujo en un FaC Scan (Becton-Dickinson.) mediante el examen de la reacción con los AcMo en la ventana de la población linfoide. CD8+ (14. Todas las muestras fueron fijadas con una solución de paraformaldehído al 1 %. por lo que nos propusimos aplicar la citometría de flujo para el inmunodiagnóstico de 7 pacientes con LCCT atendidos en la consulta de Hematología del Instituto de Hematología e Inmunología. CD19.11 Por otro lado. dentro de estos se encuentran la MF y el SS. Su incidencia es de 0. RESULTADOS. 13 El panel utilizado incluyó: CD2. El estudio inmunofenotípico en sangre periférica mostró la presencia de linfocitos T con predominio de T cooperadores CD3+. el síndrome de Sézary es considerado como la expresión leucemizada de la MF. Las muestras se obtuvieron de sangre periférica y se depositaron en tubos con EDTA al 10 %. Los LCCT constituyen un grupo de enfermedades neoplásicas caracterizado por infiltrados de células T malignas. CD3. Estos resultados corroboraron lo planteado por otros investigadores. CD8. La lectura se realizó mediante la adquisición de 10 000 células en cada tubo. Otras manifestaciones clínicas que se pueden presentar son: hiperpigmentación progresiva. Cada marcador se consideró positivo si un porcentaje superior al 20 % de los linfocitos expresaban el antígeno. MÉTODOS Se estudiaron 7 pacientes (5 del sexo masculino y 2 del femenino) con un rango de edad que osciló entre 17 y 88 años. Hay otros marcadores con fines diagnósticos de células T como CD5 y CD7. inmunológicos y moleculares para un diagnóstico de certeza y pronóstico de la enfermedad.(71.14 F-CV3-3B-2 Rev.12 Tradicionalmente.5. particularmente en la fase inicial de su desarrollo. CD22 y CD25. de ahí que se destaque la trascendencia de los estudios citogenéticos. Marcadores inmunológicos: El estudio inmunofenotípico se realizó por un método de inmunofluorescencia directa con un panel de anticuerpos monoclonales (AcMo) que detectan antígenos en linfocitos B y T. es la que presenta mayores dificultades diagnósticas. La distribución de los casos diagnosticados con LCCT se describe en la tabla 2. Junio 2007 . se caracteriza por eritrodermia. Algunos AcMo estaban conjugados con ficoeritrina (RPE) y otros con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (tabla 1).29 casos por 100 000 habitantes al año y su etiopatogenia se desconoce. CD8. Ninguno de estos criterios es absoluto. y en el caso del paciente con SS. Un caso diagnosticado con SS mostró predominio de linfocitos T CD4+ (14. poliadenopatías y elevado número de linfocitos atípicos en sangre periférica (células de Sézary). CD4+. que fueron variablemente positivos. CD8. Los marcadores B (CD19.UU. CD22) y el de activación CD25 resultaron negativos en la población celular T. EE. CD4. DISCUSIÓN.

14. Perceau G. Asadullah K.7 Fuentes de información www.. 7.cu/scielo.16 lo que permitiría una rápida curación. Murray T. Aspectos relevantes. del Valle LO. Rev Española Pat 2004. Linfomas cutáneos de células T. citogenético. Cornillet P. Actualidad clínica biológica de los linfomas T cutáneos. A retrospective study of 86 ases. Vinogradova IE. Bernard P. CUAL SEGMENTO ES EL MAS IMPORTANTE. Vieites B. Zamulaeva IA. Steny W..42:72-8. Faxas ME. una mayor sobrevida y la incorporación de estos individuos a la vida útil de la sociedad.02892005000100001&ing=es&nrm=iso>. Revisión de los aspectos histopatológicos más relevantes.Un adecuado tratamiento depende de un diagnóstico de certeza morfológico. Durlach A. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. et al.1 Marco teórico Parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel molecular.2 Competencias F-CV3-3B-2 Rev. En la actualidad se utiliza la aplicación intravenosa de anticuerpos monoclonales contra antígenos de diferenciación de células T y se trabaja en proposiciones experimentales para el tratamiento de los linfomas cutáneos que incluyen vacunación.131:339-45.5 Resultados 14.6 Cuestionario 1. Kaplanskaia IB. Kranvchenko SK. inmunológico y molecular. Clinicomorphological characteristics of Sezary`s disease and mycosis fungoides.sld. Linfomas cutáneos. 14.ISSN 6. En sentido restringido comprende la interpretación de dichos fenómenos sobre la base de la participación de las proteínas y ácidos nucleicos. Immunol Today 1998. Cutaneous malignant lymphomas.SI TUVIERA QUE DECIDIR EN IMPORTANCIA. 4.arttex&pid=S0864. Junio 2007 . 5. Zybunova EE. Disponible en: www:http://scielo.19:70-3. Ann Dermatol Venezol 2004. Landis S. Frequency of associated malignancies in cutaneous lymphoma. Rev Cubana Med 2003. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2005. 2.citometriadeflujo. Weiroch MP.37:1-35. Walden P.21(1) (citado el 14 de junio 2007). PORQUE? 14.77:61-5. Ter Arkh 2005.DESCRIBA EN FORMA CONCISA LO QUE MAS APRENDIO LEYENDO EL ARTÍCULO 2. Giliazitdinova EA. Bolden Statistics 1998. 3.com Inmunologia Molecular I y II 14. Cancer J Clin 1998.48:6-29. 15. terapia génica y trasplante antólogo de células madre. Marsán V.php? script=sci. Jahn S. Suárez JM. Macías C. Socarrás BB.

de una población de células (cultura del tejido fino o de célula).3 Materiales y equipos Multimedia Proyector 14.Conocer las técnicas utilizadas para la generación de conocimiento.7 Fuentes de información Biologia Molecular 14.5 Resultados 14. Junio 2007 . El tiempo real se utiliza comúnmente para F-CV3-3B-2 Rev. o iguala recientemente de una célula.4 Procedimiento Seminario dirigido sobre un tema de investigación 14. Hacer ejercicios de comprensión y retención de conocimientos.1 Marco teórico PCR en tiempo real es un tipo de PCR cuantitativo que mida la cantidad de DNA o de mRNA en una muestra.6 Cuestionario 14. 14.

determinar la expresión del mRNA de un gene.5 Resultados 14. dando una idea en cuanto a los cambios de la expresión que ocurren con patogenesia. El desarrollo de PCR cuantitativo en tiempo real ha eliminado la variabilidad asociada tradicionalmente a PCR cuantitativo.2 Competencias Asimilar como la tecnologia se actualiza cada dia 14.molecularstation.7 Fuentes de información http://www. PCR en tiempo real debido a su sensibilidad también se utiliza en la detección de patógeno en la sangre tal como virus.3 Materiales y equipos Multimedia Proyector 14.6 Cuestionario 14. 14. y su expresión nivela (número de la copia del mRNA) durante ciertas condiciones (tales como tratar las células con una droga).com/es/real-time-pcr/ F-CV3-3B-2 Rev. así el permitir cuantificación rutinaria y confiable de los productos de PCR.4 Procedimiento El docente presenta un seminario sobre lo que significa PCR en tiempo real como un arma significativa de la Inmunologia molecular. PCR en tiempo real se puede utilizar para comparar muestras normales (del control) a las muestras de la enfermedad. Junio 2007 . 14.

virginia..7 Fuentes de información http://www. pero hay unas que lo hacen con mayor frecuencia que otras. En el primer caso. y por lo tanto las manifestaciones clínicas.1 Marco teórico Estas enfermedades son consecuencia de una respuesta inmune exagerada en contra de algún componente propio. cualquier estructura del cuerpo puede desencadenar respuestas autoinmunes. El daño al organismo. depende del auto-antígeno en cuestión. 15. artritis reumatoide.XV.edu/uvahealth/peds_hrpregnant_sp/autohub. Junio 2007 .2 Competencias Propiedades generales y descripción de los diferentes mecanismos que conducen a una respuesta inmunitaria frente a un antígeno propio. 15 Seminario: Enfermedades autoinmunes 15.4 Procedimiento Los alumnos presentan en grupos preestablecidos.5 Resultados 15. 15.cfm F-CV3-3B-2 Rev. PRÁCTICA No. etc.healthsystem.6 Cuestionario 15. que puede hallarse sólo en un tipo particular de tejido o bien ser una molécula que se localiza en diferentes órganos. Potencialmente. 15. la enfermedad autoinmune es llamada órgano específica y en el segundo. generalizada. Lupus eritematoso. un tema relacionado a una enfermedad autoinmune: Diabetes.Fundamentos del tratamiento utilizado.3 Materiales y equipos Multimedia Proyector 15.

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