Neusely da Silva Valéria Christina Amstalden Junqueira Neliane Ferraz de Arruda Silveira Marta Hiromi Taniwaki Rosana Franscisco

Siqueira dos Santos Renato Abeilar Romeiro Gomes Margarete Midori Okazaki

MANUAL DE MÉTODOS DE ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS

São Paulo LOGOMARCA VARELA 3ª edição 2007

cap 01- cap 07.p65

1

1/7/2007, 23:50

Projeto gráfico: Danclar Rossato - (55) 30284824 - e-mail: drossato@via-rs.net Capa: Danclar Rossato Revisão: autor Figuras: autor Impressão: Pallotti - SM Tiragem: ????????????????

E24

Educação inclusiva e necessidades educacionais especiais / Soraia Freitas, David Rodrigues, Ruy Krebs (orgs.).– Santa Maria, Ed. UFSM, 2005. p. ISBN: 1. Educação 2. Educação especial 3. Inclusão escolar 4. Inclusão social 5. Portadores de necessidades especiais I. Freitas, Soraia Napoleão II. Rodrigues, David III. Krebs, Ruy Jornada CDU 376.1/.5

Ficha catalográfica elaborada por Maristela Eckhardt CRB-10/737 Biblioteca Central - UFSM

Obra financiada pela CAPES, entidade do Governo Brasileiro voltada para a formação de Recursos Humanos.

Direitos reservados à Editora da Universidade Federal de Santa Maria Prédio da Reitoria – 2º andar – Campus Universitário Camobi – 97105-900 – Santa Maria – RS Fone/fax: (055)3220.8610 e-mail: editora@ctlab.ufsm.br

cap 01- cap 07.p65

2

1/7/2007, 23:50

Sumário

Capítulo 1. Coleta, transporte e estocagem de amostras para análise
1.1. Introdução ................................................................................................................................................. Lote ........................................................................................................................................................... Amostra de lote e unidade de amostra ................................................................................................. Planos de amostragem de lotes .............................................................................................................. Unidade analítica .................................................................................................................................... 1.2. Material necessário .................................................................................................................................. 1.3. Coleta de amostras para análise ............................................................................................................. 1.3.1. Seleção e preparação de frascos para coleta de alimentos acondicionados em embalagens não individuais ....................................................................... 1.3.2. Procedimentos para a coleta de alimentos acondicionados em embalagens não individuais ......................................................................................................... 1.3.3. Coleta de alimentos envolvidos em casos de doenças de origem alimentar (DTAs) ............ 1.3.4. Coleta de amostras de água ......................................................................................................... 1.4. Transporte e estocagem de amostras até o momento da análise ....................................................... 1.4.1. Transporte e estocagem de alimentos com baixa atividade de água ...................................... 1.4.2. Transporte e estocagem de alimentos congelados .................................................................... 1.4.3. Transporte e estocagem de alimentos refrigerados .................................................................. 1.4.4. Transporte e estocagem de alimentos comercialmente estéreis em embalagens herméticas ......................................................................................................... 1.4.5. Transporte e estocagem de amostras de água ........................................................................... 1.5. Recepção de amostras para a análise ..................................................................................................... 1.6. Referências ...............................................................................................................................................

Capítulo 2. Preparação de amostras para análise
2.1. Introdução ................................................................................................................................................ 2.2. Material ncessário .................................................................................................................................... 2.3. Homogeneização da amostra e retirada da unidade analítica ........................................................... 2.3.1. Procedimento para a homogeneização e retirada da unidade analítica de produtos líquidos .................................................................................................................... 2.3.2. Procedimento para a homogeneização e retirada da unidade analítica de produtos sólidos ou líquidos concentrados .......................................................................... 2.3.3. Procedimento para a retirada da unidade analítica pela técnica do esfregaço de superfície .......................................................................................................... 2.3.3.1. Amostragem com “swabs” ............................................................................................... 2.3.3.2. Amostragem com esponjas .............................................................................................

3

cap 01- cap 07.p65

3

1/7/2007, 23:50

....................................................................... 2....... 3.......................4.......... Como obter a 2º diluição (10-2) ....... Filtração em membrana ...... 3................................................................... Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras obtidas por esfregaço de superfície ou por lavagem superficial .......................... Teste de diluição múltipla ............4...................................................................................................... Procedimento para a retirada da unidade analítica pela técnica da lavagem superficial ................... Cálculo dos resultados ................................................................................................. c.................................................................................... Plaqueamento em superfície (“spread plate”) .............2................................................................ Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra ..................................................... 4.........3............. 4 cap 01.......... Composição de amostras a seco ........................................ 2................................................ Diluentes para os ensaios gerais de quantificação .........3.....................................................................................................3....................5.. a) Pré enriquecimento ................................................................................................ Plaqueamento em gotas (“drop plate”) ..............................................2......................2.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 2................. Introdução .................................p65 4 1/7/2007........................................... Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras sólidas ou líquidos concentrados ............4...........cap 07.......... 4. Introdução .................................................................................. 2............................................................................................................................... Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras líquidas ...........................................................3..............................................................5............................................................................................. Contagem das colônias e cálculo dos resultados . Capítulo 3................................................................................. Capítulo 4....................6............... Procedimento .............................................. Guarda de contra-amostras .................. 2........................4............... 3.............................................................. Referências ...................................................................................... Plaqueamento em profundidade (“pour plate”) ............................................1...................................... Técnicas básicas de contagem de microrganismos pelo Número Mais Provável 4........................ Como obter as diluições subsequentes .......................................... Técnicas básicas de contagem de microrganismos em placas 3.............2...................... 3.................... Preparo da 1º diluição da unidade analítica ............................ Como obter uma diluição inicial diferente de 1:10 ...............................................................1) Técnica de inoculação por estrias de esgotamento para obter culturas puras .................................... 2.... Procedimento para a lavagem de outros alimentos ...........................................1........................5.................................................. b) Enriquecimento seletivo ........... 23:50 .....................4..... 3...........................4.......................................... Introdução ............................................................. d) Seleção de colônias e repique de culturas para confirmação .......................4............. Técnicas básicas de detecção da presença/ausência de microrganismos 5......................... 4.................. 5.... Procedimento para a lavagem de carcaças de aves .............. 3........................................................................1......................................................................................................................................................................... Teste de diluição única .......7................................................................................................. Composição úmida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento ............3.......................................... 2................................................................................6.......................3.................................. c) Plaqueamento diferencial ......................................................... Capítulo 5...5..............................................1................................... 2............ Material requerido nas análises ............... Como obter uma diluição inicial 1:10 (10-1) ..................................3... Diluentes para os ensaios de presença/ausência .......................................................3. Procedimento para a lavagem de embalagens ............................................................................... 4...........3.. 5................ Diluição decimal seriada da amostra .......................... Referências ...................................................................................................... Referências ..............................................................

....Sumário Técnica de repique de culturas puras a partir de colônias isoladas em placas .................................... Capítulo 6.......................................................1......... 9.............................3............3......... Métodos de análise ....... coli) .............................................. 8...................1.......................................................................................................1...................................... Método de contagem total de aeróbios mesófilos em placas ......................................................... Referências ............................................................................................................................ e) Testes de confirmação ..................... 9..................................... Defnição de coliformes termotolerantes ..........1...............3) Coloração de esporos (método de Ashby) .......3........................... Contagem de coliformes totais........2.............. Método de contagem de bolores e leveduras em placas ................... coliformes termotolerantes e Escherichia coli 9........................................................ Método de contagem de bolores termorresistentes .................................... Referências ................................................................................................ Método de contagem em placas de VRBG .................................2) Coloração de esporos (método de Schaeffer-Fulton) .....4................ Método de contagem total de aeróbios psicrotróficos ..............30 (Coliformes totais/E..... 9...................... 6........................................................5 Método do Petrifilm™ (coliformes totais/E............................................................. Contagem de bolores e leveduras 7............................................................................................................................................................................................ Contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em placas 6........... e............................................................................................. Introdução .......3..... 8.............................................................................................................5......................... Introdução ................. Taxonomia ................................................ Referências .........................................................................................................2............................................................................................................ 9............... Referências . Método de contagem de fungos psicrotróficos .............................................4) Montagens úmidas para observação microscópica a fresco ............................... Capítulo 7...........................p65 5 1/7/2007............................................................. coli ..................................... Métodos de análise ..... Introdução ........................................ 7.............................................. 23:50 ................................................................. 8........................................................... 5 cap 01.................... coli) .....................................cap 07...................... Capítulo 8.... 7................................... 6.. 6....................................... Referências ....... e... 7................. 7........................... Método do ColiComplete™ AOAC 992............ 6............ 5. coli) .........................................6.... e.... Método de contagem total de aeróbios mesófilos em Petrifilm™ .............................................. Definição de coliformes totais ............................................................................................1) Coloração de Gram (método de Hucker) ......................... Aplicação como indicadores .......................................4...................................................................5............................................................................... Contagem de enterobactérias 8.....................4...... Introdução ................................... 8..... Método do Número Mais Provável (NMP) ...................2...............................................................................................5........................................................................................ Método do Número Mais Provável (NMP) (coliformes totais/termotolerantes/E......... E..................... Método de plaqueamento em VRB (coliformes totais) ...................................... Método do Petrifilm™ ..................... Capítulo 9................................................................4...................................................................................................... 9.2.....................................................................4........ e.....................................................................

..............................................................................................2.......1........... Métodos de análise ............................. Bacillus cereus 11.. B.............Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Capítulo 10......... Referências ........................................... perfringens) ................................ Pediococcus ..................................... 10.......................................................... Introdução ..................................................3....................... Métodos de análise de C....................................................... 10.. 13...................... weihenstephanensis .......................................................................................p65 6 1/7/2007.........................................................5.............................................................................................................................................................................................. Introdução .............................................................................................. Principais características de S................................................................................... Importância em alimentos ............................................. B........ Leuconostoc ...................................... Método de contagem em placas (clostrídios sulfito redutores a 46ºC) .................................................................... 11...... Teste de presença/ausência (C............................................................................................................................ pseudomycoides ...... Staphylococcus aureus 10.......................................................3. 23:50 ..........................................................................2........................................................................................................................ Contagem de enterococos 13.....................................................................cap 07................................................................4.................................................... cereus ...... 10.................................................. perfringens ................................................................................................................................................................................................................... Clostrídios sulfito redutores a 46ºC ........................................2.......... Principais características de C.............1..... B..................................................... B..............................................3.................................................. Método de plaqueamento direto (C.......................... perfringens .....................................................................................4........................................ Métodos de análise de clostrídios sulfito redutores a 46ºC ......................................................... Referências .......................................................................................................... perfringens) ... .............. 12...................................................................................................................... 11......................................................................................................................................................................................1......................................................................................3......... Principais características de B.......................... Método de contagem direta em placas ......... 12.... Referências ............................................................................1............................................................... Método de contagem em placas ........................................................................................................................ Clostrídios sulfito redutores e Clostridium perfringens 12...................................................... Capítulo 13......................................................... 10....................................................................... thuringiensis ......... Introdução ... 13.......................................................................................................................................... Teste de presença/ausência ... mycoides ..................................... 12....................... Introdução ....................... 13.......... Introdução ............................................................... Capítulo 11................. Método do Número Mais Provável (NMP) .......5....... Referências .......................................... Métodos de análise ...............................................4.....................................4......................................... cereus ......................................................... Capítulo 12...................1........................................ 11..... B.... Métodos de análise ...................... Capítulo 14 Contagem de bactérias láticas 14................... Grupo B.... aureus ................................................................. Streptocccus ............ Método do Número Mais Provável (NMP) ..... 6 cap 01......................................................................................2................................................ anthracis .............................. Método de contagem direta em placas ......... 12......................... Método do Número Mais Provável (NMP) .........................................

...........................................................2............................................................ 23:50 ...... Métodos de análise ................... Referências .....................................4. Introdução ............................................................................................................................................p65 7 1/7/2007........ 15................................................................3.............................. Características nutricionais e de crescimento ................. 16............................................................................................ Referências .............................................................................................................................................................................................. Método de contagem em placas ........ Taxonomia ..................................................................................................................................................................................... Método de presença/ausência ISO/TS 22964 (2006) ......................................................................................Sumário Lactobacillus .... Vagococcus ............................................................................................ Tetragenococcus ...............2......................................... Método BAM/FDA ........................ Introdução .... 14.......................... Patogenicidade ........................................................................ coli O157:H7 em alimentos ...............3.............................................. 17........... Escherichia coli O157:H7 17........................................................................... 7 cap 01..................................................................................................... Referências ............................................................ Capítulo 18.............. Método de presença/ausência ISO 10272-1 (2006) ............................................................................................................................................2............... Listeria monocytogenes 18............................................................................................................................................................................................................ Taxonomia ...................................................................................1..................................................................................... Enterococcus .......................................................... Oenococcus .... Ecologia ................ Capítulo 16.......................................................................................................... E.......................................................................................................... 17............................................................................................................ Epidemiologia ..........................................................................................................................................................................................................................................cap 07............................................................... Métodos de análise ...........................................1..........................................................1..... Patogenicidade ............................................................................................................. 16.............................1....................................................................... Introdução ............................................................................................................................ 14................................................................................................. Métodos de detecção ................................... Métodos de análise ............................................................................ Taxonomia ........................... Weissella ............................................. Método do Número Mais Provável (NMP) ........................................................................................................................................... Sorotipagem ................. 14................................................................................................................................................................................... Métodos de análise ....................................................... Sorotipos STEC mais envolvidos em surtos .............................. Introdução ...................................................................... 15......................................................................................................................................................................................... Referências ........................................................................................3.......................... Patogenicidade ....... Enterobacter sakazakii 16...................................................................................................................................................................................... Capítulo 15.................2.................... Lactococcus ....... Campylobacter 15.................................................. Capítulo 17...................................................................... Carnobacterium ..................................................... Taxonomia ..............................................................................................................................................................3.....................................................................................................................

...................................... V............................................................................................................................................. Epidemiologia .............................................1.......................... Alicyclobacillus .................................................................. Introdução .............. Contagem de esporos de bactérias 22.. Características bioquímicas de Salmonella Epidemiologia ............................................................................................................................... Método ISO 6579 (2002)..........................1.................................... Métodos de análise ...................................................................... Yersinia enterocolitica 21............................................................................................... Epidemiologia .............................................................................................................................2................. Métodos de análise .......................... 19................................................ V........................................................................................................................................... Sporolactobacillus .................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................4................................... 18..............2.............................................................................................................................................................................................. Introdução .............................. Taxonomia ......... Método APHA/BAM/FDA (NMP de Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus) ............................ Clostridium ..............................................1................... Referências .... 21.....................................2............................................................................................................................................................................ vulnificus .............................. 18................... Método APHA de detecção ............................................................................................................................1............................................................................................................................................... Capítulo 22................................................................. Composição de amostras para a análise .................................... Bacillus ........................................................... parahaemolyticus ......... 20.................................................................. Método MLG/FSIS/USDA ........................................................ Referências .... Classificação taxonômica de Salmonella ........................... Salmonella 19...................................................................................... Desulfotomaculum .. Métodos alternativos de análise de Salmonella .............................................. Método APHA/BAM/FDA (presença/ausência de Vibrio cholerae) ........................................................ Introdução ......................................... Introdução ..................................5 Método BAM/FDA ..........1..................................................................... 8 cap 01.............................cap 07.................................... 18......... Vibrios patogênicos 20.............................................................................. 19....................... 19......3.................................Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 18....................................... 20...................................................................................................................................................p65 8 1/7/2007................................ Capítulo 20.............................................................................................................................. Taxonomia .... Referências .......... Taxonomia das bactérias esporogênicas importantes em alimentos ......................... Método de plaqueamento direto ........................................................ V.............................................................. Método MLG/FSIS/USDA ........................................................................4..........3.................................................................................... Classificação sorológica de Salmonella ......... Capítulo 21............................ Capítulo 19............................................4....1....................................................................................... Métodos tradicionais de análise de Salmonella ......................... cholerae ....... 22.................................3.....................2..................................................................................................... 19................................................3 Método BAM/FDA (2005) ....... 23:50 ...................5.................... Referências ................................................................................... 21............ 20..

..................................................3................ Dimensionamento de processos térmicos ................... Subprocessamento ....1.................................................................................2.....5........................................................................ Esterilidade comercial ou causa da deterioração 23...............................1.................................................................................................... Fontes de nutrientes em meios de cultura ..4.....................................1...................................8................................... Capítulo 23..4...................................... Introdução 24.......................................................................3......... 22................................. Esporos de bolores termorresistentes ................................................ 22.............................................................. 22....................... Parâmetros de avaliação da resistência térmica dos microrganismos ........................................................ 22................. Introdução .............................. 24............... Métodos de contagem de esporos de mesófilos anaeróbios ................... Métodos de contagem de esporos de termófilos anaeróbios produtores de H2S ......... Vazamento ................8.........................6.. Virgibacillus ....................... 23:50 .........................................................................1.......................... Referências ..........................1....................................................................... Ingredientes utilizados na formulação de meios de cultura .1....................1... 23.................................................... 24......................................... Teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração de alimentos ácidos ......Sumário 22.......1....................................................................................................................2....................... 23..........3...............................3............................................................... Valores D e z de microrganismos de importância em alimentos ........................................................1.......1........................................... Métodos de contagem de esporos de termófilos aeróbios totais e “flat sour” ....................................................................p65 9 1/7/2007.................1.............................. Agentes tamponantes ........................................... Ágar ...............................................................1.....................7..........2................................................................................. Causas não microbianas de deterioração .................. Aneurinibacillus ........................................................... Thermoanaerobacterium ...........................................1.................................. Paenibacillus ... Geobacillus ....................................................................... 23.....................................1....................................................................... 23..........................1....... Curva de destruição térmica e coeficiente de temperatura (valor z) .................. Deterioração por termófilos estritos ................1.............................. 23......... 22.. Agentes redutores .... 23.............................................................................................................. Agentes diferenciais ... 23....................................... Capítulo 24.......................... Esporos de bactérias ...........................................................................1..................................................... 24...........................................4..... 9 cap 01............ Deterioração microbiana de alimentos enlatados ......................................... Multiplicação microbiana antes do tratamento térmico ....................................................... 24..1.....................cap 07...................... Células vegetativas ........................................... 24..... Referências ....................................4......... Número de reduções decimais .............. Água para o preparo de meios e reagentes ..5........1..........1.. Teste de esterilidade comercial e determinação da causa da deterioração de alimentos de baixa acidez ..................................... 22...............1....................1......1.............................7.......................................................... Cuidados na preparação de meios de cultura e reagentes para análises microbiológicas 24....... Agentes seletivos ....................... Substratos cromogênicos e fluorogênicos ..................... Brevibacillus ...... Métodos de detecção de esporos de termófilos anaeróbios não-produtores de H2S .... 24........................... 24.................................................................1....................6................. 24.... Métodos para detecção ou contagem de Alicyclobacillus ...1........... Curva de sobrevivência e tempo de redução decimal (valor D) ........................... Métodos de contagem de esporos de mesófilos aeróbios ...................................................................................................................1........2..........................................

........................................... 25.... 24........ Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas 25................................................... Procedimento para a preparação de meios de cultura .....................................7..................................3........................................................................................................................................ Preparo de meios e reagentes para as análises ............................................ Pesagem e rehidratação . 24... 24...................1............................................................... Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em alimentos.............................10.............................................3.................... Esterilização pelo calor úmido ......................................... Controle de qualidade do material ............................. Esterilização ........................................ 24.....................2..p65 10 1/7/2007................................cap 07...................... Estocagem dos meios esterilizados até o momento do uso .......................2..................................2........... Preparo de vidraria nova .........2...........................2....... Distribuição ......1.................2.................................... Dissolução e dispersão ......................................................... Anexo 2................ Armazenamento dos insumos para preparo de meios de cultura...... Anexo 1............................... 25.......... 24.......................... Referências ............................ Descontaminação e descarte de resíduos contaminados ...........2......6... 24................................ 24......................... 23:50 .............................. 21.....9................2............................................2............................................................... 24... Preparação dos suplementos para meios de cultura .......................... Resolução RDC No 12 de 02 de janeiro de 2001 ....................... Referências Capítulo 25.................2....... Esterilização por filtração ..2........................................................2.......... 25.........8....................................... Anexo 3............................................................................... 25.........5................................... Verificação e ajuste do pH antes da esterilização .................................6... 25..........3........................................ Acondicionamento ....................11................Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 24.............................................................7......................4.4.............. Classificação dos meios de cultura .. Lavagem .............................................. 21... 24.. 25............................................. Verificação do pH depois da esterilização ......................................5...................2.2........1.... 24.. Preparação dos meios no momento do uso ....................................................................................................... 24.. 10 cap 01...2......................................................

p65 11 1/7/2007. porque ainda não foram publicados os volumes do Bergey’s Manual para Gram positivos. online) e últimas edições das normas ISO. moderno e atualizado. Esse material oferece uma base teórica sólida. São métodos oficiais da American Public Health Association (APHA). Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (APHA. Food and Drug Adminstration (FDA). 18a edição. 23:50 . 2o Ed (2005). Food Safety and Inspection Service do United States Department of Agriculture (FSIS/USDA). que serão de grande valia para pessoal técnico em formação.Apresentação Desde sua primeira edição. 17a edição. Para bactérias Gram negativas. 11 cap 01. em 1997. sem formação de nível superior. atualizado por capítulos. com a metodologia recomendada pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). O texto foi preparado para atender tanto aos profissionais com formação acadêmica. apresentando o que há de mais recente sobre o assunto tratado no capítulo. Standard Methods for the Examination of Dairy Products (APHA. Nessa terceira edição. uma revisão extensiva da literatura. 2005). quanto aos técnicos de laboratório. Official Methods of Analysis of AOAC International (AOAC. atualizado por capítulos. 4a Edição. Acreditamos que esse objetivo foi atingido: o manual oferece um material de conteúdo profundo. com técnicas básicas de microbiologia. online). ocorridas até dezembro de 2006. Para bactérias Gram positivas. 2001). foi utilizada a classificação e nomenclatura do International Journal of Systematic and Evolucionary Microbiology (revista oficial do International Committee on Systematic Bacteriology). 21a edição. com textos e esquemas que facilitam a compreensão. foram introduzidas as mudanças de nomenclatura das bactérias relevantes em alimentos. Foi introduzida.cap 07. do Ministério da Saúde. Bacteriological Analytical Manual (FDA. este livro foi preparado para fornecer um manual de métodos em português. todos os métodos foram revistos e atualizados. Microbiology Laboratory Guidebook (FSIS/USDA. 2004). no início de cada capítulo. Association of Official Analytical Chemists (AOAC) e International Organization for Standardization (ISO). Finalmente. mas apresentado de forma didática. 2005). de acordo com as novas edições do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (APHA. foi utilizada a classificação e nomenclatura do Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Foram introduzidos novos capítulos. que será de grande valia para a compreensão da metodologia e interpretação dos resultados.

sp. Endereço eletrônico: rosana@ital.sp.p65 12 1/7/2007.sp. presta consultoria a empresas públicas e privadas. desenvolvimento e inovação (P&D&I).sp. em Sydney-Australia. desenvolvimento e inovação (P&D&I) para o setor de alimentos. Marta Hiromi Taniwaki é bióloga. com vários livros e artigos científicos publicado no Brasil e no exterior. concentra suas atividades no estudo da deterioração de alimentos termoprocessados e no estudo de bactérias anaeróbias patogênicas de importância em água e alimentos.br. É vice diretora do Laboratório de Microbiologia do Instituto de Tecnologia de Alimentos de Campinas (ITAL).br.gov. Expert em micologia de alimentos. onde exerce atividades de pesquisa. com ênfase em pescado marinhos de água salgada e doce. órgão de pesquisa da Secretaria de Agricultura do Estado de São Paulo. Rosana Francisco Siqueira dos Santos é bióloga.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos DOS AUTORES Neusely da Silva é Engenheira de Alimentos.br. Pesquisadora do Laboratório de Microbiologia do ITAL. Endereço eletrônico: rarg@ital. Endereço eletrônico: vcaj@ital. concentra suas atividades no controle da qualidade microbiológica de alimentos.br. exerce atividades de pesquisa.br.gov. com mestrado em Ciências de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Valéria Christina Amstalden Junqueira é bióloga. Concentra suas atividades no estudo de Enterobacter sakazakii e métodos para sua detecção. Possui uma ampla experiência de consultoria a industrias privadas processadoras de alimentos principalmente em produtos contaminados por microrganismos anaeróbios patogênicos e deteriorantes. com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).gov.cap 07.gov. Renato Abeilar Romeiro Gomes é Engenheiro Agrícola. membro da International Commission on Food Mycology (ICFM). Diretor do Centro de Informação em Tecnologia de Alimentos (CIAL) do ITAL. desenvolvimento e inovação (P&D&I). Endereço eletrônico: nferraz@ital. Endereço eletrônico: neusely@ital.br.gov. É diretora do a Unidade Laboratorial de Referência em Microbiologia do ITAL. Pesquisadora do Laboratório de Microbiologia do ITAL. 23:50 . na área de higiene e legislação de alimentos. avaliação e validação de novos métodos de análise microbiológica de água e alimentos. com Doutorado na Universidade de New South Wales. Exerce atividades de pesquisa. alimentos servidos em refeições coletivas e produtos cárneos. concentra suas atividades na divulgação de informações tecnológicas para o setor de alimentos. incluindo Clostridium perfringens e Clostridium botulinum. Endereço eletrônico: mtaniwak@ital. Gerente do Laboratório de Microbiologia do ITAL.sp.sp. frutas e hortaliças minimamente processadas. com Doutorado em Ciências de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).gov. Sua área de concentração é o desenvolvimento. Neliane Ferraz de Arruda Silveira é bióloga com Doutorado em Tecnologia de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). 12 cap 01. com mestrado em Engenharia Agrícola pela Universidade Federal de Viçosa. para o controle de fungos e micotoxinas em alimentos. adequação.

lote geralmente é a quantidade de alimento produzida dentro de um intervalo de tempo de funcionamento de uma linha de produção. sob as mesmas condições. independente de quantas ou quais unidades de amostra estejam contaminadas. é comum a prática de compor (misturar) as unidades de amostra. 23:50 .cap 07. Quando diferentes ou complementares às do Compendium. No caso de alimentos acondicionados em embalagens individuais. específicas para a análise de produtos lácteos e de normas da International Organization for Standardization (ISO 6887-4:2003. retirada ao acaso. foram também incluídas recomendações da 21ª Edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice. da 17ª Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank. cujo padrão em alimentos é ausência em qualquer das unidades de amostra. Planos de amostragem de lotes 13 cap 01. químicas e sensoriais.1 INTRODUÇÃO A maioria das recomendações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). é composta de n embalagens individuais. 2004). Amostra de lote e unidade de amostra Amostra de lote é uma fração do total produzido. para realizar um único ensaio. A partir do conjunto de resultados da análise das n unidades de amostra. recomendadas para ensaios realizados com metodologia ISO. As embalagens ou alíquotas individuais são chamadas de unidades de amostra e.Capítulo1 Coleta. Maiores detalhes são apresentados no capítulo específico de Salmonella. Nas análises de Salmonella. Alguns termos utilizados ao longo do texto são oriundos da terminologia relacionada com a amostragem de lotes e devem ter seu significado corretamente compreendido: Lote Lote é definido como uma quantidade de alimento de mesma composição e características físicas. é composta de n alíquotas do produto. mas o resultado da análise de uma única unidade de amostra não pode ser tomado como representativo do lote. sem interrupção. são analisadas separadamente. para avaliar as condições do lote. 2005). descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito.p65 13 1/7/2007. é possível inferir as características de todo o lote. A presença na amostra composta é inaceitável. para a avaliação do lote. ISO 7218:1996). específicas para a análise de água. Transporte e Estocagem de Amostras para Análises 1. 2001). produzida e manuseada numa mesma batelada. Na prática. não acondicionados em embalagens individuais. No caso de grandes massas de alimentos.

O plano de três classes classifica os lotes em três categorias. mas não pode ser ultrapassado por nenhuma. contagem de bolores e leveduras. que pode ser atingido por algumas (c) unidades de amostra. Unidade analítica A unidade de amostra geralmente contém uma quantidade de produto maior do que a necessária para a análise. para a tomada de decisões a respeito dos lotes são: n: é o número de unidades de amostras a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote. dependendo dos resultados da análise das n unidades de amostra. aceitável. 23:50 . contagem de S. na composição das amostras devem ser consultadas e obedecidas as orientações dos capítulos relacionados aos ensaios específicos em questão. perfringens). Nos casos em que o padrão microbiológico é ausência. num dado alimento. São recomendados para ensaios qualitativos. por exemplo. Em um plano de três classes. uma para cada ensaio de presença/ ausência (Salmonella. Em um plano de duas classes. adotados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). c é o número máximo de unidades que podem ser aceitas com contagens acima do padrão m. c: dentre as n unidades de amostra que constituem a amostra representativa do lote. não quantitativos (Salmonella ou Listeria monocytogenes. aureus. separa o lote com qualidade intermediária aceitável do lote inaceitável. 2002). para serem analisadas individualmente. m: é o padrão microbiológico estabelecido para um dado microrganismo.cap 07. para os quais o padrão não é ausência. porém. contagem de bolores termorresistentes e outros). O número de unidades analíticas necessárias para a análise depende do número e tipos de ensaios que serão realizados na mesma unidade de amostra. O plano de duas classes classifica os lotes em duas categorias. Unidade analítica é a quantidade de alimento efetivamente utilizada na realização de um ou mais ensaios da unidade de amostra.p65 14 1/7/2007. contagem de coliformes totais/fecais/E. acima do padrão. M separa o lote aceitável do inaceitável. coli. há sempre o cuidado de se tomar quantidades suficientes para estocagem de contra-amostras e prevenção de perdas por acidente. cereus. São os mais aplicados no caso de ensaios de presença/ausência.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Sempre que se tratar da avaliação de lotes ou partidas. em que ausência é aceitável e a presença em qualquer das n unidades de amostra é inaceitável. aceitável ou inaceitável. porque. Os parâmetros utilizados nesses planos. 14 cap 01. qualidade intermediária mas aceitável e inaceitável. Os mais utilizados são os planos de duas ou três classes estabelecidos pela International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF. M: é um limite tolerável. As n unidades de amostra constituem a amostra representativa do lote. contagem de B. valores dentro de uma faixa entre m e M. Em um plano de três classes esse valor separa um lote aceitável de um lote com qualidade intermediária aceitável. contagem de C. mas sim. Para ensaios de presença/ausência. sendo uma para os ensaios gerais de quantificação (contagem total de aeróbios mesófilos. ao se coletar uma unidade de amostra. desde que não acima do limite M. Listeria monocytogenes e todos os outros que requeiram enriquecimento em caldo específico) e uma para cada outro ensaio que requeira tratamento diferenciado da amostra (contagem de esporos de bactérias. c é igual a zero e aplica-se o plano de duas classes. por exemplo) as unidades de amostra poderão ser compostas e realizada uma única análise. a tomada das n unidades de amostra deverá seguir um plano de amostragem estatístico adequado. como Salmonella.

p65 15 1/7/2007. Se o produto não permitir mistura. 15 cap 01. amostras de alimentos acondicionados em embalagens individuais devem ser coletadas e encaminhadas ao laboratório na sua embalagem comercial original. No momento da análise.cap 07. deve-se juntar o conteúdo dessas diversas embalagens em um único frasco estéril.2 MATERIAL NECESSÁRIO Frascos e utensílios para coleta • Frascos ou bolsas plásticas estéreis de capacidade variada • Espátulas • Facas • Colheres • Tesouras • Pinças • Caladores • Amostradores verticais de tubo duplo • Amostradores tipo “corer” • Furadeira elétrica e brocas esterilizadas • Caixas de isopor com gelo seco ou sachês de gelo reutilizável em gel Reagentes e diluentes • Etanol 70% • Solução de hipoclorito de sódio a 100mg/l • Solução 3% ou 10% de tiossulfato de sódio (Na2S2O3) • Solução 15% de EDTA • Solução Tamponada Glicerol Sal Equipamentos • Freezer com temperatura abaixo de 20oC negativos com termômetro calibrado • Refrigerador com temperatura entre 0 e 4oC com termômetro calibrado 1. No caso de alimentos contidos em tanques ou grandes embalagens. para compor a unidade analítica daquela unidade de amostra. Transporte e Estocagem de Amostras para Análises 1. Cada embalagem unitária do produto constitui uma unidade de amostra e devem ser coletadas tantas unidades de amostra quantas forem requeridas pelo plano de amostragem. Se a embalagem unitária contiver uma quantidade de alimento insuficiente para as análises e guarda de contra amostras. 23:50 . porções de peso aproximadamente igual. como parte de uma mesma unidade de amostra. deve-se coletar várias embalagens unitárias. de cada uma das embalagens unitárias. fechada e intacta.Coleta. deve-se tomar. sob condições assépticas. deve-se transferir porções representativas da massa total para frascos ou bolsas de coleta estéreis. misturando-se bem e retirar a unidade analítica da mistura. impossíveis de serem transportadas ao laboratório.3 COLETA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Sempre que possível.

b) Escolher frascos com tamanho adequado para a quantidade de alimento que será coletada. para facilitar a posterior homogeneização da amostra. para a separação da contra-amostra e prevenção de possíveis perdas. contaminação do ambiente de coleta com cacos de vidro e perda do conteúdo. de material não tóxico. 23:50 . pinças e fórceps estéreis para cortar pedaços menores do alimento. contagem de microrganismos viáveis menor do que 1 UFC/ml de capacidade. como blocos de pescados e frutos do mar. num teste de lavagem da superfície interna. Para definir a quantidade de amostra a ser coletada. a quantidade de produto necessária para compor a unidade de amostra. considerar que cada unidade de amostra deve conter. no máximo.) devem. autoclaváveis ou pré-esterilizados. aplicados conforme a orientação dos fabricantes e seguidos de 12 enxágües com água destilada estéril. no mínimo. colheres. retirar porções de diferentes partes do conteúdo. etc. aprovado para contato com alimentos e. até obter a quantidade de produto adequada para compor a unidade de amostra. Levar em conta.3. pinças. b2) Para compor uma unidade de amostra com porções de diferentes pontos de alimentos em grandes peças sólidas. para garantir que a distribuição dos microrganismos seja homogênea. 1.3. em diferentes partes de tanques ou grandes embalagens.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 1. ser esterilizados individualmente em autoclave (121oC/30 minutos) ou em estufa de esterilização (170±10oC/2h). antes da retirada da(s) unidade(s) analítica(s). tesouras. ou desinfetar o instrumento entre uma amostragem e outra. b1) Para coletar amostras de pó. três a quatro vezes esse valor. podem ser utilizados sem esterilização prévia. a imersão em etanol e combustão do álcool (não elimina esporos) e o tratamento com soluções desinfetantes. de preferência. deve-se usar facas. ainda. para a remoção dos resíduos.p65 16 1/7/2007.2 PROCEDIMENTOS PARA A COLETA DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EM EMBALAGENS NÃO INDIVIDUAIS a) Antes de iniciar a coleta da unidade de amostra.cap 07. b3) No caso de grandes blocos de alimentos congelados. blocos de ovo líquido. sendo recomendável utilizar. Não é recomendável o uso de frascos de vidro devido ao risco de quebra. de preferência. Frascos ou bolsas não estéreis que apresentem. etc. com comprimento suficiente para atingir o centro da massa de alimento. de preferência. caladores. Alguns outros métodos que podem ser utilizados como alternativa são a flambagem em chama. duas vezes o número de unidades analíticas que serão utilizadas nos ensaios. Evitar a retirada de porções das regiões próximas à superfície ou abertura do tanque ou volume. podem ser utilizados caladores ou amostradores verticais de tubo duplo. promover uma mistura de toda a massa de alimento. o fato de que os frascos de coleta não devem ser completamente preenchidos pelo alimento. três quartos de sua capacidade. b) Se não for possível promover a mistura da massa de alimentos antes do início da amostragem. com utensílios ou instrumentos adequados. Nesse último caso devem ser usados desinfetantes aprovados para superfícies de contato com alimentos..1 SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DE FRASCOS PARA COLETA DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EM EMBALAGENS NÃO INDIVIDUAIS a) Utilizar frascos ou bolsas com tampas à prova de vazamentos. c) Os frascos e utensílios não pré-esterilizados que serão utilizados na coleta (espátulas. Usar um amostrador estéril diferente para cada unidade de amostra coletada. o mais adequado é utilizar uma furadeira elétrica 16 cap 01. Retirar então.

g) Alimentos contaminados podem conter microrganismos perigosos para a saúde. não adianta coletar amostras de alimentos que tenham sofrido abuso de temperatura ou que já se encontrem em estado de parcial deterioração. Se não houver sobras das refeições suspeitas. e deixar escoar uma certa quantidade do produto. Essas amostras devem ser coletadas por pessoal bem treinado na manipulação de microrganismos. Em havendo interesse ou necessidade de coletar volumes 17 cap 01. Da mesma forma. Introduzir o instrumento na diagonal. não segurar os frascos ou bolsas diretamente acima da massa de alimento. previamente esterilizado. preparadas posteriormente sob as mesmas condições. o mais cedo possível. não manuseá-lo sobre os outros instrumentos pré-esterilizados. limpar a parte externa da saída com etanol 70%. Transporte e Estocagem de Amostras para Análises (com a broca previamente esterilizada) combinada com um funil estéril. utilizar um utensílio adequado para retirar as unidades de amostra. Liga-se a furadeira e as raspas congeladas do alimento vão-se dirigindo para a superfície. Os resultados dessas análises serão de pouca ou nenhuma utilidade para as conclusões da investigação. d) Ao retirar o instrumento de coleta cheio com o produto coletado. pode-se tentar uma das seguintes alternativas: coletar amostras de refeições similares. lacrada. f) Não tocar a superfície interna dos frascos ou bolsas de coleta e suas tampas. b4) Quando a coleta for feita através de torneiras ou tubulações. Assim. de onde podem ser transferidas para um frasco de coleta adequado. flambar. coletar amostras dos ingredientes e matéria-prima utilizados na preparação das refeições suspeitas e coletar os vasilhames onde as refeições suspeitas se encontravam acondicionadas. antes de iniciar a coleta.cap 07. A broca é inserida no funil (cujo diâmetro de abertura inferior deve ser apenas ligeiramente maior que o diâmetro da broca) e encostada no ponto do bloco que se deseja amostrar.3. sendo coletadas no funil.3. 23:50 . ciente dos cuidados necessários para sua própria proteção.4 COLETA DE AMOSTRAS DE ÁGUA O Capítulo 60 da 4a Edição do Compendium (Kim & Feng. 1. Essas amostras devem ser coletadas na embalagem original. nunca introduzir um frasco de coleta diretamente no produto. e) Abrir os frascos ou bolsas de coleta apenas o necessário para introduzir o produto e fechar imediatamente. rodar num círculo completo e retirar. b5) Para a amostragem de margarina e produtos similares (“spreads”) a ISO 6887-4 (2003) recomenda remover a camada externa (3 a 5mm) e retirar as unidades de amostra com um amostrador tipo “corer”. trazendo uma porção cônica do produto. c) Lembrar que a superfície externa dos frascos e bolsas de coleta não é estéril. 2001) trata da coleta de água engarrafada. considerada pelo Codex Alimentarius como alimento. pois respingos do alimento podem contaminar os que serão utilizados posteriormente. tratar cada amostra como se estivesse contaminada. Isso vai promover uma lavagem da tubulação e remover os resíduos acumulados. 1.3 COLETA DE ALIMENTOS ENVOLVIDOS EM CASOS DE DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR (DTAS) Coletar e analisar amostras de todos os alimentos suspeitos.Coleta. pois podem cair ou introduzir contaminantes no produto. Na dúvida. sem atingir o fundo. mas sim.p65 17 1/7/2007. se o material for resistente ao fogo. Entretanto.

1. bombear a água por 5 a 10min. sob condições assépticas. para estabilizar a temperatura da água antes da coleta. a parte 9000 da 21a Edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice. deve-se transportar e estocar amostras de alimentos da mesma forma como o produto é normalmente transportado e estocado na sua comercialização. para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. para impedir a continuação do seu efeito bactericida sobre a microbiota presente. no sentido contrário ao da mão. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril adequado. Para coletar amostras de água de poço ou cisterna com bomba.cap 07. Amostras de água com teor alto de metais (maior que 1.5 antes do uso. desinfetar o bocal com etanol 70% e. Essa quantidade é suficiente para neutralizar 5mg de cloro residual por litro de amostra. limpar a área externa da saída com uma solução de hipoclorito de sódio a 100mg/l ou com etanol 70%. agente quelante para reduzir a toxidade dos metais sobre os microrganismos. em condições assépticas.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos menores. Se não houver corrente de água. Isso é particularmente importante se o intervalo entre a coleta e a análise for maior do que quatro horas.1ml de uma solução 10% de tiossulfato de sódio. utilizar 0. sem a prévia neutralização do cloro. Direcionar a boca do frasco para a corrente de água e elevar ligeiramente. incluindo cobre e zinco. lagos ou reservatórios. Nas situações em que a concentração de cloro residual seja superior a 5mg/l. 0. segurar o frasco de coleta pela base e mergulhar abaixo da superfície da água. 2005) traz as seguintes orientações: Para coletar amostras de torneiras e tubulações. devem ser coletadas em frascos com EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético). para cada 100ml de água a ser coletada (372mg/l). para cada 100ml de amostra que se pretende coletar. a partir de embalagens de maior capacidade. As orientações abaixo devem ser observadas para garantir a integridade do produto até o momento das análises: cap 01. para que a água fique retida. As soluções de EDTA e tiossulfato podem ser adicionadas ao mesmo frasco. Para tanto. Para tanto. se o material for resistente ao fogo.1ml de uma solução 3% de tiossulfato de sódio (Na2S2O3). Essa quantidade é suficiente para neutralizar 15mg de cloro residual por litro de amostra. Se a amostra for coletada e enviada ao laboratório pelo próprio interessado. adicionar a solução de tiossulfato de sódio estéril imediatamente após a chegada da amostra. flambando. Ajustar o pH da solução em 6. Para coletar amostras de água de rios. 0. Reduzir o fluxo para coletar a amostra sem respingos para fora do frasco de coleta. empurrar o frasco para frente horizontalmente. Amostras de água clorada devem ter o cloro residual neutralizado imediatamente após a coleta.p65 18 1/7/2007. Se não houver uma bomba.3ml de uma solução 15% de EDTA. Para a coleta de outros tipos de água. com a boca para baixo. antes da esterilização. adicionar aos frascos de coleta. preparar os frascos de coleta com um peso na base e introduzir o frasco diretamente no poço. É necessário cuidado para não contaminar a amostra com material acumulado na superfície da água. Podem também ser utilizadas bolsas plásticas ou frascos estéreis. invertendo a embalagem várias vezes. para limpar a tubulação.0mg/l). antes da esterilização.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS ATÉ O MOMENTO DA ANÁLISE Como regra geral. Abrir totalmente a torneira e deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. deve-se homogeneizar todo o conteúdo. adicionar aos frascos de coleta. disponíveis comercialmente já contendo o tiossulfato de sódio. 23:50 .

podem manter temperaturas de refrigeração adequadas por até 48 horas. como regra geral. certos cuidados devem ser observados. por isso. pode ser utilizado gelo comum. 1. porém.p65 19 1/7/2007. não podendo sofrer descongelamento total ou parcial durante o transporte. Se o tempo de trânsito for prolongado e houver necessidade de usar gelo seco. entretanto. Caixas bem fechadas. Se a tampa da embalagem não vedar a entrada de gases e/ou se embalagem for permeável aos gases e/ou se tornar quebradiça com o frio. 23:50 . Exceções. desde que acondicionado em bolsas plásticas. 2001) recomenda que a temperatura de estocagem dessas amostras não seja superior a 20ºC negativos. as amostras devem ser congeladas e mantidas nas mesmas condições descritas para amostras congeladas. Devem. para evitar o acúmulo de líquido nas caixas. Geralmente um embrulho em papel grosso é suficiente para prevenir esse problema. estocagem entre 0 e 4. na maioria das situações. O transporte deve ser feito em caixas de isopor com gelo seco. Para certos produtos ou microrganismos as recomendações são diferenciadas: a) No capítulo específico para bactérias lácticas o congelamento não é recomendado. O Compendium (Midura & Bryant. Como regra geral. sendo recomendável o uso de sachês de gelo reutilizável em gel.4. com espaço amplo para gelo. Na impossibilidade de se proceder à análise no intervalo de tempo preconizado.Coleta. de preferência 24±2oC negativos.2 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS CONGELADOS Amostras de alimentos comercializados na forma congelada devem ser transportadas e mantidas congeladas até o momento da análise.4. não é recomendável o uso de gelo seco nas caixas de isopor. as embalagens de amostras não devem entrar em contato direto com as embalagens de gelo seco. 2001) recomenda. ser protegidos contra a umidade. 2001) recomenda que o transporte seja feito em caixas de isopor com gelo.4.3 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS REFRIGERADOS Amostras de alimentos comercializados na forma refrigerada devem ser transportados e mantidos sob refrigeração desde a coleta até o momento da análise. podendo ser transportados e estocados à temperatura ambiente. Na indisponibilidade de gelo em gel. A ISO 7218 (1996) recomenda estocagem entre 0 e 4oC (0 a 2oC para amostras altamente perecíveis como pescados e miúdos) e intervalo máximo de 24 horas entre a coleta e a análise. para prevenir a perda dos dados. para prevenir a perda dos dados. para evitar o congelamento. essas amostras não devem ser congeladas.1 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS COM BAIXA ATIVIDADE DE ÁGUA Alimentos desidratados. O produto não deve entrar em contato com o gelo seco porque a absorção do CO2 pode alterar o pH. secos ou concentrados são estáveis microbiologicamente. Transporte e Estocagem de Amostras para Análises 1.cap 07. A ISO 7218 (1996) recomenda temperatura abaixo de 18oC negativos. 1. suficiente para envolver todos os frascos de amostra. deve-se usar uma embalagem secundária.4oC e intervalo máximo de 36 horas entre a coleta e a análise. O Compendium (Midura & Bryant. Rótulos e etiquetas usados na identificação das amostras devem ser a prova d’água. O Compendium (Midura & Bryant. cap 01. Rótulos e etiquetas usados na identificação das amostras devem ser à prova d’água. devido à grande susceptibilidade desses microrganismos às injúrias pelo congelamento.

Na impossibilidade de se proceder à análise imediata. perfringens devem ser analisadas. que devem ser analisadas o mais rápido possível. A população diminui dois ciclos logarítmicos a 20oC negativos. imediatamente. da seguinte forma: transferir porções de 25g bolsas plásticas. 20 cap 01. tratar as amostras com Solução Tamponada Glicerol Sal (na quantidade requerida para atingir a concentração final de 10% na amostra) e estocar entre 55 e 60oC negativos. C. mas os sobreviventes podem ser recuperados após mais de cinco meses. Se o congelamento for inevitável. já debilitadas pela estocagem prolongada. 2001) destaca que Campylobacter é sensível ao ar. misturar porções de 25ml com igual volume da Solução Tamponada Glicerol Sal. o Compendium (Labbe. d) No capítulo específico para Campylobacter a ISO 10272-1 (2006) destaca a sensibilidade de Campylobacter ao congelamento e à secagem. não devendo ser congeladas ou mantidas sob refrigeração prolongada. O Microbiological Laboratory Guidebook (Ransom & Rose. indica Caldo Brucella suplementado com 10% de polivinil pirrolidina. à temperatura próxima de 10oC. podem sobreviver (mas não se multiplicar) uma a três semanas a 4oC (exceto no caso de leite cru). Para o transporte. também pode sobreviver dois a cinco meses a 20oC negativos. nas mesmas condições. O Bacteriological Analytical Manual (Hunt et al. adicionar 25ml da Solução Tamponada Glicerol Sal. Outras espécies. Uma vez abertos os frascos ou embalagens.cap 07.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos b) No capítulo específico para vibrios patogênicos recmenda-se que as amostras sejam estocadas sob resfriamento moderado (7-10ºC) e analisadas o mais rapidamente possível. a análise deve ser feita o mais rápido possível. Nas mesmas condições. Manter as amostras congeladas até o momento da análise. O Bacteriological Analytical Manual (Rhodehamel & Harmon. Congelar imediatamente. deve ser feito a 80ºC negativos. pois a estocagem por poucos dias sob refrigeração ou congelamento pode levar a uma redução de 3 a 5 ciclos logarítmicos na contagem em placas. Havendo necessidade de estocagem por mais de 48 horas. secagem. Para estocagem prolongada. Para amostras líquidas.. em “freezer” a 20-30ºC negativos. 23:50 . 2001) recomenda que sejam analisadas imediatamente ou refrigeradas por não mais de oito horas. devem ser usados agentes criopotetores (glicerol ou dimetil sulfóxido na concentração de 10% em relação à quantidade de amostra). Células velhas ou estressadas gradualmente adquirem forma cocoide e se tornam mais difíceis de cultivar. aquecimento. porque a temperatura ótima de manutenção é de 15-18ºC e a maioria das cepas não sobrevive bem a 4ºC. Para a estocagem congelada de “swabs”. congelamento e estocagem prolongada. 1998) destaca que Campylobacter é sensível ao congelamento e morre à temperatura ambiente. transferir as amostras tratadas para frascos não permeáveis ao CO2 (Nalgene ou equivalente) e transportar em caixa de isopor com gelo seco. se for garantida baixa tensão de oxigênio e proteção contra perda de umidade (exceto no caso de leite cru). excluir o ar das bolsas e misturar. se possível. c) No caso de C. porque a introdução de oxigênio é particularmente deletéria para as células. 2001) recomenda sejam refrigeradas pelo menor tempo possível. Durante a estocagem refrigerada (indica 4oC) pode ser sobrepujado pela microbiota psicrotrófica acompanhante nas amostras. de preferência por poucos dias. Indica estocagem à 3±2oC e análise o mais rápido possível. O congelamento das amostras é desaconselhado e. Para transporte e estocagem por período superior a oito horas. em caso de absoluta necessidade. recomendando que as amostras não sejam congeladas e que sejam protegidas contra a perda de umidade. baixo pH. em concentração dupla.p65 20 1/7/2007. podendo sofrer injúrias que dificultam a detecção. jejuni subsp jejuni pode sobreviver duas a quatro semanas sob refrigeração (4oC). preparar assepticamente a amostra para o congelamento.

cap 07.4 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE ALIMENTOS COMERCIALMENTE ESTÉREIS EM EMBALAGENS HERMÉTICAS Alimentos comercialmente estéreis com embalagens em condições normais. 23:50 . Para outros tipos de água. devem ser analisadas dentro de no máximo 6 horas após a coleta. não devendo ser congeladas (Fleming et al. g) Amostras de ovo líquido refrigerado devem ser analisadas. etc.. ou 8h. 2001). podem ser transportados e estocados à temperatura ambiente.Coleta. Se o congelamento for indispensável considerar na avaliação dos resultados que parte da microbiota pode ter sido perdida. Amostras de refrigerantes engarrafados. 2005) traz a seguinte orientação: a) Como regra geral.4. para quantificação de coliformes. O transporte e a estocagem devem ser feitos sob refrigeração (0 a 4ºC) e o intervalo entre a coleta e a análise deve ser o menor possível. h) Amostras de produtos vegetais fermentados ou acidificados não comercialmente estéreis devem ser estocadas sob refrigeração por não mais do que 24 horas. b) Para embalagens abertas ou amostras transferidas para outros frascos. 21 cap 01. comercializados à temperatura ambiente. sem necessidade de refrigeração. f) Amostras de moluscos e crustáceos (ostras. lacrada. também podem ser transportados e estocados nessas condições.. não sendo comum a ocorrência de esporulação nos produtos enlatados (Denny & Parkinson. transporte e estocagem sob refrigeração (não especifica a temperatura) e intervalo entre coleta e análise preferencialmente de 8h. O congelamento não é indicado para essas amostras. a partir da coleta. porque pode provocar injúria ou morte de vários microrganismos. não devendo ser congeladas (Ricke et al.5 TRANSPORTE E ESTOCAGEM DE AMOSTRAS DE ÁGUA O Capítulo 60 da 4a Edição do Compendium (Kim & Feng. transporte e estocagem sob refrigeração (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e análise não superior a 30h. mariscos. mexilhões. 1.4. se a análise destinar-se à confirmação de suspeita de deterioração por bactérias termófilas. 2001). c) Para a avaliação da conformidade de água não potável. a parte 9000 da 21a Edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice. b) Para avaliação da conformidade de água potável. transporte e estocagem sob refrigeração (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e análise não superior a 24h. a refrigeração é contra-indicada. 1. Por outro lado. A estocagem refrigerada permite a multiplicação dos psicrotróficos e o tempo de geração de vários desses microrganismos encontra-se dentro desse intervalo. não devendo ultrapassar 48h (ISO 7218:1996). 2001). 2001). Transporte e Estocagem de Amostras para Análises e) No capítulo específico para contagem de aeróbios psicrotróficos. camarões.p65 21 1/7/2007. recomenda-se que as amostras sejam analisadas no intervalo de seis horas. 2001) recomenda: a) Para água engarrafada na embalagem original. dentro de 4 horas após a coleta. não devendo ultrapassar 24h. se possível. porque as células vegetativas desses microrganismos usualmente morrem sob efeito do frio. Embalagens estufadas devem ser acondicionadas em bolsas plásticas devido ao perigo de vazamento de material de alto risco microbiológico. transporte e estocagem à temperatura ambiente. para a quantificação de heterotróficos (contagem total de aeróbios mesófilos em placas). transporte e estocagem sob refrigeração (menor que 10oC) e intervalo entre coleta e análise não superior a 8h. devendo ser protegidos contra exposição a temperaturas superiores a 45oC. não devendo ser congeladas (Midura & Bryant.

H. devem ser observadas as condições da embalagem e as condições em que foi feito o transporte. R.gov/~ebam/bam-toc. Compendium of Methods for the Microbiological 22 cap 01. Kluwer Academic/Plenum Publishers.169.9. LABBE. Chapter 60. D.: American Public Health Association (APHA).cfsan. F.F. pode-se proceder à análise. ISO 10272-1. In: DOWNES.p65 22 1/7/2007. furada. & FENG.). 2003. HUNT. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.: American Public Health Association (APHA).acesso em 23/03/06. Washington: American Public Health Association (APHA). p. D. Washington. P.G. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Chapter 51. p. Microbiology of food and animal feeding stuffs –General rules for microbiological examination. 2001. Chapter 62. violada.2001.E. as condições em que a amostra foi recebida devem constar da identificação da amostra e do laudo final de análise.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 1. Washington. Clostridium perfringens. bem como amostras transportadas sob condições inadequadas. K (eds.1-9. & TRAN. The International Organization for Standardization.).fda. p.M. Campylobacter. 21st Ed. 2002. 23:50 . & ITO. Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada.. McFEETERS.583-600. (Eds). por exemplo). Part 9000. F. K (eds. F.521-532. & BREIDT. New York (ISBN0-306-472627). Microrganisms im Foods 7. H. D. 2001. 1th ed. K (eds.G. HUNT. The International Organization for Standardization. 1st ed. and K. Washington. porém. 4587. Canned foods – Tests for cause of spoilage. p. ABEYTA. dependendo do tipo de embalagem. 2005.). J. disponível no site <http://vm. E. ISO 6887-4. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. M. & PARKINSON. In: DOWNES. Washington: American Public Health Association (APHA). tipo de produto e microrganismos investigados. In: DOWNES.P. DENNY. N.. DOWNES. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Horizontal method for the detection and enumeration of Campylobacter – Part 1: Detection Method.Regulamento Técnico Sobre Padrões Microbiológicos para Alimentos. 1996. ITO (ed. Seção 1.C. antes da aceitação do pedido de análise. Bacteriological Analytical Manual Online. 4th ed. C. ISO 7218. Diário Oficial da União. KIM. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. F.5 RECEPÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE Na recepção de amostras para análise no laboratório.573-576. P. FLEMING.html>.C. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products. & RICE. Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater. Resolução RDC 12 de 02 de janeiro de 2001 .). 2001. In: DOWNES. 2006.C..: American Public Health Association (APHA).W. Microbiological examination. R. p. 4th ed. F. Fermented and acidified vegatables. & ITO. Microbiological Testing in Food Safety Management. F. com corpos estranhos ou qualquer outro tipo de defeito. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples. Se o interessado estiver encaminhando amostra com embalagem já aberta ou com selo violado (comum no caso de amostras encaminhadas para responder a reclamações de consumidores. American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF). P. 1. & ITO. 2nd ed. P. 4th ed. In: EATON et al. Bottled water. 4th ed. K (eds. ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods). P.cap 07. and fish and fishery products. T. Chapter 7. P. 10 jan. 2001. C.6 REFERÊNCIAS AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA (ANVISA). & ITO.B. The International Organization for Standardization.). In: U S Food and Drug Administration (FDA). revised March 2001.

). S. P. revisão de janeiro de 2001.. B. <http://www.J. and preparation for analysis.473-481. In: DOWNES.G. F. RHODEHAMEL. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. K (eds. 23:50 .cap 07. K (eds. P.usda.fsis. 1998.13-23. American Public Health Association.. 2001. Chapter 2. S. Washington: American Public Health Association (APHA). p. Acesso em 20/04/2006. Clostridium perfringens. & HARMON. RANSOM. In: US Food and Drug Administration (FDA). Sampling plans.Coleta.asp>.fda. Chapter 16. C.). Washington. BIRKHOLD.C.. Washington: American Public Health Association (APHA). In: USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook 3rd Ed. F. & GAST. acesso em 30/03/06. Chapter 46.cfsan. S.F. 2001. T. p.E. 4th ed. Chapter 6. 4th ed. Egg and egg products. and enumeration of Campylobacter jejuni/coli from meat and poultry products. & ROSE. & ITO. R.M. G. 4th ed. Isolation. R.p65 23 1/7/2007. shipment. identification. Transporte e Estocagem de Amostras para Análises Examination of Foods.M. MIDURA. p.gov/ Science/Microbiological_Lab_Guidebook/index.325-330. & BRYANT.G.gov/~ebam/bam-toc. Chapter 34. sample collection. 23 cap 01. RICKE. 2001. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online. D. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. <http://vm.html>. E. In: DOWNES. & ITO.K.

cap 07. 23:50 .p65 24 1/7/2007.24 cap 01.

ISO 8261:2001. Se requerido. 2004). A preparação das amostras para a análise envolve três etapas.. Na indisponibilidade de uma capela de fluxo laminar. ISO 17604:2003).1. específicas para a análise de água. recomendadas para ensaios realizados com metodologia ISO. Antes de iniciar os procedimentos. verificando a necessidade ou não de luvas nos capítulos específicos de ensaios com patógenos.p65 25 1/7/2007. para prevenir a contaminação da amostra pelo ambiente e do analista pela amostra. ISO 6887-4:2003. não diretamente sobre as bancadas. descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito. em bom funcionamento. cloreto de benzalcônio a 500ppm. deve ter a chama azulada. Desinfetar todas as superfícies de trabalho com um desinfetante adequado (etanol 70%. trabalhar na região próxima à chama de um bico de Bunsen que. ISO 6887-3:2003. mas sim. Nunca pipetar com a boca. 23:50 . ISO 6887-2:2003. colocar luvas. foram também incluídas recomendações da 21ª Edição do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Eaton et al. a preparação da primeira diluição da unidade analítica e a preparação de diluições decimais seriadas. usando pipetadores. 25 cap 01. a ISO 7218 (1996) recomenda-se que sejam observados os seguintes cuidados para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas: Assegurar-se de que a área de trabalho está limpa e as portas e janelas fechadas. da 17ª Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank. Lavar as mãos e desinfetar com um desinfetante adequado ao contato com a pele. 2001).cap 07. ISO 7218:1996.Capítulo 2 Preparação de Amostras para Análise 2. para evitar correntes de ar. Depois de usados. hipoclorito de sódio ou outro composto de cloro a 200ppm são adequados) Assegurar-se de que todo o material necessário esteja disponível nas bancadas. específicas para a análise de produtos lácteos e de várias normas da International Organization for Standardization (6887-1:1999. para inoculação nos meios de cultura. Quando diferentes ou complementares às do Compendium. que são a homogeneização do conteúdo e retirada da unidade analítica. liberar o conteúdo de pipetas ou flambar alças de inoculação. 2005). INTRODUÇÃO A maioria das orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). Trabalhar preferencialmente no interior de capelas de fluxo laminar vertical. Evitar a formação de aerossóis ao abrir tubos e/ou frascos depois de agitar. acomodar as pipetas e outros utensílios em bandejas de descarte.

para análises posteriores da embalagem. descritos no Capítulo específico. abrir assepticamente e remover a tampa.2 • Solução de citrato de sódio (Na3C6H5O7. No caso de latas sem sistema “easy open”. pinças.1g/100ml) • Solução de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% • Tergitol-7 Aniônico ou Tween 80 • Sulfito de potássio (K2SO3) • Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 1N estéril • Solução de ácido clorídrico (HCl) 1N estéril • Solução alcoólica de púrpura de bromocresol a 0. se necessárias.p65 26 1/7/2007.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Todos os instrumentos e utensílios utilizados na abertura das embalagens e retirada das unidades analíticas (tesouras. caixinhas e outras embalagens destinados ao teste de esterilidade comercial. hipoclorito de sódio ou outro composto de cloro a 200ppm • Água Peptonada 0.4±0.4±0. devem ser seguidos procedimentos diferenciados. desinfetar a área externa com etanol 70%. etc. usar um abridor de latas estéril. para remover os contaminantes presentes.5±0. espátulas. Esses procedimentos objetivam garantir a integridade da selagem.2 • Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em 8. como estufamento.04% Equipamentos • Capela de fluxo laminar vertical • Bico de Bunsen • “Shaker” 26 cap 01. No caso de latas. 23:50 . facas.2 • Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8. cortar com uma tesoura estéril.2 (PB) • Água Salina Peptonada (H 2Osp) • Água Peptonada Tamponada (BPW) • Solução de Ringer ¼ de concentração • Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio • Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7.) devem ser previamente esterilizados (em autoclave ou estufa de esterilização) ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.cap 07.2 • Solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com anti espumante e pH ajustado em 7.2. vazamento. No caso de latas com sistema de abertura tipo “easy open”. Antes de abrir as embalagens. vidros. odor e/ou aparência estranha. etc. desrosquear e remover a tampa assepticamente. No caso de embalagens flexíveis.1% (H2Op) • Tampão Fosfato pH 7. presença de corpos estranhos. No caso de embalagens rígidas com tampa rosqueável. Observar e anotar qualquer anormalidade nas embalagens ou no conteúdo interno.5±0. 2.MATERIAL NECESSÁRIO Reagentes e diluentes • Etanol 70% • Solução de iodo • Cloreto de benzalcônio a 500ppm.2H2O) 2% • Leite em pó desnatado dissolvido em Tampão Fosfato (0.

a contagem de bactérias lácticas. a contagem de bolores e leveduras. Listeria monocytogenes.p65 27 1/7/2007. 23:50 . É requerida uma unidade analítica para cada ensaio (Salmonella. O número de unidades analíticas que devem ser retiradas e a quantidade de material em cada unidade analítica depende do número e tipos de ensaios que serão realizados na mesma amostra.cap 07. Vibrio cholerae. coli. cereus e a contagem de C.Preparação de Amostras para Análise • • • • • • • • Refrigerador com temperatura abaixo de 4oC com termômetro calibrado Banho maria com temperatura regulável na faixa de 30 a 45ºC. a contagem de B. De maneira geral são necessárias: a) Unidades analíticas para os ensaios de presença/ausência com enriquecimento em caldo específico. É requerida uma unidade analítica para cada ensaio (esterilidade comercial. Escherichia coli O157:H7. a contagem de S. Os ensaios gerais de quantificação compreendem a contagem total de aeróbios mesófilos ou psicrotróficos. a contagem de coliformes totais/fecais/E. Yersinia enterocolitica. A ISO 27 cap 01. A quantidade de material em cada uma dessas unidades analíticas é definida nos capítulos específicos para esses ensaios. perfringens. Enterobacter sakazakii. a contagem de enterobactérias. Vibrio vulnificus). contagem de esporos de bactérias. aureus. contagem de bolores termorresistentes e outros). Campylobacter sp. geralmente é de 25 gramas ou mililitros da amostra. no Brasil. Esses ensaios são feitos com a mesma unidade analítica que. HOMOGENEIZAÇÃO DA AMOSTRA E RETIRADA DA UNIDADE ANALÍTICA Unidade analítica é a quantidade de material retirado da amostra para ser utilizado na realização de um ou mais ensaios. com termômetro calibrado Furadeira elétrica e brocas esterilizadas Balança calibrada Agitador magnético com barras magnéticas esterilizadas Liquidificador Homogeneizador peristáltico (“stomacher”) Agitadores tipo “vortex” Instrumentos e utensílios • Tesouras • Pinças • Facas • Martelos • Espátulas • Bagetas de vidro • Pipetas de capacidade variada • Funis estéreis de capacidade variada • “Swabs” e esponjas para amostragem de superfícies • Moldes para amostragem de superfícies • Bandejas de descarte 2. A quantidade de material em cada uma dessas unidades analíticas também é definida nos capítulos específicos para esses ensaios. a contagem de enterococos. c) Unidade analítica para os ensaios gerais de quantificação.3. Vibrio parahaemolyticus. b) Unidades analíticas para os ensaios com tratamento diferenciado da amostra.

que define os procedimentos mais adequados de homogeneização e retirada da unidade analítica de diferentes tipos de alimentos. em 7 segundos. Entretanto.1. Se houver formação de espuma. 2. inverter a embalagem 25 vezes. O Compendium (Midura & Bryant. Assim. devendo ser consultado o Anexo 2. na embalagem original. seguir as orientações do Anexo 2. A O Compendium (Midura & Bryant. O uso de um banho com temperatura controlada e agitação é recomendável. 2001) recomenda que a incerteza da medição da massa não seja maior do que 0.1. 10g para sólidos ou 10ml para líquidos.cap 07. para garantir que a porção removida seja representativa de todo o material. PROCEDIMENTO PARA A HOMOGENEIZAÇÃO E RETIRADA DA UNIDADE ANALÍTICA DE PRODUTOS LÍQUIDOS No caso de amostras líquidas (viscosidade não maior que a do leite) acondicionadas em frascos com espaço suficiente para a agitação.2. 2001) não estabelece limite para a incerteza da medição do volume que. agitar em “shaker” até a completa expulsão dos gases (essa etapa pode ser dispensada se a unidade analítica for transferida diretamente para o frasco de filtração.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 6887-1 (1999) recomenda que seja de. às do Compendium. A ISO 6887-4 (2003) recomenda descongelar sob refrigeração (0 a 4oC) por não mais de 24 horas. também. Se não houver espaço livre para agitação. Os procedimentos para se conseguir uma boa homogeneização são diferentes para produtos líquidos.3. aguardar que a espuma disperse. A medida deve ser volumétrica e o intervalo entre a homogeneização da amostra e a retirada da unidade analítica não deve ultrapassar 3min.2. segundo a ISO 6887-1 (1999). Antes da retirada da(s) unidade(s) analítica(s).4oC) por não mais de 18 horas. podem ser usadas temperaturas mais altas. para a maioria dos ensaios. utilizar um segundo frasco.3. o Compendium (Midura & Bryant. nos capítulos específicos. transferir o conteúdo para um frasco estéril de boca larga e. unidades analíticas de 25g atendem às exigências da ISO 6887-1 (1999) e. A ISO 6887-1 (1999) recomenda que não exceda 5%. nos ensaios pelo método da filtração em membrana). inverter 25 vezes num arco de 30cm. 2001) recomenda descongelar sob refrigeração (≤4. estéril e transferir a amostra de um frasco para o outro. na 28 cap 01. recomenda que seja de 50g para alimentos sólidos e 10. é requerida a agitação freqüente da amostra. para facilitar o descongelamento.p65 28 1/7/2007. PROCEDIMENTO PARA A HOMOGENEIZAÇÃO E RETIRADA DA UNIDADE ANALÍTICA DE PRODUTOS SÓLIDOS OU LÍQUIDOS CONCENTRADOS No caso de amostras sólidas ou líquidos concentrados. por 3 vezes. mas não superiores a 40oC e por não mais do que 15 minutos. inserida numa profundidade não maior do que 2. não deve ser maior que 5%. conforme apresentado abaixo. Se a amostra estiver congelada. Retirar a unidade analítica com uma pipeta. o conteúdo da amostra deve ser bem homogeneizado.5cm abaixo da superfície do líquido. Há casos diferenciados em que a unidade analítica deve ser maior ou menor do que o especificado aqui. 23:50 .1g. Nesse caso. a quantidade recomendada na maioria dos casos é de 25g ou menor. 2. para verificar essas exceções. Alternativamente. 11 ou 50ml para produtos líquidos. O Capítulo 2 do Compendium (Midura & Bryant. Se o frasco apresentar mais de 2/3 do espaço preenchido. com a tampa ligeiramente aberta. 2001). Se a amostra for gaseificada (refrigerantes produtos similares). O intervalo entre a homogeneização e a retirada da unidade analítica não deve ultrapassar 15 minutos. produtos sólidos e produtos com contaminação predominantemente superficial. no mínimo.

delimitar a área a ser amostrada. utensílios e embalagens.1% (H 2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7. se a área amostrada for grande. Se a homogeneização da amostra for feita em liquidificador. descrevendo movimentos da esquerda para 29 cap 01. segurando o molde firmemente contra a superfície.cap 07. mesas. para evitar aquecimento excessivo. 2001) a Água Peptonada 0. aves e peixes. levando em conta a proporção presente no produto. com hastes de madeira de aproximadamente 15cm de comprimento por 3mm de diâmetro e a parte absorvente em algodão com aproximadamente 2cm de comprimento por 5mm de diâmetro. a quantidade de amostra mais diluente (primeira diluição 10-1) no copo do liquidificador deve ser suficiente para cobrir as facas do aparelho. comprimindo-o contra as paredes do frasco para remover o excesso de líquido. reservando a outra metade como contra-amostra.3. de onde pode(m) ser retirada(s) a(s) unidade(s) analítica(s) necessária(s) para os ensaios.3. a ISO 6887-3 (2003) recomenda usar todo o material nos ensaios. tortas. As esponjas podem ser substituídas por tampões de algodão estéreis. Uma terceira opção é tomar unidades analíticas distintas de cada camada e analisar separadamente. podem ser usadas temperaturas mais altas (18 a 27oC) por não mais do que 3 horas. Se a quantidade de amostra encaminhada para a análise for menor do que a(s) unidade(s) analítica(s) requerida(s). Se a amostra for heterogênea.1. Esse material pode ser adquirido em embalagens individuais. 2. que não podem ser descongelados nas condições preconizadas acima.Preparação de Amostras para Análise embalagem original. Amostragem com “swabs” Preparar tubos ou frascos com 10ml de um diluente adequado. Se essa homogeneização for feita em liquidificador. compor a unidade analítica com porções das diferentes camadas.3. as raspas congeladas vão-se acumulando no funil. o Compendium (Midura & Bryant. sobremesas e outros pratos prontos para consumo. Aplica-se também à análise de superfícies de equipamentos. PROCEDIMENTO PARA A RETIRADA DA UNIDADE ANALÍTICA PELA TÉCNICA DO ESFREGAÇO DE SUPERFÍCIE A técnica do esfregaço de superfície aplica-se aos alimentos cuja contaminação é predominantemente superficial. No caso de grandes blocos de alimentos congelados. preparados no laboratório. por exemplo). O esfregaço pode ser feito com “swabs” estéreis ou.p65 29 1/7/2007. Alternativamente. Umedecer o algodão no diluente. Ligando-se a furadeira. composta por diferentes camadas de composições distintas (bolos recheados. Para produtos cárneos. a ISO 6887-4 (2003) recomenda que o tempo de homogeneização não ultrapasse 1 minuto.2 (PB) e pela ISO 6887-1 (1999) a Água Salina Peptonada (H2Osp) ou a Água Peptonada Tamponada (BPW). com esponjas estéreis. segurando a haste na extremidade oposta à do algodão. Alternativamente. Inserir a broca no funil (cujo diâmetro de abertura inferior deve ser apenas ligeiramente maior que o diâmetro da broca) e posicionar a broca no ponto do bloco que se deseja amostrar. como carcaças de bovinos. pode ser seguido o procedimento recomendado pela ISO 6887-2 (2003) para grandes peças de carne. sendo recomendados pelo Compendium (Midura & Bryant. Usando um molde estéril de 50cm2. homogeneizar todo o conteúdo da amostra e retirar a unidade analítica do macerado. estéreis. 2001) recomenda submeter metade à análise. Utilizar uma furadeira elétrica (com a broca previamente esterilizada) combinada com um funil estéril. 23:50 . suínos. Retirar o “swab” de sua embalagem estéril. 2. Os “swabs” também podem ser preparados no laboratório.3. Aplicar o “swab” com pressão.

Os “swabs” podem ser recolhidos em um mesmo frasco. Após a aplicação. 15 14 9 10 11 12 13 Figura 2. Rodar o “swab” continuamento. que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso. 30 cap 01. seguir as orientações dos capítulos específicos). sobre a mesma área.1. transferir o “swab” para o tubo ou frasco de diluente. usando um “swab” seco. Tanto a área amostrada quanto o volume de diluente podem variar. O líquido de coleta dos “swabs” pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos ensaios de presença/ausência. Considerar que esse procedimento amostra uma área de 50cm2 e cada mililitro de diluente. para que toda a superfície do algodão entre em contato com a amostra. 23:50 . depois de recolhidos os “swabs”. Repetir esse procedimento mais uma vez. Para fazer o esfregaço de meias carcaças de bovinos e suínos usando o mesmo procedimento. Pontos recomendados para a amostragem de carcaças de bovinos com “swabs”. a ISO 17604 (2003) recomenda amostrar os pontos apresentados nas Figuras 2.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos a direita e depois de baixo para cima.2. com um volume total de diluente correspondente a 10ml para cada par de “swabs”. entre um ponto e outro. antes de mergulhar o restante do “swab” no diluente. Recolher o segundo “swab” no mesmo frasco ou tubo de diluente.p65 30 1/7/2007.cap 07. de acordo com a necessidade ou com as características da amostra.1 e 2. corresponde a 5cm2 de superfície. mergulhar o molde em etanol 70% e flambar. Usar um “swab” para cada ponto e. quebrando a parte manuseada da haste na borda interna do tubo ou frasco.

3. Considerar que esse procedimento amostra uma área de 100cm2 e cada mililitro de diluente.2. 23:50 . adicionando à essa bolsa todas as porções restantes do volume de 25ml correspondente a cada esponja. apresentados nas Figuras 2. colocar a esponja de volta na bolsa e adicionar o restante do diluente. delimitar a área a ser amostrada. Aplicar a esponja com pressão. massagear a esponja para umedecer uniformemente. sem excesso de fluído visível. de 10x10cm.p65 31 1/7/2007. Lavar bem as mãos. Usar uma esponja para cada ponto e. Após a aplicação. O líquido de coleta das esponjas pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos ensaios de presença/ausência que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso. colocar um par de luvas estéreis e retirar a esponja da bolsa. 31 cap 01. Segurando a bolsa pelo lado de fora. depois de recolhida a esponja. mergulhar o molde em etanol 70% e flambar. usar o mesmo procedimento para cada um dos pontos recomendados pela ISO 17604 (2003). Amostragem com esponjas Preparar tubos ou frascos com 25ml de um dos diluente recomendados para os “swabs”. Tanto a área amostrada quanto o volume de diluente podem variar. Abrir a bolsa plástica contendo a esponja (ou tampão de algodão) estéril e adicionar uma quantidade de diluente suficiente para molhar a esponja.2. Para fazer o esfregaço de meias carcaças de bovinos e suínos. Usando um molde vazado estéril. corresponde a 4cm2 de superfície.2. Pontos recomendados para a amostragem de carcaças de suínos com “swabs”.3. completando os 25ml.Preparação de Amostras para Análise 9 13 10 11 12 Figura 2. seguir as orientações dos capítulos específicos). de acordo com a necessidade ou com as características da amostra. segurando o molde firmemente contra a superfície. descrevendo 10 movimentos da esquerda para a direita e 10 movimentos de baixo para cima. As esponjas podem ser recolhidas em uma mesma bolsa. 2. entre um ponto e outro.cap 07.1 e 2.

sementes. Por exemplo.4. cada mililitro do lavado corresponde ao peso da carcaça dividido por 400. 400ml de um dos diluentes recomendados para “swabs” (o USDA/FSIS.3.3. de forma a lavar toda a superfície interna e externa da carcaça. 23:50 . Aplica-se também à análise de embalagens que possam ser fechadas e agitadas com um diluente em seu interior. nesse procedimento. grãos. como carcaças de aves inteiras. que podem ser mergulhados em um diluente adequado. recorrer ao método do “swab”.2). por fora das bolsas.p65 32 1/7/2007. Procedimento para a lavagem de carcaças de aves Procedimento recomendado pelo USDA/FSIS (2004) para a análise simultânea de Salmonella e outros microrganismos.2. Usando os mesmos diluentes recomendados para “swabs”. Considerar que. transferir a carcaça para uma bolsa estéril e pesar. contido em uma bolsa estéril. Fechando a abertura da bolsa com uma mão. Drenar o excesso de líquido das embalagens. a amostra pode ser colocada em um frasco com o diluente e agitada por 10min em “shaker”. Segurando a carcaça com uma mão e fechando a abertura da bolsa com a outra. Procedimento para a lavagem de outros alimentos Transferir a amostra para uma bolsa estéril e pesar. para remover os microrganismos aderidos às paredes internas. seguir as orientações dos capítulos específicos). adicionar à bolsa o volume de diluente requerido para diluição inicial 1:1 (1ml de diluente por grama de amostra). por exemplo). agitar rodando o líquido na bolsa (cerca de 35rpm). cascas de ovos. O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos ensaios de presença/ausência que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso. de forma a garantir uma completa remoção dos contaminantes presentes.1.4. nesse procedimento. 2. castanhas e produtos similares. para lavagem e coleta da contaminação. 2004 recomenda Tampão Fosfato pH 7.4. se o peso da carcaça for de 1600g. seguir as orientações dos capítulos específicos). 32 cap 01. sementes. PROCEDIMENTO PARA A RETIRADA DA UNIDADE ANALÍTICA PELA TÉCNICA DA LAVAGEM SUPERFICIAL A técnica da lavagem superficial aplica-se a alimentos de contaminação predominantemente superficial. Considerar que. adicionar à embalagem uma quantidade de diluente suficiente para lavar toda a superfície interna.3.3. Fechar e.3. com os devidos cuidados para que pontas ou outras protuberâncias não venham a furar a embalagem. amendoins. No caso de grãos.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 2. 2. cada mililitro do lavado corresponde a 4g da amostra. castanhas. O volume de diluente pode variar.cap 07.4. Usando os mesmos diluentes recomendados para “swabs”. Procurar atingir todos os pontos da superfície interna. com as mãos. agitar vigorosamente a embalagem. cortes de aves. Adicionar à bolsa e na cavidade da carcaça. peixes. cada mililitro do lavado corresponde a 1g de amostra. No caso de embalagens sem a tampa ou com tampas que não sejam á prova de vazamento. Procedimento para a lavagem de embalagens Esse procedimento é recomendado para embalagens com tampa à prova de vazamento. por agitação (1/5 da capacidade da embalagem. agitar a amostra e massagear as peças com a outra mão. de acordo com a necessidade ou com as características da amostra. O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos ensaios de presença/ausência que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso. 2.

o Tampão Fosfato pH 7. devendo.2 (PB) (chamado de Água de Diluição Fosfato) ou o Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio (chamado de Água de Diluição Fosfato Magnésio). ser definido a critério do laboratório. depois da retirada da(s) unidade(s) analítica(s). nesse procedimento.3. exceto as amostras perecíveis. para a análise de água. Por exemplo. 2001) recomenda a Água Peptonada 0. a Solução de Ringer ¼ de concentração. definidos no item 2. 33 cap 01.1% (H2Op). chamado de Água de Diluição. para permitir a inoculação nos meios de cultura. especificados nos capítulos específicos.3. porém.5. o material remanescente seja estocado nas mesmas condições utilizadas antes da análise.3. se a capacidade da embalagem for de 500ml e o volume de diluente igual a 100ml. 2.1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato Cloreto de Magnésio. a Água Peptonada 0. Os diluentes e a diluição inicial recomendados variam em função do tipo de amostra e do tipo de ensaio que será realizado. O tempo mínimo de guarda das contra-amostras é o requerido para a obtenção dos resultados dos ensaios. Diluentes para os ensaios que requeiram tratamento diferenciado da amostra Para esses ensaios. que devem ser congeladas. a Água Peptonada 0. para a análise de produtos lácteos. 2004) recomenda. O descarte final das amostras pode ser feito no lixo. seguir as orientações dos capítulos específicos). cada mililitro do lavado corresponde a 5cm3. 2005) recomenda. congelar como contra-amostra a parte não utilizada do diluente em que foram recolhidos os contaminantes. Considerar que.3. GUARDA DE CONTRA-AMOSTRAS A ISO 7218 (1996) recomenda que.4.1% (H 2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7. conforme descrito abaixo: Diluentes para os ensaios de presença/ausência Esses ensaios.p65 33 1/7/2007. Diluentes para os ensaios gerais de quantificação Para esses ensaios.Preparação de Amostras para Análise O líquido obtido na lavagem pode ser utilizado tanto nos ensaios gerais de quantificação como nos ensaios de presença/ausência que requerem enriquecimento em caldo diferenciado (no segundo caso. PREPARO DA 1O DILUIÇÃO DA UNIDADE ANALÍTICA No prosseguimento da análise a unidade analítica deve ser diluída e homogeneizada com um diluente adequado. definidos no item 2.2 (PB). cada mililitro do lavado corresponde à capacidade da embalagem dividido pelo volume de diluente. aquelas deterioradas ou suspeitas de conter microrganismos nocivos à saúde devem ser descontaminadas em autoclave (121oC/30min) antes do descarte. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Davis & Hickey. também devem ser consultados os capítulos específicos. No caso de amostras cuja coleta da unidade analítica tenha sido feita pela técnica do esfregaço de superfície ou da lavagem superficial. são feitos com diluição e homogeneização diretamente no caldo de enriquecimento. O Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (Hunt & Rice. são feitas as seguintes recomendações: O Compendium (Midura & Bryant.cap 07. a Água Salina Peptonada (H2Osp). definidos no item 2. 2. entretanto. 23:50 .

Para obter a mesma diluição com uma unidade analítica de 20g. Por exemplo. Como obter uma diluição inicial de 1:10 (10-1) A diluição inicial recomendada para a maioria das amostras é de 1:10 (10-1). devendo ser consultado o Anexo 2. antes de usar. devendo ser consultado o Anexo 2. para 25g de amostra. o Compendium (Midura & Bryant. o que pode ser feito por agitação com as mãos.cap 07. Por exemplo. invertendo o frasco em arco de 30cm em 7s (líquidos concentrados. enquanto a ISO 6887-4 (2003) recomenda não homogeneizar por mais do 2. Há casos especiais em que o diluente recomendado é diferente. Para isso. para evitar injúrias aos microrganismos por choque térmico.2 para verificar essas exceções. Há casos especiais em que a diluição inicial é diferente. Na homogeneização em liquidificador o Compendium (Midura & Bryant. pós solúveis). 2001) recomenda usar alta rotação nos primeiros segundos e baixa (8000rpm) no tempo restante. 23:50 . Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras líquidas No caso de alimentos líquidos. utilizar tubos ou frascos com tampa de rosca. é importante prevenir o excessivo aquecimento do material. adicionando-se m gramas ou mililitros da amostra para 9 x m mililitros do diluente. devendo ser consultado o Anexo 2. adicionar [(50x10)-10] mililitros do diluente (490ml). Homogeneizar a unidade analítica com o diluente. devendo ser consultado o Anexo 2. Há casos especiais em que a diluição inicial é diferente. 2001) recomenda resfriar o diluente em banho de gelo.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos A ISO 6887-1 (1999) recomenda a Água Salina Peptonada (H2Osp) e a Água Peptonada Tamponada (BPW). invertendo a embalagem 25 vezes.2 para verificar essas exceções. transferir a unidade analítica diretamente para os tubos ou frascos contendo a quantidade de diluente necessária para a diluição 1/10. Para definir o volume de diluente necessário para obter uma determinada diluição 1:k da amostra. A ISO 6887-1 (1999) recomenda que. Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras sólidas ou líquidos concentrados No caso de alimentos sólidos ou líquidos concentrados. Adicionar à amostra a quantidade de diluente necessária para a diluição 1:10. moídos. Para permitir a homogeneização.p65 34 1/7/2007. Como obter uma diluição inicial diferente de 1:10 Há casos especiais em que a primeira diluição é diferente de 1:10. para obter a diluição 1:50 de uma unidade analítica de 10g.2 para verificar essas exceções.m)–m].2 para verificar essas exceções.5min de cada vez. pós pouco solúveis) ou em liquidificador (alimentos duros). pastosos. Há situações em que o diluente e a diluição inicial são diferentes. adicionar [(50x20)–20] mililitros do diluente (980ml). 34 cap 01. previamente tarados. que não deve ultrapassar 2min. Se for necessário uma homogeneização mais prolongada. Homogeneizar amostra com o diluente por agitação. em homogeneizador peristáltico (“stomacher”) por 1 a 2min (alimentos moles. usar a relação v = [(k. transferir a unidade analítica para frascos ou bolsas de homogeneização estéreis. O tamanho deve ser suficiente para que não mais do que 2/3 da capacidade seja preenchida pela unidade analítica + diluente. adicionar 9x25ml de diluente (225ml). a temperatura do diluente seja a mesma do ambiente.

considerar essa diferença no cálculo final dos resultados. uma pipeta diferente para cada diluição. DILUIÇÃO DECIMAL SERIADA DA AMOSTRA A preparação e inoculação de diluições seriadas da amostra é requerida nos ensaios quantitativos. 1999). a segunda diluição é iniciada logo após o término da primeira e a duração do procedimento completo. 35 cap 01. à temperatura ambiente (entre 20 e 25oC). desde a preparação da primeira diluição até que todos os meios de cultura estejam inoculados. Analogamente. Na contagem pelo método do Número Mais Provável (NMP) deve ser tal que permita a obtenção de tubos positivos nas menores diluições e negativos nas maiores (vide Capítulo 4). a incerteza da medição não deve exceder 5% (ISO 6887-1. o Compendium recomenda que alimentos de umidade intermediária sejam mantidos de molho no diluente por um certo período de tempo. antes de transferir o volume para a segunda diluição. no caso de produtos lácteos submetidos a tratamento térmico ou acidificação. a primeira diluição seja mantida em repouso por 45min. para amolecer o produto e facilitar a liberação dos microrganismos presentes. à temperatura ambiente (não maior que 25oC). com a ponta encostada na parede interna do tubo ou frasco. conforme descrito nos Capítulos 3 e 4. Encher completamente a pipeta e descarregar o volume a partir da marca superior. permitindo a contagem. antes de transferir o volume para a segunda diluição. ovo em pó e fermento vivo em pó).5. Em todas as transferências de volumes. No capítulo específico de bolores e leveduras (Beuchat & Cousin. com um período de repouso de uma hora sob refrigeração. de forma que o líquido escorra pela parede. O tratamento subsequente de diluição decimal seriada é feito a partir dessa suspensão. Utilizar pipetas com capacidade no máximo 10 vezes superior ao volume que vai ser coletado. 2001). Como a diluição inicial não é padrão de 1:10. na contagem em placas. Caso a ponta venha a tocar qualquer superfície não estéril. descartar e substituir por outra. a duração do procedimento completo não deve exceder 45 minutos e o intervalo entre o fim do preparo da primeira diluição e o início da segunda e subseqüentes não deve exceder 30 minutos (exceto quando especificado em procedimentos específicos). No procedimento geral descrito pelo Compendium (Swanson et al. a primeira diluição seja mantida em repouso por 30±5min. Não flambar as pipetas. esponjas ou lavagem superficial já é a primeira diluição da amostra. O número de diluições necessárias depende do nível de contaminação esperado e deve ser tal que permita. 2001). Essa série de diluições geralmente é decimal. 23:50 . No procedimento geral descrito pela ISO 6887-1 (1999). A ISO 6887-4 (2003) recomenda que.. a ISO 8261 (2001) recomenda que. 2001). para recuperação de injúrias ou “stress” provocados pelo processamento. no caso de alimentos desidratados (exceto leite em pó. 2.. antes da preparação da segunda diluição.cap 07. No capítulo específico de enterococos (Hartman et al.Preparação de Amostras para Análise Procedimento para o preparo da primeira diluição de amostras obtidas por esfregaço de superfície ou por lavagem superficial O diluente no qual foi recolhida a contaminação coletada com “swabs”.p65 35 1/7/2007. o Compendium recomenda uma diluição inicial de 1:1. a obtenção de placas com número de colônias entre 25 e 250 (vide Capítulo 3) ou 15 e 150 na contagem de bolores e leveduras. para facilitar o posterior cálculo dos resultados. antes de completar a diluição a 1:10 e as subseqüentes. não deve exceder 15 minutos (exceto quando especificado nos capítulos específicos). para reduzir o número de microrganismos por unidade de volume.

E. H. J. Microbiological Methods for Dairy Products. & HICKEY.209-215. & FRANK. C. (Eds). YAUN. Acid producing microorganisms. Washington. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Se houver partículas em suspensão a ISO 6887-1 (1999) recomenda não agitar e aguardar que sedimentem no fundo do frasco. Standard Methods for the Examination of Dairy Products.F. p.R.201-207. D. Media and dilution water preparation.6. R. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 2. p.M.H. 2004. D. & FRANK. B. C. LEDENBACH. C. H.).p65 36 1/7/2007. G. Chapter 52.E. Washington. transferindo-se 1ml da diluição anterior para 9ml de diluente. D. Chapter 19. L.F (Eds. invertendo 25 vezes em arco de 30cm (em 7s) ou com o auxílio de um agitador tipo “vortex” (15s).M. 2001. F. & PINKAS..S.).533-540.. and K. K (eds. Washington.E. p. L. Antes de retirar o volume a ser transferido.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Como obter a segunda diluição (10-2) Transferir assépticamente 1ml da primeira diluição (10-1) para 9ml de diluente. Os diluentes são os mesmos recomendados no Item 2. Washington.. Se a primeira diluição não contiver partículas em suspensão.). Yeasts and molds. A. Washington. D.249-268. American Public Health Association. and K. & GREENBERG. P. Chapter 8. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Não mergulhar a pipeta numa profundidade superior a 1cm ao pipetar o volume da primeira para a segunda diluição (ISO 6887-1. ITO (ed. 2004. 4th ed. P. & COUSIN.). Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater. No caso de amostras viscosas. Gums and spices. In: WEHR. SUMNER. o material pode ser agitado antes de transferir o volume da primeira para a segunda diluição. A.. D. 2005. 2001. DOWNES.R.W. 17th ed.: American Public Health Association (APHA). 36 cap 01. S. aspirando e liberando o líquido várias vezes. Chapter 20. Chapter 9. C. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. and K. ITO (ed. Washington. Chapter 4.J. American Public Health Association.L. R. F. CLESCERI. p.cap 07. P. American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF).E. D. J.. a ISO 8261 (2001) recomenda descarregar o volume e depois lavar a pipeta com o diluente. GRAY. p. Washington.D. 4th ed. antes de transferir o volume. agitar vigorosamente o tubo. 1999). & ITO. ITO (ed. In: DOWNES. American Public Health Association.. C. Washington: American Public Health Association (APHA)..A. In: WEHR..). 21st Ed. F.. L. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. P. American Public Health Association.. 4th ed. que aderem à parede interna da pipeta. para garantir que todo o material seja transferido para a segunda diluição.J.F (Eds. D. Como obter as diluições subseqüentes Proceder de maneira similar.227-248. FRANK. 17th ed.).S. Tests for groups of microrganisms. HALL. Na segunda diluição não há casos especiais em que o diluente recomendado seja diferente.M. A.93-101. American Public Health Association.. FLOWERS. & FRANK..F (Eds. H. 4th Ed. F. American Public Health Association.4 para a primeira diluição. 23:50 . RICE. M.C. REFERÊNCIAS BEUCHAT.M.. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 17th ed.). In: DOWNES. In: DOWNES. 2001. J.. & YOUSEF. 2004. P. DUNCAN. p.. DAVIS. In: WEHR. C. J. S. J. EATON. P. 2001.

S.. ITO (eds. & BRYANT. & CIRIGLIANO. S. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.A. R. ISO 6887-4. 2001.). Standard Methods for the Examination of Dairy Products. GAMBREL-LENARZ.9. LAIRD. 4th ed.541-544. 1st ed. Sampling plans.). In: WEHR. 4th ed. 2001.13-23. The International Organization for Standardization. P. Egg and egg products.C. & K. K. RICKE. Enterococci. The International Organization for Standardization. P.). 2nd ed. HUNT. The International Organization for Standardization.. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination 2nd ed.F (Eds. ISO 6887-1. F. UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE/FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE.F (Eds. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples.C.H. D. 2004. shipment. In: DOWNES.fsis.W.M.M. Chapter 4. Washington. R. P. MIDURA. WEHR.M. 1st ed. et al. R. K. and preparation for analysis. & FRANK. The International Organization for Standardization. D. American Public Health Association.A. In: DOWNES.gov/Science/ Microbiological_Lab_Guidebook/index.G. Washington. SWANSON.03. J.). C. Chapter 6. p.F. October 2004. H. 4th ed. 17th ed. 1999. Washington: American Public Health Association (APHA). DEIBEL. J. BIRKHOLD. Washington. 4th ed. P. M. E. ISO 6887-3. Chapter 46. Chapter 6. 2003. American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF). 1996. C. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. ISO 7218. R. P.J. sample collection. Disponível no site: http://www. p. & SIEVERDING.p65 37 1/7/2007. The International Organization for Standardization. H. p. Chapter 9. 2003. & ITO. Microbiological examination.K. S. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. 2003. 4th ed. K. J. American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 2004. p.. PETRAN.cap 07. Microbiology Laboratory Guidebook. (Eds). 2001. Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater. The International Organization for Standardization. K. SMITTLE. F. Microbiological count methods.153-186. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples. 2001.473-481. 17th ed. American Public Health Association..L. R.M.asp (acesso em 21/09/05). & HANLIN. & ITO. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products. 2001.169. Culture methods for enumeration of microrganisms. 2003. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. F. 1st ed.: American Public Health Association (APHA). p. (eds. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. (eds. Chapter 53.M. In: DOWNES.usda. Washington: American Public Health Association (APHA). F. ISO 17604. p. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. In: EATON et al. Washington. D. 23:50 . 2001. 37 cap 01. D.. 1st ed. Microbiology of food and animal feeding stuffs –General rules for microbiological examination.83-87. SCHER. M. Washington: American Public Health Association (APHA).1-9. ISO 6887-2. Chapter 2.).. In: DOWNES.). 21st Ed.G. ISO 8261/IDF 122. The International Organization for Standardization. & FRANK. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples. (eds. F. & ITO.B. In: DOWNES. Part 9000. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples. T.Preparação de Amostras para Análise HARTMAN. 1st ed.C.E. Washington: American Public Health Association (APHA). & RICE. Milk and milk products – General guidance for the preparation of test samples. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products..). L. & GAST.H. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Carcass sampling for microbiological analysis. and fish and fishery products. C. p. K (eds. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 4: Specific rules for the preparation of fish and fishery products. D. 2005. F.T. P. & ITO.53-67. Salad dressings.

.p65 38 1/7/2007. água e sabão. 2004) recomenda macerar todo o conteúdo da unidade de amostra (com uma espátula estéril) e retirar a unidade analítica da mistura. Retirar a unidade analítica com uma espátula estéril ((Midura & Bryant. por 1min. 2001) recomenda lavar a casca com escova. separando a clara da gema. Produtos pastosos ou moídos Revolver o conteúdo com uma espátula ou bagueta estéril. Com luvas estéreis. transferir todo o conteúdo para um frasco maior e proceder da mesma forma (ISO 8261.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos ANEXO 2. Retirar a unidade analítica com uma espátula estéril. Produtos muito duros A ISO 6887-4 (2003) recomenda colocar em uma bolsa plástica estéril e fragmentar em pequenas partes com um martelo estéril. Peças de alimentos sólidos A ISO 6887-4 (2003) recomenda usar um instrumento adequado (faca. dependendo da finalidade do ensaio: ♦ Para analisar apenas a contaminação externa. 2001). 2004) recomenda homogeneizar todo o conteúdo da unidade de amostra em liqüidificador.1 PROCEDIMENTOS PARA HOMOGENEIZAÇÃO DO CONTEÚDO E RETIRADA DA UNIDADE DE AMOSTRA DE DIFERENTES TIPOS DE ALIMENTOS Produtos em pó Homogeneizar a amostra agitando e invertendo a embalagem com as mãos. Queijos O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al. até misturar bem (ISO 6887-4. Se a embalagem não tiver espaço livre para uma homogeneização. desprezar o conteúdo interno. para homogeneizar. Misturar bem a amostra fragmentada e retirar a unidade analítica com uma espátula estéril. 2001). Ovos em casca Para a análise do conteúdo interno o Capítulo 46 do Compendium (Ricke et al. o Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al. drenar o excesso de líquido. pode ser usado o procedimento da lavagem superficial. 2003) ou revolvendo o conteúdo com uma espátula ou bagueta estéril (Midura & Bryant.. Iogurtes com pedaços de frutas Para iogurte com pedaços de frutas. se a análise assim o exigir. 2001). quebrar os ovos. Alternativamente. Misturar bem e retirar a unidade analítica da mistura. antes de retirar a unidade analítica. A ISO 6887-4 (2003) recomenda três procedimentos.cap 07.. tesoura estéril) para quebrar ou cortar pedaços menores (de diversos pontos da peça). mergulhar em etanol 70% por 10min e flambar. abrir os ovos assépticamente e colocar o conteúdo interno num frasco ou bolsa estéril. até obter a quantidade requerida para a análise. colocar as cas38 cap 01. 23:50 .

apa. berbigão. lingueirão.cap 07.Preparação de Amostras para Análise cas em uma bolsa estéril. Moluscos cefalópodes (polvo. 23:50 . lesma) A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as conchas com uma escova abrasiva estéril. retirar a(s) unidade(s) analítica(s) requerida(s) para os ensaios. remover uma segunda camada de aproximadamente 1mm de profundidade e 4x4cm de área. limpar a casca com gaze molhada. Ouriços do mar A ISO 6887-3 (2003) recomenda lavar os organismos em água corrente (potável). 39 cap 01. sob água corrente (potável). lula) A ISO 6887-3 (2003) recomenda remover a pele e retirar a unidade analítica dos músculos dorsais e dos tentáculos. deixando secar. abrir o lado ventral e retirar toda a carne e fluído internos com uma espátula. Moluscos bivalves (ostra. A partir dessa região exposta. Cauterizar a superfície exposta com fogo a chama de um maçarico e. secar com papel absorvente. separando a clara da gema. Cortes de carne para análise de contaminação não superficial Para a análise de contaminação profunda de carcaças ou cortes de carne. lapa. com luvas estéreis. a ISO 6887-2 (2003) recomenda expor uma área de aproximadamente 5x5cm.p65 39 1/7/2007. conquilha. Quebrar a concha com um martelo estéril e retirar a carne assépticamente. colocar sobre uma superfície estéril e cobrir com papel absorvente estéril. com outra faca ou tesoura estéril. Desinfetar com álcool 70%. misturar bem e retirar a unidade analítica da mistura. quebrar os ovos. mergulhar em solução de iodo e. sob água corrente (potável). usando uma faca ou tesoura estéril para remover a pele (se presente) e uma camada superficial de aproximadamente 2mm. ♦ Para analisar a contaminação externa e interna. Lavar e desinfetar bem as mãos antes de iniciar o procedimento. Com luvas. mexilhão. Caranguejos e lagostas A ISO 6887-3 (2003) recomenda quebrar a casca com um martelo estéril e remover o máximo da carne na retirada da unidade analítica. remover assépticamente os ovos da solução. se a análise assim o exigir. Misturar bem e retirar a unidade analítica da mistura. recolhendo em uma bolsa ou frasco estéril. Drenar o excesso de água. ameijoa) A ISO 6887-3 (2003) recomenda esfregar as conchas com uma escova abrasiva estéril. quebrar as cascas. ♦ Para analisar apenas o conteúdo interno. colocar as cascas e o conteúdo interno em um frasco ou bolsa estéril. Lavar e desinfetar bem as mãos antes de iniciar o procedimento. Abrir assépticamente com as conchas e então recolher os organismos (pelo menos seis) e o líquido que escorre do interior das conchas em um frasco ou bolsa plástica estéril. caramujo. misturar bem e retirar a unidade analítica da mistura. Moluscos gastrópodes (caracol. abrir os ovos assépticamente e colocar o conteúdo interno num frasco ou bolsa estéril. búzio. colocar sobre uma superfície estéril e cobrir com papel absorvente estéril.

dependendo do teor de gordura.2 CASOS ESPECIAIS EM QUE HÁ VARIAÇÕES NA UNIDADE ANALÍTICA E/OU DILUIÇÃO E/OU DILUENTES RECOMENDADOS PARA A PREPARAÇÃO DA PRIMEIRA DILUIÇÃO DE AMOSTRAS DE DIFERENTES TIPOS DE ALIMENTOS Líquidos com baixa contaminação Nos ensaios quantitativos de amostras líquidas com baixa contagem microbiana. o mesmo procedimento descrito para manteiga.5% sulfito de potássio (K2SO3) ao diluente e trabalhar com a diluição inicial normal. em baixa rotação (8000rpm). adicionar 40 x 0. inoculando-se um volume maior da amostra. Para margarina e “spreads” a ISO 6887-4 (2003) recomenda unidade analítica de 40g e o seguinte procedimento: adicionar à unidade analítica um volume de diluente (sem suplementos) proporcional ao teor de gordura da margarina. por exemplo) e homogeneizar em liquidificador por 2min. 9m mililitros de diluente. por exemplo. Preparar então a diluição 10-1 adicionando. Continuar a análise com a fase aquosa. orégano. Alimentos gordurosos Para esses alimentos o Compendium (Midura & Bryant. na qual 1ml corresponde a 1g de margarina. para cada m mililitros de fase aquosa. dependendo do tipo de produto. Também são comuns os ensaios usando a técnica de filtração em membrana. como orégano) o Compendium (Gray & Pinkas. sem diluição. é comum inocular uma alíquota da amostra diretamente nos meios de cultura. 1:1000 para cravo).. para margarinas com 82% de gordura e unidade analítica de 40g. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos ANEXO 2. 2004) recomenda. 1/50. para margarina e “spreads”. Alternativamente. condimento desidratados em folhas. até a fusão do material. Deixar descansar à temperatura ambiente até a completa separação das fases aquosa (inferior) e gordurosa superior). A ISO 6887-4 (2003) recomenda suplementar o diluente com 1 a 10g/l de Tween 80.cap 07. podendo ser 1/20. Para produtos com 40% de gordura. Por exemplo. como condimentos (alho. pode-se adicionar 0. sem qualquer diluição. 2001) e a ISO 6887-1 (1999) recomendam trabalhar com diluição inicial maior do que 1:10. Nesse caso. o que pode levar de 2 a 5min. pectina. Colocar o frasco em banho maria com temperatura controlada a 45oC. cravo. Esse procedimento não se aplica a margarina e “spreads”. canela. recomenda-se que a primeira diluição seja maior do que 1:10 (1:100 para orégano e canela. Para produtos que contém compostos antimicrobianos naturais. cebola. a primeira diluição pode ser feita inoculando-se 1ml da amostra em 9ml do diluente. Misturar com um agitador magnético até formar uma emulsão homogênea. 23:50 .82 = 33ml de diluente. 1/100 ou outra adequada à viscosidade do material. suplementar com 4g/l de Tween 80.p65 40 1/7/2007. Espessantes ou produtos com antimicrobianos naturais Para espessantes e outros produtos que aumentam de viscosidade em água (gomas. Esse período não deve exceder 20min. 2001) recomenda suplementar o diluente com 1% (P/V) de Tergitol-7 Aniônico ou equivalentes (Tween 80. pimenta) e certos chás e café. 40 cap 01. celulose.

A concentração do NaOH (01M ou 1M. para os ensaios gerais de quantificação. A diluição inicial utilizada deve ser levada em conta no cálculo dos resultados. 2001. 2001) recomenda que sejam neutralizadas para a contagem de coliformes e S. Ricke et al. até diluição 1:20. para a determinação de outros microrganismos que não os responsáveis pela fermentação (os contaminantes). Na adição do NaOH. até a fusão do material.Preparação de Amostras para Análise A unidade analítica pode ser de 10g e a diluição inicial utilizada deve ser levada em conta no cálculo dos resultados. a elevação do pH pode ser acompanhada pela alteração de cor do meio que. Chocolate em barras.1g nos meios de cultura. em Água Peptonada Tamponada (BPW). por exemplo) a ser usada depende da acidez da amostra e deve ser tal que a quantidade adicionada não altere significativamente a proporção 1 + 9 entre amostra e diluente. adicionar à unidade analítica e misturar por agitação manual. adicionar uma quantidade adicional de diluente. seguir as orientações dos Capítulos 3 e 4. Produtos fermentados contendo microrganismos vivos destinados à quantificação da microbiota contaminante (exceto probióticos) A ISO 6887-4 (2003).1ml/l de uma solução alcoólica de púrpura de bromocresol a 0. Uma segunda opção é usar diluentes tamponados mas.cap 07. para aumentar a capacidade tamponante do meio. pode-se adicionar ao diluente (Água Salina Peptonada). o Capítulo 53 (Smittle & Crigliano. recomenda usar como diluente a Água Salina Peptonada suplementada com 0. Se a cor do diluente na primeira diluição indicar pH ácido (cor amarela). O Capítulo 2 do Compendium (Midura & Bryant. se possível. bombons A ISO 6887-4 (2003) recomenda pré aquecer o diluente a 40oC. aureus. Produtos ácidos A ISO 6887-4 (2003) recomenda que o pH da primeira diluição seja neutralizado com NaOH estéril. 0.p65 41 1/7/2007. adicionar 40g/l 41 cap 01. a inoculação de 0. Vide também as recomendações específicas para produtos lácteos fermentados. mesmo assim. Farinhas. 23:50 .04%. Manter em repouso por 20-30min à temperatura ambiente. ração animal A ISO 6887-4 (2003) recomenda adicionar o diluente à unidade analítica.8 (neutro). homogeneizando então em “stomacher”. 2001) não faz menção a procedimentos diferenciados para essas amostras. A ISO 6887-4 (2003) recomenda que a primeira diluição seja 1:40. para amostras de maionese e outros molhos para saladas. Se a viscosidade da suspensão aumentar muito. Considerar essa alteração da diluição inicial no cálculo dos resultados. Para isso. manter em repouso por 20 a 30min à temperatura ambiente e então homogeneizar. Entretanto. 2001) não faz menção a procedimentos diferenciados para essas amostras. para reduzir a inibição causada pela lisozima natural sobre os microrganismos. Se as contagens esperadas são baixas.1ml/l de uma solução alcoólica de púrpura de bromocresol a 0. a adição de NaOH freqüentemente é necessária. Clara de ovos O Compendium (Midura & Bryant.. muda de amarelo para roxo em pH 6. deve-se manter.04%. cereais. Para facilitar essa etapa. dificultando a homogeneização e a transferência de volumes.

25 vezes em sete segundos. Produtos lácteos congelados A ISO 8261 (2001) recomenda pesar uma unidade analítica de 10g em um frasco estéril. aguardar a fusão da amostra. adicionar ao meio de cultura onde será feita a contagem um agente antifúngico com a cicloeximida (50mg/Kg).2 ♦ Para leite em pó (secagem em rolo) – 90ml de solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7.1% e homogeneizar por agitação ou em “stomacher”. soro de leite. transferir para um banho-maria regulado a 40oC. pesar uma unidade analítica de 11g em um frasco estéril. Para outros microrganismos responsáveis pela fermentação. adicionar 90ml de Água Peptonada 0. que seja adequado para inibir essa microbiota. com os tubos de diluente também aquecidos.2 (PB). São recomendados os seguintes diluentes. invertendo o frasco em arco de 30cm. Pipetar então 11ml da amostra fundida (evitar a separação das fases aquosa e gordurosa). Pré aquecer o diluente a 40-45ºC e pipetar o diluente várias vezes. Se os microrganismos responsáveis pela fermentação forem leveduras. creme de leite. Preparar e inocular as diluições seriadas imediatamente. O Capítulo 6 da 17a Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al. 2004) recomenda fundir a amostra em banho a 40±1ºC. Manteiga A ISO 8261 (2001) recomenda pesar uma unidade analítica de 10g em um frasco estéril. Produtos lácteos em pó (leite. devem ser relatadas no laudo de resultados. adicionar um outro antibiótico. A homogeneização pode ser manual (inverter o frasco em arco de 30cm em 7 segundos) ou em “stomacher”. transferir para um banho-maria regulado a 30oC.2 ou solução de citrato de sódio (Na3C6H5O7. que devem ser pré aquecidos a 45oC antes do uso: ♦ Para soro de leite doce. 23:50 .5±0. não o diluente ao pó (para facilitar a hidratação). se usadas.. adicionar 99ml de Tampão Fosfato pH 7.cap 07. a nistatina (50mg/Kg) ou a anfotericina (10mg/Kg). 2004) recomenda solução de citrato de sódio 2% com pH ajustado abaixo de 8. ♦ Para soro de leite ácido – 90ml de solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8... lactose e fórmulas infantis – 90ml de Água Peptonada 0.1% (H2Op). creme de leite. aguardar a fusão da amostra (não mais do que 15min) e homogeneizar por agitação ou em “stomacher”. por não mais de 15min. Essas modificações no procedimento. fórmulas infantis) A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analítica de 10g e que o pó seja adicionado ao diluente. transferir para um banho-maria regulado a 45oC. adicionar 90ml de Água Peptonada 0. para aquecer a pipeta. retornando ao frasco.4±0. transferir para 99ml do diluente aquecido e agitar. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al. 42 cap 01.2H2O) 2%.1% e homogeneizar em “stomacher”. para sorvetes e outras sobremesas lácteas congeladas. 2004) recomenda. Para pós com baixa solubilidade o Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al.p65 42 1/7/2007.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos de hidróxido de sódio. para retornar ao pH neutro (viragem para roxo). lactose. aguardar a fusão da amostra.0. Água Peptonada Tamponada (BPW) ou Água Salina Peptonada (H2Osp).

Moluscos (bivalves e gastrópodes) e ouriços do mar Para moluscos bivalves (ostra. 99ml de solução de citrato de sódio 2%.. Produtos lácteos fermentados A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analítica de 10g e. transferir para um frasco com pérolas de vidro e adicionar 95ml de solução de tripolifosfato (Na3O10P3) 2% pré aquecida a 37o. pré aquecida a 40-45oC. 2004) recomenda unidade analítica de 11g e. lapa. como diluente. Para produtos destinados à contagem de bactérias lácticas. misturar bem. é a Água Peptonada 0. ♦ Paracaseína (obtida por coagulação com renina) . de maneira geral.5±0. porque pode causar injúrias às células. ♦ Caseína láctica ou ácida . deixar descansar por 15min à temperatura ambiente e homogeneizar em “stomacher” por 2min. búzio. o Capítulo 19 do Compendium (Hall et al. como diluente.2 ou de solução de citrato de sódio (Na3C6H5O7. transferir para um banho-maria regulado a 37oC e manter no banho por mais 15min. recomenda unidade analítica de 10g e. como diluente.2 e suplementado com anti espumante. o Capítulo 9 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Duncan et al.Preparação de Amostras para Análise Queijos A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analítica de 10g e. lesma) e ouriços do mar (Echinoidae).2. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al.2H2O) 2%. Homogeneizar em “stomacher”. Paracaseína com problemas de solubilidade A ISO 8261 (2001) recomenda moer aproximadamente 20g da amostra. pré aquecidas a 40-45o. como diluente. Para leites e creme fermentados. retirar uma unidade analítica de 5g. mexilhão. berbigão. em particular.4±0. 2004) recomenda unidade analítica de 11g e.1g/100ml).5±0. apa. 23:50 .2 e suplementado com anti espumante. Agitar em “shaker” por 15min..solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7. conquilha.1%.5±0.2. 99ml de água destilada estéril ou solução de citrato de sódio (Na3C6H5O7.solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7. 90ml de solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7. a ISO 6887-3 (2003) recomenda unidade analítica de seis organismos inteiros e diluição inicial de 43 cap 01.cap 07. 90ml de leite em pó desnatado dissolvido em Tampão Fosfato (0. agitando periodicamente para facilitar a homogeneização. como diluente. 90ml de solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 7. ameijoa) e moluscos gastrópodes (caracol.solução de fosfato de potássio (K2HPO4) 2% com pH ajustado em 8.2H2O) 2%. Deixar descansar por mais 5min antes de preparar as diluições subsequentes. 2004) destacam que não deve ser utilizado Tampão Fosfato na preparação das amostras.5±0. 2001) e o Capítulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. Caseína e caseinatos A ISO 8261 (2001) recomenda unidade analítica de 10g e 90ml dos seguintes diluentes: ♦ Caseinatos . O diluente recomendado. Adicionar o diluente à amostra. Para iogurte e outros produtos fermentados ou acidificados (exceto leite e creme). caramujo..p65 43 1/7/2007. lingueirão.

homogeneizando em “stomacher”. transferir para uma bolsa estéril e completar a diluição até 1:10 com o mesmo diluente. adicionado uma parte da amostra para 2 partes de diluente (Água Peptonada 0.p65 44 1/7/2007. Água Salina Peptonada ou Água Peptonada Tamponada).1%. Homogeneizar em liquidificador por 30s a 2min. Água Salina Peptonada ou Água Peptonada Tamponada). adicionado uma parte da amostra para 2 partes de diluente (Água Peptonada 0. preparar uma diluição inicial de 1:2. homogeneizar em liquidificador por 30s a 2min. Pepinos do mar(Holothuroidea) e tunicados ou ascídias (Ascidiacea) A ISO 6887-3 (2003) recomenda cortar os organismos em pequenos pedaços.1%. transferir para uma bolsa estéril e completar a diluição até 1:10 com o mesmo diluente. 44 cap 01.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 1:2.cap 07. 23:50 .

como também para gêneros e espécies em particular. Cada um desses ensaios segue procedimentos diferenciados. cachos. Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares. gêneros e espécies que podem estar presentes. geralmente por unidade de massa ou volume. etc.Capítulo 3 Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas 3. Para a homogeneização da amostra e preparo das diluições. gênero ou espécie que se deseja contar. meio seletivo-diferencial) e as condições de incubação (temperatura e atmosfera). cadeias. baseado na premissa de que. que verificam a presença ou ausência do(s) microrganismo(s) alvo em uma dada quantidade da amostra. A análise microbiológica de alimentos é predominantemente cultural. os aeróbios psicrotróficos. A versatilidade da técnica é decorrente do princípio envolvido na contagem. que determinam a quantidade do(s) microrganismo(s) alvo na amostra. os bolores e leveduras. que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos. que dependem do(s) microrganismo(s) alvo. como Staphylococcus aureus. sem quantificar.. um grande número de ensaios são utilizados. que podem ser de dois tipos: ensaios qualitativos. foram também incluídas orientações das normas ISO 6887-1 (1999) e ISO 11133-1 (2000). INTRODUÇÃO A maioria das orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). Bacillus cereus e Clostridium perfringens. 2001).). mas a maioria deles utiliza as mesmas técnicas culturais básicas de microbiologia.cap 07. 23:50 . Variando-se o tipo de meio de cultura (meio de enriquecimento. e ensaios quantitativos. cada célula microbiana presente na amostra irá formar uma colônia isolada. objetivando a detecção ou a enumeração de microrganismos vivos. a contagem do Número Mais Provável (NMP) (Capítulo 4) e a contagem padrão em placas. Quando diferentes ou complementares às do Compendium. A contagem padrão em placas é utilizada tanto para a quantificação de grandes grupos microbianos. quando fixada em um meio de cultura sólido adequado. os enterococos e as bactérias lácticas. é possível selecionar o grupo. contido em placas de Petri. descrita nesse capítulo. como os aeróbios mesófilos. são utiliza- 45 cap 01. os clostrídios sulfito redutores. descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Swanson et al. não é possível estabelecer uma relação direta entre o número de colônias e o número de células.1.p65 45 1/7/2007. Essas técnicas são a detecção da presença/ausência (Capítulo 5). seguida da incubação das placas até crescimento visível. Essa correlação é feita entre o número de colônias e o número de “Unidades Formadoras de Colônias” (UFC). O procedimento básico é a inoculação da amostra homogeneizada (e suas diluições) em um meio sólido (com ágar). tétrades. recomendadas para ensaios realizados com metodologia da International Organization for Standardization. meio seletivo. Em função da multiplicidade de grupos.

estéreis e vazias.cap 07. Identificar todos os tubos e placas que serão inoculados. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra e diluições seriadas. 23:50 . Utilizar uma pipeta diferente para cada diluição. contagem de enterococos e contagem de bactérias lácticas. descrito nos capítulos específicos 3.1. Suas principais aplicações são os ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos. A incerteza da medição dos volumes não deve exceder 5% (ISO 6887-1. no máximo. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar ou próximo à chama de um bico de Bunsen. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. descritos no Capítulo 2 • Meio de cultura recomendado para o ensaio a ser realizado. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido. Geralmente a inoculação é feita para vários ensaios simultaneamente. à medida que sejam inoculadas. a diluição e a sigla do meio de cultura contido. Apresenta algumas limitações. se necessário. com capacidade de. abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta.p65 46 1/7/2007. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. com o código da amostra. pois isto facilitará a posterior mistura com o meio de cultura. 1999). PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento. 3. para não inocular a mesma placa mais de uma vez ou deixar alguma placa sem inocular. selecionar três diluições adequadas da amostra (vide notas abaixo) e inocular 1ml de cada diluição em placas de Petri separadas. a principal delas sendo a necessidade de fusão do meio de cultura antes do uso. 3. c) o plaqueamento em gotas (drop plate) ou d) a filtração em membrana.2. Alguns meios. Depositar o inóculo fora do centro da placa. b) o plaqueamento em superfície (spread plate). descrito nos capítulos específicos • Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias • Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado. Mudar as placas de posição. b) Inoculação. tem limite de detecção de 10 UFC/g para produtos sólidos ou 1 UFC/ml para produtos líquidos. podem ser utilizados quatro procedimentos básicos: a) o plaqueamento em profundidade (pour plate). PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE (POUR PLATE) O procedimento padrão de plaqueamento em profundidade.2. mantendo a fervura apenas o tempo necessário para a fusão do ágar. contagem de clostrídios sulfito redutores. 10ml. descrito abaixo. Resfriar imediatamente em água fria e manter à temperatura de 44 a 46oC até o momento do uso (em banho ou estufa com temperatura controlada). contagem de enterobactérias. chamada de plaqueamento. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. suplementados com componentes sensíveis ao calor depois da esterilização. 46 cap 01. Esse procedimento pode ser adaptado.2. Observar criteriosamente se a placa utilizada corresponde à amostra e à diluição que estão sendo inoculadas. Fundir os meios de cultura em banho com água fervente.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos dos os procedimentos descritos no Capítulo 2.2. não podem ser reaquecidos para fusão do ágar antes do uso. para limite de detecção de 1 UFC/g para produtos sólidos. a) Preparação das amostras e diluições seriadas. Para a inoculação no meio de cultura. Posicionar a pipeta em em ângulo de aproximadamente 45o e tocando o fundo da placa.

a diluição inicial recomendada é maior do que 1:10 (vide Capítulo 2).5 cloreto de trifeniltetrazólio) ao meio de cultura. tempo e atmosfera especificadas para cada ensaio. devem ser distribuídas numa bancada fria. a duração do procedimento completo não deve exceder 45 minutos. Se a contaminação esperada estiver acima dessa faixa. não deve exceder 20 minutos. no caso de produtos líquidos é possível inocular 1ml da amostra sem diluição e 1ml das duas diluições subseqüentes. por exemplo. Nota b. Se as contagens esperadas nesses produtos são baixas.1) Quando vários ensaios estiverem sendo conduzidos simultaneamente.1g de produtos sólidos ou 1ml de produtos líquidos.1.p65 47 1/7/2007. recomendase inocular mais do que três diluições.2) Alguns alimentos contendo partículas (farinhas. utilizar preferencialmente placas altas (20 x 100mm). no momento do plaqueamento.1) Selecionar as diluições em função do nível de contaminação estimado da amostra. 23:50 . Utilizando essa técnica. Se estiver abaixo. pois a maioria das bactérias formam colônias vermelhas na presença do TTC. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. adicionar 0.2) Na análise de alguns alimentos. mas pode-se inocular até 2ml da diluição inicial em uma mesma placa. ou um volume maior. observando criteriosamente se a identificação das placas corresponde ao meio de cultura utilizado..3. 10-2 e 10-3. a inoculação de 0. confundidas com as partículas. Para cada 100ml de meio. Nota b. Aguardar a completa solidificação do meio de cultura. para não haver risco de solidificação do ágar. numa superfície plana. Caso não seja possível estimar previamente o nível de contaminação da amostra. previamente esterilizada por filtração. oito a dez vezes no sentido horário e oito a dez vezes no sentido anti-horário. Verter 12 a 15ml do meio nas placas inoculadas.3) Para aumentar a precisão das contagens recomenda-se inocular duas placas por diluição (duplicata) e não utilizar pipetas com capacidade maior do que 2ml. por exemplo) podem dificultar a visualização das colônias na primeira diluição. A mistura do meio de cultura com o inóculo deve ser feita imediatamente após a adição do meio. de forma a obter placas com 25 a 250 colônias. distribuído em várias placas (2ml/placa). 2001): o tempo decorrido entre o depósito do inóculo em uma placa e a adição do meio de cultura não deve ultrapassar 10 minutos. No caso de produtos sólidos não é possível inocular a amostra sem diluição. se possível. Misturar o meio com o inóculo.5ml da solução aquosa 1% de TTC.01 e 0. para evitar respingos nas placas. deve-se inocular diluições mais altas.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas Nota b. movimentando suavemente as placas. As placas podem ser empilhadas durante a adição do meio e a homogeneização com o inóculo. retirar o meio de cultura do banho ou estufa a 44-46oC e. para não formar bolhas. deve-se manter.000 UFC/g ou ml. Nota c. c) Adição do meio de cultura. deve-se aumentar o volume inoculado da diluição inicial. Para facilitar esta etapa do trabalho. se o frasco estiver molhado. pode-se adicionar TTC (2. d) Incubação. Para evitar esse problema.001g ou ml da amostra. as diluições recomendadas são a 10-1. inverter as placas e incubar nas condições de temperatura. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido. Se o nível de inóculo esperado estiver na faixa de 2. mas.1 – 0. O meio de cultura deve atingir a temperatura de incubação no intervalo máximo de 2 horas. estabelecidas pelo Compendium (Swanson et al. para evitar respingos de meio nas bordas ou nas tampas. partindo-se da diluição inicial. Na recomendação da ISO 6887-1 (1999). Evitar agitação e movimentos bruscos do frasco. na recomendação do Compendium a duração do procedimento completo. para acelerar o resfriamento e a solidificação do meio. que correspondem a 0. da mesma forma descrita na Nota b.cap 07. Nota c. desde a preparação da primeira diluição até que todos os meios de cultura estejam inoculados. Evitar o 47 cap 01. em seguida. as atividades e o trabalho em equipe devem ser programados de forma a obedecer as seguintes condições. secar com papel toalha. A movimentação das placas deve ser feita cuidadosamente. para evitar o ressecamento e aderência do inóculo às placas. Além disso.500 a 25.

23:50 .2. inocu48 cap 01. permite a visualização de características morfológicas e diferenciais de colônias. cereus. 3. já distribuído em placas. Geralmente a inoculação é feita para vários ensaios simultaneamente. para limite de detecção de 10 UFC/g para produtos sólidos ou 1 UFC/ml para produtos líquidos. se necessário. com limite de detecção de 100 UFC/g para produtos sólidos ou 10 UFC/ml para produtos líquidos. Seguir as orientações do item 3.cap 07. antes de iniciar o procedimento. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade. porque aumenta o risco de espalhamento. o controle da umidade nas estufas pode ser necessário.1ml/placa de cada diluição.3. Com uma pipeta de no máximo 1ml (divisões de 0. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.1. a diluição e a sigla do meio de cultura contido. a) Preparação das amostras e diluições seriadas. contagem de S. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra e diluições seriadas.1). aureus e contagem de B.1. O procedimento padrão é a inoculação de 0. e) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. com as tampas parcialmente abertas) ou em estufa (50oC/1.1ml). Umidade excessiva também é indesejável. A inoculação superficial é considerada vantajosa sob alguns aspectos.3. em relação ao plaqueamento em profundidade. Preparar previamente as placas e secar em capela de fluxo laminar (30-60min. para garantir a distribuição homogênea da temperatura. Esse procedimento pode ser adaptado. com o código da amostra. PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE (SPREAD PLATE) A principal diferença do plaqueamento em superfície.5-2h ou 25-30oC/18-24h). descritos no Capítulo 2 • Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio. descrito nos capítulos específicos 3. pois não expõe os microrganismos ao calor do meio fundido. que não permite a inoculação de mais do que 0. observar os cuidados descritos no Capítulo 2.6. Num intervalo de 48h de incubação. Sua principal desvantagem é que o volume inoculado é limitado à capacidade de absorção de líquido pelo meio de cultura.1 em 0. permite a utilização de meios que não podem ser fundidos depois de prontos e não exige que os meios sejam translúcidos.3. descrito nos capítulos específicos • Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70% • Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado.p65 48 1/7/2007. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido. selecionar três diluições adequadas da amostra para a inoculação (vide nota b. as placas não podem perder mais do que 15% do seu peso por ressecamento.5ml por placa. Identificar todos os tubos e placas que serão inoculados. 3. b) Inoculação. Dependendo da temperatura.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos empilhamento excessivo das placas e não encher demasiadamente as estufas incubadoras. contagem de bolores e leveduras. Suas principais aplicações são os ensaios de contagem total de aeróbios psicrotróficos. é que a amostra e/ou suas diluições são inoculadas diretamente na superfície do meio sólido. facilita a transferência de colônias.

que o volume inoculado é dez vezes menor. Considerar. exigindo cuidados para que não permaneçam filmes de umidade na superfície. Observar criteriosamente se a placa utilizada corresponde à amostra e à diluição que estão sendo inoculadas e se contém o meio de cultura correto. as atividades e o trabalho em equipe devem ser programados de forma a obedecer as seguintes condições. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar ou próximo à chama de um bico de Bunsen. três gotas por diluição. No espalhamento das placas com 0. flambando a alça com etanol 70%.1. Para amostras com nível baixo de contaminação pode-se inocular um volume maior da primeira diluição. Isso torna a técnica extremamente econômica. Nota b.2) Na análise de alguns alimentos.3ml e uma placa com 0. numa mesma placa. distribuindo esse volume por várias placas. Na recomendação da ISO 6887-1 (1999). Utilizando essa técnica. a duração do procedimento completo não deve exceder 45 minutos.4) Para aumentar a precisão das contagens recomenda-se inocular duas placas por diluição (duplicata) e utilizar pipetas de no máximo 1ml para a transferência do inóculo de 0.4. não deve exceder 20 minutos e o espalhamento do inóculo na superfície do meio deve ser iniciado imediatamente após a inoculação das três diluições da amostra. a inoculação de 0. selecionar as diluições em função do nível de contaminação estimado da amostra. deve-se manter. é possível inocular.1ml de produtos líquidos.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas lar 0. desde a preparação da primeira diluição até que todos os meios de cultura estejam inoculados. PLAQUEAMENTO EM GOTAS (DROP PLATE) O plaqueamento em gotas é uma técnica de inoculação em superfície. à medida que sejam inoculadas. com limite de detecção de 1. de forma a obter placas com 25 a 250 colônias.1ml. Usar uma alça para cada placa ou fazer o espalhamento da placa de maior para a placa de menor diluição. se possível. A principal diferença é que o inóculo não é espalhado.p65 49 1/7/2007. Como as gotas ocupam um espaço mínimo. Seguir as mesmas orientações descritas para o plaqueamento em profundidade. Não é uma técnica rotineiramente utilizada 49 cap 01.01g de produtos sólidos ou 0. depositado no meio de cultura. a diluição inicial recomendada é maior do que 1:10 (vide Capítulo 2). O mais rápido possível. estabelecidas pela APHA (2001): a duração do procedimento completo. três diluições em triplicata. com a conseqüente formação de zonas de espalhamento.1ml. em gotas de 0.1) Assim como no plaqueamento em profundidade. A distribuição mais comumente utilizada é três placas com 0.2. deve-se aumentar o volume inoculado da diluição inicial. 3. d) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. entretanto.1ml de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas.3) Quando vários ensaios estiverem sendo conduzidos simultaneamente. Resfriar a alça na parte interna da tampa da placa antes de colocá-la em contato com o inóculo Nota b. c) Incubação. Seguir as orientações do item 3.cap 07. da mesma forma descrita na Nota b.01ml. Nota b. com uma alça de Drigalski.000 UFC/g de produtos sólidos ou 100 UFC/ml de produtos líquido.6. 23:50 . Se as contagens esperadas nesses produtos são baixas. Nota b. espalhar o inóculo por toda a superfície do meio. o tempo requerido para a absorção do líquido é maior. mas sim. até que o excesso de líquido seja absorvido. Mudar as placas de posição.3ml. entre uma placa e outra. para não inocular a mesma placa mais de uma vez ou deixar alguma sem inocular. com as mesmas vantagens do plaqueamento em superfície.

ou com o auxílio de um agitador tipo “vortex”.1% de ágar. selecionar três diluições adequadas da amostra para a inoculação (vide nota b. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. para que as gotas não escorram para fora dos respectivos quadrados.3. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra e diluições seriadas. descrito nos capítulos específicos 3.4.000 UFC/g ou 100 UFC/ml.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos na análise de alimentos. que o plaqueamento em gotas não se aplica a amostras com nível de contaminação abaixo de 1. descritos no Capítulo 2 • Pipetas graduadas de 0. invertendo 25 vezes em arco de 30cm.1) Selecionar as diluições em função do nível de contaminação estimado da amostra. 3. marcando o fundo com caneta vidrográfica (três linhas horizontais e três linhas verticais).2. Nota b. mas sim. Para cada ensaio que estiver sendo conduzido.1. que não permite a transferência de líquidos viscosos ou com sólidos em suspensão. d) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. Utilizando pipetas graduadas de 0. mas pode ser muito útil em situações que exijam a inoculação de um número grande de diluições.1 abaixo).cap 07. c) Incubação. comprovar que a contagem encontra-se abaixo desse limite. Antes de coletar o volume de cada diluição. Dividir a placa em 9 setores.01ml) ou pipetadores de ponteiras descartáveis. Identificar todos os tubos e placas que serão inoculados. descrito nos capítulos específicos • Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado.p65 50 1/7/2007. Pode. se a finalidade do ensaio não for quantificar. antes de iniciar o procedimento.1ml estéreis ou pipetadores de ponteiras descartáveis.01 em 0. Considerar. Aguardar a completa absorção do líquido das gotas pelo meio de cultura e incubar nas mesmas condições recomendadas para o plaqueamento em profundidade.4. entretanto. 50 cap 01.1ml (divisões de 0. Mantendo as placas numa superfície plana. o que requer aproximadamente 30 minutos. para facilitar a posterior fixação das gotas na superfície do meio de cultura. para a inoculação nas placas. a) Preparação das amostras e diluições seriadas. não esquecer de agitar vigorosamente os tubos de diluição. A primeira razão desta limitação é o pequeno volume inoculado e a segunda é a capacidade da pipeta. entretanto. Não espalhar as gotas. preparar o diluente suplementado com 0.6. porém. para liberação das gotas • Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio.01ml de cada diluição em três quadrados adjacentes da placa (triplicata). Preparar previamente as placas com os meios de cultura e secar em estufa por 24 horas a 25-30oC. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. 23:50 . a diluição e a sigla do meio de cultura contido. ser utilizado para amostras com nível mais baixo de contaminação. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. comum nas duas primeiras diluições de alimentos sólidos. com o código da amostra. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade. Seguir as orientações do item 3. aguardar que o líquido seja absorvido pelo meio de cultura. Esse procedimento deve ser feito com cuidado. de forma a obter gotas com 30 colônias. no máximo. depositar três gotas de 0. b) Inoculação.

contagem de enterococos e contagem de coliformes totais/fecais/E. outros produtos líquidos e produtos sólidos que possam ser transformados numa solução límpida. sendo indicado para amostras com contagens abaixo do limite de detecção dos outros procedimentos. Os copos de filtração devem ser embrulhados separadamente em papel kraft e também esterilizados em autoclave (121oC/30min). próximo à chama de um bico de Bunsen. 3.2. muito úteis quando o número de amostras para filtrar é alto. o porta filtro deve ser flambado com álcool e o copo de filtração deve ser substituído. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. sem sólidos em suspensão. concentrando na membrana os microrganismos presentes na quantidade inoculada. embrulhado em papel kraft e esterilizado em autoclave (121oC/30min). antes de iniciar o procedimento. na indisponibilidade desta. Identificar todos os tubos e placas que serão inoculados. sobre essa. por exemplo. que possam ser filtradas através de uma membrana de poro 0. conectado à uma bomba de vácuo.5. A cada 10 amostras recomenda-se filtrar no conjunto 100ml de um dos diluentes recomendados 51 cap 01. com o código da amostra. para medição de volumes de amostra • Conjunto de filtração previamente esterilizado • Bomba de vácuo • Membranas de 47mm de diâmetro. preso por uma presilha. Alternativamente podem ser utilizados copos descartáveis estéreis. para acomodar o filtro membrana e.cap 07.45mm. descritos no Capítulo 2 • Proveta de 100 ou 200ml estéril. Podem também ser utilizados “manifolds”. O conjunto é preparado ajustando-se a membrana estéril no porta filtro (com a face quadriculada para cima) e o copo de filtração sobre a membrana. descrito nos capítulos específicos • Placas estéreis vazias e almofadas estéreis (“pads”) opcionais para uso dos meios na forma de caldo • Estufa incubadora regulada na temperatura especificada pelo ensaio a ser realizado. para proceder à filtração.5. Nota a1) Entre uma amostra e outra.45mm. mergulhadas em etanol • Placas de Petri contendo o meio recomendado para o ensaio. O limite de detecção é de 1 UFC por volume inoculado. O conjunto de filtração é composto de um porta filtro. No momento do uso as duas partes devem ser desembrulhadas em uma câmara de fluxo laminar ou. a) Preparação do conjunto de filtração.5. Conecta-se então o kitasato à bomba de vácuo.1. Antes do início das análises o porta filtro deve ser acoplado ao kitasato. contagem de bactérias lácticas. descrito nos capítulos específicos 3. recolhe o líquido filtrado. refrigerantes. Sua principal vantagem é que permite a inoculação de maiores volumes da amostra. um kitasato e um copo de filtração.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas 3. brancas e quadriculadas • Pinças para transferência das membranas. contagem de bolores e leveduras.p65 51 1/7/2007. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra e diluições seriadas. 23:50 . antes de posicionar uma nova membrana. O porta filtro é um tipo de funil cuja parte superior é plana. Suas principais aplicações são os ensaios de contagem total de aeróbios mesófilos. o copo de filtração. A parte inferior do porta filtro é acoplada ao kitasato que. FILTRAÇÃO EM MEMBRANA O procedimento de filtração em membrana é limitado à analise de amostras líquidas límpidas. porosidade de 0. coli em água. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. que têm vários porta filtros e permitem filtrar várias amostras simultaneamente. a diluição e a sigla do meio de cultura contido. PROCEDIMENTO Assim como recomendado no plaqueamento em profundidade. como sal e açúcar.

Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos

no Capítulo 2, estéril, incubando essa membrana para verificar possível contaminação cruzada entre as amostras. Após a filtração de 30 amostras o conjunto deve ser novamente esterilizado em autoclave, reiniciando uma nova série de filtrações. Se o intervalo entre uma filtração e outra for maior do que 30min e o conjunto estiver sendo utilizado fora da capela de fluxo laminar, então recomenda-se autoclavar todo o conjunto novamente, mesmo que não tenha sido atingido o limite de 30 amostras.

b) Preparação das placas. Na contagem pelo método de filtração em membrana as placas mais comumente utilizadas são as de 50mm de diâmetro e 9mm de altura. Se for utilizado meio sólido, devem ser preparadas previamente, da mesma forma recomendada para o plaqueamento em superfície, distribuindo-se porções de 5ml do meio de cultura. Também é comum a prática de se utilizar o meio na forma de caldo, situação em que não é necessária a preparação prévia das placas. No momento da análise, deve-se colocar uma almofada absorvente (“pad”) estéril no interior das placas também estéreis e embeber a almofada com porções de 2ml do mesmo meio, na forma líquida. c) Homogeneização da amostra e retirada da unidade analítica. Homogeneizar a amostra seguindo os procedimentos descritos no Capítulo 2. Medir 100ml numa proveta estéril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtração, evitando respingos. Se o copo do conjunto de filtração for graduado e a escala contiver a marcação de volume requerida, o volume da amostra pode ser medido diretamente, sem a utilização da proveta. d) Diluição seriada da amostra. Como o método de filtração é uma técnica de concentração dos microrganismos em amostras com baixas contagens, geralmente não são feitas diluições seriadas da amostra. O procedimento usual é a filtração de 100ml, que podem ser fracionados em duas porções de 50ml, 4 porções de 25ml ou 3 porções de 70, 25 e 5ml, respectivamente. A seleção do volume a ser filtrado, entretanto, depende da contaminação estimada na amostra, de forma a resultar em placas com contagens na faixa de 20 a 200 colônias. Se for necessário o preparo de diluições, utilizar o mesmo procedimento descrito no Capítulo 2. e) Filtração. Ligar a bomba de vácuo e proceder à filtração. Após a passagem da amostra, ainda com a bomba ligada, enxaguar as paredes do copo com 20 a 30ml de um dos diluentes recomendados no Capítulo 2, para recolher eventuais contaminantes aderidos. Repetir esse procedimento mais uma vez. Desligar a bomba de vácuo antes que a membrana seque excessivamente. Quando o volume a ser filtrado for menor do que 20ml, adicionar ao copo do conjunto de filtração cerca de 20-30ml de diluente, antes da adição da amostra. Não é necessária uma medida exata do volume de diluente, cuja função é aumentar o volume a ser filtrado, facilitando uma melhor distribuição dos microrganismos na membrana. f) Transferência e incubação da membrana. Retirar o copo e, com uma pinça flambada e resfriada, transferir a membrana para a placa com o meio de cultura, com a face quadriculada para cima. Ao colocar a membrana no meio de cultura é importante que toda a superfície fique completamente aderida ao meio, para que haja contato dos microrganismos com os nutrientes. Se houver formação de bolhas, deve-se levantar a borda da membrana mais próxima da(s) bolha(s) e recolocá-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). Incubar as placas nas condições recomendadas pelo ensaio (descrita nos capítulos específicos), invertidas e, preferencialmente, acondicionadas em sacos ou bandejas com papel toalha ou papel de filtro úmido, para evitar desidratação. g) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. Seguir as orientações do item 3.6.4. 52

cap 01- cap 07.p65

52

1/7/2007, 23:50

Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas

3.6. CONTAGEM DAS COLÔNIAS E CÁLCULO DOS RESULTADOS
As instruções apresentadas nesse item são aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias desenvolvidas nas placas, após o período de incubação, são contadas e consideradas no cálculo. No caso de ensaios que utilizam meios diferenciais, para distinguir o(s) microganismo(s) alvo da microbiota acompanhante (outros microganismos que podem crescer nas mesmas condições), apenas as colônias típicas são contadas e consideradas no cálculo. Esse é o caso da contagem de enterococos e enterobactérias, que seguem as orientações dos capítulos específicos. Da mesma forma, no caso dos ensaios que exigem a confirmação das colônias, apenas a porcentagem de colônias confirmadas é considerada no cálculo. Esse é o caso da contagem de bactérias lácticas, clostrídios sulfito redutores, C. perfringens, S. aureus e B. cereus, que também seguem as orientações dos capítulos específicos. 3.6.1. PLAQUEAMENTO EM PROFUNDIDADE Para a contagem, selecionar as placas sem espalhamento, com número de colônias entre 25 e 250. Contar as colônias com o auxílio da lupa de um contador de colônias, para facilitar a visualização. Utilizar um contador de colônias que tenha o fundo quadriculado em cm2, como guia para a contagem. Se não houver placas nessas condições ideais, seguir as orientações das regras 5 a 12, para a contagem. Para calcular os resultados, há duas situações a considerar. A primeira é situação padrão, em que unidade analítica é uma massa ou volume da amostra, homogeneizada com o diluente. A segunda é a situação em que as amostras foram preparadas pelas técnicas do esfregaço de superfície ou da lavagem superficial. Em todas as situações, usar notação exponencial na apresentação dos resultados, com apenas uma casa decimal depois da vírgula e aproximando para cima quando a segunda casa decimal for igual a cinco ou maior. A aproximação deve ser feita no número final obtido, depois de efetuados todos os cálculos. 3.6.1.1. Cálculo dos resultados na situação padrão A situação padrão é aquela em que unidade analítica é uma massa ou volume da amostra, homogeneizada com o diluente. As regras para o cálculo dos resultados são: Regra 1 - Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a amostra sem diluição, sem duplicata, o número de unidades formadoras de colônias (UFC) é igual ao número de colônias (Exemplos 1 e 2). Se foi feita duplicata, o número de UFC é igual à média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata (Exemplos 3 e 4).
No colônias na(s) placa(s) da diluição sem diluição (100) 10-1 10-2 Sem duplicata 1 199* 8 0 2 245* 22 2 Com duplicata Exemplo 3 4 62* - 57* 123*- 136* 6-5 12 - 10 0-0 Contagem UFC/ml 199 = 2,0 x 10 2 245 = 2,5 x 10 2 (62 + 57)/2 = 59,5 = 6,0 x 101 (123 + 136)/2 = 129,5 = 1,3 x 102

*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado.

53

cap 01- cap 07.p65

53

1/7/2007, 23:50

Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos

Regra 2 - Se a contagem foi feita numa placa inoculada com a diluição 10-1 ou maior, sem duplicata, calcular o número de UFC/g ou ml multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. O inverso da diluição 10-1 é 101, o inverso da 10-2 é 102 e assim por diante (Exemplos 5 e 6). Se foi feita duplicata, considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata e multiplicar pelo inverso da diluição (Exemplos 7 e 8).
Exemplo Sem duplicata 5 6 Com duplicata 7 8 No colônias na(s) placa(s) da diluição 10-1 10-2 10-3 199* Inc Inc - Inc Inc - Inc 18 245* 62* - 57* Inc - Inc 2 22 6-5 239*- 242* Contagem UFC/g ou ml 199 x 101 = 2,0 x 103 245 x 102 = 2,5 x 104 [(62 + 57)/2]x 10 2 = 59,5 x 102 = 6,0 x 10
3 3 3

*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Inc = Incontável

[(239 + 242/2] x 10 = 135,5x 10 = 1,4 x 105

Regra 3 – Se o volume inoculado da primeira diluição (ou da amostra sem diluição) foi diferente de 1ml e a contagem foi feita na placa inoculada com esse volume, valem as regras anteriores mas o número de colônias deve ser dividido pelo volume inoculado, para calcular o resultado (Exemplos 9, 10, 11 e 12).
Exemplo Sem duplicata 9 10 Com duplicata 11 12 No colônias na(s) placa(s) da diluição (volume inoculado) 10-1 (2ml) 10-2 (1ml) 10-3 (1ml) 199* 123* 62* - 57* 27* - 35* 18 2 6-5 3-3 2 0 0-0 0-0 Contagem UFC/g ou ml

(199/2) x 101 = 1,0 x 103 (123/2) x 101 = 6,2 x 102 [(62 + 57)/2)]/2 x 101 = 29,75 x 101 = 3,0 x 102 [(27 + 35)/2)]/2 x 101 = 15,5 x 101 = 1,6 x 102

*Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado.

Regra 4 – Se a diluição inicial não foi decimal (1:20, 1:50, 1:200, etc.), valem as regras 2 e 3 mas é necessário inserir nos cálculos a diluição inicial aplicada. Considerando uma unidade analítica de m gramas ou mililitros, diluída em v mililitros de diluente, a diluição inicial é igual a m/(m+v), ou seja, unidade analítica dividida pelo volume total (diluente + unidade analítica). As diluições decimais subseqüentes são a inicial multiplicada por 10-1 (1º decimal), a inicial multiplicada por 10-1 (2o decimal) e assim por diante. Por exemplo, para uma unidade analítica de 50g preparada com 950ml de diluente, a diluição inicial é de 50/(50+950) = 50/1.000 = 1/20 (1:20). A 1o decimal é 10-1/20, a 2o decimal é 10-2/20 e assim por diante. O cálculo dos resultados ainda é feito multiplicando-se o número de colônias pelo inverso da diluição mas, nesse caso, o inverso da diluição é a fração invertida: inverso da diluição 1/20 = 20/1, inverso da 10-1/20 = 20x101, inverso da 10-2/20 = 20x102 e assim por diante (Exemplos 13, 14, 15, 16, 17 e 18)

54

cap 01- cap 07.p65

54

1/7/2007, 23:50

Inc Inc .1). valor estimado.cap 07.a.1) 6.b. Considerar o número de colônias na 1ª diluição inoculada como sendo 1 e calcular o resultado de acordo com as regras 1. Se não for possível contar todas as colônias da placa. apresentando a média como resultado final (Exemplos 20 e 32 do Quadro 3. Nestes casos há quatro alternativas para estimar o número de UFC/g ou ml. considerar apenas o menor (Exemplos 19 e 31 do Quadro 3. Essas regras são apresentadas a seguir. 23:50 . Regra 5 – Uma placa da duplicata com contagem acima ou abaixo da faixa de 25-250 colônias. contar e calcular o número de UFC a partir da contagem obtida (Exemplos 23 e 35 do Quadro 3.Inc 21 . em placas da mesma diluição.000 = 1/40 25/500 = 1/20 10/500 = 1/50 10/300 = 1/30 25/375 = 1/15 25 10g 10g 237*-229* Inc . 6. calcular o número de UFC (Exemplos 21 e 33 do Quadro 3. Relatar o resultado final como menor do que o valor obtido no cálculo. 6 quadrados consecu- 55 cap 01. <50 e <30 UFC/g ou ml. Regra 9 . Nos exemplos 5 a 8 da regra 2 seria <10/g ou ml (est). sendo aplicadas algumas regras básicas para o cálculo dos resultados. o resultado deve ser apresentado como contagem estimada (est). Mas são bastante freqüentes as situações em que as placas não se apresentam em condições tão ideais. <15.1) e apresentar o resultado como contagem estimada (est).Duas diluições consecutivas com 25-250 colônias.1). Contar as colônias nas placas com número mais próximo de 25.a. sem espalhamento.1) Regra 6 . Nos exemplos 9 a 12 da regra 3 seria <5/g ou ml (est).20 62* . Em todos os casos.3x105 [(237+229)/2] x 20 = 4.7x10 3 [(62+57)/2] x 50x10 1 = 3. <40.57* Inc . Se a outra placa apresenta contagem na faixa de 25 a 250. com exemplos no Quadro 3.0x10 4 [(239+242)/2] x 30x10 2 = 7. 9.p65 55 1/7/2007. Regra 8 . considerar o número de colônias de ambas as placas no cálculo do resultado (Exemplo 30 do Quadro 3. 3 ou 4.5x10 3 Sem duplicata 10/500 = 1/50 25/1. Se um dos resultados for maior do que o dobro do outro.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas Exemplo 13 14 15 Com duplicata 16 17 18 Unidade analítica 10g 25g 25 Volume diluente 490ml 350ml 975ml 475ml 490ml 290ml Diluição inicial No colônias na(s) placa(s) da diluição 2o decimal Inicial 1o decimal 199* 280 Inc 18 30* Inc 2 133* 2-1 6-5 239*. então considerar ambos os resultados. respectivamente.Inc *Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado. Regra 7 .Nenhuma placa atingiu 25 colônias. 2. mas o número de colônias/cm2 estiver abaixo de 10. 9. o resultado final seria <1/ml (est).Nenhuma placa com crescimento. Se nenhuma placa houvesse apresentado crescimento nos exemplos 1 a 4 da Regra 1. Se um dos resultados não ultrapassar o dobro do outro. com número de colônias na faixa de 25 a 250. Se for possível contar todas as colônias da placa.2x10 5 30x15x101 = 4.0x104 133x40x102 = 5. contar as colônias em 12 quadrados de 1cm2. Inc = Incontável Os exemplos acima são de cálculos em condições ideais.b.1. <20.Todas as placas com mais de 250 colônias. Calcular o número de UFC de cada diluição e comparar os resultados.242* 2 UFC/g ou ml amostra 199 x 50 = 1. Nos exemplos 13 a 18 da regra 4 seria: <50.

2. Se numa diluição o número de colônias ficou acima de 250 e na seguinte ficou abaixo.Placas com espalhamento.1). placas de 100mm tem diâmetro interno por volta de 9cm e área total de aproximadamente 65cm2. Para contar placas com zonas de espalhamento do primeiro tipo. 9. A distinção entre os dois tipos é facilmente visualizada. 23:50 . Se a suspeita de presença de substâncias inibidoras na amostra for alta. porque no espalhamento do primeiro tipo sempre se pode observar crescimento de colônias individuais. 9. Há dois tipos distintos de espalhamento. Calcular a média de colônias/cm2. reportar o resultado como “acidente de laboratório” e repetir o ensaio. contar as colônias em quatro quadrados representativos da distribuição das colônias nas placas e calcular o número de UFC da mesma forma utilizada no caso de 12 quadrados (Exemplo 25 do Quadro 3. onde d é o diâmetro interno. contar como indicado na regra 5 e calcular o número de UFC a partir da contagem obtida (Exemplos 27 e 36 do Quadro 3. a partir da média. O primeiro é resultante da desintegração de agrupamentos de células.1). Considerar o resultado como “acidente de laboratório” e repetir o ensaio.c. Se o número de colônias/cm2 for maior do que 10. Apresentar o resultado como contagem estimada (est) (Exemplos 28 e 37 do Quadro 3. O segundo é resultante da inadequada mistura do inóculo com o meio. durante a mistura do inóculo com o meio de cultura. Utilizar este número total de colônias para calcular o número de UFC (Exemplo 24 do Quadro 3.1). Por exemplo. Regra 12 . livre de espalhamento e contar as colônias em diversos quadrados de 1cm2.cap 07.1). As placas com espalhamento poderão ser contadas nas seguintes condições: se nenhuma das zonas de espalhamento individuais tiver tamanho superior a 25% da área da placa e.p65 56 1/7/2007. utilizando os quadrados demarcados no contador de colônias como guia.Placas em que o crescimento é proporcionalmente maior nas maiores diluições. levando à formação de filmes de umidade na superfície do meio ou entre o meio e o fundo da placa. não contando as colônias individualmente dentro dessas zonas. enquanto no outro. cada zona deve ser contada como uma única UFC. se a área total coberta por zonas de espalhamento não ultrapassar 50% da placa. Lembrar que a área total da placa é igual a pd2/4. Esta situação pode ser decorrente da contaminação acidental da amostra durante o plaqueamento. a massa de crescimento é contínua. de erro na identificação da diluição nas placas ou da presença de substâncias inibidoras na amostra. devem ser tomadas medidas preventivas para minimizar esse problema.d. não há ocorrência de colônias individuais. Se o número de colônias/cm2 for maior do que 100. do Capítulo 2) (Exemplo 29 do Quadro 3.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos tivos na horizontal e 6 quadrados consecutivos na vertical. selecionar as placas com contagem mais próxima de 250. determinar o número total de colônias na placa. ainda. Para contar placas com zonas de espalhamento do segundo tipo. multiplicando a média pela área total da placa. selecionar uma região da placa. Regra 11 . Regra 10 – Número de colônias acima de 250 numa diluição e abaixo de 25 na seguinte. utilizar na repetição um procedimento adequado para suprimir ou reduzir a influência desses componentes no resultado (vide Quadro 2. Se o laboratório observar ocorrência de espalhamento do segundo tipo. Em caso contrário.1). Calcular o número médio de colônias/ cm2 e.1). apresentar o resultado como maior do que área total da placa x inverso da diluição (Exemplo 26 do Quadro 3. com tamanho superior a 25%. multiplicar pela área total da placa (65cm2 no caso de placas com diâmetro externo de 100mm) e utilizar este valor estimado para calcular o número de UFC. 56 cap 01. em mais de 5% das placas preparadas num período de trabalho.

Essa relação. Inc = Incontável. em que um esfregaço de 100cm2 de área fosse suspendido em 10ml de diluente. calcular a quantos cm2 corresponde cada mililitro da suspensão. dependendo do tipo de amostra e objetivo da amostragem.5 x103 [(228+240)/2]x101 + [(28+26)/2]x102 = 2.328* 1-2 2-2 0-0 0-0 320*. Para tanto. cada mililitro de diluente corresponde a 4cm2 de superfície.8 x 102 est < 1x101 = <10 est 370x103 = 3. Exemplos do cálculo dos resultados do plaqueamento em profundidade em condições não ideais.5x103 = 2. deve-se calcular o número de UFC por mililitro do diluente onde foram recolhidos os “swabs”. gotas ou filtração em membrana).Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas Quadro 3. Est = Estimada.1. em função das diluições inoculadas dessa suspensão. que amostra 100cm2 e recolhe as esponjas em 25ml de diluente. Em seguida.6. Numa outra situação.30 28*.5 x 103 [(18+16)/2]x101 = 17x101 = 1.520 = 2. É recomendável trabalhar sempre com volumes de diluente múltiplos das áreas amostradas. calcular o resultado.295* 2-2 [(239+328)/2]x103 = 283. dividido por dez. que amostra uma área de 50cm2 e recolhe os “swabs”em 10ml de diluente.5x103 = 3. cada mililitro de diluente corresponde a 5cm 2 de superfície.Inc 42 . No procedimento padrão descrito no Capítulo 2 para amostragem com “swabs. Inicialmente. 9a 11 12 Inc Inc 18* 0 Inc Inc Inc Inc Inc Inc 27 140* 243* 2 0 Inc Inc Inc Inc 325* 243* Esp 215 32 34* 0 0 370* 8/cm * 2 Regras usadas No colônias na(s) placa(s) da diluição 10-1 10-2 10-3 Contagem UFC/g ou ml *** 140x102 = 1.Inc 224*. No caso acima.162* 228*. 23:50 . Esp = Espalhamento. dividido por quatro.263* Inc .2. dividido por cinco. a contagem em UFC/cm2 será igual ao valor obtido por ml de suspensão.Inc 287*.4 x 106 est > 100x65x103 = > 6.Inc 138*. No procedimento descrito no Capítulo 2 para amostragem com esponjas. a contagem em UFC/cm2 será igual ao valor obtido por ml de suspensão.Inc 23 .4 x104 Acidente de Laboratório 2 21/cm * >100/cm * 2 20 Esp 20 37 11. Exemplo Sem duplicata 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Com duplicata 30 31 32 33 34 35 36 5 6a 6b 7 8 9a 10. UFC/cm2 = UFC/ml da suspensão x Área amostrada Volume de diluente de coleta 57 cap 01.5 x 106 est 325x102 = 3. para facilitar os cálculos.4 x 104 *Contagens efetivamente utilizadas no cálculo do resultado.7 x 105 est 8x65x103 = 520x103 = 5.4 x 104 [(243x102)+(34x103)]2 = 2.2 x 105 est 21x65x103 = 1.16* 0-0 Inc . Nesse caso. cada ml de suspensão corresponderia a 10cm2 de área e o número de UFC/cm2 seria igual ao valor obtido por ml de suspensão. por exemplo.19 239*.a 6.8 x 103 6.8 x105 [(138+162)/2]x101 = 150x101 = 1.cap 07.180* 28*-Esp [(224+180)/2]x102 + 28x103 = 24. 3.240* 18*.p65 57 1/7/2007.365x103 = 1.7 x 102 <10 [(320+295)/2]x103 = 307. 9a Inc . Para tanto.b 7 8 9a 9b 9c 9d 10. da mesma forma descrita para o plaqueamento utilizado (profundidade.9 x 104 18x101 = 1. entretanto. pode ser alterada a critério do laboratório.100 = 2.3 x104 est 243x102 = 2. 6a Inc . considerar essa suspensão como se fosse uma amostra sem diluição e.1 x 105 [(287+263)/2]x101 = 275x101 = 2. superfície. deve-se converter a contagem de UFC/ml da suspensão para UFC/cm2 da amostra.1.26* 2-0 0-0 Inc . Cálculo dos resultados para amostras preparadas pela técnica do esfregaço de superfície (“swabs” ou esponjas) Os resultados devem ser expressos em UFC por cm2 de amostra.

superfície. da mesma forma indicada para a análise de alimentos. Se a diluição foi 1:1. cada mililitro de lavado corresponderá a 5cm3. A contagem das colônias e o cálculo dos resultados são feitos da mesma forma descrita para o plaqueamento em profundidade. após o período de incubação.6. em função do volume de diluente usado na lavagem.6kg for lavada com 400ml de diluente. em função das diluições inoculadas dessa suspensão. Por exemplo. Esse valor é igual à capacidade da embalagem dividida pelo volume de diluente usado.2. deve-se primeiro calcular a quantos cm3 da embalagem corresponde 1ml de lavado. PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE Assim como no plaqueamento em profundidade. Inicialmente. o número de UFC/g de amostra será igual ao número de UFC/ml de lavado.cap 07. Em seguida. deve-se calcular o número de UFC por mililitro de água de lavagem. calcular o resultado da mesma forma descrita para o plaqueamento utilizado (profundidade. o resultado final deve 58 cap 01. os resultados devem ser expressos em UFC/g de amostra. Cálculo dos resultados para amostras preparadas pela técnica da lavagem superficial No caso de alimentos. são contadas e consideradas no cálculo. considerar essa suspensão de lavagem como se fosse uma amostra sem diluição e. Neste caso. se uma carcaça de frango de 1. em função da diluição inicial utilizada na lavagem (peso de amostra: volume de diluente). deve-se converter o número de UFC/ml de água de lavagem para UFC/cm3. deve-se primeiro calcular a quantos gramas de amostra corresponde 1ml de lavado. gotas ou filtração em membrana).Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 3. dividido por quatro. 23:50 . Em seguida. os resultados podem ser expressos em UFC/cm3 da embalagem ou em UFC por embalagem. UFC/embalagem = UFC/cm3 x Capacidade da embalagem 3. deve-se converter o número de UFC/ml da suspensão de lavagem para UFC/g de amostra. Para tanto. que é igual ao peso da amostra lavada dividido pelo volume de diluente usado. UFC/cm3 = UFC/ml da suspensão x Volume de diluente usado na lavagem Capacidade da embalagem Para determinar o número de UFC por embalagem. ou seja se uma embalagem de 500ml foi lavada com 100ml de diluente. cada ml de lavado corresponderá a 1g de amostra e o número de UFC/g será igual ao valor obtido por ml.1. deve-se calcular o número de UFC por mililitro do diluente de lavagem. o número de UFC/cm3 será igual ao número de UFC/ml de lavado dividido por cinco.3. as recomendações apresentadas nesse item são aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias desenvolvidas nas placas.6. Inicialmente. Neste caso. Entretanto. seguindo as mesmas regras. Se a diluição for diferente de 1:1. basta multiplicar o número de UFC/cm3 pela capacidade da embalagem.p65 58 1/7/2007. cada ml de lavado corresponderá a 4g de amostra. Para isso. Volume de diluente usado na lavagem Peso de amostra lavada UFC/g = UFC/ml da suspensão x No caso de embalagens.

para obter o número de UFC/ml. Selecionar para contagem placas com 20 a 200 colônias. Se o número de colônias por quadrícula estiver na faixa de 10 a 20. as recomendações apresentadas nesse item são aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias desenvolvidas nas placas. com aumento de 10 a 15 vezes e. as recomendações apresentadas nesse item são aplicáveis aos ensaios em que todas as colônias desenvolvidas nas placas. Se foi feita a distribuição de 1ml da primeira diluição em várias placas. 3.6.cap 07. Se foi feita a filtração de uma solução obtida de amostra sólida (sal ou açúcar.1g de amostras. Se o número de colônias por quadrícula for maior do que 20. após o período de incubação. 23:50 . Regra 2. para facilitar a visualização posicionar as placas de forma a obter uma iluminação perpendicular ao plano da membrana.4. Regra 4. Exemplo: Dissolvidas 25g de açúcar em 225ml de água peptonada 0. o número de colônias dessa diluição é a soma de todas as placas. para obter o número de UFC/ml. valem as regras 1. em 100ml foi filtrada uma quantidade equivalente a 10g da amostra sólida. então não é necessário multiplicar por 10.3. Seguir as regras abaixo para contagem e cálculo do número de UFC/ml: Regra 1. multiplicar pelo inverso da diluição e em seguida por 100. expressar o resultado como maior do que 2000 dividido pelo volume filtrado.6. filtrados 100ml da solução e contadas 120 colônias na membrana. Se o número de colônias por quadrícula da membrana for menor ou igual a 2.p65 59 1/7/2007. por exemplo). Contar as colônias das gotas com no máximo 30 colônias. tirar a média do número de colônias nas três gotas da diluição inoculada. Se o cálculo do resultado for feito com a contagem dessa diluição. contar 10 quadrículas e tirar a média por quadrícula. portanto. contar apenas 5 quadrículas para tirar a média e calcular o número de UFC/ml da mesma forma. 2 e 3 mas o valor deve ser convertido para UFC/g em função quantidade de amostra na solução. FILTRAÇÃO EM MEMBRANA Assim como no plaqueamento em profundidade. contar todas as colônias presentes e dividir pelo volume filtrado. Para calcular o número de UFC/g ou ml. Proceder à contagem das colônias com o auxílio de um microscópio estereoscópico. para levar em conta o volume 10 vezes menor inoculado. após o período de incubação. são contadas e consideradas no cálculo. PLAQUEAMENTO EM GOTAS Assim como no plaqueamento em profundidade.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos em Placas ser multiplicado por 10 (dez).1% (diluição 1:10). Se o número de colônias por quadrícula estiver na faixa de 3 a 10. Então: UFC/100ml de solução = UFC/10g de amostra = 120 ⇒ UFC/g = 120/10 = 12 59 cap 01. Multiplicar esse valor por 100 e dividir pelo volume filtrado. para considerar o volume inoculado (UFC/g ou ml = No Colônias X 100/diluição). são contadas e consideradas no cálculo. 3. Regra 3. Cada mililitro da solução eqüivale a 0.

p.J.53-67.7. & HANLIN. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General Guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory. R. 60 cap 01.p65 60 1/7/2007. (eds. The International Organization for Standardization. 1999. F. J. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions. P. 1st ed. In: DOWNES. The International Organization for Standardization. K. & ITO. 2001. PETRAN. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Culture methods for enumeration of microorganisms. REFERÊNCIAS ISO 6887-1.H. Washington: American Public Health Association (APHA). 23:50 . K. 1st ed. SWANSON. Chapter 6. ISO/TS 11133-1.L.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 3.). Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples.M.cap 07. 4th ed. 2000.

No caso de amostras sólidas. No caso de amostras líquidas. O número de alíquotas com microrganismos (tubos com crescimento positivo após a incubação) e alíquotas sem microrganismos (tubos com crescimento negativo após a incubação) permite estimar. A técnica do número mais provável é um método de análise quantitativo que permite determinar o número mais provável (NMP) do(s) microrganismo(s) alvo na amostra. Uma delas é a possibilidade de inocular quantidades maiores da amostra. através da cuidadosa agitação do material. e depois transferindo a cultura para meios seletivos.p65 61 1/7/2007. tomando-se as alíquotas a partir dessa diluição. A inoculação direta das amostras sólidas. 2001). Quando diferentes ou complementares às do Compendium foram também incluídas orientações do Bacteriological Analytical Manual (BAM) Online (Blodgett. 23:50 .. a técnica do NMP apresenta algumas vantagens em relação à contagem padrão em placas. aumentando-se proporcionalmente o volume de meio de cultura. subdividindo a amostra em alíquotas. algumas alíquotas vão conter microrganismos e outras não. Há situações em que as alíquotas da amostra sólida são inoculadas diretamente no caldo de cultura. INTRODUÇÃO A maioria das orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). Como a inoculação é feita em meios líquidos. é menos comum e depende do tipo de amostra. entretanto. mais favorável aos microrganismos injuriados. por cálculo de probabilidade. Outra vantagem é que permite a introdução de etapas de recuperação de injúrias. Isso confere á técnica uma sensibilidade maior do que a da contagem em placas e uma grande flexibilidade no estabelecimento do limite de detecção. utilizando um meio não seletivo para a inoculação inicial. contendo um meio de cultura líquido adequado ao seu crescimento. dependendo da quantidade dos microrganismos na amostra. pode ser atingida no preparo e homogeneização da primeira diluição. essa condição pode ser atingida sem dificuldade. através da inoculação de alíquotas dessa amostra em uma série de tubos. descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Swanson et al. 2003) e da norma ISO 6887-1 (1999). A determinação do número de microrganismos é baseada no princípio de que.Capítulo 4 Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) 4. a densidade original dos microrganismos na amostra. Essa aplicação da teoria da probabilidade depende de que os microrganismos estejam distribuídos ao acaso e homogeneamente por toda a amostra. 61 cap 01. recomendada para ensaios realizados com metodologia da International Organization for Standardization.cap 07.1.

as diluições recomendadas para amostras com contaminação na faixa de 3 a 1. variandose as diluições inoculadas. dependendo de como as alíquotas são distribuídas. Nesses casos o procedimento analítico é o mesmo.2. 4. de forma a obter tubos positivos nas menores diluições (maiores alíquotas da amostra) e tubos negativos nas maiores diluições (menores alíquotas da amostra). diluições não decimais. Um é o formato do teste de diluição múltipla. Suas principais aplicações são a contagem de coliformes totais. aumentando proporcionalmente o volume de meio de cultura. 23:50 . Listeria monocytogenes e outros microrganismos tradicionalmente analisados por métodos de presença/ausência. deve-se inocular mais do que três diluições (pelo menos cinco). coliformes fecais e E. permitindo a enumeração de diferentes grupos ou espécies de microrganismos. mais raramente. pode-se inocular volumes maiores da amostra sem diluição (no caso de líquidos) ou da primeira diluição (no caso de sólidos). como a contagem de Salmonella. cinco ou dez alíquotas. Uma prática bastante comum. Para a homogeneização da amostra e preparo das diluições. três diluições com três tubos por diluição são suficientes para uma boa estimativa do NMP. cinco ou dez alíquotas de uma diluição são inoculadas numa série de três. Quanto maior o número de diluições e de tubos por diluição. quando a contaminação esperada na amostra está abaixo do limite de detecção do plaqueamento ou quando partículas do alimento interferem na contagem em placas. Para orientação. cinco alíquotas por diluição e/ou cinco diluições. Se a contaminação estimada estiver abaixo dessa faixa. porque permite abranger uma faixa ampla de concentrações dos microrganismos na amostra. um número maior de alíquotas por diluição ou. Uma outra aplicação é a adaptação de métodos qualitativos para quantitativos. Para orientação na seleção das diluições pode ser consultado o Quadro 2. que apresenta a 62 cap 01. O procedimento padrão apresenta a vantagem de ter os resultados tabelados em Tabelas de NMP. A proporção entre o volume inoculado e o volume de meio de cultura recomendado pelo Compendium (Swanson et al. maior a precisão da contagem. Essa prática também é muito utilizada na inoculação da primeira diluição de amostras sólidas. sem diluição. deve-se inocular diluições mais altas. Para a inoculação. três alíquotas por diluição ou. que mantém essa proporção. Caso não seja possível estimar previamente o nível de contaminação da amostra. no qual todas as alíquotas inoculadas (geralmente cinco a dez) são de uma mesma diluição.. Para a maioria das situações encontradas na análise de alimentos.p65 62 1/7/2007. 10-2 e 10-3.cap 07. da diluição subseqüente. são utilizados os procedimentos descritos no Capítulo 2. cinco ou dez tubos e. 2001) é: uma parte da amostra ou diluição adicionada a dez partes do caldo. Pode também ser utilizada em outros ensaios quantitativos. no qual três. mesmo. uma nova série de três. é a inoculação de 10ml das amostras líquidas.000/g ou ml. O outro formato é o do teste de diluição única.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos A técnica do NMP é bastante versátil. variando-se o meio de cultura e as condições de incubação. permite procedimentos não tão comuns. A técnica. como a inoculação de um número maior de diluições decimais. A seleção das diluições depende da contaminação estimada da amostra. mas varia a forma de cálculo dos resultados. coli em água e alimentos. com igual quantidade da amostra.2. são inoculadas em outra série de tubos e assim por diante. Se a contaminação esperada estiver acima dessa faixa. são a 10-1. depois. enquanto os não padrão requerem o uso de fórmulas para o cálculo. O procedimento padrão é a inoculação de três diluições decimais seqüenciais da amostra. em 10ml do meio de cultura em concentração dupla. TESTE DE DILUIÇÃO MÚLTIPLA O teste de diluição múltipla é o mais versátil dos formatos da técnica do NMP. entretanto. a técnica do NMP apresenta dois formatos. partindo-se da diluição inicial.

23:50 .2. mas também o desenvolvimento ou não de características típicas do(s) microrganismo(s) alvo no meio utilizado. Mudar os tubos de 63 cap 01. as alíquotas são inoculadas em Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST). é novamente verificada a ocorrência ou não de crescimento com produção de gás. PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento. Na maioria dos ensaios essa verificação inclui não só a ocorrência de crescimento. A inoculação não é feita diretamente em VB porque a presença de agentes seletivos pode inibir os coliformes injuriados. sendo descrita nos capítulos específicos. sendo essa recomendação também mencionada nos capítulos específicos. A incerteza da medição dos volumes não deve exceder 5% (ISO 6887-1. em um dos métodos de ensaio de coliformes totais. descritos nos capítulos específicos • Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s) pelo ensaio a ser realizado. são inibidos ou diferenciados dos coliformes totais.cap 07. O caldo LST permite o crescimento de uma série de outros microrganismos produtores de gás que. que é um meio seletivo para coliformes totais. Observar criteriosamente se os tubos utilizados correspondem à amostra e à diluição que estão sendo inoculadas. A seleção do meio de cultura mais adequado para a inoculação das alíquotas varia para cada ensaio. As culturas obtidas nos tubos positivos para essas duas características são transferidas para o caldo Verde Brilhante Bile 2% (VB). Em alguns ensaios recomenda-se utilizar uma série de cinco alíquotas por diluição. a maioria dos ensaios exige ainda uma ou mais etapas de confirmação. selecionar três ou mais diluições decimais seqüenciais da amostra para a inoculação. Além disso. descritos no Capítulo 2 • Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) quantidade de amostra presente nas alíquotas de várias combinações de diluições. sendo descrita nos capítulos específicos. como já mencionado anteriormente. como a combinação decimal 100 – 10 – 1ml ou a não decimal 500 – 50 –5. selecionando o caldo de acordo com o ensaio a ser realizado (nos capítulos específicos). Nos casos em que isso ocorre. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. A verificação da presença do(s) microrganismo(s) alvo nas alíquotas inoculadas após a incubação. nem todos os produtos apresentam distribuição de microrganismos homogênea para inoculação direta. no Caldo VB. 1999). Identificar todos os tubos que serão inoculados. com capacidade não maior do que 10ml. em VB. para outros meios de confirmação. Após a incubação a 35oC/24h. 4. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra e diluições seriadas. Outras combinações são possíveis. com o código da amostra. No caso de amostras sólidas as opções são mais restritas. Seguindo as orientações apresentadas acima. a) Preparação das amostras e diluições. particularmente no caso de amostras líquidas. A etapa inicial no LST garante a recuperação das injúrias.2. porque. a diluição e a sigla do meio de cultura contido. Inocular três alíquotas de cada diluição em tubos do caldo de cultura.p65 63 1/7/2007. permitindo o crescimento posterior em condições seletivas. incubadas a 35oC/24h e verificada a ocorrência ou não de crescimento com produção de gás.1. que é feita transferindo-se a cultura obtida no primeiro meio inoculado. descrita(s) nos capítulos específicos 4. que podem ser adicionadas diretamente no caldo. também varia para cada ensaio. podem ser utilizadas as mesmas combinações dos produtos líquidos. com o limite de detecção da técnica em cada combinação. são confirmadas como coliformes totais. para cálculo do NMP. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. Por exemplo. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. em função do(s) microrganismo(s) alvo. b) Inoculação. por exemplo. Apenas as culturas positivas para essas duas características.2.Utilizar uma pipeta diferente para cada diluição.

desde que não provocada pela própria amostra. quando há formação de gás. durante a estocagem do meio em geladeira. A produção de ácido ou base pode ser verificada pela viragem de um indicador de pH adicionado ao caldo de cultura (púrpura de bromocresol. As transferências requeridas em cada ensaio encontram-se descritas nos capítulos específicos. podendo ser inoculadas cinco ou dez porções de 100ml em 100ml de caldo em concentração dupla. Essas quantidades podem variar dependendo da contaminação esperada na amostra.1) Crescimento. Um dos mais usados é transferir uma alçada do caldo suspeito para um novo tubo do mesmo meio e verificar a turvação.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos posição. Apenas os tubos contendo culturas confirmadas são considerados como positivos no cálculo do NMP. vermelho de fenol e outros).cap 07. d. Uma de suas principais aplicações são a contagem de coliformes em água tratada e em sucos e refrigerantes. para as quais não há necessidade nem se justifica a preparação de diluições.2) Produção de gás.4) Alteração do potencial redox.p65 64 1/7/2007. O crescimento é verificado pela turvação do meio de cultura. verificando seu deslocamento para cima. Outra alternativa utilizada para verificar a produção de gás é cobrir a superfície do caldo com vaspar ou ágar selo. TESTE DE DILUIÇÃO ÚNICA O teste de diluição única é mais utilizado para amostras com baixo nível de contaminação. para amostras com nível mais baixo de contaminação. A maioria dos ensaios que utilizam a técnica do NMP exige a transferência da cultura obtida nos tubos inoculados. previamente. para não inocular o mesmo tubo mais de uma vez ou deixar algum tubo sem inocular. depois da inoculação. 4. colocados nos tubos de caldo antes da esterilização. para confirmação da presença do(s) microrganismo(s) alvo. A produção de gás pode ser verificada pela formação de bolhas em tubos invertidos (tubos de Durhan). O procedimento padrão é a inoculação de cinco ou dez alíquotas de 10ml das amostras líquidas em 10ml do caldo de cultura em concentração dupla (50 a 100ml no total). Outra alternativa usada é medir o pH ou a acidez titulável do meio depois da incubação. Incubar os tubos nas condições especificadas para o ensaio. se não houve formação de pequenas bolhas nos tubos de Durhan. d. Essas bolhas são provocadas pelo ar dissolvido no líquido e. confirmativa do crescimento no primeiro. d. A definição das características a serem consideradas como indicação da presença do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos são definidas nos capítulos específicos. Nesse segundo caso. o azul de metileno e o cloreto de trifeniltetrazólio. à medida que sejam inoculadas. e) Transferências. ou cinco ou dez alíquotas da primeira diluição das amostras sólidas em 10ml do caldo em concentração dupla (5 a 10g no total). ou cinco ou dez porções de 1ml em 10ml de 64 cap 01. se presentes.3) Produção de ácido ou base. c) Incubação. 23:50 . A alteração do potencial de óxido redução é verificada pela viragem de aceptores de elétrons como a rezarzurina. nos capítulos específicos. o tubo deve ser descartado e substituído por outro. pode ser necessário um procedimento alternativo para confirmar o crescimento. Essas características podem ser: d. d) Verificação da presença do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos. Na utilização dessa técnica é importante verificar.3.

Pode. adicionando uma parte da alíquota para dez partes do caldo.cap 07. 1999). nove porções seguirão para confirmação. sakazakii em fórmulas infantis (Capítulo 16). Seguir as mesmas orientações do teste de diluição múltipla. No formato de cinco porções poderiam ser inoculadas cinco alíquotas de 100g. além da maior sensibilidade do ensaio. na determinação do NMP de E. se todas apresentarem crescimento. Incubar os tubos nas condições especificadas para o ensaio. Selecionar o caldo de acordo com o ensaio a ser realizado (nos capítulos específicos). PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento. ser inoculado qualquer número de alíquotas. descritas nos capítulos específicos. a) Preparação das amostras. para amostras com nível mais alto de contaminação.2. Na série de três. descritos nos capítulos específicos • Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s)pelo ensaio a ser realizado. 65 cap 01. Inocular cinco ou dez alíquotas da amostra em cinco a dez tubos ou frascos do caldo de cultura. Mudar os tubos ou frascos de posição. três porções 10g e três porções de 1g da amostra.3. o formato de cinco alíquotas pode ser mais vantajoso para amostras com baixa contaminação. A inoculação de cinco ou dez alíquotas com quantidades múltiplas de dez apresentam a vantagem de ter os resultados tabelados em Tabelas de NMP. Assim como no teste de diluição múltipla.p65 65 1/7/2007. permitindo detectar a presença em 500g da amostra. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. para não inocular o mesmo tubo/frasco mais de uma vez ou deixar algum tubo/frasco sem inocular. o cálculo dos resultados utiliza fórmulas. c) Incubação. à medida que sejam inoculadas.3. Seguir as mesmas orientações do teste de diluição múltipla. adicionadas diretamente no caldo de enriquecimento. selecionar as quantidades mais adequadas da amostra para a inoculação. Por exemplo. de qualquer quantidade. em vez das tabelas. Identificar todos os tubos que serão inoculados. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. a seleção do meio de cultura e a forma de verificação da presença do(s) microrganismo(s) alvo nas alíquotas inoculadas encontra-se descrita nos capítulos específicos. descrita(s) nos capítulos específicos 4. entretanto. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. na diluição 1:10. desde que todas sejam iguais e que a diluição seja de uma parte da amostra adicionada em dez partes de caldo. A incerteza da medição dos volumes não deve exceder 5% (ISO 6887-1. do que o de dez alíquotas ou o teste de diluição múltipla. Nesses casos. 4.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) caldo em concentração simples. Seguindo as orientações apresentadas acima. se todas as alíquotas apresentarem crescimento (teste presuntivo). 23:50 . Essa combinação permite detectar a presença em 333g da amostra. com o código da amostra e a sigla do meio de cultura contido. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra. e) Transferências. a FDA recomenda a inoculação de três porções de 100g. serão apenas cinco para confirmação. d) Verificação da presença do(s) microrganismo(s) alvo nos tubos. descritos no Capítulo 2 • Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado. Dependendo da complexidade dos testes de confirmação subseqüentes. b) Inoculação. No formato de cinco porções iguais.1.

Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos

4.4. CÁLCULO DOS RESULTADOS
A combinação de tubos positivos e negativos na técnica do NMP permite estimar, por cálculo de probabilidade, a densidade do(s) microrganismo(s) alvo na amostra. Os cálculos podem ser feitos usando várias fórmulas, mas, para as para as combinações de tubos positivos e negativos que ocorrem com maior freqüência, os valores já foram calculados e tabulados em tabelas de NMP, não sendo necessário o uso de fórmulas. As combinações que ocorrem com menor freqüência são omitidas na tabulação e, nesses casos, o cálculo do resultado pode ser feito através das fórmulas, mas é recomendável repetir antes o ensaio, para confirmar a ocorrência da combinação. 4.4.1. CÁLCULO DOS RESULTADOS DO TESTE DE DILUIÇÃO MÚLTIPLA 4.4.1.1. Cálculo usando as tabelas de NMP (para diluições decimais) A Tabela NMP-1 do Anexo 4.1, retirada do Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003), apresenta os resultados de uma série de três tubos inoculados com alíquotas de 0,1 – 0,01 e 0,001g ou ml da amostra. A Tabela NMP-2 do Anexo 4.1, retirada da mesma fonte, apresenta os resultados de uma série de cinco tubos inoculados com as mesmas alíquotas. Para outras alíquotas, são usadas as mesmas tabelas, com um fator de conversão para multiplicar ou dividir o valor lido, em função do tamanho das alíquotas inoculadas. Observar que as diluições são decimais e que as tabelas utilizam a quantidade da amostra nas alíquotas, não a diluição inoculada. Assim, para facilitar o uso, o Quadro 4.1 apresenta a correspondência entre diluições inoculadas e quantidade de amostra nas alíquotas, bem como o fator de conversão do resultado quando as alíquotas são diferentes das tabeladas. Além da estimativa do NMP/g ou ml da amostra, as tabelas de NMP também apresentam, para cada combinação de tubos positivos e negativos, o limite superior e o limite inferior da estimativa do NMP, ao nível de 95% de confiança. Esse é intervalo em que se encontra a contagem verdadeira (mas desconhecida) dos microrganismos na amostra, em 95% das vezes.
Quadro 4.1. Orientação para o uso das tabelas de NMP, em função da quantidade de amostra presente nas alíquotas e das diluições inoculadas, com o limite de detecção da contagem e a regra para conversão do resultado.
Quantidade de amostra nas alíquotas (g ou ml) 100 – 10 – 1 10 – 1 – 0,1 1 – 0,1 – 0,01 1 – 0,1 – 0,01 0,1 – 0,01 – 0,001 0,01 – 0,001 – 0,0001 0,001 – 0,0001 - 0,00001 Limite de detecção (por g ou ml da amostra) 0,003 0,03 0,3 0,3 3 30 300 Fator de conversão do resultado na Tabela dividir por 1.000 dividir por 100 dividir por 10 dividir por 10 direto multiplicar por 10 multiplicar por 100

Combinação de diluições* 1 2 3 4 5 6 S/D (100ml) - S/D (10ml) - SD (1ml) S/D (10ml) - S/D (1ml) - 10-1 (1ml) S/D (1ml) - 10-1 (1ml) - 10-2 (1ml) 10-1 (10ml) – 10-1 (1ml) – 10-2 (1ml) 10-1 (1ml) – 10-2 (1ml) – 10-3 (1ml) 10 (1ml) – 10 (1ml) - 10 (1ml) 10-3 (1ml) - 10-4 (1ml) - 10-5 (1ml)
-2 -3 -4

*Entre parênteses o volume inoculado da diluição, onde SD = sem diluição (combinação restrita à amostras líquidas).

As regras para o cálculo dos resultados, com exemplos no Quadro 4.2 são: Regra 1. Se as três diluições inoculadas correspondem às alíquotas tabeladas, o resultado é lido diretamente na linha correspondente à combinação de tubos positivos obtida (Exemplos 1 e 8 do Quadro 4.2). Regra 2. Se as três diluições inoculadas não correspondem às alíquotas tabeladas, o resultado lido na linha correspondente à combinação de tubos positivos deve ser convertido segundo o fator de conversão do Quadro 4.2 (Exemplos 2 e 9 do Quadro 4.2). 66

cap 01- cap 07.p65

66

1/7/2007, 23:50

Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP)

Regra 3. Se mais de três diluições foram inoculadas, valem as regras um e dois, mas apenas três diluições consecutivas são consideradas.
3.a. Se mais de uma diluição apresentar todos os tubos positivos, a combinação considerada deve conter a maior diluição (menor alíquota) com todos os tubos positivos e as duas consecutivas (Exemplos 3, 4, 10 e 11 do Quadro 4.2). 3.b. Se nenhuma das diluições apresentou todos os tubos positivos, considerar as três primeiras consecutivas que tenham os tubos positivos na do meio (Exemplos 5 e 12 do Quadro 4.2). 3.c. Se uma diluição apresentar número de tubos positivos maior ou igual ao da diluição anterior, somar esse número ao da diluição anterior, desconsiderando a posterior (Exemplos 6 e 13 do Quadro 4.2). 3.d. Se todas as diluições apresentarem todos os tubos positivos, considerar as três últimas diluições consecutivas (maiores diluições, menores alíquotas) (Exemplos 7 e 14 do Quadro 4.2).
Quadro 4.2. Exemplos de cálculo dos resultados usando as tabelas de NMP.
Exemplo Regra utilizada Número de tubos positivos nas alíquotas (g ou ml) 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 Combinação considerada Resultado

Série de três tubos (Tabela NMP-1) 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3a, 2 3a, 2 3b, 2 3c, 2 3d, 2 3 NI* 3 3 0 3 3 2 3 3 3 0 3 3 0 2 2 3 1 2 3 NI* 0 0 2 0 1 3 NI* NI* 0 0 0 1 3 3-2-0 3-2-0 3-2-0 3-2-0 0-1-0 3-2-2 3-3-3 93 = 9,3x101 93x10 = 9,3x102 93x10 = 9,3x102 93x100 = 9,3x103 3x10 = 3,0x101 210x10 = 2,1x103 >1.100x100 = >1,1x105

Série de cinco tubos (Tabela NMP-2) 8 9 10 11 12 13 14 1 2 3a, 2 3a, 2 3b, 2 3c, 2 3d, 2 5 NI* 5 5 0 5 5 2 5 5 5 0 5 5 0 2 2 5 1 3 5 NI* 0 0 2 0 1 5 NI* NI* 0 0 0 1 5 5-2-0 5-2-0 5-2-0 5-2-0 0-1-0 5-3-2 5-5-5 49 = 4,9x101 49 x 10 = 4,9x10 2 49 x 10 = 4,9x10 2 49 x 100 = 4,9x10 3 2 x10 =2,0x101 140x10 = 1,4x103 >1.600x100 = >1,6x105

*NI = Não inoculado

4.4.1.2. Cálculo usando a fórmula de Thomas (para diluições não decimais) Thomas (1942) publicou uma fórmula simplificada de cálculo do NMP, que pode ser utilizada para calcular os resultados de amostras inoculadas em diluições não decimais. Pode ser também utilizada para amostras inoculadas com diluições decimais, porém, cujos resultados foram omitidos das tabelas de NMP. O cálculo pela fórmula permite considerar todas as diluições inoculadas, não apenas três. Os resultados podem não concordar exatamente com os da fórmula de Halvorson & Ziegler (1933), mais usada na construção de tabelas de NMP, mas a diferença é pequena e sem conseqüências praticas. A fórmula é a seguinte: 67

cap 01- cap 07.p65

67

1/7/2007, 23:50

Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos

NMP/g ou ml = P /

NT

P = Número de tubos positivos N = Som a da quantidade de amostra inoculada em todos os tubos negativos T = Soma da quantidade de amostra inoculada em todos os tubos

Exemplo 1. Considere as alíquotas e a combinação de tubos positivos e negativos na série de três tubos abaixo:
Alíquota No de tubos positivos em 3 0,1g 0 0,01g 2 0,001g 0

P=2 N = (3 x 0,1) + (3 x 0,001) = 0,303g T = (3 x 0,1) + (3 x 0,01) + (3 x 0,001) = 0,333g NMP/g = 2 / (0,303) x (0,333) = 6,3 Exemplo 2. Considere as alíquotas e a combinação de tubos positivos e negativos na série de cinco tubos abaixo:
Alíquota No de tubos positivos em 5 0,1g 0 0,01g 2 0,001g 0

P=2 N = (5 x 0,1) + (5 x 0,001) = 0,505g T = (5 x 0,1) + (5 x 0,01) + (5 x 0,001) = 0,555g NMP/g = 2 / (0,505) x (0,555) = 3,8 Exemplo 3. Considere as alíquotas de diluições 1:2 e a combinação de tubos positivos e negativos na série de cinco tubos abaixo:
Alíquota No de tubos positivos em 5 8g 5 4g 4 2g 2 1g 0 0,5g 1 0,25g 0

P = 5 + 4 + 2 + 1 = 12 N = (1 x 4) + (3 x 2) + (5 x 1) + (4 x 0,5) + (5 x 0,25) = 18,25g T = (5 x 8) + (5 x 4) + (5 x 2) (5 x 1) + (5 x 0,5) (5 x 0,25) = 78,75g NMP/g = 12 / (18,25) x (78,75) = 0,32

4.4.1.3. Cálculo dos resultados para amostras preparadas pela técnica do esfregaço de superfície ou da lavagem superficial É feito da mesma forma descrita para a contagem em placas, porém, onde se lê UFC devese substituir por NMP e, onde se lê contagem em placas substituir por contagem pela técnica do NMP. 4.4.2. CÁLCULO DOS RESULTADOS DO TESTE DE DILUIÇÃO ÚNICA Para a distribuição de dez alíquotas de 10g ou ml da amostra, pode ser utilizada a Tabela NMP-3 do Anexo, retirada do Bacteriological Analytical Manual (Blodgett, 2003). Considerando que o teste de diluição única é aplicável principalmente para amostras líquidas com baixa 68

cap 01- cap 07.p65

68

1/7/2007, 23:50

. NMP/g ou ml = (1/z) x 2. Para outras distribuições pode ser utilizada a fórmula abaixo. conforme exemplo abaixo: Exemplo 6. 23:50 .9 Exemplo 2.html (acesso em 05/04/2006). 4. Inoculados 10 x 1ml da amostra e obtidos nove tubos positivos NMP/100ml = 23x10 = 2. Revision July 2003. Disponível no site: http:// vm.3x102 e NMP/ml = 2.fda. Exemplo 5. entretanto.cfsan.cap 07. In: US FOOD AND DRUG ADMINISTRATION (FDA).gov/~ebam/bam-toc. Exemplo 1. por exemplo).303 x Log10(5/3) = 0.3 Regra 3. Não há. t = 5. na inoculação de 10 x 10ml ou g. mas ainda múltiplas de dez. Inoculadas 10 x 1g da amostra e obtidos nove tubos positivos NMP/100g = 23x10= 2.p65 69 1/7/2007. Para determinar o NMP/100ml ou g. seguir a mesma orientação do teste de diluição múltipla. basta multiplicar (se a quantidade for menor que dez) ou dividir (se a quantidade for maior que dez) o valor lido na Tabela NMP-3.3x102 Exemplo 4. 69 cap 01.5 REFERÊNCIAS GETT. n = 3 – NMP/g = (1/25) x 2. Inoculadas 10 x 100g da amostra e obtidos nove frascos positivos NMP/100g = 23/10 = 2. Inoculadas 10 x 10g da amostra e obtidos três tubos positivos NMP/100g = 3.02 ou NMP/100g = 2 Cálculo para amostras preparadas pela técnica do esfregaço de superfície ou da lavagem superficial Para calcular os resultados de amostras preparadas pela técnica do esfregaço de superfície ou da lavagem superficial.Most Probable Number from Serial Dilutions.3 Cálculo pela fórmula O cálculo é muito simples.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) contaminação. Para determinar o resultado da inoculação de dez alíquotas com quantidade diferente de 10g ou ml. a tabela apresenta o resultado em NMP/100ml da amostra. retirada da mesma fonte.303 x Log 10 (t/n) z = peso ou volume de amostra por alíquota t = número total de alíquotas inoculadas n = número de alíquotas negativas Regras para o cálculo usando a Tabela NMP-3 Regra 1. se foram inoculadas as mesmas alíquotas (10 x 100ml da diluição 10-1 em 100ml de caldo concentração dupla. Appendix 2 . restrição ao seu uso para amostras sólidas. ou inoculação direta de 10 x 10g da amostra no caldo (se aplicável). Inoculados 10 x 10ml da amostra e obtidos cinco tubos positivos NMP/100ml = 6.6 Regra 2. Inoculadas cinco alíquotas de 25g e obtidos dois frascos positivos z = 25. Exemplo 3. basta ler o valor na linha correspondente ao número de tubos positivos obtido. Para converter o resultado de NMP/100ml ou g para NMP/ml ou g. Bacteriological Analytical Manual Online. R. basta dividir o valor por 100. 2003.

2001. (eds. P. 1999. 70 cap 01. R. K. SWANSON. 942. initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination – Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions.R. Culture methods for enumeration of microrganisms. ISO 6887-1.A. H. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Application of statistics to problems in bacteriology.p65 70 1/7/2007.H. & ZIEGLER.53-67. In: DOWNES.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos HALVORSON. PETRAN. & ITO.).. Journal of The American Water Works Association 34:572-576.M.. Journal of Bacteriology 25:101-121. J. N.O. Washington: American Public Health Association (APHA). Bacterial densities from fermentation tube tests. Chapter 6. The International Organization for Standardization.L. 23:50 . 1933. K. & HANLIN. p.J. H. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples.cap 07. F. 1st ed. THOMAS.

100 - Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett.100 >1.1 6. 23:50 . Combinação de tubos + 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-1-1 0-2-0 0-3-0 1-0-0 1-0-1 1-0-2 1-1-0 1-1-1 1-2-0 1-2-1 1-3-0 2-0-0 2-0-1 2-0-2 2-1-0 2-1-1 2-1-2 NMP/g ou ml <3.p65 71 1/7/2007.15 1.1 .6 8.2 9.5 8.6 7.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) ANEXO 4.1 TABELAS DE NMP Tabela NMP-1.5 3.000 2.2 3.6 3.6 4.2 1.5 9.17 1.7 9.01 e 0.0 6.3 3.5 4.4 3. 71 cap 01.000 4. Quantidade inoculada da amostra: 0.100 4.4 3.7 4.2 14 20 15 20 27 Intervalo de confiança Intervalo de Combinação NMP/g ou ml confiança (95%) (95%) de tubos + Mínimo Máximo Mínimo Máximo 0.4 11 11 15 16 9.5 8.0.6 11 18 18 38 18 18 38 20 38 42 42 42 38 42 42 42 42 94 2-2-0 2-2-1 2-2-2 2-3-0 2-3-1 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-1-3 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-2-3 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 21 28 35 29 36 23 38 64 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1.7 8.2 11 7.0 3.5 1.15 0. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabilidade.6 4. para diversas combinações de tubos positivos em série de três tubos.3 3.6 1.6 0.7 4.7 8. 2003).000 1.7 8.cap 07.001g ou ml.7 17 9 17 37 40 18 37 40 90 42 90 180 420 42 94 94 94 94 94 110 180 180 200 420 420 420 420 430 1.0 3.

9 36 5-2-4 150 58 400 3-0-0 7.8 50 0-3-0 5.5 22 4-5-1 48 15 120 1-4-0 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250 3-0-2 13 5.1 3.8 0.6 35 5-3-2 140 52 400 3-1-0 11 3.8 40 5-5-1 350 100 1.8 70 5-5-3 920 220 2.1 10 4-2-2 32 10 70 1-0-1 4 0.8 15 4-3-0 27 9.8 15 4-2-0 22 6.8 1. Intervalo de confiança Intervalo de Combinação NMP/g ou ml confiança (95%) (95%) de tubos + Mínimo Máximo Mínimo Máximo 0-0-0 <1.2 3.9 70 1-1-0 4 0.1 26 5-2-0 49 15 150 2-2-2 14 5.1 1.600 400 4.100 3-3-2 24 9.8 0. Quantidade inoculada da amostra: 0.8 6.7 12 4-3-1 33 10 70 1-1-1 6.8 40 5-4-2 220 70 440 3-2-2 20 6.2 3.9 36 5-5-5 >1.8 2.9 4-1-1 21 6.9 36 5-2-3 120 36 250 2-4-0 15 5.600 4-0-1 17 5.cap 07.5 1.6 0.4 22 4-4-2 47 15 120 1-3-0 8.4 22 4-5-0 41 14 100 1-3-1 10 3.0.7 10 4-1-3 31 10 70 0-2-1 5. Combinação de tubos + NMP/g ou ml 72 cap 01.7 10 4-1-2 26 9.3 3.8 70 2-0-0 4.8 15 4-4-1 40 14 100 1-2-1 8.5 26 5-3-3 180 70 400 3-1-1 14 5.1 26 5-2-2 94 34 230 2-3-1 14 5.5 0.8 15 4-3-2 39 14 100 1-1-2 8.1 1.8 17 5-1-0 33 10 100 2-1-1 9.8 40 5-4-4 350 100 710 3-3-1 21 6.1 3.1 35 5-5-4 1.8 42 0-1-1 3.8 4-0-3 25 9. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabilidade.9 36 5-2-1 70 22 170 2-3-0 12 4.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Tabela NMP-2.7 0.8 15 4-2-1 26 9.8 40 Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett.1 26 5-1-2 63 22 150 2-2-0 9.7 36 5-4-1 170 58 400 3-2-1 17 6.4 22 4-4-0 34 14 100 1-2-0 6. 23:50 .4 22 5-0-3 58 22 150 2-1-0 6.8 70 5-5-2 540 150 1. 2003).001g ou ml.09 6.600 700 4-0-2 21 6.700 3-5-0 25 9.8 70 0-2-0 3.1 22 5-3-0 79 22 220 3-0-1 11 3.79 15 5-0-1 31 10 70 2-0-1 6. para diversas combinações de tubos positivos em série de cinco tubos.8 40 5-4-5 430 150 1.01 e 0.7 10 4-2-3 38 14 100 1-0-2 6 1.6 1.8 70 5-5-0 240 70 710 3-4-0 21 6.4 22 5-1-3 84 34 220 2-2-1 12 4.8 1.p65 72 1/7/2007.5 22 5-0-0 23 6.09 6.100 3-4-1 24 9.600 4-0-0 13 4.6 36 5-3-4 210 70 400 3-1-2 17 6 36 5-4-0 130 36 400 3-2-0 14 5.8 4-1-0 17 6 40 0-1-0 1.3 3.4 22 5-1-1 46 14 120 2-1-2 12 4.8 70 0-0-1 1.8 40 5-4-3 280 100 710 3-3-0 17 6.8 70 1-0-0 2 0.1 .8 15 5-0-2 43 14 100 2-0-2 9.

7 13 15 19 24 33 53 - Fonte: Bacteriological Analytical Manual (Blodgett.cap 07.3 5.5 3.9 9.1 6.2 3.2 12.Técnicas Básicas de Contagem de Microrganismos pelo Número mais Provável (NMP) Tabela NMP-3.9 8. 23:50 .8 5.9 8. para diversas combinações de tubos positivos e negativos na inoculação de 10 alíquotas de 10g ou ml da amostra por tubo.91 1.1 2. 73 cap 01. 2003).0 16 23 >23 Intervalo de confiança (95%) Mínimo 0.6 5.05 0.1 1. Número de tubos positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NMP/100ml <1.p65 73 1/7/2007.3 4.6 2. Número Mais Provável (NMP) e intervalo de confiança a nível de 95% de probabilidade.1 12 Máximo 3.37 0.1 9.

23:50 .. Sperber et al. é necessário repetir o mesmo ensaio de presença/ ausência para várias alíquotas da mesma amostra. num teste de diluição múltipla ou cinco. descritas nos Capítulos 4 e 5 da 4ª Edição do Compendium of Methods for Microbiological Examination of Foods (Bier et al. 2001. normalmente. Listeria monocytogenes.Capítulo 5 Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos 5. incluindo os de Salmonella. 2001). é feito em duas etapas. Vários ensaios utilizados na análise de alimentos são qualitativos (presença/ausência). Enriquecimento O enriquecimento é uma etapa crítica nos ensaios de presença/ausência. A principal razão para que esses ensaios sejam qualitativos é a etapa de enriquecimento. utilizar a técnica do NMP nesses casos. para reativação das vias metabólicas responsáveis pela multiplicação. Quando há duas etapas é comum 75 cap 01. num teste de diluição única. Nos ensaios de Vibrio cholerae e Yersinia enterocolitica é feito em apenas uma. Não é incomum produtos com população menor do que uma célula por 100g e há casos de detecção de quantidades tão baixas como uma célula por 500g do produto. Todos utilizam as mesmas técnicas microbiológicas básicas.p65 75 1/7/2007.cap 07. Em função disso. a microbiota competidora nas amostras se encontra em número muito maior do que o microrganismo alvo. Células injuriadas exigem um período de tempo em condições ótimas de crescimento. se indispensável.1. Vibrio cholerae. para que o alvo tenha oportunidade de se multiplicar. embora seja possível. a quantificação se torna excessivamente trabalhosa e dispendiosa. por exemplo. as células do microrganismo alvo estão injuriadas pelo processamento. Campylobacter sp. dependendo do microrganismo alvo. A segunda razão é que. sendo necessária a recuperação das injúrias. Yersinia enterocolitica. Vibrio parahaemolyticus e Vibrio vulnificus. Escherichia coli O157:H7. sendo pelo menos nove. sendo necessário elevar o número de células a quantidades detectáveis. sendo necessário inibir o crescimento dessa população. na maioria dos alimentos industrializados. Para tanto. não sendo necessária e nem justificável. por três razões. que são o enriquecimento em um ou mais caldos específicos e o posterior isolamento em meios sólidos.. A primeira é que a população dos patógenos nas amostras é normalmente baixa (muito abaixo do limite de detecção da contagem em placas). Nos ensaios de Salmonella e Listeria monocytogenes. que dificulta a quantificação. na maioria das situações. O enriquecimento pode incluir uma ou mais etapas. INTRODUÇÃO As orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). A terceira razão é que.

por exemplo. que utiliza dois caldos. como fontes de carbono não comuns (D-manose. sorbitol. De maneira geral. do ensaio para Salmonella. o citrato férrico amoniacal ou o sulfato férrico amoniacal. é necessário diferenciar e separar o microrganismo alvo da microbiota competidora. Ao reagir com o H2S. Os indicadores de H2S são compostos de ferro como o citrato férrico. Os agentes diferenciais mais usados são os indicadores de pH. D-cicloserina. a multiplicação das células injuriadas é mínima e. se a incubação for prolongada além do necessário. oxitetraciclina. vancomicina. sais biliares. mas o tempo de incubação deve ser apenas o suficiente para a recuperação das injúrias. porém. selenito de sódio. é produzindo sulfeto 76 cap 01. Esse é o caso. deve ser ajustado para retornar ao ótimo. a adição de antibióticos (polimixina B. A temperatura de incubação também deve estar na faixa ótima.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos chamar a primeira de pré enriquecimento ou enriquecimento primário e a segunda de enriquecimento seletivo. os meios de isolamento são seletivos e diferenciais. com ótimo na faixa alcalina). para utilização em testes de confirmação da identidade. telurito de potássio. por isso. para diferenciar microrganismos que produzem dos que não produzem esse composto no metabolismo de aminoácido sulfurados. De maneira geral. Isso é feito na etapa de isolamento em meios sólidos. novobiocina. O pré enriquecimento tem por objetivo a reparação de células injuriadas. algumas cepas do alvo podem ser sensíveis às condições seletivas presentes e. A composição nutricional do meio deve ser ótima e. se houver alteração. os caldos de pré enriquecimento normalmente são não seletivos ou moderadamente seletivos. dificultando ou impedindo a posterior detecção do alvo. Os indicadores de pH mudam de cor em determinadas faixas de pH e os mais utilizados em meios de cultura são o vermelho de fenol e o púrpura de bromocresol. é comum a utilização de mais de um meio de enriquecimento seletivo. O pH do meio deve estar na faixa ótima de crescimento do alvo e. que permite também a obtenção de culturas puras.cap 07. que podem ser: o pH do meio de cultura. 23:50 . moxalactam. favorecendo a multiplicação do microrganismo alvo. selecionados em função do ensaio. a temperatura e/ou atmosfera de incubação. o pH do caldo pode oferecer uma vantagem competitiva em relação à microbiota acompanhante. ampicilina. Eventualmente. Os indicadores de sulfeto de hidrogênio (H2S) também são bastante usados. células injuriadas não crescem em condições altamente seletivas. citrato de sódio). Durante a fase de recuperação.p65 76 1/7/2007. lauril sulfato de sódio). Nem sempre os caldos de enriquecimento seletivo conseguem um balanceamento ideal entre a necessidade de inibir os competidores sem inibir o microrganismo alvo. por exemplo. a população competidora pode aumentar demasiadamente. nesses casos. para suprimir parte da microbiota competidora e distinguir o alvo da remanescente. após a inoculação de produtos ácidos. sem favorecer demasiadamente a microbiota competidora. Isolamento em meios sólidos (plaqueamento diferencial) Uma vez conseguida a multiplicação no(s) caldo(s) de enriquecimento. se possível. para diferenciar os microrganismos que produzem dos que não produzem ácido ou base durante o crescimento. por exemplo. O enriquecimento seletivo objetiva inibir a microbiota competidora presente nas amostras. Para microrganismos que têm pH ótimo fora da faixa neutra (Vibrio cholerae. Isso é conseguido através da utilização de agentes seletivos e/ou condições restritivas para a microbiota competidora. trimethiprima. oferecendo condições para a sua recuperação. Os agentes seletivos usados em meios sólidos são os mesmos usados nos meios líquidos de enriquecimento. conter nutrientes utilizados preferencialmente pelo alvo. cicloeximida) e a adição de compostos químicos (verde brilhante.

Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos de ferro. As descarboxilases mais utilizadas em testes de identificação são a arginina. específicas para cada aminoácido. que utiliza dois ou três. A maioria das bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas que contêm citocromo também apresentam catalase. para diferenciar os microrganismos que produzem dos que não produzem hemólise. O peróxido de hidrogênio (água oxigenada) é um metabólito formado durante a utilização aeróbica dos carboidratos. Em caso negativo. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para crescimento.cap 07. as bioquímicas e as sorológicas. As características mais usadas na confirmação são as morfológicas.p65 77 1/7/2007. o arranjo das células (isoladas. além dos grupos amina e carboxila. Assim como no enriquecimento seletivo. lisina e ornitina descarboxilases. são passíveis de descarboxilação A disponibilidade de uma ou mais descarboxilases varia entre as espécies e representa uma característica útil na diferenciação. No teste. bastonetes retos. algumas cepas do alvo podem ser sensíveis às condições seletivas dos meios de plaqueamento. em tétrades. em cachos. enzimas indutíveis produzidas pelas bactérias apenas na presença dos respectivos aminoácidos e em condições ácidas. a única fonte de carbono disponível no meio de cultura é o citrato. helicoidais). para diferenciar os microrganismos que produzem dos que não produzem enzimas lipolíticas. ocorrerá multiplicação. tendo seu crescimento inibido pelo acúmulo desse produto do seu próprio metabolismo. 23:50 . como Clostridium sp. pelo acúmulo de massa celular ou por viragem de indicador de pH. Os testes mais utilizados são os descritos abaixo (Silva. com a conseqüente alcalinização do meio de cultura. A decomposição desse material ocorre através da ação das enzimas classificadas como hidroperoxidases. por exemplo. que incluem a peroxidase e a catalase (peróxido de hidrogênio redutase). através de testes que verificam características típicas do(s) microrganismo(s) alvo. Se a bactéria dispõe do aparato metabólico necessário à assimilação do citrato. O crescimento pode ser observado visualmente. não haverá crescimento. Testes de descarboxilação de aminoácidos. é comum a utilização de mais de um meio. a esculina. a motilidade e a formação de esporos. Objetivam verificar se a bactéria é capaz de descarboxilar aminoácidos formando aminas. 1996): Teste de catalase. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de produzir a enzima catalase. como é o caso do ensaio de Salmonella. para diferenciar os microrganismos que hidrolizam dos que não hidrolizam esse composto e o sangue. em filamentos) a coloração de Gram. Outros agentes diferenciais são a gema de ovo. responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2). Nesses casos. em pares. por exemplo. As características bioquímicas dependem do microrganismo alvo e são apresentadas nos capítulos específicos. As características morfológicas incluem principalmente forma das células (cocos. A maioria das bactérias anaeróbias. um composto preto e solúvel que se difunde e provoca o escurecimento do meio de cultura. É tóxico e pode provocar a morte das células se não for rapidamente decomposto. bastonetes curvos. As bactérias que não apresentam catalase ou peroxidase não são capazes de decompor o peróxido de hidrogênio. As características sorológicas incluem principalmente a verificação da presença dos antígenos somáticos “O” da parede celular e dos antígenos flagelares “H”. em cadeias. Confirmação Essa etapa objetiva confirmar a identidade da cultura isolada. Teste de citrato. O metabolismo de descarboxilação é um processo 77 cap 01. Apenas os aminoácidos que apresentam pelo menos um grupo químico ativo. A descarboxilação é dependente da disponibilidade de enzimas de descarboxilação. possuem peroxidase em lugar da catalase.

amônia e energia. por sua vez. Os processos fermentativos são seqüências de reações de óxido-redução que transformam a glucose em um ou mais compostos de carbono. incluindo ácidos. 23:50 . será posteriormente degradada a L-ornitina. Teste de fenilalanina deaminase. O ácido fenilpirúvico pode ser detectado no meio de cultura através da adição do cloreto férrico. de cor vermelho-violeta. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de utilizar o malonato de sódio como fonte de carbono para crescimento. produzindo ácido com ou sem gás. sob a ação de uma aminoácido oxidase. Galactose (hexoses) • Dissacarídeos: Maltose (glucose + glucose). também testado nos ensaios de fermentação: • Monossacarídeos: Eritritose (tetrose). ou seja. os produtos finais do processo serão alcalinos e produzirão o mesmo resultado no teste. que é um composto não-derivado de carboidratos. Objetivam verificar se a bactéria é capaz de fermentar determinados carboidratos. Sacarose (glucose + frutose). Xilose. CO2 e NH3. sendo um dos caracteres de fenótipo mais utilizados na identificação de bactérias. CO2 e H2.cap 07. Lactose (glucose + galactose) • Trissacarídeos: Rafinose • Polissacarídeos: Amido. Testes de fermentação de carboidratos. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de desaminar o aminoácido triptofano. Teste de malonato. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de desaminar o aminoácido fenilalanina. A entrada de um carboidrato diferente da glucose nos processos fermentativos depende da capacidade de cada espécie para introduzir o carboidrato na célula. Sorbitol Teste de indol. Ribose. Arabinose (pentoses). Esses compostos. O metabolismo da arginina é mais complexo e envolve duas vias metabólicas que podem operar simultânea ou separadamente: a via da arginina descarboxilase e a via da arginina deidrolase. pela enzima citrulina ureidase. A desaminação ocorre na presença de oxigênio. a arginina é inicialmente degradada a agmatina que. Manitol. que reage com o ácido fenilpirúvico formando um produto colorido. O 78 cap 01.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos anaeróbio que resulta em cadaverina e CO2 a partir da lisina e putrescina e CO2 a partir da ornitina. porém. Dulcitol. varia de espécie para espécie bacteriana. A desaminação do triptofano depende da disponibilidade pelas bactérias do complexo enzimático triptofanase. inclui os compostos abaixo. Independente de qual via seja utilizada pela bactéria no metabolismo da arginina. álcoois. O termo carboidratos. flavoproteína que catalisa a conversão de uma molécula de fenilalanina em uma molécula de ácido fenilpirúvico e uma molécula de amônia. a arginina é inicialmente degradada a L-citrulina que. Vias metabólicas de fermentação de diferentes carboidratos são características das espécies. por sua vez. O tipo(s) de produto(s) final(ais) da oxidação da glucose. além do inositol. formando um anel na superfície do meio de cultura líquido. a fenilhidrazona. O indol liberado para o meio de cultura pode ser detectado por uma reação química com o aldeído presente no reagente de Kovacs para teste de indol (p-dimetilamino benzaldeído). pela enzima agmatinase. gerando energia no final. ficam concentrados na fase alcoólica do reagente.p65 78 1/7/2007. a uréia ainda será degradada a duas moléculas de amônia. Frutose. o tipo de fermentação. de maneira geral. Nas bactérias urease positivas. Na via da descarboxilase. será posteriormente degradada a putrescina e uréia. Na via da deidrolase. ácido pirúvico. que desamina o triptofano resultando em indol. que resulta em produtos de condensação coloridos. Glucose. Inulina • Açúcares-álcool: Adonitol. convertê-lo em glucose e então realizar a fermentação. com resultante alcalinização do meio de cultura.

embora algumas espécies sejam capazes de crescer substituindo o oxigênio por compostos inorgânicos como o nitrato e o sulfato (respiração anaeróbia). 23:50 . Assim. A utilização de carboidratos para produção de energia nas bactérias pode ocorrer por dois processos. Objetiva verificar o tipo de metabolismo de carboidratos utilizado pela bactéria ou a não utilização de carboidratos. gerando como produto final de metabolismo o hidróxido de sódio.6. o reagente utilizado é sempre um agente redutor artificial que atua como aceptor final dos elétrons transferidos pela citocromo oxidase C. também é capaz de utilizar o sulfato de amônia como única fonte de nitrogênio. essencial à atividade metabólica das bactérias para a produção de energia. As bactérias que utilizam tanto o metabolismo oxidativo quanto o fermentativo são chamadas de anaeróbias facultativas. embora possam utilizar outros carboidratos. pelo acúmulo de hidróxido de sódio. Se o metabolismo da glicose for estritamente oxidativo ou oxidativo e fermentativo. é um processo anaeróbio e não depende da disponibilidade de oxigênio. a menos que as células sejam capazes de utilizar o próprio malonato como fonte de carbono e energia. algumas bactérias são incapazes de utilizar a glicose. que se oxida para manter o sistema funcionando. O metabolismo oxidativo é um processo aeróbio para a maioria das bactérias. um indicador de pH com ponto de viragem em 7. como o Campylobacter. Essa alcalinização pode ser detectada pelo azul de bromotimol. Teste de oxidase. isto é. é o oxigênio. uma vez que seu crescimento só ocorre na presença de O2.Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos malonato é um composto que apresenta a característica de inibir a atividade da enzima succinato desidrogenase.cap 07. Esse sistema é uma seqüência de reações de óxido redução. o dos demais também será. presentes em todas as bactérias que utilizam o metabolismo respiratório. 79 cap 01. utilizada como caráter de identificação. em que elétrons são transferidos de um substrato para outro. Quando uma bactéria é capaz de utilizar o malonato. o oxidativo (respiração celular) e o fermentativo. as citocromo oxidases. que deriva sua energia de aminoácidos ou de ácidos intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico. Também há bactérias que são incapazes de utilizar qualquer tipo de carboidrato. não havendo necessidade de testar um a um. O metabolismo de respiração celular nas bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas apresenta. porque podem crescer tanto na presença quanto na ausência de O2. ao contrário. uma das oxidases que participam do processo oxidativo de respiração celular. com a produção de energia. a citocromo C oxidase. ao receber os elétrons. O tipo e o número de citocromo oxidases presentes na cadeia de transporte de elétrons de diferentes bactérias é uma característica das espécies. Para que a transferência de elétrons para o oxigênio possa ocorrer é necessária a participação de um grupo especial de enzimas de transporte de elétrons. o aceptor final de elétrons. O carboidrato normalmente adicionado aos meios teste de oxidação fermentação é a glucose. No final da cadeia. Dependendo da concentração do malonato presente. por exemplo. Objetiva verificar a presença da enzima citocromo C. adicionando-se sulfato de amônia ao meio de cultura. Por outro lado. de forma que. o sistema de transporte de elétrons. só ocorre na presença do oxigênio como aceptor final de elétrons. as bactérias malonato-positivas provocarão uma elevação do pH do meio. que não se encontra presente em todas as bactérias capazes de utilizar o metabolismo respiratório. No teste. Esses reagentes apresentam a característica de mudar de cor ao passar do estado reduzido para o oxidado. a multiplicação dos microrganismos pode ser parcial ou completamente inibida. O teste de oxidase detecta especificamente uma dessas oxidases. que recebe os elétrons transportados pelos substratos anteriores. O metabolismo fermentativo. As bactérias que utilizam o metabolismo oxidativo dependente do oxigênio são chamadas de aeróbias estritas. como etapa final do processo. provocando uma reação colorida visível.p65 79 1/7/2007. Teste de oxidação/fermentação (O/F). porque é utilizado pela maioria das bactérias. oxidam-se.

que atua como catalisador para a reação com o reagente seguinte. a acetoína (acetilmetilcarbinol). à medida em que é formado. a amônia (NH3). Os produtos da redução podem ser utilizados ou não no metabolismo das bactérias. dependendo das condições ambientais. 5. descrita(s) nos capítulos específicos 80 cap 01. O diacetil reage com os núcleos guanidina da peptona do meio. A urease é uma enzima do grupo das amidases. o produto final é uma mistura de ácidos (2 glicose + 1 H2O ⇒ 2 ácido lático + 1 ácido acético + 2 ácido fórmico + 1 etanol) que reduzem o pH do meio para menos de 4. A acetoína pode ser detectada no teste de VP. responsável pela decomposição da uréia em amônia. Objetiva verificar se a bactéria produz a enzima urease. Na fermentação butilenoglicólica.4. podendo incluir o nitrito(NO2-). que catalisam a hidrólise de amidas como a uréia. O nitrito pode ser detectado através de uma reação colorida com os reagentes para teste de nitrato.5. Essa verificação é feita com zinco. descritos nos capítulos específicos • Estufa(s) incubadora ou banho(s) maria regulado(s) na(s) temperatura(s) especificada(s) pelo ensaio a ser realizado. acelerando a reação e intensificando a cor. o gás nitrogênio resultante dessa redução. uma solução concentrada de hidróxido de potássio ou sódio. A fermentação da glicose pelas bactérias pode resultar em diferentes produtos finais de fermentação. pode-se concluir que o nitrato foi reduzido. a ocorrência do processo pode ser comprovada pela ausência do nitrato originalmente acrescentado ao meio de cultura. que atua como agente oxidante para a oxidação da acetoína a diacetil. um indicador de pH com ponto de viragem abaixo de 4. indicativa de não redução. que supera a capacidade tamponante do tampão fosfato presente. convertida em butilenoglicol pela ação da diacetil redutase.2. Na fermentação ácido mista. que reagem com o nitrito formando um composto diazônico colorido. Os mais comuns são o nitrito e. Objetiva verificar se a bactéria é capaz de reduzir o nitrato a nitrito ou a gás nitrogênio livre. o óxido nítrico (NO).p65 80 1/7/2007. se o meio estiver isento de produtos da redução do nitrato. onde podem ser detectados. um indicador de pH com ponto de viragem em pH 8. A hidrólise de cada molécula de uréia resulta em duas moléculas de amônia. Essa redução acentuada do pH. o produto final é precedido por um precursor intermediário. pode ser detectada adicionando-se à cultura algumas gotas de solução de vermelho de metila. Não ocorrendo reação. Quando não utilizados são excretados para o meio de cultura. o gás nitrogênio (N2).5. o óxido nitroso (N2O) e a hidroxilamina (R-NH-OH). Alternativamente. formando um produto de condensação avermelhado que. Teste de Voges-Proskauer (VP). Primeiramente uma solução alcoólica 5% de α-naftol. sendo o tipo de metabolismo fermentativo uma característica das espécies. no caso das bactérias também capazes de reduzir o nitrito. uma mistura de α-naftilamina e ácido sulfanílico. capaz de provocar uma reação colorida com qualquer nitrato presente no meio.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Teste de redução do nitrato. MATERIAL REQUERIDO NAS ANÁLISES • Material para preparação da amostra. combinase com o α-naftol. Objetiva verificar se o metabolismo fermentativo da bactéria é do tipo ácido misto. através da adição dos reagentes Barrit para teste de VP. descritos nos capítulos específicos • Meios de cultura recomendados para o ensaio a ser realizado. uma diamida do ácido carbônico ou carbamida. A redução completa do nitrato a gás nitrogênio (via nitrito ou óxido nitroso) é chamada denitrificação. Teste de urease. Objetiva verificar se a bactéria produz butilenoglicol (butanodiol) como produto final de fermentação da glicose. A redução do nitrato (NO3-) é um processo usualmente anaeróbio e o produto final da redução varia em função da espécie bacteriana. Teste de vermelho de metila (VM).cap 07. 23:50 . que elevam o pH do meio de cultura e podem ser detectadas pelo vermelho de fenol.

seguir as orientações dos capítulos específicos. compondo os caldos de pré enriquecimento obtidos. substituindo o diluente pelo caldo de pré enriquecimento. Para a incubação do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo. Esse cuidado evita que a amostra inoculada permaneça por muito tempo nas estufas antes de atingir a temperatura de incubação.cap 07.3. de enriquecimento seletivo. 81 cap 01. transferir uma alíquota para o segundo caldo de maneira similar. a) Pré enriquecimento Nos ensaios que utilizam uma única etapa de enriquecimento. observar os cuidados descritos no Capítulo 2. seguir as orientações dos capítulos específicos para cada ensaio. o volume do caldo de enriquecimento seletivo deve ser suficiente para manter a proporção recomendada de pré enriquecimento a ser transferido. Composição úmida de amostras em ensaios com duas etapas de enriquecimento. Se. Como esse volume normalmente é grande. Para tanto. uma alíquota de cada caldo de pré enriquecimento é transferida para um mesmo frasco de caldo de enriquecimento seletivo. Na análise de diversas unidades de amostra de lotes. para manter a proporção. Para a incubação do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo. na quantidade necessária para diluição 1:10. Identificar todos os frascos. para garantir que as atividades sejam conduzidas sob condições assépticas. Se não foi feita a composição a seco. Composição de amostras a seco. recomenda-se que a temperatura do caldo. b) Enriquecimento seletivo Esse item aplica-se apenas aos ensaios que utilizam duas etapas de enriquecimento. o volume da alíquota de caldo de pré enriquecimento a ser transferida para o(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo deve ser multiplicada pelo número de unidades de amostra compostas. Nesse caso. mas sim. devendo ser consultados os capítulos específicos. Se foi feita a composição a seco de várias amostras no pré enriquecimento. mas há exceções. 23:50 . PROCEDIMENTO Antes de iniciar o procedimento. no momento da inoculação. A essa amostra composta adiciona-se o caldo de préenriquecimento. A diluição padrão da amostra no caldo é de 1:10 (uma parte da amostra para nove partes de caldo). são necessários 100ml do caldo de enriquecimento seletivo para compor 10 amostras. pode-se fazer a composição úmida. Agitar cuidadosamente o frasco de pré enriquecimento e transferir uma alíquota para o caldo de enriquecimento seletivo. essa etapa não é de pré enriquecimento. por exemplo. na maioria dos ensaios. é possível preservar cada unidade pré enriquecida sob refrigeração e analisar individualmente depois. descrita no item abaixo. coletando-se uma unidade analítica de cada e juntando todas numa única amostra composta. tubos e placas que serão inoculados. A proporção entre o volume da alíquota e o volume do caldo é de uma parte para dez. A maioria deles utiliza os mesmos procedimentos de preparação de amostras descritos no Capítulo 2. Para alimentos que não permitam a obtenção de uma amostra composta homogênea. Para a prática de transferir 1ml do caldo de pré enriquecimento para 10ml do caldo de enriquecimento seletivo. seja a mesma da incubação. for importante determinar qual unidade de amostra está contaminada. O volume do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo também deve ser multiplicado pelo número de unidades de amostras compostas.p65 81 1/7/2007. com o código da amostra e a sigla do meio de cultura contido. nessa etapa pode ser feita a composição úmida de várias amostras pré enriquecidas. seguir as orientações dos capítulos específicos. é comum a prática de compor as amostras.Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos 5. Se mais de um caldo for utilizado no ensaio. Para a inoculação da amostra. no caso de presença.

A cada série de estrias o inóculo é menor. em outra placa do mesmo meio. transferir uma alíquota de 1ml de cada caldo enriquecido para um mesmo tubo estéril vazio. puxar novamente o inóculo para o último quarto não inoculado da placa. As estrias são feitas da seguinte forma: com uma alça de inoculação. A inoculação deve ser feita por estrias de esgotamento. mesmo que outros tipos de colônias estejam presentes.cap 07. conforme mostrado na Figura 5. Essas exceções são apresentadas nos capítulos específicos.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Composição úmida em ensaios com uma única etapa de enriquecimento. o ensaio é dado como concluído e o resultado como ausência. puxar o inóculo para fora da metade inoculada e descrever novas linhas. c) Plaqueamento diferencial Nos ensaios de duas etapas de enriquecimento. Se isso não ocorrer.1) Técnica de inoculação por estrias de esgotamento para obter culturas puras. Utilizar a técnica descrita abaixo para a repicar a cultura das colônias nos meios de isolamento. As novas linhas não devem tocar as primeiras. devendo ser seguidas as orientações dos capítulos específicos. A partir desse ponto.p65 82 1/7/2007. d) Seleção de colônias e repique de culturas para confirmação A confirmação é feita a partir das colônias com características típicas do microrganismo alvo. até obter placas com colônias isoladas. Na ausência de colônias típicas. nos capítulos específicos. Atingida a metade da placa. Assim. 82 cap 01. c. aguardar esfriar e. estriar uma alçada na superfície do meio de cultura seletivo diferencial recomendado para o ensaio. para obter culturas puras em colônias isoladas. próximo à parede da placa.1. homogeneizar bem em um agitador tipo “vortex” e utilizar essa amostra composta na etapa de plaqueamento diferencial subsequente. A incubação das placas deve ser feita da forma recomendada para o ensaio. porque foi sendo esgotado na série anterior. Havendo colônias típicas. De maneira geral. Há exceções em que se recomenda utilizar colônias atípicas. 23:50 . A partir desse ponto. A partir de cada tubo ou frasco de caldo enriquecido. repetir esse procedimento em cada meio utilizado. bem próximo à parede da placa. flambar a alça. o plaqueamento diferencial é feito a partir do(s) caldo(s) de enriquecimento seletivo. no último quadrante inoculado. As linhas não devem encostar umas nas outras. O número de colônias que devem ser isoladas para a confirmação varia com o ensaio. nos capítulos específicos. uma alçada da cultura na placa deve ser novamente inoculada por estrias de esgotamento. a partir da segunda série de estrias. sendo mantido um pequeno ângulo entre uma e outra. aguardar resfriar e tocar em um ponto da metade inoculada. ocupando um quarto da placa. descrevendo novas linhas em toda a área restante. assim como os meios de isolamento. pelo menos duas colônias típicas de cada meio de plaqueamento diferencial são submetidas à confirmação. fazendo linhas bem próximas umas das outras. Nesse caso. descritas nos capítulos específicos. em metade da placa. conforme descrito abaixo. transferindo-se uma pequena parte da massa de células para um ou mais meios de isolamento. deve ser feito o isolamento da cultura. Flambar novamente a alça. é feita a partir do único caldo de enriquecimento. a placa deve conter colônias isoladas. Não tocar nenhuma das estrias feitas anteriormente. transferir uma alçada da cultura para um ponto da superfície do meio. Se mais de um meio de plaqueamento for recomendado para o ensaio. para aumentar a chance de isolar uma que seja do microrganismos alvo. pelo menos no último quarto inoculado. é provável a obtenção de colônias isoladas. puxar a alça em movimentos de vai-e-vem. Esse procedimento deve ser repetido tantas vezes quantas necessárias. Nos ensaios de uma única etapa. na ausência das típicas. Para o isolamento. de forma a transferir culturas puras.

agitar o caldo e colocar uma alçada sobre 83 cap 01.1. porque isso aumenta o risco de carregar os contaminantes. Se a cultura estiver em caldo. e. colocar uma gota de solução salina (NaCl 0. também. de forma a retirar uma quantidade mínima da massa de células. Os meios semi-sólidos e os sólidos não inclinados são inoculados por picada. Para garantir que a cultura tomada de uma colônia típica esteja pura. coloração de esporos e preparação de montagens úmidas.cap 07. nunca com alças de inoculação. mesmo que não possa ser vista. não flambar a agulha nem tomar um novo inóculo entre um tubo e outro. Os meios normalmente estão contidos em tubos. Com a ponta da agulha.Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos Placa de Petri com meio de cultura Alça de inoculação Figura 5. depois. Preparar um esfregaço da cultura da seguinte forma: Se a cultura estiver em meio sólido. 23:50 . colônias atípicas de vários tipos. sem atingir o fundo do tubo.p65 83 1/7/2007. Os meios sólidos inclinados são inoculados fazendo-se uma picada. Os meios líquidos são inoculados introduzindo-se a agulha até uma profundidade próxima do fundo e agitando levemente (há exceções.85%) sobre uma lâmina de vidro limpa e seca e emulsionar uma alçada da cultura com a solução salina. tocar levemente o centro da colônia. estrias na rampa. a retirada do inóculo deve ser feita com agulhas. podendo ser sólidos (inclinados ou não). exceto os procedimentos básicos de coloração de Gram. em sua parte mais alta. Não tocar qualquer outra região da colônia ou do meio de cultura em redor. Técnica de repique de culturas puras a partir de colônias isoladas em placas. semi-sólidos ou líquidos. As placas normalmente contém colônias típicas e. sem atingir o fundo e. Incubar os tubos nas condições descritas para o ensaio. nos capítulos específicos. e) Testes de confirmação Os testes requeridos na confirmação são definidos nos capítulos específicos.1) Coloração de Gram (método de Hucker). Técnica de inoculação por estrias de esgotamento. é suficiente para inocular vários meios de isolamento. Nunca remover toda a colônia. Na inoculação de vários tubos. que são da microbiota competidora. Os capítulos também apresentam o procedimento para a realização dos testes. Uma quantidade mínima de inóculo. apresentadas nos capítulos específicos). apresentados abaixo.

sem esfregar. Aguardar que o líquido seque naturalmente e. Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão. passando rapidamente a lâmina pela chama do bico de Bunsen. então. Se a cultura estiver em caldo. • Lavar em água corrente e cobrir com Solução de Safranina 0. podendo também ser observadas a morfologia e o arranjo das células. apenas tocando o esfregaço com o papel). As células das bactérias Gram positivas vão ficar coradas de roxo e as das Gram negativas de vermelho. Corar da seguinte forma: • Segurar a lâmina sobre um banho ou frasco com água sob fervura.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos a lâmina de vidro. lavar em água corrente e cobrir com Solução de Safranina 0. sem esfregar. por três vezes. • Lavar em seguida com etanol. apenas tocando o esfregaço com o papel). • Lavar em água corrente (fluxo de água bem leve) e cobrir com Solução de Iodo (Lugol) por um minuto. • Lavar em água corrente e cobrir com Solução de Safranina por 30 segundos. Corar da seguinte forma: • Cobrir o esfregaço com Solução de Verde Malaquita 5% aquosa e corar a quente durante cinco minutos. • Cobrir o esfregaço com Solução de Verde Malaquita 5% aquosa e corar durante um a dois minutos. • Após o tempo de contato recomendado.cap 07.3) Coloração de esporos (Método de Ashby). antes que o material seque. • Lavar em água corrente e secar com papel de filtro. da mesma forma indicada para a coloração de Gram. até que não haja mais desprendimento de corante (30 segundos). Os esporos vão ficar corados de verde e as células vegetativas de vermelho. Para aquecer a solução de verde de malaquita.4) Montagens úmidas para observação microscópica a fresco. Cobrir o líquido com uma lamínula e observar imediatamente ao microscópio. e. segurar a lâmina sobre um banho ou frasco com água sob fervura.p65 84 1/7/2007. tocando levemente. Os esporos vão ficar corados de verde e as células vegetativas de vermelho. agitar o caldo e colocar uma alçada sobre a lâmina de vidro. da mesma forma indicada para a coloração de Gram. Preparar um esfregaço da cultura. A melhor 84 cap 01. Corar da seguinte forma: • Cobrir o esfregaço com Solução de Cristal Violeta de Hucker e manter em contato por um minuto. e. • Lavar em água corrente e secar com lenço de papel ou papel de filtro. Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão. Preparar um esfregaço da cultura. 23:50 .2) Coloração de esporos (Método de Schaeffer-Fulton). e. Se a cultura estiver em meio sólido. fixar o esfregaço pelo calor. • Lavar em água corrente e secar com papel absorvente (lenço de papel ou papel de filtro. colocar uma gota de solução salina sobre uma lâmina de vidro limpa e seca e emulsionar uma alçada da cultura com a solução salina. até observar gotas de água condensada na parte de baixo da lâmina.5% aquosa por 20 a 30 segundos.5% aquosa por 30 segundos. Observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão. • Lavar em água corrente e secar com lenço de papel ou papel de filtro (sem esfregar.

p. 4th ed. MOORMAN..2. p. a forma e o arranjo das células.A. P. mas. T. K.Técnicas Básicas de Detecção da Presença/Ausência de Microrganismos visualização é obtida em microscópio de contraste de fase. W.F. In: DOWNES.37-44. (eds. M. & ITO. SPERBER. SPLITTSTOESSER. D. F. na falta deste. 4th ed. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. (eds.45-51. 2001. Testes Bioqúimicos para Identificação de Bactérias em Alimentos. Cultural methods for the enrichment and isolation of microrganisms. REFERÊNCIAS BIER.A. J... F. também pode ser feita em microscópio óptico. P. TORTORELLO. 2001. A observação a fresco permite verificar a motilidade. com objetiva de imersão. 23:50 .).L.A. & FREIER. K. 85 cap 01. 1996. Washington: American Public Health Association (APHA). 5. Microscopic methods.W. N. In: DOWNES. M. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. SILVA. Chapter 5. Washington: American Public Health Association (APHA). & ITO.cap 07. Chapter 4.p65 85 1/7/2007.). Campinas: Instituto de Tecnologia de Alimentos.

1 são apresentadas as contagens típicas em algumas mercadorias no comércio internacional. Significado da contagem total de aeróbios mesófilos A contagem Total de Aeróbios Mesófilos em placas. 2004) e da 21a Edição do Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater (Eaton et al. Não diferencia tipos de bactéria.1. Não é um indicador de segurança. manipulação e vida de prateleira. também denominada Contagem Padrão em Placas. INTRODUÇÃO A maioria das orientações desse capítulo são da American Public Health Association (APHA). pode ser útil na avaliação da qualidade. Nas Tabela 6. deve levar em conta a diluição e o efeito no produto final.Capítulo 6 Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas 6.2 as especificações da FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization) para a contagem total de aeróbios mesófilos em alguns alimentos. pode indicar se o controle da umidade está sendo corretamente aplicado ao processo de secagem. descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito.p65 87 1/7/2007. A utilização da contagem total de aeróbios mesófilos como indicador de qualidade deve ser criteriosa. Na Tabela 6. 23:50 . pois não está diretamente relacionado à presença de patógenos ou toxinas. práticas de manufatura. Na Tabela 6. condições de processamento. Dependendo da situação. 2005). Os produtos fermentados. 87 cap 01. sendo utilizado para se obter informações gerais sobre a qualidade de produtos. é o método mais utilizado como indicador geral de populações bacterianas em alimentos. aplicada à ingredientes. ao contrário. porque populações altas de bactérias podem indicar deficiências na sanitização ou falha no controle do processo ou dos ingredientes. Por exemplo. matérias primas utilizadas. sem qualquer relação com a qualidade. Quando diferentes ou complementares às do Compendium.cap 07.. (Aerobic Plate Count). apresentam populações naturalmente altas de mesófilos.3 as especificações apresentadas pelo Standard Methods for the Examination of Dairy Products da APHA para a contagem total de aeróbios mesófilos em produtos lácteos. 2001). Aplicada a alimentos desidratados. foram também incluídas recomendações da 17a Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank.

Especificações da FAO/WHO para contagem total de aeróbios mesófilos em alimentos (Morton.0x104 a 1.0x104 3.8x106 1.5x104 5.0x102 1.0x106 1.0x105 2.0x104 5.0x106 1.5x104 3.0x104 5. camarões) Carne moída fresca Cortes de frango Batatas congeladas Contagem total de aeróbios mesófilos máxima (UFC/g) 1.0x104 1. Produto Arroz não beneficiado Arroz beneficiado Amêndoas Nozes Massas frescas refrigeradas ou congeladas Pães.0x102 a 1.0x105 1. Contagem total de aeróbios mesófilos máxima (UFC/g ou ml) 2.1.0x104 3. Contagem total de aeróbios mesófilos típica em mercadorias no comércio internacional (Morton..OMS).0x105 Tabela 6.0x104 1.0x105 1. batatas. 2001).0x104 1.0x103 a 1. 23:50 .2.0x103 1.p65 88 1/7/2007.cap 07.3x105 1.0x105 3. WHO = World Health Organization (Organização Mundial da Saúde .3.1x104 a 2. 2001).0x103 a 1.0x104 7. doces e salgados assados Proteína de soja Massas Misturas de cereais secos Cereias matinais Cacau Vegetais congelados Leite cru Saladas mistas (frango.0x104 FAO = Food and Agriculture Organization.0x105 1.0x103 1. Produto Leite e produtos lácteos pasteurizados Leite condensado Leite desnatado em pó tipo A e tipo Instantâneo Leite desnatado em pó tipo Extra Leite desnatado em pó tipo Padrão Leite integral em pó tipo Extra Leite integral em pó tipo Padrão APHA = American Public Health Association.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Tabela 6.4x103 3.0x105 1.0x104 3. ovos.0x104 88 cap 01.0x103 a 1.0x104 4.0x102 a 6.0 a 7. bolos. Tabela 6.0x101 a 1.0x105 0 a 1.0x105 1. Produto Ovo integral em pó ou congelado Produtos instantâneos em pó Produtos desidratados consumidos após adição de líquido com emprego de calor Camarão congelado pré cozido Misturas geladas Gelo comestível Leite em pó Caseínas Contagem total de aeróbios mesófilos máxima (UFC/g) 5. 2004).0x102 a 1.0x103 a 1.0x106 8. Especificações apresentadas pelo Standard Methods for the Examination of Dairy Products da APHA para a contagem total de aeróbios mesófilos em produtos lácteos (Lewis et al.

5oC/ 48±2h. Psychrobacter. descrito no Capítulo 7 do Compendium. cocos e bastonetes. incluindo Listeria monocytogenes. Clostridium. Recomenda ainda. Algumas bactérias patogênicas também são psicrotróficas. superfície ou filtração em membrana). aves. Lactobacillus. superfície e filtração em membrana. São definidos como microrganismos capazes de produzir crescimento visível a 7±1oC no prazo de 7 a 10 dias. esporogênicos e não esporogênicos. 23:50 . Na classificação tradicional dos microrganismos em função da temperatura – termófilos. cárneos. Yersinia enterocolitica. exclusivamente para a técnica de filtração em membrana. Flavobacterium. se multiplicam em alimentos refrigerados mas crescem melhor nas temperaturas da faixa mesófila.5oC/48±2h. Alcaligenes. incubado a 35±1oC/48±2h. Leuconostoc. Enterobacter. 2001) recomenda substituir o PCA pelo Ágar Soro de Laranja (OSA). Os psicrotróficos. mesófilos e psicrófilos . Métodos de análise O método clássico de contagem total de aeróbios mesófilos ou psicrotróficos em alimentos. Carnobacterium. Esses meios podem ser usados no plaqueamento em profundidade. 2004) recomenda incubar o PCA a 32±1oC/48±2h.cap 07. Enterobacter. prolongando a incubação até 72±3h no caso de produtos lácteos desidratados. 2005) recomenda substituir o PCA pelo Ágar R2A ou NWRI. Alcaligenes. Chromobacterium. Pseudomonas sendo a mais freqüente. Escherichia. a Seção 9215 do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice. bem como Carnobacterium e Weissella viridescens. As principais bactérias psicrotróficas estão distribuídas em vários gêneros. Microbacterium. algumas cepas de Bacillus cereus.p65 89 1/7/2007. Espécies de Bacillus. Corynebacterium. em menor extensão. incluindo. peixes e frutos do mar) são espécies dos gêneros Acinetobacter. independente de sua temperatura ótima. Flavobacterium. algumas cepas de Clostridium botulinum tipo E e tipos B e F não proteolíticos. Flavobacterium. Leuconostoc e membros da família Enterobacteriaceae são deteriorantes de alimentos embalados sob vácuo ou atmosferas modificadas. com as seguintes exceções: Na análise de leite e produtos lácteos o Capítulo 6 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al. ao contrário. Lactobacillus. Espécies de Alteromonas. Pseudomonas e Yersinia causam amolecimento e deterioração em vegetais refrigerados. Bacillus. Klebsiella. O meio de cultivo recomendado para a maioria dos ensaios é o Ágar Padrão para Contagem (PCA). Micrococcus. Aeromonas hydrophila. permitindo recuperar as bactérias lácticas. Brochothrix. incubado a 30±1oC/48±2h. porque esses últimos geralmente morrem à temperatura ambiente.. Citrobacter. Acinetobacter.os psicrotróficos são um subgrupo dos mesófilos. Na análise de água. Na análise de sucos de frutas o Capítulo 58 do Compendium (Hatcher et al. Serratia. O OSA é um meio nutricionalmente mais rico que o PCA. o Ágar m-HPC. Pseudomonas. Klebsiella. Vibrio cholerae. Shewanella.Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas Definição de psicrotróficos Microrganismos que crescem em alimentos sob refrigeração (0-7oC) mas apresentam temperatura ótima acima de 20oC são chamados de psicrotróficos ou psicrotrófilos. Arthrobacter. algumas cepas de E. não dos psicrófilos. Moraxella. Brochothrix. Streptococcus e Weissella. normalmente presentes nesses produtos.. é a contagem padrão em placas (plaqueamento em profundidade. incubado a 35±0. aeróbios e anaeróbios. Aeromonas. As mais comuns em alimentos (produtos lácteos. Bacillus e Lactobacillus são deteriorantes de produtos lácteos. Listeria. Clostridium. Photobacterium e Vibrio são importantes deteriorantes de pescados. incubados a 35±0. Pseudomonas. Em água o PCA resulta em contagens menores do que 89 cap 01. coli enteropatogênica.

para estudos comparativos com outros meios e para laboratórios que necessitam manter a continuidade de registros antigos. leite Produtos lácteos e não lácteos Alimentos. da seleção das diluições ao cálculo dos resultados. Tabela 6.org/testkits/kits-microbiology. O procedimento descrito abaixo não apresenta esses detalhes. “Kits” analíticos oficializados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC. 2005).12. Fabricante 3M Microbiology Products 3M Microbiology Products BioControl Systems.. acesso em 10/02/06. 989.aoac. as do Capítulo 6 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al. Inoculação por plaqueamento em profundidade • Placas de Petri de 20 x 100mm estéreis vazias • Ágar Padrão para Contagem (PCA) • Ágar Soro de Laranja (OSA) (para sucos de frutas) • Ágar R2A ou NWRI (preferenciais para amostras de água) 90 cap 01.2 (PB) • Pipetas de 1 ou 2ml • Observação: consultar o Anexo 2.10. produtos lácteos. Incluídas também as recomendações específicas do Capítulo 58 do Compendium (Hatcher et al. que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas. mas foi mantido na 21o edição do Standard Methods. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE Preparacão da amostra e diluições seriadas • Diluente: Água Peptonada 0. 6.htm>. 2001) para a análise de sucos de frutas.07 Aplicação Alimentos.2. 23:50 . 2001). MÉTODO DE CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS EM PLACAS Método da American Public Health Association (APHA) para a análise de alimentos. A contagem pode ser feita utilizando-se os métodos de plaqueamento em profundidade (pour plate).2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em função da amostra analisada.p65 90 1/7/2007.1.4.33 AOAC Official Method 988. para a análise de água.2 (PB) • Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0. Aplicação: análise de água e de todos os alimentos. Antes de iniciar as atividades. 2004) específicas para a análise de produtos lácteos. pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.18 AOAC Official Method 2002. Outros métodos que já foram oficializados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC. Nome do “kit” Petrifilm Aerobic Count Plate Redigel Aerobic Plate Count SimPlate for Total Plate Count Color Indicator (TPC-CI) Validação AOAC AOAC Official Methods 990. disponível no site <http://www.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos o R2A ou o NWRI. 986.1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7.3. descrito no Capítulo 7 da 4o Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Morton.2.1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7. e as da Seção 9215 do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (Hunt & Rice. Inc.. ingredientes e amostras ambientais Fonte: AOAC International. 2005) para contagem total de aeróbios em alimentos. 6. superfície (spread plate) e filtração em membrana. ler atentamente as orientações do Capítulo 3.cap 07. 2005) são os “kits” analíticos descritos na Tabela 6.

2001).2.Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas Inoculação por plaqueamento em superfície • Placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA) • Placas com Ágar Soro de Laranja (OSA) (para sucos de frutas) • Placas com Ágar R2A ou NWRI (para amostras de água) • Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70% Inoculação por filtração em membrana • Placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA) • Placas com Ágar R2A.1ml 1ml ou 0.45µm. porosidade de 0.1ml 1ml ou 0. PROCEDIMENTO O esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em placas encontra-se descrito na Figura 6. brancas e quadriculadas • Conjunto de filtração previamente esterilizado • Bomba de vácuo • Pinças para transferência das membranas. 23:50 .cap 07. NWRI ou m-HPC (para amostras de água) • Membranas de 47mm de diâmetro. para medição de volumes de amostra Incubação • Estufa incubadora regulada a 35±1oC com termômetro calibrado (para alimentos em geral) • Estufa incubadora regulada a 30±1oC com termômetro calibrado (para sucos de frutas) • Estufa incubadora regulada a 32±1oC com termômetro calibrado (para leite e produtos lácteos) 6.2. 91 cap 01. mergulhadas em etanol • Proveta de 100 ou 200ml estéril.1.1.p65 91 1/7/2007.1ml PCA Ágar Padrão para Contagem (PCA) plaqueamento em profundidade ou superfície 35±1oC/48±2h PCA CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS UFC/g Figura 6. Homogeneização 10 -1 1ml 10 -2 1ml 10 -3 9ml H20p 25g de amostra + 225ml de Água Peptonada (H20p) 9ml H20p 1ml ou 0. Esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos em placas (Morton.

Para amostras de sucos de frutas. substituir o PCA pelo Ágar R2A ou NWRI. 6. preferencialmente. c) Inoculação. Misturar o inóculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas. Para amostras de água.32±1oC/72±3h para produtos lácteos desidratados OSA . Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 0. considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata.2. Para amostras de sucos de frutas.p65 92 1/7/2007.1. secar em capela de fluxo laminar (30 a 60 minutos.1ml de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula. b) Preparação das placas. Inverter e incubar as placas nas seguintes condições: PCA .Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 6. Plaqueamento em profundidade a) Preparação das amostras e diluições seriadas. b) Inoculação. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. estéreis e vazias. em um contador de colônias. preferencialmente. espalhar o inóculo 92 cap 01. substituir o PCA pelo Ágar Soro de Laranja (OSA). Preparar previamente placas de Ágar Padrão para Contagem (PCA) e. para solidificação do meio.2. numa superfície plana.2. seguir as orientações do Capítulo 3. previamente fundido e resfriado a 44-46oC.cap 07. em movimentos na forma de oito ou em movimentos circulares. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular 1ml de cada diluição em placas de Petri separadas. oito a dez vezes no sentido horário e oito a dez vezes no sentido anti-horário. substituir o PCA pelo Ágar R2A ou NWRI. Plaqueamento em superfície a) Preparação das amostras e diluições seriadas. aguardar a completa solidificação do ágar e adicionar uma sobrecamada do mesmo meio. Verter nas placas inoculadas. Calcular o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mililitro da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada.32±1oC/48±2h para produtos lácteos PCA . sem empilhar. Limite de detecção do procedimento padrão (1ml/diluição): 1 UFC/ml de amostras líquidas ou 10 UFC/g de amostras sólidas. antes do uso. Para amostras em que seja comum a ocorrência de colônias grandes e espalhadas (leite em pó. Caso tenham sido utilizadas duas placas por diluição (duplicata). Para amostras de água. 23:50 . com as tampas parcialmente abertas) ou em estufa (50oC/1. substituir o PCA pelo Ágar Soro de Laranja (OSA). por exemplo).35±1oC/48±2h para alimentos em geral PCA . c) Adição do meio de cultura. Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados em situações não usuais. d) Incubação.35±0. Distribuir as placas numa bancada fria.5oC/48±2h para água e) Contagem das colônias e cálculo dos resultados.5-2h ou 25-30oC/18-24h).2.2. Selecionar as placas com 25 a 250 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. 12 a 15ml de Ágar Padrão para Contagem (PCA).30±1oC/48±2h para sucos de frutas R2A e NWRI . na apresentação dos resultados. Usando uma alça de Drigalski.

Podem também ser utilizadas placas de 50mm de diâmetro (com 5ml de meio de cultura) ou almofadas absorventes (“pads”) estéreis. por exemplo. entretanto.1) Como o método de filtração é uma técnica de concentração dos microrganismos em amostras com baixas contagens. colocados no interior de placas (também estéreis) e embebidos com porções de 2ml dos mesmos meios. Se o cálculo do resultado for feito com a contagem dessa diluição. Seguir as mesmas orientações descritas para o plaqueamento em profundidade.30±1oC/48±2h para sucos de frutas R2A e NWRI . Filtração em membrana O método de filtração em membrana aplica-se a líquidos límpidos. que podem ser fracionados em duas porções de 50ml.p65 93 1/7/2007. depende da contaminação estimada na amostra. substituir o PCA pelo Ágar R2A. NWRI ou m-HPC. 25 e 5ml. Homogeneizar a amostra seguindo as orientações do Capítulo 2. c) Preparação da amostra. d) Incubação. Aguardar que as placas sequem (mínimo 15min).3. Nota c. 6.1ml/diluição): 10 UFC/ml de amostras líquidas ou 100 UFC/g de amostras sólidas.32±1oC/48±2h para produtos lácteos PCA . Limite de detecção do procedimento padrão (0. o procedimento usual é a filtração de 100ml da amostra.3ml e uma placa com 0. Preparar previamente.35±0. a) Preparação do conjunto de filtração. 23:50 .35±1oC/48±2h para alimentos em geral PCA . Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados em situações não usuais. Se o nível de contaminação esperado da amostra for baixo. evitando respingos. seguir as orientações do Capítulo 3. É recomendado para amostras com contagens abaixo do limite de detecção dos outros métodos. Pode também ser utilizado na análise de produtos sólidos convertidos em soluções límpidas. sendo bastante utilizado na análise de refrigerantes (não contendo sucos naturais) e água para consumo humano. da mesma forma recomendada para o plaqueamento em superfície. sem a utilização da proveta. de forma a resultar em placas com contagens na faixa de 20 a 200 colônias. o número de colônias dessa diluição é a soma das quatro placas. como sal e açúcar. Se o copo do conjunto de filtração for graduado e a escala contiver a marcação de volume requerida.5oC/48±2h para água e) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. b) Preparação das placas. então não é necessário multiplicar por dez. preferencialmente. o volume da amostra pode ser medido diretamente. quatro porções de 25ml ou três porções de 70. Medir 100ml numa proveta estéril e verter cuidadosamente no copo do conjunto de filtração. 93 cap 01. Se foi feita a distribuição de 1ml da primeira diluição em quatro placas. inverter e incubar nas seguintes condições: PCA . para levar em conta o volume dez vezes menor inoculado.cap 07. Seguir as orientações do Capítulo 3. multiplicar o resultado por dez. A seleção do volume a ser filtrado.32±1oC/72±3h para produtos lácteos desidratados OSA . na forma líquida. respectivamente. inocular um volume maior da primeira diluição. até que o excesso de líquido seja absorvido.Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas por toda a superfície do meio.2. Para amostras de água.2. porém.1ml). distribuindo esse volume por quatro placas (três placas com 0. sem sólidos em suspensão.

Se o número de colônias por quadrícula estiver na faixa de três a dez. PCA .12/989. com a face quadriculada para cima. Se o número de colônias por quadrícula estiver na faixa de dez a vinte. ainda com a bomba ligada. para que haja contato dos microrganismos com os nutrientes. Não é necessária uma medida exata de diluente. Se o número de colônias por quadrícula for maior do que vinte. enxaguar as paredes do copo com 20 a 30ml de diluente. para evitar desidratação. f) Incubação.cap 07. Retirar o copo e. deve-se levantar a borda da membrana mais próxima da(s) bolha(s) e recolocá-la de forma a eliminar a(s) bolha(s). Após a passagem da amostra.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Nota c2) Quando o volume a ser filtrado for menor do que 20ml. Incubar as placas nas condições abaixo. Proceder à contagem das colônias com o auxílio de um microscópio estereoscópico.33) ™ Petrifilm™ é uma modificação da contagem de células viáveis em placas. Multiplicar esse valor por 100 e dividir pelo volume filtrado. Repetir esse procedimento mais uma vez. Ligar a bomba de vácuo e proceder à filtração. para recolher eventuais contaminantes aderidos. preferencialmente. reidratáveis. d) Filtração. Se houver formação de bolhas.0x103 dividido pelo volume filtrado. para obter o número de UFC/ml. impregnados por substâncias geleificantes solúveis em água fria.PCA) e por um indicador de tetrazólio (torna as colônias vermelhas.10/986. expressar o resultado como maior do que 2. MÉTODO DE CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS MESÓFILOS EM PETRIFILM™ (AOAC 990. com uma pinça flambada e resfriada. facilitando uma melhor distribuição dos microrganismos na membrana. NWRI ou m-HPC . facilitando a contagem). contar todas as colônias presentes e dividir pelo volume filtrado.35±0. Ao colocar a membrana na placa é importante que toda a superfície fique completamente aderida ao meio. Selecionar para contagem placas com 20 a 200 colônias. adicionar ao copo do conjunto de filtração cerca de 20-30ml de diluente. pelo meio de cultura (similar ao Ágar Padrão para Contagem . antes da adição da amostra. invertidas e. transferir a membrana para a placa com o meio de cultura. com aumento de 10 a 15 vezes e. contar dez quadrículas e tirar a média por quadrícula. cuja função é aumentar o volume a ser filtrado. Limite de detecção do procedimento padrão (filtração de 100ml): 1 UFC/100ml. 6.p65 94 1/7/2007. e) Transferência e incubação da membrana. para obter o número de UFC/ml. Desligar a bomba de vácuo antes que a membrana seque excessivamente. acondicionadas em sacos ou bandejas com papel toalha ou papel de filtro úmido.35±1oC/48±2h para alimentos em geral R2A. É composto por dois filmes estéreis. contar apenas cinco quadrículas para tirar a média e calcular o número de UFC/ml da mesma forma.5oC/48±2h para água g) Contagem das colônias e cálculo dos resultados.3. 94 cap 01. para facilitar a visualização posicionar as placas de forma a obter uma iluminação perpendicular ao plano da membrana. Seguir as orientações abaixo para contagem e cálculo do número de UFC/ml: Se o número de colônias por quadrícula da membrana for menor ou igual a dois. 23:50 .

Contar todas as colônias vermelhas. incubar a 32±1oC/48±3h d) Contagem das colônias e cálculo dos resultados. A área circular de crescimento do petrifilm tem aproximadamente 20cm2 e a contagem deve ser feita nos petrifilms com 25 a 250 colônias. aplicar uma leve pressão. a) Preparação das amostras e diluições seriadas. levantando o filme superior e depositando o inóculo no centro da área circular do filme inferior.. PROCEDIMENTO Observação.1.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em função da amostra analisada. calcular a média por cm2 e multiplicar por 20. 95 cap 01. contar as colônias em um ou mais quadrados de 1cm2.3. Baixar o filme superior sobre o inóculo. para espalhar o inóculo. em pilhas de não mais de 20 filmes. posicionar o espalhador (que acompanha o kit de petrifilms) e. No caso de produtos lácteos.2 (PB) • Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0.Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas Método oficial da AOAC (Association of Official Analytical Chemists). sem inverter. Selecionar três diluições adequadas da amostra para a inoculação.2 (PB) • Pipetas de 1 ou 2ml • Observação: consultar o Anexo 2.p65 95 1/7/2007. Limite de detecção: 1 UFC/ml de amostras líquidas ou 10 UFC/g de amostras sólidas. independente do tamanho ou intensidade da cor. O procedimento abaixo é orientativo. 23:50 . c) Incubação: Aguardar um minuto para o gel solidificar e incubar 35±1oC/48±2h. 2004). b) Inoculação. Posicionar os petrifilms em uma superfície plana. Para determinar o número de colônias em petrifilms com mais 250. 2001) e no Capítulo 6 da 17a Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Laird et al. Inoculação • Placas de Petrifilm™AC para Contagem Total (3M Company) • Espalhador Incubação • Estufa incubadora regulada a 35±1oC com termômetro calibrado • Estufa incubadora regulada a 32±1oC com termômetro calibrado (para leite e produtos lácteos) 6. devendo sempre ser verificadas e obedecidas as instruções do fabricante. seguindo as instruções do fabricante.2.cap 07.1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7. incluído no Capítulo 7 da 4 Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Morton.3.1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7. Calcular o número de UFC por grama ou mililitro da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE Preparacão da amostra e diluições seriadas • Diluente: Água Peptonada 0. Inocular 1ml de cada diluição em placas de Petrifilm™AC para Contagem Total (3M Company) separadas. a 6. Aplica-se à análise de todos os alimentos. Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2.

p65 96 1/7/2007.1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7. Não recomenda o plaqueamento em profundidade porque as bactérias são sensíveis ao calor e podem ser afetadas pelo meio de cultura quente. antes da adição sobre o inóculo. 2001) recomenda plaqueamento em Petrifilm ou plaqueamento em superfície.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 6. a partir da coleta. Inoculação por plaqueamento em superfície • Meio de cultura: placas com Ágar Padrão para Contagem (PCA). alterando a condição de incubação. 2004) recomenda. descrito no Capítulo 13 da 4 Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Cousin et al. porque pode provocar injúria ou morte de vários microrganismos. 23:50 . A incubação pode ser feita a 7±1oC por 10 dias ou 17±1oC por 16 horas.. plaqueamento em profundidade.1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7.cap 07. Incubação a 7±1oC por 10 dias. MÉTODO DE CONTAGEM DE AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS Método da American Public Health Association (APHA). PROCEDIMENTO O esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios psicrotróficos em placas encontra-se descrito na Figura 6. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE Preparacão da amostra e diluições seriadas • Diluente: Água Peptonada 0. 96 cap 01.2. considerar na avaliação dos resultados que parte da microbiota pode ter sido perdida.1. 2001) e no Capítulo 8 da 17o Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. seguido de mais 3 dias a 7±1oC. o 6. A estocagem refrigerada permite sua multiplicação e o tempo de geração de vários desses microrganismos encontra-se dentro desse intervalo. que pode ser substituído pelo Ágar Tripticase de Soja (TSA) ou pelo Petrifilm Contagem Total (3M Company) • Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70% • Estufa incubadora regulada a 7±1oC com termômetro calibrado • Estufa incubadora regulada a 17±1oC com termômetro calibrado (opcional) 6. O Capítulo 13 do Compendium (Cousin et al. Segue o mesmo procedimento da contagem total de aeróbios mesófilos.2.4.2 (PB) • Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0. 2004). O Compendium recomenda que as amostras destinadas à contagem de aeróbios psicrotróficos sejam analisadas no intervalo de seis horas. O congelamento não é indicado para essas amostras.4. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. Se o congelamento for indispensável. para leite e produtos lácteos..2 (PB) • Pipetas de 1ml • Observação: consultar o Anexo 2. Aplica-se à análise de todos os alimentos.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em função da amostra analisada. usando PCA resfriado a 45±1oC.4. usando Ágar Padrão para Contagem (PCA) ou Ágar Tripticase de Soja (TSA) como meios de cultivo.

F. 2001. Psychrotrophic microrganisms. and K. PARISH.C. J.1ml 0.htm>. & GREENBERG. A.. American Public Health Association. 2004. E.: American Public Health Association (APHA).org/testkits/kits-microbiology. 2001.. American Public Health Association. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 2001). CLESCERI.. and K. M. SPLITTSTOESSER.W.159-166. In: WEHR. American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF).227-248.C.M.1ml PCA ou TSA Ágar Padrão para Contagem (PCA) ou Ágar Tripticase de Soja (TSA) Plaqueamento em superfície 7±1 C/10 dias ou o 17±1 C/16h seguido de 7±1oC/3 dias o PCA ou TSA CONTAGEM TOTAL DE AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS UFC/g Figura 6. A. D.. Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater.2. Chapter 13. C. W. In: DOWNES. C. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Washington. B. RICE. Washington. EATON. D. p.. F. Rapid Test Kits. D.D.Contagem total de Aeróbios Mesófilos e Psicrotróficos em Placas Homogeneização 10 -1 1ml 10 -2 1ml 10 -3 9ml H20p 25g de amostra + 225ml de Água Peptonada (H20p) 9ml H20p 0.). Chapter 58. P.). J. WEIHE. & YOUSEF. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.E. Washington. HATCHER.). & FRANK. p.S.F. 2005.. C. 4th ed. Washington: American Public Health Association (APHA). P. 2005. In: DOWNES. L. acesso em 10/02/06. JAY. American Public Health Association. & ITO. F.F (Eds. P. FRANK.M..E. D.. ITO (ed. & WOODWARD. J..p65 97 1/7/2007. J. P. Fruit beverages. Esquema geral de análise para contagem total de microrganismos aeróbios psicrotróficos em placas (Cousin et al. Washington.1ml 0. 97 cap 01. (Eds). p. & VASAVADA. 21st Ed. K (eds. F. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 23:50 . Disponível no site <http://www. 4th ed. 2001.B. 4th ed. 6.L.A. 17th ed. Tests for groups of microrganisms.aoac. COUSIN.cap 07. ITO (ed.S.E. M. DOWNES. Chapter 8. D... A. H.).5 REFERÊNCIAS AOAC International..565-568.

ITO (ed. F. (Eds). & FRANK. Washington. p. D.). H.). R.F (Eds. Washington.A. In: EATON et al.153-186. Milk and milk products standards. C. W.36.F (Eds. In: WEHR. D.cap 07. S. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. C. MORTON. Chapter 6. Chapter 16.D... In: WEHR. M..p65 98 1/7/2007. CLARK. H. et al. D. GAMBREL-LENARZ. C. SPOMER. SMITH.C.63-67. WEHR.M.537-550.F (Eds.34-9. p. Part 9000. F.E. C. SCHER. 2004. Chapter 7..). 98 cap 01.: American Public Health Association (APHA). 2004. & FRANK.. American Public Health Association. 2004. J.. 2005.M. P. & FRANK. LAIRD.M. J. American Water Works Association (AWWA & Water Environment Federation (WEF). Standard Methods for the Examination of Dairy Products. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.). Standard Methods for the Examination of Water & Wastewater. D. Section 9215. Microbiological count methods.. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 17th ed. & RICE. p. American Public Health Association. D. LEWIS.M. 4th ed. E. D. In: DOWNES.W. American Public Health Association. p. Washington. D. M. 23:50 . D. 17th ed. H. American Public Health Association.. J.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos HUNT.T. Washington. Washington.9. 21st Ed. 2001. Aerobic plate count. 17th ed.. and K. Microbiological examination.

Entretanto. limitam a gama de alimentos susceptíveis à deterioração por leveduras. seu efeito restritivo sobre a velocidade de crescimento torna-se mais acentuado. e aqueles que crescem em altas concentrações de sal são chamados halófílicos. os íons de amônia e o nitrogênio orgânico.80. Seu crescimento não é incomum sob condições de refrigeração (5oC).Capítulo 7 Contagem de Bolores e Leveduras 7. Os bolores são extremamente versáteis. A temperatura ótima de crescimento da maioria dos fungos encontra-se na faixa de 25 a o 28 C. Entretanto. não conseguem utilizar a sacarose como única fonte de carbono. temperatura.0 a 8. INTRODUÇÃO A maioria das informações e orientações contidas nesse capítulo são da American Public Health Association (APHA). 99 cap 01. específicas para a análise de produtos lácteos. de maneira geral. por exemplo. de uma certa forma. Quando diferentes ou complementares às do Compendium. porém. várias espécies vão apresentar um crescimento limitado. Muitas são incapazes de assimilar nitrato e carboidratos complexos. 2004). foram também incluídas recomendações da 17ª Edição do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Wehr & Frank. se houver outros fatores de inibição (atividade de água. os fungos são muito pouco afetados pela variação na faixa de 3. Os bolores e leveduras constituem um grande grupo de microrganismos.p65 99 1/7/2007. não crescendo bem nas temperaturas mesófilas (35-37oC) e raramente nas temperaturas de bactérias termotolerantes (45oC). descritas na 4ª Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Downes & Ito.0 e diversas leveduras abaixo de 1. como pH ácido e atividade de água baixa. As leveduras.cap 07.0.88 e a maioria dos bolores na faixa de 0. Esses fatores. como Zygosaccharomyces bailii. se for necessário utilizar as proteínas ou os aminoácidos como fonte tanto de nitrogênio quanto de carbono. a maioria das espécies capaz de assimilar qualquer fonte de carbono derivada de alimentos. quando o pH afasta-se do ótimo (geralmente próximo de 5. podendo utilizar o nitrato. 2001). A maioria também é indiferente com relação às fontes de nitrogênio. Os bolores e leveduras são também bastante resistentes à condições adversas. A maioria das leveduras apresenta atividade de água mínima de crescimento na faixa de 0.1.0) a velocidade de crescimento diminui e. 23:50 . algumas exigem vitaminas e outras. Com relação ao pH.85 são chamados de xerófilicos.). a maioria originária do solo ou do ar.5. Os bolores e leveduras capazes de crescer em atividades de água abaixo do limite de 0. são mais exigentes do que os bolores. etc. Vários bolores que crescem abaixo de 2. abaixo de 10oC negativos os alimentos podem ser considerados microbiologicamente estáveis.

que reduz a atividade de água do meio. além de cloranfenicol e dicloran. são eficientes em utilizar pequenas quantidades de oxigênio. Por outro lado. Em linhas gerais. algumas espécies de bolores dos gêneros Mucor. provocando alterações percebidas mais fácil ou rapidamente.1. em cuja superfície há fácil acesso ao oxigênio. 1999). determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC). para aumentar a exposição ao oxigênio e evitar o “stress” causado pelo meio de cultura quente. No entanto. contém também glicerol. assim como a atmosfera de armazenamento. Isso as torna os deteriorantes mais comuns de alimentos líquidos engarrafados. para inibir bactérias. Outros métodos já oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) são os “kits” analíticos descritos na Tabela 7. O Capítulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. Métodos de análise de bolores e leveduras totais A quantificação de bolores e leveduras em alimentos é feita pelo método de contagem padrão em placas. Byssochlamys e Fusarium podem crescer nesses produtos. 2001) recomenda o Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC). ao contrário. para alimentos de atividade de água menor ou igual a 0.. exerce uma considerável influência sobre os tipos de fungos que irão provocar a deterioração do produto.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Os bolores deteriorantes de alimentos. sugerindo que leveduras não possam deteriorar alimentos sólidos ou bolores alimentos líquidos. exigem oxigênio para crescimento.p65 100 1/7/2007.cap 07. Os fungos infecciosos raramente são associados aos alimentos. de forma que o efeito do O2 é dependente da quantidade absoluta dissolvida no substrato. Eventualmente. para alimentos com atividade de água superior a 0. porém. Vários bolores produzem micotoxinas. certas leveduras de origem alimentar podem desencadear reações alérgicas e alguns bolores podem provocar infecções em indivíduos imunodeprimidos. Penicillium e Fusarium. Vários meios podem ser utilizados: O Capítulo 20 do Compendium (Beuchat & Cousin. as leveduras são mais competitivas em líquidos. O DG18. provocando deterioração. Rhizopus. 2004) recomenda o DRBC para produtos lácteos em geral e o Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC) para amostras com predomínio de leveduras ou com leveduras injuriadas pelo processamento. são favorecidos por substratos sólidos firmes. ideais para as leveduras fermentativas. que são metabólitos tóxicos formados durante o crescimento. Simplesmente. e não da concentração presente na atmosfera. pode também ser utilizado Ágar Batata Dextrose Acidificado (PDA-AC). 100 cap 01. Além disso. O DRBC contém cloranfenicol. Os gêneros de bolores toxigênicos mais importantes são Aspergillus. muitas espécies de leveduras são capazes de crescer na completa ausência de O2 e em diferentes concentrações de CO2. O método mais recomendado é o plaqueamento em superfície. nos quais o crescimento dos bolores é limitado pela disponibilidade de oxigênio. substratos líquidos oferecem maior oportunidade para desenvolvimento de condições anaeróbias. as leveduras predominam em alimentos líquidos. algumas bactérias podem crescer neste meio (Taniwaki et al. para restringir o espalhamento da colônia. acidificação ou outro tratamento que possa provocar injúrias às células. Para produtos não submetidos a tratamento térmico. como quase todos os outros fungos filamentosos. várias espécies. podendo ser considerados aeróbios estritos. porque são unicelulares e se dispersam mais facilmente em líquidos. Os bolores. Nesses produtos o DRBC recupera menos leveduras do que o YEGC. porém.95. além de dicloran e rosa de bengala.95 e o Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18). 23:50 . Ao contrário dos bolores. essa afirmação não deve ser entendida como absoluta. A consistência do alimento.

O método tradicional de quantificação de psicrotróficos em alimentos é contagem padrão em placas.02 AOAC Official Method 2002. Pichia. fulva (Splittstoesser & Splittstoesser.cap 07. Os gêneros de leveduras mais encontrados são Candida.11 Aplicação Alimentos Alimentos. Cladosporium.p65 101 1/7/2007. geléias e produtos fermentados (iogurte. com D88ºC de 0. alta acidez ou condições de embalagem que inibam bactérias. na completa alteração da textura. exceções. disponível no site <http://www.org/testkits/kits-microbiology. fischeri é similar à de B. Sporotrichum. frutas. Rhizopus.95. A temperatura de incubação é de 7±1oC por 10 dias ou 17±1oC por 16 horas. devido à produção de pectinases. Saccharomyces. “Kits” analíticos oficializados pela AOAC (Association of Official Analytical Chemists) para a contagem bolores e leveduras em alimentos.8min e valor z entre 6 e 7ºC (Casella et al. de maneira geral. Talaromyces bacillisporus e Eupenicillium brefeldianum. capazes de sobreviver aos tratamentos térmicos. As espécies conhecidas são Byssochlamys fulva. Mucor. Debaromyces. Kluveromyces. entretanto. Os bolores são Alternaria. sendo destruídos com relativa facilidade por tratamentos térmicos brandos. seguido de mais 3 dias a 7±1oC.1. Aspergillus.. acesso em 10/02/06. Fusarium. Neosartoria fisheri. Sua sobrevivência ao tratamento térmico pode resultar em crescimento com formação de micélios e. com baixa atividade de água. Cryptococcus. Thamnidium e Trichothecium.aoac. Botrytis. Torulopsis e Trichosporon.75 a 0. determinando-se o número de unidades formadoras de colônias (UFC) de aeróbios por grama ou mililitro. embutidos. ingredientes e amostras ambientais Fonte: AOAC International. Fungos psicrotróficos Os bolores e leveduras também apresentam cepas psicrotróficas. Os bolores termorresistentes são mais comumente associados com a deterioração de frutas e seus derivados. Fabricante 3M Microbiology Products BioControl Systems Inc. 1979) e valor z entre 6 e 7ºC (King et al. Penicillium. A resistência térmica de B nivea é ligeiramente inferior. pois certos fungos filamentosos do sub-reino Ascomycotina produzem esporos sexuais (ascosporos).Contagem de Bolores e Leveduras Tabela 7. Há.. fulva tem valor D90ºC de 1 a 12 min (Bayne & Michener. 101 cap 01. 1990) e a de N. Monascus. Byssochlamys nivea. Bolores termorresistentes Os fungos. 1969). 1977).htm>. queijos. Geotrichum. Rhodotorula. cujos ascosporos podem apresentar resistência térmica comparável à dos esporos bacterianos. processados termicamente. incluindo. apresentam baixa resistência ao calor. para alimentos em geral (pode ser substituído pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18). embora sejam menos estudadas do que as bactérias. no caso de Byssochlamys. Colletotrichum. Os meios utilizados são o Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC). 23:50 .). etc. Os ascosporos de B. Hansenula. Os fungos predominam em alimentos refrigerados. Talaromyces flavus. Nome do “kit Petrifilm Yeast and Mold Count Plate SimPlate Yeast and Mold Color Indicator (YM-CI) Validação AOAC Official Method 997. para alimentos com atividade de água menor que 0.

Por essa razão.95 e produtos lácteos em geral) • Placas de Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18) (para alimentos com atividade de água menor ou igual a 0. 7. sem adição de conservantes. o número de esporos em frutas geralmente é baixo.1% (H2Op) ou o Tampão Fosfato pH 7.1. o sucesso da detecção depende da coleta de amostras significativamente maiores do que as normalmente requeridas nas demais análises de alimentos. O procedimento descrito abaixo não apresenta esses detalhes.2 (PB) • Pipetas de 1 ou 2ml • Observação: consultar o Anexo 2. A detecção é baseada no tratamento térmico das amostras. mesmo contagens ainda mais baixas são inaceitáveis.MATERIAL REQUERIDO PARA ANÁLISE Preparacão da amostra e diluições seriadas • Diluente: Água Peptonada 0.95. descrito no Capítulo 20 da 4 Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Cousin. ler atentamente as orientações do Capítulo 3.p65 102 1/7/2007. Em alimentos processados assepticamente em altas temperaturas por curto tempo (UHT ou HTST). que apresenta todos os detalhes e cuidados envolvidos na contagem de microrganismos em placas. Ainda assim. o 7. porém. como o Ágar Batata Dextrose (PDA) ou o Ágar Extrato de Malte (MEA). Incluídas também as recomendações específicas do Capítulo 52 do Compendium (Gray & Pinkas. porque os esporos não são afetados pelo congelamento. a presença de apenas cinco esporos/g de produto já é considerada um problema sério. pectina e celulose e as do Capítulo 8 do Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. da seleção das diluições ao cálculo dos resultados. na etapa imediatamente anterior ao tratamento térmico. 2004) específicas para a análise de produtos lácteos. para eliminação das células vegetativas de bolores.2.2 (PB) • Tubos de diluição com 9ml de Água Peptonada 0.1% (H2Op) ou Tampão Fosfato pH 7. exceto produtos lácteos) • Placas de Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC) opcional para produtos lácteos com predomínio de leveduras ou com leveduras injuriadas) 102 cap 01. Antes de iniciar as atividades.2 do Capítulo 2 para verificar casos especiais em que o tipo ou volume de diluente variam em função da amostra analisada. seguido do plaqueamento em um meio adequado ao crescimento de bolores. Contagem por plaqueamento em superfície • Placas de Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) (para alimentos com atividade de água maior que 0. leveduras e bactérias. Essas amostras podem ser congeladas antes da análise. não excedendo 1-10/100g ou ml dos produtos processados.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Os bolores termorresistentes são amplamente distribuídos no solo. pressupondo que sejam conhecidos pelo analista.cap 07. 2001). MÉTODO DE CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS EM PLACAS Método da American Public Health Association (APHA). 2001) para a análise de gomas.2. 23:50 .

Esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em placas (Beuchat & Cousin.2.1. Homogeneização 10 -1 1ml 10 -2 1ml 10 -3 9ml H20p 25g de amostra + 225ml de Água Peptonada (H20p) 9ml H20p 0. 2001).cap 07. DG18 = Ágar Dicloram Glicerol 18 103 cap 01.p65 103 1/7/2007.1ml 0.2.1ml DRBC ou DG 18 Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG 18) Plaqueamento em superfície 22-25oC/5 dias DRBC ou Dg18 Colônias presuntivas de leveduras 5 colônias Colônias típicas de bolores Observação microscópica da morfologia das células % de colônias confirmadas CONTAGEM DE BOLORES (UFC/g) CONTAGEM DE LEVEDURAS (UFC/g) Somatório CONTAGEM TOTAL DE BOLORES E LEVEDURAS (UFC/g) Figura 7.Contagem de Bolores e Leveduras • Alça de espalhamento (alça de Drigalski) mergulhada em etanol 70% • Estufa incubadora regulada entre 22 e 25oC (25±1ºC para produtos lácteos) com termômetro calibrado 7. DRBC = Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol. 23:50 .1. PROCEDIMENTO O esquema geral de análise para contagem de bolores e leveduras em placas encontra-se descrito na Figura 7.1ml 0.

Recomenda-se não contar as colônias antes de cinco dias. recomenda 30oC/5 dias para produtos estocados à temperatura ambiente (Pitt & Hocking. manter a amostra de molho no diluente por um certo período de tempo. b) Inoculação Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular (plaqueamento em superfície) 0. Nota c. para alimentos com atividade de água menor ou igual a 0. O Standard Methods for the Examination of Dairy Products (Frank & Yousef. distribuindo o volume por quatro placas. 2001). até que todo o excesso de líquido seja absorvido. sem inverter. No caso da análise de matérias primas destinadas à formulação de produtos com atividade de água maior que 0. • Ágar Batata Dextrose Acidificado. opcional para produtos lácteos com predomínio de leveduras ou com leveduras injuriadas. 104 cap 01. Nota c.p65 104 1/7/2007. em pilhas de não mais de três placas. em função da viscosidade desses produtos. para evitar a fotodegradação do rosa de bengala. protegidas contra a luz. Se as contagens esperadas são baixas. selecionar as placas com 15 a 150 colônias e contar as colônias com o auxílio de uma lupa. pode ser feito o plaqueamento direto de 1g da amostra na placa. em um contador de colônias. de um dos seguintes meios de cultura: • Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC).1ml. porque a movimentação das placas pode resultar em crescimento secundário (devido ao deslocamento de esporos). exceto produtos lácteos.2) Antes do uso. estocar as placas de DRBC ou DG-18 em geladeira. Nota b1) Na análise de espessantes (gomas. três com 0. Para alimentos de umidade intermediária. invalidando a contagem final. • Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18).Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos a) Preparação das amostras e diluições seriadas Seguir os procedimentos descritos no Capítulo 2. Se as contagens estimadas na amostra forem menores do que 100/g ou ml. 2004) recomenda incubação a 25±1oC por 5±0. para alimentos com atividade de água maior que 0.1ml de cada diluição em placas previamente preparadas e secadas. inocular 1ml da primeira diluição. opcional para produtos lácteos não submetidos ao calor. pectina. 23:50 . Nota b.2) A International Commission on Food Mycology (ICFM) recomenda incubação a 25oC/5 dias como condição padrão. • Ágar Extrato de Levedura Glicose Cloranfenicol (YEGC). acidificação ou outro tratamento que possa provocar injúrias às células Espalhar o inóculo com uma alça de Drigalski.5 dias para a análise de produtos lácteos. c) Incubação Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos) e incubar a 22-25oC por cinco dias. para amolecer o produto e facilitar a liberação dos microrganismos presentes.95. espalhando o material por toda a superfície (Gray & Pinkas. celulose) a diluição inicial deve ser maior do que 1:10. das placas de maior para as placas de menor diluição.95. utilizar o Ágar DRBC.1. com formação de compostos inibidores para os bolores e leveduras. d) Contagem das colônias e cálculo dos resultados Para a contagem de colônias e cálculo dos resultados. no escuro.3ml e uma com 0. Em regiões tropicais. para verificar a contagem de potenciais deteriorantes do produto final. 1997).95 e produtos lácteos em geral.cap 07.

cap 07. Então.3. MÉTODO DE CONTAGEM DE FUNGOS PSICROTRÓFICOS Método da American Public Health Association (APHA).1ml) . a homogeneização em “stomacher” é mais indicada do que em liqüidificador. observando se a cultura é de leveduras.UFC/g ou ml de bolores e leveduras = (30+32)x102x10 = 6. o 105 cap 01.2. cinco foram submetidas à confirmação e três foram confirmadas como leveduras (60%). para alimentos em geral (pode ser substituído pelo PCA suplementado com 100mg/l de cloranfenicol) e o Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG-18).2x104. Na mesma placa. bactérias ou mistura de ambas.Contagem de Bolores e Leveduras Na placa selecionada. .0x104. multiplicar o número de colônias confirmadas como leveduras por dez e pelo inverso da diluição. seguido de mais 3 dias a 7±1oC. Os meios recomendados são o Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC). não ultrapassar dois minutos de homogeneização.Total de colônias típicas de bolores na placa = 30 . eventualmente capazes de crescer. contar as demais colônias. que podem ser de leveduras ou de bactérias. Para calcular o número total de bolores e leveduras. para alimentos com atividade de água menor que 0. de 30 colônias contadas. conforme procedimento descrito no Capítulo 5. contar separadamente as colônias com aspecto filamentoso. que pode ser 7±1oC por 10 dias ou 17±1oC por 16 horas.UFC/g ou ml de bolores = 30x102x10 = 3. características de bolores. Considerar como confirmadas todas as colônias que apresentarem leveduras ou mistura de leveduras e bactérias. o numero de colônias de leveduras na placa é de 30x0. O cálculo dos resultados deve ser feito de acordo com as orientações do Capítulo 3.Total de colônias de leveduras na placa = 40x0. somar o número de colônias de bolores e o número de colônias confirmadas como leveduras e multiplicar por dez e pelo inverso da diluição. Na preparação das amostras. cotonoso ou pulverulento. alterando a condição de incubação.Colônias presuntivas de leveduras na placa = 40. Para isso.8 = 32 . que pode favorecer a fragmentação dos micélios. Segue o mesmo procedimento da contagem total de bolores e leveduras. multiplicar o número de colônias típicas de bolores por dez e pelo inverso da diluição. Se for necessário usar liqüidificador. Exemplo .p65 105 1/7/2007.. cinco submetidas à confirmação. Selecionar pelo menos cinco dessas colônias e verificar a morfologia das células ao microscópio. pode ser feita uma montagem úmida ou uma coloração de Gram.2x104. Determinar o número de colônias de leveduras na placa em função da porcentagem confirmada. 23:50 .6=18. Para calcular o número de UFC/g ou ml de leveduras. 7. O esquema geral de análise para contagem de fungos psicrotróficos em placas encontra-se descrito na Figura 7. Para calcular o número de UFC/g ou ml de bolores.UFC/g ou ml de leveduras = 32x102x10 = 3. alterando a contagem.Diluição 10-2 (inoculados 0. . Por exemplo.95). 2001). descrito no Capítulo 13 da 4 Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Cousin et al. quatro confirmadas (80%) . anotando o resultado.

DRBC = Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol. 2001).2.cap 07.1ml 0.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos Homogeneização 10 -1 1 ml 10 -2 1 ml 10 -3 9ml H20p 25g de amostra + 225ml de Água Peptonada (H20p) 9ml H20p 0. DG18 = Ágar Dicloram Glicerol 18 106 cap 01. 23:50 .. Esquema geral de análise para contagem de fungos psicrotróficos em placas (Cousin et al.1ml DRBC ou DG18 Ágar Dicloran Rosa de Bengala Cloranfenicol (DRBC) ou Ágar Dicloran Glicerol 18 (DG18) Plaqueamento em superfície DRBC ou DG18 7±1oC /10 dias ou 17±1oC/16h seguido de 7±1oC/3 dias Colônias presuntivas de leveduras 5 colônias Colônias típicas de bolores Observação microscópica da morfologia das células % de colônias confirmadas CONTAGEM DE BOLORES PSICROTRÓFICOS (UFC/g) CONTAGEM DE LEVEDURAS PSICROTRÓFICAS (UFC/g) Somatório CONTAGEM TOTAL DE FUNGOS PSICROTRÓFICOS (UFC/g) Figura 7.1ml 0.p65 106 1/7/2007.

cap 07. Manter no banho por 90min. com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. transferir três porções de 50ml para tubos de 107 cap 01. 2001).p65 107 1/7/2007. igual quantidade de NaOH 10% estéril. adicionar 100ml de água destilada estéril e homogeneizar por 5min ou pelo tempo necessário para obter uma suspensão homogênea. Manter no banho por 30min. pesar 100g da amostra em uma bolsa plástica estéril. Após a homogeneização. Anotar o volume de NaOH consumido no ajuste e adicionar assepticamente. 23:50 . PROCEDIMENTO Atenção.4. MATERIAL REQUERIDO PARA A ANÁLISE • Água destilada estéril • Liquidificador ou “stomacher” e bolsas estéreis para homogeneização da amostra • Ágar Batata Dextrose (PDA) com Antibióticos ou Ágar Extrato de Malte (MEA) com Antibióticos. transferir três porções de 50ml da amostra para tubos de 200x30mm e utilizar um dos tubos para ajustar o pH em 3. MÉTODO DE CONTAGEM DE BOLORES TERMORRESISTENTES Método da American Public Health Association (APHA). aos dois demais tubos. para evitar a contaminação acidental da amostra por bolores do ambiente. Todas as etapas da análise para detecção de bolores termorresistentes devem ser realizadas em capela de fluxo laminar. Descartar o tubo manuseado e transferir os dois demais para um banho fechado. com a temperatura controlada entre 75 e 80oC.1) Para a análise de frutas ou polpas contendo pedaços de frutas.1. garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho.6. a.4.Contagem de Bolores e Leveduras 7. 7. pesar 100g da amostra em uma bolsa plástica estéril. garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho. Alternativamente. em concentração 1. garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho.2) Para a análise de sucos de frutas não concentrados (Brix < 35o).2. descrito no Capítulo 21 da 4o Edição do Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Beuchat & Pitt. Manter no banho por 30min. Colocar o copo em uma bolsa plástica estéril e transferir para um banho-maria fechado. pesar 100g da amostra em um copo de liquidificador estéril. adicionar 200ml de água destilada estéril e homogeneizar em “stomacher”. a) Choque térmico a.4. por 2-4min.5 • Tubos de 200x30mm ou Erlenmeyers de 250ml • Placas de Petri estéreis de diâmetro 150 mm • Banho-maria fechado regulado a 75-80oC e termômetro calibrado • Estufa incubadora regulada a 30±1oC e termômetro calibrado 7.4-3. transferir duas porções de 50ml para tubos de 200x30mm e colocar os tubos em um banho-maria fechado. adicionar 100ml de água destilada estéril e homogeneizar em “stomacher”. a.3) Para a análise de sucos de frutas concentrados (Brix > 35o). Após a homogeneização. com a temperatura controlada entre 75 e 80oC. com NaOH 10%.

c) Incubação Transferir as placas para uma bolsa plástica estéril. Environ. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. BEUCHAT.A. p.. na proporção 1:1. 23:50 . CASELLA. P.). Washington. COUSIN.. 7. Amostras líquidas com Brix > 35o devem ser diluídas. Washington.. Manter no banho por 30min. Washington. J. Technol. 1990.M. 4th Ed.217-222. Psychrotrophic microrganisms. BEUCHAT. L. & MICHENER.5. F. P. 4th Ed. In: DOWNES.. porém. ITO (ed.0 com NaOH 10%. com a temperatura controlada à 80oC. antes do aquecimento. C. REFERÊNCIAS BAYNE.G. Detection and enumeration of heat resistant molds. American Public Health Association. H. M. p. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.R. Nota b. 4th Ed.). Influence of age. Appl.159-166. 1979. fechar bem a bolsa. 10ml de Ágar Batata Dextrose (PDA) ou Ágar Extrato de Malte (MEA) com antibióticos e com 1. Após o choque térmico. em dupla concentração.R.A. F. b) Inoculação Distribuir as porções de 100ml em oito placas de Petri grandes (150mm de diâmetro) ou as porções de 50ml em quatro placas.D. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.C. and K.1%. J. previamente fundido e resfriado a 50-60oC. C. H. p.L. Chapter 20.. In: DOWNES. Homogeneizar bem e distribuir em cinco placas de Petri estéreis. In: DOWNES. Lebensm. American Public Health Association. 108 cap 01. W. A maioria dos esporos viáveis normalmente germinará e formará colônias visíveis em 7-10 dias.. growth medium. & COUSIN. MATASCI. 23:404-411. aguardando a completa solidificação. ajustar o pH e continuar a análise da mesma forma descrita para sucos não concentrados. Adicionar a cada placa.A. para evitar o ressecamento do meio de cultura e incubar a 30ºC por até 30 dias. com antibióticos..). devem ter seu pH ajustado em 3. ITO (ed. and K. Wiss. 2001. M. d) Cálculo dos resultados Contar as colônias desenvolvidas em todas as placas e calcular o resultado como número de esporos/100g ou ml.5 vezes a concentração normal. C. Colocar os tubos ou o saco de stomacher com a amostra num banho fechado. Heat resistance of Byssochlamys ascospores.209-215.Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos 200x30mm. & PITT. American Public Health Association. 2001..I. com água peptonada 0. P. Microbiol. garantindo que a superfície do produto permaneça abaixo da superfície da água do banho. esporos injuriados pelo calor poderão requerer um período adicional para desenvolver colônias. and K. Chapter 13. Chapter 21. D. Misturar bem a amostra com o meio de cultura e aguardar solidificar.5 a 4. vazias. D.cap 07. Yeasts and molds.p65 108 1/7/2007..1) Pitt & Hocking (1997) descrevem o seguinte procedimento alternativo: Pesar 100g da amostra em um saco de “stomacher” ou duas porções de 50g em tubos de 200x30mm ou Erlenmaeyers de 250ml. 2001. L. Amostras muito ácidas.. misturar a amostra com 100ml de Ágar Batata Dextrose (PDA) ou Ágar Extrato de Malte (MEA). 37:449-453. F. M. F & SCHMIDT-LORENZ. JAY. P. & VASAVADA. examinando semanalmente. D. and temperature on heat resistance of Byssochlamys nivea ascospores. ITO (ed.

D. In: WEHR.H. J. Washington. R. WEHR.T. & PINKAS.. A. Microbiol. & SPLITTSTOESSER..J. (eds). 23:50 . H. Blackie Academic & Professional.. Ascospores of Byssochlamys fulva compared with those of heat resistant Aspergillus.E. Appl.. MICHENER. GRAY. F.F. Tests for groups of microrganisms. SPLITTSTOESSER. P. Washington: American Public Health Association (APHA). 109 cap 01. H. 42:685-688. C. J. 1997. & FRANK.. J. Fungi and Food Spoilage.M. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. F. KING. Gums and spices. Control of Byssochlamys and related heat-resistant fungi in grape products.p65 109 1/7/2007. ITO (ed. D. A.A. TANIWAKI. and K. J. 1969. C. & ITO.. K (eds. 1977.F (Eds.M. J. IAMANAKA.). 4th ed. Journal of Food Mycology. American Public Health Association. American Public Health Association.Contagem de Bolores e Leveduras DOWNES. In: DOWNES. C. p.M. 2001. 2nd Ed.H.cap 07.D.I. American Public Health Association. H.533-540. 2: 291-302. A. K. D. J. 2001. London. FRANK. Washington. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.. Comparison of culture media to recover fungi from flour and tropical fruit pulp.F.). Food Sci. 4th Ed. p. Chapter 8. Standard Methods for the Examination of Dairy Products.F (Eds. 2004. D. D. 17th ed. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods.M. & ITO. B. & BANHE. 17th Ed. Washington. A.A. & YOUSEF. 18:166-173.227-248. 1999.). Chapter 52. & HOCKING. M. C. PITT. P.). 2004. & FRANK.D..

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful