P. 1
tugas_KFA_II_260110080090

tugas_KFA_II_260110080090

|Views: 745|Likes:
Published by EcHie Choi

More info:

Published by: EcHie Choi on Mar 30, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

01/12/2013

pdf

text

original

NAMA : HERISTIANA PRATIWI

NPM : 260110080090

SPEKTROFOTOMETER UV-Vis
A. PRINSIP
Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang
menggunakan sumber radiasi elektromagnetik unltrafiolet dekat (190 – 380 nm) dan
sinar tampak (380 -780 nm) dengan memakai instrumentasi spektrofotometer.
Radiasi ultaviolet jauh (100-190 nm) tidak dipakai sebab dareah tersebut diabsorbsi
oleh udara. Ada kalanya spektrofotometer UV-Vis yang beredar di pasaran
memberikan rentang pengukuran panjang gelombang 190 – 1100 nm. Hal ini perlu
diperhatikan karena daerah diatas 780 nm merupakan daerah radiasi inframerah.
Oleh karena itu pengukuran yang dilakukan pada daerah panjang gelombang diatas
780 nm harus menggunakan detektor yang sensitif terhadap radiasi inframerah.
Prinsip dari spektrofotometer UV-Vis adalah ketika suatu molekul diberikan
suatu energi berupa radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak yang cukup pada
panjang gelombang tertentu maka akan terjadi transisi elektronik. Dengan demikian
spektra ultraviolet dan spektra tampak sebagai spektra elektronik. Keadaan energi
yang paling rendah disebut keadaan dasar (ground state). Transisi-transisi elektronik
akan meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat
energi tereksitasi. Jika suatu molekul sederhana dikenakan radiasi elektromagnetik
maka molekul tersebut akan menyerap rradiasi elektromagnetik yang energinya
sesuai. Interaksi antara molekul dengan radiasi elektromagnetik ini akan
meningkatkan energi potensial elektron pada tingkat keadaan tereksitasi. Ada tiga
macam proses penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak yaitu :
1. Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan antiikatan (π, σ, n)
2. Penyerapan oleh transisi elektron d dan f
3. Penyerapan oleh perpindahan muatan

B. PARAMETER KUALITATIF
Analisis kualitatif d engan menggunakan spektrofotometer UV-Vis hanya dipakai
untuk data sekunder atau data pendukung. [ada analisis kualitatif dengan metode
spektrofotometer UV-Vis terdapat dua hal yang dapat ditentukan yaitu :
Pemeriksaan kemurnian spectrum UV-Vis
Penentuan panjang gelombang maksimum (λ
max
).
Selain kedua hal tersebut, ada parameter lain yang dapat diperoleh dalam
analisis dengan metode spektrofotometer UV-Vis yaitu efek pH, intensitas dan
pelarut dimana kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah
dipublikasikan (published data).
Pada pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis dilakukan perbandingan
kemiripan spektrum UV-Vis zat yang ditentukan dengan refrence sandard dengan
melihat harga MF (Match Factor) atau faktor kecocokan sebagaimana dirumuskan :
H˘ =
ŵŴ
3
{¿X . ¥ - (¿X. ¿¥)]
2
|¿X
2
-
(¿X . ¿X)
n
| |¿¥
2
- |
¿¥ . ¿¥
n
1|

Dimana :
X = absorban spektrum pertama
Y = absorban spektrum kedua
n = banyaknya tempat penentuan
harga MFR = 900 – 1000 menunjukkan bahwakedua spektra identik sedangkan
harga MF < 900 menunjukkan bahwa kedua spektra tidak identik. Walaupun kedua
spektra UV-Vis identik, belum tenty kedua spektra UV-Vis tersebut diberikan oleh
molekul yang sama sebab spektra UV-Vis sangat tidak bergantung pada struktur
molekul akan tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi UV-
Vis (struktur elektronik molekul). Pada penentuan panjang gelombang didasarkan
atas perhitungan pergeseran panjang gelombang maksimum karena adanya
penambahan gugus pada sistem kromofor induk. Ada beberapa macam pergeseran
diantaranya :
• Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan
energi yang lebih rendah.
• Hypsokromik (pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih
pendek.
• Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar.
• Hypokromik, reduksi absortivitas molar.
Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang
serapan maksimum, yaitu :
• Pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga
maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut
perubahan absorbansi untuk setiao satuan konsentrasi adalah paling
besar
• Disekitar panjang gelombang maksimum, bentuk kurva absorbansi
datar dan pada kondisi tersebut hukum lambert beer akan terpenuhi
• Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemanasan ulang panjang gelombang akan keccil sekali, ketika
digunakan panjang gelombang serapan maksimum.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Dalam aspek kuantitatif suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan
sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang
diserap oelh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang
diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap
lainnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton
yang melalui satu satuan luas penampang per detik. Serapan dapat terjadi jika foton
atau radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang
dibutuhkan yntuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga
mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya akan
tetapi penurunan karena hal ini sangat kecil dibandingkan dengan proses
penyerapan.
Berdasarkan hukum Lambert-Beer, hubungan antara transmitan atau absorban
terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan
yang mengabsorbsi sebagai :
ˠ =
I
t
I
o
= ŵŴ
-s.c.b


˓ = ˬo˧
ŵ
ˠ
= e. c. b
Dimana :
T = persen transmitan
Io = intensitas radiasi yang datang
It = intensitas radiasi yang diteruskan
ε = absorbansi molar (Lt.mol
-1
cm
-1
)
c = konsentrasi (mol Lt
-1
)
b = tebal larutan (cm)
A = absorban
Absorbtivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada
konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorbtivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang
gelombang radiasi. Satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c
dalam molar (M) maka absorbtivitas disebut absorptivitas molar yang disimbolkan
dengan ε dengan satuan M
-1
cm-
1
atau liter.mol
-1
cm
-1
. Jika c dinyatakan dengan
persen berat/volume (g/100ml) maka absorbtivitas dapat ditulis dengan ˗
1 cm
1%
dan
seringkali ditulis dengan ˓
1 cm
1%
.
Hubungan antara nilai ˗
1 cm
1%
dengan absorbtivitas molar (ε) adalah sebagai
berikut :
e = ˗
1 cm
1%
×
BM
10

Pada Hukum Lambert-Beer ada beberapa pembatasan yaitu :
1. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
2. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai yang
mempunyai penampang luas sama
3. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak bergantung
terhadap yang lain dalam larutan tersebut
4. Tidak terjadi peristiwa fluoresensi dan sosforisensi
Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis da[at digolongkan
atas 3 macam pelaksanaan, yaitu :
- Analisis kuantitatif zat tunggal (satu komponen)
Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan pengukuran harga A pada panjang
gelombang maksimum atau dilakukan pengukuran %T pada panjang
gelombang minimum. Alasan dilakukan pengukuran pada panjang gelombang
minimum adalah perubahan absorban untuk setiap satuan konsentrasi
adalah paling besar pada panjang gelombang maksimum, sehingga akan
diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Disamping itu pita serapan di
sekitar panjang gelombang maksimal datar dan pengukuran ulang dengan
kesalahan yang kecil dengan demikian akan memenuhi hukum Lambert-Beer.
Ada 4 cara pelaksanaan analisis kuantitatif zat tunggal.
Pertama. Dengan mebandingkan absorban atau persen transmitan yang
dianalisis dengan reference standard pada panjang gelombang maksimal.
Persyaratannya pembacaan nilai absorban sampel dan reference standard
tidak jauh berbeda.
Kedua. Dengan memakai kurfa baku dari reference standard dengan pelarut
tertentu pada panjang gelombang maksimum. Dibuat grafik sistem koordinat
Cartesian dimana sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah
konsentrasi.
Ketiga. Dengan jalan menghitung absorbansi larutan sampel (˗
1 cm
1%
, λ
max
)
pada pelarut tertentu dan dibandingkan dengan absorbansi zat yang
dianalisis yang terterap pada buku resmi.
Keempat. Dengan memakai perhitungan nilai ekstingsi molar (absorbansi
molar ε) sama dengan cara yang ketiga hanya saja pada perhitungan
absorbansi molar lebih tepat karena melibatkan massa molekul relati (Mr).
e = ˗
1 cm
1%
× Hr. ŵŴ
-1


- Analisis kuantitatif zat campuran (dua komponen)
Bila diinginkan pengukuran 2 buah senyawa secara bersamaan secara
spektrofotometri maka dapat dilakukan pada panjang gelombang yang mana
masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan dari
kompinen yang lain paling kecil. Dua buah kromofor yang berbeda akan
mempunyai kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pula pada satu daerah
panjang gelombang. Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan pada
dua panjang gelombang, sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara
absorbansi dengan konsentrasi masing-masing komponen dapat dihitung.
Pengukuran campuran 2 senyawa dilakukan baik pada panjang gelombang 1
dan panjang gelombbang 2, oleh karena itu absorbansi senyawa 1 dan
absorbansi senyawa 2 dapat dihitung secara matematis dengan menggunakan
persamaan :
A
λ1
= (a
1
c
1
)
λ1
+ (a
2
c
2
)
λ1
A
λ2
= (a
1
c
1
)
λ2
+ (a
2
c
2
)
λ2


- Analisis kuantitatif zat 3 campuran atau lebih (multi komponen)
Prinsip analisis 3 komponen atau lebih (multikomponen) dengan metode
spektrofotometer UV-Vis adalah kalibrasi tiap-tiap komponen dengan
menggunakan larutan standar. Dikenal dua macam larutan standar yaitu larutan
standar murni (pure standard) dan larutan standar campuran (mixed standard).
Proses perhitungannya ada dua macam yaitu cara konvensional dan cara
modern tergantung pada instrumen yang digunakan.

D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Spektrofotometer merupakan gabungan
dari alat optik dan elektronika serta sifat-sifat kimia fisiknya dimana detektor yang
digunakan secara langsung dapat mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan
(It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia), jadi tergantung pada
spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna
terbentuk.
Dilihat dari sistem optiknya spektrofotometer dapat digolongkan dalam 3
macam yaitu :
Sistem optik radiasi berkas tunggal (single beam)
Sistem optik radiasi berkas ganda (double beam)
Sistem optik radiasi berkas terpisah (splitter beam)

Secara umum skema dari intrumentasi spektrofotometer UV-Vis adalah sebagai
berikut :

Spektrofotometer UV-Vis berkas tunggal (single beam)

Spektrofotometer UV-Vis berkas ganda (double beam)

Komponen utama dari spektrofotometer UV-Vis adalah :
Sumber sinar
Sumber sinar yang umumnya digunakan ada 2 tipe yaitu hydrogen atau
deuterium discharge lamp dan incandescent filament lamp. Namun ada
juga yang menggunakan lampu wolfram atau tungsten lamp.
1. Lampu wolfram / tungstent lamp
Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang
gelombang (l ) adalah 350-2200 nm. Di bawah kira-kira 350 nm,
keluaran lampu wolfram itu tidak memadai untuk
spektrofotometer dan harus digunakan sumber yang berbeda.
2. Lampu deuterium / lampu hidrogen
Lampu ini mengeluarkan cahaya padapanjang gelombang 200 –
360 nm. Terdiri dari semacam tabung yang didalamnya terdapat
anoda dan katoda. Tabung tersebut berisikan gas hidrogen atau
deuterium pada tekanan rendah sekitar 5 torr. Cahaya yang
dihasilkan oleh lampu deuterium 3 – 5 kali lebih terang dari
lampu hidrogen.
3. Incandescent filament lamp
Umumnya digunakan sebagai sumber sinar tampak. Pada
dasarnya terdiri dari logam filamen pijar biasanya tungsten yang
terbungkus dengan glass envelope. Hanya 15 % dari sinar yang
dihasilkan merupakan daerah sinar tampak. Sebagian besar
merupakan daerah sinar inframerah.
Monokromator
Monokromator merupakan suatu alat yang berfungsi untuk
mendispersikan sinar dari sinar polikromatik menjadi sinar
monokromatik. Ada dua macam tipe monokromator yaitu
monokromator prisma dan monokromator gratting (kisi difraksi).
o Monokromator prisma

o Monokromator gratting


Keuntungan menggunakan kisi difraksi :
- Dispersi sinar merata
- Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
- Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum
Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu
yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang
disebut slit. Ketelitian dari monokromator dipengaruhi juga oleh lebar
celah (slit width) yang dipakai.

Slit atau celah
Celah monokromator merupakan bagian pertama dan terakhir dari suatu
sistem optik monokromator pada spektrofotometer UV-Vis. Elah dibuat
dari logam yang kedua ujungnya diasah dengan cermat sehingga sama.
Lebar celah masuk dan lebar celah keluar harus sama yang dapat diatur
dengan memutar tombol mekanik atau diatur dengan sistem elektronik.

Filter optik
Filter optik berfungsi sebagai penyerap warn komplementer sehingga
sinar tampak yang diteruskan merupakan cahaya berwarna sesuai
dengan warna filter optik yang digunakan. Filter optik yang banyak
digunakan terdiri dari kaca berwarna. Dengan adanya filter optik sebagai
bagian dari monokromator akan dihasilkan pita cahaya sangat sempit
sehingga kepekaan analisisnya lebih tinggi. Dan lebih dari itu akan
mendapatkan cahaya yang hampir monokromatis sehingga memenuhi
hukum Lambert-Beer.

Cuvet
Merupakan sel sampel atau wadah sampel yang akan dianalisis. Ditinjau
dari pemakaiannya kuvet ada dua macam yaitu kuvet yang permanen
yang terbuat dari bahan gelas atau leburan silika dan kuvet disposible
untuk satu kali pemakaian yang terbuat dari teflon atau plastik. Untuk
sampel uap gas disediakan kuvet khusus yang tertutup rapat dengan
bentuk segi empat panjang dan silindris.

Detector
Merupakan salah satu bagian dari spektrofotometer UV-Vis yang penting.
Oleh sebab itu kualitas detektor akan menetukan kualitas
spektrofotometer UV-Vis. Fungsinya di dalam spektrofotometer UV-Vis
adalah mengubah sinyal radiasi yang diterima menjadi sinyal elektronik.
Adapun persyaratan detektor yang baik adalah sebagai berikut :
1) Harus mempunyai kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang
diterima, namun harus memberikan derau atau noise yang sangat
kecil
2) Harus mempunyai kemampuan untuk memberikan respon
terhadap radiasi pada daerah panjang gelombang yang lebar (UV-
Vis)
3) Harus memberikan respon radiasi dalam waktu yang serempak
4) Harus memberikan jaminan terhadap respon kuantitatif dan
sinyal radiasi yang diterima
5) Sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor harus dapat
diamplifikasikan oleh amplifier ke rekorder.
Macam-macam detektor yang digunakan ada 4 yaitu :
1) Detektor fotosel
2) Detektor foton tabung hampa
3) Detektor tabung penggandaan foton (Photomultiplier Tube)
4) Detektor Photo Diode-Array, yang merupakan detektor
dengan teknologi modern.
Amplifier
Berfungsi sebagai penguat sinyal elektronik yang diteruskan oleh
detektor.
Display / read out
Berfungsi untuk menampilkan spektrum hasil pengukuran dengan
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Biasanya dibantu
dengan suatu perangkat lunak (software) sehingga dapat muncul
spektrum dari zat yang dianalisis.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM
Pengukuran dilakukan biasanya dengan melarutkan sampel dengan pelarutnya.
Perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut. Spektrofotometer UV-Vis dapat
digunakan untuk menganalisis sampel berbentuk gas, padat dan larutan. Untuk
sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan dalam hal pemilihan larutan. Ada
beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam pemilihan pelarut diantaranya :
Pelarut yang dipakai tidak mengandung ikatan rangkap terkonjugasi pada
struktur molekulnya dan tidak berwarna.
Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang akan dianalisis
Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis
Pada umumnya pelarut yang sering digunakan adalah air, etano, sikloheksan
dan isopropanol. Namun perlu diperhatikan kembali bahwa absorpsi pelarut yang
dipakai di daerah UV-Vis. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah polaritan pelarut
yang dipakai karena akan sangat berpengaruh terhadap pergeseran spektrum
molekul yang dianalisis. Untuk pengamatan absorban radiasi elektromagnetik oleh
molekul pada rentang pembacaan yang memenuhi syarat maka larutan yang diamati
harus dibiat sangat kecil kadarnya. Biasanya untuk pengamatan larutan kadar
diamati berkisar 2,5 – 50 ppm.

SPEKTROFOTOMETER INFRARED (IR)
A. PRINSIP
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi
infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri
adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-
1000μm.
Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang pada Tabel 1 dan Gambar 2,
sinar infra merah dibagi atas tiga daerah, yaitu:
1. Daerah Infra Merah dekat.
2. Daerah Infra Merah pertengahan.
3. Daerah infra merah jauh
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun
biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik.
Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu
gugus fungsi spesifik.
Dasar Spektroskopi Infra Merah dikemukakan oleh Hooke dan didasarkan atas
senyawa yang terdiri atas dua atom atau diatom yang digambarkan dengan dua
buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti tampak pada gambar disamping ini.
Jika pegas direntangkan atau ditekan pada jarak keseimbangan tersebut maka energi
potensial dari sistim tersebut akan naik.
Setiap senyawa pada keadaan tertentu telah mempunyai tiga macam gerak, yaitu :
1. Gerak Translasi, yaitu perpindahan dari satu titik ke titik lain.
2. Gerak Rotasi, yaitu berputar pada porosnya, dan
3. Gerak Vibrasi, yaitu bergetar pada tempatnya.
Bila ikatan bergetar, maka energi vibrasi secara terus menerus dan secara
periodik berubah dari energi kinetik ke energi potensial dan sebaiknya. Jumlah
energi total adalah sebanding dengan frekwensi vibrasi dan tetapan gaya ( k ) dari
pegas dan massa ( m
1
dan m
2
) dari dua atom yang terikat. Energi yang dimiliki oleh
sinar infra merah hanya cukup kuat untuk mengadakan perubahan vibrasi.
Prinsip dari spektrofotometer IR adalah ketika suatu molekul dari suatu senyawa
diberikan energi radiasi inframerah, maka molekul tersebut akan mengalami vibrasi
dengan syarat energi yang diberikan terhadap molekul cukup untuk mengalami
vibrasi. Macam macam vibrasi ada 2 yaitu ada vibrasi regangan atai sterching dan
vibrasi bending. Vibrasi streching ada dua tipe yaitu streching asimetris dan streching
simetris. Perbedaannya, streching simetris merupakan perubahan panjang ikatan
menjadi lebih panjang atau lebih pendek namun tidak menyebabkan perubahan
momen dipol (momen dipol 0) sehingga tidak IR aktif.


Streching bending merupakan perubahan sudut ikatan yang pasti menyebabkan
perubahan momen dipol sehingga IR aktif. Ada 4 tipe vibrasi bending yaitu vibrasi
goyangan (rocking), vibrasi guntingan (scissoring), vibrasi pelintiran (twisting), dan
vibrasi kibasan (wagging).


B. PARAMETER KUALITATIF
Spektrofotometer IR dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa.
Yang menjadi parameter kualitatif pada spektrofotometer IR adalah bilangan
gelombang dimana muncul gugus fungsi yang khas dari suatu senyawa. Namun jika
hanya daerah gugus fungsi saja tidak dapat digunakan untuk menganalisis identitas
senyawa. Ada daerah lain yang dinamakan daerah sidik jari atau dikenal sebagai
finger print region. Daerah finger print ini untuk setiap senyawa tidak akan ada yang
sama sehingga merupakan identias dari suatu senyawa.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Spektrofotometer IR dapat digunakan dalam analisis secara kuantitatif jika
dihubungkan atau dilanjutkan analisis dengan bantuan dari instrumentasi lain
misalnya GC-MS, MS, dan sebagainya. Biasanya spektrosfotometer IR digunakan
sebagai analisis kuantitatif yaitu dalam menentukan indeks kemurnian yaitu
seberapa besarkah sampel yang dianalisis jika spektrum IR sampel dibandingkan
dengan spektrum IR baku pembanding atau reference standard dari sampel yang
dianalisis.



D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA
Ada dua tipe instrumentasi spektrofotometer infra merah yaitu tipe Dispersive
spectrophotometer dan multiplexing spectrophotometer atau disebut juga dengan
Fourier Transform Infrared (FTIR).
Dispersive spectrophotometer. Monokromator yang digunakan mirip dengan
monokromator yang digunakan oleh spektrofotometer UV-Vis tipe berkas ganda
atau double beam. Biasanya digunakan secara primer unruk menganalisis senyawa
secara kualitatif. Detektor yang digunakan adalah tipe thermal transducer.
Responnya lambat sehingga sinar harus dipotong-potong terlebih dahulu oleh
chopper. Sistemnya double bead, karena ada beberapa hal yaitu :
Untuk mengurangi radiasi atmosferik (CO2 dan H2O)
Mencegah ketidakstabilan radiasi sinar infra merah
Mengurangi radiasi percikan oleh partikel pengotor atau debu di dalam
spektrofotometer infra merah
Memungkinkan pembacaan dan perekaman langsung
Mekanisme kerja. Sinar radiasi IR sebelum menembus sampel dan refrence
displit terlebih dahulu supaya pembacaan tidak lama. Setelah sinar IR displit, sinar
terbagi menjadi dua arus, yaitu sinar yang menuju sampel dan sinar yang menuju
larutan baku pembanding. Kemudian kedua berkas sinar tersebut masuk ke chopper
sehingga keluar output sinar yang diteruskan ke monokromator. Sinar masuk melalui
celah masuk atau entrance pada monokromator. Didalamnya terdapat gratting dan
sinar difokuskan oleh gratting. Setelah itu sinar keluar melalui celah keluar atau
extrance slit dan masuk ke alat scan frekuensi baru diteruskan ke detector. Oleh
detector sinar diubah menjadi sinyal elektrik dan diperkuat oleh amplifier. Kemudian
sinyal tersebut diinterpretasikan dalam bentuk spektrum infra merah dengan
bantuan perangkat lunak dalam komputer.
Fourier Transform Infra Red. Spektrofotometer iR ada beberapa kelemahan
yang telah disebutkan sebelumnya. Untuk mengatasi kelemahan tersebut perlu
adanya pengembangan pada sistem optiknya. Perkembangan spektrofotometer IR
yang paling modern adalah FTIR. Dasar pemikiran FT-IR adalah deret persamaan
gelombang yang dirumuskan oleh Jean Baptise Fourier yang membuat persamaan
matematika gelombang elektronik :
o
0
+ o
1
cos æˮ + b
1
sinæˮ + o
2
cosŶæˮ + b
2
s˩nŶæˮ
Dimana :
a , b = suatu bilangan
t = waktu
ω = frekuensi sudut
FT-IR ini menggunakan suatu monokromator yang berbeda denga
monokromator pada spektrofotometer IR tipe dispersive. Monokromator yang
digunakan adalah monokromator Michelson Interferometer. Pada sistem optik ini
terdapat 2 cermin yaitu cermin yan g bergerak tegak lurus dan cermin diam. Skema
sistem optik ini seperti pada gambar dibawah :

Michelson Interferometer
Kelebihan dari FT-IR adalah :
Respon cepat
Sinar mengalami perubahab dahulu baru masuk ke sampel
Lebih bagus dari spektrofotometer IR dispersive
Lebih sensitif
Sinar radiasi infra merah tidak mengganggu atau tidak terganggu
Menggunakan monokromator Pyroelectric transducer.

Instrumentasi spektrofotometer infra merah mirip dengan instrumentasi
spektrofotometer UV-Vis. Perbedaannya adalah sampel berhadapan langsung
dengan sumber radiasi.
Secara berurutan, komponen utama dari spektrofotometer infra merah adalah
sebagai berikut :
Sumber radiasi
Sampel kompartemen
Monokromator
Detector
Amplifier atau penguat
Recorder / read out
Sumber radiasi. Prinsipnya sumber radiasi IR dipancarkan oleh padatan
lembam yang dipanaskan sampai pijar dengan aliran listrik. Ada 3 macam sumber
radiasi yaitu :
1. Globar source : tabung silica carbida dengan ukurandiameter 5mm dan
panjang 5cm
2. Nernst Glower : senyawa-senyawa oksida
3. Tungsten Filament Lamp : untuk analisis dengan nir-IR
4. Incandescent Wire : merupakan lilitan kawat nikrom.
Sampel kompartemen. Cuplikan atau sampel yang dianalisis dapat berupa
cairan, padatan atau pun gas. Karena energi vibrasi tidak terlalu besar sampel dapat
diletakan langsung berhadapan dengan sumber radiasi IR. Karena gelas kuarsa atau
mortar yang terbuat dari porselene dapat memberikan kontaminasi yang menyerap
radiasi IR, maka pemakaian alat tersebut harus dihindari. Preparasi cuplikan harus
menggunakan mortar yang terbuat dari batu agate dan pengempaan dilakukan
dengan menggunakan logam monel.
Monokromator. Fungsinya sama dengan monokromator [ada
spektrofotometer UV-Vis. Hanya saja monokromator dalam spektrofotometer IR
tidak terbuat dari kuarsa atau leburan silika tetapi terbuat dari garam NaCl, KBr,
CsBr, atau LiF. Oleh sebab itu spektrofotometer IR harus diletakkan di suatu tempat
dengan kelembaban yang rendah untuk mencegah kerusakan pada peralatan
optiknya.
Ada dua macam monokromator dengan fungsi berbeda yang sama fungsinya
dengan monokromator spektrofotometer UV-Vis. Monokromator celah berfungsi
untuk lebih memurnikan radiasi IR yang drai cuplikan sehingga masuk ke dalam
rentang bilangan gelombang yang dikehendaki. Monokromator prisma yang terbuat
dari bahan garam anorganik berfungsi sebagai pengurai dan pengarah radiasi IR
menuju detektor. Monokromator prisma terbuat dari hablur NaCl yang paling banyak
digunakan sebab memberikan resolusi radiasi IR terbaik dibandingkan dengan yang
lainnya. Prisma leburan garam-garam bromida pada umumnya dipakai sebagai
resolusi radiasi IR jauh sedangkan garam fluorida untuk radiasi sinar IR dekat.
Monokromator yang umum digunakan adalah monokromtor kisi difraksi atau
gratting. Kisi difraksi terbuat dari bahan gelas atau palstik yang tertoreh dengan
halus permukaannya dan terlapisi oleh kondensasi uap aluminium. Jenis
monokrotaor kisi difraksi sudah banyak digunakan pada spektrofotometer IR yang
modern. Keunggulannya memberikan resolusi yang lebih bagus dengan dispersi yang
surambung lurus, disamping itu tetap menjaga keutuhan radiasi IR menuju detektor.
Kelemahannya adalah timbulnya percikan radiasi IR pada monokromator kisi difraksi.
Hal ini diusahakan dengan memakai monokromator ganda yang merupakan
kombinasi dari monokromator prisma dan monokromator kisi difraksi.
Detector. Berfungsi mengubah sinyal radiasi IR menjadi sinyal listrik. Selain itu
detektor dapat mendeteksi adanya perubahan panas yang terjadi karena adanya
pergerakan molekul. Detektor spelktrofotometer yang bersifat menggandakan
elektron tidak dapat dipakai pada spektrofotometer IR sebab radiasi IR sanngat
lemah dan tidak dapat melepaskan elektron dari katoda yang ada pada sistem
detektor. Ada tiga tipe detektor yang dapat digunakan pada spektrofotometer IR,
yaitu :
Thermal transducer : terdiri dari dua logam bercabang dimana suhu
tergantung pada potensialnya. Intrumen yang menggunakan detektor ini
harus disimpan pada tempat yang ber-AC atau bersuhu konstan karena dapat
dipengaruhi oleh suhu sehingga dapat terjadi kesalahan dalam mendeteksi
suatu senyawa. Responnya lambat sehingga jarang digunakan.
Pyroelectric transducer : berupa kristal cairan dari triglisin sulfat (TGS) dimana
temperatur dipengaruhi oleh polaritas senyawa. Memiliki respon yang cepat
dalam menganalisis suatu senyawa.
Photoconducting transducer : terbuat dari bahan semikonduktor seperti
timbal sulfida, eaksa telurida, dan cadmium telurida, indium antimonida.
Harus menggunakan pendingin gas nitrogen sehingga responnya cepat.
Amplifier/penguat dan read out. Penguat dalam sistem optik
spektrofotometer IR sangat diperlukan karena sinyal radiasi IR sangat kecil atau
lemah. Penguat berhubungan erat dengan derau instrumen serta celah
monokromator, jadi keduanya harus diselaraskan dengan tujuan mendapatkan
resolusi puncak spektrum yang baik dengan derau maksimal. Sedangkan pencatat
atau read out harus mampu mengamati spektrum IR secara keseluruhan pada setiap
frekuensi dengan seimbang. Rentang bilangan gelombang 4000cm-1 sampai 650cm-
1 dalam keadaan normal harus dapat teramati dalam selang waktu 10 – 15 menit.
Untuk maksud pengamatan pendahuluan selang waktu tersebut dapat dipersingkat
ataupun diperlambat untuk mendapatkan hasil resolusi puncak spektrum IR yang
baik.
E. PENGUKURAN SECARA UMUM
Pengukuran dengan spektrofotometer infra merah bisa mengukur sambel
berwujud gas, padatan dan cairan atau larutan. Untuk setiap wujud sampel berbeda
cara preparasi sampelnya.
Sampel padatan. Ada 4 cara preparasi sampel yaitu :
Sampel dicampur dalam mortir agate dengan menambahkan mulling
agent (mulling agent : paraffin atau cairan nujol) kemudian diteteskan
pada plat garam KBr atau NaCl dan diukur.
Sejumlah sampel digerus dan dicampur dengan garam murni (KBr atau
NaCl) di dalam mortir agate kemudian dicetak penjadi plat KBr atau plat
NaCl dan ditempatkan dalam plat sampel dan diukur.
Menggunakan Cast Film Technique. Biasanya untuk sampel berbentuk
polimer. Sampel dilarutkan dengan pelarutnya yang bersifat
nonhigroskopis kemudian diteteskan pada plat garam setelah itu
pelarut diuapkan dan dikeringkan kemudian diukur. Dalam preparasi
sampel harus setipis mungkin karena jika terlalu tebal sinar infra merah
tidak dapat menembus sampel sehingga tidak dapat terukur atau
teranalisis.
Sampel bisa dipotong-potong sampai ukurannya cukup pada plat
sampel kemudian langsung diukur.
Sampel berwujud gas. Sampel biasanya ditempatkan dalam suatu tabung
tertutupdengan panjang seku=itar 5 – 10 cm. Untuk sampel gas umumnya tidak
murni dan memiliki kemampuan adsorben yang lemah.
Sampel berwujud cairan atau larutan. Sampel cairan atau larutan dimasukkan
ke dalam plat berbentuk bulat kemudian ditambahkan garam murni KBr atau NaCl
yang sudah dicampurkan oleh sedikit sampel, kemudian disimpan dalam plat sampel
dan diukur.
Dalam preparasi sampel dipilih garam murni NaCl atau KBr karena
spektrofotometer infra merah merupakan senyawa ionik yang memiliki energi yang
digunakan untuk bervibrasi sangat tinggi dan energi radiasi sinar infra merah tidak
akan cukup kuat untuk menyebabkan molekul garam tersebut untuk bervibrasi.
Akibatnya tidak akan muncul peak dari garam tersebut di daerah inframerah
sehingga tidak akan mengganggu proses analisis senyawa.

KROMATOGRAFI (GC, TLC, HPLC)
TLC (Thin Layer Chromatography)
A. PRINSIP
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan
melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat
dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang
berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan
berdasarkan pergerakan pada kolom. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan
campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-
masing komponen. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan
fasa stasioner (padatan atau cairan). Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung
satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa
mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen
dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara
fasa mobil dan fasa diam (stationer).
Prinsip pemisahannya berdasarkan prinsip adsorpsi yaitu penyerapan sebagian
komponen sampel pada fasa diam berdasarkan kepolaran komponen sampel.

B. PARAMETER KUALITATIF
Parameter kualitatifnya adalah nilai Rf dari tiap senyawa yang dibandingkan
dengan nilai Rf senyawa baku. Jika warna spot, Rf nya sama dengan baku, maka
sampel yang dianalisis mempunyai identitas yang sama dengan baku pembanding.
Untuk menghitung nilai Rf adalah sebagai berikut :




C. PARAMETER KUANTITATIF
Untuk analisis kuantitatif tidak bisa hanya dengan menggunakan KLT saja,
namun perlu dilengkapi beberapa langkah.
menggunakkan kromatografi preparatif. Setelah mengembangkan dan dikeringkan
bagian spot pada fase diam (misalnya silica gel) dikerok kemudian dimasukkan ke
dalam wadah. Penentuan kadar dapat dilakukan dengan metode spe
UV-Vis, dan bisa juga dengan HPLC, Spektrofotometer Inframerah dengan syarat
harus ada baku pembanding dari senyawa yang dianalisis.

D. INSTRUMENTASI
Semua kromatografi memiliki
kombinasi cairan-padatan) dan
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen
dalam campuran. Komponen
berbeda.
Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi
lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan
pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM
Kromatogram pada KLT merupakan noda
dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda
kromatoram yang mengabsorpsi radiasi ultraviolet
radiasi ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.
Pada adsorban yang berfluoresensi maka noda akan tampak sebagai
pemadaman fluoresensi. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan
kromatogran dengan perea

PARAMETER KUANTITATIF
Untuk analisis kuantitatif tidak bisa hanya dengan menggunakan KLT saja,
namun perlu dilengkapi beberapa langkah. Untuk analisis kuantitatif, biasanya
menggunakkan kromatografi preparatif. Setelah mengembangkan dan dikeringkan
bagian spot pada fase diam (misalnya silica gel) dikerok kemudian dimasukkan ke
dalam wadah. Penentuan kadar dapat dilakukan dengan metode spe
Vis, dan bisa juga dengan HPLC, Spektrofotometer Inframerah dengan syarat
harus ada baku pembanding dari senyawa yang dianalisis.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau
padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak
mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat
dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi
lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan
mpuran pelarut yang sesuai.
PENGUKURAN SECARA UMUM
Kromatogram pada KLT merupakan noda-noda yang terpisah setelah visualitas
dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda
kromatoram yang mengabsorpsi radiasi ultraviolet atau berfluoresensi dengan
radiasi ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm.
Pada adsorban yang berfluoresensi maka noda akan tampak sebagai
pemadaman fluoresensi. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan
kromatogran dengan pereaksi warna atau fluoresensi yang spesifik. Visualisasi cara

Untuk analisis kuantitatif tidak bisa hanya dengan menggunakan KLT saja,
Untuk analisis kuantitatif, biasanya
menggunakkan kromatografi preparatif. Setelah mengembangkan dan dikeringkan
bagian spot pada fase diam (misalnya silica gel) dikerok kemudian dimasukkan ke
dalam wadah. Penentuan kadar dapat dilakukan dengan metode spektrofotometer
Vis, dan bisa juga dengan HPLC, Spektrofotometer Inframerah dengan syarat
(dapat berupa padatan, atau
(berupa cairan atau gas). Fase gerak
komponen yang terdapat
komponen yang berbeda bergerak pada laju yang
Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi
lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour
dalam sinar ultra violet, alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan
noda yang terpisah setelah visualitas
dengan cara fisika atau kimia. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda
atau berfluoresensi dengan
Pada adsorban yang berfluoresensi maka noda akan tampak sebagai
pemadaman fluoresensi. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan
ksi warna atau fluoresensi yang spesifik. Visualisasi cara
kimia ini dilakukan dengan cara penyemprotan dengan atomizer atau memberikan
uap zat kimia pada kromatoram atau dengan cara pencelupan ke dalam pereaksi
penampak warna atau penampak bercak.
Perlu diperhatikan bahwa penyemprotan dengan pereaksi kimia ini diusahakan
jangan sampai merusak lapisan adsorban pada pelat dan diusahakan warna
kromatogram yang cukup stabil dalam jangka waktu lama.


GC (Gas Chromatography)
A. PRINSIP
Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan campuran senyawa
berdasarkan prinsip adsorpsi dan prinsip partisi. Prinsip partisi adalah dimana suatu
senyawa yang akan dipisahkan dengan kromatografi gas bersifat volatile atau mudah
menguap. Proses pemisahan terjadi karena adanya kesetimbangan konsentrasi
sampel dalam fasa diam dan pasa gerak. Sistem adsorpsi pada fase diap padan atau
gas solid chromatography. Pemisahan bisa terjadi akibat perbedaan titik didih, titik
cair, atau perbedaan titik leleh.
Faktor kritis dalam proses pemisahan dengan menggunakan instrumen
kromatografi gas adalah resolusi, kecepatan, dan kapasitas sampel.

B. PARAMETER KUALITATIF
Parameter analisis kualitatif dari kromatografi gas sama halnya dengan tipe
kromatografi lainnya yaitu waktu retensi senyawa. Waktu retensi senyawa
merupakan waktu yang dibutuhkan oleh suatu senyawa keluar melewati kolom
kromatografi pada kondisi kromatografi yang sama. Setiap senyawa memiliki waktu
retensi yang berbeda-beda.

C. PARAMETER KUANTITATIF
Selain parameter analisis kualitatif, kromatografi gas memiliki parameter
analisis kuantitatif. Parameter tersebut ada dua yaitu tinggi puncak kromatogram
dari senyawa yang dianalisis dan luas area di bawah kurva atau kromatogram (AUC).
Parameter ini berguna pada saat penentuan kadar dari suatu sampel.
Dalam kromatografi gas ada faktor kritis yaitu :
1. Kapasitas sampel
2. Kecepatan alir
3. Resolusi

D. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA
Instrumentasi dari gas chromatography atau kromatografi gas umumnya
adalah sebagai berikut :
Mobile phase tank (tanki fase gerak)
Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi gas adalah berwujud gas.
Syaratnya adalah gas yang digunakan sebagai fase gerak harus bersifat inert,
memiliki tekanan inlet 10 – 50 psi lebih besar dari tekanan kamar,
kecepatan alirnya 25 – 150 ml/menit untuk kolom pack dan 1-25 ml/menit
untuk kolom kapiler. Umumnya gas yang digunakan sebagai pembawa
adalah gas helium. Adapun gas yang dapat digunakan sebagai fase gerak
adalah Ar, N
2
,H
2
, dan O
2
.
Injektor sampel
Injektor sampel berfungsi intuk menginjeksikan sampel ke dalam tempat
sampel. Injektor sampel berupa microsyringes. Digunakan microsyringes
karena sampel yang disuntukkan harus sedikit mungkin karena jika terlalu
banyak akan menurunkan efisiensi kolom. Efisiensi kolom dipengaruhi oleh
banyaknya sampel yang diinjeksikan. Untuk kolom pack sampel diijeksikan
sebanyak 20µL dan untuk kolom kapiler 100 kali lebih besar dari kolom
pack. Ijeksi sampel harus cepat karena jika injeksi sampel lambat maka akan
terjadi injeksi sampel yang berlebihan sehingga menyebabkan band
spreading atau pelebaran kromatogram dan pemisahan menjadi buruk.
Syringe menginjeksikan sampel ke dalam vaporization chamber. Proses
penguapan sampel terjadi pada suhu 280oC. Injektor ada 2 tipe yaitu tipe
splitless (100 : 90) dan tipe split (100 : 1).

Oven
Digunakan untuk mengontrol suhu. Ada dua sistem pengaturan suhu, yaitu
o Sistem isotermal : dalam satu kali running alat atau melakukan
pemisahan sisten diatur hanya menggunakan 1 suhu saja.
o Sistem gradien : dalam satu kali running alat atau satu kali proses
pemisahan suhu dinaikan secara bertahap.

Kolom
Kolom merupakan bagian paling penting dalam kromatografi kolom
termasuk kromatografi gas karena di dalam kolomlah proses pemisahan
campuran senyawa terjadi. Umumnya terbuat dari bahan teflon, stainless
steel, silica, gelas. Ukuran bervariasi, diameter antara 10 – 30 cm, dan
dilengkapi dengan termostat. Secara umum kolom kromatografi dibagi
mejadi 2 tipe yaitu :
1. Kolom terpacking (packed column)
Ukuran maksimal 5m. Kolom terlapisi alumina, fire bricket.
Keuntungannya adalah kapasitas besar, namun kelemahannya
adalah resolusinya rendah. Panjangnya berkisar 2-50m. Kolom pack
terbuat biasanya dari gelas bersilika. Sifatnya rapuh namun inert
sehingga jika ada zat yang bersifat korosif (misalnya fenol) dalam
sampel tidak diganggu oleh kolom dan kerusakan kolom akan
terlihat (hitam dan pecah-pecah).

2. Kolom terbuka (capillary column)
Ukuran maksimal adalah 100 m. Biasanya terlapisi oleh bahan silika
atau poliamida. Keuntungan dari kolom terbuka adalah memiliki
resolusi yang tinggi. Namun keleemahannya adalah memiliki
kapasitas sampel yang terbatas.
Fase diam yang digunakan dipilih berdasarkan polaritas sampel.
Senuawa polar contohnya Carbowax / PEG 20 M 200
o
C dan DEGS 190
o
C.
Senyawa nonpolar contohnya SE-30 350
o
C, Squalan 100
o
C, dan senyawa
semipolar contohnya OV-17 dan OV-210. Fasediam adalah lemak sehingga
dapat meleleh. Ketika meleleh gas pembawa akan membawa komponen
analit berdasarkan kepolaran.
Detector
Detektor berfungsi untuk mendeteksi senyawa yang keluar melewati kolom
dan mengubah menjadi sinyal elektronik yang dapat dibaca oleh readout
atau data sistem. Pemilihan deektor bergantung pada sneyawa yang akan
dianalisis. Syarat detektor ideal adalah sebagai berikut :
a. Harus memiliki sensitivitas yang tinggi
b. Stabilitas dan reprodusibilitas yang baik
c. Memberikan respon linier terhadap pelarut
d. Mempunyai range suhu antara suhu kamar sampau dengan minimal
400oC
e. Waktu respon yang pendek tidak bergantung pada kecepatan alir
f. Reabilitas tinggi dan mudah digunakan
g. Tidak merusak sampel
h. Memberikan respon yang sama pada semua sampel.
Adapun macam-macam detektor yaitu :
o FID (Flame Ionization Detector), paling umum digunakan di bidang
farmasi. Digunakan untuk mendeteksi semua senyawa termasuk
pelarut.
o FTD (Flame Thermal Detector), untuk senyawa yang mengandung
unsur P dan unsur N
o FPD, untuk menganalisis senyawa pestisida organoposfat karbamat
(senyawa fosfor dan nitrogen sehingga yang akan terdeteksi adalah
senyawa yang mempunyai gugus posfat dan fosfor.
o ECD (Electron Captured Detector), untuk pestisida organoklorin
sehingga tidak boleh menggunakan pelarut kloform atau pelarut lain
yang mengandungf gugus clorin. Pelarut yang biasanya digunakan
adalah DDT. Aldrin, dan dieldrin.
o TCD (Thermal Capture Detector), untuk isolasi senyawa karena dapat
ditampung namun paling tidak sensitif.

Data sistem
Data sistem ini fungsinya sama seperti pada spektrofotometer IR dan
Spektrofotometer UV-Vis. Hanya saja menggunakan perangkat lunak atau
software yang berbeda. Data sistem ini berfungsi untuk
menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari
masing-masing senyawa yang dipisahkan. Selain itu dari data sistem bisa
diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat.

E. PENGUKURAN SECARA UMUM
Seperti yang dijelaskan sebelumnya baha GC digunakan untuk senyawa yang
mudah menguap. Namun ada beberapa senyawa yang kurang stabil jika dalam
keadaan uap atau memiliki sifat atsirinya rendah. Hal ini dapat diatasi dengan
menderivatisasi senyawa yang memiliki sifat atsiri yang rendah sehingga hasil
derivatisasi mempunyai sifat atsiri yang baik. Pada derivatisasi semua gugus fungsi
yang relevan harus dapat terderivat secara kuantitatif dengan cara yang disebut
sililasi, yaitu untuk mengurangi antaraksi dipol-dipol serta menambah keatsirian.
Pereaksi yang banyak digunakan untuk menderivatisasi adalah N,O bis-(trimetilsilil),
trifluoroasetamida, BSTFA, TMCS, TMSDEA. Sebagai contoh gugus polar – OH ,
- COOH, _- NH
2
, =NH, dan - SH dapat diubah dengan gugus silil –O-Si(CH
3
)
3
dengan
pereaksi BSTFA dan BSA.
Dalam menggunakan peralatan GC untuk menganalisis senyawa, instrumen
harus dikondisikan terlebih dahulu supaya komponen penyusun instrumen terutama
kolom tidak rusak. Caranya adalah instrumen dinyalakan sekaligus temperaturnya
diatur harus 30
o
C diatas suhu analisis. Kemudian gas pembawa dinyalakan dan akan
mengalir keluar dari kolom. Instrumen dibiarkan selama 30 menit.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) / KCKT
A. PRINSIP
Maksud dan tujuan analisis dengan mengunakan KCKT adalah hanya ada 2 hal
yaitudidapatkannya pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat. Prinsip
pemisahan dengan menggunakan instrumentasi KCKT adalah berdasarkan prinsip
partisi dimana sampel terbagi atau terpartisi ke dalam dua fase yaitu dalam fase
diam dan dalam fase gerak. Fase gerak berupa larutan dan fase diam dikemas atau
terpacking di dalam kolom. Sebelum melakukan pemisahan instrumentasi di-
running dengan cara membiarkan aliran eluen atau f
proses degassing harus dilakukan untuk menghilangkan gas di dalam kolom karena
jika tidak dihilangkan gasnya maka dapat merusak kolom.

B. PARAMETER ANALISIS
a. ANALISIS KUALITATIF
Parameter kualitatif dari kromatografi cair tekanan
1. Parameter retensi
Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan sampel untuk
keluar dari kolom. Setiap senyawa meiliki waktu retensi yang
berbeda.
Dimana :


2. Efisiensi kolom
Efisiensi kolom padat dihitung dengan metode :


3. Kesimetrisan kromatogram
Dapat ditentukan dengan :
running dengan cara membiarkan aliran eluen atau fase gerak melewati kolom dan
proses degassing harus dilakukan untuk menghilangkan gas di dalam kolom karena
jika tidak dihilangkan gasnya maka dapat merusak kolom.
PARAMETER ANALISIS
ANALISIS KUALITATIF
Parameter kualitatif dari kromatografi cair tekanan tinggi ada 4 yaitu :
Parameter retensi
Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan sampel untuk
keluar dari kolom. Setiap senyawa meiliki waktu retensi yang
berbeda. Parameter retensi dapat dihitung dengan rumus :

Dimana :

Efisiensi kolom
Efisiensi kolom padat dihitung dengan metode :
Kesimetrisan kromatogram
Dapat ditentukan dengan :
ase gerak melewati kolom dan
proses degassing harus dilakukan untuk menghilangkan gas di dalam kolom karena
tinggi ada 4 yaitu :
Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan sampel untuk
keluar dari kolom. Setiap senyawa meiliki waktu retensi yang
Parameter retensi dapat dihitung dengan rumus :


S : Symmetry factor ( T : Tailing factor )
S =
2f
W0.05
f
W0.05
h x 0.05
h
S = 1 : The peak is completely symmetric.
S > 1 : Tailing
S < 1 : Leading

4. Parameter kondisi pemisahan
2. Parameters used in HPLC
Condition for good separation
Rs =
4
1 - 1
1 + k’2
k’2
N
A larger Rs value means a better separation.
1 + k’2
k’2
: Capacity term
increases the retention time
- 1
: Selectivity term
increases the time interval between peaks
N : Column efficiency term
produce narrow peaks

b. ANALISISI KUANTITATIF
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk
penentuan secara kuantitatif adalah:
a) Parameter percobaan sama antara standar dan sampel
b) Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama
c) Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan
menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.
• Berdasarkan area kromatogram
• Berdasarkan tinggi puncak kromatogram
Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.
Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan
banyaknya jenis komponen dalam sample. Sample yang mengandung banyak
komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak.
Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan
menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu
biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang
lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih
dari impuritis.
Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit
mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui
proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan
mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas
mengetahui peak
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah deng
Peak yang mempunyai RT yang sa
akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang
sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan
standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun
bukan berarti RT ya
Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi
suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama aka
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

C. INTRUMENTASI DAN FUNGSINYA
Dibawah ini adalah 5 model kerja den
HPLC atau KCKT mempunyai instrumentasi dengan komponen
sebagai berikut :

• Mobile phase tank
Mobile phase tank merupakan tempat penampungan eluen
akan digunakan sebagai fase gerak. Biasanya terdapat 4 campuran eluen
proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan
mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas ban
mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa)
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling
umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT).
Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya
akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang
sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan
standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun
bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama.
Disinilah para analis biasanya terkecoh.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi
suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
INTRUMENTASI DAN FUNGSINYA
Dibawah ini adalah 5 model kerja dengan menggunakan HPLC :
HPLC atau KCKT mempunyai instrumentasi dengan komponen

Mobile phase tank
Mobile phase tank merupakan tempat penampungan eluen
akan digunakan sebagai fase gerak. Biasanya terdapat 4 campuran eluen
proses pelarutan saja. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan
banyak peak. Untuk
mana yang merupakan milik analat (zat target analisa)
kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Cara yang paling
an melihat Retention time (RT).
ma dengan standard umumnya
akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang
sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan
standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun
ng sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama.
Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi
suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal
n mempunyai spektrum 3D yang juga sama.
Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut
dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.
gan menggunakan HPLC :

HPLC atau KCKT mempunyai instrumentasi dengan komponen-komponen
Mobile phase tank merupakan tempat penampungan eluen-eluen yang
akan digunakan sebagai fase gerak. Biasanya terdapat 4 campuran eluen
yang digunakan yaitu aquabidest, acetonitrile, dapar pH natrium dihidrogen
posfat, dan metanol.
• Solvent delivery
Solvent delivery merupakan tempat pencampuran pelarut-pelarut menjadi
eluen yang homogen.
• Injector
Pemasukkan atau injeksi sampel untuk analisis dengan metode KCKT
merupakan tindakan ilmuwan yang penting. Ada tiga macam injektor yang
biasanya ada pada rangkaian alat KCKT yaitu :
1. Injektordengan memakai diafragma (septum)
2. Injektor tanpa septum
3. Injektor dengan pipa dosis
Untuk analisis kuantitatif yang paling tepat digunakan adalah injektor
dengan pipa dosisb alasannya adalah ketepatan jumlah volume sampel yang
diinjeksikan akan sangat penting untuk analisis kuantitatif dan keadaan ini
hanya dapta diantisipasi denga injektor pipa dosis. Prinsipnya adalah load
injected, ini berarti pada keadaan pertama sampel akan masuk loop dan
akhirnya dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun segera masuk
menuju kolom pemisahan.
• Column
Ini merupakan bagian terpenting dalam instrumen kromatografi. Kolom ini
merupakan tempat terjadinya separasi komponen-komponen sampel yang
akan terjadi di kolom. Oleh karena itu, harus diperhatikan dengan seksama
3 hal berikut yaitu :
1. Pemilihan kolom yang sesuai
2. Pemeliharaan kolom
3. Uji terhadap spesifikasi kolom
FASE KOLOM
Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, maka kolom kromatografi cair
kinerja tinggi dibagi mejadi 2 tipe :
1. Kromatografi fase normal
Kolomnya konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar
misalnya silika gel sedangkan fase geraknya bersifat nonpolar.
2. Kromatografi fase terbalik
Merupakan kebalikan dari fase normal yaitu kromatografi sengan kolom
yang fase diamnya bersifat nonpolar dan fase geraknya bersifat polar.
Biasanya digunakan untuk memisahkan asam-asam lemak rantai panjang
melalui suatu kolom yang terbuat dari bahan karen yang bersifat
nonpolar. Biasanya fase gerak yang digunakan adalah air, metanol, dan
aseton. Untuk mendapatkan fase diam yang nonpolar silika gel
direaksikan dnean klorosilan. Fase diam yang banyak digunakan adalah
jenis C
18
, C
8
dan C
2
.
Keuntungan dengan menggunakan fase terbalik adalah senyawa yang
polar akan lebih baik pemisahannya pada kromatografi sistem ini. Selain
itudapat memisahkan senyawa yang mudah terionkan yang tidak dapat
dipisahkan dengan kromatografi fase normal dapat menggunakan air
sebagai salah satu komponen fase gerak.

• Detector
Detektor pada KCKT memberikan segala informasi kepada kita tentang
segala sesuatu yang diperlukan sehubungan dengan tujuan analisis baik
kuantitatif maupun kualitatif. Detektor yang biasa digunakan dalam
instrumentasi KCKT adalah :
a) Detektor UV-Absorpsi
b) Detektor Flourimetri
c) Detektor refraktive index
d) Detektor elektrokimia
Walaupun yang banyak digunakan adalah detektor UV-Absorpsi maka ada
beberapa kecenderungan yaitu akan ada puncak yang tidak terdeteksi dan
terjadi pergeseran puncak kromatogram. Maka dari itu detektor yang
banyak digunakan adalah detectro UV-Vis Photo Diode Array. Detektor tipe
ini dapat menjamin derau d an pelayangan instrumental yang sangat relatif
kecil sehingga dapat diabaikan. Keistimewaan dari detektor ini adalah :
o Sistem optik tidak menggunakan cermin dan menjamin spektral
purity dan mengabaikan stray radiation
o Hanya ada satu lensa fokus
o Tidak ada pergerakan mekanis sehingga menjamin ketepatan
panjang gelombang penentuan
o Kecepatan deteksinya 300 – 400 kali detektor PMT
o Rentang pengukuran 190 – 600 nm
o Hollografik gratting yang tidak bergerak.
• Oven kolom
Kolom KCKT diletakan di dalam oven untuk menjaga temperatur kolom
supaya stabil (tetap sesuai dengan program). Karena hal ini sangat penting
untuk memperoleh stabilitas dan keterandalan dalam analisis dengan
metode KCKT. Oven kolom yang banyak digunakan adalah dengan sistem
sirkulasi udara panas uang bertekanan. Oven kolom dapat memuat kolom
KCKT sampai 4 kolom sekaligus dengan temperatur kerja sampai 99
o
C.
• Data processor
Data sistem ini fungsinya sama seperti pada GC. Hanya saja menggunakan
pengaturan ynag berbeda. Data sistem ini berfungsi untuk
menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari
masing-masing senyawa yang dipisahkan. Selain itu dari data sistem bisa
diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat. Dengan data processor
kita dapat memperoleh secara langsung data yang diperlukan bisalnya luas
area kromatogram, lebar puncak, tinggi puncak, dan waktu retensi.

• Penampungan akhir
Digunakan untuk menampung eluen yang keluar dari kolom baik pada
proses degassing maupun dalam peroses pemisahan.

D. PENGUKURAN SECARA UMUM
Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis
atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel
loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). Injeksi sampel dapat dilakukan
melalui manual.
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
Cara mengelusi sampel pun harus diperhatikan. Ada dua cara elusi yaitu elusi
gradien dan elusi isokratik. Elusi isokratik dilakukan hanya menggunakan 1
perbandingan konsentrasi eluen dalam satu kali proses pemisahan. Elusi Gradien
didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat
dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan
kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis
gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah
satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat
luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum
yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena
prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari
semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang
menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama
bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak
dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga
data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless).
Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang
sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2).
KEUNTUNGAN MENGANALISIS DENGAN KCKT
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara
lain:
• Waktu analisis cepat
• Resolusi besar
• Sensitivitas detektor
• Kolom yang dapat digunakan kembali
• Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik
• Mudah rekoveri sampel

pelarut dimana kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan (published data). Pada pemeriksaan kemurnian spektrum UV-Vis dilakukan perbandingan kemiripan spektrum UV-Vis zat yang ditentukan dengan refrence sandard dengan melihat harga MF (Match Factor) atau faktor kecocokan sebagaimana dirumuskan : H Dimana : X = absorban spektrum pertama Y = absorban spektrum kedua n = banyaknya tempat penentuan harga MFR = 900 – 1000 menunjukkan bahwakedua spektra identik sedangkan harga MF < 900 menunjukkan bahwa kedua spektra tidak identik. Walaupun kedua spektra UV-Vis identik, belum tenty kedua spektra UV-Vis tersebut diberikan oleh molekul yang sama sebab spektra UV-Vis sangat tidak bergantung pada struktur molekul akan tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi UVVis (struktur elektronik molekul). Pada penentuan panjang gelombang didasarkan atas perhitungan pergeseran panjang gelombang maksimum karena adanya penambahan gugus pada sistem kromofor induk. Ada beberapa macam pergeseran diantaranya : Bathokromik, pergeseran ke panjang gelombang yang lebih tinggi dengan energi yang lebih rendah. • Hypsokromik (pergeseran biru), pergeseran ke panjang gelombang yang lebih pendek. • Hyperkromik, peningkatan absoritivitas molar. • Hypokromik, reduksi absortivitas molar. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang serapan maksimum, yaitu : • Pada panjang gelombang serapan maksimum, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut perubahan absorbansi untuk setiao satuan konsentrasi adalah paling besar • Disekitar panjang gelombang maksimum, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum lambert beer akan terpenuhi • I I . { I I{{$ { I I{ I I I$ . < I$ . F< J J
%{

mol-1cm-1) c = konsentrasi (mol Lt-1) b = tebal larutan (cm) A = absorban Absorbtivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi. Satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. pelarut. struktur molekul. Jika satuan c dalam molar (M) maka absorbtivitas disebut absorptivitas molar yang disimbolkan dengan ε dengan satuan M-1cm-1 atau liter. ketika digunakan panjang gelombang serapan maksimum. tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. dan panjang gelombang radiasi. . Radiasi yang diserap oelh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies penyerap lainnya. Berdasarkan hukum Lambert-Beer. Serapan dapat terjadi jika foton atau radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang dibutuhkan yntuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Absorbtivitas tergantung pada suhu. PARAMETER KUANTITATIF Dalam aspek kuantitatif suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya.• Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemanasan ulang panjang gelombang akan keccil sekali. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya akan tetapi penurunan karena hal ini sangat kecil dibandingkan dengan proses penyerapan. Jika c dinyatakan dengan # persen berat/volume (g/100ml) maka absorbtivitas dapat ditulis dengan # dan # seringkali ditulis dengan # . C. hubungan antara transmitan atau absorban terhadap intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorbsi sebagai : H H J II Dimana : T = persen transmitan Io = intensitas radiasi yang datang It = intensitas radiasi yang diteruskan ε = absorbansi molar (Lt. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang per detik.mol-1cm-1.

# # 0 HJ # Analisis kuantitatif zat campuran (dua komponen) Bila diinginkan pengukuran 2 buah senyawa secara bersamaan secara spektrofotometri maka dapat dilakukan pada panjang gelombang yang mana #" . Dengan memakai kurfa baku dari reference standard dengan pelarut tertentu pada panjang gelombang maksimum. Dengan memakai perhitungan nilai ekstingsi molar (absorbansi molar ε) sama dengan cara yang ketiga hanya saja pada perhitungan absorbansi molar lebih tepat karena melibatkan massa molekul relati (Mr). Persyaratannya pembacaan nilai absorban sampel dan reference standard tidak jauh berbeda. Pertama. Alasan dilakukan pengukuran pada panjang gelombang minimum adalah perubahan absorban untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar pada panjang gelombang maksimum. Keempat. Tidak terjadi peristiwa fluoresensi dan sosforisensi Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis da[at digolongkan atas 3 macam pelaksanaan. Dengan jalan menghitung absorbansi larutan sampel ( # . # Ketiga. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis 2. λmax) pada pelarut tertentu dan dibandingkan dengan absorbansi zat yang dianalisis yang terterap pada buku resmi. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai yang mempunyai penampang luas sama 3.Analisis kuantitatif zat tunggal (satu komponen) Analisis kuantitatif zat tunggal dilakukan pengukuran harga A pada panjang gelombang maksimum atau dilakukan pengukuran %T pada panjang gelombang minimum. Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak bergantung terhadap yang lain dalam larutan tersebut 4. Dibuat grafik sistem koordinat Cartesian dimana sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah konsentrasi.Hubungan antara nilai berikut : # # # # dengan absorbtivitas molar (ε) adalah sebagai 0 Pada Hukum Lambert-Beer ada beberapa pembatasan yaitu : 1. Ada 4 cara pelaksanaan analisis kuantitatif zat tunggal. Dengan mebandingkan absorban atau persen transmitan yang dianalisis dengan reference standard pada panjang gelombang maksimal. yaitu : . Disamping itu pita serapan di sekitar panjang gelombang maksimal datar dan pengukuran ulang dengan kesalahan yang kecil dengan demikian akan memenuhi hukum Lambert-Beer. Kedua. sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal.

D. Pengukuran dilakukan pada masing-masing larutan pada dua panjang gelombang. Proses perhitungannya ada dua macam yaitu cara konvensional dan cara modern tergantung pada instrumen yang digunakan.masing-masing komponen tidak saling mengganggu atau gangguan dari kompinen yang lain paling kecil. Spektrofotometer merupakan gabungan dari alat optik dan elektronika serta sifat-sifat kimia fisiknya dimana detektor yang digunakan secara langsung dapat mengukur intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya yang diabsorbsi (Ia). Dua buah kromofor yang berbeda akan mempunyai kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pula pada satu daerah panjang gelombang. Dilihat dari sistem optiknya spektrofotometer dapat digolongkan dalam 3 macam yaitu : Sistem optik radiasi berkas tunggal (single beam) Sistem optik radiasi berkas ganda (double beam) Sistem optik radiasi berkas terpisah (splitter beam) Secara umum skema dari intrumentasi spektrofotometer UV-Vis adalah sebagai berikut : . oleh karena itu absorbansi senyawa 1 dan absorbansi senyawa 2 dapat dihitung secara matematis dengan menggunakan persamaan : Aλ1 = (a1c1)λ1 + (a2c2) λ1 Aλ2 = (a1c1)λ2 + (a2c2) λ2 Analisis kuantitatif zat 3 campuran atau lebih (multi komponen) Prinsip analisis 3 komponen atau lebih (multikomponen) dengan metode spektrofotometer UV-Vis adalah kalibrasi tiap-tiap komponen dengan menggunakan larutan standar. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. jadi tergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Dikenal dua macam larutan standar yaitu larutan standar murni (pure standard) dan larutan standar campuran (mixed standard). sehingga diperoleh dua persamaan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi masing-masing komponen dapat dihitung. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk. Pengukuran campuran 2 senyawa dilakukan baik pada panjang gelombang 1 dan panjang gelombbang 2.

daerah panjang gelombang (l ) adalah 350-2200 nm. Cahaya yang dihasilkan oleh lampu deuterium 3 – 5 kali lebih terang dari lampu hidrogen. Lampu wolfram / tungstent lamp Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa. 1. Di bawah kira-kira 350 nm. 3. Namun ada juga yang menggunakan lampu wolfram atau tungsten lamp. Terdiri dari semacam tabung yang didalamnya terdapat anoda dan katoda. 2. Pada dasarnya terdiri dari logam filamen pijar biasanya tungsten yang terbungkus dengan glass envelope. Incandescent filament lamp Umumnya digunakan sebagai sumber sinar tampak. .Spektrofotometer UV-Vis berkas tunggal (single beam) Spektrofotometer UV-Vis berkas ganda (double beam) Komponen utama dari spektrofotometer UV-Vis adalah : Sumber sinar Sumber sinar yang umumnya digunakan ada 2 tipe yaitu hydrogen atau deuterium discharge lamp dan incandescent filament lamp. Lampu deuterium / lampu hidrogen Lampu ini mengeluarkan cahaya padapanjang gelombang 200 – 360 nm. Tabung tersebut berisikan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan rendah sekitar 5 torr. Hanya 15 % dari sinar yang dihasilkan merupakan daerah sinar tampak. Sebagian besar merupakan daerah sinar inframerah. keluaran lampu wolfram itu tidak memadai untuk spektrofotometer dan harus digunakan sumber yang berbeda.

Lebar celah masuk dan lebar celah keluar harus sama yang dapat diatur dengan memutar tombol mekanik atau diatur dengan sistem elektronik.Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang disebut slit. Ketelitian dari monokromator dipengaruhi juga oleh lebar celah (slit width) yang dipakai. Slit atau celah Celah monokromator merupakan bagian pertama dan terakhir dari suatu sistem optik monokromator pada spektrofotometer UV-Vis. o Monokromator prisma o Monokromator gratting Keuntungan menggunakan kisi difraksi : .Dispersi sinar merata . Ada dua macam tipe monokromator yaitu monokromator prisma dan monokromator gratting (kisi difraksi).Monokromator Monokromator merupakan suatu alat yang berfungsi untuk mendispersikan sinar dari sinar polikromatik menjadi sinar monokromatik. Elah dibuat dari logam yang kedua ujungnya diasah dengan cermat sehingga sama. Filter optik Filter optik berfungsi sebagai penyerap warn komplementer sehingga sinar tampak yang diteruskan merupakan cahaya berwarna sesuai .Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama .

namun harus memberikan derau atau noise yang sangat kecil 2) Harus mempunyai kemampuan untuk memberikan respon terhadap radiasi pada daerah panjang gelombang yang lebar (UVVis) 3) Harus memberikan respon radiasi dalam waktu yang serempak 4) Harus memberikan jaminan terhadap respon kuantitatif dan sinyal radiasi yang diterima 5) Sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor harus dapat diamplifikasikan oleh amplifier ke rekorder. Detector Merupakan salah satu bagian dari spektrofotometer UV-Vis yang penting. Fungsinya di dalam spektrofotometer UV-Vis adalah mengubah sinyal radiasi yang diterima menjadi sinyal elektronik.dengan warna filter optik yang digunakan. Adapun persyaratan detektor yang baik adalah sebagai berikut : 1) Harus mempunyai kepekaan yang tinggi terhadap radiasi yang diterima. Oleh sebab itu kualitas detektor akan menetukan kualitas spektrofotometer UV-Vis. Filter optik yang banyak digunakan terdiri dari kaca berwarna. Dengan adanya filter optik sebagai bagian dari monokromator akan dihasilkan pita cahaya sangat sempit sehingga kepekaan analisisnya lebih tinggi. . Macam-macam detektor yang digunakan ada 4 yaitu : 1) 2) 3) 4) Amplifier Detektor fotosel Detektor foton tabung hampa Detektor tabung penggandaan foton (Photomultiplier Tube) Detektor Photo Diode-Array. Ditinjau dari pemakaiannya kuvet ada dua macam yaitu kuvet yang permanen yang terbuat dari bahan gelas atau leburan silika dan kuvet disposible untuk satu kali pemakaian yang terbuat dari teflon atau plastik. Cuvet Merupakan sel sampel atau wadah sampel yang akan dianalisis. yang merupakan detektor dengan teknologi modern. Untuk sampel uap gas disediakan kuvet khusus yang tertutup rapat dengan bentuk segi empat panjang dan silindris. Dan lebih dari itu akan mendapatkan cahaya yang hampir monokromatis sehingga memenuhi hukum Lambert-Beer.

PRINSIP Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. dan jauh. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat. 2.5 – 50 ppm. Daerah Infra Merah dekat. Perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senyawa yang akan dianalisis Kemurniannya harus tinggi atau derajat untuk analisis Pada umumnya pelarut yang sering digunakan adalah air. Daerah Infra Merah pertengahan. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah polaritan pelarut yang dipakai karena akan sangat berpengaruh terhadap pergeseran spektrum molekul yang dianalisis. Spektrofotometer UV-Vis dapat digunakan untuk menganalisis sampel berbentuk gas. Namun perlu diperhatikan kembali bahwa absorpsi pelarut yang dipakai di daerah UV-Vis. Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang pada Tabel 1 dan Gambar 2. sikloheksan dan isopropanol. Ada beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam pemilihan pelarut diantaranya : Pelarut yang dipakai tidak mengandung ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak berwarna. etano. Biasanya untuk pengamatan larutan kadar diamati berkisar 2. padat dan larutan. sinar infra merah dibagi atas tiga daerah. E. PENGUKURAN SECARA UMUM Pengukuran dilakukan biasanya dengan melarutkan sampel dengan pelarutnya.51000μm. pertengahan. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.Berfungsi sebagai penguat sinyal elektronik yang diteruskan oleh detektor. 3. Daerah infra merah jauh . SPEKTROFOTOMETER INFRARED (IR) A. Untuk sampel yang berupa larutan perlu diperhatikan dalam hal pemilihan larutan. yaitu: 1. Untuk pengamatan absorban radiasi elektromagnetik oleh molekul pada rentang pembacaan yang memenuhi syarat maka larutan yang diamati harus dibiat sangat kecil kadarnya. Display / read out Berfungsi untuk menampilkan spektrum hasil pengukuran dengan menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis. Biasanya dibantu dengan suatu perangkat lunak (software) sehingga dapat muncul spektrum dari zat yang dianalisis.

maka molekul tersebut akan mengalami vibrasi dengan syarat energi yang diberikan terhadap molekul cukup untuk mengalami vibrasi. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik. Macam macam vibrasi ada 2 yaitu ada vibrasi regangan atai sterching dan vibrasi bending. Jika pegas direntangkan atau ditekan pada jarak keseimbangan tersebut maka energi potensial dari sistim tersebut akan naik. 2. Vibrasi streching ada dua tipe yaitu streching asimetris dan streching simetris. yaitu bergetar pada tempatnya. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa. Energi yang dimiliki oleh sinar infra merah hanya cukup kuat untuk mengadakan perubahan vibrasi. Gerak Translasi. Bila ikatan bergetar. streching simetris merupakan perubahan panjang ikatan menjadi lebih panjang atau lebih pendek namun tidak menyebabkan perubahan momen dipol (momen dipol 0) sehingga tidak IR aktif. Gerak Rotasi.Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif. Dasar Spektroskopi Infra Merah dikemukakan oleh Hooke dan didasarkan atas senyawa yang terdiri atas dua atom atau diatom yang digambarkan dengan dua buah bola yang saling terikat oleh pegas seperti tampak pada gambar disamping ini. yaitu perpindahan dari satu titik ke titik lain. Jumlah energi total adalah sebanding dengan frekwensi vibrasi dan tetapan gaya ( k ) dari pegas dan massa ( m1 dan m2 ) dari dua atom yang terikat. yaitu : 1. Prinsip dari spektrofotometer IR adalah ketika suatu molekul dari suatu senyawa diberikan energi radiasi inframerah. namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Setiap senyawa pada keadaan tertentu telah mempunyai tiga macam gerak. . yaitu berputar pada porosnya. Perbedaannya. dan 3. terutama senyawa organik. maka energi vibrasi secara terus menerus dan secara periodik berubah dari energi kinetik ke energi potensial dan sebaiknya. Gerak Vibrasi.

dan vibrasi kibasan (wagging). Biasanya spektrosfotometer IR digunakan sebagai analisis kuantitatif yaitu dalam menentukan indeks kemurnian yaitu seberapa besarkah sampel yang dianalisis jika spektrum IR sampel dibandingkan dengan spektrum IR baku pembanding atau reference standard dari sampel yang dianalisis.Streching bending merupakan perubahan sudut ikatan yang pasti menyebabkan perubahan momen dipol sehingga IR aktif. Ada 4 tipe vibrasi bending yaitu vibrasi goyangan (rocking). MS. PARAMETER KUALITATIF Spektrofotometer IR dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa. . dan sebagainya. vibrasi pelintiran (twisting). Ada daerah lain yang dinamakan daerah sidik jari atau dikenal sebagai finger print region. Daerah finger print ini untuk setiap senyawa tidak akan ada yang sama sehingga merupakan identias dari suatu senyawa. C. PARAMETER KUANTITATIF Spektrofotometer IR dapat digunakan dalam analisis secara kuantitatif jika dihubungkan atau dilanjutkan analisis dengan bantuan dari instrumentasi lain misalnya GC-MS. Namun jika hanya daerah gugus fungsi saja tidak dapat digunakan untuk menganalisis identitas senyawa. B. Yang menjadi parameter kualitatif pada spektrofotometer IR adalah bilangan gelombang dimana muncul gugus fungsi yang khas dari suatu senyawa. vibrasi guntingan (scissoring).

Sinar radiasi IR sebelum menembus sampel dan refrence displit terlebih dahulu supaya pembacaan tidak lama. Setelah sinar IR displit. Kemudian kedua berkas sinar tersebut masuk ke chopper sehingga keluar output sinar yang diteruskan ke monokromator. Didalamnya terdapat gratting dan sinar difokuskan oleh gratting.I# …‘• Dimana : a . Responnya lambat sehingga sinar harus dipotong-potong terlebih dahulu oleh chopper. Kemudian sinyal tersebut diinterpretasikan dalam bentuk spektrum infra merah dengan bantuan perangkat lunak dalam komputer. Setelah itu sinar keluar melalui celah keluar atau extrance slit dan masuk ke alat scan frekuensi baru diteruskan ke detector. sinar terbagi menjadi dua arus.I$ J J I" . Monokromator yang digunakan adalah monokromator Michelson Interferometer. Perkembangan spektrofotometer IR yang paling modern adalah FTIR. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA DAN FUNGSINYA Ada dua tipe instrumentasi spektrofotometer infra merah yaitu tipe Dispersive spectrophotometer dan multiplexing spectrophotometer atau disebut juga dengan Fourier Transform Infrared (FTIR). Dispersive spectrophotometer.I$ IJJ . Biasanya digunakan secara primer unruk menganalisis senyawa secara kualitatif. b = suatu bilangan t = waktu ω = frekuensi sudut FT-IR ini menggunakan suatu monokromator yang berbeda denga monokromator pada spektrofotometer IR tipe dispersive. Spektrofotometer iR ada beberapa kelemahan yang telah disebutkan sebelumnya. yaitu sinar yang menuju sampel dan sinar yang menuju larutan baku pembanding. Sistemnya double bead. Untuk mengatasi kelemahan tersebut perlu adanya pengembangan pada sistem optiknya. karena ada beberapa hal yaitu : Untuk mengurangi radiasi atmosferik (CO2 dan H2O) Mencegah ketidakstabilan radiasi sinar infra merah Mengurangi radiasi percikan oleh partikel pengotor atau debu di dalam spektrofotometer infra merah Memungkinkan pembacaan dan perekaman langsung Mekanisme kerja. Fourier Transform Infra Red. Pada sistem optik ini . Sinar masuk melalui celah masuk atau entrance pada monokromator.D.I# •‹ . Oleh detector sinar diubah menjadi sinyal elektrik dan diperkuat oleh amplifier. Dasar pemikiran FT-IR adalah deret persamaan gelombang yang dirumuskan oleh Jean Baptise Fourier yang membuat persamaan matematika gelombang elektronik : . Monokromator yang digunakan mirip dengan monokromator yang digunakan oleh spektrofotometer UV-Vis tipe berkas ganda atau double beam. Detektor yang digunakan adalah tipe thermal transducer.

Perbedaannya adalah sampel berhadapan langsung dengan sumber radiasi. Globar source : tabung silica carbida dengan ukurandiameter 5mm dan panjang 5cm 2. Prinsipnya sumber radiasi IR dipancarkan oleh padatan lembam yang dipanaskan sampai pijar dengan aliran listrik. Instrumentasi spektrofotometer infra merah mirip dengan instrumentasi spektrofotometer UV-Vis. komponen utama dari spektrofotometer infra merah adalah sebagai berikut : Sumber radiasi Sampel kompartemen Monokromator Detector Amplifier atau penguat Recorder / read out Sumber radiasi. Skema sistem optik ini seperti pada gambar dibawah : Michelson Interferometer Kelebihan dari FT-IR adalah : Respon cepat Sinar mengalami perubahab dahulu baru masuk ke sampel Lebih bagus dari spektrofotometer IR dispersive Lebih sensitif Sinar radiasi infra merah tidak mengganggu atau tidak terganggu Menggunakan monokromator Pyroelectric transducer. Secara berurutan.terdapat 2 cermin yaitu cermin yan g bergerak tegak lurus dan cermin diam. Ada 3 macam sumber radiasi yaitu : 1. Nernst Glower : senyawa-senyawa oksida 3. Tungsten Filament Lamp : untuk analisis dengan nir-IR .

Oleh sebab itu spektrofotometer IR harus diletakkan di suatu tempat dengan kelembaban yang rendah untuk mencegah kerusakan pada peralatan optiknya. Sampel kompartemen. Ada dua macam monokromator dengan fungsi berbeda yang sama fungsinya dengan monokromator spektrofotometer UV-Vis. Fungsinya sama dengan monokromator [ada spektrofotometer UV-Vis. atau LiF. Monokromator celah berfungsi untuk lebih memurnikan radiasi IR yang drai cuplikan sehingga masuk ke dalam rentang bilangan gelombang yang dikehendaki. Detektor spelktrofotometer yang bersifat menggandakan elektron tidak dapat dipakai pada spektrofotometer IR sebab radiasi IR sanngat lemah dan tidak dapat melepaskan elektron dari katoda yang ada pada sistem detektor.4. Karena gelas kuarsa atau mortar yang terbuat dari porselene dapat memberikan kontaminasi yang menyerap radiasi IR. Selain itu detektor dapat mendeteksi adanya perubahan panas yang terjadi karena adanya pergerakan molekul. Detector. Hal ini diusahakan dengan memakai monokromator ganda yang merupakan kombinasi dari monokromator prisma dan monokromator kisi difraksi. Prisma leburan garam-garam bromida pada umumnya dipakai sebagai resolusi radiasi IR jauh sedangkan garam fluorida untuk radiasi sinar IR dekat. maka pemakaian alat tersebut harus dihindari. disamping itu tetap menjaga keutuhan radiasi IR menuju detektor. Intrumen yang menggunakan detektor ini . Cuplikan atau sampel yang dianalisis dapat berupa cairan. Jenis monokrotaor kisi difraksi sudah banyak digunakan pada spektrofotometer IR yang modern. Monokromator prisma terbuat dari hablur NaCl yang paling banyak digunakan sebab memberikan resolusi radiasi IR terbaik dibandingkan dengan yang lainnya. Kisi difraksi terbuat dari bahan gelas atau palstik yang tertoreh dengan halus permukaannya dan terlapisi oleh kondensasi uap aluminium. Incandescent Wire : merupakan lilitan kawat nikrom. padatan atau pun gas. Monokromator prisma yang terbuat dari bahan garam anorganik berfungsi sebagai pengurai dan pengarah radiasi IR menuju detektor. Keunggulannya memberikan resolusi yang lebih bagus dengan dispersi yang surambung lurus. yaitu : Thermal transducer : terdiri dari dua logam bercabang dimana suhu tergantung pada potensialnya. CsBr. Hanya saja monokromator dalam spektrofotometer IR tidak terbuat dari kuarsa atau leburan silika tetapi terbuat dari garam NaCl. KBr. Monokromator. Ada tiga tipe detektor yang dapat digunakan pada spektrofotometer IR. Kelemahannya adalah timbulnya percikan radiasi IR pada monokromator kisi difraksi. Preparasi cuplikan harus menggunakan mortar yang terbuat dari batu agate dan pengempaan dilakukan dengan menggunakan logam monel. Karena energi vibrasi tidak terlalu besar sampel dapat diletakan langsung berhadapan dengan sumber radiasi IR. Monokromator yang umum digunakan adalah monokromtor kisi difraksi atau gratting. Berfungsi mengubah sinyal radiasi IR menjadi sinyal listrik.

Memiliki respon yang cepat dalam menganalisis suatu senyawa. Sampel dilarutkan dengan pelarutnya yang bersifat nonhigroskopis kemudian diteteskan pada plat garam setelah itu pelarut diuapkan dan dikeringkan kemudian diukur. Dalam preparasi sampel harus setipis mungkin karena jika terlalu tebal sinar infra merah tidak dapat menembus sampel sehingga tidak dapat terukur atau teranalisis. Responnya lambat sehingga jarang digunakan. indium antimonida. Pyroelectric transducer : berupa kristal cairan dari triglisin sulfat (TGS) dimana temperatur dipengaruhi oleh polaritas senyawa. Sampel bisa dipotong-potong sampai ukurannya cukup pada plat sampel kemudian langsung diukur. Untuk setiap wujud sampel berbeda cara preparasi sampelnya. . PENGUKURAN SECARA UMUM Pengukuran dengan spektrofotometer infra merah bisa mengukur sambel berwujud gas. Sedangkan pencatat atau read out harus mampu mengamati spektrum IR secara keseluruhan pada setiap frekuensi dengan seimbang. Penguat berhubungan erat dengan derau instrumen serta celah monokromator. dan cadmium telurida. Untuk maksud pengamatan pendahuluan selang waktu tersebut dapat dipersingkat ataupun diperlambat untuk mendapatkan hasil resolusi puncak spektrum IR yang baik. Menggunakan Cast Film Technique. jadi keduanya harus diselaraskan dengan tujuan mendapatkan resolusi puncak spektrum yang baik dengan derau maksimal. Rentang bilangan gelombang 4000cm-1 sampai 650cm1 dalam keadaan normal harus dapat teramati dalam selang waktu 10 – 15 menit. eaksa telurida. Biasanya untuk sampel berbentuk polimer. padatan dan cairan atau larutan. Harus menggunakan pendingin gas nitrogen sehingga responnya cepat. Amplifier/penguat dan read out. Penguat dalam sistem optik spektrofotometer IR sangat diperlukan karena sinyal radiasi IR sangat kecil atau lemah. E. Sejumlah sampel digerus dan dicampur dengan garam murni (KBr atau NaCl) di dalam mortir agate kemudian dicetak penjadi plat KBr atau plat NaCl dan ditempatkan dalam plat sampel dan diukur. Photoconducting transducer : terbuat dari bahan semikonduktor seperti timbal sulfida.harus disimpan pada tempat yang ber-AC atau bersuhu konstan karena dapat dipengaruhi oleh suhu sehingga dapat terjadi kesalahan dalam mendeteksi suatu senyawa. Sampel padatan. Ada 4 cara preparasi sampel yaitu : Sampel dicampur dalam mortir agate dengan menambahkan mulling agent (mulling agent : paraffin atau cairan nujol) kemudian diteteskan pada plat garam KBr atau NaCl dan diukur.

Dalam preparasi sampel dipilih garam murni NaCl atau KBr karena spektrofotometer infra merah merupakan senyawa ionik yang memiliki energi yang digunakan untuk bervibrasi sangat tinggi dan energi radiasi sinar infra merah tidak akan cukup kuat untuk menyebabkan molekul garam tersebut untuk bervibrasi. Sampel cairan atau larutan dimasukkan ke dalam plat berbentuk bulat kemudian ditambahkan garam murni KBr atau NaCl yang sudah dicampurkan oleh sedikit sampel. Rf nya sama dengan baku. yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer). Untuk menghitung nilai Rf adalah sebagai berikut : . Sampel berwujud cairan atau larutan. Alat yang digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan). Prinsip pemisahannya berdasarkan prinsip adsorpsi yaitu penyerapan sebagian komponen sampel pada fasa diam berdasarkan kepolaran komponen sampel. kemudian disimpan dalam plat sampel dan diukur. Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masingmasing komponen. Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom. PARAMETER KUALITATIF Parameter kualitatifnya adalah nilai Rf dari tiap senyawa yang dibandingkan dengan nilai Rf senyawa baku. akan melewati kolom yang merupakan fase diam. KROMATOGRAFI (GC. Akibatnya tidak akan muncul peak dari garam tersebut di daerah inframerah sehingga tidak akan mengganggu proses analisis senyawa.Sampel berwujud gas. Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Untuk sampel gas umumnya tidak murni dan memiliki kemampuan adsorben yang lemah. Molekul yang terlarut dalam fase gerak. HPLC) TLC (Thin Layer Chromatography) A. Jika warna spot. Dengan ini. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. TLC. PRINSIP Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. maka sampel yang dianalisis mempunyai identitas yang sama dengan baku pembanding. B. Sampel biasanya ditempatkan dalam suatu tabung tertutupdengan panjang seku=itar 5 – 10 cm. berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom.

PENGUKURAN SECARA UMUM Kromatogram pada KLT merupakan noda noda yang terpisah setelah visualitas noda-noda dengan cara fisika atau kimia. Spektrofotometer Inframerah dengan syarat Vis. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. namun perlu dilengkapi beberapa langkah. biasanya menggunakkan kromatografi preparatif. INSTRUMENTASI Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan. alasannya akan dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). PARAMETER KUANTITATIF Untuk analisis kuantitatif tidak bisa hanya dengan menggunakan KLT saja. Setelah mengembangkan dan dikeringkan bagian spot pada fase diam (misalnya silica gel) dikerok kemudian dimasukkan ke dalam wadah. dan bisa juga dengan HPLC. Visualisasi cara pereaksi .C. harus ada baku pembanding dari senyawa yang dianalisis. D. Untuk analisis kuantitatif. Fase gerak padatan) mengalir melalui fase diam dan membawa komponen komponen yang terdapat komponen-komponen dalam campuran. Pada adsorban yang berfluoresensi maka noda akan tampak sebagai pemadaman fluoresensi. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Visualisasi dengan cara kimia adalah dengan mereaksikan kromatogran dengan pereaksi warna atau fluoresensi yang spesifik. Penentuan kadar dapat dilakukan dengan metode spe spektrofotometer UV-Vis. Komponen komponen yang berbeda bergerak pada laju yang Komponen-komponen berbeda. Visualisasi cara fisika yaitu dengan melihat noda kromatoram yang mengabsorpsi radiasi ultraviolet atau berfluoresensi dengan radiasi ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. mpuran E.

Perlu diperhatikan bahwa penyemprotan dengan pereaksi kimia ini diusahakan jangan sampai merusak lapisan adsorban pada pelat dan diusahakan warna kromatogram yang cukup stabil dalam jangka waktu lama. atau perbedaan titik leleh. Parameter ini berguna pada saat penentuan kadar dari suatu sampel. Setiap senyawa memiliki waktu retensi yang berbeda-beda. titik cair. Kapasitas sampel 2.kimia ini dilakukan dengan cara penyemprotan dengan atomizer atau memberikan uap zat kimia pada kromatoram atau dengan cara pencelupan ke dalam pereaksi penampak warna atau penampak bercak. Resolusi D. kecepatan. Dalam kromatografi gas ada faktor kritis yaitu : 1. dan kapasitas sampel. Parameter tersebut ada dua yaitu tinggi puncak kromatogram dari senyawa yang dianalisis dan luas area di bawah kurva atau kromatogram (AUC). kromatografi gas memiliki parameter analisis kuantitatif. Proses pemisahan terjadi karena adanya kesetimbangan konsentrasi sampel dalam fasa diam dan pasa gerak. B. PARAMETER KUALITATIF Parameter analisis kualitatif dari kromatografi gas sama halnya dengan tipe kromatografi lainnya yaitu waktu retensi senyawa. Faktor kritis dalam proses pemisahan dengan menggunakan instrumen kromatografi gas adalah resolusi. GC (Gas Chromatography) A. PARAMETER KUANTITATIF Selain parameter analisis kualitatif. PRINSIP Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan campuran senyawa berdasarkan prinsip adsorpsi dan prinsip partisi. Sistem adsorpsi pada fase diap padan atau gas solid chromatography. Pemisahan bisa terjadi akibat perbedaan titik didih. C. Waktu retensi senyawa merupakan waktu yang dibutuhkan oleh suatu senyawa keluar melewati kolom kromatografi pada kondisi kromatografi yang sama. Kecepatan alir 3. Prinsip partisi adalah dimana suatu senyawa yang akan dipisahkan dengan kromatografi gas bersifat volatile atau mudah menguap. INSTRUMENTASI / KOMPONEN UTAMA Instrumentasi dari gas chromatography atau kromatografi gas umumnya adalah sebagai berikut : .

kecepatan alirnya 25 – 150 ml/menit untuk kolom pack dan 1-25 ml/menit untuk kolom kapiler. Kolom pack terbuat biasanya dari gelas bersilika. silica. Kolom terpacking (packed column) Ukuran maksimal 5m. stainless steel. Untuk kolom pack sampel diijeksikan sebanyak 20µL dan untuk kolom kapiler 100 kali lebih besar dari kolom pack. Injektor sampel Injektor sampel berfungsi intuk menginjeksikan sampel ke dalam tempat sampel. Umumnya gas yang digunakan sebagai pembawa adalah gas helium. Ukuran bervariasi. dan O2. Ijeksi sampel harus cepat karena jika injeksi sampel lambat maka akan terjadi injeksi sampel yang berlebihan sehingga menyebabkan band spreading atau pelebaran kromatogram dan pemisahan menjadi buruk.Mobile phase tank (tanki fase gerak) Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi gas adalah berwujud gas. Syaratnya adalah gas yang digunakan sebagai fase gerak harus bersifat inert. Oven Digunakan untuk mengontrol suhu. Sifatnya rapuh namun inert . Syringe menginjeksikan sampel ke dalam vaporization chamber. Injektor ada 2 tipe yaitu tipe splitless (100 : 90) dan tipe split (100 : 1). Digunakan microsyringes karena sampel yang disuntukkan harus sedikit mungkin karena jika terlalu banyak akan menurunkan efisiensi kolom. o Sistem gradien : dalam satu kali running alat atau satu kali proses pemisahan suhu dinaikan secara bertahap. Ada dua sistem pengaturan suhu. Umumnya terbuat dari bahan teflon. memiliki tekanan inlet 10 – 50 psi lebih besar dari tekanan kamar. Proses penguapan sampel terjadi pada suhu 280oC. fire bricket. namun kelemahannya adalah resolusinya rendah. dan dilengkapi dengan termostat. Efisiensi kolom dipengaruhi oleh banyaknya sampel yang diinjeksikan. Kolom Kolom merupakan bagian paling penting dalam kromatografi kolom termasuk kromatografi gas karena di dalam kolomlah proses pemisahan campuran senyawa terjadi. Secara umum kolom kromatografi dibagi mejadi 2 tipe yaitu : 1. Adapun gas yang dapat digunakan sebagai fase gerak adalah Ar. Injektor sampel berupa microsyringes. Kolom terlapisi alumina. Keuntungannya adalah kapasitas besar.H2. Panjangnya berkisar 2-50m. diameter antara 10 – 30 cm. gelas. yaitu o Sistem isotermal : dalam satu kali running alat atau melakukan pemisahan sisten diatur hanya menggunakan 1 suhu saja. N2.

paling umum digunakan di bidang farmasi. . Senuawa polar contohnya Carbowax / PEG 20 M 200oC dan DEGS 190oC. Detector Detektor berfungsi untuk mendeteksi senyawa yang keluar melewati kolom dan mengubah menjadi sinyal elektronik yang dapat dibaca oleh readout atau data sistem. Namun keleemahannya adalah memiliki kapasitas sampel yang terbatas. 2. Waktu respon yang pendek tidak bergantung pada kecepatan alir f. o FTD (Flame Thermal Detector). Syarat detektor ideal adalah sebagai berikut : a. untuk senyawa yang mengandung unsur P dan unsur N o FPD. Senyawa nonpolar contohnya SE-30 350oC. Memberikan respon linier terhadap pelarut d. dan senyawa semipolar contohnya OV-17 dan OV-210. Tidak merusak sampel h. Adapun macam-macam detektor yaitu : o FID (Flame Ionization Detector). Harus memiliki sensitivitas yang tinggi b. Ketika meleleh gas pembawa akan membawa komponen analit berdasarkan kepolaran. Fase diam yang digunakan dipilih berdasarkan polaritas sampel. untuk menganalisis senyawa pestisida organoposfat karbamat (senyawa fosfor dan nitrogen sehingga yang akan terdeteksi adalah senyawa yang mempunyai gugus posfat dan fosfor. Kolom terbuka (capillary column) Ukuran maksimal adalah 100 m. Squalan 100oC. Biasanya terlapisi oleh bahan silika atau poliamida. Pemilihan deektor bergantung pada sneyawa yang akan dianalisis. Mempunyai range suhu antara suhu kamar sampau dengan minimal 400oC e. Stabilitas dan reprodusibilitas yang baik c. Memberikan respon yang sama pada semua sampel. Digunakan untuk mendeteksi semua senyawa termasuk pelarut.sehingga jika ada zat yang bersifat korosif (misalnya fenol) dalam sampel tidak diganggu oleh kolom dan kerusakan kolom akan terlihat (hitam dan pecah-pecah). Reabilitas tinggi dan mudah digunakan g. Fasediam adalah lemak sehingga dapat meleleh. Keuntungan dari kolom terbuka adalah memiliki resolusi yang tinggi.

PENGUKURAN SECARA UMUM Seperti yang dijelaskan sebelumnya baha GC digunakan untuk senyawa yang mudah menguap. Fase gerak berupa larutan dan fase diam dikemas atau terpacking di dalam kolom. PRINSIP Maksud dan tujuan analisis dengan mengunakan KCKT adalah hanya ada 2 hal yaitudidapatkannya pemisahan yang baik dalam waktu yang relatif singkat. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) / KCKT A. Data sistem Data sistem ini fungsinya sama seperti pada spektrofotometer IR dan Spektrofotometer UV-Vis. Aldrin.O bis-(trimetilsilil).o ECD (Electron Captured Detector). Pada derivatisasi semua gugus fungsi yang relevan harus dapat terderivat secara kuantitatif dengan cara yang disebut sililasi. Hanya saja menggunakan perangkat lunak atau software yang berbeda. Sebagai contoh gugus polar – OH . Data sistem ini berfungsi untuk menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari masing-masing senyawa yang dipisahkan. Caranya adalah instrumen dinyalakan sekaligus temperaturnya diatur harus 30oC diatas suhu analisis. Kemudian gas pembawa dinyalakan dan akan mengalir keluar dari kolom. Prinsip pemisahan dengan menggunakan instrumentasi KCKT adalah berdasarkan prinsip partisi dimana sampel terbagi atau terpartisi ke dalam dua fase yaitu dalam fase diam dan dalam fase gerak. Namun ada beberapa senyawa yang kurang stabil jika dalam keadaan uap atau memiliki sifat atsirinya rendah. o TCD (Thermal Capture Detector). yaitu untuk mengurangi antaraksi dipol-dipol serta menambah keatsirian. Dalam menggunakan peralatan GC untuk menganalisis senyawa. =NH. E. BSTFA. untuk isolasi senyawa karena dapat ditampung namun paling tidak sensitif. Hal ini dapat diatasi dengan menderivatisasi senyawa yang memiliki sifat atsiri yang rendah sehingga hasil derivatisasi mempunyai sifat atsiri yang baik. Pelarut yang biasanya digunakan adalah DDT. Sebelum melakukan pemisahan instrumentasi di- . dan dieldrin. Selain itu dari data sistem bisa diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat. untuk pestisida organoklorin sehingga tidak boleh menggunakan pelarut kloform atau pelarut lain yang mengandungf gugus clorin.NH2 . Instrumen dibiarkan selama 30 menit. Pereaksi yang banyak digunakan untuk menderivatisasi adalah N. instrumen harus dikondisikan terlebih dahulu supaya komponen penyusun instrumen terutama kolom tidak rusak. _. TMCS.SH dapat diubah dengan gugus silil –O-Si(CH3)3 dengan pereaksi BSTFA dan BSA. trifluoroasetamida. dan . TMSDEA. .COOH.

Efisiensi kolom Efisiensi kolom padat dihitung dengan metode : 3. PARAMETER ANALISIS a. Kesimetrisan kromatogram Dapat ditentukan dengan : . Parameter retensi Waktu retensi merupakan waktu yang dibutuhkan sampel untuk keluar dari kolom. ANALISIS KUALITATIF Parameter kualitatif dari kromatografi cair tekanan tinggi ada 4 yaitu : 1.running dengan cara membiarkan aliran eluen atau fase gerak melewati kolom dan fase proses degassing harus dilakukan untuk menghilangkan gas di dalam kolom karena jika tidak dihilangkan gasnya maka dapat merusak kolom. B. Setiap senyawa meiliki waktu retensi yang berbeda. Parameter retensi dapat dihitung dengan rumus : Dimana : 2.

Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.1 : Capacity term increases the retention time : Selectivity term increases the time interval between peaks : Column efficiency term produce narrow peaks N b. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). • Berdasarkan area kromatogram • Berdasarkan tinggi puncak kromatogram Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram.S : Symmetry factor ( T : Tailing factor ) h x 0. Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi.05 2f h S = 1 : The peak is completely symmetric. S > 1 : Tailing S < 1 : Leading 4. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Parameter kondisi pemisahan 2.05 S= W0.1 k’2 1 + k’2 N Rs = k’2 1 + k’2 . 1 4 .05 f W0. Parameters used in HPLC Condition for good separation A larger Rs value means a better separation. Sample ini umumnya hanya melalui . Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. ANALISISI KUANTITATIF Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: a) Parameter percobaan sama antara standar dan sampel b) Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama c) Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu.

dengan Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya sama akan langsung di vonis sebagai peak milik analat.proses pelarutan saja. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama. melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Biasanya terdapat 4 campuran eluen . Jadi. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. akan Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda. C. yang Disinilah para analis biasanya terkecoh. meskipun memiliki RT yang sama. Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas ban banyak peak. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. INTRUMENTASI DAN FUNGSINYA Dibawah ini adalah 5 model kerja dengan menggunakan HPLC : dengan HPLC atau KCKT mempunyai instrumentasi dengan komponen komponen-komponen sebagai berikut : • Mobile phase tank Mobile phase tank merupakan tempat penampungan eluen eluen-eluen yang akan digunakan sebagai fase gerak. maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan.

• Column Ini merupakan bagian terpenting dalam instrumen kromatografi. Oleh karena itu. Solvent delivery Solvent delivery merupakan tempat pencampuran pelarut-pelarut menjadi eluen yang homogen. Pemilihan kolom yang sesuai 2. Kromatografi fase normal Kolomnya konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar misalnya silika gel sedangkan fase geraknya bersifat nonpolar. Uji terhadap spesifikasi kolom FASE KOLOM Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak. Injektordengan memakai diafragma (septum) 2. Injektor dengan pipa dosis Untuk analisis kuantitatif yang paling tepat digunakan adalah injektor dengan pipa dosisb alasannya adalah ketepatan jumlah volume sampel yang diinjeksikan akan sangat penting untuk analisis kuantitatif dan keadaan ini hanya dapta diantisipasi denga injektor pipa dosis. Kolom ini merupakan tempat terjadinya separasi komponen-komponen sampel yang akan terjadi di kolom. harus diperhatikan dengan seksama 3 hal berikut yaitu : 1. maka kolom kromatografi cair kinerja tinggi dibagi mejadi 2 tipe : 1. dan metanol. Injektor tanpa septum 3. acetonitrile. 2. dapar pH natrium dihidrogen posfat. Injector Pemasukkan atau injeksi sampel untuk analisis dengan metode KCKT merupakan tindakan ilmuwan yang penting. ini berarti pada keadaan pertama sampel akan masuk loop dan akhirnya dengan volume yang tidak berkurang sedikitpun segera masuk menuju kolom pemisahan. Ada tiga macam injektor yang biasanya ada pada rangkaian alat KCKT yaitu : 1. Kromatografi fase terbalik Merupakan kebalikan dari fase normal yaitu kromatografi sengan kolom yang fase diamnya bersifat nonpolar dan fase geraknya bersifat polar.• • yang digunakan yaitu aquabidest. Biasanya digunakan untuk memisahkan asam-asam lemak rantai panjang melalui suatu kolom yang terbuat dari bahan karen yang bersifat . Pemeliharaan kolom 3. Prinsipnya adalah load injected.

Untuk mendapatkan fase diam yang nonpolar silika gel direaksikan dnean klorosilan. Oven kolom yang banyak digunakan adalah dengan sistem sirkulasi udara panas uang bertekanan. C8 dan C2. Oven kolom dapat memuat kolom KCKT sampai 4 kolom sekaligus dengan temperatur kerja sampai 99oC. Maka dari itu detektor yang banyak digunakan adalah detectro UV-Vis Photo Diode Array.nonpolar. Biasanya fase gerak yang digunakan adalah air. • . dan aseton. • Detector Detektor pada KCKT memberikan segala informasi kepada kita tentang segala sesuatu yang diperlukan sehubungan dengan tujuan analisis baik kuantitatif maupun kualitatif. Keistimewaan dari detektor ini adalah : o Sistem optik tidak menggunakan cermin dan menjamin spektral purity dan mengabaikan stray radiation o Hanya ada satu lensa fokus o Tidak ada pergerakan mekanis sehingga menjamin ketepatan panjang gelombang penentuan o Kecepatan deteksinya 300 – 400 kali detektor PMT o Rentang pengukuran 190 – 600 nm o Hollografik gratting yang tidak bergerak. Fase diam yang banyak digunakan adalah jenis C18. Keuntungan dengan menggunakan fase terbalik adalah senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya pada kromatografi sistem ini. metanol. Karena hal ini sangat penting untuk memperoleh stabilitas dan keterandalan dalam analisis dengan metode KCKT. Oven kolom Kolom KCKT diletakan di dalam oven untuk menjaga temperatur kolom supaya stabil (tetap sesuai dengan program). Detektor yang biasa digunakan dalam instrumentasi KCKT adalah : a) Detektor UV-Absorpsi b) Detektor Flourimetri c) Detektor refraktive index d) Detektor elektrokimia Walaupun yang banyak digunakan adalah detektor UV-Absorpsi maka ada beberapa kecenderungan yaitu akan ada puncak yang tidak terdeteksi dan terjadi pergeseran puncak kromatogram. Selain itudapat memisahkan senyawa yang mudah terionkan yang tidak dapat dipisahkan dengan kromatografi fase normal dapat menggunakan air sebagai salah satu komponen fase gerak. Detektor tipe ini dapat menjamin derau d an pelayangan instrumental yang sangat relatif kecil sehingga dapat diabaikan.

Ada dua cara elusi yaitu elusi gradien dan elusi isokratik. Penampungan akhir Digunakan untuk menampung eluen yang keluar dari kolom baik pada proses degassing maupun dalam peroses pemisahan. Ada dua model umum : a. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Elusi isokratik dilakukan hanya menggunakan 1 perbandingan konsentrasi eluen dalam satu kali proses pemisahan. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah c. Hanya saja menggunakan pengaturan ynag berbeda. Selain itu dari data sistem bisa diatur secara komputerisasi untuk menjalankan alat. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL). gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa. Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom. Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Total waktu analisis dapat direduksi b. • D. Solvent Flowing Cara mengelusi sampel pun harus diperhatikan. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. lebar puncak. 1. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual. dan waktu retensi. Stopped Flow b. Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan : a. Dalam praktek. Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah . Dengan data processor kita dapat memperoleh secara langsung data yang diperlukan bisalnya luas area kromatogram. Tabel 3. tinggi puncak. harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing) d.• Data processor Data sistem ini fungsinya sama seperti pada GC. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. PENGUKURAN SECARA UMUM Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Data sistem ini berfungsi untuk menginterpretasikan hasil pemisahan dalam bentuk kromatogram dari masing-masing senyawa yang dipisahkan.

antara lain: • • • • • • Waktu analisis cepat Resolusi besar Sensitivitas detektor Kolom yang dapat digunakan kembali Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik Mudah rekoveri sampel . Melarutkan sampel 5. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price) Umumnya. Sesuai dengan defektor 4. Bila diperlukan.satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Dari semua persyaratan di atas. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT. tidak terdapat kontaminan 2. semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. KEUNTUNGAN MENGANALISIS DENGAN KCKT KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik. yaitu rasa gerak harus : 1. Murni. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Memiliki visikositas rendah 6. memudahkan "sample recovery" 7. Tdak bereaksi dengan wadah (packing) 3. Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2). tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai. terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting. Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->