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ALUMNO (a

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PRESENTACION
Los profesores de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la U niversidad Nacional de Trujillo, han actualizado la Guía de Práctica, donde el estudiante encontrará una breve introducción de la importancia bioquímica y correlato medico de cada práctica, así como el procedimiento a desarrollar, finalizando con un breve cuestionario a fin de ampliar o concretar la aplicación de lo tratado. La Bioquímica es sin duda la ciencia que más ha aportado al desarrollo de la Medicina, basada en una rigurosa apl icación del método científico de la investigación

experimental. En la práctica, los alumnos a partir de los conocimientos adquiridos en los diálogos, seminarios y casos clínicos, tienen la oportunidad de plantear

interrogantes, contrastarlas con un experimento en forma ordenada, obten iendo resultados que al final se discutirán en grupo con el docente. También podrán conocer algunos métodos aplicados al diagnóstico clínico o al estudio nutricional. La práctica en Bioquímica, constituye un estímulo importante en el desarrollo de la investi gación experimental, permitiendo a nuestros estudiantes desarrollar habilidades y destrezas en trabajos de investigación y así obtener logros a nivel nacional para nuestra Facultad. Un recuerdo especial para los profesores que sentaron las bases para la actual guía de práctica como el Dr. Hugo Alpaca Muñoz, el Dr. Jorge García Ventura y un

agradecimiento a todos los docentes que de una u otra manera aportaron con sus conocimientos para disponer de esta herramienta que beneficiará a los alumnos de nuestra Facultad. Dr. CARLOS ARANCIBIA ARROYO Dra. MARIA DAYSI REYES BELTRAN Dr. JUAN VALLADOLID ALZAMORA Dr. JORGE HUAMAN SAAVEDRA Dr. WALTER OBESO TERRONES Dr. ALFREDO LARIOS CANTO Dr. JORGE PLASENCIA ALVAREZ Dr. HECTOR RODRIGUEZ BARBOZA

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I UNIDAD SUBESTRUCTURA CELULAR: ENZIMAS Y BIOENERGETICA

REUNION DE LABORATORIO N° 01
PRACTICA N° 01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION: La vida depende de una serie ordenada de reacciones químicas que son catalizadas por enzimas formadas para este fin. Las enzimas son proteínas relativamente frágiles con tendencia a sufrir desnaturalización e inactivación, es decir alteraciones en su conformación, por efecto de diversos agentes físicos y químicos como: temperatura, ácidos, álcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc. Las enzimas se encuentran en pequeñas concentraciones en los materiales biológicos resultando , complicada su individualización o purificación. Para poder verificar directamente las propiedades comunes o similares de la naturaleza proteica que las caracterizan, experimentalmente se pueden utilizar las propiedades de catalizadores específicos que tienen las enzimas, como indicador de las alteraciones que pueden sufrir éstas cuando son sometidas a la acción de diferentes agentes físicos y químicos. De esta manera, sin necesidad de individualizar o purificar una determinada enzima se pueden verificar cómo los agentes físicos y químicos afectan la naturaleza proteica de las enzimas, disminuyendo su actividad. La finalidad de la presente práctica, es evidenciar las características proteicas de las enzimas y que expuestas a la acción de diversos agentes físicos y químicos hacen variar su comportamiento y actividad catalítica. II. REACTIVOS A UTILIZAR: NaOH 1N SO4 Cu 20% NaCl 0.15M Amilasa salival 1.0% Solución iodada HCl 3N y 0.05N Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 Ácido tricloro acético (A.T.C.A.) al 20%

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Preparar: SISTEMA A TUBOS COMPONENTES (en ml) Amilasa al 1% NaOH 1N HCl 3N Ácido Tricloro acético 20% Sulfato de Cobre al 20% Buffer fosfato 0.1M / pH 6.6 I 1.0 2.4 II 1.0 2.4 III 1.0 2.4 IV 1.0 2.4 V 1.0 2.4 VI 1.0 2.4

b. 3.4 2. Agregar 0.6 NaCl 0. Observar el aspecto y color producido e interpretar.0 III 1.5 VI 5 0.5 0.0 V 1.0 5.5 III 5 0.15 M Agua Destilada 5.5 II 5 0.5 0.4 2.1 M / pH 6.4 2.6 ml. 4.5 V 5 0.0 5.0 1. IV. d. CUESTIONARIO: 1.5 0.0 II 1.0 a.4 2. Dejar en incubación a 37 °C por 20 minutos. d.0 IV 1.4 a. de la enzima tratada.5 e.0 1.0 1.0 1. Explique los tipos de enlaces fuertes y débiles que existen entre los aminoácidos para conformar una determinada proteína. Durante este lapso construir el siguiente SISTEMA B: SISTEMA B: TUBOS COMPONENTES (en ml) Almidón al 1. agregar: Solución yodada 0. .5 0.05N De los tubos de reacción del sistema (B). Explique la teoría de la acción molecular de las enzimas sobre sus respectivos sustratos. Colocar el tubo VI en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.5 IV 5 0.0 5.0 5.0 1. de cada uno de los tubos del sistema (A) a su correspondiente tubo del último sistema (B). Esquematice el procedimiento de la práctica. Interprete y explique bioquímicamente cada uno de los pasos realizados durante el desarrollo de la práctica 2. A continuación armar el siguiente sistema: TUBOS COMPONENTES (en ml) HCl 0.0 1.5 0. c.4 2. Pre incubar por dos minutos a 37 ºC.5 I 5 0.0 5.0 VI 1.0% en solución acuosa Buffer fosfato 0. c.0 I 1. Dejar los 5 primeros tubos del sistema en reposo por 10 minutos a la temperatura ambiente. b. Observar el color producido e interpretar los resultados.4 2.

Enzima al 1% (amilasa salival).Solución yodada. II. y Volverlos a colocar al baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. . La finalidad del presente trabajo experimental es determinar la actividad enzimática. . 1 ml. . Para poder mostrar la actividad enzimática se debe tener presente fundamentalmente que cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima. Verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. utilizando la enzima amilasa salival que tiene la capacidad de degradar el almidón en maltosa (disacárido reductor) y algo de glucosa. y Colocar los tubos al baño de agua a 37 °C por 5 minutos. II 5 ml. solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general. la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: 1. Sin estas proteínas especializadas.Solución de almidón pH 6.Cloruro de sodio solución 0. 2.0 al 1% Solución de cloruro de sodio 0. 1 ml. Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada. Verificando el sustrato no transformado (SUSTRATO RESIDUAL ) después de un tiempo determinado de incubación en condiciones especificas de pH y temperatura. 3 ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) y Armar el siguiente sistema: ETAPA A: TUBOS COMPONENTES Solución de almidón pH 6. verificando tanto el sustrato residual y los productos formados en dicha reacción. El reactante o sustancia química que reacciona para dar un producto en un sistema enzimático se llama sustrato. entonces en un organismo vivo habría tantos sistemas enzimáticos como sustratos reaccionantes. Solución Cúprica alcalina. permitiendo que las reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien definidas.Reactivo Folin Wu: a. .1M . Solución fosfomolíbdica.0 al 1%.Ácido Clorhídrico 0. y Agregar 1 ml. REACTIVOS A UTILIZAR: . INTRODUCCION: Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia. III. la vida tal como es no podría existir. b.5 PRACTICA N° 02 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I.1M Agua destilada I 5 ml. de enzima al tubo II. 4 ml.05N .

a este nuevo sistema. 0. 2ml. II 5 ml.5 ml. transferir 0. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática? Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática. Elabore un gráfica para demostrar la acción de una enzima sobre su sustrato.5 ml. De cada uno de los tubos del sistema anterior. 1ml. 1ml. 4. y Inmediatamente cumplidos los 10 minutos. . observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante III.5 ml. Mezclar. 1ml. observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color resultante. CUESTIONARIO: 1. II 1ml. donde se observe la energía de activación y el estado de transición. 2. y Mezclar. TUBOS COMPONENTES Ácido clorhídrico 0.5 ml.05 N De los tubos I y II: Etapa A Solución yodada I 5 ml. CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (Folin WU) TUBOS COMPONENTES De los tubos I y II: etapa A Solución Cúprica alcalina Hervir 8 minutos Enfriar Solución fosfomolíbdica Agua destilada y I 1ml.5 ml. 0.6 CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático y defínalos. 2ml. 0. 0. 1ml. 3.

0 1. porque el número total de cargas positivas es igual al número total de cargas negativas contenidas en la proteína. se extrae 5 ml. la proteína sufre variaciones en la constitución de sus grupos químicos.NaOH al 10%.Solución de caseína en Acetato de Sodio 0. de solución y se elimina.0 VI 5.0 1.1N (sal)  I 5.0 1.0 1. Por tanto.7 PRACTICA N° 03 DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LAS PROTEINAS I. cada proteína posee un determinado punto isoeléctrico (PI). REACTIVOS A UTILIZAR: .0 V 5.0 III 5. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que el punto o pH isoeléctrico de las enzimas es una característica físico química común de estas moléculas. del tubo N° 2 y transferir al tubo N° 3.0 Mezclar al instante por inversión.0 1. Completando del mismo modo hasta completar la serie. . de caseína en acetato de sodio 0. En el tubo N° 9 una vez efectuada la mezcla.1N en cada tubo. cuando se encuentran en una solución que tienen pH igual al PI. Al contenido anterior del sistema agregar rápidamente 1 ml. Mezclar Extraer 5ml. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Marcar una serie de tubos de ensayo de 1 al 9 TUBOS REACTIVOS (en ml.8 II 5 III 5 IV 5 V 5 VI 5 VII 5 VIII 5 IX 5 Mezclar el tubo N° 1 Extraer 5ml.0 IX 5.) Contenido Anterior Caseína 0. se puede determinar el PI de una proteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteína se encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.0 VII 5.0 1.Indicador de pH: Papel Indicador ó pHmetro. iguales o mayores al PI.0 1. de solución del tubo N° 1 y agregarlo al tubo N° 2.Ácido acético 1N . . produciéndose en consecuencia variaciones en la estructura terciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica Aparte de otras propiedades que presentan las proteínas. Aprovechando este comportamiento. algunas proteínas son muy díficilmente solubles y precipitan.2 6.0 1. que precipitan porque la solubilidad en estas condiciones disminuye al mínimo.) Ácido Acético 1N Agua Destilada      I 3.0 IV 5.0 1.0 II 5.1N III. . INTRODUCCION: El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrógeno en el cual la proteína es eléctricamente neutra. TUBOS CONTENIDO ( en ml. II. Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pH menores.0 VIII 5.

al 0. 0. Anotar los resultados en la columna respectiva del cuadro anterior. Etc. debe calcularse el pH de cada uno de los tubos IV. 0.6 ml. que encontró en su experimento.1 TUBO N° 3 = pH 4.7 Ejemplo : Si la concentración de la sal es de 1 ml.1 N en todos los casos. la concentración de ácido acético varía. verificar el pH de cada uno de los tubos con el indicador de pH. ¿Cómo interpreta el resultado obtenido del punto isoeléctrico? ¿Qué es el pK? El pH neutro del medio ¿es igual al pH isoeléctrico? De sus razones. TUBOS N°.1 N.  Calcular el pH de cada uno de los tubos aplicando la Ecuación de Henderson ± Hasselbach.8    Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína en los diferentes tubos. Anotar en el cuadro que se da a continuación Observar después de 30 minutos de reposo y anotar también en el cuadro respectivo. de acetato de sodio 0.0 ml.1 N. x = precipitado EFECTO INMEDIATO EFECTO DESPUÉS DE 30 MINUTOS CÁLCULO DEL pH  Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación.7 ± 0.1N). Ver ejemplo. CUESTIONARIO: 1. Así en el tubo N° 1 es de 1. 3. [ Ácido ] pK del Ácido Acético = 4.6 = 4. .1 4 NOTA: De la manera indicada en el ejemplo. Indique el punto isoeléctrico aproximado a la proteína.  Luego de transcurridos los 30 minutos de reposo. Ecuación de Henderson ± Hasselbach [ sal ] pH = pK + log. 2. Cálculo de pH para el tubo N° 3: pH = pK + log. 1 = 4. I II III IV V VI VII VIII IX Emplear los símbolos siguientes : O = no cambia + = opalescencia. de ácido 1 N (16 ml. En el tubo N° 3 la concentración de ácido acético es de 4. lo cual se producirá en el tubo que tiene pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína. 4. En el tubo N°2 la concentración de ácido acético es de 8 ml.

1 N ¿Cuál es el pH de la solución en 1 ml? . Si la concentración de ácido acético en el tubo II es 8 ml a 0.9 5.

Esa velocidad de reacción se expresa como la cantidad de sustrato transformado en cierto tiempo. INTRODUCCION: Al no ser posible medir la cantidad de enzima directamente en las estructuras biológicas. A fin de evitar ambigüedades surgidas de la utilización de distintas unidades para expresar la cantidad de sustrato y el tiempo se ha definido por convención una unidad que puede ser aplicada a casi todas las enzimas y que permite comparar las actividades de enzimas diferentes. deben establecerse: . Se denomina Actividad Específica a la cantidad de una enzima expresada en términos del contenido de proteína de la preparación. constituye una medida del grado de pureza de la enzima durante el proceso de purificación.El pH. Es decir en los ejemplos mencionados más que el numero de moléculas completamente hidrolizados. se recurre a la medida de la velocidad de la reacción que cataliza.Cuando el sustrato es una proteína. En cuanto a las mencionadas condiciones de medida. Esto es posible debido a que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de enzima. se debe reemplazar la definición de un Qmol de sustrato por un microequivalente (Q eq) del grupo involucrado.En casos de reacciones bimoleculares del tipo: 2 A ----. definible como el número de moléculas de sustrato transformado por minuto y por molécula de enzima (ó por un solo centro activo) en condicionales experimentales tales que se esté midiendo la velocidad máxima (concentración saturante del sustrato).La concentración del sustrato o los sustratos y cofactores.10 REUNION DE LABORATORIO N° 02 PRACTICA N° 04 CUANTIFICACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE LAS ENZIMAS I. Esta aumenta durante el proceso de purificación de la enzima en los homogenizados biológicos y llega a ser máxima y constante cuando la enzima se halla en estado puro. De esta manera se puede expresar la cantidad de una enzima en términos de unidades enzimaticas. . . una Unidad será la cantidad de enzima que cataliza la transformación de dos Q Moles de sustrato por minuto. se toma como medida de la reacción el número de uniones peptídicas o glicosídicas atacadas respectivamente. entendiéndose por unidad de una enzima a la cantidad de ella que produce cierta velocidad de reacción bajo determinadas condiciones. y se expresa como el número de unidades de la enzima por miligramo de proteína. ACTIVIDAD ESPECÍFICA. En éste último caso y siempre que se conozca un peso molecular se puede definir otra unidad ³LA ACTIVIDAD MOLECULAR O MOLAR O NÚMERO DE RECAMBIO´ (ÍNDICE CATALÍTICO). . o cualquier otra molécula en la cual son atacados más de una unión.La temperatura a la cual se define la Unidad. Entonces la actividad específica además de cuantificar la enzima. .B + C en que dos moléculas reaccionan entre si. y en general de todos aquellos factores que de una u otra manera pueden modificar la actividad de la enzima. Dos casos merecen aclaración especial: . La definición recomendada por la Unión Internacional de Bioquímica a través de su comisión de enzimas es la siguiente: ³Una Unidad Internacional (UI) de cualquier enzima es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol (Q mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de medida´. o un polisacárido.

01667 microkatales = 16.5 ml. 20 minutos 0.02 M pH 5.02M pH 5.0 ml.2 ml. (Pre ± incubación) Preparado enzimático Mezclar e incubar a 37°C. 0. Mezclar: Separar el precipitado de proteínas filtrando o centrifugando por 10 minutos. Detener la reacción empleando: Hidróxido de bario 0.3 ml.3 ml.67 nanokatales La Actividad Específica se expresa en esta nueva unidad como Katales por kilogramo de proteína (ó Microkatales por miligramo de proteína) y la actividad molar en Katales por mol de enzima.0 ml.5 ml.5 ml.17 M Buffer acetato 0. 0.5 ml. 0. REACTIVOS A UTILIZAR: y Preparado enzimático (homogenizado celular de Fusarium moniliforme) y Buffer de acetato 0.5 ml.3 N y Sulfato de Zinc al 5 % y Solución fosfomolíbdica y solución cúprico alcalina y Reactivo de Biuret III. II.0 Incubar a 37°C.2 ml. La finalidad del presente trabajo experimental es cuantificar la Actividad Enzimática determinando la actividad específica. 2 minutos 0.3 N Sulfato de Zinc 5 % Sacarosa 0. Su relación con la Unidad Internacional es la siguiente: Un Katal es igual a 6 x 10 7 Unidades Internacionales. recomienda el uso de una nueva unidad EL KATAL (Kat) que se define como la cantidad de enzima que transforma un mol de sustrato en producto por segundo. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: y Armar el siguiente sistema: SISTEMA DE INCUBACIÓN COMPONENTES Sacarosa 0. 0.11 Actualmente la Unión Internacional de Bioquímica.17 M Agua destilada y y TUBOS DE ENSAYO I II 0. 8. 0.0 y Sacarosa 0. 0. 0.17M y Hidróxido de bario 0. Una Unidad Internacional es igual a 0. DETERMINACIÓN DE PRODUCTOS DE LA REACCIÓN (azúcar reductor) Se empleará los filtrados libres de proteínas del paso anterior y se determinará azúcar reductor mediante el siguiente procedimiento: . 8.5 ml.

del blanco) ± (Lect.. = mg... Leer a 420 nm. II ± Lect. I ± Lect. III 1. 4. 0. Mezclar y dejar en reposo durante 20 minutos..5 ml. 1. 0.5 ml.0 ml. I II 0...5 ml. 0..0 ml. = Micromoles de Hexosas / 2 Minutos Tiempo de incubación en minutos (20 min).0 ml... 0.. agregar 7... y y y CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Determinación de la concentración de proteínas en el preparado enzimático: (Reacción de Biuret) COMPONENTES Preparado enzimático Agua destilada Reactivo de Biuret 1. el factor es..5 ml. Mezclar y dejar en reposo por 30 minutos.5 ml.0 ml. Colocar en un baño de agua hirviendo durante 8 minutos Enfriara al chorro de agua Solución fosfomolíbdica y 1. II ± Lect.12 TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES Filtrado I Filtrado II Agua destilada Solución cúprica alcalina I 0. de agua destilada.5 ml. 0. Cálculos de la concentración de los productos (hexosas) [(Lect.5 ml.0 ml. Mezclar..045 uM/ml.0 ml. I) x Factor = mg. CÁLCULO: (Lect....0 ml. 4. de Proteínas .. Cálculo de las Unidades (U) (U) = uM de sustrato transformado x ml..8 ml.E. 1. Factor = 0. de proteínas por ml. del blanco)] x Factor = uMoles de Hexosas por ml.0 ml. y CÁLCULO DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA U A. Leer a 540 nm Para el espectrofotómetro. II 0.2 ml. 0..

. ¿Cómo explica la aparición de la coloración al final del sistema? ¿Por qué es necesario conocer previamente la concentración de proteínas del preparado enzimático y determinar la unidad de enzima (U). 4. Cuándo determina el azúcar reductor de una reacción. 3. proteína) a. 5. CUESTIONARIO: 1. 2. A = 1 x 10-3 y B = 1.5 x 10-4 ¿En cual de los dos preparados hay mayor cantidad de enzima? 6.13 IV. para calcular la Actividad Específica? ¿Por qué se utiliza el reactivo de Biuret? ¿Por qué una enzima se cuantifica en función de su actividad enzimática y no por el peso de la proteína (enzima)? Si en dos preparados biológicos A y B la actividad específica de una determinada enzima es: (en uM/mg.

6 Buffer fosfato 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.Solución de cloruro de sodio al 2 % . INTRODUCCION: En general. pH.0 1. Este patrón general.0 5.0 VI 1.1M pH 9. PH.0 3.0 1.) Solución de almidón al 1 % Buffer acetato 0.05N .1M pH 4. etc).4 2.0 5.4 III 2.0 IV 1.4 2.Ácido clorhídrico 0.0 1. de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros. retardando o i pidiendo m su actividad. Estos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de la reacción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.0 5. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes.0 5.Buffer acetato 0. III.0 1.6 Buffer borato 0.0 5. tomando como ejemplo la hidrólisis enzimática del almidón y evaluando las variaciones del sustrato transformado y de los productos de la reacción enzimática. independientemente del tipo de reacción que catalizan.0 V 1.0 . todas las enzimas.1M pH 4.4 1. II.0 5. como se comprenderá.14 PRACTICA N° 05 FACTORES FÍSICOS-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS PARTE I: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMAS. Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo.0 VII 1. temperatura. IONES INORGÁNICOS I. varia en forma característica para cada enzima en particular. concentración de enzima.25 % . La finalidad de este experimento es observar el efecto de iones activadores. presentan características comunes en cuanto a los factores que intervienen favoreciendo.0 1.Solución cúprico alcalina.4 2.4 2. iones.1M pH 9. REACTIVOS A UTILIZAR .Solución yodada (yoduro de potasio + yodato de potasio) .0 Solución de ClNa al 2 % Agua destilada I 1. tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática.0 1.0 5. concentración de enzima.6 . sobre la serie infinita de enzimas que se conoce.Buffer fosfato 0. .0 1. pH.1M pH 6.6 . TIEMPO TEMPERATURA. concentración de sustrato.Amilasa salival dializada al 0.Buffer borato 0.Solución de almidón al 1 % .4 2.6 II 1. concentración de sustrato.4 VIII 1.1M pH 6.Solución fosfomolíbdica.4 2.0 .0 5.

5 5.5 5.5 5. 0.Mezclar y colocar los tubos: del I al VII al baño de agua a 37 °C.El control del sustrato no transformado se realiza por la reacción del yodo.5 5. sin color) en el cuadro final. para el equilibrio de la temperatura.6 (Computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo) y Mezclar y continuar la incubación por 20 minutos.0 0. Cumplido los 8 minutos sacar los tubos y enfriar con agua corriente y AGREGAR: . azul claro.Agregar el preparado enzimático a los tubos: II al VIII.0 0.El Control de los productos formados se hará en base a la capacidad reductora de estos (glucosa.0 0. por cinco minutos.5 cada uno de los tubos HCl 0.5 0.0 II 0.0 ml. TUBOS V 1.6 VII 0. . 1.0 ml. agregando a cada tubo marcado. valorando los cambios de coloración (azul oscuro.5 5. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.Realizar controles de la actividad enzimática.15 . y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS .5 Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de los tubos. de acuerdo a los sistemas que a continuación se presentan: y CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO RESIDUAL . 1. I 0. de la siguiente manera: Cumplidos los 20 minutos de incubación sacar los tubos del baño maría y luego armar una serie paralela de tubos marcados del I al VIII.0 ml.5 5.6 III 0.2 VIII 0. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES III Incubado correspondientemente a los tubos III y V Solución cúprico alcalina 1. maltosa) de la siguiente manera: Esta determinación sólo se hará en los tubos III y V del incubado a los 20 minutos. TUBOS DE ENSAYO COMPONENTES (en ml.) Preparado enzimático (en ml.0 0.5 0.0 0.El tubo VIII mantenerlo en agua helada entre 0 °C y 4 °C durante cinco minutos.5 0. según se indica y tomar el tiempo.0 ml.0 Solución iodada 0.6 VI 0.5 0. Mezclar y poner en baño maría hirviendo por 8 minutos.6 IV 0.5 0. .6 V 0.5 0. del incubado de su correspondiente tubo.0 0.5 ml.5 0.05N 5. .) I II III IV V VI VII VIII Incubado correspondiente de 0.5 5.0 0.

CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA POR E L SUSTRATO RESIDUAL: (cambio de color) A los 20 minutos: I II III IV V VI VII VIII CUADRO PARA LA VALORACIÓN FINAL DE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN ENZIMÁTICA POR LOS PRODUCTOS FORMADOS (cambio de color) A los 20 minutos III V IV. 5.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la concentración de la enzima sobre la velocidad de la reacción enzimática? 5.16 COMPONENTES III Solución fosfomolíbdica Agua destilada TUBOS IV 1.0 ml. ¿Cómo se determina el sustrato residual y los productos finales cuando se usa almidón como sustrato? 3.0 ml. 5. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 4. 1. ¿Cómo puede demostrar el efecto de la presencia de un ión activador sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? . azul claro. CUESTIONARIO: 1.0 ml. ¿Cómo puede demostrar el efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas? 6. Observar y anotar los resultados de las reacciones de cada uno de tubos valorando los cambios de coloración (azul oscuro. ¿Cuáles son los factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas? 2. sin color) en el cuadro final.

075 M Solución de ureasa cristalina en Buffer fosfato 0. Con un incremento ulterior en la concentración de sustrato. de modo que no es tan directamente proporcional a la concentración del sustrato. Sin embargo. Desde el punto de vista operacional la constante de Michaelis (Km). REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato 0. cuando la concentración del sustrato es incrementada.005 M Urea 0. y se dice que la enzima está siendo saturada con su sustrato. debido a que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. la velocidad de reacción siempre es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. la velocidad inicial se incrementa con menor intensidad. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: . Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferentes. A baja concentración de sustrato la velocidad inicial de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato y la reacción es de primer orden con respecto al sustrato. en esta zona la reacción es de orden mixto. La finalidad de la presente práctica es demostrar el efecto de la concentración del sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática y hallar la velocidad máxima y el Km de la reacción.6 Tungstato de sodio al 10 % Ácido sulfúrico 2/3 N III. DETERMINACIÓN DE LA VELOCIDAD MÁXIMA Y KM. la velocidad de la reacción llega a ser esencialmente independiente de la concentración del sustrato y asintóticamente alcanza una velocidad constante.17 REUNION DE LABORATORIO N° 03 PRACTICA N° 06 FACTORES FÍSICO-QUÍMICOS QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS. se define mejor en términos de la concentración de sustrato necesario para obtener una velocidad inicial de reacción igual a la mitad de la velocidad máxima. II. PARTE II: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO. I. INTRODUCCION: En las reacciones no catalizadas.1 M pH 6. En este rango de concentración de sustrato la reacción es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato.1 M pH EDTA 0.

0 1.0 III 1.0 0.0 8.5 V 0.5 III 2.0 0.0 II 1.5 0.5 III 0.0 8.5 VI 0.5 0.5 0.5 0.6 Urea 0.0 - Pre incubar a 37 °C durante cinco minutos Incubar cada uno de los tubos exactamente 15 minutos 37°C ES FUNDAMENTAL: Medir exactamente el tiempo de incubación para cada tubo.5 3. = V¶. V¶ = 4 ml.5 1.  Calcular la velocidad de reacción para cada uno de los sistemas enzimáticos preparados.0 1.5 0.5 II 0. empleando la concentración de amoníaco producido por ml.0 8. Datos: V = 0.5 V 1. ésta debe agregarse con intervalos de 1 a 2 minutos a cada tubo de tal manera que permita un fácil manejo de los mismos al final de cada tiempo.  Encontrar la concentración de amoníaco producido por ml.0 IV 1.0 8.5 IV 1.075 M Ureasa 0.5 MEZCLAR y dejar en reposo por cinco minutos.M.0 2.0 VII 1.5 0.5 VII 0.  Calcular la concentración de sustrato (concentración molar) en cada tubo de incubación empleando la siguiente fórmula: V.0 1.0 8. Luego:  Realizar las lecturas en el espectrofotómtero a 540 nm en cada uno de los tubos.  Hallar la diferencia de cada uno de los tubos.05 % I 3. con respecto al tubo blanco (tubo VII).5 VII 0.18 COMPONENTES Buffer fosfato pH 6.5 0.5 0.0 1.5 IV 0.0 0.5 2.0 8.0 0. . Para ello multiplicar la diferencia anterior por el factor de calibración empleado (1660) = µmoles de NH3 /ml. de cada uno de los siguientes incubados a tubos de ensayo de una segunda serie siguiendo el siguiente esquema: COMPONENTES Del incubado anterior Agua destilada Reactivo de Nessler I 1.0 1.5 0.0 1.5 3. Para ello se medirá el tiempo de incubación inmediatamente después de agregar la enzima.M¶ Ejemplo: Concentración de úrea en el tubo I.5 ml.5 0.5 0.0 8.5 II 2.MEZCLAR Transferir 1ml. Transcurridos los 15 minutos agregar rápidamente: COMPONENTES H2SO4 2/3 N Tungstato de sodio 10% Ureasa .0 V 1.0 1.0 1.0 VI 1.0 I 0.5 VI 0. dividido entre el tiempo de incubación (15 minutos).

aplicar la ecuación de Lineweaver Burk a los resultados obtenidos.5 ml x 0.  Anotar los resultados de cada uno de los tubos (concentración del sustrato y velocidad de la reacción). ¿Qué importancia tien el Km? 5.  Utilizando papel milimetrado.0093 M 4ml. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué establece la ecuación de Micahelis Menten? 3.  Construir una gráfica en el sistema de coordenadas teniendo como parámetros : La concentración del sustrato (abscisa) en función de la velocidad de la reacción (ordenada). En la curva trazada calcular la Km e indicar la Vmax. ¿Cómo afecta la concentración del sustrato la velocidad de la reacción? 2. Construir una gráfica en un sistema de coordenadas teniendo como parámetros la inversa de la concentración del sustrato (1/S) (abscisas) en función de la inversa de la velocidad inicial de la reacción (ordenada).075 M = 0. ¿Para que sirve la ecuación de Lineweaver? 6. ¿Qué es el Km? 4. ¿Qué métodos conoce para determinar el Km? . Calcular en la gráfica obtenida la velocidad máxima y la Km.075 M M¶ = ? M¶ = 0.19 M = 0. IV.

común en sistemas más complejos en el que el inhibidor se une exclusivamente al complejo enzima -sustrato para dar un complejo enzimasustrato-inhibidor incapaz de transformarse en otro producto. Ejemplos de este tipo de inhibición son los causados por el N-etilamida. Excluyéndose de ésta categoría aquellos agentes como los ácidos fuertes. si la enzima continúa inhibida después de la reacción del inhibidor. Por esta razón la unión de este último con la enzima no es afectada por la presencia del inhibidor. el exceso de inhibidor. es otro tipo de inhibición reversible. Respecto de los inhibidores reversibles es importante destacar que la interacción entre inhibidor y enzima se traduce en varios tipos de inhibición perfectamente diferenciados experimentalmente. y la enzima recupera su actividad original. Experimentalmente se puede identificar si un inhibidor cualquiera es o no competitivo. Estas sustancias se conocen como los inhibidores enzimáticos. Un ejemplo clásico. si el sistema deshidrogenasa succínica+succinato. . que es cataliticamente inactivo y no puede escindirse en productos de la reacción y complejo-enzima-inhibidor. de este tipo de inhibición es el que presenta la succinato deshidrogenasa que tiene como sustrato el succinato y puede ser inhibido por sustancias estructuralmente parecidas a dicho ácido como son el malato. Si la inhibición no se revierte al agregar sustrato (succinato). alcoholes y calor que producen alteraciones en la estructura espacial de la molécula proteica que conduce a la desnaturalización. se agrega malonato como inhibidor. Los inhibidores enzimáticos se clasifican en reversibles e irreversibles. De allí el nombre de competitivo. Por ejemplo. a las que se pueden agregar las inhibiciones reversibles acompetitivas.20 REUNION DE LABORATORIO N° 04 PRACTICA N° 07 ACCION DE LOS INHIBIDORES COMPETITIVOS Y NO COMPETITIVOS SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA I. los cuale enlazan iones metálicos necesarios para la actividad enzimática. cloruro de mercurio. entonces la inhibición será de tipo no competitiva. Los dos tipos más comunes son: las inhibiciones reversibles competitivas y las inhibiciones reversibles no competitivas. El inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en el sitio por el cual se debería unir el sustrato impidiendo por lo tanto la formación del complejo activoenzima-sustrato. Si después de hacer actuar el inhidor sobre la enzima. Quedando por demostrar si este tipo de inhibición es reversible o no. se dice que el inhibidor es reversible. ácido oxálico y glutarato. se dice que el inhibidor es irreversible. EDTA. pudiéndose formar entonces un complejo ternario enzima-sustrato-inhibidor. inhiben metaloenzimas por enlazarse al ión metálico. Aquí el inhibidor se une a la enzima en otro sitio que no es aquel por el cual se une al sustrato. que se pueden distinguir en base a un criterio experimental. La inhibición no competitiva se caracteriza por que no puede ser revertida por un aumento de la concentración del sustrato ya que este último no puede desplazar al inhibidor unido a la enzima. Si el efecto inhibidor se revierte al incrementar la concentración del sustrato (succinato) entonces se podrá afirmar que el inhibidor es de tipo competitivo. La inhibición acompetitiva. En la inhibición competitiva se dice que un inhibidor obra por competencia si su acción inhibidora se revierte al aumentar la concentración de sustrato. A la inversa. por que efectivamente tanto el inhibidor como el sustrato compiten por el mismo sitio y tratan de desplazarse mutuamente de la enzima. INTRODUCCION: Existen sustancias cuya acción sobre una enzima es la disminución de su actividad. NO y CO. eliminamos por algún método.

2 .0 1. ¿Por qué el cloruro de mercurio es inhibidor no competitivo? 3.1 M . que el malonato es un inhibidor competitivo y que el cloruro mercúrico es un inhibidor no competitivo. II 0.0 1.2 Succinato de sodio 0.3 0.0 Dejar en reposo por 30 minutos a la temperatura ambiente.0 1.2 Anotar y luego agregar a los tubos II.5 M Buffer fosfato 0. ¿Por qué el malonato es inhibidor competitivo? 2. II.1 M 2 ± 6 diclorofenolindofenol Homogenizado 10 % I 2.0 0. CUESTIONARIO: 1. Observar los resultados en cada uno de los tubos (cambio de color).0 1. COMPONENTES Succinato de sodio 0.1 M.0 V 1.5 1.2 0.5 M .2 0.8 0.0 III 1.0 IV 1.5 III 0.2 ± 6 Diclorofenolindofenol .Succinato de sodio 0.0 1.Buffer fosfato 0. IV.5 0.1 M . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.Malonato de sodio 0.1M pH 7.Succinato de sodio 0.0 1.Homogenizado hepático 10 % III. pH 7.0 II 1.1 M Succinato de sodio 0. Dejar en reposo 15 minutos a la temperatura ambiente y luego observar los resultados y anotar. REACTIVOS A UTILIZAR .3 0.5 - IV.5 IV 0.Cloruro de mercurio .5 M Cloruro de mercurio 0. ¿Cómo podría usted demostrar que la inhibición producida por el cloruro mercúrico es o no reversible? .21 La siguiente práctica tiene por finalidad demostrar en el sistema enzimático Deshidrogenasa succínica+succinato: que el malonato y el cloruro mercúrico producen inhibición de este sistema. III.5 1.5 1.1 M Malonato de sodio 0.1M pH 7.2 1.

¿Qué diferencias puede usted establecer entre la inhibición competitiva y la inhibición alostérica? 7. sin considerar el cloruro de mercurio. Señale por lo menos tres ejemplos de sustancias que pueden producir inhibición no competitiva reversible. De usted por lo menos dos ejemplos de sustancias que producen inhibición competitiva en el sistema Deshidrogenasa succínica ± succinato. 6. 5.22 4. además del malonato utilizado en el presente experimento. . De por los menos dos semejanzas entre la inhibición no competitiva reversible e inhibición alostérica.

mediante el uso de indicadores conocidos como 2 ± 6 diclorofenolindofenol y p ± fenilendiamina. ésta cede sus electrones a los indicadores entre la FMN y la CoQ. que al reducirse (recibir electrones) se decoloran. A estos se les denomina inhibidores del sitio III. así por ejemplo el 26 diclorofenolindofenol y el azul de metileno son sustancias indicadoras de color azul en estado oxidado. es decir que es capaz de ceder electrones. es otro indicador que actúa como sustrato. Existen diversas sustancias que actúan como inhibidores de la cadena respiratoria. es o no permeable al flujo de electrones que provienen del indicador. actúan en las regiones cercanas al sitio I. Inhibidores de localización son: el amital. Este sistema está localizado en la membrana mitocondrial interna y se caracteriza por la cohesión física con la cual sus componentes se encuentran unidos entre si e integrados en la membrana. inclusive de la cadena (región que incluye el sitio I). Los inhibidores más comúnmente usados pueden reunirse en tres grupos principales según el sitio de la cadena respiratoria donde actúan. la azida. entonces podemos deducir que el inhibidor actúa en algún sitio anterior al citocromo o de la cadena. etc.23 PRACTICA N° 08 EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA DE ÓXIDO-REDUCCIÓN I. Si al administrar un inhibidor de la cadena. . Por su acción cercana en el primer sitio de la desfosforilación se les suele denominar inhibidores del sitio I. el BAL y barbiturato de sódio. respectivamente. átomos de hidrógeno o electrones. Cuando se oxida (cede electrones) cambia de color (a marrón oscuro). pero si el indicador se decolora. la p-fenilendiamina no se oxidará (no cambia de color). quiere decir que dicho inhibidor estará actuando en alguna región anterior a la FMN. el citocromo C actuará como primer aceptor de electrones que provienen de la p-fenilendiamina. sitio II y sitio III. etc. Si el inhibidor no impide la oxidación del indicador. La p-fenilendiamina. el monóxido de carbono. La presente práctica tiene por finalidad demostrar que los inhibidores: rotenona. Como hay flujo de electrones en la cadena. De esta manera se puede verificar si la cadena comprendida entre el citocromo C y el oxígeno. INTRODUCCION: Los equivalentes de reducción. En la cadena REDOX. denominación que pone énfasis en que las oxidaciones reducciones son fenómenos caracterizados por la pérdida o ganancia de electrones. entonces podemos deducir que el mencionado inhibidor actuará en algún sitio comprendido entre la CoQ y el citocromo B inclusive (cercano al sitio II de la cadena). El ejemplo clásico de este grupo es la antimicina. entonces podemos deducir que el sitio de inhibición estará en alguín sitio posterior a la CoQ inclusive. se les denomina inhibidores del sitio II. Este mismo sistema multienzimático es también conocido como cadena de transporte de electrones. Los más representativos de este grupo son la rotenona y la piericidina. algunos anestésicos volátiles como el halotano. barbital sódico y azida de sodio. Para poder determinar la permeabilidad de la cadena de oxidoreducción al paso o no de electrones. éste impide que el 2-6 diclorofenolindofenol se reduzca (se decolore). los detergentes. Si se administra un inhibidor que impide el flujo de electrones en algún punto de esta porción de la cadena. inhibidores similares son la hidroxiquinolina N-óxido. se utilizan sustancias indicadoras artificiales que cambian de color cuando se oxidan o se reducen. Un grupo de inhibidores actúa sobre el Hemo a3 de la citocromo oxidasa impidiendo su interacción con el oxígeno. bloqueando el transporte de electrones entre la flavina y la ubiquinona. comprenden el cianuro. los esteroides. Si se administra un inhibidor que no impide la oxidación de la p-fenilendiamina y que tampoco impide la reducción del 2-6 diclorofenolindofenol. Un primer grupo de inhibidores actúa sobre la NADH-deshidrogenasa. provenientes de la deshidrogenación de los sustratos del ciclo de Krebbs y otros metabolitos son transferidos al oxígeno por un sistema multienzimático denominado cadena respiratoria. Un segundo grupo de sustancias actúan bloqueando la transf rencia de electrones e entre los citocromos b y c.

5 0.5 VI 0.5 0.5 0.1M pH 7.1M. barbital sódico y azida de sodio.5 0.5 0.0 0.5 III 1. dejar en 10% ambiente por 20 0.5 1. En el sistema p±fenilendiamina + cadena rédox mitocondrial.5 0.4 2.5 0.5 1.5 II 1.5 V 0.0 V 1. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0.2 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) En el sistema Deshidrogenasa málica + malato + cadena rédox mitocondrial.2 1. ARMAR EL SIGUIENTE SISTEMA: TUBOS COMPONENTES (en ml.5 Mezclar. pH: 7.2 0.2 0.1M P±fenilendiamina 1% Homogenizado de mitocondrias Mezclar.02 % Malato 0.5 0.) Buffer fosfato 0.5 0.5 0.5 0. verificar el efecto de los inhibidores rotenona.1M Rotenona 0.0 0.0 IV 1.24 II.5 1.5 0.5 0.) Buffer fosfato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio 0.1M Barbiturato de sodio Azida de sodio Homogenizado mitocondrial 10% I 1.0 .5 reposo a temperatura minutos.0 0. TUBOS COMPONENTES (en ml. 6-diclorofenol indofenol 0.6-diclorofenolindofenol 0.4 Azida de sodio Barbiturato de sodio 0.0 0. verificar el efecto de los inhibidores: rotenona.2 0.02 % p-fenilendiamina 1% Malato de sodio 0.5 1.1M Rotenona 0.5 IV 0. Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). barbital sódico y azida de sodio.0 0.0 II 1.0 0.1M pH 7.1M Rotenona 0. I 2. dejar en reposo a temperatura ambiente por 20 minutos.4 2.5 0.0 1.2 III 1.1M Azida de sodio Fracción mitocondrial 10% (hígado de rata) III.

Grafique usted en una cadena de óxido reducción biológica. la acción de los inhibidores e indicadores utilizados en el experimento. ¿Si utiliza el indicador rédox 2. ¿Si utiliza el indicador p±fenilendiamina en un sistema con cadena respiratoria. barbiturato de sodio y azida de sodio? 3. Indique usted los sustratos y enzimas que intervienen en los sistemas realizados en la práctica. .25 Observar y anotar los resultados (cambios de color en cada uno de los tubos). IV. que cambios observaría con la rotenona. que cambios observaría con la rotenona. barbiturato de sodio y azida de sodio? 4. 5. CUESTIONARIO: 1.6-diclorofenolindofenol en un sistema con cadena respiratoria. ¿Qué inhibidores de la cadena de óxido reducción conoce y a qué nivel actúan? 2.

hallándolas de modo fundamental en una subestructura celular en donde la energía derivada de las oxidaciones es "capturada" en la forma del intermediario macroérgico ATP. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) Fraccionamiento Celular Cada grupo recibirá una rata albina (Rattus rattus var.154 M III. Las enzimas de óxido . INTRODUCCION: Los carbohidratos.reducción usando los indicadores redox 2 .1M p±fenilendiamina 1% Homogenizado total de hígado de rata en sucrosa 0. aminoácidos y algunas otras sustancias sufren oxidaciones en el organismo mediante sistemas enzimáticos simples o complejos.25 M Fracción nuclear del homogenizado. El animal será sacrificado. previa calibración en la balanza. Se coloca el hígado en un petri se elimina la cápsula del hígado y otros tejidos periféricos. El sobrenadante anterior es centrifugado a 15000 revoluciones por 15 minutos en la centrífuga refrigerada.154 M. grupos prostéticos y átomos metálicos. albicans). Se hace presión manualmente con el embolo girando hacia el fondo. De acuerdo a su estructura y función. El sedimento se separa en otro beaker y constituye la fracción mitocondrial. Homogenizado al 10%: se pesa 10gr de hígado y se corta en fragmentos pequeños y se coloca en el homogenizador potter y se le agrega solución de KCl 0. KCl 0. inmediatamente se hara un corte longitudinal en el abdomen procediendo a extraer el hígado. las enzimas que intervienen en estos pr cesos se encuentran o clasificadas en diversos grupos y tienen denominaciones particulares dentro de la literatura enzimológica. constituyendo la fracción microsomal con el citosol. Se separa el sobrenadante en un beaker. El sedimento constituye la fracción nuclear y se coloca en un beaker de 100ml.6 diclorofenilindofenol y p . Todo debe trabajarse entre 0 y 4ºC.reducción tienen una distribución característica intracelularmente. El sobrenadante es separado en un beaker de 500ml.fenilendiamina y los componentes celulares de un homogeneizado de hígado de rata obtenidos por centrifugación dif rencial mediante el método de e Schreider y col.4 2. fosfolípidos. II. Fracción mitocondrial del homogenizado. REACTIVOS A UTILIZAR Buffer fosfato de sodio 0. - - .02 % Succinato 0. El homogenizado es centrifugado a 800 revoluciones por 10 minutos colocándolo en tubos de polietileno. La finalidad del presente trabajo es objetivizar la distribución intracelular de las enzimas de óxido . se emplea una centrífuga refrigerada.6-diclorofenolindofenol 0.1M pH: 7. Fracción microsomal soluble del homogenizado. Estos sistemas están constituidos por proteínas.26 PRACTICA N° 09 DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDOREDUCCIÓN I. ácidos grasos.

4 2 ± 6 diclorofenolindofenol Succinato de sodio 0.2 0.6-diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respiratoria? 2.1M Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal -soluble Homogenizado total I 1.5 0.5 1 1.5 1. pH 7.5 IV 0.5 0.0 0.0 0.0 0.5 2 1.0 0. pH 7. para interpretar los resultados.0 0.5 1.1M.4 P ± fenilendiamina 1% (sustrato + indicador) Fracción nuclear Fracción mitocondrial Fracción microsomal ±soluble Homogenizado total 0.6 diclorofenolindofenol y p±fenilendiamina. Armar otro sistema.5 3 1.5 Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. ¿En que fracciones celulares se encuentran las enzimas de óxido ± reducción? 6.5 III 0. ¿Qué es el 2.0 0. Grafique usted en una cadena de óxido ± reducción biológica la acción de los indicadores rédox 2.0 0.0 0.2 0.27 Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Buffer fosfato 0. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador.5 V 0.0 1.0 0. ¿Qué es el p-fenilendiamina y cómo actúa en la cadena respiratoria? 3. Observar constantemente y anotar los cambios de color del indicador. IV.5 - Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente.2 II 0. ¿Qué es un homogenizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial? 5. 4. empleando: COMPONENTES Buffer fosfato 0. Haga un esquema de la centrifugación diferencial .2 0. para interpretar los resultados.5 1.5 1.5 5 1.1M. CUESTIONARIO: 1.5 0.5 4 1.2 0.5 0.

en el que la cantidad de almidón y tiempo de incubación son ajustados de manera que sólo una porción de almidón es hidrolizado cuando la reacci n ó es parada por la adición de yodo. El origen de la amilasa sérica humana incluye al páncreas y glándulas salivales. La amilasa es un poliglucósido de configuración lineal de unidades de glucosa unidos por enlace alfa 1-4 glucosídicos. Muy raramente permanece elevada 4-6 días. cirrosis. También ha sido informado en leche y en el semen humano. obstrucción intestinal. En la bilis no hay actividad. edema y pancreatitis están presentes indudablemente. después de colangiografía. Para la determinación de amilasa usamos el método de Caraway. en pacientes con insuficiencias pancreática. con frecuencia 2-3 días después. Si liberan alfa o beta maltosa. Si dentro de 24 horas no se eleva. Ambas. Bajos niveles pueden encontrarse en pancreatitia crónica y en carcinoma pancreático cuando el daño es extenso y hay insuficiencia de las acinos glandulares. En otros. Se ha reportado incremento después de la ingestión de alcohol. mide la cantidad de almidón hidrolizado y por ende la actividad de amilasa de la muestra. morfina. La diferencia entre la cantidad de color azul formado en la muestra incubada y el blanco incubado por la adición de suero después de la incubación. después de la administración secretina. En obstrucción de los conductos puede elevarse. peritonitis. La amilasa puede ser detectada en niños desde 1 a 2 meses de edad y los valores son más bajos que en el adulto normal. trombosis mesentérica. En los casos señalados se ha propuesto la prueba funcional de la amilasa sérica después de la administración de secretina y morfina. no es probable el diagnóstico de pancreatitis aguda. En el suero humano. se les clasifica en alfa y beta amilasa. las cuales explicarían probablemente menos del 25% de la actividad sérica normal. pero al año de edad la actividad es igual a la del adulto. así como en la orina existe actividad amilásica. Para la mayor parte. En normales. amilasa y amilopectina producen sólo B-glucosa por hidrólisis. La amilasa comprende a sólo el 20% del almidón y es soluble en agua.28 PRACTICA N° 10 DETERMINACION DE AMILASA SERICA I. después de ruptura esplénica. La elevación puede ocurrir en otras condiciones que incluyen enfermedad de las glándulas salivales (pancreatitis). Es posible encontrar valores más altos. El presente experimento tiene por finalidad determinar la amilasa sérica en personas normales y/o con alteraciones patológicas especialmente del pancreas. Entre 2 ± 12 horas después de producida la pancreatitis aguda. uremia después de la administración de codeína. La alfa amilasa actúa rompiendo los enlaces alfa 1-4 glucosídicos en la parte central de la amilasa formando una mixtura de pequeñas dextrinas + maltosa. En algunas de estas condiciones. trompa de Falopio y tejido adiposo. enfermedad séptica aguda del coledoco. Los valores normales de amilasa por el método de Caraway calibrado en unidades Somogy es de 60 a 180. la explicación no es clara. el resto es una fracción inosoluble llamada amilopectina. diuréticos tiazídicos. encefalitis viral. La amilasa salival y pancreática humana esta dentro del grupo de las primeras. INTRODUCCION: La amilasa es una enzima que hidroliza el almidón. las elevaciones son (con excepción de los niveles obtenidos después de la administración de opiáceos) menos de 500 unidades. Después de la administración de morfina en normales se incrementa la amilasa sérica. En pancreatitis se llega hasta 2000 a 3000 unidades. la amilasa se encuentra grandemente incrementada y retorna a los valores normales lentamente. difiere de la amilasa porque contiene además enlaces alfa 1-6 glucosídicos frecuentemente ramificados. músculo estriado. Otras fuentes incluyen el hígado. carcinoma bronconígeno y en neumonía. . úlcera duodenal o gástrica penetrante o perforada. la amilisa sérica se altera.

en función de la actividad enzimática? ¿Cómo explica usted el diferente comportamiento de la amilasa hepática y pancreática sometidas a electroforesis? ¿Por qué la concentración de amilasa sérica es menor durante los primeros meses de vida lactante? . 35 ml.0 ml.1 ml. 2. pH 7. 0. II BLANCO 5.1 ml.0 ml. Leer 660 nm. 5. Mezclar bien.0 : y Solución Stock de iodo : y Solución iodada de trabajo: III.29 II. 3. en CÁLCULO Absorbancia del _ Absorbancia del blanco problema _______________________________________ X Absorbancia del blanco 5.0 ml. CUESTIONARIO: 1. IV. 35 ml.0 ml.5 minutos exactamente 800 = Unidades de amilada por 100 ml (Se requiere un blanco por cada muestra de suero. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): Armar el siguiente sistema: (Utilizar dos frascos volumétricos ± Erlenmeyer de 50 ml. De qué manera el ión cloruro activa a la amilasa ¿Qué semejanza o diferencia puede establecer usted entre amilasa dializada y no dializada. 0. 5.) I PROBLEMA Sustrato de almidón Bufferado Retirar los frascos y agregar suero Retirar los frascos y agregar suero Agua destilada Solución iodada de trabajo. REACTIVOS A UTILIZAR: y Sustrato de almidón Bufferado. 4. espectrofotómetro a Incubar a 37°C durante cinco minutos ambos frascos Mezclar e incubar a 37°C durante 7. debido a que las proteínas séricas disminuyen la cantidad de color producido por el complejo yodo ± almidón y este podría ser diferente).

30 .

hay gasto de glucosa cuando es removida de los tejidos periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina. sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. se llama cotransporte. y depende de su funcionamiento de que exista una alta concentración de sodio en fluído extracelular. Este es un caso interesante en que un sistema de transporte a través de la membrana favorecería a otro. En el caso del hígado.31 II UNIDAD METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS REUNION DE LABORATORIO N° 05 PRACTICA N° 11 DEMOSTRACION DE LA DIGESTION Y ABSORCION DE LOS CARBOHIDRATOS: GLICEMIA PRE Y POST-PRANDIAL. por la bomba de sodio y potasio. Según el método l de Folin Wu. Este mecanismo requiere ATP como fuente de energía. el organismo dispone de una compleja maquinaria metabólica que permite asegurar la constancia de la concentración de glucosa en la sangre y. al salir del Na+ mantenga alta concentración en el líquido extracelular. Por otra parte. el corazón y el músculo esquelético. por ello. Varía entre los 80 ± 120 mg%. En el cerebro y los glóbulos rojos es la única fuente de energía. El mecanismo por el cual ocurre este pasaje activo de la glucosa a través de las células de la mucosa intestinal no es muy conocido. contribuyen a mantener constante la concentración de glucosa en sangre. la constante disponibilidad de este sustrato a los tejidos. volvería a salir de la célula. en particular en el tejido adiposo. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea es una de las fuentes de energía más importantes en el organismo y en algunos tejidos altamente especializados. A su vez. siendo el hepatocito permeable para este metabolito. En este caso la glucosa entra en la célula. Este proceso. La entrada de la glucosa en estas células está supeditada a que. El conocimiento de la glicemia es importante no sólo porque permite tener una idea integral del mecanismo de homeostasis metabólica existente. En casi todos los demás tejidos la glucosa no puede penetrar en el interior de las células por simple difusión. el transporte de glucosa al interior de las células es por difusión pasiva. el sodio. sino que lo hace por un mecanismo de difusión controlada. Se cree que está íntimamente ligado al transporte de sodio. I. por lo tanto la concentración de glucosa en sangre depende del balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo. Diversos factores que inciden sobre la absorción. con ella. que proviene del hígado por glucogenólisis. . Por todo esto. La glucosa en sangre. y de origen endógeno. Los valores normales de glucosa en sangre son variables de acuerdo al método utiizado. producción endógena de glucosa así como la utilización y excreción de la misma. posiblemente porque se une a la misma proteína transportadora que lleva el sodio. proviene de dos orígenes: de origen exógeno de los alimentos. con el método de la glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 ± 110 mg/dl.

II. Separar el suero.GOD/POD: Solución de glucosa oxidasa (1. Mezclar por inversión sin agitar. Agregar 3 partes de enzimas GOD/POD previamente homogenizadas. .000 partes con agua destilada. después de la ingesta alimenticia. de sangre de la flexura del codo. Dpre. Rotular y fechar. se extraerán 5 ml. luego se centrifuga a 3000 RPM por 10 minutos. Colocar las muestras en tubos de ensayo. con jeringa hipodérmica de 10 ml.AF. Utilizar 4 tubos de ensayo: B (Blanco). tanto en personas normales como en casos patológicos. Antes de multiplicar D x f. . REACTIVOS A UTILIZAR . III.00 g/l f = ----------- S y D = Dpre. 50 partes de Reactivo 4. cuál es el rango considerado normal para la glicemia basal? Explique las variaciones en los valores. La determinación de la glicemia se realizará por el método Enzimático de la glucosa oxidasa.Reactivo 4. 50 partes de Reactivo Fenol y llevar a 1. .Preparación del Reactivo de trabajo: 500 partes de agua destilada. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES : Se tomarán dos muestras de sangre : La primera: La persona debe mantener de 4 a 8 horas de ayuno al momento de obtener la muestra. que usted puede encontrar por ejemplo en una intolerancia a la glucosa. ----20 ul ----2 ml Dpost.000 U/ml) y Peróxidasa (120 U/ml). Restar a D el Blanco (B) y el resultado se multiplica por f.AF: Solución de 4 ± aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0. --------20 ul 2 ml Incubar todos los tubos 10 minutos en baño de agua a 37 ºC Leer en Espectrofotómetro a 505 nm llevando el aparato a cero con el blanco. La segunda: Esta muestra se tomará después de una hora. (Desconocido preprandial) y Dpost. CUESTIONARIO: 1.32 La finalidad de la siguiente práctica es demostrar la digestión y absorción de la glucosa. cuantificando la glicemia pre y postprandial. En esos momentos. ¿Actualmente. . y Dpost. (Desconocido post prandial). como máximo. y con aguja N° 20. IV. colocar: COMPONENTES Standard Muestra (suero preprandial) Muestra (suero postprandial) Reactivo de trabajo B ------------2 ml S 20 ul --------2 ml Dpre. por el método de Glucosa oxidasa. S (Standard).92 mol/l.Reactivo Fenol: Solución de Fenol 55 mmol/l. se deja reposar 10 minutos.Estándar: Solución de glucosa 1 g/l . Cálculo de los resultados : Glucosa (g/l) = D x f donde 1.

glucógeno sintetasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación.Na2S04 solución saturada.4 y alfa 1.5 .Homogenizado de hígado de rata al 10 % (pesar 10 g. .4 y las ramificaciones se forman por enlaces glucosidicos alfa 1. . INTRODUCCION: El glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos los que contienen las enzimas glucógeno fosforilasa.Alcohol absoluto. . 3. para el diagnóstico de diabetes mellitus? 5.5 --II --0. EXTRACCION DE GLUCOGENO HEPATICO (Procedimiento) Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Homogenizado de hígado en ayunas Homogenizado de hígado post prandial I 0. lugares principales de almacenamiento. ¿Cuál son los criterios bioquímicos. ¿Cómo esperaría encontrar los valores de la glicemia dosada en la sangre venosa y en la sangre arterial? Fundamente las variaciones que se pueden encontrar. ¿Conoce otros métodos para determinar la glicemia? Explique su fundamento 4. En el hígado el glucógeno se incrementa después de la ingesta de alimentos (período post prandial) llegando a los límites máximos cuando la dieta es abundante y/o en base a carbohidratos. pero las concentraciones varían en los diferentes tejidos correspondiendo las concentraciones más altas del hígado y al músculo esquelético. El glucógeno es también fácilmente hidrolizable por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente. El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de hidróxido de potasio caliente en los cuales los enlaces no reductores alfa 1.Fenol al 80 % . En cambio el glucógeno post prandial es debido a que la glucogénesis se incrementa cuando las concentraciones en sangre alcanzan valores de 150 mg/100 ml ó más.6 los cuales se presentan con frecuencia aproximada de uno por cada 10 residuos. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento.33 2. REACTIVOS A UTILIZAR . La finalidad de la siguiente práctica es cuantificar el glucógeno en ayunas y después de la uingesta de alimentos y evaluar los valores encontrados relacionados con los factores que determinan sus síntesis y degradación II.6 son estables. La mayoría de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1. La acción de la beta amilasa también rinde una dextrina límite. de hígado y homogenizar con agua destilada. ¿Qué variaciones fisiológicas de glicemia puede usted señalar? PRACTICA N° 12 INFLUENCIA DE LA DIETA EN LA FORMACIÓN Y ALMACENAMIENTO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO I.KOH al 60 % . El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa de fácil disponibilidad. relacionados con la glicemia. Se encuentra glucógeno o se puede sintetizar en cualquier célula del organismo.) III.H2S04 concentrado.

CUANTIFICACION POR METODO COLORIMETRO DEL GLUCOGENO EXTRAIDO Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml)) I II BLANCO Muestra del tubo I del Sistema anterior««««««« 1.1 0. Colocar los tubos en agua helada durante 5 min.0 Fenol al 80 % 0. .34 KOH al 60 % 0. 2. CUESTIONARIO: 1. Eliminar el sobrenadante y colocar boca a bajo los tubos sobre papel de filtro por 5 minutos.0 1. y sin retirar los tubos del baño helado: Agregar H2S04 cc.1 Mezclar.5 0. Reposo por una hora. Leer en el fotocolorímetro con filtro verde.0 5. Centrifugar a 3500 RPM por 10 min.1 0. gota a gotaen el centro de c/tubo 5.0 5. Agregar agua destilada 5. Explique los mecanismos que regulan la homeostasis de la glucosa y el rol del glucógeno durante el ayuno prolongado.1 0.0 -Agua destilada 1.0 Disolver el precipitado por agitación.0 --Muestra del tubo II.1 Mezclar.0 Na 2SO4 solución saturada. ¿Qué relaciones metabólicas puede usted establecer entre los valores de glucógeno obtenidos en ambas muestras de hígado de rata. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones de ayuno? Dé usted las razones metabólicas que expliquen su resultado. CALCULOS: Factor Espectrofotómetro = 7 g % de glucógeno = (Lec. ¿Cómo espera encontrar las concentraciones de glucógeno en la muestra de hígado de rata en condiciones post prandial? 3.0 5.I ± Lect. 0. del Sistema anterior« -1. 540 n m. motivo del experimento? 4.5 Calentar los tubos en baño maría a 100 C por 10 min.0 5. ¿Porqué mecanismo metabólico el glucógeno incrementa cuando la concentración de glucosa en sangre es mayor de 150 mg/dl? 5. Alcohol al 98 % 5.0 2. Blanco) x Factor IV.0 Mezclar y dejar en el baño de agua helada durante 5 minutos más.

en ayunas. . El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el de un nivel sanguíneo de glucosa elevado (hiperglicemia). La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos.Solución de insulina cristalizada (Lilly): I Unidad por ml. La insulina también favorece la conversión de los hidratos de carbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogénesis a partir de los aminoácidos. lipogénesis y otras semejantes. de peso corporal sometidos a ayuno de 8 horas. Los mecanismos reguladores de la concentración de glucosa son nerviosos y endocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediante modificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna. otros carbohidratos y de glucosa absorbida por el intestino. En condiciones normales. La secreción de insulina parece estar condicionada en forma importante por el nivel de glicemia. una excesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel de glucógeno en el hígado. pues es utilizada por todas las células para producir energía y por algunas células para funciones más especializadas por ejemplo glucogénesis. . La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento rico en hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora y media o dos horas después de la ingestión vuelve al nivel de ayunas. REACTIVOS A UTILIZAR . La administración de insulina va seguida de la glicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada.35 REUNION DE LABORATORIO N° 06 PRACTICA N° 13 REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA ACCION DE LA HORMONA INSULINA I. . se produce más insulina que tiende a aminorarla.Glucómetro.Conejos adultos de más de 2 kg. La insulina ejerce efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otros nutrientes. . aminoácidos. cuya sensibilidad está regida en medida importante por el balance entre la insulina por un lado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipófisis por el otro. a la vez que acelera la oxidación de glucosa en diferentes tejidos.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. INTRODUCCION: La glucosa sanguínea proviene de: glucógeno hepático. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de administración de insulina. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas y es secretado en respuesta directa al incremento de glucosa en la sangre. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemia que es el signo fundamental del cuadro denominado Diabetes. II. de manera que cada vez se eleva la glicemia. Siendo en la sangre arterial mayor que en la venosa. de modo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende del equilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea. la glicemia es muy constante. el efecto se debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno en el hígado y en el músculo.

Explique brevemente la regulación de la glicemia.  Luego extraer muestras de sangre a los 15 . .36 III. EXTRACCION DE LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE INSULINA. Explique el mecanismo de acción de la insulina en la homeostasis de la glucosa. Explique cómo y porqué se producen los signos y síntomas del cuadro clínico de hipoglicemia. La que servirá para establecer los valores basales de glicemia. en términos generales. Dosis de la solución de insulina cristalina (I Unidad por ml) inyectar I Unidad por Kilogramo de peso corporal. 4.  Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de insulina. Anotar los resultados en relación al tiempo. 2.  Extraer una primera muestra de sangre del pabellón auricular del conejo. lo que hace un total de tres muestras en una hora. y y Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. CUESTIONARIO: 1. Utilizar una jeringa hipodérmica de 1 ml. 30 y 60 minutos después de inyectada la insulina. Hacer una gráfica de glicemia vs tiempo       IV. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. 3. que facilita la medida de la dosis. de la tasa de llegada e índice de salida de la glucosa de la sangre. ¿Cuáles son las hormonas contrarreguladoras y su mecanismo de acción? 5. como resultado. Explique la naturaleza química y las acciones biológicas de la insulina.

. lo que hace un total de tres muestras en una hora.Jeringas hipodérmicas de 1 cc. Con cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa según el método de Glucocinta 5. Extraer una primera muestra de sangre. 3. hormona secretada por la médula suprarrenal.  Dosis de la solución de adrenalina (0. por la ausencia en este de la glucosa 6.25 ml de la solución a utilizar por kg de peso. .025 mg por cada kilogramo de peso corporal que corresponde a 0.37 ACCION DE LA HORMONA ADRENALINA I. Inyectar por vía intraperitoneal la cantidad calculada de adrenalina según el peso del animal. con especial referencia al metabolismo de los carbohidratos. ¿Cuál es el mecanismo de acción hormonal de la adrenalina a nivel de sus órganos blanco? Explique de manera suscinta el efecto de la adrenalina sobre la glicemia. Servirá para establecer los valores basales de glicemia. REACTIVOS A UTILIZAR . 4. sometidos a ayuno de 8 a 12 horas. 2.1 mg por ml. Explique la naturaleza química y las acciones fisiológicas de la adrenalina. 2. Utilizar una jeringa hipodérmica de tuberculina que facilita la medida de la dosis. LAS MUESTRAS DE SANGRE Y ADMINISTRACION DE 1. tomando las variaciones en relación al tiempo. ¿Cuál es el efecto metabólico de la adrenalina sobre el hígado y sobre el tejido muscular y que efecto produce sobre la glicemia? . .Glucómetro. Con los resultados así obtenidos. Anotar los resultados en relación al tiempo. EXTRACCION DE ADRENALINA. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activa a la fosforilasa.Conejos adultos de más de 2 kg de peso corporal. 30 y 60 minutos después de inyectada la adrenalina.Solución de adrenalina 0. INTRODUCCION: La adrenalina. II. tiene acción hiperglicemiante.1 mg/ml) inyectar 0.fosfatasa. si l aparece hipoglicemia se segrega más adrenalina y glucagón que aceleran la regulación que espontáneamente debe realizar el hígado. del pabellón auricular del conejo. ello se debe a que favorece la conversión del glucógeno en glucosa (glucogenólisis) en el hígado. CUESTIONARIO: 1. Luego extraer muestras de sangre a los 15 . III. construir una gráfica. ACTIVIDADES INTRUCCIONALES: Procedimiento  Determinar con exactitud el peso de los conejos sometidos a ayuno con la finalidad de calcular la cantidad de adrenalina a inyectar. 3. ¡ ¡ ¡ IV. la glucogenólisis se realiza con la formación de lactato el que va ha contribuir directamente a la formación de glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismos gluconeogenéticos. además de actuar en el músculo. 4. La finalidad de este experimento es dosar la glucosa en sangre para determinar la variación de glicemia como consecuencia de la administración de adrenalina. La secreción de adrenalina parece estar condicionada en forma importante por el nive de glicemia.

pero cuando la glicemia supera los 180 mg % se puede producir glucosuria (presencia de glucosa en orina) porque en estas condiciones se supera la capacidad del riñón para reabsorverla (dintel renal). de uso generalizado en clínica. por acción de la glucosa oxidasa produce ácido glucorón más peróxido de ico hidrógeno. sin tomar en cuenta su acción en el metabolismo hidrocarbonado? REUNION DE LABORATORIO N° 07 PRACTICA N° 14 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y SEMICUANTITATIVA DE GLUCOSA EN ORINAY SU DIFERENCIACIÓN DE OTROS AZUCARES REDUCTORES I.38 5. además de glucosa. REACTIVOS A UTILIZAR . fructuosa. creatinina. La prueba está basada en que la glucosa urinaria en presencia de oxígeno. La glucosa puede ser determinada de manera específica utilizando como reactivo básico la glucosa oxidasa (método enzimático). Por el contrario. c) Algunas drogas y/o sus catabolitos: salicilato cloral. Todas ellas pueden dar resultado positivo con el reactivo de Benedict que con relativa frecuencia se utiliza para determinar glucosa en orina. en presencia de peroxidasa produce 0-tolidina oxidasa (de color azul) más agua. ácido ascórbico.5 g/l. puede eliminarse muchas otras sustancias reductoras entre las que podemos señalar: a) Otros azúcares reductores: lactosa. y por tanto es explicable que no aparezca glucosa en orina. ácido glucorónico. Este. utilizando un método específico a base de glucosa oxidasa y otro inespecífico en base al reactivo de Benedict. el cual es hidratado a ácido glucónico. es posible encontrar cierta cantidad de elementos reductores que se eliminen diariamente entre 0. La glucosa oxidasa. galactosa y pentosas. El peróxido de hidrógeno en presencia de peroxidasa oxida a la 0-tolidina y toma color azul. En la orina. II. Cuando la capacidad de reabsorción renal disminuye. Los azúcares forman más o menos la décima parte de dicha cantidad y de ella no puede decirse que su totalidad esté constituída por glucosa. La finalidad del presente experimento es identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. Sin embargo. cuando existe insuficiencia renal (menor filtración) no aparece glucosa en la orina aunque la concentración de glucosa se encuentra elevada por encima de 180 mg %. formaldehído. en presencia de glucosa (sustrato) de la orina remueve de éste 2 iones hidrógeno (2H+) formando gluconolactona). Los iones hidrógeno removidos se combinan con el oxígeno atmosférico y forman peróxido de hidrógeno (H2O2). pero como anotamos éste identifica a las sustancias con capacidad reductora y por tanto es de carácter inespecífico. la orina en glucosa aparece aunque ésta se encuentre en concentraciones normales en la sangre (diabetes insípida). ¿Qué efectos tiene la adrenalina. INTRODUCCION: En la orina de sujetos normales no existen cantidades detectables de azúcares en orina. La glucosa del filtrado glomerular renal se reabsorbe en su totalidad en los tubos contorneados proximales.5 y 1. ácido úrico. b) Otros compuestos orgánicos: ácido homogentísico. etc.

6. 2. al ser tratada con el método de la glucosa oxidasa. 4. incluida la glucosa Que resultados podrían obtenerse al tratar una muestra problema de orina. Agitar para evitar que el líquido se proyecte hacia fuera del tubo. Determinación enzimática de la glucosa en orina (Método de la glucosa oxidasa). Colocar en baño de agua hirviendo por 5 min o exponer al fuego directo hasta ebullición por 1 min. Agregar orina problema: 5 gotas. Determinación de sustancias reductoras en orina mediante el reactivo de Benedict. Introducir la tira impregnada de glucosa oxidasa (Glucocinta) en la orina recién emitida contenida en un depósito de 5. Procedimiento: 1. adquiere o no color azul. CUESTIONARIO: 1. realizamos la siguiente determinación con la misma muestra de orina. IV. Colocar Reactivo de Benedict en un tubo: 5 ml. en relación a la glicemia del paciente podría plantear? Explique el fundamento del método de a glucosa oxidasa para la detección de glucosuria. 4. . 1. Para identificar la glucosa en orina y diferenciarla de otras sustancias reductoras. Explique que es el umbral renal de la glucosa. Cuidar que la llama incida en la parte media y superficial del líquido contenido en el tubo. Observar si a los 60 segundos. 3. Fundamente la utilización del reactivo de Benedict para la detección de sustancias con capacidad reductora.39 - Reactivo de Benedict. 3. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Si aparece un precipitado de color rojo ladrillo. 3. primero con el reactivo de Benedict y luego por el método de la glucosa oxidasa Que presunciones plantearía si una muestra de orina tratada primero con el reactivo de Benedict da resultado positivo y sin embargo. III. da negativo Ante una prueba positiva de glucosa en orina: ¿Qué presunciones diagnósticas. Tiras impregnadas de glucosa oxidasa prefabricadas (Glucocinta Lilly). 5. Observar si hay cambio de color y precipitado. Llevar al baño de agua hirviendo por 5 min o exponer el tubo al fuego directo hasta que hierva por 1 min. después de humedecida la cinta. Compare la intensidad de la coloración azulada con una escala adjunta que representa aproximadamente las concentraciones preestablecidas de glucosa. 2. 2. la reacción demuestra la presencia de sustancias reductoras.10 ml.

40 .

REACTIVOS A UTILIZAR . III y IV. 300 ml . aorta. . RESULTADOS Positivo: aparición de un color púrpura. llamados también MPS I.Usar orina fresca o de 24 hrs conservadas en refrigeración (no usar preservantes). IV. 20 ml.1 ml. 2. De acuerdo a su composición química los mucopolisacáridos están agrupados en dermatán sulfato.Poner una gota de orina al centro de un papel de prueba con Azure-A. Síndrome de Hunter. INTRODUCCION: Determinar desórdenes genéticos puede involucrar los sistemas enzimáticos esenciales del metabolismo de los mucopolisacáridos. resultado obtenido cuando la excreción está sobre el límite superior normal de 15 mg/día. Los mucopolisacáridos son sustancias de gran peso molecular que se encuentran en varios tejidos: Conectivo. II. los cuales son excretados anormalmente en grandes cantidades en las mucopolisacaridosis (MPS). cordón umbilical. Estas son subdividas en varios grupos tales como : Síndrome de Morquiolo.41 PRACTICA N° 15 IDENTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDURIA I. 0.La orina turbia debe ser filtrada o centrifugada previamente. II. CUESTIONARIO: 1. válvulas del corazón y son responsables de las características físicas de estas estructuras. Los individuos con MPS secretan grandes cantidades de mucopolisacáridos. . Si un resultado cualitativo para investigar mucopolisacáridos en orina ha sido positivo ¿Porqué debe ser confirmado y cuantificado por cromatografía o precipitación? ¿Cuál es la constitución química básica de los glicosaminoglicanos (mucopolisacáridos)? ¿Cuál es la constitución química básica de los proteoglicanos? Cite 5 ejemplos de éstos. Transferir a una caja Petri llena de solución de lavado. III. 3. Síndrome de Hurler. heparán sulfato y queratán sulfato. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. Síndrome de Sanfilippo. Sacar y secar la tira de papel en estufa a 80º C o con aire caliente. cartílago. cerca de 100 mg/día. Negativo: aparición solamente de un color azul pálido.Papel Whatman I impregnado con Azure-A .Solución de Lavado :  Metanol  Acido acético glacial  Agua destilada. Un resultado positivo por este procedimiento debe ser confirmado y cuantificado por columna cromatográfica ó utilizando la reacción de precipitación con cloruro de cetil piridium. Dejar por 20 min. cantidad que es bastante elevada si se compara con los 15 mg/día que excretan las personas normales. en contacto con mucopolisacpáridos forma un complejo de color púrpura metacromático. La presencia de mucopolisacáridos en orina puede detectarse por un simple procedimiento o Test de Identificación de Mucopolisacáridos que se basa en que el papel Whatman I impregnado con el colorante AZURE-A. . La finalidad del experimento es determinar cualitativamente en orina la excesiva excreción de mucopolisacáridos. Dejar 3 min.

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4.

¿Cuál es la importancia biológica del ácido hialurónico, condroitina y heparina?

III UNIDAD METABOLISMO DE LIPIDOS

REUNION DE LABORATORIO N° 08
PRACTICA N° 16
DEMOSTRACIÓN DE LA DIGESTION DE LAS GRASAS IN VITRO. ACCION EMULSIFICANTE DE LAS SALES BILIARES SOBRE LAS GRASAS. ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA SOBRE LOS TRIGLICÉRIDOS Y EFECTO DE LAS SALES BILIARES
I. INTRODUCCION: Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. En el estómago ocurre la acción de la lipasa gástrica y la licuefacción de la masa de lípidos de los alimentos por contraccion peristálticas. La es principal digestión ocurre en el duodeno, tiene lugar en la interfase agua-lípido y su velocidad depende del área de superficie de la interfase, la cual es grandemente incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de los ácidos biliares. Los ácidos biliares son moléculas anfipáticas sintetizados por el hígado a partir del colesterol y secretados como conjugados de glicina y taurina. La lipasa pancreática (Triacilglicerol lipasa) cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en sus posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La actividad enzimática de la lipasa pancreática incrementa grandemente cuando contacta la interfase agua-líquido, un fenómeno conocido como activación interfacial. La unión a la interfase agua-líquido requiera la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa pancreática (449 residuos), con cambios conformacionales que f rma una o superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo. La alteración en la digestión o absorción de las grasas produce esteatorrea La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y el cloroformo. Asimismo la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares. II. REACTIVOS A UTILIZAR III. Cloroformo Aceite vegetal, de olivo Solución de sales biliares Buffer fosfato 0.1M pH 8,0 Emulsificación de aceite vegetal Solución de fenolftaleina (Solución alcohólica) Hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N

ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento

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y

Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas utilizando tubos de 15 x 125 mm. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES Aceite de olivo(gotas) Agua destilada (ml) Cloroformo (ml) Sales Biliares (ml) Agitar enérgicamente los tubos Dejar en reposo y anotar los resultados para interpretarlos Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y efecto de las sales biliares sobre la reacción enzimática utilizando tubos de 20 ± 25 x 150 mm. COMPONENTES (ml) TUBOS Emulsificación de aceite vegetal Buffer fosfato 0.1M pH 8.0 Solución de sales biliares 1 % Solución de extracto pancreático 1 % Agua destilada I 2 2 2 3 II 3 2 2 2 III 3 2 2 2 IV 3 2 2 2 Tubo 1 3 5 Tubo 2 3 3 2 Tubo 3 3 2 -

Mezclar los 4 tubos y llevar al baño maría a 37 °C , por 30 minutos, agitando de vez en cuando. Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien y luego realizar la titulación. TITULACION: Utilizando una pipeta graduada de 1 ml, dejar caer gota a gota NaOH 0,1N en el fondo de cada tubo del sistema, mezclar bien hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. Anotar la cantidad de NaOH 0,1N gastados. Anotar los resultados para su interpretación. IV. CUESTIONARIO: 1. Explique lo que son sustancias anfipáticas. 2. Diferenciar emulsión de solución, acción de las sales biliares vs cloroformo. 3. ¿Cuántas clases de lipasa pancreática actuán en el intestino? 4. Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática se ha empleado en esta práctica. Explique el papel de la fenolftaleína en la titulación. 5. Diferencie la absorción de los ácidos grasos según su tamaño.

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PRACTICA N° 17
DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS PRE Y POST PRANDIAL EN SUERO HUMANO
I. INTRODUCCION: Los lípidos de la dieta son principalmente triglicéridos. Son transportados junto a colesterol y fosfolípidos por los quilomicrones, formados en el enterocito. Los quilomicrones son las lipoproteínas más grandes, menos densas, ricas en triglicéridos, con la apoproteína apo B48. Por el conducto toráxico llegan a la circulación general. El pico máximo de lipemia postprandial se observa entre las 4 y 6 horas de la ingesta, y al cabo de 9 a 10 horas retorna a los valores basales de lípidos, especialmente de los triglicéridos. Los niveles de lípidos postprandiales, especialmente de los triglicéridos dependen de la cantidad de lípido de la dieta, de la digestión y absorción, de los niveles basales sanguíneos, de la acción de la lipasa lipoproteic en los tejidos extrahepáticos. La lipasa a lipoproteica actúa sobre los triglicéridos de los quilomicrones, liberando ácidos grasos que son captados por los tejidos extrahepáticos. Los quilomicrones son convertidos en remanentes de quilomicrones y captados por el hígado. Se ha considerado al incremento de la lipemia postprandial como un factor riesgo de aterogénesis. La finalidad de la práctica es demostra las variaciones de la concentración de trigliceridos en suero después de la ingesta de alimentos de alto contenido de grasas II. REACTIVOS A UTILIZAR - Reactivo enzimático para determinación de Triglicéridos ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Un alumno por cada mesa vendrá en ayunas de al menos 10 horas, a las 7 a.m. se les extraerá una muestra basal. Ingerirán una dieta rica en grasas conteniendo un vaso de leche, un huevo, 2 panes y 10 aceitunas. A las 4 y 7 horas de la ingesta, se obtendrá una segunda muestra. Se obtendrá el suero y se hará la determinación de triglicéridos. Armar el siguiente sistema. COMPONENTES BLANCO STANDARD DESCONOCIDO Muestra --------10 ul Standard ----10 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar e incubar 10 minutos de 20« 25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC. Medir la absorbancia del Standard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A). Cálculos:

III.

C ! 200 v

(ADesconocid o ?mg / dl A (AStandar
1.71 mmol/l 2.28 mmol/l

C ! 2.28 v

(ADesconocido ?mmol / l A (AStandar

Valores Referenciales Sospechoso: sobre 150 mg/dl ó Elevado: sobre 200 mg/dl ó

4. Explique porqué el incremento de la lipemia postprandial es considerado un factor de riesgo coronario. el ejercicio y el género sobre la lipemia postprandial. Grafique los cambios de triglicéridos postprandiales en función del tiempo.45 IV. 5. Destino de los productos de acción de la lipasa lipoproteica sobre los triglicéridos. Cuál es el efecto de la edad. Alteración de la lipemia postprandial en diabetes y familiares de diabéticos. CUESTIONARIO: 1. 3. . 2.

Los dos primeros pasan a la sangre y son fuente de energía en los tejidos extrahepáticos como el corazón y el músculo esquelético.Cloruro Férrico. Los cuerpos cetónicos son eliminados por la orina y la a etona también por la c respiración. rinde un color azul violeta. de la beta oxidación y de la cetogénesis. Aumentan en sangre (cetonemia) y en orina (cetonuria) por condiciones fisiológicas como el ayuno prolongado. REACTIVOS A UTILIZAR: . INTRODUCCION: La beta oxidación de los ácidos grasos en el hígado. Dado que éstos son ácidos se produce acidosis metabólica. y en sangre hasta 1mg/dl. hipertiroidismo. cristales. en la dieta pobre en carbohidratos. a nivel mitocondrial. a l denominada cetoacidosis diabética.5 g Mezclar hasta disolver los cristales de Sulfato de Amonio. En la Diabetes mellitus. Estos son el ácido acetoacético. Prueba de Rothera y Trabajar del tubo identificado como orina patológica y Utilizar nitroprusiato en polvo. de la siguiente manera: II. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento INVESTIGACION DE ACETONA . el aumento de la lipólisis. incluyendo el cerebro en el ayuno prolongado. solución al 5% en H2O.Disponer de dos tubos que contengan orina normal y orina patológica. III. Su concentración normal en orina es de 125 mg/ 24 horas. DETERMINACION SEMICUANTITATIVA DE CUERPOS CETONICOS EN ORINA I. en el síndrome de Fanconi.Sulfato de amonio. especialmente de acetona. en los vómitos. produce acetil CoA que ingresa al Ciclo de Krebs y en parte se utiliza en la síntesis de cuerpos cetónicos (cetogénesis). En condiciones patológicas como la Diabetes mellitus. en toda hipercatabolia como la fiebre. en la enfermedad de Von Gierke y otras glucogenosis. al superar la capacidad de oxidación de los tejidos extrahepáticos lleva a niveles aumentados de cuerpos cetónicos. . solución al 10% en H2O . Prueba de Legal El nitroprusiato de sodio diluido en presencia de cuerpos cetónicos. el hiperinsulinismo. El diagnóstico y monitoreo de su tratamiento se hace con su determinación en sangre o/i orina.46 PRACTICA N° 18 IDENTIFICACIÓN DE LOS CUERPOS CETONICOS EN LA ORINA.Nitroprusiato de sodio. el ácido beta hidroxibutírico y la acetona. Procedimiento: Armar el siguiente sistema: COMPONENTES TUBO Orina 3 ml Cristales de sulfato de amonio 0. . Nitroprusiato de sodio 10% 3 gotas Amoníaco (agregar lentamente por las paredes del tubo. sin mezclar) 1ml _________________________________________________________________________ Anotar sus resultados.

47   En una lámina de porcelana con excavaciones colocar 0. Este método con sus dos variantes es posible aplicarlo al suero sanguíneo. Prueba de Cloruro Férrico o de Gerhart. 1/30.2 g de reactivo sólido de nitroprusiato de sodio en cada una de éstas.9 cc 3. para investigar acetona y tener una cifra aproximada en su cuantía. INVESTIGACIÓN DE ACIDO ACETOACETICO . Esto es debido a que el nitroprusiato de sodio en polvo da reacción positiva solo cuando en la orina sin diluir alcanza la concentración mínima de 10 mg% de acetona y por eso. etc.9 cc 1.1 cc 0. se debe multiplicar por 10 el número de veces que se ha diluido ésta.1 cc DILUCION 1/10 1/20 1/30 1/40 1/50   Agregar una gota de cada una de las diluciones. el ácido acetoacético rinde una coloración rojo burdeos.9 cc + + + + + ORINA 0. 1/20.1 cc 0. Realice una comparación entre la síntesis de cuerpos cetónicos con la etapa inicial de la síntesis de colesterol Defina: cetonemia. Cuál es el mecanismo fisiopatológico de la cetoacidosis en un paciente que llega al hospital por alcoholismo agudo . estimando la concentración como negativo 5. 150 mg/dl.Armar dos sistemas que contengan orina normal y patológica. Uso de tira reactiva. Sumergir la tira en el frasco conteniendo la orina. cetoacidosis y de ejemplos de cada uno de ellos. 4. 15. 50. en cada una de las excavaciones que contiene el reactivo. 2. Se basa en que en presencia de cloruro férrico. de la siguiente manera: AGUA 0. leer en escala colorimétrico.1 cc 0.1 cc 0. Diluir la orina al 1/10. Procedimiento (Se utiliza orina filtrada): COMPONENTES Orina filtrada Cloruro Férrico. Esperar 20 segundos.9 cc 4. CUESTIONARIO: 1. Cuál es la importancia de la cuantificación de los cuerpos cetónicos en el monitoreo de la cetoacidosis. Observar la máxima dilución de la orina en el que aparece color azul violeta y multiplicar por el denominador de la dilución alcanzada por 10 y se tendrá la cantidad aproximada de acetona en mg por 100ml. 5. solución 5% en agua TUBO 5 ml gota a gota hasta la aparición del Color rojo burdeos si existe ácido Acetoacético IV. Compare los métodos para determinar los cuerpos cetónicos. para calcular la concentración en orina diluida. cetonuria.9 cc 2. 3.

Medir la absorbancia del Starndard y de la muestra frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos ( A) III. incubar 10 minutos de 20«25 ºC ó por 5 minutos a 37 ºC.. Entre las hipercolesterolemias primarias se señalan: La hipercolesterolemia familiar. o secundarias a otras enfermedades. de los tejidos hacia el hígado y es considerada antiaterogénica . Hipertrigliceridemia moderada de 200 a 499. La HDL realiza el transporte reverso del colesterol. obesidad central. ictericia obstructiva. y el resto en la VLDL y HDL. La hipertrigliceridemia puede deberse a causa primarias o familiares. INTRODUCCION: El colesterol es un componente importante de las biomembranas. su incremento también es considerado factor de riesgo coronario. El LDL colesterol. alto o protector mayor o igual a 60. En los triglicéridos se considera: normal menos de 150mg/dl. El HDL colesterol. 5 niveles: Óptimo < 100 mg/dl. La hipertrigliceridemia se asocia a disminución de HDL.Reactivo Standard para colesterol 50 mg/dl. y el LDL. la hiperlipidemia familiar combinada la hiperkilomicronemia. Es transportado principalmente por la LDL que es considerada aterogénica. . Entre las secundarias: La diabetes. A partir de él se forman los ácidos biliares y las hormonas esteroideas. el HDL. 3 niveles: Bajo o de riesgo < 40. previa precipitación de las otras lipoproteínas. por el método enzimático y la determinación de HDL. II. la hiperlipidemia familiar combinada. regulando su fluidez. el alcoholismo. clorhidrato de magnesio. la disbetalipoproteinemia. se realizará la determinación de colesterol sanguíneo. cirrosis biliar. Son hipertrigliceridemias primarias.48 REUNION DE LABORATORIO N° 09 PRACTICA N° 19 DETERMINACION DE PERFIL LIPIDICO I. . severa 500 o más La hipercolesterolemia puede deberse a causas primarias o secundarias.Precipitante para macro ensayos (PRECa) . En la presente práctica. el hipotiroidismo. . el lipoteroidismo. resistencia a la insulina. etc. el uso de anticonceptivos orales. limítrofe de 150 a 199. REACTIVOS A UTILIZAR: . limítrofe alto 200-239 y alto definitivo > 240 (Hipercolesterolemia > 200 mg/dl). Los triglicéridos an ayunas circulan unidas a las VLDL y son fuente de energía para los tejidos. normal a 40 a 59. en el denominado síndrome metabólico. el síndrome nefrótico. la gota. la hipercolesterolemia poligénica. Son causas secundarias: la diabetes.Precipitante para semimicro ensayos (PRECb) ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN DE COLESTEROL SANGUÍNEO Armar el siguiente sistema: COMPONENTE BLANCO PROBLEMA ESTÁNDAR Suero ----10 ul ----Estándar 200 mg/dl --------10 ul Reactivo enzimático 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar.Reactivo precipitante de HDL: ácido fosfotungstico. la hipertrigliceridemia familiar. hiperglicemia e hipertensión. En el colesterol se considera 3 niveles: Deseable < 200 mg/dl.El III Panel de Expertos ha establecido los valores de referencia para el colesterol.

incubar por 5 minutos a 37 ºC o 10 minutos a 20«25 ºC. Leer las absorbancias del desconocido y del Standard.7 mmol/l ó 6. Centrifugar for 2 minutos a 10000 RPM. respectivamente.7 mmol/l Componente Macro Semi-micro Suero 500 ul 200 ul PRECa 1000 ul ----PRECb ----500 ul Mezclar bien. CALCULOS: Concentración HDL-Colesterol: Macro método : ¤ C ! 150 v A Desconocid o A Standard mg/dl Semi  micro método : ¤ C ! 175 v A Desconocid o A Standard mg/dl TG 5 Concentración de LDL-Colesterol: VALORES DE REFERENCIA: HDL-Colesterol: Hombres LDL  C ! TC  HDL  C  ?mg/dlA Mujeres (mg/dl) ¢ standard £ ¢ ! 200 v muestra ?mg/dl A ó ! 5.49 CALCULOS VALORES REFERENCIALES: Sospechoso: sobre 220 mg/dl Elevado: sobre 260 mg/dl DETERMINACIÓN DE HDL -COLESTEROL: Armar el siguiente sistema: ó 5. comparando con el blanco. dentro de 60 minutos ( A). alternativamente por 10 minutos a 4000 RPM Después de centrifugar separar el sobrenadante del precipitado y determinar la concentración de colesterol: Componente Blanco Standard Desconocido Agua Destilada 100 ul --------Standard ----100 ul ----HDL sobrenadante --------100 ul Reactivo de trabajo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar. incubar por 10 minutos a temperatura ambiente.17 v ¢ ¢ muestra standard ?mmol/l A ¤ ¤ £ .

Alteraciones del perfil lipídico en la diabetes y en el hipotiroidismo. Cualés son las causas primarias de hipertrigliceridemia. 8. Realice una breve descripción de hipercolesterolemia familiar y su relación con la cardiopatía isquémica.50 Normal > 55 Bajo riesgo 35-55 Riesgo elevado < 35 LDL-Colesterol: Sospechoso: Elevado: IV. Señale la importancia clínica del colesterol. 3. Señale la importancia fisiológica del colesterol. 4. 2. Cuál es la importancia de la hipertrigliceridemia en la aterogenesis. CUESTIONARIO: > 65 45-65 < 45 150 mg/dl 190 mg/dl 1. Señale las principales causas de HDL disminuido. 7. Realice una breve explicación del rol de la LDL en la aterogénesis. 6. . 5.

III. bajo la supervisión del personal de la sección. Las cuales se dividirán en dos grupos en forma aleatoria. Y secundarias a otras patologías como la diabetes. o Las diez restantes conformaran el grupo experimental. Se extraera el suero y a cada una se determinara el perfil lipídico siguiendo el método enzimático empleado en la práctica anterior.  Set de determinación de triglicéridos enzimático. especialmente coronario.  Reactivo precipitante para HDL. II. 1-2 representantes de cada mesa se encargarán del control de la dieta. cada mesa obtendrá de cada rata control y experimental una muestra sanguínea de la cola antes del tratamiento y otra al final. Se compararán los valores de colesterol. Con la ayuda del personal de la sección. La ATP III. Extracción de las muestras. aumento de las grasas monoinsaturadas y polinsaturadas. etc. El tratamiento será por 21 días. como parte del cambio de estilo de vida junto al ejercicio y control de peso. o Diez de ellas constituirán el grupo control y seguiran su dieta habitual agua y alimentos (maíz) ad libitum. HDL.    . LDL y triglicéridos entre ambas ratas. INTRODUCCION: El aumento de los lípidos sanguíneos o hiperlipidemia constituye una situación metabólica de riesgo. Se considera aterogénicos el aumento del colesterol y de los tigliceridos. la hipertrigliceridemia familiar etc. sidrome nefrotico. se busca mostrar como la ingesta de una dieta rica en grasa saturada con sebo de pollo por 3 semanas. Una dieta rica en grasas saturadas aumenta el riesgo de hiperlipidemia y consiguiente mayor riesgo coronario. Las hiperlipidemias pueden ser primarias o familiares como la hipercolesterolemia familiar. Se dispondran de 20 ratas albinas adultas. REACTIVOS A UTILIZAR:  Ratas de peso aproximado de 200gr. En el presente experimento. hipotiroidismo. la hiperlipidemia familiar combinada.  Dieta standard para ratas a base de maíz. La dieta es importante en el control de la hiperlipidemia. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procemiento  Tratamiento experimental. ha establecido los criterios para una dieta adecuada que incluye disminución de la ingesta de colesterol.  Sebo de pollo. puede producir el incremento de los lípidos sanguíneos.51 PRACTICA N° 20 HIPERLIPEMIA EXPERIMENTAL I.  Set de determinación de colesterol enzimático. las que recibiran adicionalmente 2 cc de aceite preparado de sebo de pollo. Se determinará el perfil lipídico antes y después del tratamiento y se compararan los resultados. disminución de las grasas saturadas.

7. Señale en detalle la dieta recomendada por la ATP III. 5. 3. CUESTIONARIO: 1. . 6. 2. Qué alimentos son fuentes de fibra.52 IV. 4. Qué alimentos son fuentes de omega 3. Qué alimentos son ricos en grasas monoinsaturadas. Qué alimentos son ricos en grasas polinsaturadas. Qué alimentos son ricos en grasas saturadas. Qué alimentos son ricos en colesterol. para el tratamiento de la hiperlipidemia.

triptofano y fenilalanina. quimotripsina. dipeptidasas. y azorrea (gran cantidad de productos nitrogenados en las heces). ataca a los residuos pequeños. quimotripsina. La presente práctica tiene como finalidad demostrar la acción hidrolítica de las enzimas digestivas contenidas en el páncreas sobre la caseína o proteína de la leche. determinado los productos (aminoácidos) con ninhidrina II. con retardo marcado del crecimiento. . Son endopeptidasas: pepsina. elastasa y carboxipeptidasa. alanina y serina.25% saturada con butanol. c) de origen intestinal: aminopeptidasas.1 M pH 8. Son exopeptidasas: carboxipeptidasa y aminopeptidasa. La elastasa tiene una especificidad amplia. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) I II III III. es un proceso complicado que se realiza con el concurso de diversas enzimas proteolíticas Entre estas enzimas proteoliticas tenemos: a) de origen gástrico: pepsina y renina. La falta de enzimas proteolíticas produce creatorrea (presencia de fibras musculares identificables en las heces.Acido tricloroacético al 10%. tripsina. que provienen de la carne de los alimentos). elastasas. La carboxipeptidasa hidroliza el enlace peptídico carboxiterminal en las cadenas polipeptidicas. .Caseína al 1% en buffer fosfato 0. En el lactante con ausencia congénita de tripsinogeno y por consiguiente por falta de activación de quimotripsinógeno y procarboxipeptidasa. y es específica de los enlaces peptidicos sobre el lado carboxílico de residuos de aminoácidos básicos: lisina y arginina solamente. . b) de origen pancreático: tripsina.Solución de extracto pancreático. existe hipoproteinemia.1 M pH 8.Solución acuosa de ninhidrina al 0.Buffer fosfato 0.53 IV UNIDAD PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS: INTEGRACION DEL METABOLISMO REUNION DE LABORATORIO N° 10 PRACTICA N° 21 DIGESTION DE LAS PROTEINAS: ACCION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS PANCREATICAS SOBRE LA CASEINA I. . es activada por la enterocinasa en el intestino. . La tripsina. o degradación hasta aminoácidos en el tubo digestivo. INTRODUCCION: La digestión de las proteínas. como la glicina. La quimotripsina es específica para los enlaces peptidicos de los aminoácidos sin carga como los aromáticos: tirosina. REACTIVOS A UTILIZAR: .

Explique el sitio de producción y la acción de las hormonas que intervienen en el proceso de digestión y absorción de los aminoácidos. 4. agregar 1 ml de solución de ninhidrina.0 Solución de extracto pancreático Agua destilada Pasos: * * * * * * * 1 1 1 --- 1 1 --1 --1 1 1 Mezclar y colocar al baño de agua a 37 ºC por 30 minutos. 3. En este nuevo sistema.5 ml. CUESTIONARIO: 1. III). Elabore un esquema con la digestión y absorción de proteínas y aminoácidos. Observe las variaciones que se produce en cada tubo. . Interprete todos los resultados encontrados en la práctica y explíquelos usando algunos dibujos. II. de cada uno de los tubos y trasladarlo a otro sistema numerado (I. Observa los cambios de color de cada tubo. Luego a los tubos de incubación del primer sistema. 2. Escriba dos esquemas mostrando dos ejemplos de transaminación y dos de desaminación con los nombres de aminoácidos y alfa cetoácidos que participan. Después del tiempo de incubado tomar 0.1 M pH 8. Mezclar y llevar a un baño de agua hirviendo (franca ebullición). agregue gota a gota 1 ml de ácido tricloroacético al 10% agitando continuamente.54 Caseína al 1% Buffer fosfato 0. IV. durante 3 a 5 minutos.

La finalidad del siguiente experimento es demostrar el efecto inhibidor del extracto de soya cruda sobre el efecto proteolítico de la tripsina. Mezclar y centrifugar a 2500 rpm por 10 min.Proteína de soya hervida 30%. Digiere las proteínas desnaturalizadas y parcialemente digeridas. El ovomucoide de la clara de huevo inhibe también de manera enérgica la tripsina.55 PRACTICA N° 22 INHIBICION DE LAS ENZIMAS DIGESTIVAS: ACCION DE LA SOYA HERVIDA Y CRUDA SOBRE EL EFECTO PROTEOLITICO DE LA TRIPSINA I. ello explica en parte que el valor nutritivo del frijol de Soja aumenta considerablemente si se coce a ebullición por varios minutos.5 0. INTRODUCCION: La tripsina actúa como una endopeptidasa e hidroliza prácticamente toda clase de proteínas. . .0. Algunos alimentos en estado natural poseen componentes perjudiciales para la nutrición.Los extractos de páncreas poseen también un péptido inhibidor de la tripsina. . secretada a la luz intestinal. con actividad antioxidante y antitripsina que disminuye el apetito y dificulta la digestión de las proteínas. el gisipol. b. Esta sustancia de naturaleza peptídica es inactivada por el calor.Solución de ninhidrina 0.2 II 2.Solución de tripsina 20 mg%. la alfa-1 antitripsina fecal (1-AT-Fecal) que es una glicoproteína.Buffer fosfato 0.5 0. . .2 IV 2.Etanol absoluto III. I 2. Por ejemplo el frijol de soja contiene un principio cuya actividad antitripsina dificulta la digestión de las proteínas. efecto que desaparece cuando la soya es hervida.25% saturada con butanol. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.5 0.1 M pH 8.5 0.Proteína de soya cruda 30%. Después del tiempo de incubación: agregar a cada uno de los tubos 2 ml de etanol absoluto. .1 M pH 8.0 Proteína de soja cruda 30% Proteína de soja hervida 30% Solución de tripsina 20 mg% Pasos: a.5 III 2. c.5 0.5 0. con mayor rapidez que las originales desdoblándose en polipéptidos de peso variable y algunos aminoácidos. REACTIVOS A UTILIZAR.5 - . II. Es interesante también que el aceite de semilla de algodón posea un pigmento. Incubar en baño maría a 37°C durante 1 hora.

Por qué razón el ovomucoide de la clara del huevo inhibe la acción de la tripsina. f. e. Someter los tubos a temperatura de ebullición del agua utilizando baño maría durante 5 minutos. Anotar los resultados. III. 4.25%. . 3. Explique con sus propias palabras cuál cree que es el objetivo de la práctica que realizó. ¿Qué es el gisipol y cómo actúa en su acción antioxidante? Con dibujos represente la práctica realizada. IV colocar 1 ml de sobrenadante de los tubos respectivos del paso anterior y agregar 1 ml de ninhidrina 0.56 d. 2. II. CUESTIONARIO: 1. IV. En otra serie de tubos numerados I .

etc. excreción. FUNDAMENTOS DEL METODO Determinación de Proteínas Totales: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico. cuya intensidad es provisional a la concentración de proteínas totales en la muestra. disminución de la formación en el hígado como en la cirrosis. haptoglobina. es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. regulación del metabolismo. por el método colorimétrico.9 g/dl de las cuales albúmina: 3. La disminución de proteínas totales (hipoproteinemia) son generalmente asociadas con HIPOALBUMINEMIA que a su vez están acompañadas con pequeños cambios en las globulinas.1 a 7. etc. insuficiente ingestión de proteína. inmunodifusión o inmunoelectroforesis.8.5 a 4. El origen de las proteínas plasmáticas es hepático con excepción de las globulinas gamma que se forman en las células plasmáticas. en la gastroenteropatía exudativa con pérdidas fecales de proteínas. para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540nm. Las cifras de proteínas plasmáticas totales pueden aumentar (hiperproteinemia) con cociente A/G normal en la hemoconcentración. INTRODUCCION: Las proteínas plasmáticas son importantes para el organismo porque realizan diversas funciones: coagulación.Las fracciones globulínicas contienen varias proteínas específicas: inmunoglobulinas. El aumento de absorbancia a 625 nm. La presente práctica tiene por finalidad determinar las concentraciones séricas de proteínas totales y fraccionadas en personas normales y/o con procesos patológicos. en presencia de un exceso de colorante. globulina y fibrinógeno..8 g/dl y globulinas: 2. que se pueden determinar por electroforesis. en la macroglobulinemia de Waldenström. defensa contra las infecciones. en el kala-azar. II. En el suero solo albúmina y globulina . Los bajos niveles de albúmina pueden ser debidos a: incrementadas pérdidas de albúmina en la orina. Agammaglobulinemia y la analbuminemia son cuadros demasiado raros. Determinación de Albúmina: La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de la bromo Cresolsulfon Ftaleina (BCF). ceruloplasmina. en medio tamponado a pH3. la transferrina. La concentración sérica de las proteínas totales es de 6. Las proteínas plasmáticas por métodos químicos se clasifican en albúmina.57 REUNION DE LABORATORIO N° 11 PRACTICA N° 23 CUANTIFICACION DE PROTEINAS SERICAS TOTALES Y FRACCIONADAS I.1 g/dl. conservación del equilibrio ácido básico.6 a 3. REACTIVOS A UTILIZAR. con inversión de A/G por aumento de las globulinas: en el mieloma múltiple. regulación del equilibrio hídrico. en las colagenopatías. respecto del Blanco del reactivo. Reactivo EDTA/Cu Reactivo BCF . transporte. etc. en medio alcalino.

2 . S (Standard) y D (Desconocido).2 ± 2.01 ----1.Alb.5 ± 4.(g/dl) Relación A/ ! ¥ VALORES DE REFERENCIA: Albúmina = 3.8 g/dl Relación A/G = 1. S (Standard) y D (Desconocido).0 g/dl Determinación de Albúmina.(g/dl) Albúmina (g/dl) ! D v f f! S Albúmina(g/dl) PT. Reactivo BCF 1ml. Mantener los tubos entre 15 y 28 ºC durante 10 minutos.01 1. Leer en espectrofotómetro a 625 nm o en fotocolorímetro con filtro rojo (620-650 nm) llevando a cero con el blanco de reactivo CALCULOS DE LOS RESULTADOS : Alb. colocar: Componentes Muestra (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco --------1.0 Standard ----0. 1 ml. ó 20 minutos a temperatura ambiente.0 Mezclar e incubar 10 minutos a 37rC.58 III. 1 ml. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. (g/dl). CALCULOS: FACTOR ! Concentrac ión Standard Absorbancia Standard  Proteina Total (g/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: 6.0 Desconocido 0. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Determinación de Proteínas Totales PROCEDIMIENTO: En tres tubos marcados B (Blanco). llevando a cero el espectrofotómetro con el blanco de reactivo. Leer las absorbancias a 540 nm. Mezclar con varilla. colocar: B S D Suero Patrón 10 ul Muestra 10 ul.0 a 8. PROCEDIMIENTO: En tres tubos de fotocolorímetro marcados B(Blanco).

en clínica? ¿En qué se basa la determinación de las proteínas totales y fraccionadas en nuestro experimento? Elabore un esquema sobre el proceso fisiopatológico de un edema. 2. 5. 4. 3. Cuáles son las principales características de las proteínas plasmáticas.59 IV. . ¿Qué importancia clínica tiene la determinación de las proteínas séricas totales y las fracciones albúmina y globulinas? ¿Qué importancia tiene determinar la relación albúmina/ globulina. CUESTIONARIO: 1.

85%. Extrarrenal: proteinuria ortostática. La proteinuria fisiológica (proteinuria ortóstatica) se presenta después de ejercicios y de permanecer largo tiempo en posición de pie.0 Someter a ebullición por 1 minuto. Son causas de proteinuria Renal: glomerulonefritis difusa. III. Se diluye con cloruro de sodio 0. síndrome nefrótico. sin que exista evidencia de lesión renal. en la eclampsia. aparece la proteína de Bence Jones. Standard de proteína: Pueden usarse suero claro normal de concentración conocido o un suero control adquirido comercialmente. REACTIVOS A UTILIZAR. etc. INTRODUCCION: La orina normal contiene una pequeña cantidad de proteínas solubles (albúminas. hemoglobina.60 PRACTICA Nº 24 DETERMINACION CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE PROTEINAS EN ORINA I. glomerulonefritis focales proliferativas. II. luego las globulinas. COMPONENTE (ml) TUBO Muestra de Orina 5. riñón poliquístico etc. mieloma múltiple. Las proteínas son casi completamente absorbidas en los túbulos. por ejemplo la proteína de Bence Jones. Acido tricloroacético.5% (en agua destilada) Cloruro de sodio 0. 12. El fibrinógeno es una molécula muy larga y escapa solo en enfermedad renal severa. febril. .). La proteína de Bence Jones está constituída por las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas que constituye la proteína monoclonal. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LAS PROTEÍNAS EN ORI NA: Coagulación por el calor. Las proteínas de peso molecular relativamente bajo y de pequeño tamaño pasan primero a través de los glomérulos injuriados. nefropatía lúpica. tuberculosis renal. se ha hace más intensa o se forma un precipitado. albúmina. Esta dilución debe ser preparada el mismo día. nefropatía diabética. La presente práctica tiene por finalidad determinar la presencia de proteínas en la orina y de cuantificarlas en caso que estén presentes en casos normales y en estados patológicos. se trata de proteínas. gravídica. moléculas proteicas de variado tamaño incluyendo las más largas. escapan en el filtrado de forma que los túbulos son incapaces de captar la gran cantidad de proteínas y resulta una masiva proteinuria. Si la turbidez persiste. Cuando el glomérulo es dañado por alguna enfermedad. la cantidad es pequeña alcanzando máximo de 150 mg en orina de 24 horas. Acido acético al 2%. Si aparece un precipitado o enturbamiento se puede deber a la presencia de proteínas o fosfatos. En el mieloma múltiple y macroglubinemia de Waldestrom. se trata de fosfatos que se han disuelto en medio ácido. menos de 10 mg/dl. La proteinuria puede ser renal o extrarrenal. nefropatía tóxica. Añadir: Solución de ácido acético al 2% IV gotas Si desaparece la turbidez.85% a una concentración final de 25 mg/ml. algunas enzimas.

¿Cómo diferencia usted un precipitado en un tubo de ensayo que no c orresponde a proteínas en orina? Señale algunos tipos de proteínas anormales que pueden ser encontradas en la orina. CUESTIONARIO: 1.0 Dejar reposar 5 a 10 min. . y leer en fotocolorímetro con filtro (420 um). orina Absorbancia del standard Volumen total en ml orina -----------------------------------.0 II 1. En tres tubos marcados previamente agregar: COMPONENTES (ml) /TUBOS Solución standard de proteína Orina previamente filtrada Agua destilada Acido tricloroacético 12.0 III 4. 3. Leer el standard (I) calibrando con agua destilada y luego a la lectura del problema (II) restar el blanco de la orina (III). mg/100 ml orina x 100 IV.5% I 4. 5. En qué consiste el método de Heavy para la determinación de proteínas ¿Cuál es el mecanismo por el cual un paciente con glomeruloesclerosis elimina mucha proteína por la orina? Señale algunas causas de proteinuria fisiológica y patológica. 4. CALCULO: Desde que 4 ml de orina se trata igual que un standard de 4 ml conteniendo 25 mg/100 ml entonces: Calcular de la siguiente manera: Absorbancia problema ± Absorbancia blanco x 25 = mg/100 ml. 2.61 DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS EN LA ORINA : Método turbidimétrico de Heavy.0 1. NOTA: Antes de leer los tubos deben ser mezclados totalmente evitando que burbujas de aire puedan interferir con la lectura.= proteína total de orina de 24 H en mg.0 1.0 4.

VALORES DE REFERENCIA: Hasta 29 U/l a 30 ºC Hasta 45 U/l a 37 ºC .0 Volumen de muestra (ml) 0.glutamato. En la presente práctica la glutámico pirúvico transaminasa (GPT) es determinada agregando suero a una solución bufferada conteniendo ácido alfa cetoglutarato y L-alanina y el ácido pirúvico formado. particularmente en el hígado y corazón.62 PRACTICA N° 25 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ALANINA AMINOTRANSFERASA SERICA (ALT) o TRANSAMINASA GLUTAMICO PIRUVICA (SGTP) I. se mide colorimétricamente por reacción con dinitrofenil hidrazina en medio alcalino.5  a-cetoglutarato  L-alanina  LDH  NADH III. Las transaminasas están normalmente presentes en la sangre. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Reactivo reconstituido (ml) 1. Leer la absorbancia inicial (A1) a 340 nm. CALCULOS: Actividad ALAT (UI/l) = A/min x 1768 Nota: de las absorbancias. producto resultante después de la incubación.. Incubar 60 segundos a la temperatura de reacción.1 Mezclar y transferir a la cubeta del espectrofotómetro. Con la aspartato transaminasa. estas enzimas son liberadas dentro de la corriente sanguínea y pueden elevar sus niveles. Repetir las lecturas a intervalos de 60 segundos.. estas enzimas proveen un medio de interconversión de proteínas e intermediarios metabólicos de los carbohidratos y hacen disponibles las reservas proteicas almacenadas en el hígado al ciclo del ácido cítrico. relativamente en bajas concentraciones pero en los tejidos están presentes en grandes cantidades.Piruvato + L . en la hepatitis o en el infarto de miocardio. II. REACTIVOS A UTILIZAR. llamada también alanina aminotransferasa cataliza la reacción L-alanina + alfa-cetoglutarato . INTRODUCCION: La transaminasa glutámica pirúvica. hasta por tres minutos. Reactivo para SGTP:  Buffer TRIS pH 7. sacar diferencias y determinar una media que luego se multiplica por el factor determinado. Cuando se produce destrucción tisular de estos órganos como sucede por ejemplo.

2. CUESTIONARIO: 1. en el diagnóstico diferencial clínico? 4. colocando los nombres de las moléculas que participan. Diga usted en que consiste el mecanismo de transaminación. ¿Cuál es la importancia metabólica de la transaminasa glutámico pirúvico? 3. 6. ¿Cuáles serían las razones para solicitar.63 IV. ¿Cuál es la ubicación intercelular de las TGP y TGO? 5. TGO-S algunas veces separadas y otras veces juntas. Haga un esquema de una transaminación. . Cuál es la utilidad práctica de la utilización del dosaje de transaminasas.

1 0. En las lesiones o hepáticas aumentan ambas transaminasas en el suero.1 0.25 Standard 0. El ascenso es. Otras enzimas. Agregar 5 ml de NaOH 0.35 0.4 Reactivo de color: 2-4 dinitrofenilhidrazina Standard: Buffer piruvato pH 7. Armar el siguiente sistema: Tubo 1 2 3 4 5 6 Agua Destilada (ml) 0.1 0. descienden en forma paralela y. como es el caso de: Las enzimas del tubo digestivo. El color es estable sólo por 30 minutos. salen de las células y funcionan fuera de ellas. Leer a 505 nm. es la determinación por método colorimétrico de una de estas transaminasas de importancia clínica como es la aspartato aminotransferasa.05 0.1 0. INTRODUCCION: En condiciones normales.50 0.25 AST 0 22 55 96 150 212 Agregar 0. éstas. a veces proporciona datos positivos en casos con datos electrocardiográficos de difícil interpretación. las enzimas se sintetizan en las células y en la mayoría de los casos ejercen su función en su interior. si aparece una recaída.40 0. II. cuando sobreviene la mejoría clínica. La finalidad del presente trabajo experimental. pero tiene el inconveniente de elevarse en diversos cuadros. la glutámico pirúvica (TGP) y la glutámico oxalacética (TGO) o aspartato aminotransferasa (AST). REACTIVOS A UTILIZAR Sustrato AST: Buffer de DL-aspartato y -cetoglutarato pH 7.1 0.10 0. por ejemplo) y las enzimas de escape. proporcional a la extensión del infarto.4N diluido con agua destilada 1:10) Mezclar y reposar por 15 minutos a temperatura ambiente antes de leer.64 CUANTIFICACION DE TRANSAMINASAS SERICAS: ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (AST) I. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento) : 1) CURVA DE CALIBRACIÓN: Antes de usar los reactivos por primera vez.4N (NaOH 0. aunque se hallan en todos los tejidos se relacionan preferentemente con los procesos de ³escape´ de enzimas del mi cardio o el hígado.0 0. las dos suben nuevamente.1 Sustrato AST (ml) 0.45 0. En la clínica son importantes dos transaminasas. una vez sintetizadas.20 0.4 NaOH 0. en general. sube al máximo entre las 12 y 48 horas y suele volver a lo normal a los 4 ó 7 días.15 0.30 0.4N III. El tejido miocárdico es muy rico en TGO y el ascenso de esta enzima acompaña a los procesos destructivos del corazón.5 ml de reactivo de color. preparar una curva de calibración para AST. . Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Las enzimas con actividad en el suero sanguíneo (las que intervienen en la coagulación. presentes en cantidades muy bajas en el suero aun cuando en ciertas enfermedades suben considerablemente. sobre todo en la cogestión hepática.

Incubar a 37 ºC durante 60 minutos. .65 Construir en papel semilogarítmico los valores de transmitancia en el eje vertical y en el eje horizontal las U/ml de AST 2) PROCEDIMIENTO DE LA MUESTRA (disponer de un tubo de ensayo): .Incubar a 37 ºC durante 5 minutos.5 ml de sustrato AST en cada tubo.4 N Mezclar y dejar reposar por 15 minutos antes de la lectura.Al cumplirse los 60 minutos. 2. Mezclar y dejar reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. según instrucciones previas.1 ml de suero.5 ml de reactivo de color. . . CUESTIONARIO: 1. IV. Haga un resumen de seis líneas sobre AST.Agregar 0. .Obtener el valor de U/ml de AST a partir de la curva de AST de calibración. .Agregar 5 ml de Na OH 0. . agregar 0.Colocar 0. exactamente. 3. Inmediatamente empezar el control de tiempo. ¿Cuál es la utilidad y el comportamiento en sus concentraciones de la AST en casos de infarto agudo de miocardio? Interprete y explique todo lo actuado en la práctica. .

en niños existe variación con la edad. . con dos subunidades alfa y dos beta. da lugar a las diferentes tipos de porfirias. Standard de Hemoglobina. La concentración normal es de 12 a 14 g/dl en mujeres y de 14 a 16 g/dl en varones en nuestro medio y a nivel del mar. REACTIVO MATERIAL Y EQUIPOS Tensioactivo/CNX: ampollas autorrompibles conteniendo solución estabilizada de tensioactivo/CNX. produce disminución de su concentración dando lugar a la anemia por menor producción como en la anemia ferropénica. cuya función es el transporte de oxígeno. INTRODUCCION: La hemoglobina es una hemoproteína. En este último grupo. utilizando el método enzimático de determinación de hemoglobina. Se sintetiza en la médula ósea por una vía común a la síntesis de porfirinas. El defecto enzimático en algunas de las etapas de síntesis del grupo Hemo. una causa pueden ser las hemoglobinopatías por defecto en la síntesis de una de las cadenas (talasemias) o de cambios en la estructura de una de las subunidades por mutaciones que cambian un aminoácido por otro como en la hemoglobina S. que termina con la adición del hierro por la ferroquelatasa. tetramérica. Buffer/Ferricianuro: comprimidos estabilizados de ferricianuro de potasio y buffer de fosfatos. Pero la hemoglobina puede también disminuír por pérdida de sangre como en las hemorragias o por hemólisis (anemias hemolíticas). que es sin duda uno de los exámenes más solicitados. que también puede deberse a problemas en la maduración de los glóbulos rojos como la deficiencia de ácido fólico. de modo que en mujeres se considera si esta es menor de 12 g/dl y en varones. Hemoglowiener reactivo Tubos de vidrio Lancetas Pipetas ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: COMPONENTES STANDARD hemogloWiener Reactivo 5 ml Con pipeta limpia y seca. II. menor de 13 g/dl. En la práctica médica es por ello importante determinar la concentración de la hemoglobina. por diferentes causas.66 REUNION DE LABORATORIO N° 12 PRACTICA N° 26 CUANTIFICACION DE HEMOGLOBINA I. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración de hemoglobina en sangre de personas normales. que puede tener también otras causas como la Policitemia Vera La OMS basa su definición de anemia en la concentración de hemoglobina. La disminución de la síntesis de hemoglobina. agregar: hemogloWiener Standard 20 ul DESCONOCIDO 5 ml ----Armar el siguient e sistema: III. En la hipoxia por altura por otro lado se produce aumento de su síntesis llevando a la policitemia.

Cuál es la más frecuente y cuántos tipos de anemia conoce.Mujeres: 11.0 ± 18. Haga un esquema con la estructura de la hemoglobina. 2. 3. Mezclar y luego de 3 minutos leer en espectrofotómetro a 540 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (520 -550). CUESTIONARIO: 1. enjuagando tres veces en el propio reactivo antes de agregar cada muestra. el número de ellos y las interacciones del ión Fe++ dentro del grupo hemo. Qué es la anemia.67 Muestra (sangre total) ----20 ul Medir primero el Standard y luego usar la misma micropipeta. 4.Hombres: 13.0 ± 16. Una anemia importante es la anemia de células falciformes: Haga un resumen de las causas de su etiología y su patogenía.0 g/dl IV. . llevando el aparato a cero con Reactivo CALCULO DE RESULTADOS: Hemoglobin a (g/dl) ! D v factor factor ! Standard (g/l) S VALORES DE REFERENCIA: . Interprete y explique el procedimiento de la práctica. indicando sus aminoácidos importantes en cada polipéptido.0 g/dl .

habrá III. Si lee antes. Las lecturas pueden efectuarse entre 4 y 15 minutos. hepático y post hepático.Reactivo sulfanílico . .5 ml Reactivo Sulfanílico 200 ul --------Diazorreactivo ----200 ul 200 ul Mezclar de inmediato cada tubo por inversión. La hemoglobina es liberada y se separa la globina del hem. Total Muestra (suero) 200 ul 200 ul 200 ul Agua destilada 2. la indirecta. se convierte en una forma soluble. que utiliza el diazorreactivo de Erlich. Si se lee después. por el método enzimático de determinación de bilirrubina.Desarrollador o solvente . INTRODUCCION: Los hematíes tienen una vida media de 120 días. da color a las heces y ultrafiltra el glomérulo. llevando el aparato a cero con agua destilada. La bilirrubina indirecta o no conjugada llega al hepatocito y se separa de la albúmina. que varían con la edad de presentación y también en cuanto a su gravedad La bilirrubina directa da una reacción inmediata con el diazorreactivo. Cada gramo de hemoglobina degradada origina 35 mg de bilirrubina. al cabo de la cual son destruidos en el sistema retículo endotelial. después de un proceso de captación y conjugación con dos moléculas de ácido glucurónico por la enzima bilirrubina glucuronil transferasa. Luego de 5 minutos. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total de las fracciones de bilirrubina en el suero o plasma de personas normales y con ictericia. denominada bilirrubina directa o conjugada.5 ml ----Desarrollador --------2. habrá subvaloración de los resultados por reacción incompleta.Bilirrubina Standard. . II. leer en espectrofotómetro a 530 nm o fotocolorímtero con filtro verde (520-550 nm). siendo en su mayoría bilirrubina indirecta.Nitrito de Sodio . La hiperbilirrubinemia puede ser a predominio de la bilirrubina no conjugada como en las anemias hemolíticas o en los defectos congénitos de conjugación. o en las enfermedades extrahepáticas obstructivas. por el método de Malloy Evelyn. REACTIVOS . donde el defecto limitante es la excreción. y el origen de esta alteración obedece a causas de origen pre hepático. ACTIVIDADES PROCEDIMENTALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Bil. que no se excreta por orina. La concentración sanguínea de bilirrubina total es de 1 mg / dl. La finalidad de la presente práctica es determinar la concentración total y de las fracciones (bilirrubina directa e indirecta) en el suero de personas normales. sólo reacciona después de agregar alcohol a la mezcla. excepto para la bilirrubina directa que debe leerse a los 5 minutos exactos. que es finalmente excretada con la bilis al intestino por un proceso de transporte activo. o de la bilirrubina conjugada en las hepatopatías. La manifestación clínica más importante de las hiperbilirrubinemias es la ictericia.Diazorreactivo: Mezclar: 1 parte de Nitrito de Sodio con 21 partes de Reactivo sulfanílico.68 CUANTIFICACION DE BILIRRUBINAS SERICAS I. Directa Bil. Este pigmento insoluble en agua es transportado unido a la albúmina. éste es convertido en biliverdina y luego en bilirrubina.5 ml 2.

¿Cuál es la acción bioquímica que realiza cada uno de los reactivos utilizados en la práctica? 5. CUESTIONARIO: 1. total . B. Bil. 2. ¿Cuál es el riesgo de aumento de bilirrubina no conjuda en el recién nacido? 6.69 sobrevaloración porque comienza a reaccionar la bilirrubina libre CALCULOS: Bilirrubina total (mg/l) = (Abs.Abs. Por qué? . ¿Cuáles son las causas de hiperbilirrubinemia conjugada? 4.Bilirrubina Directa VALORES DE REFERENCIA: . Directa . Elabore un esquema con los tipos de ictericia que se pueden producir durante el metabolismo de la bilirrubina. Blanco) x F Bilirrubina Directa (mg/l) = Abs. ¿Cuál es el comportamiento de las bilirrubinas en caso de una insuficiencia hepática.) x F Bilirrubina Libre (indirecta) = Bilirrubina total . ¿Cuáles son las principales causas de hiperbilirrubinemia no conjugada? 3.Abs Blanco.Adultos: o Directa: hasta 2 mg/l o Total: hasta 10 mg/l IV.

5 ml Mezclar suavemente e incubar 15 minutos en baño de agua a 37 °C o 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 25 °C). policitemias. que es el más común de los desórdenes del metabolismo de las purinas. En orina. Reactivo de fenol. la concentración de ácido úrico en suero o plasma depende de un neto balance entre el grado de síntesis de purinas y fraccionamiento de nucleoproteínas por un lado y. Retirar. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento .5 ml 2. En condiciones patológicas. En las alteraciones renales severas son comunes los niveles altos de ácido úrico como resultado de una excreción disminuida. etc. Un adulto normal produce unos 500 mg de ácido úrico por día. los que se degradan y en un primer momento liberan los ácidos nucleicos de las proteínas. II. diferencia que desaparece después de los 45-50 años de edad. la uricemia se incrementa después de la ingestión de nucleoproteínas con los alimentos. colocar: B S D Standard 50 ul Muestra 50 ul Reactivo de trabajo 2. o urea. del grado de eliminación de ácido úrico. el resto se degrada y es eliminado como CO2 y NH3. Al pH sanguíneo predomina la forma desprotonada o urato. REACTIVOS A UTILIZAR. cantidad que puede incrementarse con una dieta rica en purinas. INTRODUCCION: El ácido úrico es un producto de la degradación hepática de las bases nitrogenadas purínicas adenina y guanina. por otro. el ácido úrico alcanza una concentración de 4 a 6 mg/dl.70 PRACTICA N° 27 CUANTIFICACION DEL ACIDO URICO SERICO I. III. el pH ácido favorece la formación de ácido úrico no disociado y puede precipitar. que circulan en la sangre (en el plasma y en los glóbulos rojos humanos) y es la orina su vía de excreción. . ocurre lo contrario. La cantidad de uratos excretados varía normalmente de 250 a 750 mg / 24 hrs. En el hombre. También existe hiperuricemia proveniente de la destrucción excesiva de células (material nuclear) en leucemias y linfomas. S (Standard) y D (Desconocido). más frecuente en hombres. enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm). podemos encontrar concentra ciones incrementadas de ácido úrico sérico en la gota. Los varones tienen niveles 1 mg/dl más altos que las mujeres. En el plasma. a pH menores predomina la forma protonada no disociada o ácido úrico. Como sucede con otros constituyentes séricos.Muestra: suero o plasma heparinizado . en alcalinidad. llevando el aparato a cero con el blanco.En tres tubos de fotocolorímetro o cubetas espectrofotométricas marcadas B (Blanco). La presente práctica tiene por finalidad cuantificar las concentraciones séricas de ácido úrico en personas adultas normales y / o con alteraciones patológicas mediante el procedimiento químico de Folin-Dennis que se basa en la acción reductora del ácido úrico en medio alcalino sobre el ácido fosfotúngstico. Standar: solución de ácido úrico 100 mg/dl Uricasa: solución de uricasa mayor o igual a 3U/I Reactivo 4-AF/POD: frasco conteniendo más de 100 U de peroxidasa (POD). Aproximadamente 80 % de esa cantidad es excretada por orina.5 ml 2.

3. 6. se observan los siguientes rangos de valores: Hombres: 26-60 mg/l Mujeres: 20-50 mg/l Los valores de ácido úrico varían de acuerdo a la edad. IV. 5. Cómo se sintetiza el ácido úrico. . Y dónde se realiza esta síntesis. 2. Cuál es la fisiopatología de las hiperuricemias. Señale la deficiencia parcial enzimática que ha sido encontrada en algunos pacientes con gota. con ingesta normal de proteínas. CUESTIONARIO: 1. 4.71 - CALCULO DE RESULTADOS: Acido Urico (mg/dl) ! D v f donde " f " ! 100 mg/dl S - VALORES DE REFERENCIA: En adultos normales. el sexo y las diferentes dietas. incluso se ha observado una variación estacional. ¿Cómo explica el uso del alopurinol en el tratamiento de la gota? ¿Cuál es el proceso de la artritis y de la formación de los tofos en la gota? Explique por qué existe hiperuricemia en las enfermedades de leucemia.

II. La concentración normal en suero varía de 0. mientras que en eritrocitos sólo corresponde a un 40%. .16 mmol/l . como las glomerulonefritis o la nefropatía diabética o post renal. La creatina fosfato se forma en los miocitos y es un compuesto importante como fuente de energía en la contracción muscular. catabolismo de proteínas. El clearence de creatinina normal es mayor de 100 ml / min. La cantidad eliminada por las personas del sexo masculino generalmente es más grande que en las de sexo femenino. La creatinina es un constituyente habitual de la orina. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento III.Reactivo 2: Acido pícrico 4. esta última determinación se prefiere porque proporciona mayor información relacionada con el estado de la función renal. La creatinina urinaria disminuye en la insuficiencia renal y es útil para medir el grado de filtración glomerular y lo poco que es transferido a través de las células tubulares. La creatinina es fácilmente difusible y es igualmente distribuida en el agua corporal. La creatininuria es determinada mediante el método enzimático. Usando métodos enzimáticos para determinar específicamente creatinina y comparando con los valores obtenidos por la reacción de Jaffe en personas normales y nefriticos se encuentra que la creatinina verdadera del suero comprende aproximadamente un 90% del total. INTRODUCCION: La creatina.1. la cantidad total depende de la masa muscular. la cual puede alterarse por diversas causas. REACTIVOS A UTILIZAR. La determinación de creatinina tiene utilidad en la práctica médica para la evaluación de la función renal. El suero es depurado de creatinina en el riñón por filtración glomerular proporcionando una buena base para el test de clearance. Es excretada fundamentalmente por el riñón el cual clarifica el plasma de creatinina. como las uropatías obstructivas La creatinina en medio alcalino reacciona con el ácido pícrico para dar un tautómero de picrato de creatinina de color anaranjado (reacción de Jaffe). aunque una pequeña cantidad pre formada es ingerida con los alimentos. renal. y es excretada en una cantidad casi constante. las que pueden ser de origen pre renal como el shock o la insuficiencia cardíaca.72 REUNION DE LABORATORIO N° 13 PRACTICA N° 28 DETERMINACION DE CREATININA SERICA EN PERSONAS SANAS Y NEFROPATAS I. Esto.4 mg /100 ml. siendo la producción endógena constante. La concentración de creatinina en suero no es afectada por la dieta. precursora de la creatinina. sexo o ejercicios. Elevadas concentraciones se producen solamente cuando la función renal está muy alterada y aunque el mismo tipo de información acerca del diagnóstico y pronóstico se obtiene por la determinación de nitrógeno ureico o creatinina. La determinación de hace de ordinario en un filtrado libre de proteínas obtenido a partir del suero.5 a 1. ya que los niveles de creatinina sérica dependen del grado de excreción. Aproximadamente 2% de la creatina fosfato muscular es convertida en creatinina diariamente. hace remarcable la necesidad de usar suero y no sangre total para la determinación de creatinina por el método colorimétrico.0 mol/l .Standard: Solución de creatinina 2 mg/l. aumenta en el cuerpo humano fundamentalmente por síntesis. edad. . las variaciones fluctúan entre 0.Reactivo 1: Hidróxido de sodio 0. 9 .5 g/24hs.

Incubar 1 minuto a 20-25 °C y leer A1.73m2A ! mgcreatinina mlOrinav mlorina/24h mgcreatinina ml suerov 1440 /100 VALORES REFERENCIA: DE SUERO/PLASMA: Mujeres Varones ORINA: Mujeres Varones Clearance de Creatinina: Mujeres Varones IV. Explique por qué se incrementa la creatinina en tres estados patológicos que conozca. Incubar 5 minutos a 20-25 °C/30 °C/37 °C. Mezclar.73 PROCEDIMIENTO En caso de que la muestra a utilizar sea en suero.6 ± 1.9 ± 1. CUESTIONARIO: 1. Incubar exactamente por 2 minutos y leer A2. ¿Qué información o presunción obtiene al dosar la creatinina sérica? ¿Por qué se prefiere la determinación de creatinina urinaria a la de nitrógeno ureico? Interprete y explique el procedimiento de la práctica. A que se denomina clearence de creatinina y que importancia tiene.3 mg/dl 11 ± 20 mg/kg/d 14 ± 26 mg/kg/d 95 ± 160 ml/min/1. M (Muestra) Componentes Blanco Standard Muestra Reactivo 1 1000 ul 1000 ul 1000 ul Muestra --------50 ul Standard ----50 ul ----Mezclar. 3. 4. 2. su determinación. En tubos de ensayo marcados B (Blanco). S (Standard).1 mg/dl 0. luego agregar: Reactivo 2 250 ul 250 ul 250 ul Llevar el espectrofotómetro a cero con el blanco. CALCULOS: ¨A Muestra (A2-A1) y ¨A Standard (A2-A1) CALCULOS: SUERO/PLASMA : ¦ ¦ Creatinina(mg/dl)! ORINA : Creatinina(mg/dl)! Standard(mg/dl)A v? A Standard A Muestra A Muestra CLEARANCE DE CREATININA : /100 ?mg/min/1. Haga dibujos del procedimiento.73 m2 98 ± 156 ml/min/1. ¦ ¦ Standard(mg/dl)Av 50 v? A Standard 0.73 m2 . 5.

Normalmente no tiene función útil en el organismo. es excretado casi enteramente por los riñones. suero o plasma. La urea en el plasma es filtrada por los glomérulos renales. Agregar a cada tubo: Reactivo hipoclorito (ml) 1. Cuando el nitrógeno ureico es determinado por el método de la ureasa. éste reacciona con fenol e hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina colorimétricamente. se informa el BUN según la siguiente fórmula: Urea x 0.Reactivo de salicilato. en personas normales y / o con procesos patológicos. . REACTIVOS A UTILIZAR.Reactivo hipoclorito. El grado de azoemia depende de la extensión y tipo de lesión renal.74 PRACTICA N° 29 CUANTIFICACION DE UREA EN SANGRE I. son muy similares. es convencionalmente reportado co nitrógeno ureico. La or importancia clínica de la urea viene del hecho de una elevada concentración sanguínea puede estar asociada con una mala función renal.Solución standard III. pero en condiciones normales aproximadamente el 40% de este filtrado regresa p difusión a la sangre. La concentración de la urea en la corriente sanguínea es el resultado del balance entre el grado de degradación de las proteínas y el grado de eliminación por los riñones. Las concentraciones de urea en sangre total. ésta transforma a la urea en carbonato de amonio y con la adición del reactivo de Nessler el amoníaco liberado forma un compuesto de color amarillo bruno cuya intensidad se mide en fotocolorímetro. La uremia es determinada colorimétricamente por el uso de ureasa.00 1. es el principal producto final del catabolismo de las proteínas y se distribuye en todos los tejidos. INTRODUCCION: La urea es sintetizada en el hígado. . La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco.01 Standard (ml) ----0. Los valores normales de urea en suero (como nitrógeno ureico sanguíneo o BUN) es de 9 ± 19 mg/100 ml. .14 = UREA En sentido inverso.01 ----Reactivo de trabajo (ml) 1. o 3 minutos a 37 °C. II. Este método es altamente específico y aunque está basado en reacciones de urea. Los valores de urea se mo reportan siguiendo la siguiente fórmula: Nitrógeno ureico sanguíneo x 2.00 1.00 1.00 Incubar 5 minutos a temperatura ambiente (20 °C a 25 °C). .00 1.4665 = Nitrógeno ureico sanguíneo Los riñones eliminan diariamente entre 20 a 40 gramos de urea. conociendo los valores de urea. La finalidad de la presente práctica es cuantificar la uremia por el método de la ureasa.00 Mezclar e incubar 10 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 °C) o 5 .Suspensión de ureasa. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento PROCEDIMIENTO Componentes Blanco Standard Desconocido Muestra (ml) --------0.

.5 a 22. ¿Qué alteraciones en las concentraciones séricas de úrea y NH4+ podrían encontrarse en el coma hepático? ¿Cuál es la importancia metabólica de la existencia del ciclo de la ornitina en el hígado de los seres humanos? ¿Cuál es la importancia metabólica que en el hígado humano exista una relación entre el ciclo de los ácidos tricarboxilicos y el ciclo de la ornitina? 10 a 50 mg/dl : 15 a 30 g/24 hrs. conocer las concentraciones séricas de úrea? ¿Qué influencia tiene la ingesta proteica sobre la concentración sérica de úrea? En relación a las concentraciones séricas de úrea y NH4+. 2. 4.7 mg/dl 7 a 14 g/24 hrs. CUESTIONARIO: 1. ¿Qué importancia clínica tiene para usted. 6.75 minutos a 37 °C. 3. : 4. 5. Leer las absorbancias dentro del plazo de una hora CALCULOS: FACTOR ! 66 Absorbancia Standard Urea (mg/dl) ! Factor v Absorbancia desconocido VALORES DE REFERENCIA: SUERO/PLASMA: Urea : Nitrógeno Ureico ORINA: Urea : Nitrógeno Ureico IV. Señale las características comunes que se encuentran en los efectos enzimáticos hereditarios del ciclo de la úrea.

Dos sistemas enzimáticos de transaminación: la alanina piruvato transaminasa(ALT) y la glutamato alfa-cetoglutarato transaminasa (AST) catalizan la transferencia de grupos amino de la mayor parte de los aminoácidos para formar alanina a partir del piruvato o glutamato a partir de alfa-cetoglutarato. Filtrar y medir a otros tubos previamente marcados: . .5 III 4.2-4-Dinitrofenilhidrazina: solución 0.0 1.1M pH 7.5 III. Si se agrega una determinada cantidad de L-alanina a un homogeneizado de hígado después de un período de incubación (30 minutos) podemos demostrar que se ha producido desaminación si encontramos determinada cantidad de cetoácidos (ácido pirúvico y ácido alfa-cetoglutarato) los que pueden ser identificados frente a una solución de 2-4 Fenihidrazina en medio alcalino. II. Añadir ácido tricloroacético al 10% Mezclar y añadir agua destilada I 4.5 1.4 .76 PRACTICA N° 30 DEMOSTRACION DE LOS PROCESOS DE DESAMINACION OXIDATIVA DE LOS L-E-AMINOACIDOS I.0 3.0 0. todo el nitrógeno amino proveniente de los aminoácidos que puede experimentar transaminación se puede concentrar en el glutamato.Homogeneizado de hígado o riñón de rata 10% y conservado en baño helado.4 Solución L-alanina 0.0 1.0 1. Esto es importante porque el L-glutamato es el único aminoácido en el hígado que experimentan desaminación oxidativa a una tasa apreciable y esta reacción se cataliza por la L glutamato deshidrogenasa.0 0.2M . . Puesto que la alanina es también sustrato para la reacción de glutamato transaminasa. La finalidad de la práctica es demostrar los procesos de desaminación (oxidativa o no) que sufren los L aminoácidos en el hígado utilizando a la L-Alanina como un ejemplo de éstos y al 2-4 Dinitrofenilhidrazina como indicador de los cetoácidos formados provenientes de la desaminación.5 1.1% en HCl 2 N.0 3.1 M pH 7. INTRODUCCION: La remoción del grupo amino de las L-aminoácidos es el primer paso en la degradación metabólica general de estos compuestos (catabolismo). ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente esquema de incubación: COMPONENTES (ml) Buffer fosfato 0.L-alanina: solución 0.5 1. La presencia de estos cetoácidos se debe fundamentalmente a los procesos de transdesaminación y desaminación del ácido glutámico (transdesaminación) que se estimula fundamentalmente y en mucha menor proporción por desaminación de la L-Alanina por la acción de la L-aminoácido.NaOH: solución 2N .Buffer fosfato 0.5 TUBOS DE ENSAYO II 4.0 0.2M Agua destilada Homogeneizado de hígado Colocar en baño maría a 37°C durante treinta minutos.Acido tricloroacético al 10% .0 3. REACTIVOS A UTILIZAR.

0 1.4-Dinitrofenilhidrazina solución al 1% Mezclar y dejar en reposo durante veinte minutos.0 1.0 4.0 4.4-Dinitrofenilhidrazina en el sistema? ¿Cómo explica usted los resultados fotocolorimétricos obtenidos en los tres diferentes tubos de experimentación del sistema? ¿Cuál es la importancia biológica de la desaminación oxidativa de los aminoácidos? ¿Qué conclusiones puede establecer usted.77 COMPONENTES (ml) Filtrado 2. Realizar las lecturas con el espectrofotómetro. ¿Cuál es la razón por la que se utiliza 2. NaOH 2N Dejar en reposo durante 10 minutos.0 Señale los sistemas enzimáticos flavinodependientes que producen desaminación oxidativa de los aminoácidos. De un ejemplo de desaminación oxidativa de un aminoácido. IV.0 TUBOS DE ENSAYO II 4.0 4.0 III 4.0 1. CUESTIONARIO: 1 2 3 4 5 6 I 4. de los resultados de su práctica de laboratorio? .

Muchas de estas propiedades podrían depender de las propiedades reversibles de óxido reducción (redox) de esta vitamina (ácido ascórbico .5 mg de ácido ascórbico para niños y 7. Los síntomas son vagos y generalmente limitadas alteraciones del crecimiento de los dientes. Antes de la intervención quirúrgica las cifras plasmáticas inferiores de 0.2 mg/100ml o en glóbulos blancos a 8 mg/100 g indican una deficiencia importante que puede significar cicatrización tardía o dehiscencia de las suturas. la hipófisis y el ojo son espacialmente ricos en vitamina C. En el escorbuto no tratado. En caso de alimentación deficiente.1 gm/100ml y en glóbulos blancos menos de 2 mg/100 g. Para ello es necesario que los. Se presenta en alimentos frescos y en vegetales. La única acción en el cuerpo es debido principalmente a que es una clase especial de agente reductor que influye en los procesos de óxido reducción. Un excelente test clínico para la deficiencia de vitamina C es la determinación del promedio de resistencia capilar. Ciertas células sin vitamina C no son capaces de producir o mantener sustancias de importancia intracelular. El principal resultado de tal deficiencia es el escorbuto.5 mg para adultos es suficiente para prevenir síntomas de deficiencia. Se necesita también para la producción normal de fibrinas del tejido conectivo y de la sustancia del baso intercelular (por ello el aumento de fragilidad capilar en el escorbuto). INTRODUCCION: La vitamina C o ácido ascórbico es hidrosoluble y antiescorbútica. una enfermedad caracterizada por debilidad. Los nivelas ² plasmáticos en una población bien alimentada varían entre 5. lesiones en las encías y ligera anemia. La vitamina C es destruida rápidamente por el calor de cocimiento o la pasteurización. Casos subclínicos de deficiencia de vitamina C son muy comunes entre la población pobre de las grandes ciudades. Se estima que una ingestión diaria de 2. alimentos antes del cocimiento contengan 70 mg de vitamina C. VITAMINAS Y MINERALES REUNION DE LABORATORIO N° 14 PRACTICA N° 31 DOSAJE DE VITAMINA ³A´ El instructivo de la presente práctica se les proporcionará durante la práctica respectiva. dolor de las extremidades. el nivel plasmático de ácido ascórbico es inferior de 0. Esto puede ser hecho con un simple aparato para medir la presión sanguínea con la cual la presión dentro de los capilares se incrementa por la constricción de . Aunque no se conoce con seguridad sus funciones metabólicas precisas hay pruebas que señalan su requerimiento para el metabolismo de la tirosina . PRACTICA N° 32 DOSAJE DE VITAMINA ³C´ I. Las necesidades mínimas diarias de vitamina C son 10 mg y son preferibles 30 mg por día.2 mg/100ml.78 V UNIDAD NUTRICION: REQUERIMIENTOS ENERGETICOS. Las intervenciones quirúrgicas dan lugar a disminuciones de 17 a 20% de contenido en el plasma y en glóbulos blancos. En los leucocitos la concentración es mucho mayor que en el plasma (15 mg/100 g) de capa blanca leucocitaria.ácido dehidroascórbico). hemorragias subcutáneas y sangrado de encías. La corteza suprarrenal. el escorbuto clínico tarda 6 meses en manifestarse. PROTEICOS.5 y 1.

El ácido ascórbico es estable durante varias horas en el filtro. y 0.1 de la solución tioúrea. enfriando el hielo.1 mil de la solución de sulfato cúprico. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento y Extraer más o menos 5 mi de sangre de la flexura del codo e introducirlos en frascos previamente oxalatados. En un pH ácido.5% III. II.6 ml de agua destilada. Se prepara en el mismo dia de uso. CÁLCULOS: Abs. Mezclar: COMPONENTES (ml) TUBOS Liquido sobrenadante de paso anterior Acido tricloroacético al 10% Standard de ácido ascórbico.4 dinitrifenilhidracina al 2% en ácido sulfúrico 9 N. Agua destilada Reactivo de color combinado I II 1 0.). esta debe ser fresca (no después de 30 min. Por 6'ste procedimiento el ácido ascórbico del plasma o sangre es oxidado a ácido dehidroascórbico. y Reactivos 2. y Leer en fotocolorimetro (540 nm). mezclando: 5 ml del reactivo 2.4 III 0. y Solución de tioúrea al 10% en etanol al 50%.4 - y Se mezclan los reactivos.2 mg/dl pueden preceder en 2-3 meses a la aparición de un escorbuto clínico. REACTIVOS A UTILIZAR: y Acido tricloroacético al 10& (P/V). el acide dehisroascórbico se transforma rápidamente en ácido dicetoglucónico que se une a 2 dinitrofenilhidracina -4 para formar una hidrazona de color pardo.5 0. y Agregar a cada tubo lentamente y mezclando.4 0. y Standard de ácido ascórbico 2 ml/100ml. y El ácido ascórbico utilizado para preparar la solución patrón debe ser de grado analítico. Hemorragias que en la piel aparecen con excesiva frecuencia podrían indicar fragilidad capilar. Del problema .4 dinitrofenilhidracina.5 0. La excreción normal diaria de vitamina C en orina de adultos varia entre 10 y 30 mg.5 0. Esta sufre rearreglo molecular en ácido fuerte dando un compuesto rojo.5 0. y Dejar los tubos en reposo por 30 min. por el método colorimétrico de Roe y Ructher modificado.5%. Para la determinación del ácido ascórbico en sangre. Se utilizará el método de Roe y Kutcher modificado para la cuantificación del ácido del ácido ascórbico en sangre. y Agregar 1. Por ello es indispensable separa el plasma de ids glóbulos rojos y realizar el análisis sin tardar. Del Standard . y Oxalato de litio al 6. y Acido sulfúrico al 85%. se tapan en tubos con papel parafinado y se colocan en baño de agua a 56°C durante una hora. y Los valores inferiores a 0. y Mezclar nuevamente.Blanco x 2. y Solución de sulfato cúprico al 1. total o plasma. Transcurrido el tiempo se enfrian los tubos en baño de hielo durante 5 minutos.5 = mg/dl Abs. El propósito de la siguiente práctica es determinar la concentración de ácido ascórbico en el plasma de personas adultas normales o carenciales.Blanco NOTA: y El ácido ascórbico es muy inestable. 2 mi de ácido sulfúrico al Q5°o. . 0.79 la vena del brazo. Absorbancia se compara con patrones adecuados de ácido ascórbico. y Reactivo de color.

¿Por qué las necesidades de vitamina C deben ser satisfechas en la dieta normal? 2. hipertiroidismo. CUESTIONARIO 1. . ¿Qué relaciones metabólicas podría mencionar entre el ácido fólico y Fe+++ en la producción de anemia en el escorbuto? 3. lactancia e intervenciones quirúrgicas? 4. neoplasias. ¿Cómo explicaría que las dosis superiores a 1 g/dia pueden ocasionar hemolisis en portadores de deficiencia eritrocitica de G-6-P-deshidrogenasa? 5. Mencione algunas funciones metabólicas importantes del ácido ascórbico. embarazo.80 IV. Desde el punto de vista metabólico ¿Cómo explica que los requerimientos de vitamina C sean mayores en el curso de las enfermedades infecciosas.

5 2. El contenido de hierro en el cuerpo humano se encuentra distribuido en tres formas: el almacenado. aumento de Capacidad Total de Fijación de Hierro y disminución de la Saturación de Hierro  Anemia por deficiencia de hierro: microcítica hipocrómica. El 90 % de anemias en las mujeres es por deficiencia de Fe.0 Reactivo color: ferrozina. Prácticamente todo el hierro corporal se encuentra unido a proteína. etc. hidroxilamina clorhidrato. De la misma manera. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento DETERMINACION DE HIERRO Armar el siguiente sistema Componentes Blanco (suero) Muestra Buffer Acido (ml) 2.50 0. que se encuentra en la hemoglobina. La evaluación de la concentración de hierro sérico es de gran utilidad.81 REUNION DE LABORATORIO N° 15 PRACTICA N° 33 DETERMINACION DE HIERRO SERICO TOTAL Y TIBC I. su disminución se asocia entre otras patologías a problemas de absorción y almacenaje. defectos en el mecanismo de almacenaje. El hierro es absorbido en el intestino delgado como Fe2+ y su regulación ocurre a ese nivel y es transferido a la transferrina para su transporte sérico. Solución Standard: Fe (II) en hidroxilamina clorhidrato 500 ug/dl III. el hierro en uso. La deficiencia de hierro pasa por tres estadios:  Deficiencia de los depósitos de hierro.50 Reactivo color (ml) ----0.y la mioglobina. sino que además es tóxico. dado que un aumento en sus niveles se encuentra asociado a diversas patologías tales como destrucción aumentada de los glóbulos rojos.0. dado que no sólo es relativamente insoluble. REACTIVOS A UTILIZAR: Buffer ácido: buffer acetato pH 4. que se encuentra dentro de las células. hidroxilamina clorhidrato. enzimas y varios tipos de proteínas. etc. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm . fiebre reumática.5 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) --------Muestra (ml) 0. etc. El hierro forma parte de los centros Fe-S de la cadena respiratoria. Buffer alcalino: buffer TRIS pH 8. INTRODUCCION: El hierro sérico es importante en el organismo porque es componente esencial de la hemoglobina encargada del transporte de oxígeno. tumores. La capacidad de fijación de hierro (TIBC) aumenta en casos de anemias ferroprivas y disminuye en las hemocromatosis. lo que lleva a la disminución de la ferritina sérica  Disminución de hierro sérico.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos. II. así como de otras hemoproteínas como los citocromos ± componentes de la cadena respiratoria. y el circulante.

Standard Abs.standard Abs.50 Muestra (ml) 0.00 Agua Destilada (ml) --------Standard (ml) 0.Reactivo v 500 Abs.Muestra Abs.82 Cálculos: Ferremia (ug/dl) ! Valores de referencia:  Varones: 50 .50 0.00 2.Bl. : : : 100 ± 400 ug/dl 250 ± 400 ug/dl 20 ± 55 % Señale al menos 5 funciones del hierro Causas de deficiencia de hierro Informe sobre estructura de la ferritina ¿Qué exámenes solicitaría para evaluar la deficiencia de hierro? ¿Qué importancia tiene medir la saturación de hierro? ©¨ § (ug/dl) ! Ferremia(ud/dl) I (ug/dl) ©¨ v 100 . 2. CUESTIONARIO: 1. Leer las absorbancias contra el blanco reactivo a 560 nm Calculos: UIBC (ug/dl) ! 500  TI v 500 Abs.160 ug/dl  Mujeres : 40-150 ug/dl DETERMINACION PARA TIBC (capacidad de fijación de hierro) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Muestra Muestra Buffer Alcalino (ml) 2. 4.Muestra Abs.Bl.Bl.50 Reactivo color (ml) ----0.muestra Abs.reactivo Abs. 5.05 Mezclar e incubar a 37 °C por 10 minutos.50 0.Bl. 3.muestra % Saturación! Ferremia (ug/dl) TIBC (ug/dl) Valores de Referencia: TIBC: Hasta 6 años Sobre 6 años % Saturación IV.

4. INTRODUCCION: El ión cloro comprende aproximadamente el 65% del total de aniones del liquido extracelular. REACTIVOS A UTILIZAR: . d) excesiva ingestión de ClNH4 (cloruro de amonio) produce acidosis que puede ser seguida de altos niveles de cloruro sérico. SODIO Y POTASIO EN EL SUERO DE PERSONAS SANAS Y EN ESTADO PATOLOGICO DETEMINACION DE CLORO I. c) algunos tipos de enfermedad tubular renal con acidosis pueden producir incremento del cloruro sérico. 3) enfermedad pulmonar. 5) en la diabetes mellitus no controlada. 7) en hiper o en s hipofunción de las glándulas adrenales (corteza).83 PRACTICA N° 34 DETEMINACION DE CLORO. fiebre. después de incubar 5 minutos a oscuras.Estándar de cloruro: 355 mg/dl III. tensión de oxígeno disminuida (altura). ansiedad. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Antes de la determinación el estándar y las muestras de suero deben ser diluidas en relación 1/50 con agua destilada (20 µL de muestra/1 ml de agua).Reactivo de Color 2. Se puede presentar concentración de cloruro disminuido (hipocloremia) en hipoventilación causada por: 1) depresión del sistema nervioso central. 6) dieta alta en grasas o en ayuno prolongado el cloro es desplazado por los cuerpos cetónico por sobre producción de estos. 4) enfermedad renal crónica. todas estas alteraciones tienen exceso de C02 (que produce hipocloremia). b) enfermedades que producen estímulo del centro respiratorio como: histeria. De todos los aniones es uno de los de más baja concentración en el líquido intracelular. Este tipo de alcalosis que es de tipo respiratorio resulta por hiperventilación que puede ser causada a su vez por: a) drogas. igualmente sucede en el ClK. Armar el siguiente sistema: COMPONENTES ESTANDAR PROBLEMA Estándar diluido 20 ul --Suero diluido --20 ul Reactivo de color 1 ml 1 ml Mezcla. No exponer a la luz CALCULOS Lectura tandard   ! 355 v Lectura uestra ?mg/dlA  .6 TPZ existente parcialmente como complejo Hg(II)+Sulfato de Hierro . En el suero normal el cloruro se encuentra en concentraciones que varían entre 100 y 106 mEqL. 2) parálisis de los músculos respiratorios. Medir en el transcurso de 60 minutos la absorbancia de problema y estándar. II. La concentración de cloruro se puede incrementar (hipercloremia) en muchos casos como resultado del déficit primario de C02.

55) IV. ¿Puede señalar cinco causas de hipocloremia? 5 ¿Cual es la relación de las alteraciones de la cloremia con el equilibrio ácido básico? . (Convertir en mEq/l dividiendo entre 3. ¿Puede señalar cinco causas de hipercloremia? 4. CUESTIONARIO: 1. la deficiencia acentuada del cloro en la enfermedad de Addison? 3.383 mg/dl. ¿Qué influencia tiene la Aldosterona en el metabolismo del cloro? 2. ¿Cómo explicaría usted.84 VALORES NORMALES : 335 .

pacientes con diarrea. La concentración sérica normal es de 135 a 145 mEq por L (310 A 340 mg%). es aparentemente inerte (no ionizable). En condiciones anormales pueden ser muy considerables las pérdidas de agua por el sudor u otr s o fluidos. en mujeres hay sólo 39 mEq por kg. La determinación del sodio de los fluidos biológicos se realiza sea por electrodo ión selectivo o menos frecuentemente por método colorimétrico II. El ion sodio es ingerido en los alimentos en combinación con el cloro fosfato. y en niños es mayor. en pacientes con diarrea. es el principal factor de regulación de este ion corporal y de sus concentraciones. Como sucede con el agua corporal los valores varían inversamente con la grasa corporal. tratado sólo con insulina y solución salina. Pequeñas cantidades aparecen también en las heces. el sodio esta en equilibrio con el del líquido intersticial. Son ingeridos cerca de 3 gr. La concentración sérica es representativa de toda la concentración celular. INTRODUCCIÓN Debido a la predominante concentración del ión sodio en el líquido extracelular éste influye sobre la presión osmótica que juega un rol preponderante en la distribución del agua entre el espacio extra o intra celular. enfermedad renal con disfunción tubular. Un adulto de 70 kg de peso contiene aproximadamente 80 g de sodio de los cuales 44 se encuentra en el % líquido extra celular y el 35% en los huesos. sudor y saliva. como en el coma diabético.85 DETERMINACION DE SODIO I. El exceso de sodio se elimina por el riñón. por ejemplo en pacientes con diabetes insípida no controlada. En el hombre adulto hay cerca de 43 mEq de sodio intercambiable por kg. En el suero. El suero o plasma contiene más del 90% del sodio total de la sangre. Puede ocurrir deshidratación con sodio sérico elevado. El sodio se excreta casi exclusivamente en la orina.diariamente. sulfato y otros aniones (sales). por peso corporal. Algunos pacientes con enfermedad cerebral. alimentación nasogástrica con alto contenido de proteínas. El riñon puede regular la excreción de sodio y agua por lo tanto. con pequeñas diferencias debido al equilibrio de Donnan. Tales valores no dan información acerca del volumen y distribución de la cantidad total presente ni de la cantidad intracelular existente. El ión sodio es importante en el mantenimiento del equilibrio ácido básico ya que constituye aproximadamente el 90% del total de cationes extra celulares. fístula intestinal. Se puede encontrar incremento de sodio con hiperosmolaridad en individuos con deficiencia predominante de agua corporal. Del total de sodio corporal hay un 18% que fundamentalmente se encuentra en los huesos. El estado clínico de hidratación es importante para evaluar el significado de los niveles séricos de sodio. si el líquido ingerido es insuficiente por razones anormales. hay por lo tanto un 82% del total que es capaz de recambio y participa en las reacciones fisiológicas. La cantidad presente dentro de la célula no puede ser medida sin biopsio del tejido. Diariamente y tiene acceso al suero por difusión a través de la mucosa intestinal o sea que cerca del 4% del sodio corporal total se recambia. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante: Acetato de uranilo más acetato de magnesio  Reactivo de color: tioglicolatop de amonio  Standard de sodio: 50 mmol/l . Se observan concentraciones bajas si las concentraciones de sodio exceden a las del agua. cuando el líquido ingerido no es suficiente para eliminar la sobrecarga de solutos por el riñón. en diabetes mellitus no controlada.

¿Cuál es la importancia biológica del ion sodio? 2. 5. Dejar reaccionar durante 5 minutos Agitar fuertemente por 50 segundos. ¿Por qué la clasificación de deshidratación por alteración de la osmolaridad. ¿Qué semejanza existe en la absorción intestinal de este ion y la glucosa? 4. incluye básicamente las concentraciones de esté ion? . ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (PROCEDIMIENTO) Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco de Standard Problema Reactivo Standard 20 ul Problema 20 ul Precipitante 1 ml 1ml Tapar los tubos y mezclar cuidadosamente. Emplear el sobrenadante Precipitante 20 ul Sobrenadante 20 ul Standard Sobrenadante 20 ul Problema Reactivo de color 1 ml 1 ml 1 ml Mezclar bien. ¿Cuál es el principal factor de regulación del ion sodio corporal? 3. Después de 5 a 30 minutos medir las absorbancias contra agua destilada a 405 nm CALCULOS: Factor: 150 /Lectura Bco Reactivo-Lectura Standard Na (mmol/l)= (Lectura Bco Reactivo-Lectura Muestra) x factor IV. Dejar reaccionar durante 30 minutos Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm).86 III. CUESTIONARIO: 1. Señale las concentraciones séricas normales.

Bajo condiciones de incremento de pH (alcalosis) asociado con la disminución de cloruros. el potasio es liberado de las células y excretado dando como resultado hipopotasemia. (3300 mEq) de potasio en un adulto de 70 kg. en mujeres solamente 40 mEq por kilogramo de peso. Existe también una pérdida lenta de potasio de los glóbulos rojos hacia el suero cuando la sangre permanece guardada. El déficit de potasio celular es reflejado en los hallazgos séricos y bajo estas condiciones la regla es hipopotasemia debido a la elevada excreción urinaria de cloruro de potasio. Hiperpotasemia se puede encontrar en: Shock o falla circulatoria de cualquier causa. Aproximadamente 293 gr. Se produce hiperpotasemia con pérdida intracelular de potasio cuando la permeabilidad de la membrana celular está alterada por lesión tisular. influye activamente en el metabolismo celular ya que es cofactor de muchas reacciones enzimáticas intercelulares. son perdidos a través del vómito. Del sue el ro potasio es transferido el líquido intersticial antes de penetrar a las células o al filtrado glomerular a través de la membrana de los capilares glomerulares del riñón. en deshidratación. Bajo estas condiciones el potasio se eleva si el riñon no puede excretar esta sobrecarga. La concentración de potasio en el suero de personas normales es de 3. esto es debido a que la excreción de potasio por orina se mantiene constante. Existe aproximadamente 130 gr. en la diabetes no controlada. la excesiva destrucción de células del cuerpo y la utilización de proteínas para propósitos calóricos se acompañaría de pérdida de potasio celular. Con ingestión calórica inadecuada y la utilización de proteínas celular para propósitos calóricos. en adultos masculinos hay aproximadamente 46 mEq de recambio de potasio. en insuficiencia de la corteza adrenal. Los niños tienen relativamente menos contenido de potasio por kilogramo de peso debido a que la relación de agua intracelular/extracelular es menor que en adultos. Déficit de potasio corporal puede resultar en: Pobre ingestión de alimentos. Se debe evitar la hemolisis en la toma de muestras de sangre porque el potasio puede ser liberado de los eritrocitos lisados. De potasio en forma de sal son ingeridos diariamente y recambiados con el potasio corporal. del cual el 98% es intracelular mientras que el 2% está presente en el liquido extracelular.87 DETERMINACION DE POTASIO I. en fístulas gastrointestinales y vómitos. Entonces el 2<26 del total del potasio corporal son recambiados diariamente. Excesiva cantidad de potasio puede liberarse del cuerpo bajo dos condiciones: primero cuando las secreciones intestinales con su contenido relativamente alto de potasio. La concentración de potasio intracelular varia con los cambios del agua que gene ralmente acompaña a las alteraciones de los niveles de sodio extracelular. en administración continua de glucosa endovenosa y terapia salina. en recién nacidos los niveles son algo más altos. El potasio es rápidamente removido del líquido extracelular después que es ingerido. se produce intercambio entre el sodio intersticial y el potasio intracelular. en intoxicación temprana con salicilatos. En los niños donde la ingestión de potasio es relativamente más grande. El potasio se pierde en el cuerpo principalmente en la orina aunque pequeñas cantidades son perdidas en la respiración insensible. El 95% del total del potasio corporal es intercambiable aunque el grado de recambio de cada tejido varía en los diferentes órganos. en alcalosis con hiperventilación. en hipoventilación tanto central como periférica cuyo incremento de potasio es frecuente.5 -5-3 mEq/L. pues la falta de esferoides adrenales provocan retención de potasio sérico. varían entre 4-5. en íleo paralitico y anastomosis intestinal no funcionante. INTRODUCCIÓN El potasio es el principal catión intracelular y por lo tanto es un factor importante de la presión osmótica que determina la distribución de agua entre las células y el líquido extracelular.9 mEq/L. el recambio diario es de 14%. Además de este rol pasivo. asi mismo en algunos casos de insuficiencia renal se encuentra elevada la concentración de potasio. cerebro y de los glóbulos rojos se recambia más lentamente que en otros órganos. así mismo en algunos casos de . El potasio del hueso. en hiperfunción adrenocortical o sobredosis de cortisona o ACTH. diarrea o fístula gastrointestinal segundo por excreción urinaria incrementada en individuos con anormalidades tubulares renales.

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insuficiencia renal crónica. II. REACTIVOS A UTILIZAR:  Reactivo precipitante :ácido tricloroacético  Reactivo TPB-Na: tetrafenilborato de sodio  NaOH  Estándar de Potasio III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES (Procedimiento): 1. Precipitación: en un tubo de ensayo pequeño añadir 50 ul de suero y 500 ul de reactivo precipitante. Mezclar cuidadosamente. Centrifugar a alta velocidad de 5 a 10 minutos (3500 rpm). 2. Armar el siguiente sistema: Componentes Reactivo de trabajo Standard Sobrenadante Standard 1 ml 100 ul 100 ul Problema 1 ml

Para producir una turbidez homogénea el Standard y el sobrenadante transparente deben de ser agregados en el centro de la superficie del reactivo de trabajo Mezclar cuidadosamente Dejar reposar por lo menos 5 minutos Medir las absorbancias dentro de los 5 y 30 minutos CÁLCULOS: Factor: 5/Lectura del Standard Problema: lectura del problema x factor VALORES NORMALES: Suero de 3.5 a 5.5 mmol/l IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es el principio o fundamento del método de Hoffman para determinación del potasio sérico? 2. ¿Cómo explica metabólicamente la influencia sobre la concentración sérica de potasio producida por la administración de glucosa e insulina? 3. Explique usted los efectos metabólicos de la aldosterona en la excreción renal de potasio. 4. De ejemplos de hiperpotasemia y de hipopotasemia

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PRACTICA N° 35
DETERMINACION DE CALCIO SERICO
I. INTRODUCCION: El calcio sérico se encuentra en dos formas: Una combinada con proteínas séricas, inactivo e incapaz de difundir a través de las membranas de los capilares. Y la forma no unida a las proteínas, es principalmente iónico, difusible y activo. Varios factores influyen en la concentración de calcio sérico total. La hiperproteinemia está asociada con una elevación en los niveles de calcio, mientras que la hipoproteinemia se acompaña con disminución de la concentración de calcio; sin embargo la concentración de calcio ionizado no se altera. El calcio ionizado se altera en las siguientes situaciones: 1) Por variaciones del pH sérico; la alcalosis tiende a disminuir el calcio y la acidosis tiende a incrementarlo. 2) La ingestión de vitamina D aumenta el calcio ionizado a través de la absorción de calcio y por la excreción del fósforo. 3) La hormona paratiroidea es el factor más importante que controla los niveles de calcio sérico y su efecto es casi exclusivamente limitado a la forma iónica del calcio. La concentración del calcio sérico en individuos normales es de 9 a 11,5 mg por 100 ml Aproximadamente 4,5 a 5,5 mg% es ionizado y cerca de 0,5 mg% está presente como citrato de calcio y el resto se encuentra unido a las proteínas. El propósito de la presente práctica es determinar la concentración sérica de calcio total en personas adultas normales y/o en estado patológico por el método colorimétrico directo

II.

REACTIVOS A UTILIZAR: - Buffer alcalino: buffer lisina pH 11,1 - Reactivo de Color: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleina-complexona, ácido clorhídrico - Solución estándar de calcio: 8 mg/dl

III. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento Armar el siguiente sistema: Componentes Blanco Standard Muestra Muestra --------20 ul Standard ----20 ul ----Reactivo 1000 ul 1000 ul 1000 ul Mezclar y medir la absorbancia de la muestra (¨A muestra) y del Standard (¨A Standard) contra el blanco en un lapso de 5 a 30 minutos CALCULOS: A muestra C ! 8v ?mg/dlA A standard VALORES DE REFERENCIA: Suero o Plasma: 8,1 ± 10,4 mg/dl 


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IV. CUESTIONARIO: 1. ¿Cuál es la importancia biológica del calcio en el ser humano? 2. ¿Cuáles son las formas de calcio sérico? 3. ¿Cuáles son los factores que controlan los niveles de calcio sérico? 4. ¿Cuál es la concentración normal de calcio sérico total? 5. Señale algunas alteraciones fisiológicas y/o patológicas que producen alteraciones de los niveles séricos de calcio.

0. 2. El uso de anticoagulantes del tipo de los oxalatos que comprende la adición de sales osmóticamente activas son indeseables. Sin embargo en ciertas anemias hemolíticas adquiridas. La muestra de sangre debe ser obtenida con un mínimo de estancamiento y de trauma. .86 g). no deben hacer contacto con las paredes de los tubos secos porque estos pueden causar .Na2P04 (27. INTRODUCCION: La membrana de los eritrocitos es semipermeable. Sin embargo cuando los eritrocitos son colocados en solución hipotónica aceptan líquido (hinchándose) hasta que se alcanza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen. Si utilizamos una serie de soluciones de CINa de concentraciones gradualmente progresivas es posible comprobar que la hemolisis de los eritrocitos se producen dentro de ciertos limites de hipotonicidad. cuando estos son puestos en soluciones hipertónica e hipotónica respectivamente. II.5% . 3. Cuidar que las gotas de sangre caigan directamente en las soluciones salinas. Demostrar la fragilidad osmótica de los eritrocitos cuando éstos son colocados en diversas soluciones de CINa de diversas concentraciones.2H2O (4.NaCl al 8. es observada en la talasemia. Utilizar heparina como anticoagulante de elección. . Cuando éstos son colocados en una solución hipertónica pierden líquido arrugándose y destruyéndose hasta que se establece el equilibrio osmótico con el líquido circulante.Heparina III.5% EXPERIMENTO N°2 . la resistencia de los eritrocitos a las soluciones hipotónicas disminuye.NaCl al 15%.5 .Solución salina amortiguada concentrada 10%. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento FRAGILIDAD OSMÓTICA DE LOS ERITROCITOS : PRECAUCIONES: 1. .3%).Cloruro de sodio (180 g). . La presente práctica tiene la finalidad de: Verificar el desplazamiento de agua desde el medio extracelular hacia el medio intracelular y viceversa en los eritrocitos. de allí que se emplee el término de fragilidad. Aunque en la prueba de la osmosis la ruptura de las células resulta de la alteración de su forma y disminución de su resistencia a las fuerzas osmóticas más que a un cambio en la composición de la célula o su osmolaridad.31 g). Las células esferociticas se rompen más rápidamente que las demás y de hecho la prueba de la fragilidad osmótica puede ser considerada como un índice más sensible que la de la magnitud de eritrocitos a la lisis en solución hipotónica. La muestra debe ser procesada tan pronto como sea posible después de tomada. REACTIVOS A UTILIZAR: EXPERIMENTO N°1 .NaH2 PO4. anemia falciforme y en la anemia hipocrónica ordinaria (ferropénica). .NaCl al 4.91 PRACTICA N° 36 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. 4. Se afora con 2 litros de agua destilada y se conserva a 0° C (dura varios meses). lo que se conoce con el nombre de fragilidad osmótica de los eritrocitos (0.

50 8 2.00 0.50 2.50 0. Marcar el tubo donde la hemólisis es completa (color rojo intenso). en tubos heparinizados.75 0. con un algodón empapado en alcohol yodado.40 6 2. 3. Depositar una gota de sangre en cada una de las tres láminas porta-objeto.30 4 1. Procedimiento: Realizar asepsia del pulpejo del dedo escogido de la mano.45 7 2.75 3. Mezclar correctamente cada tubo y dejar a temperatura ambiente por 30 minutos. 5. con las precauciones señaladas. 4. PREPARACIÓN DE LAS DILUCIONES Las diluciones se pueden preparar inmediatamente antes de la prueba: 1. Mezclar el contenido de cada tubo antes de agregar la sangre. Volver a mezclar y luego centrifugar a 2000 rpm.50 0.00 1. objetivado por el color rojizo pálido que toma el líquido sobrenadante en los tubos centrifugados.00 0.00 4. 6. añadir 0.75 0.25 0. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 2 y 4 de cada mesa de trabajo).50 0.25 2.75 2.25 0. Utilizando lancetas descartables o lanceta de Link estéril pinchar el dedo. La sangre del paciente y del sujeto normal son tomadas.50 3. por acción de soluciones salinas de diferente concentración). Anotar los resultados.10 2 1.65 11 3. Colocar cantidades similares de sangre control del sujeto normal en cada uno de los tubos de una segunda hilera. Proceder de la siguiente manera: Láminas (gotas) I II III .00 2. Se debe rotar cada muestra suavemente en el tubo hasta que el color sea rojo brillante (plenamente oxidado).35 5 2. EFECTO DE LAS SOLUCIONES HIPERTÓNICAS E HIPOTONICAS SOBRE LA INTEGRIDAD DE LOS ERITROCITOS: (Verificar por inferencia el desplazamiento del agua entre los medios intra y extracelular. (Se sugiere que esta actividad debe ser realizada por los subgrupos 1 y 3 de cada mesa de trabajo). Utilizando con precisión una pipeta para hemoglobina o una pipeta Pasteur calibrada.02 ml de sangre del paciente a cada uno de los doce tubos de una primera hilera.60 10 3.50 1.00 3.70 12 4.00 0.55 9 3.50 0.20 3 1. 7.50 4.00 0. LECTURA: Observar cuidadosamente y marcar los tubos donde se inicia la hemólisis. Observar que la fragilidad globular media de los eritrocitos se produce entre los tubos 5 y 6 (0.92 hemólisis.45% de NaCl).40 y 0.25 1. Conviene preparar una solución al 1% a partir de la solución concentrada al 10% y armar la siguiente serie de tubos: N° de NaCl al 1% Agua destilada % de NaCl tubo (ml) (ml) 1 0.80 2.

5% Mezclar bien. Señale causas de alteraciones en la fragilidad osmótica. 4. 2.5% Solución hipertónica de CINa 15% Solución hipotónica de CINa 4. . IV. De acuerdo a los valores normales del test de fragilidad osmótica de los eritrocitos. señale la concentración o porcentaje de NaCl del tubo en el cual empezó la hemólisis. Anotar los resultados. Según observación cuidadosa. ¿Cuál es la relación normal existente que permite la forma de disco bicóncavo del eritrocito? B. 3. Establecer las comparaciones morfológicas y/o lisis de los glóbulos rojos en rel ción a cada tipo de a soluciones empleadas en cada caso. CUESTIONARIO: 1. 1 2 - 1 2 - 1 2 Utilizando el microscopio observar los eritrocitos de cada una de las láminas. ¿Cuáles son las relaciones normales existentes para la formación de los esferocitos y de las células tipo tiro al blanco? (target cell). Si el test de fragilidad osmótica de los eritrocitos de un modo general evalúa la relación entre el área superficial y el volumen de la célula. señale los porcentajes de inicio y finalización (total) de la hemólisis. diga: A.93 Sangre del pulpejo de dedo Solución isotónica de CINa 8. así mismo el tubo en donde la hemólisis fue completa.

en la Prueba de Paul-Bunnell (Prueba de aglutinación en pacientes con mononucleosis infecciosa). ambos tipos de reacciones se producen por medio de anticuerpos multivalientes que se combinan con partículas de antígeno formando complejos de antígeno anticuerpos. etc. Estas partículas (bacterias. Se denomina reacción de aglutinación al fenómeno en que la mezcla de las partículas de antígeno con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas antigénicas. pero en algunos casos se necesita el examen microscópico de la preparación estudiada. En efecto dichas pruebas permiten habitualmente descubrir hasta 0. como el tifus endémico).). En la membrana de los glóbulos rojos de cualquier persona normal se pueden encontrar determinados antígenos (antígeno de superficie o determinantes antígenos). La concentración del anticuerpo aglutinante se define como la mayor dilución de antisuero que aglutina el antígeno examinado. etc. una baja concentración de anticuerpos IgM produce una reacción de aglutinación cuya intensidad es igual a la que se produce con una elevada concentración de anticuerpos IgG. eritrocitos. En general las pruebas de aglutinación son fáciles de prac ticar. en pruebas inmunitarias del embarazo. bastante reproducibles y sumamente sensibles. INTRODUCCION: Frecuentemente los antígenos se asocian con partículas que son demasiado grandes para formar soluciones o suspensiones coloidales en los medios acuosos. en la Prueba de Weil Felix (en pacientes con enfermedades provocadas por Ricketsias. El mecanismo de una reacción de aglutinación es semejante al de las reacciones de precipitación. tanto para medir antígenos como para determinar las concentraciones de los anticuerpos. Algunas personas . Las pruebas de aglutinación tienen muchos usos en el laboratorio clínico. Por lo tanto no es sorprendente que los anticuerpos IgM. en la superficie de los eritrocitos del donador (Prueba indirecta de Coombs). en las condiciones empleadas en la prueba. con cinco sitios eficaces de fijación de antígeno por cada moléculas de 19S tengan una actividad aglutinante superior a la de los anticuerpos IgG con dos sitios de fijación de antígeno por cada molécula. otras personas tienen otro tipo de antígeno de superficie que se llama antígeno B (eritrocitos tipo B). para descubrir la presencia de anticuerpos del receptor.1 Ugr de anticuerpos/ml de suero Las pruebas de aglutinación se utilizan rutinariamente en las pruebas cruzadas con sangre antes de administrar transfusiones endovenosas en pacientes. dirigidos contra el mismo antígeno. en la Prueba de Widal (en pacientes infectados con bacterias gram negativas como Salmonella. Estas diferencias dependen principalmente de la valencia del sitio de fijación del antígeno en las diversas clases de los anticuerpos.94 PRACTICA N° 37 EFECTO DE LA OSMOLARIDAD SOBRE LOS HEMATIES I. Los anticuerpos de las distintas clases de inmunoglobulinas difieren en su capacidad de producir reacciones de aglutinación. Brucella. Algunas personas son poseedoras de un antígeno de superficie designado en forma arbitraria como antígeno A (eritrocitos tipo A). partículas de látex. En otras palabras. Al igual que las reacciones de precipitación las pruebas de aglutinación requieren de un pH apropiado y de la moralidad de amortiguadores salinos y debe existir una proporción adecuada de antígeno respecto del anticuerpo. en el diagnóstico de las anemias hemolíticas por autoinmunidad (en la que los pacientes producen anticuerpos para las membranas de sus propios eritrocitos). pueden quedar suspendidas en una solución salina y mezclarse con antisueros específicos. en la prueba del factor reumatoideo (en pacientes con artritis reumatoides). Por lo general la aglutinación puede observarse a simple vista. La única diferencia entre una reacción de precipitación y otro de aglutinación es que los antígenos son moléculas pequeñas en tanto que los antígenos aglutinantes están asociados con partículas de mayor tamaño. Pasteurella).

Utilizando los símbolos (+ )= positivo y (-)= negativo complete el cuadro de aglutinación de los grupos sanguíneos ABO: . para eliminar los anticuerpos inespecíficos adicionados a la superficie de los glóbulos rojos. porque producen aglutinación de los glóbulos rojos que poseen el correspondiente antígeno y porque los antígenos son de origen humano (iso=de una misma especie). se ha sugerido que las inmunizaciones inaparentes durante la infancia y el comienzo de la niñez pueden ser responsables de la producción de anti A o anti B. Por otra parte. ya que su propio antígeno A. Como existe un desarrollo gradual de estas isoglutininas. y Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos lavados. II. y Obtener muestras de sangre tipo A y tipo B. del tipo A y B en solución salina fisiológica. pero aumentan con rapidez su titulación en los primeros meses de vida. CUESTIONARIO: 1. ACTIVIDADES INSTRUCCIONALES: Procedimiento. y y y y IV. De acuerdo con esta hipótesis todos los recié nacidos n están expuestos a los antígenos A y B.  Identificación de isoaglutininas en suero: y De uno de los estudiantes de cada grupo (o masa) de trabajo. En cada extremo de una lámina porta objetos poner una gota del suero recientemente obtenido y marcar 1 y 2 respectivamente. aunque quizá sea más realista una cifra de 5000. en el suero existe también normalmente anticuerpos contra los antígenos A y B. La misma lógica explicaría que una persona del grupo B forma sólo anti A y no anti B. y Llevar los glóbulos rojos sedimentados con suero fisiológico por tres veces.95 pueden tener ambos antígenos A y B (eritrocitos AB) y una cuarta posibilidad es que no tengan ninguno de los antígenos mencionados (eritrocitos tipo 0 o H). Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo B sobre la gota de suero con marca 2 y mezclar. Pero una persona del grupo A forma sólo anti B y no anti A. III.000. Observar si hay o no aglutinación de los glóbulos rojos en 1 y/o en 2 de isoaglutininas en el suero problema del estudiante y deducir el grupo sanguíneo que posee. le ha conferido una tolerancia inmunológica específica hacia él. previamente identificadas. y Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos y descartar el plasma. llamados isoaglutininas. REACTIVOS A UTILIZAR: y Kit para identificar grupos sanguíneos (Diagnóstica). tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y obtener el suero por centrifugación. Los antígenos aparecen a comienzos de la edad fetal en cuanto se forman los eritrocitos . Los antígenos de superficie A y B son llamados también aglutinógenos y se ha estimado que pueden haber hasta un millón de sitios antigénicos A o B en un solo hematíe. Estos anticuerpos (isoaglutininas) son del tipo IgH y son poco detectables en los sueros de los recién nacidos. con hepsrina como anticoagulante. Agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos tipo A sobre la gota de suero con marca 1 y mezclar. Es un hecho bien conocido que muchas bacterias instestinales (salmonellas y shigellas) tienen antígenos que reaccionan en forma cruzada con los antígenos humanos AB0 (H).

¿Qué aplicaciones de las reacciones antígeno anticuerpo puede señalar? 5. (G. SANG) A B O AB ANTICUER.96 SUERO DEL GRUPO O B A AB ( ( ( ( AB ) ) ) ) ERITROCITOS DEL GRUPO A B ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( ) ) ) ) ( ( ( ( C ) ) ) ) 2. En el siguiente cuadro anote los anticuerpos en el suero: GRUPOS SANGUÍNEOS ABO ANTIGENOS EN LOS POS ERITROCI. Diga usted ¿Por qué ya no es costumbre corriente utilizar sujetos de tipo O como ³donadores universales´ y personas de tipo AB como ³receptores universales´? 3. EN EL SUERO Anti Anti Anti Anti POSIBILIDADES DE TRANSFUSIÓN Puede recibir Puede donar De A AyO ByO O Todos (receptor Universal) A y AB B y AB Todos (donador Universal) AB 4. ¿Cuál es el fundamento de las reacciones antígeno-anticuerpo? .