7.

Enzime
7.1. Aspecte generale
Enzimele sunt substanţe chimice complexe de natură organică-proteine coloidal solubile - elaborate de plante, animale şi microorganisme, capabile să mărească viteza reacţiilor chimice ce se desfăşoară în sistemele biologice, fără să se consume în cursul lor. Sunt deci, o clasă specială de proteine dotate cu activitate catalitică; se mai numesc şi biocatalizatori. Denumirea de enzime a fost dată de către Kuhne (1878) şi provine de la expresia "en zima = în levură" (în 1. greacă), pornind de la faptul că din drojdii s-au extras pentru prima dată enzime. Procese enzimatice, cum sunt fermentaţia vinului, dospirea pâinii, acidifierea laptelui etc. sunt cunoscute din cea mai îndepărtată antichitate. Dar cunoştinţe sistematice în acest domeniu s-au obţinut începând cu identificarea primelor enzime: amilaza din malţ (Kirchoff, 1814), amilaza salivară (Leuchs, 1831) şi pepsina (Schwann, 1836). Ulterior, progrese importante s-au realizat prin lucrările privind cataliza şi biocataliza ale lui Berzelius şi Liebig, prin studiile asupra cineticii ale lui Michaelis şi Menten (1912), prin obţinerea enzimelor în stare cristalizată (Sunner, 1926). Enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocupă cu studiul enzimelor, s-a dezvoltat exploziv pe baza unor cercetări ample privind structura enzimelor, mecanismele de reacţie studiate la nivel electronic şi cuantic, reglarea proceselor enzimatice în cadrul metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vieţii. Prin acţiunea lor catalitică, enzimele fac posibilă, în condiţii compatibile

Biochimia produselor alimentare cu viaţa, realizarea unei întregi serii de reacţii chimice, care în vitro nu se pot realiza decât în condiţii foarte dure, improprii vieţii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimică se realizează la 37°C, numai în mediu puternic acid şi într-un interval de timp foarte lung (3 luni); în organism, în stomac, această degradare are loc extrem de rapid şi în mediu mai slab acid. Pentru a realiza "in vitro" tot atât de repede această hidroliză sunt necesare o temperatură de 120- 140°C şi o mare aciditate, deci condiţii absolut incompatibile cu viaţa organismelor. În mod similar, arderea glucozei în organismele vii cu producerea apei, a dioxidului de carbon şi a energiei se realizează prin intermediul enzimelor în condiţii specifice vieţii celulare. În absenţa enzimelor, aceleaşi transformări necesită temperaturi de 180-200°C. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental în procesele vieţii, iar studiul acestora apare astfel ca problemă centrală a biochimiei. Conform definiţiei lui Haldane, "enzima este un catalizator organic, solubil şi coloidal produs de celula vie". Ca urmare, enzimele sunt prezente în toate celulele ţesuturilor, organelor. Organismele vii trebuie să fie capabile să-şi sintetizeze singure enzimele de care au nevoie pentru desfăşurarea normală a activităţii vitale. Biosinteza enzimelor este similară cu cea a proteinelor fiind dirijată de acizii nucleici şi de substanţele specifice din fiecare organism. Deşi sinteza lor se face numai în interiorul organismului, enzimele îşi pot exercita acţiunea lor atunci când sunt extrase din organism, şi în afara acestuia. Numărul enzimelor este foarte mare şi mereu se identifică altele noi.. În principiu, se poate spune că pentru fiecare substanţă proprie organismului trebuie să existe cel puţin o enzimă care să catalizeze, fie reacţia de formare a ei dintr-o substanţă inferioară sau superioară ca structură, fie transformarea ei. În multe cazuri enzima care participă la sinteza substanţei este diferită de cea care efectuează degradarea ei. Substanţa care este transformată printr-o reacţie catalizată de o enzimă se numeşte substrat. Natura şi cantitatea de enzime variază în funcţie de genul organismului, de vârsta lui. Animalele sunt mai bine dotate din punct de vedere enzimatic decât plantele. Unele enzime sunt sintetizate de celulă sub formă inactivă -proenzimedar trec în stare activă când celula are nevoie; aceasta constituie o formă de reglare deosebit de importantă pentru viaţa celulei. În felul acesta se evită autodistrugerea unor ţesuturi, organe sau se pot evita o serie de tulburări cu consecinţe deosebit de grave pentru organism. După formarea lor, enzimele (sau proenzimele) sunt difuzate la locul lor din celula respectivă (intracelulare) sau sunt excretate (extracelulare) la locul unde îşi vor manifesta activitatea lor catalitică.

180

Enzime Enzimele intracelulare sunt acele enzime care sunt produse şi îşi desfăşoară activitatea chiar în celulele în care sunt biosintetizate. Ele sunt legate puternic de structura celulei şi nu pot fi extrase decât prin distrugerea acesteia pe cale mecanică (îngheţ-dezgheţ, mojarare cu nisip de cuarţ etc.). Extragerea se face cu apă, glicerină, soluţii saline, menţinându-şi activitatea ca şi în celule. Enzimele intracelulare pot fi legate prin adsorbţie şi în acest caz se numesc bioenzime, iar când sunt legate profund de celule, de protoplasma celulei, prin legături chimice, se numesc desmoenzime. Acestea se separă numai după autoliza substanţei celulare şi nu prin distrugerea mecanică. După autoliză, enzimele se extrag cu apă, glicerină etc., păstrându-şi activitatea. Enzimele extracelulare sunt enzimele care, deşi biosintezate în celule, sunt eliminate în lichidele din organism sau în mediile de cultură, exercitându-şi acţiunea la acest nivel. Aceste enzime se extrag cu uşurinţă de la locul de acţiune, iar activitatea lor este deplină. În organism există enzime fie independent de prezenţa substratului (enzime constitutive), fie enzime care sunt sintetizate în caz de nevoie şi când substratul respectiv este prezent (enzime adaptive sau enzime inductibile). Sisteme enzimatice. Există reacţii catalizate de o singură enzimă; în celulă însă majoritatea căilor metabolice au un număr de etape intermediare, adică între substanţa iniţială (A) ce urmează a fi transformată şi produsul final (D) iau naştere o serie de produşi intermediari. Fiecare etapă intermediară este catalizată de o anume enzimă(E) iar reacţia în total este catalizată de un sistem enzimatic:

Într-un astfel de sistem nu toate enzimele au aceeaşi importanţă funcţională; cele care au rolul principal se numesc enzime limitative sau enzime "cheie". Sistemul enzimatic este riguros coordonat, etapele se succed într-o ordine anumită în aşa fel ca produsul unei reacţii să servească ca substrat pentru etapa următoare. Această succesiune de reacţii trebuie să fie neîntreruptă deoarece blocarea uneia conduce la blocarea întregului sistem. De asemenea, unii intermediari pot fi utilizaţi în alte căi metabolice. Este necesară deci o coordonare cantitativă pentru fiecare sistem enzimatic.

7.2. Structura enzimelor
181

Biochimia produselor alimentare

7.2.1. Constituenţii enzimelor
Toate enzimele sunt de natură proteică şi au un înalt grad de structurare posedând o structură primară, imprimată de secvenţializarea aminoacizilor în catena polipeptidică fundamentală, o structură secundară, o structură terţiară şi o structură cuaternară, determinate de modul în care catenele polipeptidice se pot plia şi asocia între ele. Numeroase enzime însă au o structură binară care constă dintr-o componentă proteică, denumită apoenzimă şi una sau mai multe componente neproteice, denumite cofactori. Complexul apoenzimă+cofactor este denumit holoenzimă şi este activ din punct de vedere catalitic. Prin îndepărtarea cofactorului, rămâne componenta proteică inactivă în forma liberă. În structura holoenzimei, cofactorul imprimă specificitate de acţiune, respectiv determină tipul şi viteza reacţiei catalizate, în timp ce apoenzima imprimă specificitate de substrat, respectiv determină substanţa asupra căreia acţionează enzima. Apoenzima fiind de natură proteică, manifestă proprietăţile generale ale proteinelor; este termolabilă şi nedializabilă; stabileşte legătura enzimei cu substratul; manifestă grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibilă de modificări conformaţionale în anumite limite. Cofactorii enzimatici reprezintă componente neproteice de natură chimică foarte diferită, care sunt indispensabili pentru manifestarea activităţii catalitice a numeroase enzime. După natura chimică şi modul lor de legare la apoenzimă, cofactorii se clasifică în: coenzime, grupări prostetice, ioni metalici. • coenzimele sunt compuşi organici - majoritatea derivaţi de la vitamine care se ataşează temporar la apoenzimă prin legături necovalente şi care sunt uşor disociabili de aceasta. Ele pot trece uşor de la o apoenzimă la alta putând astfel participa la transformarea altor molecule de substrat după terminarea unei anumite reacţii. Dintre acestea fac parte: NAD+, NADP+, ATP, CTP, acidul lipoic etc.

• grupările prostetice sunt substanţe organice fIxate pe apoenzimă şi care disociază greu deoarece sunt legate prin legături covalente; dintre aceste grupări se pot menţiona FAD, FMN, TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetică imprimă mecanismul unor procese enzimatice ca: transportul de electroni, de grupări – NH2, acetil etc. De exemplu, hemul conţinând ionul Fe2+ este o componentă a citocromilor (enzime ce transportă electroni) puternic legată de apoenzimă prin legături chimice de tip covalent.

182

Enzime

• ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funcţiei catalitice a unor enzime, participând în calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Aceste enzime se numesc şi metal-enzime iar printre ionii care îndeplinesc rol de cofactor se pot menţiona: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+(3+), Mo2+. Unele enzime pot conţine chiar doi ioni metalici.

7.2.2. Centrul activ al enzimei
În interacţiunea dintre enzimă şi substratul său, enzima participă cu o porţiune limitată din structura sa. Pe această porţiune există grupări reacţionale capabile să atragă şi să fixeze molecula substratului într-o poziţie privilegiată şi într-un loc strict determinat; ansamblul acestor grupări chimice şi al încărcărilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau centrul catalitic. Astfel, centrul activ al unei enzime reprezintă ansamblul regiunilor funcţionale ale enzimei, respectiv ansamblul grupărilor chimice active care participă efectiv la reacţia catalizată. În cazul enzimelor care nu necesită pentru activitatea lor catalitică prezenţa unui cofactor, acest centru activ este reprezentat de o secvenţă de aminoacizi şi este condiţionat de configuraţia tridimensională a moleculei. Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de grupările funcţionale ce se combină cu substratul ci de integritatea configuraţiei moleculei proteice care determină poziţiile spaţiale relative ale acestor grupări funcţionale. Acest fapt subliniază importanţa structurii terţiare a proteinei pentru activitatea enzimatică. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumită situs catalitic, unde se găseşte secvenţa de aminoacizi implicaţi în activitatea catalitică. În cazul enzimelor care conţin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic şi regiunea din moleculă la care este ataşat cofactorul (coenzima, metal), adică: centru activ = situs catalitic + cofactor

7.2.3. Organizarea structurală a enzimelor
În funcţie de organizarea lor structurală ca molecule proteice, enzimele se încadrează în următoarele grupe principale: enzime monomere, enzime oligomere, izoenzime. Enzimele monomere au o structură constituită dintr-un singur lanţ polipeptidic în care este inclus situsul catalitic. Sunt într-un număr restrâns,

183

Biochimia produselor alimentare nu pot fi disociate în subunităţi şi posedă mase moleculare relativ mici (13.000 - 35.000). Enzimele oligomere sunt agregate moleculare constituite din două sau mai multe subunităţi (protomeri) asociate într-o structură compactă dotată cu proprietăţi catalitice. Au mase moleculare mari, cuprinse între 35.000 şi câteva sute de mii. Marea majoritate a enzimelor care catalizează diferite reacţii biochimice ale metabolismului sunt enzime oligomere. Izoenzimele reprezintă forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizează aceeaşi reacţie, au originea în aceeaşi celulă, ţesut sau lichid biologic, dar diferă ca structură (configuraţie spaţială) şi proprietăţi fizico-chimice (pH optim de acţiune, cinetică de reacţie, mobilitate electroforetică). Izoenzimele apar datorită diferenţelor la nivelul structurilor cuaternare, respectiv combinărilor variate ale unor subunităţi structurale de natură polipeptidică. De exemplu, lactat dehidrogenaza din muşchi este un tetramer care are două lanţuri polipeptidice de tipul H şi două de tipul M. Cuplarea lanţurilor este diferită, ceea ce dă naştere la 5 forme izomere ale acestei enzime: H H H H; H H H M; H H M M; H M M M; M M M M.

7.3. Specificitatea enzimelor
Enzimele diferă de catalizatorii neproteici prin una din cele mai remarcabile şi caracteristice proprietăţi ale lor şi anume specificitatea. Se înţelege prin specificitatea unei enzime proprietatea sa de a acţiona preferenţial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cu caractere chimice comune. Specificitatea enzimatică se poate manifesta la nivelul tipului de reacţie catalizată de enzimă şi la nivelul substratului. Specificitatea de reacţie (de acţiune) se manifestă asupra unui singur substrat de către mai multe enzime, fiecare catalizând o anumită reacţie. De exemplu, un α - aminoacid poate constitui substratul de reacţie pentru mai multe enzime care catalizează reacţii diferite - însă specifice - de transformare a sa în produşi de reacţie diferiţi:

184

Enzime

Fiecare enzimă manifestă o anumită specificitate de acţiune, catalizând un anumit tip de reacţie biochimică. Specificitatea de substrat. Aceasta se referă la activitatea pe care o manifestă enzimele faţă de anumite substrate. Gradul specificităţii de substrat variază foarte mult. Se deosebesc astfel: • specificitate absolută. Unele enzime nu acţionează decât asupra unui singur substrat fiind inactive faţă de alte substanţe cu structură asemănătoare; de exemplu ureaza hidrolizează numai ureea, nu şi derivatul său metilat:

Arginaza numai arginina:

H2N -C-NH2 O
NH2 C NH NH CH2 3 CH NH2 COOH argininã

ureaza H2O

CO2

+ 2 NH3

hidrolizează

NH2 arginazã H2O CH2 3 CH NH2 COOH ornitinã

NH2 C O + NH2 uree

• specificitatea de grup o au enzimele care acţionează asupra unei serii de substanţe apropiate ca structură chimică. Astfel, pepsina nu atacă decât proteinele, dar toate tipurile de proteine, amilaza atacă amidonul, dextrinele, glicogenul; hexokinaza catalizează fosforilarea unei serii de hexoze în prezenţă de ATP. Stereospecificitatea. Unele enzime au stereospecificitate faţă de izomeria

185

Biochimia produselor alimentare cis-trans. Astfel, fumaraza acţionează numai asupra acidului fumaric şi este inactivă asupra izomerului său cis, acidul maleic:

HOOC C=C H acid fumaric

H fumaraza COOH H2O

HOOC C C

H

H H OH COOH

acid malic În cazul substanţelor optic active, enzimele manifestă o acţiune specifică faţă de o anumită formă stereoizomeră a substratului; de exemplu, L-aminoacidoxidazele nu recunosc decât L-aminoacizii iar pentru transformarea Daminoacizilor este necesară prezenţa D -aminoacid - oxidazelor.
Unele enzime fac distincţie între conformaţiile α şi β din legăturile glicozidice. Maltaza, de exemplu, hidrolizează numai legătura (1→ 4) α glicozidică din molecula de maltoză, şi nu atacă legătura (1→ 4) β glicozidică din celobioză.

7.4. Mecanismul de acţiune al enzimelor
Mecanismul general de acţiune al enzimelor este cel al tuturor catalizatorilor şi anume: - intervin numai în acele reacţii care sunt posibile din punct de vedere termodinamic; - nu modifică echilibrul unei reacţii, ci fac ca acest echilibru să fie atins mai repede; - cantitatea lor rămâne neschimbată la sfârşitul reacţiei. Enzimele au şi ele aceste proprietăţi, la care se mai adaugă următoarele: - natura lor proteică le conferă un grad mare de specificitate; - activitatea enzimatică este supusă unui control şi acest fapt are mare importanţă pentru reglarea metabolismului celular; - micşorează energia de activare în reacţia respectivă ceea ce determină creşterea vitezei acesteia. În general, pentru ca o reacţie să aibă loc cu o viteză apreciabilă, moleculele reactanţilor trebuie să fie activate. Energia de activare poate fi furnizată de temperatură însă, în cazul organismelor vii, utilitatea ei este limitată. Enzima are capacitatea de a coborî nivelul energetic care condiţionează reacţia, ceea ce permite moleculelor să reacţioneze cu o viteză apreciabilă în condiţii în care în absenţa enzimei nu ar reacţiona decât cu o viteză extrem de mică.

186

Enzime Deci, enzimele scad nivelul "energiei de activare" necesar ca o reacţie să poată avea loc. Această scădere a energiei de activare se datorează formării unui complex activat între enzimă şi substrat (ES) care apoi se transformă cu viteză mare în produşi finali de reacţie şi enzimă, ultima fiind capabilă să se combine cu o altă moleculă de substrat. Ipoteza formării complexului intermediar ES a K3 K1 fost emisă pentru prima dată de Michaelis şi E-S E+S E + P Menten. K2 Reacţia de formare a complexului enzimăsubstrat este reversibilă, constantele de echilibru fiind K1 şi K2. La formarea complexului activat, substratul se fixează pe centrul catalitic al enzimei. Între centrul catalitic şi molecula substratului există complementarităţi conformaţionale şi chimice (ipoteza "lacăt-cheie") care permit asamblarea lor (fig. 7.1).

Fig. 7.1. Schema modului de acţiune a enzimei Fixarea substratului pe enzimă îi imprimă acestuia o stare de tensiune moleculară care are drept consecinţă labilizarea lui şi facilitarea reacţiei biochimice. Deci rolul complexului enzimă-substrat în procesele de cataliză enzimatică este de a micşora energia de activare a reacţiei. Astfel, se consideră că un substrat S se poate transforma în compusul P atât direct, fără enzimă (1), cât şi prin cataliză enzimatică (2). Energia medie a moleculelor substratului este Er. Prin şocuri se poate ajunge la energia El necesară pentru ca S să dobândească o stare activată S l care să-i permită trecerea în P. Energia maximă El necesară transformării este energia de activare în absenţa enzimei. În prezenţa enzimei însă, prin formarea complexului enzimă-substrat este nevoie de o energie de activare mult mai mică E2 pentru transformarea substratului. Energia eliberată în ambele reacţii este însă aceeaşi, ΔE (fig. 7.2).

187

Biochimia produselor alimentare

Fig. 7.2. Nivelele de energie ale moleculelor în cursul unei reacţii fără enzimă (1) şi cu enzimă (2)

7.5. Cinetica reacţiilor enzimatice
Studiul cineticii enzimatice este deosebit de important deoarece permite cunoaşterea mecanismelor reacţiilor enzimatice, înţelegerea şi clasificarea proceselor metabolice şi importanţa lor fiziologică pentru organism. Măsurarea activităţii enzimatice se reduce la 'studiul cineticii sau vitezei reacţiei catalizate.

7.5.1. Viteza de reacţie
Este caracteristica esenţială a unei enzime, reprezintă cantitatea de substrat (S) transformată în unitatea de timp (t) şi se exprimă prin relaţia:

v=

dS dt

Dacă se reprezintă grafic variaţia cantităţii de substrat transformat (sau de produs obţinut) în unitate a de timp, se obţine o curbă formată dintr-o parte rectilinie (în care viteza este constantă) şi una curbă în care

188

Enzime viteza scade (datorită faptului că rămâne o cantitate tot mai mică de substrat netransformat). Pentru studiul cineticii se ia în considerare numai prima parte a curbei care indică viteza iniţială a reacţiei şi ea este definită prin panta maximă a curbei (fig. 7.3): vo = tgαo. Pentru un timp t1, v1 = tgα1.

7.5.2. Factorii care influenţează cinetica reacţiilor enzimatice
Viteza de reacţie, respectiv cinetica reacţiilor enzimatice este dependentă de o serie de factori, şi anume: concentraţia enzimei, concentraţia substratului, temperatură, pH, efectorii enzimatici. a. Concentraţia enzimei În condiţiile în care concentraţia substratului este constantă, viteza de reacţie iniţială (vo) este direct proporţională cu concentraţii crescânde ale enzimei între anumite limite; la concentraţii crescute de enzimă viteza de reacţie rămâne constantă ca urmare a transformării întregii cantităţi de substrat (fig. 7.4).

b. Concentraţia substratului Menţinând constantă cantitatea de enzimă şi mărind concentraţia substratului are loc o creştere a vitezei de reacţie până la o limită (Vmax). Crescând în continuare concentraţia substratului viteza de reacţie rămâne constantă, ceea ce denotă că la concentraţii mari de substrat, toate situsurile catalitice ale moleculelor de enzimă sunt complet saturate cu substrat; deci nu mai există enzimă disponibilă (fig. 7.5). Dependenţa vitezei unei reacţii enzimatice de concentraţia substratului a fost studiată iniţial de Michaelis şi Menten porninduse de la ecuaţia generală:

189

Biochimia produselor alimentare

E+S

K1 K2

E-S

K3

E+P

Aplicând legea maselor şi făcând unele transformări se ajunge la ecuaţia lui Michaelis - Menten, care se reprezintă grafic printr-o hiperbolă:

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

în care: v - este viteza reacţiei la timpul t; Vmax - viteza maximă de reacţie corespunzătoare saturării enzimei cu substrat; [S] - concentraţia substratului; Km - constanta Michaelis (moli/l). Această ecuaţie reprezintă expresia matematică care defineşte relaţia cantitativă dintre viteza de reacţie enzimatică şi concentraţia substratului. Din curbă se observă că la o valoare a vitezei de reacţie (v) egală cu jumătate din valoarea vitezei maxime de reacţie (v = Vmax/2) corespunde, pe abscisă, o valoare, a concentraţiei substratului notată K m care este tocmai constanta Michaelis. Deci, constanta Michaelis (Km) reprezintă acea concentraţie de substrat pentru care viteza de reacţie corespunde la jumătate din viteza maximă de reacţie. Aşadar, pentru v= Vmax/2, Km = [S]. Constanta Michaelis (Km) reprezintă un indicator al afinităţii enzimei pentru substrat; cu cât Km are o valoare mai mare, cu atât afinitatea enzimei pentru substrat este mai scăzută şi invers. Astfel, Km constituie un parametru cinetic operaţional care furnizează indicaţii asupra cineticii unei reacţii enzimatice, respectiv a comportării enzimei în raport cu substratul său de reacţie. Măsurarea directă a valorii algebrice Vmax şi deci calculul lui Km implică concentraţii mari de substrat pentru a atinge condiţii de saturare ceea ce este dificil în experimentele de laborator. Această dificultate poate fi evitată prin reprezentarea liniară a ecuaţiei Michaelis-Menten, care permite extrapolarea cu uşurinţă a valorilor Vmax şi Km plecând de la vitezele reacţiilor măsurate în condiţii de concentraţii de substrat inferioare saturaţiei. Ecuaţia Michaelis-Menten poate fi inversată şi Vmax descompus în factori în modul următor:

190

Enzime

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

1 Km 1 [S] = ⋅ + v Vmax [ S] Vmax [ S]

invers

1 K m + [ S] = v Vmax [ S]

sau

prin simplificare

1 Km 1 1 = ⋅ + v Vmax [ S] Vmax y = a ⋅ x + b unde

relaţia este o dreaptă care nu trece

prin origine, de forma

y=

1 v

x=
şi

1 [S] . y= 1 v

Dacă valoarea este reprezentată în funcţie de x

1 sau [ S] , intersecţia acestei
drepte, b, este egală cu

1 Vmax , şi panta, a, este Km V egală cu max .
Valoarea negativă a intersecţiei pe axa x poate fi determinată făcând y

x=−
= 0. În acest caz se obţine:

b 1 =− a Km .

O astfel de reprezentare (fig. 7.6), denumită Lineweaver-Burk permite estimarea lui Km utilizând fie panta şi punctul de intersecţie a axei y, fie punctul de intersecţie a axei x. Valoarea lui Km se exprimă în moli/l. c. Influenţa temperaturii La fel ca şi în cazul reacţiilor chimice, viteza de reacţie enzimatică creşte cu mărirea temperaturii, dar numai în anumite limite. Urmărindu-se variaţia vitezei de reacţie în funcţie de temperatură şi reprezentând grafic se obţine o curbă (fig. 7.7) din care se observa ca pentru început viteza reacţiei creşte pana la o anumită valoare denumită temperatură optimă (to). Temperatura optimă pentru cele mai multe enzime este de 30-40°C. Mărind în continuare temperatura se înregistrează o diminuare

191

Biochimia produselor alimentare progresiva a vitezei de reacţie până la o anulare a sa care se produce la o anumită temperatură, proprie fiecărei enzime şi care se numeşte temperatură de inactivare (ti). Diminuarea activităţii enzimei până la anularea ei se explică prin denaturarea termică a enzimei, al cărei edificiu molecular este afectat. Deci, enzimele sunt termolabile; încălzite dincolo de o anumită temperatură îşi pierd ireversibil activitatea. Majoritatea enzimelor sunt inactive printr-o încălzire la temperaturi în jur de 80°C, multe din ele prin încălzire chiar peste 55°C, însa sunt şi enzime care rezistă la temperaturi de peste 100°C. Temperatura de inactivare ca şi cea optimă este influenţata de mai mulţi factori. Astfel, enzimele pure sunt mai sensibile la inactivarea termică decât preparatele impure care conţin o serie de substanţe ce exercită o acţiune de protecţie a moleculei de enzimă. De asemenea, în stare uscată enzimele rezistă mai bine la temperaturi ridicate. Astfel se explică de ce, malţul folosit la fabricarea berii, deşi a suferit temperaturi ridicate in ultima fază a operaţiei de uscare, mai conţine o cantitate apreciabilă de enzime deosebit de active. La temperaturi scăzute, în general, enzimele au o activitate foarte lentă sau chiar nulă, dar prin ridicarea temperaturii ele devin din nou active. Multe din ele rezistă chiar la temperatura aerului lichid (-191°C). O dovadă a faptului că frigul nu inhibă complet activitatea enzimelor sunt transformările calitative (gust, miros, culoare) pe care le suferă alimentele congelate în timpul păstrării lor în această stare. d. Influenţa pH-ului Toate reacţiile enzimatice sunt puternic influenţate de pH-ul mediului. Reacţia are o viteză maximă pentru o anumită valoare a pH-ului sau pentru un interval foarte strâns de pH, denumit pH optim. Abateri de la aceste valori produc o scădere bruscă a vitezei de reacţie. Reprezentând grafic variaţiile vitezei în funcţie de pH se obţine o curbă în formă de clopot îngust (fig. 7.8). Valoarea pH-ului optim al diverselor enzime coincide în general cu pH-ul lichidelor din organism unde ele îşi exercită acţiunea.

192

Enzime De exemplu, pH-ul optim al pepsinei este 1,5-2,5 realizat în sucul gastric de acidul clorhidric; al tripsinei este 8-11, identic cu pH-ul sucului pancreatic. Majoritatea enzimelor vegetale acţionează bine la un pH în jur de 6-7. De asemenea, pH-ul optim de activitate al unei enzime are o valoare caracteristică numai în condiţii bine precizate. Aceste valori pot suferi variaţii sub influenţa a numeroşi factori: - cu temperatura: la 40°C amilaza din malţ are pH-ul optim 4,4 iar la 60°C - pH-ul optim este de 6,6; - cu substratul: maltaza are pH-ul optim pentru maltoză 6,0 iar pentru metilglucoză 6,7; - cu originea enzimei: amilaza din malţ are pH-ul optim de acţiune 5,2; cea din pancreas 7,0; iar cea din ficat 6,0. La majoritatea enzimelor intervalul de pH în interiorul căruia îşi manifestă acţiunea se întinde pe câteva unităţi de pH, de obicei 6-8. Abaterile de la acest interval conduc la imposibilitatea enzimei de a-şi mai exercita acţiunea. e. Influenţa radiaţiilor Activitatea enzimelor mai poate fi influenţată de radiaţii. Lumina vizibilă nu are influenţă asupra activităţii enzimelor decât în prezenţă de substanţe sensibilizante. Radiaţiile ultraviolete (UV) fiind absorbite de substanţele proteice în domeniul 260-280nm datorită resturilor de aminoacizi aromatici din molecule pot să producă ruperea unor legături care determină denaturarea proteinelor şi deci inactivarea enzimelor. Radiaţiile ionizante (razele X, radiaţiile radioactive) în doze mici acţionează indirect asupra enzimelor datorită substanţelor oxidante care iau naştere prin descompunerea apei şi a oxigenului dizolvat în apă. Sunt sensibile la aceste radiaţii enzimele care conţin grupe –SH. Prin introducerea unor antioxidanţi (glutation redus, cisteină, acid ascorbic) în mediul de reacţie, se pot proteja grupările -SH din situsul catalitic al unor enzime. f. Efectorii enzimatici Pe lângă factorii arătaţi anterior, activitatea enzimelor este influenţată şi de unele substanţe numite efectori biochimici care pot mări sau scădea viteza de reacţie enzimatică, deci pot influenţa pozitiv sau negativ activitatea catalitică a unei enzime. Substanţele capabile să mărească viteza unei reacţii enzimatice se numesc activatori enzimatici, în timp ce substanţele ce micşorează viteza unei reacţii enzimatice se numesc inhibitori enzimatici.

• Activatorii enzimatici sunt compuşi de natură organică sau anorganică care în concentraţie mică sunt necesari pentru a mări viteza unire reacţii

193

Biochimia produselor alimentare enzimatice întrucât ei aduc enzima într-o formă activă. Activatorii enzimatici îşi exercită acţiunea pe căi diferite în funcţie de natura lor. Astfel: - Ionii metalici mono- sau bivalenţi (K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, etc.), activează unele enzime prin legarea cu acestea. De exemplu, fosfotransferazele sunt activate de ionii Mg2+ sau K+ (şi inhibate de Ca2+ sau Na+). - Activatori ai unor proenzime acţionează prin înlăturarea unor fragmente din molecula inactivă a unor enzime, transformându-le în enzimă activă datorită demascării situsului catalitic. De exemplu, enterokinaza din intestin, desprinde 6 aminoacizi din molecula inactivă de tripsinogen secretat de pancreas – şi o transformă în tripsină activă. Aceşti activatori se mai numesc şi kinaze. - Substanţe protectoare. Acestea au numai indirect rolul de activator. Astfel, substanţele reducătoare care posedă grupări tiolice -SH (cisteina, glutationul) sunt agenţi complexanţi care au proprietatea de a bloca ionii metalelor grele, evitând astfel inhibarea grupărilor –SH din situsul catalitic al enzimei sau a celor ce au rol în menţinerea conformaţiei enzimei.

• Inhibitorii enzimatici. Activitatea enzimatică poate fi diminuată de o mare varietate de compuşi. Clasificarea lor este dificilă datorită compoziţiei chimice foarte diferite precum şi datorită modului lor de acţiune la fel de variat. Astfel, multe enzime sunt inactivate de metale grele (mercur, plumb, cupru) sau de unele metaloide (arsen). Există şi inhibitori de natură proteică. Astfel, în leguminoasele uscate există un inhibitor al tripsinei care sub aspect chimic este globulină.
În general, inhibitorii scad activitatea unei enzime prin două mecanisme majore: - se combină cu enzima şi o inactivează; - se combină cu substratul şi îl fac impropriu pentru transformare. Se deosebesc mai multe tipuri de inhibiţie enzimatică: - Inhibiţie competitivă. Acest tip de inhibiţie este realizată de substanţele care au o structură asemănătoare cu a substratului (fig. 7.9).

194

Enzime

Fig. 7.9. Inhibiţie competitivă În acest caz centrul catalitic (situsul catalitic) al enzimei se poate combina atât cu substratul cât şi cu inhibitorul competitiv: +I EI (inactiv) E+P E
+ -S

ES (activ)

E+P

Reacţiile fiind reversibile, prin mărirea concentraţiei sub-stratului există

posibilitatea de a scoate enzima din combinaţia cu inhibitorul, încât la o concentraţie adecvată de substrat influenţa inhibitorului este anulată (fig. 7.10). Reprezentarea Lineweaver-Burk a inhibiţiei competitive (fig. 7.11) ilustrează că la o concentraţie infinit de mare de substrat (1/[S]=0), viteza este aceeaşi ca şi în absenţa inhibitorului, dar afinitatea enzimei este scăzută. Un exemplu de inhibiţie

competitivă îl constituie cazul reacţiei de

195

Biochimia produselor alimentare dehidrogenare a acidului succinic la acid fumaric, catalizată succinatdehidrogenază. Acidul malic, diferind de acidul succinic numai prin existenţa unui hidroxil în locul unui hidrogen la una din grupările metilenice, poate să se lege de centrul activ al succinatdehidrogenazei. Fracţiunea de succinat-dehidrogenază combinată cu acidul malic poate fi recuperată prin simpla creştere a concentraţiei de substrat. - Inhibiţie necompetitivă. Inhibitorii necompetitivi se fixează pe enzimă pe alt loc decât centrul activ (nu există competiţie cu substratul), dar centrii activi ai enzimei îşi reduc capacitatea de a reacţiona cu substratul datorită unui fenomen de împiedicare sterică.
+I -

de

EI E - IS E+P ES

E
+S -

E+P Inhibitorii necompetitivi diminuează viteza maximă. Deoarece I şi S se pot fixa în locuri diferite, se poate forma atât EI cât şi EIS. Descompunerea lui EIS în produse de reacţie va fi mai lentă decât a lui ES, reacţia este mai înceată, dar nu oprită.
În cazul inhibiţiei necompetitive mărirea concentraţiei

substratului nu suprimă inhibarea activităţii enzimatice (fig. 7.12). Reprezentarea liniară (fig. 7.13) ilustrează că în inhibiţia necompetitivă valoarea lui Km rămâne neschimbată. Astfel de inhibitori necompetitivi sunt cianurile care se combină cu unele metale care sunt necesare pentru activitatea enzimei. Acidul etilendiamino-tetraacetic (EDTA) leagă Mg2+ şi alţi cationi

196

Enzime bivalenţi inhibând astfel ne-competitiv unele enzime. Unele metale grele (Hg, Pb, Ag, Cu) sunt, de asemenea, inhibitori deoarece se combină cu grupările – SH ale enzimei (din afara situsului catalitic) formând mercaptide: E - SH + Ag+ → E - S - Ag + H+ - Inhibiţie incompetitivă (mixtă). În acest caz inhibitorul se combină numai cu complexul enzimă – substrat: ES + I ↔ ESI un exemplu este cel al inhibării citocromoxidazei de către azidă. - Inhibiţie prin exces de substrat. Există unele reacţii enzimatice în care excesul de substrat duce la formarea unui complex de forma E-S-S care este mai puţin activ sau chiar inactiv. Reprezentând grafic viteza de reacţie în funcţie de concentraţia substratului se obţine o curbă în formă de clopot (fig. 7.14). Un astfel de exemplu este inhibarea

fructozo-1,6-difosfatazei 1,6-difosfat.

de către fructozo-

- Inhibitori enzimatici de origine biologică. Organismele pot să producă substanţe care să inhibe acţiunea enzimelor. Rolul acestor inhibitori naturali este fie de a apăra organismul de acţiunea dăunătoare a unei enzime străine de organism, fie de a regla anumite procese enzimatice în cazul enzimelor proprii. Astfel, paraziţii intestinali din genul Ascaris nu sunt atacaţi de proteazele tubului digestiv (pepsină, tripsină). Ei produc substanţe care inhibă acţiunea acestor enzime. Pentru tripsină sunt şi alţi inhibitori naturali. De exemplu un inhibitor tripsinic se găseşte în pancreas, în plasma sângelui, în albuşul de ou, în colostru şi în leguminoasele uscate (soia, fasole, mazăre, etc.).

7.6. Reglarea activităţii enzimatice
S-a arătat că reacţiile catalizate de enzime au loc cu viteze anumite, determinate de concentraţia lor, a substratului, de pH, temperatură etc. Aceste reacţii nu sunt independente unele de altele, ci sunt grupate, se succed formând căi metabolice care funcţionează simultan şi în mod

197

Biochimia produselor alimentare coordonat atât calitativ cât şi cantitativ. La nivel celular, activitatea enzimelor, de care depind procesele metabolice, este sub un control permanent asigurat de mai multe mecanisme de reglare: A – Sinteza enzimelor (biosinteza proteinelor- enzime). B – Mediul intracelular. La nivelul mediului intracelular pot interveni o serie de factori care să regleze activitatea enzimelor. Astfel: a) pH-ul şi electroliţii pot avea efect inhibitor sau activator. Ionii de Ca2+ exercită un rol regulator al glicolizei. Astfel, concentraţii mari inhibă acţiunea piruvatkinazei conducând la acumularea de fosfoenolpiruvat. b) hormonii. Organismele pluricelulare sunt reglate lor de hormoni. Aceştia acţionează asupra activităţii efectori enzimatici) sau asupra sintezei lor. Astfel, măreşte de 25 ori activitatea α -cetoglutarat-transaminazei; biosinteza enzimelor gluconeogenezei. în funcţionarea enzimelor (ca hidrocortizonul insulina inhibă

c) concentraţia intracelulară a cofactorilor, (NAD+, NADP+, ATP, etc.). Spre exemplu, în metabolismul acidului piruvic calea pe care acesta o va urma este în funcţie de concentraţia de NAD+ care depinde de conţinutul în O2. Dacă în celulă există O2 disponibil, NAD+ va fi produs în cantitate suficientă şi ca urmare, acidul piruvic va fi metabolizat prin ciclul acidului citric (ciclul lui Krebs). Dacă există puţin O2, NADH + H+ nu va fi oxidat de NAD +şi în acest caz acidul piruvic este redus la acid lactic. C – Membranele celulare. După cum ştie, pentru ca o moleculă a unei substanţe să fie metabolizată de celulă, ea trebuie să pătrundă în celulă. Pentru acest scop există un sistem specific de transport realizat de permeaze care ele însele sunt enzime. De asemenea, membranele intracelulare (lizozomale, mitocondriale, etc.) a căror permeabilitate pentru diversele substraturi, cofactori, enzima este diferită, permit funcţionarea normală a celulei. D – Reglarea allosterică. Mecanismul cel mai complex al coordonării metabolice este reglarea allosterică în care sunt implicate enzimele allosterice. Prin structura şi funcţiile lor, aceste enzime intervin în reglarea şi controlul diferitelor secvenţe de reacţii ale unor căi metabolice, constituind astfel un fenomen natural, necesar în desfăşurarea proceselor biochimice. Enzimele allosterice au primit această denumire datorită faptului că efectorii (activatori sau inhibitori) care influenţează activitatea lor şi care se numesc efectori allosterici – se aşează pe enzimă în alt loc – loc (situs) allosterioc – decât centrul activ.

198

Enzime

Fig. 7.15. Modul de acţiune al unui activator allosteric

Efectorii allosterici modifică conformaţia enzimei şi deci a centrului catalitic făcându-l să devină mai apt (activator) sau mai puţin apt (inhibitor) de a se combina cu substratul. Modificarea structurală a enzimei sub influenţa efectorului allosteric se numeşte tranziţie allosterică.

Fig. 7.16. Modul de acţiune al unui inhibitor allosteric Enzimele allosterice sunt constituite din mai multe subunităţi – sunt deci oligomere. Efectorii allosterici, dar nu substratul, le conferă o rezistenţă mărită la denaturarea termică. Ele posedă mai multe locuri (situsuri) de legare (cel puţin două), având un centru activ (situs catalitic) la care se leagă substratul şi care este responsabil de activitatea catalitică propriuzisă şi un situs allosteric la care se leagă selectiv şi reversibil efectorii enzimatici. Enzimele allosterice manifestă o comportare cinetică diferită de cea stabilită de Michaelis-Menten; relaţia dintre viteza reacţiei şi

199

Biochimia produselor alimentare concentraţia substratului indică pentru aceste enzime o curbă cu un aspect sigmoid (fig. 7.18). Aceasta se traduce printr-un efect cooperativ, adică fixarea primei molecule de substrat facilitează fixarea următoarei molecule de substrat; se consideră astfel că fiecare moleculă de enzimă se combină nu cu o singură moleculă de substrat ci cu mai multe şi acest lucru se explică prin natura oligomeră a enzimelor allosterice (existenţa mai multor lanţuri polipeptidice şi deci a mai multor situsuri catalitice). În ansamblul proceselor de reglare biochimică a activităţii metabolice a organismelor, mecanismul de reglare prin tranziţii allosterice deţine un rol dominant. Reglarea allosterică este o reglare tip feed-back, care se mai numeşte reglare prin retroinhibiţie sau prin produs final. Reglarea feed-back reprezintă un proces specific de reglare prin care produsul final (P) al unei secvenţe constituită din mai multe reacţii biochimice înlănţuite şi catalizate de enzime diferite acţionează asupra primei enzime din sistem pe care o inhibă: Inhibitie feed-back

A

E1

B

E2

C

E3

D

E4

P

În această secvenţă prima enzimă (E1) este o enzimă allosterică. Inhibarea ei de către produsul final demonstrează că acesta (P) se comportă ca un efector allosteric; în consecinţă el se fixează la situsul allosteric al enzimei allosterice (E1) care astfel este supusă unei tranziţii allosterice ce are drept efect o diminuare sau anulare temporară a activităţii catalitice. În felul acesta, enzima E1 asigură reglarea activităţii întregului şir de reacţii, în sensul că inhibarea activităţii ei nu mai permite fucţionarea succesivă a celorlalte enzime deoarece substraturile acestora (B, C, D) nu se mai produc.

200

Enzime În concluzie, reglarea allosterică se manifestă prin efecte de inhibare sau de activare a activităţilor enzimatice aferente unui set de reacţii caracteristice diferitelor căi metabolice, controlând astfel dinamica biochimică a metabolismului celular.

7.7. Preparate enzimatice
Activitatea catalitică a enzimelor, extrem de importantă din punct de vedere fiziologic, prezintă şi o deosebită importanţă practică. O serie de industrii care prelucrează materii prime de origine vegetală sau animală au de a face în procesele lor tehnologice cu reacţii catalizate de enzime care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de microorganismele ce se dezvoltă în /pe ele. Reacţii enzimatice similare pot avea loc însă şi cu enzime exogene sau cu sisteme enzimatice extrase din diverse surse bogate în enzime şi introduse apoi în procesele tehnologice în scopul realizării unor transformări dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate din mediile în care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se caracterizează printr-o puritate mai mică sau mai mare în funcţie de cantitatea şi tipul compuşilor, proveniţi din sursa enzimatică, ce le însoţesc. Cu alte cuvinte, preparatele enzimatice pot fi mai mult sau mai puţin pure (purificate). În vederea obţinerii preparatelor enzimatice trebuie ales un material biologic bogat în enzime cu o înaltă activitate catalitică; materialul trebuie să fie ieftin, uşor accesibil şi să se prelucreze uşor. Materiile prime folosite la obţinerea preparatelor enzimatice pot fi de natură vegetală, animală sau microbiană. La plante concentraţii mari de enzime se întâlnesc în seminţe, în boabele de cereale germinate şi negerminate, în fructe, rădăcini, sevă, frunze. La animale enzimele se găsesc în toate celulele, însă concentraţii mari de anumite enzime se găsesc localizate în diferite organe ca: ficat, rinichi, inimă, muşchi. Acestea au însă organe şi ţesuturi specializate în producerea de enzime, aşa cum sunt glandele salivare, mucoasa stomacului, pancreasul, mucoasa intestinală. O sursă foarte importantă de enzime pentru obţinerea preparatelor enzimatice o constituie microorganismele: bacteriile, drojdiile şi mucegaiurile. Acestea prezintă avantajul că se pot obţine cu uşurinţă în cantităţi mari prin înmulţirea în instalaţii speciale pe medii de cultură ieftine, de obicei subproduse ale industriei alimentare(tărâţe de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi de soia şi de floarea soarelui, etc.). de asemenea, ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt în comparaţiei cu ciclul de dezvoltare al animalelor şi plantelor, iar

201

Biochimia produselor alimentare producţia lor de enzime poate fi mult mărită prin selectarea şi utilizarea de tulpini şi mutante înalt productive şi prin utilizarea unor condiţii optime de cultivare. Eliberarea enzimelor din celule. Procesul de extracţie a enzimelor din materiile prime enzimatice este precedat întotdeauna, cu excepţia enzimelor extracelulare elaborate de microorganisme, de operaţia de dezintegrare a celulelor pentru eliberarea enzimelor. Enzimele extracelulare secretate de microorganisme în timpul dezvoltării lor se găsesc în cea mai mare parte în mediile de cultură lichide sau solide şi numai o mică parte se mai află în interiorul celulelor în momentul opririi procesului de înmulţire. Ca urmare,lichidul de cultură sau mediul solid constituie deja preparate enzimatice brute. Pentru eliberarea enzimelor intracelulare este nevoie de distrugerea membranelor celulare. In cazul ţesuturilor animale se folosesc maşini de mărunţit sau omogenizatoare. Pentru mărunţirea organelor şi ţesuturilor vegetale se folosesc mori cu valţuri sau cu ciocane. Ruperea membranelor celulare ale unor microorganisme este o operaţie mult mai dificilă şi poate fi realizată cu ajutorul unor agenţi mecanici (mojarare în prezenţa nisipului de cuarţ, a sticlei pisate sau agitarea suspensiei de celule în prezenţa unor abrazivi), agenţi fizici (ultrasonare, îngheţ şi dezgheţ repetat), agenţi chimici (detergenţi, solvenţi organici) sau biochimici (enzime). Extracţia enzimelor. După dezintegrarea celulelor, urmează operaţia de extracţie a lor care constă în amestecarea materialului cu solvenţi care dizolvă enzimele şi apoi în separarea soluţiei de enzime de toate particulele în suspensie. Solubilizarea se realizează prin tratarea materialului cu apă sau soluţii diluate de săruri, în funcţie de solubilitatea enzimei. Molaritatea şi pH-ul mediului de extracţie, precum şi timpul necesar unei extracţii optime se stabilesc experimental. Amestecul de material şi solvent este centrifugat iar supernatantul reprezintă extractul enzimatic brut care poate fi utilizat ca atare, după concentrare sau după uscare sau este supus operaţiei de purificare. Purificarea enzimelor din extracte. În extracte, enzimele se găsesc alături de numeroase substanţe care s-au solubilizat în acelaşi timp în solvenţii de extracţie folosiţi. Deoarece substanţele însoţitoare ale enzimei pot influenţa utilizarea şi activitatea preparatelor enzimatice este necesar să se procedeze la purificarea enzimelor. În general, metodele de purificare se referă fie la îndepărtarea impurităţilor din extract, fie la îndepărtarea enzimei din extract prin precipitare, absorbţie sau extracţie. Moleculele mici de impurităţi pot fi îndepărtate din extract printr-o simplă dializă faţă de apă sau faţă de o soluţie tampon. Moleculele cu mase moleculare mai mari, (proteinele) sunt separate prin precipitări fracţionate cu săruri anorganice sau cu solvenţi organici, prin cromatografiere pe “site moleculare” (Sephadex), schimbători de ioni (DEAE – celuloză, CM-celuloză, etc.), absorbanţi (hidroxilapatita).

202

Enzime După această operaţie se obţin preparate enzimatice parţial purificate. Cristalizarea. Când preparatul enzimatic a fost adus într-o stare avansată de puritate este posibilă cristalizarea lui. Cea mai uzuală metodă de cristalizare foloseşte soluţii saturate de sulfat de amoniu. Pentru aprecierea purităţii preparatelor enzimatice se utilizează curbele de solubilitate care stabilesc variaţia cantităţii de enzimă solubilizată în funcţie de cantitatea de enzimă introdusă în soluţie. Preparate enzimatice imobilizate. În scopul utilizării repetate a unei enzime şi pentru desfăşurarea în instalaţii continui sau semicontinui a reacţiilor enzimatice, în practica industrială au căpătat o largă utilizare în ultimul timp preparatele enzimatice imobilizate. Imobilizarea enzimelor constă în legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem enzimatic de un suport insolubil în apă, cu păstrarea proprietăţilor catalitice. Suporturile sau matricele utilizate în imobilizarea enzimelor pot fi de natură anorganică: silice coloidală, perle de sticlă cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu etc.) şi de natură organică: celuloză şi derivaţii acesteia, agaroză, amidon, dextran, colagen, poliacrilamida, acid metacrilic etc. Metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazează pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legăturilor fizice: interacţiuni electrostatice, legături ionice, de hidrogen. Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor constau în formarea de legături covalente sau parţial covalente între diferite grupări funcţionale care nu sunt esenţiale pentru manifestarea activităţii catalitice şi un suport activat chimic, insolubil în apă. Prin legarea fizică se obţin preparate imobilizate sub formă de: - enzimă absorbită pe un suport insolubil în apă (celuloză, sticlă, schimbători de ioni, cărbune); - enzimă inclusă în structuri macromoleculare formate prin polimerizarea unor materiale în prezenţa moleculelor de enzimă; se formează o matrice de polimer în care sunt incluse moleculele de enzimă; - microcapsule din membrane semipermeabile în care enzima este încapsulată; - celule de ultrafiltrare care conţin enzimă imobilizată. În legarea chimică a enzimelor de suport, preparatul enzimatic rezultă prin copolimerizarea enzimei cu un monomer şi legarea încrucişată (cross-linking) sau reticulară intra- şi inter- moleculară a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncţional. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoacă schimbări în comportamentul acestora şi în cinetica reacţiilor: se

203

Biochimia produselor alimentare măreşte stabilitatea enzimei, se schimbă afinitatea enzimei faţă de substrat. Preparatele enzimatice imobilizate prezintă o serie de avantaje: - utilizarea repetată a enzimei. Cu aceeaşi cantitate de enzimă se poate prelucra o cantitate mai mare de substrat; - utilizarea unor instalaţii cu funcţionare continuă care permit conducerea automatizată a proceselor; - enzima nu rămâne în produs; - reacţia se poate opri la momentul dorit printr-o simplă operaţie mecanică. Cu toate avantajele pe care le prezintă enzimele imobilizate, deocamdată industria alimentară utilizează numai glucozoizomeraza imobilizată pentru transformarea glucozei în fructoză şi lactaza imobilizată pentru hidroliza lactozei din lapte sau zer. Exprimarea activităţii enzimatice Studiul cantitativ al enzimelor constă în măsurarea activităţii catalitice a acestora. Dozarea activităţii enzimelor se bazează pe proprietatea lor de a cataliza o anumită reacţie caracterizată, printr-o anumită viteză, în condiţii determinate (timp, pH, temperatură). Comisia de Enzimologie de pe lângă Uniunea Internaţională de Biochimie recomandă folosirea următoarelor unităţi: - unitatea enzimatică (U) reprezintă acea cantitate de enzimă care catalizează transformarea unui micromol (mmol; 10-6 mol) de substrat în timp de 1 minut, la 25°C, în condiţii optime de pH şi de concentraţie de substrat Unităţile enzimatice se pot exprima şi în nanomoli (nmol; 10 -9 mol) sau picomoli (pmol; 10-2 mol) de substrat care reacţionează, sau de produs de reacţie format, într-un minut. Se recomandă de asemenea , exprimarea activităţii enzimatice în Katali (Kat); un Kat reprezintă cantitatea de enzimă ce transformă un mol de substrat într-o secundă. 1 Kat = 1 mol/s = 60 moli/min = 60 x 106 µmoli/min = 6 x 107 U - activitate specifică reprezintă numărul de unităţi enzimatice raportat la 1 mg proteină; - activitate molară este numărul de moli de substrat transformat (sau de produs format) în decurs de 1 minut de o moleculă de enzimă; acest mod de exprimare a activităţii enzimatice necesită cunoaşterea greutăţii moleculare a enzimei luate în studiu; - activitatea centrului activ se exprimă prin numărul de molecule de

204

Enzime substrat transformate într-un minut de centrul activ al enzimei.

7.8. Nomenclatura şi clasificarea enzimelor
Enzimele sunt substanţe complexe şi întrucât la majoritatea nu li se cunoaşte precis structura, nu li s-a făcut o clasificare pe baza structurii chimice. Iniţial ele au fost denumite după substratul pe care îl transformă urmat de sufixul "ază" (lipază, maltază etc.); de asemenea, s-au păstrat denumiri mai vechi care nu aduc informaţii speciale: pepsină, papaina, tripsină. Identificarea unui număr tot mai mare de enzime (în prezent sunt cunoscute peste 2000) a impus necesitatea unei nomenclaturi. Astfel, în 1961 Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie a stabilit un sistem de nomenclatură şi clasificare pentru enzime; denumirea unei enzime este constituită din trei părţi: 1) denumirea substratului (sau substratelor); 2) tipul de reacţie; 3) sufixul - ază. De exemplu, enzima care catalizează reacţia de transformare a acidului lactic în acid piruvic este denumită lactat-dehidrogenaza. Pe acest principiu enzimele sunt clasificate în clase, în subclase şi subsubclase în funcţie de unele detalii privind grupările chimice supuse transformării (hidroliză, transfer, activare, etc.) şi natura cofactorilor implicaţi în reacţia pe care o catalizează. Fiecare enzimă este desemnată printr-un cod format din 4 cifre care conţine informaţii despre enzima respectivă. De exemplu, lactatdehidrogenaza are codul EC 1.1.1.27; EC reprezintă prescurtarea de la Enzyme Commission; prima cifră – clasa; a doua – subclasa; a treia – sub-subclasa, iar a patra – numărul de ordine a enzimei din subsubclasă. Uneori este necesară şi o infirmaţie adiţională asupra naturii reacţiei. Aceasta este indicată în paranteze. De exemplu, pentru reacţia: L-malat + NAD+ → piruvat + CO2 + NADH + H+ enzima este denumită L-malat-NAD oxidoreductaza (de decarboxilare). În funcţie de tipul reacţiei pe care o catalizează, enzimele sunt împărţite în şase mari clase: • Oxidoreductaze – sunt sisteme enzimatice care catalizează reacţii de tip redox. În aceste reacţii are loc transferul de electroni sau de hidrogeni între diferiţi parteneri de reacţie. Energia liberă care se degajă în aceste reacţii constituie cea mai importantă sursă energetică pentru metabolismul celulei vii.

205

Biochimia produselor alimentare • Transferaze – sunt enzime care catalizează reacţiile de transfer a unui fragment molecular de pe un substrat pe altul. Energia implicată în timpul acestei transformări este de multe ori apropiată ca valoare de cea care rezultă din reacţiile redox. • Hidrolaze – cuprind enzimele care catalizează reacţiile de scindare a substratului cu participarea apei. • Liaze – catalizează reacţiile de desfacere în care nu apar fenomene de tip redox sau de hidroliză. • Izomeraze – sunt sisteme enzimatice care catalizează reacţiile de izomerizare a substanţelor. • Ligaze – catalizează reacţii în care se formează legături chimice noi, energia necesară fiind furnizată de ATP.

7.9. Descrierea principalelor clase de enzime
7.9.1. Oxidoreductaze
În clasa oxidoreductazelor sunt cuprinse enzimele care catalizează reacţii de oxidoreducere ce se manifestă prin transfer de electroni de la un donor (agent reducător) către un acceptor (agent oxidant). În timpul trecerii electronilor de la agentul reducător la agentul oxidant se creează o diferenţă de potenţial care va fi cu atât mai mare cu cât compusul care primeşte electroni are o afinitate mai mare pentru aceştia. Transferul de electroni în multe reacţii are loc prin transferul atomilor de hidrogen; astfel dehidrogenarea are ca echivalent oxidarea, iar hidrogenarea reducerea. Aceste enzime se deosebesc de enzimele altor clase prin unele particularităţi. Astfel, în celula vie oxidoreductazele formează sisteme – aşa numite lanţuri de enzime oxido-reducătoare, în care are loc un transfer în trepte al atomilor de hidrogen sau al electronilor de la primul substrat la acceptorul final, care, de regulă, este oxigenul. În final, atomii de hidrogen sunt transferaţi pe oxigen şi se formează apa. Oxidoreductazele care transferă atomii de hidrogen sau electronii direct pe atomii de oxigen se numesc dehidrogenaze aerobe sau oxidaze. Spre deosebire de acestea, oxidoreductazele care transferă atomii de hidrogen şi electronii de la un component al lanţului de oxidare la altul fără a-i ceda oxigenului, se numesc dehidrogenaze anaerobe. Dacă

206

Enzime enzima catalizează reacţia luând hidrogen direct de la substanţa ce se oxidează (primul substrat), atunci ea se numeşte dehidrogenază primară. Dacă enzima accelerează prelucrarea atomilor de hidrogen de la al doilea substrat, care a primit atomii de hidrogen prin intermediul dehidrogenazei primare (al doilea substrat poate fi chiar oxidoreductaza primară), atunci poartă denumirea de dehidrogenază secundară. O particularitate importantă a oxidoreductazelor este faptul ca intervin într-o mare varietate de reacţii redox. Acest lucru se explică prin faptul că, unul şi acelaşi cofactor este capabil să se unească cu diverse apoenzime, formând de fiecare dată o oxidoreductază specifică în raport cu un substrat sau altul. Oxidoreductazele îşi exercită acţiunea lor catalitică în prezenţa unor coenzime diferite: nicotinamidice, flavinice, heminice care se comportă ca acceptori intermediari între substratul primar şi acceptorul final. 7.9.1.1. Oxidoreductaze NAD+ - sau NADP+ - dependente Aceste enzime denumite şi dehidrogenaze (transhidrogenaze) catalizează reacţii de oxidoreducere prin transfer, în general reversibil, de hidrogen de pe un donor pe un acceptor. Au un caracter anaerob deoarece acceptorul de hidrogen este altul decât oxigenul. Acţiunea catalitică a dehidrogenazelor constă într-o labilizare a hidrogenului din molecula substratului (donorul), astfel că acetsa devine apt să se unească cu o altă moleculă din sistem – acceptorul – capabil să-l fixeze. Acţiunea de activare se explică prin faptul că dehidrogenazele sunt sisteme oxido-reducătoare reversibile, adică fixează cu uşurinţă hidrogenul substratului pe care-l pot ceda, cu aceeaşi uşurinţă, unui acceptor capabil să-l primească, dar nu direct, ci numai prin intermediul dehidrogenazelor. Dacă se notează cu DH2 substratul (donorul de hidrogen), cu Ttransportorul de hidrogen (enzima), cu A – acceptorul de hidrogen, reacţia de oxido-reducere se poate reprezenta schematic astfel: DH2 + T + A ↔ D + T + AH2 Aceasta se realizează de fapt prin etapele: DH2 + T ↔ D + TH2 TH2 + A↔ T + AH2 în care transportorul intervine direct, dar numai temporar. Mecanismul de acţiune al dehidrogenazelor este determinat de cofactorul lor care este NAD+ sau NADP+. Funcţia de acceptor de protoni şi electroni o îndeplineşte nucleul piridinic al acestor coenzime conform reacţiei:

207

Biochimia produselor alimentare

DH2 ↔ D + 2H+ + 2e NAD (sau NADP ) + 2e + 2H+ ↔ NADH (sau NADPH) + H+
+ +

sau

H
4 4 +

H + H+ N R

+ 2H ++ 2e

N R NAD+ (NADP+)

NADH (NADPH)

Se observă că, în această reacţie substratul (DH2) dă doi atomi de hidrogen; un atom de hodrogen se leagă la molecula coenzimei (în poziţia 4 a nucleului piridinic), iar al doilea atom de hidrogen îi dă electronul coenzimei şi se transformă în proton (H+) care este absorbit de capacitatea tampon a mediului de reacţie. Oxidoreductazele NAD+ - dependente intervin în procese metabolice oxidative (ciclul acidului citric, catena de oxidare celulară), iar cele NADP+ dependente, în procesele reductive de sinteză (biosinteza extramitocondrială a acizilor graşi, steroizilor etc.) şi în şuntul pentozomonofosfat. Dehidrogenazele au o largă distribuţie în diferite ţesuturi, catalizând reacţii în care intervin diverse substraturi. Câteva exemple de dehidrogenaze:

Enzima

Denumirea prescurtat ă

Coenzima

208

Enzime Lactatdehidrogenaza Alcooldehidrogenaza Glicerofosfatdehidrogenaza Colindehidrogenaza Malatdehidrogenaza Glutamatdehidrogenaza Glucozo-6-fosfatdehidrogenaza D-izocitricdehidrogenaza Glutationreductaza LDH ADH GPDH ChDH MDH GDH G-6-PDH ICDH NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ + NAD sau NADP+ NAD+ sau NADP+ NADP+ NADP+ NADP+

Reacţiile în următoarele:

care

intervin

unele

din

aceste

dehidrogenaze

sunt

- lactatdehidrogenaza (LDH) catalizează reacţia de dehidrogenare a acidului lactic la acid piruvic:
NAD+ NADH+H+

CH3 CH COOH OH acid lactic

CH3

C COOH

O acid piruvic

Are o specificitate în raport cu configuraţia L a acidului lactic, forma D fiind mult mai lent dehidrogenată. Lactatdehidrogenaza se găseşte în muşchi, plămâni, ficat şi în alte ţesuturi animale. O enzimă similară există în plante şi microorganisme. - alcooldehidrogenaza (ADH) catalizează reacţia transformare a alcoolului etilic în acetaldehidă:
NAD+ NADH+H+

reversibilă

de

CH3 CH2 OH alcool etilic

CH3

CHO

acetaldehidã

Reacţia reprezintă etapa finală a fermentaţiei alcoolice. Enzima se găseşte în ţesuturile animale, vegetale şi microorganisme. Alcooldehidrogenaza din drojdie este o enzimă ce conţine grupe –SH drept grupări active. glicerofosfatdehidrogenaza (GPDH) catalizează reversibilă a α-glicerofosfatului în dioxiacetofosfat: dehidrogenarea

OH CH2 CHOH CH2OH α-glicerofosfat O P OH O

NAD+ NADH+H+

OH CH2 C O CH2OH dioxiacetonfosfat O P OH O

209

Biochimia produselor alimentare Enzima este specifică. Intervine în etapele fermentaţiei alcoolice şi ale glicolizei. Este prezentă în drojdie, celulele animale şi vegetale. - malatdehidrogenaza (MDH) catalizează reacţia de oxidare a acidului malic cu formare de acid oxalilacetic:

COOH CH OH CH2 COOH acid malic
NAD+ NADH+H+

COOH C O CH2

COOH acid oxalilacetic

Enzima face parte din sistemul enzimatic al ciclului acidului citric şi este prezentă în toate organismele. - glucozo-6-fosfatdehidrogenaza (G-6-PDH) transformă glucozo-6-fosfatul în acid 6-fosfogluconic:
OH CH2 O H H OH

O
H

P H OH

O OH

NADP+

NADPH+H+

H

CH2 O OH H H

P

O OH

OH OH H

OH OH H

COOH

OH

OH

glucozo-6-fosfat
Este o enzimă absolut specifică.

acid-6-fosfogluconic

- D-izocitricdehidrogenaza (ICDH), importantă în ciclul acidului citric, face trecerea acidului D-izocitric în acid oxalsuccinic:

HO CH COOH CH COOH CH2 COOH acid izocitric

NADP+

NADPH+H+

O C

COOH

CH COOH CH2 COOH acid oxalsuccinic

Activitatea enzimei necesită prezenţa Mg2+ sau Mn2+, iar reacţia de dehidrogenare este urmată de una de decarboxilare. - glutationreductaza participă la oxidoreducerea glutationului:
NADPH+H+ NADP+

G S S G glutation oxidat

2 G SH glutation redus

210

Enzime În felul acesta este refăcut glutationul redus necesar pentru menţinerea în formă activă a conformaţiei unor enzime ce conţin grupări –SH. 7.9.1.2. Oxidoreductaze FAD sau FMN dependente (Flavinenzime) Flavinenzimele sunt enzime care actalizează reacţii de oxidoreducere transferând hidrogenul fie direct de la substrat, fie de la formele reduse ale coenzimelor piridinice la oxigenul molecular sau la alţi intermediari. Cele care transferă hidrogenul oxigenului funcţionează ca dehidrogenaze aerobe, pe când cele ce transferă hidrogenul la un acceptor oarecare, diferit de oxigen, au un caracter anaerob. Transferul hidrogenului de către aceste enzime se realizează prin intermediul cofactorilor lor. Acestea sunt flavinadeninmononucleotidul (FMN) şi flavinadenindinucleotidul (FAD). FMN şi FAD se deosebesc de NAD+ şi NADP+ prin faptul că sunt strâns legate de molecula de apoenzimă, de care se despart doar printr-o hidroliză acidă. Toate nucleotidele flavinice conţin riboflavină al cărei nucleu izoaloxazinic conţine duble legături conjugate ce conferă funcţia dehidrogenazică:
R H3C H3C N N O NH O +2H -2H H3C H3C R N H N O NH

N FAD (FMN) (Forma oxidata)

O FADH2 (FMNH2)

N H

Transferul a doi atomi de hidrogen se realizează prin adiţia şi cedarea hidrogenului la nivelul sistemului de duble legături conjugate la care participă atomii de azot din poziţiile 1 şi 10 ale ciclului izoaloxazinic. Enzimele flavinice intervin ca transportori de hidrogen într-un mare număr de reacţii de oxidoreducere şi în special în dehidrogenările în care, în prima etapă, intervin dehidrogenazele cu NAD+ şi NADP+, determinând regenerarea formelor oxidate ale acestor coenzime. în cazul enzimelor flavinice cu caracter aerob, succesiunea de reacţii poate fi redată astfel:

211

Biochimia produselor alimentare
DH2 NAD+ FADH2 O2

Acceptorul de D FAD NADH + H+ este oxigenul iar produsul de reacţie este apa oxigenată. -

H2O2

hidrogen molecular

în cazul enzimelor flavinice cu caracter anaerob, reacţiile decurg în modul următor:
DH2 NAD+ FADH2 2 citocromi (Fe3+)

D Aceste 2 citocromi (Fe2+) + 2H+ FAD NADH + H+ reacţii constituie o parte a catenei de oxidare celulară, în care după cum se observă, cofactorii FAD sunt situaţi între NAD+ şi citocromi. În felul acesta, în lanţul reacţiilor de oxidoreducere ale respiraţiei celulare, enzimele flavinice au funcţia de a transporta hidrogenul substratului, preluat iniţial de NAD+, la citocromi.

Unele flavinenzime conţin în molecula lor şi metale, Cu2+, Fe3+ sau Mo2+, ceea ce le conferă un rol dublu, fiind şi transportoare de electroni. Dintre flavinenzime se menţionează câteva mai importante: - glucozoxidaza, care catalizează reacţia de oxidare a glucozei la acid gluconic cu formare de H2O2. Enzima se foloseşte pentru dozarea glucozei în mod specific. Preparatele enzimatice care conţin glucozoxidază, obţinute din culturi de diferite mucegaiuri ,sunt utilizate şi în industria alimentară pentru îndepărtarea glucozei şi a oxigenului din diverse produse. Îndepărtarea glucozei este necesară pentru a se evita desfăşurarea reacţiei Maillard în unele alimente (ex. din albuşul de ou întreg la obţinerea prafului de ouă). Consumarea oxigenului rezidual din alimente în prezenţa excesului de glucoză şi a glucozoxidazei evită procesele oxidative care afectează calităţile produselor. Îndepărtarea enzimatică a oxigenului se aplică pentru conservarea maionezei, laptelui praf, prafului de ouă, cafelei prăjite, untului, produselor din carne. Preparatul enzimatic introdus în pungi de polietilenă permeabilă la aer şi impermeabilă la apă, se închide în ambalaj odată cu alimentul, iar oxigenul din acesta difuzează prin membrană şi este consumat de glucozoxidază. Apa oxigenată formată este descompusă de catalază, enzimă care însoţeşte preparatul de glucozoxidază. De asemenea, prin oxidarea β -glucozei sub acţiunea glucozoxidazei se formează δ -gluconolactona utilizată în industria preparatelor de carne

212

Enzime pentru menţinerea culorii roşii caracteristice a acestor produse. - D-aminoaxcidoxidazele realizează oxidarea formelor D ale aminoacizilor după reacţia generală:
COOH H C R NH2 + O2 + H2O FAD FADH2 COOH C R O + NH3 + H2O2

Aceste enzime se găsesc în rinichi, prezintă o specificitate în raport cu configuraţia aminoacizilor (formele L nu sunt oxidate), iar reacţiile de acest tip constituie sursa principală de peroxid de hidrogen în sistemele metabolice. Coenzima lor este FAD. Formele L ale aminoacizilor sunt oxidate de L-aminoacid-oxidaze cofactor FMN. ce au drept

- citocrom-c-reductaza se găseşte în ficat, inimă, drojdie şi acţionează sinergic cu enzimele NAD+ dependente, după mecanismul enzimelor flavinice de tip anaerob. - xantinoxidaza catalizează oxidarea bazelor purinice – xantina şi hipoxantina până la acid uric:
O HN N N H N FAD FADH2 O HN N H N H O N

H2O + O2

H2O2

hipoxantina
O FAD FADH2 O HN N H N H NH O

xantina

H2O + O2

H2O2

acid uric

Xantinoxidaza se găseşte în lapte, precum şi în ţesuturile animale şi vegetale. Necesită Mo pentru acţiune. 7.9.1.3. Citocromii Citocromii sunt enzime care catalizează reacţiile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor pe un acceptor.

213

Biochimia produselor alimentare Numai puţine dehidrogenaze sunt capabile de a ceda hidrogenul preluat de la substrat sau de la dehidrogenaze reduse direct oxigenului din aer. Veriga intermediară între piridinele sau enzimele flavinice reduse, pe de o parte, şi oxigenul atmosferic pe de altă parte, o constituie sistemul citocromic. Sistemul citocromic este alcătuit din citocromi precum şi din citocromoxidază, enzimă care activează oxigenul molecular şi oxidează cu acesta citocromul redus. Sistemul citocromic se întâlneşte practic în toate organismele aerobe. El cuprinde o serie de citocromi care se deosebesc după spectrul de absorbţie, după afinitatea faţă de oxigenul molecular, potenţialul redox şi sunt denumiţi prin diferite litere sau litere care poartă ca indice o cifră: citocrom a, citocrom a3, citocrom b, citocrom c, citocrom c1, citocrom P-450 etc. Citocromii reprezintă în sine nişte proteine conjugate (cromoproteide) a căror grupare prostetică este hemul şi al căror mecanism de acţiune se bazează pe posibilitatea de a-şi schimba reversibil valenţa fierului din ion feros în ion feric şi invers. -ecit (Fe3+) cit (Fe2+) +eforma oxidata Prin această forma redusa schimbare de valenţă se realizează transferul de electroni. În funcţie de natura hemului pe care-l conţin, citocromii au fost clasificaţi în patru grupe: - citocromii a - care au drept coenzimă formil-porfirina; - citocromii b – care conţin protoporfirina; - citocromii c – conţin porfirină substituită legată covalent cu partea proteică; - citocromii d – au drept coenzimă dihidroporfirina. După spectrul de absorbţie în soluţie alcalină de piridină, citocromii se clasifică în: 580-590 nm pentru citocromii a; 556-558 nm pentru citocromii b; 549-551 nm – citocromii c şi 600-620 nm citocromii d. În funcţie de potenţialul oxido-reducător, citocromii se diferenţiază în: a1, a2, a3, b1, b5, c1, c2, c3, c4. Citocromul a transferă electronii de la citocromul c la citocromul a3. Citocromul a3 împreună cu citocromul a formează o moleculă unică, citocromoxidaza care transferă electronii direct oxigenului molecular; este deci o transelectronază aerobă spre deosebire de ceilalţi citocromi

214

Enzime care sunt de tip anaerob. Citocromul a3 are potenţialul cel mai electropozitiv şi în afară de fier mai conţine şi cupru, iar partea sa proteică este legată de o lipoproteidă a membranei mitocondriale. Acceptă electronii de la citocromul a şi îi cedează oxigenului care va reacţiona cu H+ formând apa:

2 cit. a (Fe2+) + 2 cit. a3(Fe3+) 2 cit. a3 (Fe2+) + 1/2 O2 O + 2H
2+

2 cit. a (Fe3+) + 2 cit. a3(Fe2+) 2 cit. a3 (Fe3+) + O2H2O

Citocromoxidaza se diferenţiază de hemoglobină şi de mioglobină întrucât acestea când se oxigenează nu-şi modifică valenţa fierului din structură; la citocromoxidază valenţa fierului se modifică atunci când interacţionează cu oxigenul. Citocromul b transportă electronii de la ubichinonă la citocromul c în catena de respiraţie celulară. Citocromul b5 face parte din structura microzomilor şi participă la transportul de electroni şi la procesele de hidroxilare împreună cu citocromul P-450. Citocromul c este cel mai cunoscut citocrom atât în ceea ce priveşte structura, cât şi funcţia sa. El acţionează ca transportor de electroni în catena de respiraţie celulară între citocromii b şi a. Se găseşte în miocard, în ficat, rinichi, în germenii cerealelor, în drojdii. Citocromul c are legată partea heminică de partea proteică prin punţi de sulf;

215

Biochimia produselor alimentare de asemenea, este posibilă stabilirea de legături coordinative între fierul din hem şi ciclul imidazolic al radicalilor de histidină. O asemenea structură conferă moleculelor de citocromi o mare stabilitate. În transferul electronilor de la atomii de hidrogen prin catena de oxidare celulară, la nivelul mitocondriilor, iau parte succesiv citocromii b, c1, c, a, a3 dispuşi în această ordine pe baza potenţialului redox. Trebuie totodată, precizat că citocromii iau parte nu numai în procesul de respiraţie, ci şi în procesele de fotosinteză, chemosinteză şi fixare a azotului molecular. 7.9.1.4. Oxidaze Oxidazele sunt enzime care catalizează reacţiile directe dintre substraturile lor şi oxigenul molecular, transferând hidrogen sau electroni de la substrat la O2. În funcţie de mecanismul de acţiune, oxidazele, se împart în următoarele tipuri: • Oxidaze care transportă electroni. Acestea catalizează reacţii în care electronii substratului sunt transferaţi pe O2 după reacţia: DH2 D ½O2 H2O

Fac parte din această categorie de enzime citocromoxidaza, al cărei rol în procesele redox a fost prezentat anterior, ascorbatoxidaza, fenoloxidazele, ceruloplasmina. a)Ascorbatoxidaza este o cupruenzimă ce catalizează oxidarea acidului ascorbic la acid dehidroascorbic:
O C HO C HO C HC HO C H CH2OH acid ascorbic O + 1/2 O 2
-H2O

O C O C O C HC HO C H CH2OH acid dehidroascorbic O

216

Enzime Este larg răspândită în vegetale. Deosebit de activă este

ascorbatoxidaza din dovleac, varză şi dovlecei. În unele plante această enzimă are rol de oxidază finală în sistemul enzimatic oxidoreducător al glutationului. Ascorbatoxidaza este foarte specifică în privinţa acceptorului de electroni, care trebuie să fie oxigenul molecular şi în privinţa substratului care trebuie să aibă o structură dienolică adiacentă grupării carboxil, o structură în ciclul închis şi izomerul L. Are pH-ul optim 5,6-6,0. Reacţia de oxidoreducere a acidului ascorbic are loc în mod permanent în ţesutul vegetal integru, sub acţiunea unor sisteme redox (glutation). Dacă ţesutul este vătămat, reacţia de oxidare devine enzimatică datorită prezenţei O2, nu mai este reversibilă şi ca urmare are loc o scădere sensibilă a conţinutului de acid ascorbic. Ascorbatoxidaza poate fi inactivată prin încălzire la 100°C şi inhibată prin introducerea în mediu a SO2 sau prin modificarea pH-ului. În acest sens, opărirea fructelor şi legumelor tăiate, menţinerea lor în soluţii acide sau cu SO2 constituie modalităţi de acţiune pentru contracararea ascorbatoxidazei şi evitarea pierderilor de vitamină C la prelucrarea acestor produse. b) Fenoloxidazele sunt enzime prezente în toate ţesuturile organismelor superioare şi la microorganisme catalizând oxidarea monofenolilor şi poilifenolilor. Din punct de vedere chimic, fenoloxidazele sunt cupruenzime care au posibilitatea de a reacţiona direct cu oxigenul

217

Biochimia produselor alimentare molecular prin schimbare de valenţă. Clasificarea lor se face după natura substratului pe care-l oxidează, în două tipuri: - fenoloxidaze de tipul tirozinazei; - polifenoloxidaze. - Tirozinaza este o fenoloxidază care oxidează monofenolii şi o-difenolii. Este prezentă în ţesuturile plantelor, în ciuperci şi în unele ţesuturi animale. Tirozinaza
OH OH 1/2 O2 OH 1/2 O2 - H2O o-chinona O O

fenol

o-difenol

transformă fenolul şi o-difenolul în chinone colorate în brun:

În regnul animal tirozinaza participă la formarea melaninelor prin oxidarea tirozinei. Într-o primă etapă, tirozina este oxidată la dioxifenilalanină (DOPA), iar în continuare aceasta este oxidată, tot de către tirozinază, la melanină.
OH OH OH Melanina

CH2 CH COOH NH2 tirozina

CH2 CH COOH NH2 DOPA

O activitate tirozinazică intensă există în mucegaiuri şi în făina de secară. Culoare închisă a pâinii de secară se explică, în mare parte, prin prezenţa tirozinazei. Tot acestei cauze se datorează uneori culoarea mai închisă a unor paste făinoase (unele laturi de făină de grâu conţin o tirozinază foarte activă).

218

Enzime - Polifenoloxidazele sunt, de asemenea, cupruenzime care oxidează orto- şi para- difenolii în chinone colorate, dar nu acţionează asupra monofenolilor. Se găsesc în cartofi, mere, struguri, pere, gutui, cereale, la unele mucegaiuri. Prin acţiunea polifenoloxidazelor se explică închiderea la culoare a cartofilor sau merelor tăiate, a sucurilor de fructe, sau a vinurilor; de asemenea, aceste enzime iau parte la oxidarea substanţelor tanante în timpul fermentării frunzelor de ceai şi tot lor se datorează îmbrunarea fructelor şi legumelor în timpul uscării. Fenomenul este cunoscut sub denumirea de îmbrunare enzimatică, iar pentru că produce o depreciere a culorii produselor este nedorit în indusrtria alimentară. Prevenirea îmbrunării se poate face prin inactivarea termică a polifenoloxidazelor (opărire) sau pe cale chimică (SO 2, acid ascorbic). pHul optim de acţiune al acestor oxidaze din fructe este cuprins între 5,17,3, iar temperatura optimă este 30°C. În celulele sau ţesuturile intacte, fenoloxidazele nu oxidează polifenolii deoarece lipseşte oxigenul molecular; or, aceste enzime nu acţionează decât în prezenţa sa. c) Ceruloplasmina se găseşte în plasma sanguină, conţine cupru şi catalizează oxidarea hidrochinonei şi p-fenilendiaminei până la pchinone. • Dioxigenaze. Sunt enzimele care catalizează reacţii în care amândoi atomii oxigenului molecular se regăsesc în produşii de reacţie. Reacţia generală se prezintă sub forma: A + O2 → AO2 Enzimele acestei grupe pot conţine în calitate de grupare activă hem sau fier neheminic, iar pentru acţiunea unora, pe lângă acesta, este necesară şi prezenţa (α )-cetoglutaratului. Cu predilecţie, dioxigenazele catalizează ruperea dublelor legături din ciclul aromatic, însă şi alte diverse reacţii sunt catalizate în mod asemănător. O astfel de enzimă este lipoxidaza (lipoxigenaza) care oxidează acizii graşi nesaturaţi, carotenii şi vitamina A. Este răspândită în vegetale, iar cantităţi mari se găsesc în leguminoase şi oleaginoase. Substratul principal al lipoxidazei sunt acizii graşi care conţin în molecula lor gruparea –CH=CH-CH2-CH=CH- cu configuraţia cis, adică cel puţin două duble legături izolate, despărţite printr-o grupă metilen. Acizii graşi care conţin asemenea grupe sunt acizii graşi polinesaturaţi: linoleic, linolenic şi arahidonic. Procesul de oxidare a acidului linoleic decurge după schema:

219

Biochimia produselor alimentare

CH3

13 12 11 10 9 (CH2)4 CH CH CH2 CH CH

(CH2)7

COOH

O2 13 12 11 10 9 CH3 (CH2)4 CH CH CH CH CH OO

(CH2)7

COOH

Radical liber Formele trans nu sunt atacate. Se observă că în desfăşurarea reacţiilor de oxidare se formează radicali liberi care întreţin lanţul de reacţii până la antrenarea întregii cantităţi de acizi, precum şi a carotenilor şi vitaminei A. Reacţia catalizată de lipoxidază este cauza principală a râncezirii grăsimilor nesaturate în timpul păstrării lor, a scăderii conţinutului de caroteni sau de vitamina A şi are deci un rol deosebit în degradarea unor produse alimentare. Prin emulsionarea substratului se măreşte suprafaţa de contact dintre enzimă şi substrat, deci viteza de reacţie creşte. Pentru prevenirea acţiunii lipoxidazei se folosesc inhibitori (antioxidanţi) care prin reacţii de terminare blochează radicalii liberi. Totuşi, sunt şi implicaţii pozitive ale lipoxidazei pentru calitatea unor produse alimentare. Astfel, lipoxidaza grâului şi mai ales preparatele de lipoxidază din soia determină albirea aluatului şi îmbunătăţirea proprietăţilor sale reologice. Datorită decolorării pigmenţilor făinii, lipoxidaza conduce la obţinerea pâinii cu miez deschis la culoare. • Monooxigenaze. Organismele animale conţin o grupă numeroasă şi diversă de enzime care poartă denumirea de monooxigenaze. În cazul tipic, un atom al moleculei de oxigen este regăsit în noua grupare hidroxilică a substratului, iar celălalt este redus până la apă, în cursul reacţiei respective. Pentru aceasta reacţia trebuie să decurgă în prezenţa enzimei, substratului, O2 şi a unui oarecare agent reducător. Aceste enzime se mai numesc hidroxilaze sau oxidaze cu funcţii mixte. Reacţia generală după care decurge monooxigenaze este următoarea: o reacţie catalizată de

D-H + O2 + AH2 → D-OH + H2O + A În care: - D-H este substratul care se oxidează în D-OH; - AH2 este agentul reducător (donor de hidrogen). În acest mod agentul reducător care este un donor de hidrogen joacă rolul de cosubstrat. De multe ori acest rol de cosubstrat este îndeplinit de NADH + H+. Astfel, unele din enzimele implicate în biosinteza steroizilor sau în transformările acestora sunt monooxigenaze care utilizează NADPH drept cosubstrat. De asemenea, o serie de enzime implicate în metabolismul xenobioticelor (substanţe biologic active de natură exogenă) sunt monooxigenaze care se găsesc în microzomii

220

Enzime celulei hepatice împreună cu citocromul P-450 şi citocromul b5. Acest sistem enzimatic hepatic are drept cosubstrat NADH+H+ şi realizează, prin transfer de electroni şi hidroxilare enzimatică, hidroxilarea xenobioticului contribuind la metabolizarea sa:
2H+ NADH+H+ FAD 2 cit b5 (Fe2+) 2 cit P-450 (Fe3+) X-OH + H2O

NAD+

FADH2

2 cit b5 (Fe3+)

2 cit P-450 (Fe2+)

X-H + O 2

în care X este xenobioticul (medicament, drog, compuşi toxici etc.). Citocromul P-450 poate fi indus tocmai prin prezenţa diferitor xenobiotice. 7.9.1.5. Alţi transportori de electroni Coenzima Q În mitocondrii există o grupă de chinone înrudite care se reduc când mitocondria este incubată anaerob cu diverse substraturi. Ele se numesc coenzime Q. Structura şi caracteristicile acestui tip de compuşi au fost redate în capitolul referitor la vitamine şi anume în prezentarea ubichinonelor. În catena de respiraţie, coenzima Q ocupă un loc intermediar între FMN şi citocromul b, participând la transferul electronilor de la primul la al doilea din compuşii amintiţi. Superoxiddismutaza În timpul transportului electronilor spre oxigenul molecular pe calea catenei de respiraţie mitocondrială, ca şi în diferite reacţii de hidroxilare şi oxigenare ,se pot forma produşi toxici rezultaţi din reducerea parţială a oxigenului. Printre aceştia fac parte anionul superoxid O2−. şi H2O2 care sunt extrem de reactivi şi capabili de a distruge activitatea unor biomolecule. Pentru eliminarea anionului superoxid, organismele sunt dotate cu o enzimă specifică – superoxiddismutaza (SOD) care catalizează reacţia:

H2O2 + O2 cea mai importantă 2 + O2 + 2 H Aceasta este reacţie de protecţie a organismului, care acţionează în “prima linie” de apărare celulară, neutralizând peste 90% din radicalii liberi formaţi.
Superoxiddismutaza este o metal enzimă, care conţine în centrul activ un metal, de exemplu Cu2+, Mn2+, Fe3+. Enzima din citosolul celulelor de eucariote conţine Zn2+ şi catalitic, într-o vecinătate foarte strânsă. Cu2+ în centrul

O

+

SOD

221

Biochimia produselor alimentare Catalazele şi peroxidazele În reacţiile de oxidoreducere catalizate de transhidrogenazele aerobe precum şi în reacţia catalizată de superoxiddimutază se formează peroxid de hidrogen (H2O2) care este un oxidant puternic şi acumularea sa în celule în cantitate mare este dăunătoare. Descompunerea apei oxigenate rezultată din reacţiile menţionate are loc în organism în mod organizat prin enzime specifice ce o descompun utilizând-o în scopuri precise de oxidare necesară proceselor metabolice, fie o descompun pur şi simplu în apă şi oxigen. Enzimele care catalizează această reacţie de descompunere a peroxidului de hidrogen sunt catalazele şi peroxidazele. În reacţiile catalizate de aceste enzime îndeplineşte funcţia de acceptor de hidrogen: H2O2 + 2H+ + 2e → 2 H2O Catalazele sunt cromoproteide cu hem, a căror grupare prostetică este legată de proteină prin două grupări carboxil Activitate catalazică s-a observat aproape la toate celulele şi organele animale. Ficatul, eritrocitele şi rinichii sunt surse bogate de catalază. Această activitate a fost evidenţiată, de asemenea, la toate ţesuturile vegetale şi la majoritatea microorganismelor, cu excepţia celor obligator anaerobe. Reacţia după care catalaza descompune apa oxigenată este următoarea: peroxidul de hidrogen

2 H2O + O2 H2O2 + H2O2 Oxigenul molecular rezultat din reacţie constituie o sursă de oxigenare a unor ţesuturi şi este utilizat totodată de celule pentru efectuarea unor reacţii.
Preparatele enzimatice de catalază obţinute din ficat de bovine sau prin biosinteză prin cultivarea unor microorganisme, sunt utilizate în industria alimentară pentru distrugerea apei oxigenate folosite pentru pasteurizarea ouălor, conservarea laptelui, stabilizarea culturilor starter producătoare de acid lactic. Peroxidazele sunt tot cromoproteide cu hem care descompun peroxizii după reacţia:

catalaza

ROOR' + DH2 peroxid

R-OH + R'-OH

în care ROOR’ este un peroxid oarecare sau peroxidul de hidrogen (H2O2). Pentru descompunerea peroxidului este necesară prezenţa unui donor de hidrogen (DH2). Acesta poate fi reprezentat de o substanţă oarecare, de obicei fenoli, aminoacizi, amine, aromatice.

222

Enzime Peroxidazele sunt rar întâlnite în ţesuturile animale. În ficat şi rinichi s-a evidenţiat o slabă activitate peroxidazică; peroxidaza se găseşte şi în lapte; în eritrocite există glutationperoxidaza care conţine Se şi care oxidează specific glutationul redus. Drojdiile conţin peroxidaze specifice faţă de citocromul c, iar la unele bacterii se găsesc peroxidaze care oxidează NADH. Toate plantele sunt bogate în peroxidază. Surse excelente sunt hreanul şi ridichea neagră. Peroxidazele din ţesuturile vegetale lezate, secţionate folosesc drept donori de hidrogen polifenolii pe care-i oxidează la chinone ce prin condensare generează pigmenţi melanici de culoare brună, afectând culoarea fructelor şi legumelor în timpul prelucrării lor. Pentru inactivarea acestor enzime este necesar un tratament termic mai intens (temperatura de 90-95°C, timp de 2-3 minute) deoarece sunt termostabile. Se poate recurge şi la utilizarea unor inhibitori care se combină cu ionul de fier din hem. Peroxidazele acţionează şi în produsele vegetale congelate şi se poate aprecia că degradarea culorii cestor produse este cauzată, în mare parte de peroxidaze. Opărirea prealabilă a materiilor prime previne acest defect.

7.9.2. Transferaze
Enzimele din această clasă catalizează reacţii de transfer, prin care o parte (G) din molecula unui substrat numit donor este cedată unui alt substrat, numit acceptor. Mecanismul general al reacţiilor catalizate de aceste enzime este de forma: D-G + A D + A-G

În aceste reacţii se formează intermediar un complex enzimă-grupare transferabilă, complex care va reacţiona ulterior cu acceptorul, fixând pe acesta gruparea activată. Denumirea enzimelor din această clasă se face după regula: donoracceptor ca prefix, urmată de denumirea grupării transferate, după care se adaugă cuvântul transferază. În funcţie de natura grupării transferate, aceste enzime se împart în mai multe subclase: 7.9.2.1. Aminotransferaze (Tranaminaze) Aminotransferazele sunt enzimele care catalizează transferul unei grupări amino de pe un α -aminoacid pe un α - cetoacid, cu formarea unui nou aminoacid:

223

Biochimia produselor alimentare

R CH COOH + R' C NH2 O

COOH

R

C O

' COOH + R CH COOH NH2

În procesul de transaminare, aminoacizii dicarboxilici – acidul glutamic şi acidul aspartic – joacă un rol central; acceptorul de grupare amino poate fi un cetoacid oarecare, dar cel mai frecvent sunt acizii piruvic, oxalacetic sau α -cetoglutaric. Însă marea majoritate a aminoacizilor participă la procesele de transaminare, fenomen prin care organismele au posibilitatea de a-şi sintetiza acizii aminaţi proprii în funcţie de necesităţile metabolice. Mecanismul transaminării constă în transferul grupării amino de pe aminoacid pe cetoacid sub acţiunea catalitică a enzimelor de

transaminare care au drept componentă

prostetică piridoxalfosfatul.

Acest transfer se face în mai multe etape, implicând o serie de rearanjări intramoleculare, care în final duc la formarea unui nou aminoacid şi a unui nou cetoacid. În prima fază are loc o condensare între aminoacid şi centrul activ al enzimei, cu formarea unui compus de tipul bazelor Schiff. Compusul format suferă o rearanjare intramoleculară prin deplasarea unui proton de la un carbon la altul, adică are loc tautomeria bazei Schiff. În faza a treia, în prezenţa apei enzima preia funcţia amino pe care o va ceda unui cetoacid, prin acelaşi mecanism ca mai sus şi rezultă cetoacidul corespunzător aminoacidului iniţial. Acest tip de transfer poartă

224

Enzime denumirea de „mecanism de ping-pong”.
CHO

R HC NH2 +

HO

CH2

O

P -H2O +H2O

R HC N CH Pirid

COOH aminoacid R C

H3C

N

COOH bazã Schiff

piridoxalfosfat (Pirid-CHO) N H2C Pirid
+H2O -H2O

R C O + H2N-H2C-Pirid

COOH

COOH

R' C O + H2N-H2C-Pirid

R'
-H2O +H2O

R' N H2C Pirid CH N CH Pirid

C

COOH R' +H2O -H2O HC NH2 + OHC-Pirid

COOH

COOH

COOH

Activitatea transaminazelor este favorizată de unii ioni metalici cu care enzima formează chelaţi, înlesnind astfel legătura enzimă-substrat. Reacţiile de transaminare au o importanţă deosebită în metabolismul intermediar. Cu ajutorul lor se pot sintetiza aminoacizii proprii organismului, utilizând aminoacizii şi cetoacizii în exces, care se găsesc în aşa numitul rezervor (pool) metabolic. Tot cu ajutorul acestor reacţii se stabileşte conexiunea între metabolismul proteic şi cel glucidic. Exemple de transaminare: - Alanin -α -cetoglutarattransaminaza catalizează reacţia de transaminare reversibilă de pe alanină pe acid α -cetoglutaric:

225

Biochimia produselor alimentare

CH3 COOH

COOH CH2 CH2 COOH acid α-cetoglutaric

CH3 COOH

COOH CH2 CH2

CH NH2 + C O

C O + CH NH2

alaninã

COOH acid piruvic acid glutamic

- Glutamat – oxaloacetattransaminaza (GOT) catalizează reacţia reversibilă dintre acidul glutamic şi oxalacetic:

COOH CH NH2 + CH2 CH2 COOH acid glutamic

COOH C O CH2 COOH acid oxalacetic

GOT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid α-cetoglutaric +

COOH CH NH2 CH2 COOH acid aspartic

- Glutamat – piruvattransaminaza (GPT) transferă reversibil gruparea amino a acidului glutamic pe acidul piruvic:

COOH

CH3

CH NH2 + C O COOH CH2 CH2 COOH acid glutamic acid piruvic

GPT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid α-cetoglutaric +

CH3 CH NH2 COOH

alaninã

De asemenea, sub acţiunea aminotransferazelor specifice, asparagina şi glutamina pot să cedeze cetoacizilor grupările lor aminice. Aminotransferazele există la microorganisme, plante şi animale. 7.9.2.2. Fosfotransferaze (Kinaze) Fosfotransferazele sunt enzime care catalizează reacţiile de transfer a grupării fosfat de la un donor la un acceptor specific, conform reacţiei

226

Enzime generale: R-PO3H2 + R’ – H → R’ – PO3H2 + R-H În general, aceste reacţii se efectuează cu o substanţială modificare de energie, transferul radicalului fiind virtual ireversibil (cu excepţia formării compuşilor macroergici) şi însoţit de un important schimb de energie liberă. Compuşii fosforilaţi participă întotdeauna la schimbări energetice importante: energia care rezultă din reacţiile oxidative exerogonice este folosită în mare măsură pentru sinteza compuşilor organici fosforilaţi pe seama fosfatului anorganic (reacţie endergonică). Ulterior aceşti compuşi fosforilaţi sunt utilizaţi în reacţiile de sinteză intracelulară, ei furnizând energia liberă pentru reacţiile endergonice. Din această subclasă fac parte: - Hexokinaza care catalizează prima reacţie din procesul glicolizei, pornind de la glucoză şi în care are loc un transfer de grupare fosfat de la ATP la hexoză:
CH2OH O H H H HO OH H H OH OH CH2 O P O H H H H OH OH

ATP +

ADP +

HO OH H

glucozã

glucozo-6-fosfat
fosforilarea
O H OH HO H

- Fosfohexokinaza fosfohexozelor:
P OH2C
H

care

catalizează

mai

departe

a

O H OH HO H

CH2OH OH

P OH2C
H

CH2O P
OH

+ ATP

+ ADP

fructozo-6-fosfat

fructozo-1,6-difosfat

- Piruvatkinaza trece fosforul de pe acidul fosfoenolpiruvic pe ADP cu formare de ATP:

227

Biochimia produselor alimentare

COOH O C O ~ P OH + ADP OH CH acid 2-fosfoenolpiruvic
2

COOH C O + ATP CH3 acid piruvic

- Creatinkinaza participă la transferul grupării fosfat de pe ATP pe creatină cu formare de creatinfosfat şi ADP:

HN C

HN2 N CH2 COOH

NH ~ P + ATP HN C N CH2 COOH CH3 creatinfosfat

+ ADP

CH3 creatinã

7.9.2.3. Metiltransferaze Sunt enzime care catalizează transferul grupării metil de pe donor pe acceptor. Înainte de cedare, gruparea metil trebuie activată de substanţe macroergice de tip ATP, formându-se o combinaţie intermediară, reactivă. Ca substanţe donatoare de radical metil funcţionează metionina, colina etc. iar ca substanţe acceptoare colamina, glicocolul, noradrenalina, acidul guanidinacetic etc. Astfel, în cursul metabolismului intermediar, metionina furnizează grupări metil colaminei, trecând-o în colină. Mai întâi însă are loc activarea metioninei de către ATP. Aceasta constă în legarea sa la restul de adenozil sub forma unui compus de sulfoniu, o stare mai reactivă, conform reacţiei:

S CH3 CH2 2 CH NH3 COO+

NH2

+ ATP

metioninadenoN ziltransferazã H2O Pi + PPi N

N

CH3

CH2 S + ( CH2)2 CH COON OH OH + NH3 H H H O H

metioninã

S-adenozilmetionina (metil activ)

Gruparea metil legată sub această formă este activă şi poate fi cedată uşor atomului de azot; după cedare, ionul de sulfoniu trece la forma normală de adenozintioeter. Transferul metilului se face numai pe un

228

Enzime atom de azot care fixează gruparea la cei doi electroni neparticipanţi:

A Rib S CH3 3 CH2 2 H C NH2 COOH S-adenozilmetioninã

+

CH3 + N CH3 metiltransferazã + CH2 OH CH2 OH CH3 colaminã colinã CH2 NH2 CH2 + CH2 NH2 metiltransferazã CH2 NH CH3 COOH COOH glicocol sarcozinã NH2 NH2 metiltransferazã C NH + C NH N CH2 NH CH
2

COOH acid guanidin acetic

CH3 COOH creatinã

7.9.2.3. Aciltransferaze Aciltransferazele catalizează reacţiile de transfer a radicalilor acil (R-CO-) cu ajutorul coenzimei A (CoA-SH) care reprezintă gruparea lor prostetică. Reacţia generală de transfer este următoarea: R-CO-R' + R”-H → R'-H + R-CO-R” Ca donori de radicali acil funcţionează acil-derivaţii coenzimei A care sunt formele activate ale acizilor organici prin care aceştia se pot degrada oxidativ sau pot să participe la reacţii de sinteză. Activarea acizilor organici prin transformarea în acil-derivaţi ai CoA se face cu participarea ATP-ului ca furnizor de energie. După activare, radicalul acil este trecut pe acceptorul specific:

acil-donor

CoA-SH

acil-acceptor

donor

CoA~acil

acceptor

În acest transfer, între CoA şi gruparea acil se stabileşte o legătură mercaptoacil – macroergică – fapt ce explică denumirea de „formă activată” a acidului organic. În legătura mercaptoacil, coenzima participă cu gruparea sa –SH. Reacţia generală de activare se prezintă astfel:

229

Biochimia produselor alimentare

R-COOH + CoA-SH + ATP
iar de transfer:

tiokinaze

R-CO~SCoA + AMP + PPi acil derivat al CoA

Aciltransferaza R - CO ~ SCoA + R"- H

CoA - SH + R - CO - R"

Foarte important în procesele metabolice este activarea acetatului sub formă de acetil-coenzimă A (“acetat activat”):

CH3-COOH + CoA-SH + ATP

acetiltiokinaza

CH3-CO~SCoA + AMP + PPi acetil-CoA

Acetil-CoA participă în anumite procese biochimice, constituind un “fond metabolic” comun (“pool”) prin care se stabilesc corelaţii între diferite căi metabolice. Unul din cei mai importanţi formatori de grupări acetil este acidul piruvic, care în cea mai mare parte, provine din glucoză. Transformarea sa în acetil-CoA se face printr-o reacţie de decarboxilare oxidativă sub acţiunea unui complex enzimatic la care, în afară de CoA, mai participă NAD+, FAD,TPP şi acidul lipoic:

CH3

C COOH + CoA-SH

TPP; acid lipoic NAD+ NADH+H+

CH3-CO~SCoA + CO2 acetil-CoA

O acid piruvic

Acceptorul grupei acil poate fi colina, oxalacetatul, glucozamina etc. În cazul în care colina primeşte restul acil se formează acetilcolina care este un mediator chimic neuro-muscular:
CH3 CH3 aciltransferazã + + H3C CO O CH2 CH2 N CH3 CH3-CO~SCoA + HO CH2 CH2 N CH3 - CoA-SH CH3 CH3 acetil-CoA colinã acetilcolinã

7.9.2.5.Glicoziltransferaze Glicoziltransferazele catalizează transferul unui rest de glucid (G) pe un acceptor specific (A), după reacţia: D – O – G + A – OH ↔ A – O – G + D - OH Restul de glucid, respectiv grupările transferate de glicoziltransferaze sunt de tip hexozil sau pentozil. Donorii acestor grupări sunt oligozaharide, polizaharide, glicozizi, iar acceptorii pot fi alte monozaharide sau derivaţi ai acestora.

230

Enzime Prin reacţii de transfer ale dizaharidelor şi polizaharidelor. grupării glicozil are loc biosinteza

Pentru a putea fi transferat, restul de glucide trebuie în prealabil activat pentru a avea energia necesară formării legăturii glicozidice. Această activare se realizează pe baza energiei eliberate prin hidroliza UTP şi ATP, iar formele activate ale monozaharidelor ce urmează a fi transferate constituie compuşii dintre glucid şi UDP. Astfel, biosinteza unui dizaharid se efectuează după schema generală:

monozaharid1- P + ADP pirofosfatazã monozaharid1- P + UTP UDP-monozaharid1 + PPi (forma activã) glicoziltransferazã UDP-monozaharid1 + monozaharid2 monozaharid1-monozaharid2 - UDP (dizaharid)
Prin urmare, nucleozid difosfatul, respectiv UDP, funcţionează ca transportor specific al radicalului glicozil. În biosinteza glicogenului intervin mecanisme asemănătoare, însă participă atât glicoziltransferaze care formează legături α (1→4) cât şi glicoziltransferaze responsabile de formarea legăturilor α (1→6) prin care se produce ramificarea macromoleculei. Foarte răspândită în plante, animale şi la microorganisme este o glicoziltransferază care se numeşte fosforilază sau α-glucanfosforilaza. Această enzimă catalizează transformarea amidonului sau glicogenului în glucozo-l-fosfat, adică transferul unui radical glicozil de pe macromoleculă, pe acidul fosforic, astfel:

monozaharid1 + ATP

kinazã

amidon (glicogen) + H3PO4

fosforilazã

glucozã-1- P

Această transformare este analogă hidrolizei, dar spre deosebire de aceasta, în locul apei acţionează acidul fosforic. Reacţia de fosforoliză este reversibilă. Însă pentru ca α-glucanfosforilaza să sintetizeze in vitro glicogen sau amidon din glucozo-1-fosfat este necesară prezenţa în mediu de reacţie a unor mici cantităţi din aceste polizaharide care acţionează ca „înductori”. Astfel, fosforilaza din cartofi, mazăre, porumb sintetizează în vitro din glucozo-1-fosfat un polizaharid asemănător cu amidonul natural, iar fosforilaza din ficat formează un polizaharid care aminteşte de glicogen. Enzima zaharozo-glicoziltransferaza (zaharozofosforilaza) catalizează interacţiunea zaharozei şi ortofosfatului cu formarea glucozo-1-fosfatului şi fructozei: zaharoză + ortofosfat ↔ glucozo-1-fosfat + fructoza Din această relaţie se observă că fenomenul este reversibil şi pe această

231

Biochimia produselor alimentare cale, la unele bacterii, poate decurge sinteza enzimatică a zaharozei din glucoză-1-fosfat şi fructoză.

7.9.3. Hidrolaze
Hidrolizele sunt enzime care catalizează reacţia de scindare a moleculelor cu fixarea componentelor apei la produsele rezultate, după reacţia generală:

R-R’ + HOH ↔ R-H + R’-OH
Din această clasă fac parte enzimele care hidrolizează proteinele până la aminoacizi, polizaharidele până la monozaharide şi lipidele până la acizi graşi şi glicerol. Reacţiile catalizate de hidrolaze se produc cu modificări energetice mici, cu degajare de energie liberă mică, deci ele nu constituie o sursă energetică importantă pentru organism. Hidrolazele au totuşi un rol deosebit în metabolismul substanţelor aduse cu alimentaţia deoarece ele descompun moleculele mari care intră în compoziţia alimentelor, în molecule simple uşor de asimilat. În general, reacţiile de hidroliză enzimatică sunt reversibile, iar principalele legături chimice care pot fi scindate sunt: legătura ester, legătura glicozidică, legătura peptidică. În funcţie de tipul legăturii asupra căreia acţionează, hidrolazele se împart în mai multe subclase. 7.9.3.1. Esteraze Esterazele sunt enzime care catalizează reacţia reversibilă de scindare a legăturilor esterice cu formarea acidului şi alcoolului corespunzători: R1-COOR + HOH ↔ R1-COOH + R-OH Aceste enzime au o specificitate mică în raport cu substratul şi ca urmare hidrolizează cu viteze comparabile un număr mare de esteri. Există mai multe tipuri de esteraze în funcţie de natura chimică a acidului care participă la formarea legăturilor ester. a) Carboxilesteraze. În această sub-subclasă sunt cuprinse enzimele care catalizează scindarea hidrolitică a esterilor carboxilici. Din această categorie fac parte: • Lipazele sau, conform denumirii sistematice, glicerol-ester-hidrolaze, care catalizează hidroliza gliceridelor după reacţia:

232

Enzime trigliceridă + H2O ↔ digliceridă + acid gras Lipazele nu au o specificitate strictă, dar viteza de acţiune catalitică variază cu originea diverselor lipaze. Au o specificitate în funcţie de lungimea catenei acizilor graşi şi posedă o selectivitate în funcţie de configuraţia substratului. Posedă, de asemenea, o specificitate stereochimică, unul din izomerii optici ai aceluiaşi substrat putând fi atacat cu o viteză mai mare decât celălalt. Lipazele scindează toţi cei trei acizi graşi ai gliceridei, însă nu simultan, ci succesiv, fapt foarte important pentru procesul de absorbţie a lipidelor. Lipazele sunt enzime foarte răspândite în natură. În organismul animal se găseşte lipază în sucul pancreatic, ficat, sânge, limfă şi în lapte. Plantele oleaginoase (ricin, soia, floarea soarelui) conţin, de asemenea, lipaze foarte active O serie de mucegaiuri şi bacterii reprezintă surse bogate în lipaze, fiind folosite pentru biosinteza carboxilesterazelor şi obţinerea preparatelor enzimatice de acest tip. Trebuie însă menţionat că lipazele de diferite provenienţe se deosebesc între ele sub aspectul proprietăţilor şi caracterului acţiunii. Acţiunea lipazelor are o mare importanţă pentru păstrarea alimentelor, mai ales a celor ce conţin cantităţi mari de lipide. Prin acţiunea acestor enzime, în timpul depozitării produselor alimentare se produce o rapidă descompunere a gliceridelor în acizi graşi şi glicerol, ceea ce conduce la o creştere a acidităţii produselor şi la deprecierea lor calitativă. • Fosfolipazele sunt esteraze care catalizează reacţia de scindare hidrolitică a acizilor graşi din glicerofosfolipide (fosfatidilcolina, fosfotidiletanolamina):

CH2

O OC R 1

CH O OC R 2 O CH2 O P O CH2 CH2 CH3 + N CH3 CH3

OH fosfatidilcolina si locul de actiune a fosfolipazelor
• Colinesterazele scindează hidrolitic esterii colinei, prezenţi îndeosebi în ţesutul nervos, sinapse, eritrocite. Astfel, sub acţiunea acestor enzime se descompune acetilcolina, mediatorul chimic care facilitează transmiterea influxului nervos de la nervii motori la muşchii striaţi.
(H3C)3N +-CH2-CH2-O-CO-CH3 acetilcolina
acetilcolinesteraza

(H3C)3N+-CH2-CH2-OH + HOOC-CH3 colina

233

Biochimia produselor alimentare • Clorofilazele sunt esteraze specifice care se găsesc în plante verzi şi care în soluţii alcoolice descompun foarte activ clorofila. Reacţia catalizată de aceste enzime constă în scindarea restului de fitol din molecula de clorofilă şi înlocuirea lui cu un rest de alcool ce se găseşte în mediu: R-COOC20H39 + C2H5OH clorofila
clorofilazã

R-COOC2H5 + C20H39OH etilclorofilidã fitol

Acţiunea optimă a acestor enzime are loc la pH=5,9. Este interesant de menţionat că acţiunea clorofilazei din frunze este deosebit de intensă în mai şi septembrie, adică în perioada când se intensifică formarea şi descompunerea clorofilei. • Tanazele catalizează descompunerea hidrolitică a taninurilor-esteri complecşi ai acizilor aromatici cu fenolii. Tanazele au o acţiune specifică strictă în sensul că ele scindează numai esterii complecşi al căror component acid conţine cel puţin doi hidroxili fenolici. Un astfel de ester este didepsidul acidului orselinic numit acid lecanoric:

CH3 HO COO OH
Tanaza este produsă de mucegaiuri si plante.

CH3 COOH OH

Acidul lecanoric si locul de actiune a tanazei

• Pectinesteraza (PE) sau Pectaza este una din enzimele care realizează descompunerea hidrolitică a substanţelor pectice. Acţiunea specifică a pectinesterazei constă în hidroliza legăturilor esterice dintre acidul poligalacturonic şi alcoolul metilic din molecula de pectină:

Pectina + nH2O

PME

Acid poligalacturonic + CH3 - OH

Această enzimă mai este denumită şi pectinmetilesterază (PME). Pectinesterazele se găsesc în rădăcinile, frunzele şi fructele plantelor, precum şi în bacterii, mucegaiuri şi drojdii. Cele mai bine studiate sunt cele din mucegaiuri deoarece intră în preparatele pectolitice comerciale (filtragol, pectinol, aspergol etc.) folosite în industria sucurilor de fructe, conservelor vegetale, vinurilor. Biosinteza pectinmetilesterazelor de către microorganisme este mult stimulată de prezenţa pectinei în mediul de cultură. Este un caz de biosinteză indusă a acestor enzime. Pectinesterazele au un mare rol în fermentarea tutunului deoarece eliberează alcoolul metilic din pectinele care se găsesc în frunzele de

234

Enzime tutun şi în felul acesta fumul este mai puţin toxic. Tot datorită acţiunii pectinesterazelor se acumulează alcoolul metilic în fructele lăsate la fermentat în scopul obţinerii unor băuturi alcoolice. Acest alcool trece la distilare în băuturi şi prin urmare, la acţiunea toxică a alcoolului etilic se adaugă şi cea a alcoolului provenit din pectina fructelor. b) Tioesteraze. Sunt enzime care catalizează scindarea hidrolitică a tioesterilor. O astfel de enzimă este, de exemplu, tioglicozidaza sau mirozinaza care hidrolizează tioglicozizii, cum ar fi sinigrina ce se găseşte în muştar. Prin umectarea seminţelor de muştar, sub acţiunea mirozinazei sinigrina se descompune în glucoză, ester al alcoolului alilic şi bisulfat de potasiu:
S CH2 CH CH2 sinigrina C C 6H11O5
mirozinaza

C6H12O6 + CH2 glucozã

CH CH2

N C S

N O SO3K H2O

KHSO4

ester al alcoolului alilic

c) Fosfoesteraze. Sunt enzime care catalizează scindarea hidrolitică a esterilor acidului fosforic cu formare de alcool. Aceste enzime sunt deosebit de importante, deoarece substratul lor participă la metabolismul intermediar al glucidelor, lipidelor, nucleotidelor. Clasificarea fosfoesterazelor are drept criteriu substratul asupra cărora acţionează, şi anume: c1- fosfomonoesterazele (fosfatazele) scindează hidrolitic monoesterii acidului ortofosforic după reacţia: R-O-PO3H2 + HOH → R-OH + H3PO4 Fosfomonoesterazele cu specificitate mai marcantă sunt cele ce catalizează hidroliza esterilor fosforici ai glucidelor, glicerinei, mononucleotidelor, inozitolului. - glucozo-6-fosfataza este enzima specifică de scindare a esterului glucozo-6-fosfat:
CH2 O P O H H H HO OH H CH2OH O H H H HO OH H H OH OH

+HOH -H3PO4 H OH

glucozo-6-fosfat

OH

glucozã

- hexozodifosfataza are drept substrat specific esterul fructozo-1,6-difosfat:

235

Biochimia produselor alimentare

P O H2C
H

O H OH

CH2 O P P O H2C +HOH H OH H HO -H3PO4 H OH

O HO H

CH2OH OH

fructozo-1,6-difosfat

fructozo-6-fosfat

- nucleotidazele sunt fosfomonoesteraze care au ca substrat mononucleotidele, acidul adenozin-5’-fosforic din muşchi şi acidul adenozin-3’-fosforic din drojdii. Prin hidroliză se formează nucleozidul şi acidul fosforic.
NH2 N N N H H OH N O
O

NH2 N N +HOH -H3PO4 N H H OH N

CH2 O H H OH

P OH OH

O

CH2OH H H OH

5'-ribonucleotid

5'-ribonucleozid

Nucleotidazele bazice se găsesc în intestin şi ficat şi au optimum de pH=9. Nucleotidazele ce acţionează în mediu acid au pH optim de 4,9 şi se găsesc în frunze, rădăcini, seminţe şi la mucegaiuri. - fitazele detaşează acidul fosforic din acidul fitic, care sub forma sărurilor de Ca-Mg reprezintă de fapt fitina. Fitază foarte activă se găseşte în drojdii şi în seminţele multor plante. Fitaza are un rol deosebit de important pentru calităţile nutritive ale pâinii. Acidul fitic (inozitfosforic), formând săruri insolubile cu calciul, împiedică absorbţia acestuia în organismul omului. De aceea, fitaza din drojdie şi din făină, care descompune în timpul fermentării aluatului o mare parte din acidul fitic existent în el, contribuie la îmbunătăţirea absorbţiei calciului furnizat de făina de grâu. c2- fosfodiesterazele acţionează hidrolitic asupra legăturilor fosfodiester, conform reacţiei generale:

R O R1 O P

O OH

+H2O

R-OH +

HO R1 O P

O OH

Fac parte din această sub-subclasă enzimele care catalizează hidroliza acizilor nucleici - nucleazele şi cele ce hidrolizează legăturile diesterice din fosfatidil colină. - ribonucleazele depolimerizează acizii ribonucleici pe care-i transformă în

236

Enzime ribonucleotide. Au acţiune catalitică de desfacere a legăturilor diesterice care unesc mononucleotidele din molecula de ARN, fără formare de acid fosforic liber. Se găsesc în pancreas şi sucul pancreatic, ficat, splină. Sunt prezente, de asemenea, în plante şi microorganisme. - dezoxiribonucleazele sunt nucleaze ce catalizează scindarea hidrolitică a ADN-ului în interiorul catenelor polinucleotidice cu formare de 5’- sau 3’dezoxiribonucleotide. 7.9.3.2. Glicozidaze Glicozidazele sunt enzime care catalizează scindarea hidrolitică a legăturilor glicozidice din oligo- şi polizaharide precum şi din diferiţi glicozizi. După natura substratelor atacate glicozidazele se pot clasifica în: oligozidaze, cele care catalizează hidroliza oligozaharidelor şi glicozizilor şi poliozidaze care hidrolizează polizaharidele (amidon, celuloză, glicogen, substanţe pectice etc.). Glicozidazele prezintă specificitate în funcţie de tipul de oză legată glicozidic (glucozidaza, galactozidaza), de natura acestei legături (α,β), de stereoizometrie (D- sau L-glicozizi). a) Oligozidaze Oligozidazele posedă o specificitate redusă de grup catalizând hidroliza unui număr mare de substrate înrudite între ele prin natura restului glicozil şi prin felul legăturii glicozidice. Specificitatea acestor enzime este determinată de natura inelului componentei glicozil (piranozic sau furanozic), de configuraţia sterică a atomilor de hidrogen şi a grupelor OH din inel, de natura legăturii glicozidice (α sau β). -α-glucozidaza se mai numeşte şi maltază şi este enzima care scindează legătura α- glicozidică din molecula de maltoză:
CH2OH O H H HO OH H H OH CH2OH O H OH H CH2OH H + H2O -H2O O H H OH OH

H

H

2

H H HO OH H

O maltozã

H OH OH

Este răspândită în natură. Se găseşte în organismele animale (intestinul subţire), la plante, mucegaiuri, drojdii, bacterii. Maltaza din intestin, activă la un pH=6,5, participă la digestie. Cantităţi deosebit de mari de maltază se găsesc în seminţele de cereale germinate aşa cum este malţul obţinut prin germinarea orzului şi care se utilizează pentru fabricarea mustului de bere. Maltază activă se

237

Biochimia produselor alimentare găseşte şi în făina de grâu. In timpul fermentării aluatului, ea transformă maltoza făinii în glucoza necesară întreţinerii procesului fermantativ. Preparatele enzimatice de maltază obţinute prin biosinteză cu ajutorul microorganismelor pot fi utilizate în industria alimentară în tehnologiile de obţinere a glucozei din amidon în combinaţie cu preparate de αamilază. -β-fructofuranozidaza se mai numeşte zaharază şi este enzima care scindează hidrolitic legătura β-glicozidică din molecula de zaharoză cu formare de β - fructoză şi α – glucoză:
CH2OH O H H HO OH H H OH O H OH CH2OH O H H H HO OH H H OH OH O HO H

H
(1)

HOH2C O
(2)

H HO CH2OH H

+H2O

HOH2C

H CH2OH

+

HO H OH

zaharozã

α-glucozã

β-fructozã

Deoarece prin această hidroliză rezultă zahăr invertit, enzima se mai numeşte şi invertază. β-fructofuranozidaza (2) rupe legătura care se găseşte la atomul de carbon β-glicozidic al restului de fructoză, în timp ce, legătura de la atomul de carbon α-glicozidic al restului de glucoză este descompusă de o α-glucozidază (1). Deoarece şi în rafinoză există o legătură β-glicozidică între glucoză şi fructoză ca şi în zaharoză, este de subînţeles că invertaza hidrolizează şi rafinoza. În urma acestei acţiuni, din rafinoză rezultă o moleculă de fructoză şi una a dizaharidului melibioza. β-fructofuranozidaza se găseşte în plante, microorganisme şi în sucurile digestive ale animalelor. Deosebit de activă este zaharaza din drojdii, din care de regulă se obţin preparate mai puţin purificate, active şi stabile în timp destinate scopurilor industriale. Astfel, preparatele de invertază se utilizează la fabricarea produselor zaharoase de tipul bomboanelor cu miez moale îmbrăcate în ciocolată. Invertaza se omogenizează în siropul de zahăr şi în timpul depozitării produselor la rece, enzima produce hidroliza zaharozei în mod lent, determinând formarea unei creme moale localizată în interiorul miezului. Preparatele de invertază se folosesc şi pentru obţinerea zahărului invertit destinat fabricării băuturilor nealcolice, îngheţatei, lichiorurilor. -β-glucozidaza este enzima care descompune legătura β-glucozidică din dizaharide, precum şi din β-glucozizi. Viteza de descompunere a diferitelor substraturi ale β-glucozidazei depinde de structura moleculei de glucozid ce conţine β-glucoză. O influenţă deosebită asupra acestei

238

Enzime viteze o au, de asemenea, proprietăţile părţii proteice a enzimei. Cele mai bune substrate pentru această enzimă sunt celobioza şi genţiobioza, precum şi glicozizii amigdalina, arbutina, glucovanilina. β-glucozidaza se poate obţine sub formă de preparate pure din mucegaiuri, fructe de migdal, unele bacterii. Preparatele enzimatice β-glucozidazice prezintă importanţă practică pentru mărirea randamentelor de hidroliză a celulozelor precum şi pentru hidroliza unor glicozizi din diferite materii prime alimentare. -β-galactozidaza sau lactaza este enzima care catalizează hidroliza βgalactozidelor de tipul lactozei punând în libertate β-galactoză:
CH2OH HO H H OH H O O H OH H OH H CH2OH H H O OH H H OH + H2O CH2OH HO H H OH H O CH2OH OH O OH H H OH

H H OH

+

H HO

H OH H

β-lactozã

β-galactozã

β-glucozã

β-galactozidazele sunt produse de unele plante, microorganisme şi de mucoasa intestinală a animalelor. Preparatele enzimatice de lactază, obţinute cu ajutorul unor microorganisme producătoare de această enzimă se pot folosi la fabricarea unor produse lactate. Hidroliza lactozei din diverse produse determină o intensificare a gradului de dulce deoarece lactoza are o putere de îndulcire şi solubilitate relativ scăzută, în timp ce componenţii ei sunt mai dulci. Mai mult, această hidroliză face posibilă consumarea laptelui şi de către persoanele cu intoleranţă la lactoză. Totodată, îngheţata fabricată cu lapte smântânit tratat cu β-galatozidază este hipocalorică posedând şi calităţi senzoriale superioare. Efectul hipocaloric se explică prin adaosul mai scăzut de zaharoză datorită puterii de îndulcire mai ridicate a hidrolizatului de lactoză. -α-galactozidaza este o enzimă care catalizaează reacţia de descompunere a α-galactozidelor, de exemplu a rafinozei şi melibiozei. Prin acţiunea α-galactozidazei asupra rafinozei are loc hidroliza legăturii dintre α-galactoză şi zaharoză. α-galactozidaza se găseşte în drojdia de bere şi în unele mucegaiuri. Preparatele enzimatice cu această enzimă au evidente posibilităţi de utilizare în industria zahărului deoarece realizează o îmbunătăţire a condiţiilor de cristalizare a zaharozei şi o creştere a randamentului în zahăr ca urmare a hidrolizei rafinozei. De asemenea, preparatele de α-galactozidază se pot folosi pentru hidroliza rafinozei şi stahiozei din seminţele de leguminoase în scopul eliminării factorilor de flatulenţă din aceste produse.

239

Biochimia produselor alimentare b) Poliozidaze Poliozidazele sunt enzimele care catalizează scindarea hidrolitică a polizaharidelor. Prezintă o specificitate marcantă în raport cu tipul legăturii a cărei scindare o realizează. - Amilaze. Printre poliozidaze, cea mai mare importanţă o au amilazele – enzimele sub acţiunea cărora are loc hidroliza amidonului şi a glicogenului. Cele mai active amilaze se găsesc în salivă şi în sucul pancreatic al omului şi animalelor, în mucegaiuri, în cerealele încolţite. Amilazele hidrolizează atât amidonul nemodificat cât şi pe cel gelifiat. Viteza de descompunere a amidonului de diferite provenienţe de către amilaze este diferită. Această comportare diferită a amidonului la acţiunea amilazelor poartă denumirea de atacabilitate. În felul acesta viteza de descompunere a amidonului sub acţiunea amilazelor depinde nu numai de cantitatea şi activitatea enzimelor, ci şi de atacabilitatea substratului. Susceptibilitatea amidonului la atacul amilazelor se măreşte cu micşorarea dimensiunilor granulelor de amidon, sau astfel vorbind, cu creşterea suprafeţei lor relative. Atacul amidonului de către amilaze se intensifică rapid, de asemenea, în cazul distrugerii mecanice a structurii granulelor de amidon (ex. măcinarea cerealelor). Totuşi, acţiunea amilazelor asupra granulelor de amidon nemodificat sau chiar degradat mecanic este întotdeauna mai slabă în comparaţie cu acţiunea lor asupra amidonului gelatinizat. De aceea, într-o serie de sectoare ale industriei alimentare, de exemplu în industria spirtului, hidroliza amidonului cu ajutorul unor surse de amilaze are loc numai după fierberea făinii sau a cartofilor mărunţiţi. La ora actuală este stabilită existenţa a trei tipuri de amilaze: α-amilaza, β-amilaza şi glucoamilaza (sau amiloglucozidaza); acestea se deosebesc între ele prin proprietăţile lor, distribuţia în natură şi capacitatea de acţiune asupra amidonului.

• α-Amilaza se găseşte în salivă şi sucul intestinal, elaborată de pancreas; are rol important în procesul de digestie unde intervine în transformarea amidonului macromolecular, în compuşi mai simpli. Acest tip de amilază se mai găseşte în mucegaiuri şi boabe germinate de grâu, orz, ovăz. • β-Amilaza se găseşte numai în vegetale şi microorganisme.
Aceste două enzime se deosebesc sensibil sub aspectul acţiunii lor asupra celor două componente ale amidonului – amilaza şi amilopectina, dar ambele atacă numai legăturile (1→4) α-glicozidice din moleculele acestora. Astfel, α-amilaza hidrolizează, la întâmplare, legaturile glicozidice din interiorul moleculelor de amiloza sau amilopectină generînd dextrine cu masă moleculară mică şi o cantitate mică de maltoză şi izomaltoză

240

Enzime In schimb, β-amilaza descompune succesiv numai legăturile glicozidice penultime ale moleculelor de amiloză sau amilopectimă. Ca urmare, amiloza este complet (100%) transformată în maltoză. Dacă substratul βamilazei este însă amilopectina, atunci se formează maltoză şi dextrine care dau o coloraţie brun roşcată cu iodul(dextrine limită). β-Amilaza descompune, cu formarea de maltoză, numai capetele libere ale lanţurilor glicozidice; acţiunea ei încetează când ajunge la ramificaţii. De aceea, β-amilaza descompune amilopectina cu formarea maltozei numai în proporţie de 54%. Dextrinele care se formează sub acţiunea β-amilazei asupra amilopectinei, sunt hidrolizate de α-amilază cu formarea unor dextrine care au o masă moleculară mai mică şi nu mai dau coloraţie cu iodul.
β-amilazã

.
β-amilazã

. .

.
Amiloza

.

100% hidrolizã

.

. .

. .

. .

. .

.

.
Amilopectinã

R . 54% hidrolizã . .

În felul acesta, prin acţiunea β-amilazei asupra amidonului se formează în cea mai mare parte maltoza şi o mică cantitate de dextrine cu masă moleculară mare. Nici α-, nici β-amilaza separat nu pot hidroliza deplin amidonul cu formarea maltozei. Acţiunea iniţială a α-amilazei care generează dextrine, facilitează formarea maltozei de către β-amilază. Prin acţiunea simultană a ambelor amilaze amidonul este hidrolizat la maltoză în proporţie de 95%. α- şi β- Amilaza se deosebesc şi sub aspectul comportării faţă de reacţia mediului: α-amilaza este cu mult mai sensibilă la acizi. pH-ul optim al αamilazei din malţ este 5,5-5,7, iar al β-amilazei 4,3-4,5. De asemenea, pH-ul optim al amilazelor variază şi cu originea lor: α-amilaza din salivă are pH-ul optim 6,9. Cele două tipuri de amilaze se deosebesc, de asemenea, din punct de vedere al termostabilităţii şi temperaturii optime de acţiune. α-Amilaza este mult mai stabilă la acţiunea temperaturilor ridicate; temperatura ei optimă este ceva mai sus (65-66°C), decât a β-amilazei (50-52°C). Este foarte interesant faptul că seminţele plantelor se deosebesc între ele sub aspectul conţinutului lor de α- şi β- amilaze. În seminţele negerminate de grâu, orz, ovăz există numai β-amilază; α-amilaza se formează numai prin germinare. În seminţele de leguminoase, atât negerminate cât şi germinate există numai β-amilază. În seminţele negerminate de sorg există o mare cantitate de α-amilază.

241

Biochimia produselor alimentare Amilazele au o mare importanţă în unele ramuri ale industriei alimentare: panificaţie, hidrolizate de amidon, bere, spirt. Fermentarea aluatului şi acumularea în el a dioxidului de carbon care-l afânează şi conferă pâinii porozitate şi volum, depind de conţinutul de zaharuri fermentescibile. La rândul lor, acestea depind nu numai de cantitatea de zaharuri existente în făină, ci şi de viteza de acumulare a maltozei sub acţiunea amilazelor asupra amidonului. Pe de altă parte, ca urmare a unei acţiuni intense a α-amilazei care se găseşte în cantităţi mari în făina din grâul încolţit, se produce acumularea în exces a dextrinelor în aluat, acesta are o elasticitate proastă şi sunt afectate calităţile pâinii: porozitatea, aspectul, gustul. Malţul utilizat pentru fabricarea berii şi pentru zaharificarea plămezilor de cereale sau cartofi în industria spirtului constituie surse de amilaze foarte active care determină transformarea amidonului în zahăr fermentescibil – maltoza. Preparate enzimatice amilolitice deosebit de active se pot obţine şi din diferite microorganisme, în special din mucegaiuri. Ele se folosesc cu succes în industria berii, spirtului, în panificaţie sau în industria hidrolizatelor de amidon. Cu ajutorul preparatelor de α-amilază bacteriană se realizează dextrinizarea amidonului din cereale sau cartofi, obţinându-se maltodextrine. Acestea se utilizează ca ingredient la fabricarea produselor dietetice şi pentru copii deoarece sunt foarte asimilabile, precum şi în industria produselor zaharoase pentru prepararea cremelor, pudingurilor etc. α-Amilaza fungică este folosită pentru mărirea gradului de fermentare a berii, dextrinele fiind hidrolizate la maltoză care este apoi fermentată de drojdii.

• Amiloglucozidaza sau glucoamilaza este o enzimă care hidrolizează amidonul cu formarea preponderent a glucozei şi a unei mici cantităţi de dextrine. Preparatele de glucoamilază se obţin din mucegaiuri. Deoarece această enzimă hidrolizează amidonul până la glucoză, cu ajutorul preparatelor de glucoamilază se obţin industrial siropul de glucoză şi glucoza cristalină. Pentru fabricarea berii hipoglucidice se întrebuinţează glucoamilaza care hidrolizează dextrinele la glucoză ce este apoi fermentată de drojdii.
-α-1,6-glucozidaza este enzima care catalizează hidroliza legăturilor α1,6-glucozidice din amilopectină intensificând acţiunea α-amilazei. Preparatele care conţin aceste două enzime permit o hidroliză mai rapidă a amidonului pentru obţinerea hidrolizatelor bogate în maltoză. - Celulaze. Aceaste enzime realizează descompunerea hidrolitică a celulozei cu formarea celobiozei. Este un complex format din două enzime – endoglucanaza şi exoglucanaza. Celulazele sunt prezente în cerealele germinate, în unele bacterii şi mucegaiuri.O cantitate mare de

242

Enzime celulază activă produc, de asemenea, bacteriile din stomacul ierbivorelor. Preparatele enzimatice celulolitice pot fi utilizate pentru descompunerea hidrolitică a celulozei din diverse surse până la glucoză care prin procedee microbiologice este transformată în biomasă bogată în proteine sau alcool etilic carburant. - Hemicelulaze. Sub această denumire sunt reunite enzimele care catalizează hidroliza diferitelor hemiceluloze. Se găsesc în seminţele germinate şi în mucegaiuri. - Inulinaze. Aceste enzime se mai numesc şi inulaze. Au fost identificate în plantele care acumulează cantităţi mari de inulină (napi, cicoare), precum şi în mucegaiuri. Sub acţiunea inulinazei, inulina se hidrolizează cu formarea fructozei. Pe această cale se pot valorifica materiile prime bogate în inulină ca surse alternative de obţinere a unui îndulcitor (siropul de fructoză) pentru diverse ramuri ale industriei alimentare, îndeosebi pentru realizarea produselor dietetice. - Protopectinaza şi poligalacturonaza. Substanţele pectice se descompun sub acţiunea a două tipuri de enzime. Descompunerea protopectinei are loc sub acţiunea enzimei protopectinaza care hidrolizează legătura dintre acidul poligalacturonic metoxilat, arabanii şi galactanii legaţi de el. Ca rezultat se formează acid poligalacturonic metoxilat liber (pectina solubilă), care la rândul său se hidrolizează sub acţiunea enzimei pectinesteraza (sau pectaza) care aparţine grupei esteraze. Se formează acid poligalacturonic şi alcool metilic. Enzima poligalacturonaza, care uneori se mai numeşte şi pectinaza, catalizează hidroliza legăturilor glicozidice existente în substanţele pectice între resturile de acid galacturonic care nu conţin grupări metoxil. Acţiunea enzimelor care catalizează hidroliza substanţelor pectice poate fi reprezentată schematic astfel:

Araban

Acid poligalacturonic metoxilat

Galactan

Actiunea protopectinazei
Actiunea pectinmetil esterazei
COOH O
H

O H H OH O
H

H OH H

H

COOCH3 O H H OH OH H O
H

H

COOCH3 O H H OH O
H

COOH H OH H

O H H OH O
H

COOH H OH H

O H H OH O

OH H

poligalacturonaza nu actioneazã

actiunea poligalacturonazei

243

Biochimia produselor alimentare Spre deosebire de pectinmetilesterază, care este prezentă atât în plante cât şi în diferite microorganisme, poligalacturonaza se găseşte în special în bacterii şi mucegaiuri; în plante ea se întâlneşte rar. Preparatele enzimatice pectolitice se obţin de regulă din diverse mucegaiuri. Ele se utilizează în industria alimentară pentru limpezirea sucurilor de fructe şi pentru mărirea randamentului lor, precum şi pentru limpezirea sucurilor de struguri şi bace, în care de regulă există o cantitate mare de pectină solubilă ce îngreunează filtrarea şi constituie o cauză a tulburelii vinului. Aceste preparate transformă soluţiile coloidale care menţin în suspensie şi alte impurităţi, în soluţii adevărate, iar impurităţile se depun. Prin acţiunea enzimelor pectolitice existente în ţesuturile vegetale se explică şi înmuierea fructelor în timpul coacerii sau depozitării lor în stare proaspătă. Astfel, pe măsură ce fructele se coc protopectina insolubilă se transformă, sub acţiunea protopectinazei, în pectină solubilă iar ţesutul devine moale şi suculent. - Alte glicozidaze. În salivă, lapte proaspăt muls, lacrimi şi albuşul de ou este prezentă o enzimă care se numeşte lizozim şi care catalizează hidroliza legăturilor glicozidice dintre unităţile de aminozaharuri din mucopolizaharide. Această enzimă hidrolizează pereţii celulari ai bacteriilor şi conferă astfel mediilor în care se găseşte acţiune bactericidă. În bacterii, veninul de albine şi de şarpe, în tumorile canceroase şi în alte ţesuturi se găseşte hialuronidaza, o enzimă care hidrolizează acidul hialuronic cu formarea acidului glucuronic şi a acetilglucozaminei. 7.9.3.3. Proteaze Proteazele sau enzimele proteolitice sunt enzimele care catalizează scindarea legăturilor –CO-NH- peptidice din moleculele proteinelor şi ale produşilor lor de degradare, polipeptide şi oligopeptide până la aminoacizi, cu fixarea componentelor apei. În funcţie de poziţia internă sau terminală a legăturii peptidice scindate, proteazele se împart în exopeptidaze şi endopeptidaze. a) Exopeptidaze. Sunt proteazele care atacă numai legăturile peptidice terminale, situate la capetele lanţului polipeptidic, adiacent grupărilor αamino- şi α-carboxil terminale. Aceste enzime acţionează în general asupra produşilor de hidroluiză rezultaţi prin acţiunea endopeptidazelor sau chiar asupra proteinelor încă neatacate; au ca produşi de hidroliză, de regulă, aminoacizii. În funcţie de modul de acţiune se împart în: - Aminopeptidaze – proteazele care scindează legătura peptidică adiacentă unui aminoacid terminal ce are grupare aminică liberă, eliberând acest

244

Enzime aminoacid:

H2N CH CO R1

NH

CH CO R2

HOH

H2N CH COOH + H2N R1

CH CO R2

Produşii de hidroliză sunt aminoacizi şi oligopeptide. Foarte larg răspândită este leucinaminopeptidaza care hidrolizează cu o mare viteză compuşii leucinei, dar şi o serie de peptide care conţin alţi aminoacizi Nterminali. Enzima conţine zinc. Aminopeptidaze se găsesc în drojdii, în mucoasa intestinală, bacterii şi mucegaiuri. - Carboxipeptidaze - enzime care scindează în polipeptide legătura peptidică ce se găseşte lângă o grupare carboxil liberă:

CH CO NH CH COOH HOH R2 R1

CH COOH + H2N R2

CH COOH R1

Carboxipeptidaza se găseşte în intestinul subţire şi se utilizează pe larg în chimia proteinelor pentru determinarea aminoacizilor C-terminali. Constituie de fapt o metaloenzimă ce conţine zinc. Produşii de hidroliză rezultaţi prin acţiunea carboxipeptidazelor sunt tot oligopeptide şi aminoacizi. - Dipeptidaze - catalizează scindarea hidrolitică a dipeptidelor în aminoacizi liberi. Astfel, de exemplu glicilglicildipeptidaza hidrolizează glicilglicina în două molecule de glicocol:

NH2 CH2 CO COOH NH CH2 + HOH 2 CH2 NH2 COOH

Se găseşte în plante, animale şi microorganisme. Sunt prezente în mucoasa intestinală, rinichi, drojdii, mucegaiuri, malţ. Prezintă specificitate în funcţie de aminoacizii constituenţi ai substratului şi necesită pentru activitatea catalitică diferiţi ioni metalici. b) Endopeptidaze. Sunt proteazele care hidrolizează legăturile peptidice din moleculele de proteine. Ca urmare a acţiunii lor, proteinele se transformă în peptone, polipeptide şi aminoacizi liberi. Multe endopeptidaze sunt capabile să producă coagularea laptelui. Se mai numesc şi proteinaze. În funcţie de grupările centrului activ, se disting 4 subsubclase de endopeptidaze: - proteinaze serinice al căror centru activ conţine un rest de serină;

245

Biochimia produselor alimentare enzimele reprezentative sunt subtilaza, tripsina, elastaza; - proteinaze tiolice (SH- dependente) a căror activitate depinde de prezenţa în centrul activ a unor grupări –SH libere. Sunt reprezentate de papaină, ficină, bromelină. - proteinaze acide, au în centrul catalitic grupări carboxilice ionizate, fiind active în domeniu de pH acid. Acestei subsubclase îi aparţin enzimele renina, pepsina; - metalproteinaze, sunt activate de ionii metalici legaţi de centrul activ al enzimei (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+). Sunt reprezentate de colagenază. Caracteristicile endopeptidazelor mai importante sunt următoarele: - Pepsina este enzima proteolitică care hidrolizează legăturile peptidice în care sunt implicaţi aminoacizii aromatici; este secretată de celulele glandelor fundice ale stomacului sub formă inactivă de pepsinogen. Acidul clorhidric activează pepsinogenul punând în libertate pepsina activă şi un polipeptid. Aceeaşi acţiune o are însăşi pepsina printr-un efect autocatalitic:

Pepsina are un pH optim de 1,5 – 2,5 care variază după natura substratului. Pepsinogenul şi pepsina au acelaşi aminoacid terminal, alanina. Pepsina desface legăturile peptidice formate între gruparea aminică a tirozinei şi gruparea –COOH a unui aminoacid monoaminodicarboxilic (acid aspartic, acid glutamic). Scindează o mare varietate de proteine, iniţiind astfel procesul de digestie a acestora. Produsele rezultate din hidroliza substanţelor proteice sub acţiunea pepsinei sunt albumoze şi peptone cu greutate moleculară relativ mare, dar solubile în apă. Această endopeptidază posedă şi o anumită activitate de coagulare a laptelui. Pepsina cristalizată este o proteină; posedă însuşirile de solubilitate ale globulinelor. Industrial se obţine un preparat enzimatic de pepsină prin macerarea stomacului de porcine cu acid clorhidric 0,5%. Soluţia obţinută se poate purifica prin dializă şi apoi este concentrată în vid. Se utilizează pentru coagularea laptelui în industria brânzeturilor. - Tripsina este o enzimă proteolitică care acţionează în zona pH-urilor alcaline, pH-ul optim fiind de 8-9. Ea acţionează hidrolitic asupra compuşilor rezultaţi în urma acţiunii pepsinei şi formează diferite polipeptide şi peptide. Scindează preferenţial legăturile peptidice la care participă arginina sau lizina. Tripsina este secretată de pancreas sub formă de precursor inactiv denumit tripsinogen. Activarea tripsinogenului se face în intestin sub acţiunea autocatalitică a tripsinei precum şi a enterokinazei secretată de

pepsinogen

HCl

pepsina + polipeptid

246

Enzime mucoasa intestinală. Trecerea proenzimei la forma activă este accelerată de ionii de Ca2+ şi H+ şi constă în desprinderea unui hexapeptid:

Tripsinogen

enterokinaza

Tripsina + hexapeptid

- Renina (Chimozina sau labfermentul) este o endopeptidază secretată de stomacul animalelor tinere, acţionează la pH=4,0 şi are proprietatea de a coagula laptele, transformând cazeina solubilă în cazeinat de calciu insolubil. Pentru mărirea activităţii sale în coagularea laptelui sunt necesari ionii de Ca2+. Coagulul format este apoi digerat de către pepsină. În felul acesta este prevenită trecerea rapidă a laptelui prin stomac şi se favorizează staţionarea proteinelor sale precipitate pentru a putea fi digerate. Preparatele de renină, comercializate sub formă de cheag sunt obţinute prin macerarea stomacului animalelor tinere şi sunt utilizate industrial pentru fabricarea brânzeturilor. - Chimotripsina este o proteinază secretată de pancreas sub formă de proenzimă denumită chimotripsinogen. Sub acţiunea urmelor de tripsină, acesta se transformă complet în proteinaza activă – chimotripsina. Chimotripsinogenul nu este activat de enterokinază şi chimotripsină. În felul acesta, proteinazele secretate de pancreas rămân inactive până când ajung în curentul intestinului subţire şi vin în contact cu enterokinaza. Aceasta activează tripsinogenul la tripsină, care la rândul său activează tripsinogenul şi chimotripsinogenul. Activarea zimogenului şi transformarea sa în forma activă a enzimei necesită cantităţi foarte mici de activatori. Astfel, de exemplu, activarea chimotripsinogenului cristalin are loc deja în prezenţa a 0,001 mg tripsină. Chimotripsina scindează hidrolitic proteine native şi denaturate, albumoze, peptone, acţionând asupra legăturilor peptidice stabilite între un aminoacid aromatic şi unul alifatic. Produşii săi de hidroliză sunt polipeptide şi peptide. Are un pH optim de 8,0-9,0. - Catepsine. Sunt proteinaze existente în ţesuturile animale, localizate intracelular la nivelul lizozomilor. Ele participă la procesele de autoliză şi autodegradare a ţesuturilor. Acţionează la un pH=4-5. Activitatea lor este deosebit de intensă după moartea animalelor, când ţesuturile devin acide şi se creează condiţii de acţiune. - Papaine. Sunt endopeptidaze ce se găsesc în ţesuturile vegetalelor şi în drojdii. Acţionează asupra proteinelor native, asupra peptidelor şi polipetidelor şi au o acţiune largă nespecifică, eliberând aminoacizi. Papainele sunt deci enzime cu acţiune complexă care nu au corespondenţi în organismele animale. Domeniul optim de acţiune al acestor enzime este slab acid, neutru sau slab alcalin, în funcţie de natura substratului. Astfel, acţiunea papainei

247

Biochimia produselor alimentare asupra albuşului denaturat termic are loc la pH=7,5, iar asupra gelatinei la pH=5,0. Aceste deosebiri se datorează proprietăţilor substratului utilizat. De aceea, pentru a se obţine cea mai bună imagine asupra proprietăţilor şi condiţiilor de acţiune ale unei anumite proteinaze vegetale este necesar ca ea să fie studiată pe substratul specific, existent în planta respectivă. Molecula de papaină conţine trei punţi disulfidice şi o grupare –SH care intră în centrul său activ. Acesta mai include şi un rest de histidină. Cea mai caracteristică particularitate a papainei, ca şi a altor enzime proteolitice de origine vegetală constă în faptul că este activată de acidul cianhidric şi compuşii ce conţin grupări –SH. Printre aceştia trebuie, înainte de toate, menţionaţi cisteina şi glutationul redus. Pornind de la faptul că activarea papainei se realizează cu reducători, se consideră că în papaină există un sistem reversibil, care este alcătuit din enzimă oxidată şi enzimă redusă: Pa - S - S - Pa
+2H+ -2H+

Pa - SH + HS - Pa

Forma activă a papainei este tocmai cea redusă. Ca urmare, oxidarea papainei conduce la diminuarea sau deplina inhibare a activităţii hidrolitice. În seminţele plantelor, papainazele au o acţiune foarte redusă datorită cantităţii mici de apă. Prin umectarea cerealelor, leguminoasele uscate sau prin umectarea făinurilor şi crupelor obţinute din acestea, papainazele îşi amplifică activitatea şi descompun proteinele existente în mediu. Astfel de fenomene au loc la umectarea bobului de orz în fabricile de malţ, a bobului de grâu în timpul condiţionării şi odihnei sale înainte de măcinare, sau în aluatul destinat fabricării pâinii. Foarte intensă este acţiunea papainazelor în seminţele germinate, eliberându-se aminoacizii necesari dezvoltării plantulei. Paralel, creşte şi conţinutul în glutation al embrionului, care activează procesele de hidroliză a proteinelor. În fructele de ananas se găseşte o proteinază care se numeşte bromelină. Această enzimă este activată de compuşii sulfhidrilici, iar pH-ul optim este 6,0-7,0. O proteinază de tipul papainei activată de reducători se găseşte şi în latexul de smochin precum şi în alte plante ce aparţin familiei Ficus. Se numeşte ficină, pH-ul său optim este 7,0 şi hidrolizează legăturile peptidice dintre tirozină şi fenilalanină. Enzimele proteolitice participă la transformările biochimice pe care le suferă compuşii de natură proteică în timpul maturării unor produse alimentare (brânzeturi, preparate din carne, preparate din peşte, etc.) contribuind la formarea unor calităţi senzoriale (gust, aromă, textură, etc.) specifice acestor alimente. Preparatele enzimatice proteazice obţinute din materii prime de origine

248

Enzime animală, vegetală, sau din microorganisme sunt utilizate în diferite domenii ale industriei alimentare în scopul diversificării produselor sau îmbunătăţirii calităţilor lor. Astfel, în prezent se produc pe scară industrială cheaguri microbiene, care sunt utilizate pentru coagularea laptelui în industria brânzeturilor. Pentru fabricarea supelor pulbere sau a unor adjuvanţi de aromă, se utilizează hidrolizate proteice obţinute din diverse materii prime vegetale sau de origine animală. Preparatele enzimatice proteolitice se pot folosi şi pentru îmbunătăţirea frăgezimii cărnii de vită sau pentru fabricarea membranelor comestibile din piei de animale. O importanţă deosebită o au preparatele enzimatice proteolitice pentru îmbunătăţirea calităţilor senzoriale sau nutriţionale ale proteinelor din unele materii prime, prin reacţia de plasteinizare. Plasteinizarea constă în resinteza legăturilor peptidice dintr-un hidrolizat proteic, după efectuarea unor modificări dorite în compoziţia sa. Prin această reacţie se pot introduce unii aminoacizi deficitari ai unor proteine (lizină în gluten, lizină şi triptofan în zeină, metionină în proteinele din soia) realizându-se o îmbunătăţire a calităţilor nutriţionale ale proteinelor respective. De asemenea, se poate diminua conţinutul proteinelor în anumiţi aminoacizi – fenilalanina de exemplu –în scopul obţinerii unor produse destinate alimentaţiei copiilor cu insuficienţă genetică fenil-cetonurinică. Tot prin plasteinizare se pot elimina gustul amar al unor hidrolizate sau se pot îndepărta substanţele cu miros neplăcut din unele proteine (din leguminoase, peşte). 7.9.3.4. Amidaze Sub denumirea de amidaze sunt grupate enzimele care catalizează hidroliza unor legături C-N, altele decât cele peptidice. Aparţin acestei subclase enzime ca ureaza, asparaginaza, glutaminaza, arginaza şi nucleozidazele. - Ureaza scindează hidrolitic legăturile amidice din uree cu producere de NH3 şi CO2:

C

NH2 O + H2O NH2

2 NH3 + CO2

Ureaza are specificitate absolută. Se găseşte în plante, mucegaiuri şi unele bacterii. O cantitate deosebit de mare de urează conţin seminţele de soia. Printr-o urează foarte activă se disting bacteriile care descompun

249

Biochimia produselor alimentare ureea (urobacterii) şi participă astfel la circuitul azotului în natură. - Asparaginaza şi glutaminaza sunt enzimele care catalizează hidroliza asparaginei şi glutaminei în acid aspartic, respectiv acid glutamic şi amoniac. Aceste hidrolaze se găsesc în ţesuturile animalelor, în mucegaiuri, în drojdii, în bacterii şi plante. Zona optimă de acţiune a asparaginazei şi glutaminazei este în jur de pH=8,0. Asparaginaza şi glutaminaza au un rol important în metabolismul azotului la plante deoarece catalizează transformarea amidelor aminoacizilor dicarboxilici care se acumulează în cantităţi mari în plante şi care constituie produşi intermediari de metabolism. - Arginaza este enzima care catalizează descompunerea hidrolitică a Largininei în ornitină şi uree:
NH H2N C NH CH2 3 arginina CH COOH NH2
+H2O

C

NH2 O + H2N CH2 3 NH2 uree

CH COOH

NH2 ornitinã

D-arginina nu este descompusă de arginază. Această enzimă se găseşte în ficatul mamiferelor; lipseşte din ficatul păsărilor dar se găseşte în alte organe ale acestora. Arginaza face parte din sistemul enzimatic care catalizează „ciclul ornitinei”. Amoniacul toxic pentru celule, rezultat din catabolismul proteinelor şi al purinelor se elimină din unele organisme sub formă de uree prin ciclul ornitinei. Zona optimă de pH pentru activitatea arginazei este în domeniu alcalin (pH=10). Deoarece enzima este activată de săruri de mangan se consideră că ea reprezintă în sine o proteină ce conţine un mangan. - Nucleozidaze. sunt enzime care catalizează hidroliza legăturii C-N din nucleozide, formând ca produşi de reacţie o bază azotată şi o pentoză:
NH2 N N N H N
O

NH2 CH2OH H H OH H2O N N N H N

H OH

+

H HO H OH

O

CH2OH H H OH

Nucleozid

Bazã azotatã

Pentozã

Se găsesc la plante, animale şi microorganisme şi acţionează la un pH de 7-8.

250

Enzime 7.9.3.5. Polifosfataze Sunt enzime care catalizează scindarea radicalilor fosfat, dar legăturile stabilite de aceşti radicali în moleculele compuşilor respectiv nu sunt de tip esteric, ci legături de tip -P-O-P-. Enzimele din această subclasă sunt deosebit de importante datorită substraturilor asupra cărora acţionează: ATP, ADP, NAD+, FAD. Ele au un rol important în schimburile energetice ale celulei. Astfel: - ATP-aza sau ATP-fosfohidrolaza catalizează scindarea hidrolitică a legăturii fosfat terminală, puternic energetică, din molecula de ATP: ADP + H3PO4 ATP + H2O - Apiraza sau ATP-difosfohidrolaza catalizează eliberarea a două molecule de acid fosforic din ATP: AMP + 2 H3PO 4 ATP + H2O

7.9.4. Liaze
Liazele reprezintă clasa de enzime care catalizează reacţii de descompunere nehidrolitică a compuşilor organici prin scindarea legăturilor C-C, C-N, C-O etc. Ca urmare a acţiunii acestor enzime frecvent apar duble legături în molecula substratului şi se formează compuşi simpli –CO2, H2O, NH3 etc. Unele din aceste reacţii sunt reversibile şi enzimele corespunzătoare catalizează nu numai descompunere, ci şi sinteză. Denumirea sistematică a acestor enzime se face adăugând la numele substratului terminal termenul liaza. În cazul unor denumiri curente se admit denumirile decarboxilază, aldolază, dehidratază, etc. 7.9.4.1. Carbon - carbon liaze (C-C-liaze) Reprezintă una din cele mai importante subclase de liaze şi printre ele, de un interes deosebit sunt: - Decarboxilazele care catalizează reacţiile de decarboxilare a α cetoacizilor după următoarea schemă:

CH3 C O

COOH

piruvatdecarboxilaza

CH3 CHO + CO2 aldehida acetica

acid piruvic Există şi decarboxilaze care au drept substrat aminoacizii pe care-i transformă în aminele corespunzătoare:

251

Biochimia produselor alimentare

R CH NH2 aminoaciddecarboxilaza
Astfel, de COOH amina exemplu, prin decarboxilarea lizinei sub acţiunea lizindecarboxilazei se formează cadaverina, a ornitinei, de către ornitindecarboxilază– putresceina etc. Decarboxilaze ale aminoacizilor se găsesc în plante, animale şi microorganisme. În cantităţi deosebit de mari sunt în bacteriile care produc degradarea substanţelor proteice conducând la acumularea de amine biogene. Decarboxilazele sunt enzime a căror grupare prostetică (cofactorul) este reprezentată de esterii fosforici ai vitaminelor hidrosolubile: tiaminpirofosfatul (TPP) pentru decarboxilazele α -cetoacizilor şi piridoxalfosfatul (pirid-CHO) pentru cele ale aminoacizilor. - Aldehidliaza sau aldolaza este un reprezentant caracteristic al C-Cliazelor şi reprezintă enzima care catalizează reacţia reversibilă de descompunere a fructozodifosfatului până la fosfotrioze:
CH2 O PO3H2 C O HO C H H C OH H C OH CH2 O PO3H2 fructozo - 1,6-difosfat
aldolaza

R CH2 NH2 + CO2

CH2 O PO3H2 C O CH2OH

CHO + H C OH CH2 O PO3H2

dioxoaceton1-fosfat

gliceraldehid 3-fosfat

Aldolaza joacă un rol deosebit în procesele de respiraţie, fotosinteză şi fermentaţie alcoolică. Este o enzimă strict specifică şi acţionează la toate organismele în metabolismul glucidelor.

7.9.4.2. Carbon-oxigen liaze (C-O-liaze) Enzimele din această subclasă catalizează reacţia de scindare a legăturii C-O conducând la formarea unor produşi nesaturaţi. În această categorie

252

Enzime sunt incluse hidroliazele care accelerează reacţia de hidratare şi deshidratare a compuşilor organici. Mai importante sunt: - Carbonat hidroliaza sau carbonic anhidraza care reversibilă de descompunere a acidului carbonic: catalizează reacţia

H2CO3 H2O + CO2 Această enzimă se găseşte în hematii, mucoasa gastrică, rinichi, sistemul nervos central. Conţine Zn2+ în moleculă.
Carbonic anhidraza din mucoasa gastrică asigură formarea H2CO3 care furnizează ionii de hidrogen (H+) necesari sintezei HCl din stomac şi anionii HCO3− ce trec în plasmă şi participă la menţinerea pH-ului sanguin. - Fumarat hidroliaza sau fumaraza catalizează reacţia reversibilă de adiţie a apei la dubla legătură din acidul fumaric cu formare de acid L-malic:
COOH HC COOH HOOC CH acid fumaric + H2O
fumaraza

CH2 HO C H COOH acid L-malic

Fumarat hidroliaza este o enzimă foarte răspândită în ţesuturile animale, ale plantelor şi microorganismelor; face parte din sistemul enzimatic care intervine în ciclul acidului citric şi este absolut specifică deoarece alte substrate înrudite nu sunt atacate. - Fosfopiruvathidroliaza sau enolaza catalizează reacţia reversibilă, deosebit de importantă a glicolizei, de transformare a acidului 2fosfogliceric în acid 2-fosfoenolpiruvic, prin care se obţine o legătură macroergică:

CH2 OH CH O PO3H2 COOH enolaza

CH2 C O~ PO3H2 COOH + H2O

acid 2-fosfoenolpiruvic Enolazele acid 2-fosfogliceric sunt foarte răspândite; se găsesc în toate organismele la care degradarea zaharurilor se face prin glicoliză. Sunt nişte metalenzime care conţin Mg2+, Mn2+.
- Citrat (izocitrat)-hidroliaza (aconitaza) catalizează transformarea reversibilă a acizilor citric, izocitric şi cis-aconitic în ciclul acidului citric.

253

Biochimia produselor alimentare Această transformare decurge în modul următor:
OH CH COOH +H2O -H2O CH COOH CH2 COOH acid izocitric

CH2 COOH HO C COOH CH2 COOH acid citric

CH COOH -H2O + H2O C COOH CH2 COOH acid cis-aconiticc

Reactia are un rol deosebit şi în transformările acizilor organici în plante. 7.9.4.3. Carbon-azot liaze (C-N-liaze) Reprezentantul acestei grupe de liaze este L-asparatamoniacliaza sau aspartaza ce transformă acidul aspartic în acid fumaric şi amoniac:

COOH CH NH2 CH2 COOH acid aspartic
aspartaza

COOH CH HC + NH3

COOH acid fumaric

Ca urmare, aminoacizii se transformă în acizi nesaturaţi datorită dezaminării. Această enzimă este caracteristică pentru bacterii şi plante. 7.9.4.4. Carbon-sulf liaze (C-S-liaze) Scindarea legăturilor carbon-sulf este realizată, de exemplu, cisteindesulfhidraza care transformă cisteina în acid piruvic şi H2S: de

CH2 SH CH NH2 COOH cisteinã

H2O

CH3 O + H2S + NH3 COOH acid piruvic C

7.9.5. Izomeraze 254

Enzime

Izomerazele sunt enzimele care catalizează transformarea intramoleculară a unui compus dintr-o formă izomeră în altă formă izomeră. Aceste transformări constau din transferul intramolecular al hidrogenului, grupărilor fosfat sau acil, în modificarea distribuţiei spaţiale a atomilor unor grupări, în deplasarea dublelor legături etc. Clasa izomerazelor include câteva zeci de enzime individuale care se împart în mai multe subclase. 7.9.5.1. Racemaze şi epimeraze Din această categorie fac parte enzimele care catalizează reacţii de racemizare şi epimerizare ale aminoacizilor, hidroxiacizilor, glucidelor şi a altor compuşi. Racemizarea se face după tipul: L - aminoacid L - lactat D - aminoacid D - lactat

Astfel, enzima alanin-racemaza transformă reversibil L-alanina în D-alanină iar lactat-racemaza catalizează transformarea D-lactatului în L-lactat.

CH3 H C OH COOH D-acid lactic

CH3 HO C H COOH L-acid lactic

Reacţiile catalizate de racemaze au o importanţă deosebită pentru că permit trecerea formelor D în forme L ale unor molecule pătrunse în organism odată cu hrana, organismul utilizând numai forma L. De asemenea, prin aceste reacţii unele microorganisme pot metaboliza ambele forme ale unor compuşi. Epimerazele catalizează reacţii de epimerizare acţionând asupra glucidelor şi derivaţilor lor. Astfel, UDP-glucozo-4-epimeraza transformă reversibil UDP-glucoza în UDP-galactoză:
CH2OH H HO H OH H O H H O - UDP OH HO CH2OH H O H H O - UDP OH

H OH H

UDP-glucozã

UDP-galactozã

255

Biochimia produselor alimentare

7.9.5.2. Izomeraze cis-trans Din această subclasă face parte enzima maleatizomeraza care catalizează reacţia de transformare reversibilă a acidului maleic în acid fumaric:

H C COOH H C COOH acid maleic

H C COOH HOOC C H acid fumaric

7.9.5.3. Oxidoreductaze intramoleculare Sunt izomeraze care catalizează intertransformarea aldozelor şi cetozelor. Are loc o reducere concomitentă a grupării aldehidice la gruparea alcool primar şi oxidarea grupării alcool secundar la gruparea cetonică. Astfel de enzime sunt: -Triozofosfatizomeraza - catalizează intertransformarea unor produşi intermediari ai glicolizei, respectiv a 3-fosfogliceraldehidei şi fosfodioxiacetonei (dihidroxiacetonfosfat):

CHO OH CH2 O P O OH 3-fosfogliceraldehida CHOH

CH2OH C O OH CH2 O P O OH fosfodioxiacetona

-Glucozofosfatizomeraza sau glucozoizomeraza – catalizează o reacţie în cadrul procesului de glicoliză şi anume transformarea reversibilă a glucozo-6-fosfatului în fructozo-6-fosfat:
CH2 O P O H H OH H H OH OH O H OH HO H

H HO

P O H2C
H

CH2OH OH

glucozo-6-fosfat

fructozo-6-fosfat

Glucozoizomeraza produsă de către microorganisme este utilizată ca atare sau sub formă imobilizată pentru izomerizarea industrială discontinuă sau continuă a siropurilor de glucoză. Prin această izomerizare enzimatică se obţin siropuri cu conţinut ridicat de fructoză (Izosirop sau High Fructose Syrup) care sunt utilizate în industria alimentară

256

Enzime ca produşi de îndulcire deoarece, prin prezenţa fructozei, au o putere de îndulcire mai mare decât siropurile din glucoză. Totodată, izosiropul se foloseşte şi pentru obţinerea produselor dietetice, deoarece fructoza este mai bine tolerată de diabetici. -Ribozofosfatizomeraza catalizează intertransformarea formelor cetonică şi aldehidică ale ribozo-5-fosfatului:

P O H2C

OH H OH C

O H

P O H2C

OH CH2OH C O

H H OH

H H OH

Ribo-aldozo-5-fosfat (ribozo-5-fosfat)

Ribo-cetozo-5-fosfat (ribulozo-5-fosfat)

7.9.5.4. Transferaze intramoleculare În această subclasă sunt incluse izomerazele care catalizează transferul unor grupări chimice în diferite poziţii ale moleculei de substrat. Se mai numesc mutaze. Astfel sunt: -Fosfoglucomutaza care transportă gruparea fosfat de la carbonul 1 la carbonul 6 din molecula de glucozo-1-fosfat:
OH CH2 O P O O H H OH H H OH OH OH H OH

CH2OH O H H H H OH OH O H OH

O P OH OH

glucozo-1-fosfat

glucozo-6-fosfat

-Fosfogliceromutaza asigură conversia acidului 3-fosfogliceric în acidul 2fosfogliceric:

COOH CHOH O OH CH2 O P

COOH

O OH

CH O P CH2OH OH

OH acid 3-fosfogliceric

acid 2-fosfogliceric

7.9.6. Ligaze 257

Biochimia produselor alimentare Ligazele sau sintetazele sunt enzime care catalizează reacţiile de sinteză a substanţelor organice ce se desfăşoară cu descompunerea unor donori de energie pentru realizarea proceselor de biosinteză. Unul dintre aceşti donori naturali de energie este ATP. Energia care se eliberează prin ruperea resturilor de acid fosforic este utilizată pentru activarea substanţelor care reacţionează. Prin urmare, ligazele catalizează sinteza compuşilor organici din substanţe activate prin descompunerea ATP. Ele conduc la formarea de noi legături C-C, C-N, C-O, C-S. Sunt enzime ce au o importanţă deosebită pentru sinteza proteinelor (formarea legăturii peptidice), glucidelor (formarea legăturii glicozidice) şi a lipidelor (formarea legăturii ester) pe seama energiei eliberate prin transformarea ATP în ADP sau AMP. -Acil-CoA-ligaze sunt enzime ce catalizează legarea resturilor diferitor acizi organici (acetic, succinic etc.) la conezima A, după reacţia:

R-COOH + CoA-SH + ATP

acetiltiokinaza

R-CO~SCoA + AMP + PPi acil-CoA

De exemplu, acetil-CoA-ligaza formează acetil-CoA:

CH3-COO- + CoA-SH + ATP

acetiltiokinaza

CH3-CO~SCoA + AMP + PPi acetil-CoA

Compuşii coenzimei A care se formează în acest mod reprezintă surse importante de grupări acil active ce sunt utilizate pentru diverse sinteze care au loc în celule. -Carboxilaze sunt enzime care catalizează legarea dioxidului de carbon la diverşi acizi organici, adică reacţia de lungire a lanţului atomilor de carbon ,folosind energia eliberată prin descompunerea molecului de ATP. De exemplu, piruvatcarboxilaza catalizează reacţia de sinteză a acidului oxalacetic din acid piruvic:

COOH C O + H2O + CO2 + ATP
sau

COOH C O CH2 + ADP + H3PO4 COOH acid oxalacetic

CH3 acid piruvic

acetilcarboxilaza care determină legarea CO2 la restul acetil cu formarea malonil-CoA:

258

Enzime

CH3 - CO ~ SCoA + CO2 + ATP acetil - CoA

HOO - CH2 - CO ~ SCoA + ADP + H3PO4 malonil - CoA

Carboxilazele care catalizează legarea CO2 conţin în calitate de coenzimă biotina. -Aminoacid tARN-ligazele catalizează activarea aminoacizilor liberi din citoplasmă; aceştia, prin intermediul tARN, sunt transferaţi la nivelul ribozomilor unde participă la biosinteza proteinelor conform informaţiei codificată în ADN şi transmisă la ribozomi prin mARN. Sub acţiunea ligazelor se formează un complex al aminoacizilor cu tARN. Aminoacid + ATP + tARN → aminoacil-tARN + AMP + PPi -Amidligaze sunt enzimele care catalizează formarea legăturilor C-N. De exemplu, glutaminsintetaza determină sinteza glutaminei din acid glutamic şi amoniac: acid glutamic + NH3 + ATP → glutamină + ADP + H3PO4

259

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful