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Textos curriculares de Análise Orgânica – QMC 5215 e QMC 5226

Prof. Moacir Geraldo Pizzolatti – Departamento de Química -UFSC

CAPÍTULO - I

INTRODUÇÃO

A Análise Orgânica trata dos métodos de separação, purificação e identificação dos


compostos de carbono obtidos de organismos vivos (metabólitos primários e secundários de
plantas e animais), de fósseis (carvão, petróleo, gás, sedimentos orgânicos) e de sínteses de
laboratório (instituições de ensino e pesquisa, indústrias químicas, petroquímica, farmacêutica,
alimentos). A metodologia utilizada na análise orgânica tem ampla aplicação em
determinações laboratoriais diversas envolvendo a identificação e quantificação de espécies
químicas das mais variadas procedências, bem como na pesquisa e desenvolvimento
tecnológico. Assim, os princípios básicos da Análise Orgânica se faz presente em laboratórios
de análises clínicas, indústria farmacêutica, tecnologia de alimentos, indústria química,
engenharia química, engenharia sanitária, bioquímica, biologia, meio ambiente, toxicologia,
medicina forense, materiais, controle de qualidade, etc.
A Sistemática de Análise Orgânica evoluiu ao longo dos tempos e acompanhou o
desenvolvimento dos conceitos fundamentais da química orgânica e o conhecimento das
reações químicas. Desde os tempos mais remotos da Química Orgânica, os compostos
orgânicos eram identificadas através do estudo de suas propriedades físicas e químicas. O
estudo destas propriedades e de como determiná-las levou a construção de equipamentos de
análise os quais se tornaram cada vez mais sofisticados com o desenvolvimento tecnológico
da ciência. Com a descoberta das propriedades espectroscópicas das moléculas e a
construção e desenvolvimento de equipamentos espectrométricos, uma nova geração de
metodologias passam a dominar, a espectroscopia aplicada a Análise Orgânica.
Os arranjos estruturais dos compostos orgânicos são virtualmente infinitos. Até
meados de 1970, estimava-se que mais de cinco milhões de compostos orgânicos já haviam
sido caracterizados. Sabemos que a cada ano milhares de novos compostos orgânicos são
identificados, assim, a análise sistemática é essencial pois através das propriedades de um
composto desconhecido pode-se rapidamente excluir milhares de possibilidades estruturais,
ficando algumas poucas para estudos mais avançados.
É importante destacar para o aluno, que o estudo da Análise Orgânica requer a
organização dos conhecimentos acumulados com respeito as propriedades físico-químicas,
estruturais e reações estudadas na Química Orgânica.
Os conhecimentos básicos a serem adquiridos em Análise Orgânica tais como: a)
identificação dos compostos orgânicos através de suas propriedades físico-químicas e
espectroscopicas; b) métodos de separação e purificação e análises cromatográficas; c)
aplicação de métodos espectroscópicos e cromatográficos em análises químico-farmacêutica,
bioquímica, clínica médica, alimentos, indústria, saúde pública, meio ambiente, controle de
qualidade (fitoterápicos, matéria prima, produção de medicamentos, etc.) e muitas outras áreas

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de atuação do químico e farmacêutico-bioquímico, darão o suporte necessário para uma boa


formação profissional seja qual for a escolha de sua área de atuação futura.
De uma forma descritiva, podemos abordar o estudo da Análise Orgânica do ponto de
vista da evolução dos conhecimentos das propriedades da matéria e o desenvolvimento
científico e tecnológico. O estudo da Análise Orgânica, cronologicamente, permite a distinção
de dois importantes períodos:
a) PERÍODO CLASSICO - As substâncias orgânicas eram separadas e identificadas através
de suas propriedades físicas e propriedades químicas.
b) PERÍODO MODERNO - A identificação e determinação estrutural das substâncias orgânicas
resulta principalmente da análise de suas propriedades espectroscopicas e a separação de
misturas e o isolamento de substâncias puras através de métodos instrumentais. Com o
advento das técnicas hifenadas, constituintes de mixturas complexas já podem ser
identificados com alto grau de segurança.
A Identificação Sistemática dos Compostos Orgânicos envolve três aspectos
importantes a serem pré considerados: I) Separação de misturas e isolamento do composto
puro, II) análise qualitativa e III) Análise quantitativa.

I - SEPARAÇÃO DE MISTURAS E ISOLAMENTO DO COMPOSTO PURO:

A investigação estrutural de compostos orgânicos é muito mais difícil e trabalhosa que


a dos compostos inorgânicos, pelo fato de serem substâncias muito mais complexas em
estrutura, ter uma infinidade de possibilidades estruturais e geralmente são encontrados em
misturas complexas de difícil separação, como no caso de produtos naturais. Também por
apresentarem uma reatividade extremamente diversificada e com reações muitas vezes de
maior dificuldade de compreensão.
Para que um composto orgânico seja efetivamente identificado é necessário separá-lo
da mistura. A separação de cada componente de uma mistura é realizada com base nas
diferenças de suas propriedades físicas e químicas, como por exemplo, valendo-se da
Mudança de Estado Físico da Matéria podemos obter a separação e purificação de
determinados Compostos Orgânicos por destilação e/ou sublimação. Outras propriedades
como as diferenças de Solubilidade permite a separação utilizando técnicas de precipitação e
cristalização.
Um dos métodos de maior eficiência na separação de misturas e por isso mesmo é de
longe o mais utilizado em problemas de separação e purificação de compostos orgânicos é a
Cromatografia. A cromatografia é um termo geral que descreve inúmeras técnicas de
separação utilizando as diferenças nas propriedades da matéria. Assim podemos estudar os
métodos cromatográficos classificando-os em: Métodos tradicionais - Cromatografia em
camada fina (CCF ), Cromatografia em papel, Cromatrografia em coluna (CC); Métodos
instrumentais - Cromatografia gasosa (CG), Cromatografia Gasosa de Alta Resolução
(CGAR), Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), Eletroforese

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II - ANÁLISE QUALITATIVA

A análise qualitativa tem por objetivo a identificação de cada componente da amostra


problema, seja a análise elementar de uma molécula ou a identificação das substâncias
químicas presentes numa mistura. Na análise qualitativa de uma determinada substância
orgânica pode ser aplicado os métodos clássicos de análise orgânica sistemática ou a análise
instrumental e métodos hifenados.
- Métodos Clássicos de Análise Orgânica:
Os métodos clássicos de análise orgânica compreende a análise elementar, a
determinação das propriedades físicas e a identificação sistemática dos grupos funcionais
através de suas reatividades específicas.
- Métodos Instrumentais:
Os métodos instrumentais de identificação estão fundamentados nas propriedades
moleculares tais como densidade atômica na cristalografia por Raio-X, força das ligações
na Espectrometria de Massas (EM) e nas propriedades espectroscopicas das moléculas
orgânicas como na Espectroscopia na Região do Ultravioleta e Visível (UV-VIS),
Espectroscopia na Região do Infravermelho (IV), Espectroscopia de Ressonância
Magnética Nuclear (RMN). Os métodos cromatográficos tais como a cromatografia gasosa
de alta resolução (CGAR), a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a eletroforese
são alternativas na identificação através dos parâmetros de retenção cromatográfica. Estes
métodos cromatográficos quando acoplados a espectroscopia molecular ou espectrometria
de massas são excelentes ferramentas nas identificação dos compostos orgânicos,
constituin do os métodos hifenados de análise. Assim temos a Cromatografia Gasosa de
Alta Resolução acoplada a Espectrometria de Massas (CGAR-EM) ou Espectroscopia no
Infravermelho (CGAR-IV) e a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a
Espectrometria de Massas (CLAE-EM).

III- ANÁLISE QUANTITATIVA

A análise quantitativa tem por objetivo determinar a quantidade de cada componente


na amostra problema. Do ponto de vista da análise elementar, a composição centesimal dos
elementos químicos de uma molécula pode ser obtida, e juntamente com a determinação da
massa molecular a fórmula molecular fica estabelecida. A análise quantitativa também se
ocupada da quantificação de cada composto químico presente em uma mistura, bem como a
determinação do grau de pureza de uma substância.
De modo geral a metodologia de análise quantitativa está fundamentada na correlação
linear existente entre a quantidade de uma substância e uma determinada propriedade física,
química ou espectroscópica, conforme apresentado no esquema da figura 1.1.

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Figura 1.1- Esquema ilustrativo de uma análise quantitativa.

Diversas métodos instrumentais foram desenvolvidos para medir as propriedades de


uma molécula e assim determinar sua quantidade. O quadro abaixo mostra algumas
propriedades e a instrumentação para medi-las:

Propriedade Medida Método Instrumental


Absorção de Radiação Eletromagnética Espectroscopia UV-VIS
Espectroscopia de Infra-Vermelho
Espectroscopia de R. M. N.
Emissão de Radiação Eletromagnética Fluorimetria
Fosforimetria
Lumnescência
Espalhamento da Radiação Eletromagnética Turbidimetria
Nefalometria
Espectroscopia Raman
Refração da Radiação Eletromagnética Refratometria
Interfcerometria
Rotação da Luz Polarizada Polarimetria
Absorção Atômica Espectrometria de Abbsorção Atômica
Emissão Atômica Espectrometria de Emissão de Chama
Potencial Elétrico Potenciometria
Carga Elétria Coulometria
Corrente Elétrica Voltametria
Resistência Elétria Condutimetria
Razão Massa/Carga Espectrometria de Massas

O calculo da quantidade ou concentração de uma substância é feito com auxílio de


uma curva de calibração (figura 2.2) que correlaciona linearmente a intensidade da propriedade
medida dessa substância com sua massa. Esta curva de calibração pode ser construída
preparando-se uma série de soluções padrão de concentração (massa) conhecida cuja
propriedade selecionada é medida. Um gráfico é então construído plotando-se a massa do
padrão no eixo x e a correspondente intensidade da propriedade medida no eixo y, obtendo-se
a melhor reta pelo método da regressão linear. Importante determinar a faixa linear dinâmica
apropriada para cada tipo de trabalho e de acordo com a sensibilidade do método. Para que
se possa aplicar os parâmetros estatísticos de confiabilidade, deve-se fazer no mínimo três
replicatas para cada medida. É também recomendável obter cinco pontos para a construção da
reta, ou seja da curva de calibração.

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Na aplicação do método da regressão linear simples para a construção da curva de


calibração, trabalha-se com duas variáveis: uma variável independente (eixo x) que representa
a massa da substância, e uma variável dependente (eixo y) que representa a intensidade da
propriedade medida. Supondo-se que a variável independente x se conheça sem erro, todo o
erro estará associado a medida da variável dependente y que é calculada através da equação
da reta:
y = a + bx

Para cada valor de “x”, calcula-se o valor de “y” correspondente. É no valor de “y”
calculado que estão expressos os erros. Os valores dos coeficientes angular “a”, que é a
inclinação da reta, e linear “b”, que é a interseção da reta com o eixo “y”, são calculados
aplicando as equações:

1,2

1,0
Propriedade Medida

0,8

0,6

0,4

0,2

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0


Concentração

Figura 2.2 – Ilustração de uma curva de calibração

a=
(∑ y ∑ x ) − (∑ y∑ yx )
2

b=
n∑ xy − ∑ x∑ y
n∑ y − (∑ y )
2 2
n∑ y 2 − (∑ y )
2

onde “n” é o número de pontos da reta.

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O valor numérico de “y” nestas equações é a média aritmética da propriedade medida a


cada concentração de padrão. Para cada ponto (cada concentração de padrão), deverão ser
realizadas “m” medidas ( no mínimo três) repetindo a cada medida todo o desenvolvimento da
metodologia desde o princípio, para que se possa fazer a análise estatística e definir o desvio
padrão. Os valores de “y” assim calculados, devem representar os erros e os desvios do
método analítico os quais deverão ser tratados por métodos estatísticos com parâmetros pré-
estabelecidos, o que é fundamental para a optimização do método.
Três parâmetros fundamentais que devem ser descritos são o desvio padrão “σ”, o
coeficiente de correlação linear “r” e o índice de confidência, cujos valores deverão serem bem
estabelecidos:

⎜ (∑ xi )2 ⎞

b ∑ xi −
∑ (x − y )2 2 2
⎜ ⎟
σ = r= ⎝
n

n −1 (∑ yi )2
∑ yi − n
2

O coeficiente de correlação linear “r” diz o quanto uma reta é linear. Uma reta perfeita,
onde todos os pontos calculados ficariam exatamente encima da reta, apresentaria um
coeficiente de correlação linear r=1, ou seja, 100% reta. Dependendo da precisão do método e
da faixa linear dinâmica, pode-se trabalhar com coeficientes de correlação inferior a um, até
0,95 ( 95%)

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CAPÍTULO - II

MÉTODOS CLÁSSICOS DE ANÁLISE ORGÂNICA

IDENTIFICAÇÃO SISTEMÁTICA DE COMPOSTOS ORGÂNICOS

1- EXAME PRELIMINAR

Com uma simples inspeção visual cuidadosa e com consumo mínimo de material e
tempo podemos obter informações valiosas sobre a composição da amostra em análise.

1.1- Estado físico: A verificação do estado físico da amostra a ser analisada, a


temperatura ambiente, é a primeira observação a ser anotada. Orienta na determinação das
constantes físicas, nos processos de separação e purificação a serem utilizados e os valores
dos pontos de ebulição ou fusão podem dar uma indicação do tamanho da cadeia carbônica.
Assim, por exemplo uma amostra no estado sólido pode ser purificada utilizando técnicas de
recristalização ou sublimação. Por outro lado, uma amostra líquida os procedimentos de
purificação poderão serem direcionados às técnicas de destilação .

1.2 – Homogeneidade: É uma importante observação que pode dar informação


quanto a pureza da amostra. Por ex. a observação de duas fases para líquidos imissíveis,
soluções coloidais, supensão e a observação das diferentes formas cristalinas nos sólidos.

1.3- Cor: Uma parcela significativa dos compostos orgânicos é incolor frente a luz
natural. A observação da cor fornece informações importantes tais como a presença de grupos
cromóforos que podem conferir colorações características à substância, presença de
determinados metais, oxidação, impurezas etc. A observação de mudanças na coloração da
amostra, se expontânea podem indicar degradação da substância mas quando induzidas por
reativos pode fornecer informações estruturais.

1.3- Odor: A verificação das propriedades organolépticas pode dar pistas a respeito da
composição da amostra através de Odores e Sabores característicos e familiares. Desde que
muitos compostos orgânicos não apresentam cheiro, esta informação poderá ser de grande
valia na identificação da presença de certos compostos conhecidos pelos seus odores
característicos, sobretudo aqueles componentes de óleos essencias tais como eugenol (cravo),
limoneno (limão e laranja), mentol (hiortelã), eucalipetol (eucalipto), pineno (pinho),
cinamaldeído (canela) entre outros. Devido a grande sensibilidade do olfato, estes compostos
podem ser identificados mesmo quando presentes em baixíssimas concentrações. A presença
de odor é também um indicativo da presença de estruturas voláteis e de baixo PM.

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1.4- Teste de Ignição: Este é um dos mais rudimentares experimentos utilizados na


identificação de espécies químicas. O teste de ignição é uma ferramenta muito útil que permite
uma rápida e econômica análise preliminar. Quando um material desconhecido for colocado na
chama de um bico de Bunsen, pode-se fazer as seguintes observações:
Não Queima, significa que o material é inorgânico
Queima, significa que o material é orgânico
Se o resultado da queima fornecer uma chama fuliginosa, significa que a combustão é
incompleta, característica de compostos orgânicos insaturados.
Se após a combustão permanecer algum resíduo, é um indicativo da presença de
metais. Neste caso pode-se fazer o teste da chama com o resíduo, como na análise de
compostos inorgânicos. Alguns metais quando submetidos a uma chama redutora emitem
radiação na região do visível com comprimentos de onda característicos. Assim pode-se
identificar certos metais como o chumbo (chama azul), cobre (chama verde), lítio (chama
carmim), cálcio (chama vermelho-amarelo), potássio (chama violeta) e sódio (chama amarela).

2 - DETERMINACÃO DA PUREZA

A determinação da pureza de uma determinada espécie química deve obedecer alguns


critérios a saber:
- Uma única mancha, quando analisado por cromatografia em camada fina (CCF) e eluída
com dois ou mais sistemas de solventes diferentes ou quando a mesma for desenvolvida
no modo bidimensional (Fig. 2.1- a, b).
- Um único sinal, como resultado da análise por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) ou cromatografia gasosa de alta resolução (CGAR) usando duas ou mais colunas
de polaridades diferentes (Fig. 2.1- c, d).

Figura 2.1 - a) composto puro por CCF, b) amostra impura, c) composto puro por CGAR ou
CLAE e d) amostra impura.

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- Apresentar ponto de fusão (PF) e ou ponto de ebulição (PE) constantes (Figura 2.2). Neste
caso um bom critério de pureza aceita uma variação de ± 0,50C

3 - PROPRIEDADES FÍSICAS

Toda substância após sua purificação deverá ter suas constantes físicas determinadas
e comparadas com os dados da literatura, em alguns casos estes parâmetros por si só podem
permitir a identificação de substâncias bem conhecidas.

3.1 - Ponto de Fusão:

O ponto de fusão pode ser definido como sendo a temperatura na qual a fase sólida e a
fase líquida de uma substância estão em equilíbrio. A maioria dos compostos orgânicos fundem
abaixo de 300 0C. Substâncias como açúcares e proteinas são degradadas a temperaturas
elevadas antes mesmo de atingir seu ponto de fusão. O ponto de fusão de uma espécie
química depende da energia da rede cristalina a qual está diretamente relacionada a estrutura
molecular. Assim, o valor do ponto de fusão permite de certo modo uma avaliação das forças
de interação intermoleculares e intramoleculares , destacando as pontes de hidrogênio,
interações dipolo-dipolo e o tamanho da cadeia carbônica.
No processo de fusão, as moléculas ordenadamente agrupadas na rede cristalina,
passam a se movimentar livremente deslizando umas sobre as outras. A temperatura em que
isto ocorre depende da intensidade das forças de atração na rede cristalina o que permite
inferir dados com respeito ao tamanho e arranjo estrutural das moléculas.

TEMPERATURA

250

200

150
FUSÃO

100

50

0 15 20 25 30

TEMPO

Figura 2.2 - Comportamento da fusão de uma substância pura e de uma substância impura.

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3.2 - Ponto de Ebulição: (correlação com estrutura)

O ponto de ebulição pode ser definido como sendo a temperatura na qual as fases
líquida e de vapor de uma substância se encontram em equilíbrio a uma determinada pressão.
Também podemos definir como a temperatura na qual a pressão de vapor de um líquido é igual
a pressão que está sendo exercida na sua superfície. O valor do ponto de ebulição pode ser
considerado uma medida imprecisa das forças de interação intermolecular (as forças que
mantém as moléculas unidas). Estas forças de atração são eletrostáticas e variam com a
estrutura das moléculas e vão desde as fracas interações das forças de Van der Waals
passando pelas interações dipolo-dipolo de várias intensidades até as fortes linterações por
ligações de hidrogênio. Assim, algumas informações estruturais como tamanho, disposição
espacial, flexibilidade, polaridade e natureza química das moléculas podem ser estimadas a
partir dos valores destas propriedades físicas.
O estudo do ponto de ebulição, assim como do ponto de fusão, permite a obtenção de
importantes correlações estruturais como ilustrado no gráfico da figura 2.3 que correlaciona os
pontos de ebulição de séries homólogas. Observa-se nestas correlações que se pode predizer
estruturas e propriedades, por ex. o aumento do ponto de ebulição com o aumento da cadeia
carbônica numa série homóloga; ou o aumento do ponto de ebulição com o aumento da
polaridade numa série heteróloga. Assim podemos destacar a importância da polaridade e da
natureza química dos grupos funcionais nas forças de atração molecular.

P.E.
200

150

100

50

0 HIDROC.
ÉTER
ALDEIDO
-50 CETONA
ÁLCOOL
-100

20 40 60 80 100 120 140


P.M.

Figura 2.3 - Correlação estrutura-ponto de ebulição para séries homólogas de hidrocarbonetos,


éteres, aldeídos, cetonas e álcoois.

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3.3 - Ponto de Congelamento

É a temperatura na qual uma substância líquida passa para o estado sólido. Na prática,
quando um composto orgânico é sólido a pressão e temperatura ambiente, determina-se o
ponto de fusão. Por outro lado, quando a substância for líquida, pode-se determinar o ponto de
congelamento, que é o equivalente ao ponto de fusão. Porém, como o ponto de congelamento
de um líquido é muito difícil medir com precisão, é mais útil determinar o ponto de ebulição.

3.4 - Densidade Específica

A densidade específica é uma outra constante física importante na caracterização dos


compostos orgânicos e é um parâmetro necessário para o cálculo da fração molar. Pode ser
determinada diretamente comparando a massa da amostra com a massa de um igual volume
de água, usando um pequeno aparelho chamado de picnômetro. A dendidade da água a 4 ºC é
um.

mA
DA = × DH 2 O
mH 2 O

3.5 - Índice de Refração

O índice de refração é definido como sendo a razão entre a velocidade da luz no ar e


no composto. A determinação do índice de refração é feita com auxílio de um equipamento
T
denominado refratômetro, e é expresso como nD

T = temperatura na qual a medida é realizada, geralmente 20 ºC.


D = Comprimento de onda da luz empregada, linha D do sódio.
A refração molar Mr é calculada através da equação:

Mr =
(
M n2 − 1 )
(
d n2 + 2 )

M = massa molecular da substância


d = densidade
n = índice de refração

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3.6 - Rotação ótica

Os compostos orgânicos que tem assimetria molecular por possuírem um ou mais


carbonos quirais apresentam atividade ótica. Esta propriedade é a medida do desvio do plano
da luz polarizada realizada em um polarímetro que usa um prisma de Nicol como polarizador.

Esta propriedade é expressa como rotação ótica específica [α ]TD

[α ]TD = α ⋅ 100
l ⋅c

α = rotação em graus observada no polarímetro


l = caminho ótico em dm
c = concnetração em g/100 ml
T = temperatura na qual a medida é realizada
D = comprimento de onda da linha D do sódio

4 - DETERMINAÇÃO DA MASSA MOLECULAR

4.1 - Aplicando a Lei de Raoult

A determinação da Massa Molecular pode ser abordada aplicando alguns conceitos


fundamentais da fisico-química. Isto levou ao desenvolvimento de vários métodos clássicos que
sempre deixou um certo grau de incerteza na determinação da Massa Molecular,
principalmente para substâncias desconhecidas. Estes métodos estão fundamentados no
princípio de que a presença de um soluto num determinado solvente, proporciona alterações
em suas propriedades coligativas as quais estão diretamente relacionadas ao peso molecular
do soluto. Esses métodos são na verdade uma aplicação da lei de Raoult (figura 2.4) que trata
das trocas na pressão de vapor sob adição de um soluto não volátil a um solvente puro: “A
pressão parcial de cada componente em uma solução ideal é dependente da pressão de vapor
dos componentes individuais e da fração molar dos mesmos componentes”

Figura 2.4 - Variação da pressão de vapor total de uma


mistura binária com a fração molar do composto 1
quando a Lei de Raoult é obedecida.

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a) Determinação da Massa Molecular pela Diminuição do Ponto de Congelamento:


A diminuição do ponto de congelamento está relacionada a massa molecular através
da equação:

K ⋅ m1 ⋅ 100
Mol =
ΛT ⋅ m0

Mol = Massa Molecular


K = Constante de diminuição do ponto de fusão molecular correspondente ao solvente
empregado. Estes valores São encontrados em tabelas.
m1 = Massa em gramas do soluto
m0 = Massa em gramas do solvente
ΔT = Diminuição do ponto de congelamento

b) Determinação da Massa Molecular pela Elevação do Ponto de Ebulição:


A elevação do ponto de ebulição está relacionada a massa molecular através da
equação:

K B ⋅ m1 ⋅ 100
Mol =
ΛT ⋅ m0

Mol = Massa Molecular


KB = Constante de elevação do ponto de ebulição molecular.
m1 = Massa em gramas do soluto
m0 = Massa em gramas do solvente
ΔT = Elevação do ponto de ebulição

4.2- Espetrometria de Massas

Com o advento da Espectrometria de Massas (Cap. .....) e sua grande evolução


culminando na construção de Espectrometos de Massas de Alta Resolução, tem sido
possível a determinação da Massa Molecular com alto grau de precisão, levando ao
abandono dos métodos clássicos para este propósito.

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5 - DETERMINAÇÃO DA FÓRMULA MOLECULAR

A fórmula molecular de um composto orgânico pode ser inferida com bastante

segurança através dos dados espectroscopicos de 1H e 13C RNM (Cap......) e Massas. Do

ponto de vista da Análise Orgânica Clássica, a determinação da fórmula molecular requer o

conhecimento da massa molecular e da análise qualitativa e quantitativa de cada elemento

químico que compõe a substância. Atualmente a análise elementar é realizada em um

equipamento denominado CHN que determina simultaneamente os teores de Carbono,

Hidrogênio e Nitrogênio em uma molécula orgânica. No passado, a análise elementar seguia

um roteiro sistemático como mostrado na sequência:

5.1- Análise Elementar Qualitativa

Neste tipo de análise determina-se a natureza química dos elementos que compõem
a amostra. A amostra ao ser submetida a fusão com sódio produzirá deternadas substâncias
inorgânicas simples que são caracterizadas através de reações químicas específicas que
resultam na formação de complexos coloridos e ou precipitados característicos do elemento.

A - Fusão com Sódio

Nesta técnica, 10 mg da amostras é adicionada a 30 mg de sódio metálico em um


cadinho de platina. A mistura é aquecida gentilmente para eliminar voláteis e então aquecida
até obter a fusão. Após esfriar, adicionar 2 ml de metanol e 2 ml de água, levar à fervura e
após diluir com água e filtrar. O filtrado é então analisado para NaX, NaCN, Na2S, NaCNS .
A reações envolvidas neste processo são:

C, H, O, N, S, X + Na0 + calor ⇒ NaX, NaCN, Na2S, NaCNS

-Teste p/ Haletos: NaX + AgNO3 → AgX (pto)


-Teste p/ Nitrogênio: NaCN + Fe (NH4)2 (SO4)2 → Complexo Ciano
-Teste para Enxofre: Na2S + PbOAc → PbS (pto)

B - Fusão com Nitrato de Amônia:

A amostra é submetida a fusão com nitrato de amonia e o resíduo obtido é submetido


a Marcha Analítica Inorgânica Qualitativa

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5.2 - Análise Elementar Quantitativa - CHN

O composto orgânico é submetido a uma combustão completa resultando na


degradação da amostra a gás carbônico, água e nitrogênio quando for o caso.

AMOSTRA + COMBUSTÃO → CO2 + H2O + N2

Os gases obtidos desta combustão completa são seletiva e quantitativamente adsorvidos no


substrato apropriado e sua massa é determinada:

-H2O: Adsorsão em Cloreto de Cálcio


-CO2: Adsorsão em NaOH/Asbesto
-N : Determinado por volume
-O : Determinado por diferença

Cálculo da fórmula mínima e molecular


Exemplo de como determinar a formula molecular com base nos dados das análises qualitativa
e quantitativa:
Considerando que o resultado da análise qualitativa e quantitativa seja o seguinte:
C = 67.39%; H = 7.92%; N = 15.72% e O = 8,88%
Dividindo a porcentagem de cada elemento pela sua massa atômica e o resultado dividido pelo
menor valor, teremos o número de cada elemento na fórmula molecular. A porcentagem de
oxigênio é calculada por diferença do que falta para o 100%. Isto resulta na fórmula molecular
C10H14N 2O
C = 67.39% ÷ 12.01 = 5.61 ÷ 0.56 = 10
H = 7.92% ÷ 1.01 = 7.84 ÷ 0.56 = 14
N = 15.72% ÷ 14.01 = 1.12 ÷ 0.56 = 2
O = 8.88% ÷ 16.00 = 0.56 ÷ 0.56 = 1

Cálculo do N0 de Insaturações (I):

I= [∑i ni (vi-2) + 2]/2 ; ni = n0 átomos i, vi = valência do átomo i

O conhecimento do número de insaturações de uma determinada substância orgânica


é uma informação bastante valiosa na determinação estrutural. As insaturações, ou deficiências
de hidrogênio, refere-se a ligações múltiplas e a estruturas cíclicas:
Insaturações: -ligações duplas (C=C, C=O, C=N, N=O)
-ciclos (cada ciclo vale uma insaturação)
-anel aromático (cada anel vale quatro insaturações)

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6 - TESTES DE SOLUBILIDADE

As diferenças na solubilidade dos compostos orgânicos entre si, em solventes inertes


ou reativos de conformidade com seu caráter ácido, básico ou neutro e suas características
polares, permitem a construção de esquemas de solubilidade para a classificação dos
Compostos Orgânicos. Estes ensaios orientam a determinação estrutural no que se refere a
grupos funcionais, polaridade e tamanho da cadeia carbônica. Além disso o conhecimento da
solubilidade dos compostos orgânicos e a sua inércia ou reatividade perante os solventes se
faz necessário para o desenvolvimento dos processos químicos e separação dos compostos.
No esquema apresentado nas figuras 2.5 e 2.6 convenciona-se um limite mínimo de
solubilidade: o soluto deverá ser no mínimo 3% solúvel no solvente do esquema, colocando a
amostra no respectivo grupo de solubilidade.
Na aplicação da classificação por solubilidade devemos ter em mente que muitos
compostos não cairão rigorosamente em um grupo, mas em uma posição intermediária.
Conforme os esquemas das figuras 2.5 e 2.6, através de testes de solubilidade conduzido de
acordo com o esquema, podemos classificar os compostos orgânicos dentro das referidas
classes, o que é de grande valia na orientação das etapas seguintes a serem seguidas na
marcha sistemática de análise orgânica.
Utilizando o fato de que a solubilidade dos compostos orgânicos permite agrupá-los
com propriedades similares e tamanho de cadeia carbônica, poderemos optimizar métodos de
separação por extração. Um exemplo disto é a metodologia de extração de princípios
alcalóides de plantas por extração ácido-base, usando a propriedade básica dos alcalóides

ESQUEMA DE SOLUBILIDADE PARA A CLASSIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS


ORGÂNICOS
Inicialmente a amostra a ser analisada é testada quanto sua solubilidade em água. Se
a amostra for solúvel em água, seguir o esquema da figura 2.5, se a amostra se mostrar
insolúvel em água, seguir o esquema da figura 2.6.

Figura 2.5 - Esquema para os testes de solubilidade em amostras solúveis em água

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Figura 2.5 - Esquema para os testes de solubilidade em amostras insolúveis em água

Classes de conpostos representativas dos grupos de solubilidade

Grupo 1: Ácidos e Bases de baixo peso molecular com até cinco átomos de carbono e
compostos neutros de baixa polaridade.
Grupo 2: Sais orgânicos, áçúcares, amino ácidos e outros compostos neutros polifuncionais de
alta polaridade.
Grupo 3 : Ácidos Orgânicos Fortes com mais de seis carbonos.
Grupo 4: Ácidos orgânicos fracos com mais de seis carbonos.
Grupo 5: Compostos básicos com mais de ouito carbonos.
Grupo 6: Hidrocarbonetos, Haletos de alquila e aromáticos
Grupo 7: Álcoois, aldeídos, ctonas, ésteres com mais de cinco carbonos.
Grupo 8: Alcenos, alcinos, étres com mais de seis carbonos

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7 - TESTES QUÍMICOS PARA GRUPOS FUNCIONAIS

Os grupos funcionais de uma molécula podem ser determinados através de reações

químicas específicas. Isto envolve o conhecimento da reatividade das funções orgânicas obtida

nas disciplinas Química Orgânica A e B. A seguir são esquematisados alguns exemplos de

reações úteis na identificação dos grupos funcionais:

Aminas -Benzenosulfonil cloreto - aminas prim., sec. e terc


-Ácido Nitroso - corantes azo
-Cloretos de ácido

Haletos -Solução etanólica de nitrato de prata


-Iodeto de sódio em acetona

Aldeídos e cetonas -Phenilhidrazina e 2,4-dinitrofenilhidrazina


-Cloridrato de hidroxilamina
-Bissulfito de sódio
-Teste do Iodofórmio - metilcetonas

Aldeídos -Reação de Benedict - Cobre


-Reação de Tollens - Espelho de Prata
-Fuchsina

Fenóis -Água de Bromo


-Cloreto Férrico
-Cloreto de ácido

Insaturação -Permanganato de Potássio


-Bromo em tetracloreto de carbono

Nitro compostos -Zinco em cloreto de amônia


-Hidroxido ferroso
-Hidróxido de sódio

Esteres -Saponificação
-Cloridrato de hidroxilamina

Álcoois -Reação de Lucas - ácido clorídrico/cloreto de zinco

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-Nitrato cérico
-Ácido periódico
Hidrocarbonetos Aromáticos -Sulfonação - ácido sulfúrico fumegante
-Azo - cloreto de alumínio e azoxibenzeno

Eteres -Ácido clorídrico


-Água de bromo

8- PREPARO DE DERIVADOS

A preparação de derivados é uma ferramenta de grande utilidade na determinação


estrutural, confirmação de determinadas estruturas e o estabelecimento da reatividade química
da substância. Servem também como pré-tratamento de amostras para análises
cromatográficas e doseamento de princípios ativos.
O desenvolvimento da química medicianl, um dos mais importantes e atuais temas da
química farmacêutica, tem utilizado a preparação de derivados para a obtenção de
correlações quantitativas de estrutura atividade (QSAR) que tem se tornado uma
poderosíssima ferramenta na obtenção de novos medicamentos, bem como no aprimoramento
da medicina alternativa, como o estudo de plantas medicinais. Além disso, os estudos de
QSAR podem contribuir decisivamente na elucidação dos mecanismos de ação de drogas,
permitindo também o planejamento de síntese de drogas específicas.
Algumas das reações mais utilizadas na preparação de derivados são: Oxidação,
Redução, Metilação, Acetilação, Silanização.

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CAPÍTULO - III

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO

1 – CRISTALIZAÇÃO

A cristalização é um dos métodos mais versáteis e eficientes para a purificação de


substâncias sólidas quando o solvente de cristalização for devidamente selecionado.
Em linhas gerais a substância sólida a ser purificada é dissolvida sob aquecimento num
solvente no qual ela apresenta pouca solubilidade. A solução ainda quente é filtrada a fim de
remover impurezas sólidas ou em suspensão. Com o lento resfriamento da solução, a
substância vai se solidificando, de tal forma que suas moléculas são organizadamente
depositadas numa rede cristalina. Os cristais formados são removidos por filtração do
solvente de cristalização. Este sobrenadante, que contém as impurezas solúveis, numa
linguagem coloquial é denominado de "liquor mãe". Os cristais são lavados em sua superfície
com uma nova porção de solvente ou, se necessário, são redissolvidos para uma nova
recristalização.
Em regra, quanto mais lenta a cristalização mais perfeitos serão os cristais formados e
consequentemente mais puros. Não raro os cristais podem trazer impurezas, necessitando de
novas recristalizações até se atingir o grau de pureza desejado. Além das impurezas, o “liquor
mãe” poderá conter uma maior ou menor quantidade da substância de interesse, conforme for
o seu produto de solubilidade naquele solvente. Assim, para aumentar o rendimento procede-
se a evaporação parcial do solvente de cristalização e espera-se novas cristalizações da
substância.
Nos trabalhos em escala semi-micro pode-se fazer uso de pequenos frascos para
cristalização como por ex. em pequenos tubos de ensaio ou “vidrinhos de penicilina”. Após
ocorrer a formação adequada de cristais, o “liquor mãe” resultante pode ser removido com
uma pequena seringa ou pipeta Pasteur contendo um pequeno tufo de algodão na ponta para
fazer o papel de filtro. É importante evitar que o solvente de cristalização se evapore
completamente pois isto contaminaria os cristais formados.
Uma outra técnica é o uso de mistura de solventes. Neste caso normalmente trabalha-
se com um solvente apolar no qual o soluto é insolúvel. Um solvente mais polar é então
adicionado, cuidadosamente sob aquecimento até a completa solubilização da substância.
Com o resfriamento e a mudança na composição percentual da mistura de solventes, tem-se a
cristalização do soluto.
Finalmente devemos lembrar que o sucesso de uma boa cristalização está na
paciência de esperar o fenômeno ocorrer lenta e naturalmente, podendo levar horas, dias ou
até semanas.

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2 – DESTILAÇÃO

A destilação é o processo mais freqüente e importante de separação e purificação de


substâncias líquidas. O método está baseado no fenômeno de mudança de estado físico
líquido–vapor–líquido (evaporação seguida de condensação) de acordo com as leis da física
que regem o equilíbrio entre as fases líquida e de vapor.

Quando um líquido é colocado em um recipiente fechado e todo o ar for removido, ele


se evapora até que seu vapor atinja uma determinada pressão que depende somente da
temperatura. Esta pressão que é exercida pelo vapor em equilíbrio com o líquido é chamada
pressão de vapor a temperatura T, cujo valor tem uma relação direta com a temperatura.

Considerando um líquido em recipiente aberto, aumentando-se a temperatura, sua


pressão de vapor aumenta e quando esta atinge 760 mmHg (pressão atmosférica –
experimento a nível do mar) o líquido entra em ebulição (ponto de ebulição). Se o vapor for
conduzido a um condensador, este retornará ao estado líquido com o resfriamento.

Existem várias técnicas de destilação as quais deverão ser selecionadas para cada tipo
de problema em particular e de acordo com os objetivos a serem alcançados.

2.1 - DESTILAÇÃO SIMPLES e DESTILAÇÃO A VÁCUO

Na destilação simples o líquido a ser destilado é colocado num balão de destilação o qual
é aquecido até atingir a temperatura de ebulição do líquido que é marcada no termômetro. O
vapor ao passar pelo condensador (normalmente refrigerado pela passagem de água corrente)
condensa e o líquido é recolhido num segundo balão imerso em banho de gelo.

Este processo pode separar eficientemente um líquido volátil de uma ou mais substâncias
não voláteis, como solutos sólidos ou líquidos não voláteis. Porém falha na separação de dois
ou mais líquidos voláteis mesmo que seus pontos de ebulição sejam bem diferentes. Isto
porque o líquido menos volátil sempre terá uma determinada pressão de vapor e estará
presente no vapor do líquido mais volátil sendo arrastado por ele, resultando na contaminação
do composto volátil.
Nos casos de líquidos com alto ponto de ebulição, cuja elevada temperatura poderia
degradar as substâncias ou mesmo ser difícil atingir o equilíbrio para a destilação, usa-se o
artifício de aumentar a pressão de vapor pela diminuição da pressão exercida na superfície do
líquido em ebulição, através de uma destilação a vácuo, fig 3.1. Fazendo-se pressão negativa
(menor que 1 atm. = 760 mmHg) diminui-se a temperatura de ebulição dos líquidos. A pressão
negativa aplicada pode ser controlada através de um manômetro apropriado.
Um outro método muito útil na remoção de solventes de substâncias sólidas a
temperaturas relativamente baixas e com bastante rapidez é a evaporação rotatória. Este
método faz uso de um equipamento denominado evaporador rotatório ou rotavapor, no qual o

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solvente a ser removido é colocado num balão imerso em Banho Maria e acoplado a um eixo
que gira a uma velocidade controlada e a um sistema de vácuo. A evaporação do solvente é
facilitada por dois fatores: diminuição da pressão de vapor e aumento da superfície de
evaporação. Desta forma é possível destilar água rapidamente a 40 0C por exemplo.

Figura 3.1 - Esquema de um sistema para destilação simples a vácuo.

2.2 - DESTILAÇÃO POR ARRASTE DE VAPOR

Na destilação por arraste de vapor, substâncias líquidas ou sólidos voláteis são


arrastadas junto com o vapor de água super aquecido que se faz passar através da matriz que
contém os voláteis. A figura 3.2 ilustra o equipamento básico constituído de um gerador de
vapor com um tubo equalizador de pressão e válvula de segurança. No frasco de extração,
que deve ficar sob aquecimento, é colocada a matriz contendo a substância volátil. O vapor de
água superaquecido ao passar pelo frasco extrator arrasta as substâncias voláteis e ambos
são condensados ao passar pelo condensador e são finalmente recolhidos no frasco coletor
imerso em banho de gelo. A substância volátil, um sólido ou óleo imissível com a água, é
separado por filtração ou por meio de um funil de separação.

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A destilação por arraste de vapor baseia-se no princípio de que dois líquidos


completamente imissíveis entre si, exercem sua própria pressão de vapor independentemente
um do outro. Deste modo a pressão total de vapor é a resultante da soma aritmética da
pressão de vapor de cada componente. Sabendo-se a pressão de vapor do material volátil a
ser destilado e aplicando a lei de Raout pode-se determinar a composição do vapor de água e
assim o quanto de material está sendo recuperado.
A técnica de destilação por arraste de vapor é particularmente útil quando a substância
a ser destilada apresenta alta pressão de vapor e se decompõe próximo de seu ponto de
ebulição. Nestse casos destilação por arraste de vapor permite a destilação a temperaturas
aquém do ponto de ebulição.

Figura 3.2 - Esquema de um sistema de destilação por arraste de vapor

A figura 3.3 mostra um esquema alternativo para a destilação por arraste de vapor do
tipo clevenger. O próprio frasco extrator gera o vapor d'água que arrasta os constituintes
voláteis até o condensador e o condensado é recolhido no frasco de separação.

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A destilação por arraste de vapor substitui com vantagem a destilação a vácuo


sobretudo quando se tem pequenas quantidades de material volátil em misturas com grande
quantidade de material sólido. A utilização desta metodologia é bastante diversificada nos
laboratórios de Química Orgânica e na indústria. Alguns exemplos podem ser mencionados
como na purificação de produtos de síntese que estão impurificados com grande quantidade
de subprodutos resinosos. É freqüentemente utilizado no isolamento de produtos naturais, na
obtenção de óleos essenciais que podem ser extraídos de ervas e plantas aromáticas (ex.
casca de laranja [limoneno], cravo da índia [eugenol], folhas de eucalipto [eucaliptol], capim
limão [citral], hortelã, essência de rosas, jasmim, e outras matérias primas na obtenção de
perfumes e aromas).

condensador

fase oleosa

fase aquosa

frasco extrator
e gerador de vapor

banho de aquecimento

Figura 3.3 - Esquema alternativo de um aparelho para destilação por arraste de vapor.

2.3 - DESTILAÇÃO FRACIONADA

A destilação fracionada, figura 3.4, é uma excelente técnica de purificação de líquidos


voláteis os quais são separados em função de seus pontos de ebulição. Neste tipo de
destilação a separação dos líquidos ocorre numa coluna de fracionamento que funciona como
se fosse várias destilações simples sucessivas. A cada secção da coluna de fracionamento,
figura 3.5, se estabelece um equilíbrio vapor-líquido de tal modo que a medida que se avança

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na coluna, diminui a concentração do líquido menos volátil contaminando o vapor do líquido


mais volátil. Desta forma, quando o vapor atinge o topo da coluna de fracionamento, os
vapores do líquido mais volátil estarão livres das moléculas do líquido menos volátil e portanto
puro. Quando o líquido menos volátil for totalmente destilado, a temperatura do sistema
aumenta até atingir o ponto de ebulição do líquido menos volátil que da mesma forma será
purificado ao longo da coluna de fracionamento. A técnica permite a separação de vários
líquidos de pontos de ebulição bastante próximos, desde que a coluna de fracionamento seja
apropriadamente dimensionada.
O tratamento teórico da destilação fracionada requer um conhecimento da relação
entre os pontos de ebulição ou pressões de vapor das misturas das substâncias e sua
composição. Se estas curvas forem conhecidas será possível prever se a separação será difícil
ou não ou mesmo se será possível.
A separação de misturas de líquidos por destilação fracionada pode ser melhor
explicada através da lei de Raout:

pA = pA ' xA
“a pressão de vapor de um componente a uma dada temperatura é igual a pressão de vapor da
substância pura multiplicada pela sua fração molar na solução”
Considerando uma mistura formando uma solução ideal e aplicando a lei de Raout para
cada componente:

pA = pA ' xA pB = pB ' xB

a pressão total será a soma aritmética das pressões parciais pA e pB, assim a composição da
fase de vapor será dada por:

pA pB
x Av = xBv =
p A + pB pB + p A

Tomando como exemplo dois componentes A e B cujas pressão de vapor são 60 e 100
mmHg e a fração molar 0,25 e 0,75 respectivamente, a composição molar da fase de vapor
será xA = 0,167 e xB = 0.833. Assim esta solução está em equilíbrio com um vapor contendo
16,7 moles por cento do componente A e 83,3 moles por cento do componente B. O
componente B com pressão de vapor maior está relativamente mais concentrado na fase de
vapor que na fase líquida.

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Figura 3.4 - Esquema de um aparelho de destilação fracionada.

Figura 3.5 - Diferentes tipos de coluna de fracionamento

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Considerando que ao longo de uma coluna de fracionamento temos “n” equilíbrios fase
líquida-fase de vapor, e que a cada equilíbrio superior temos um aumento da fração molar do
componente B em relação ao componente A na fase de vapor, a partir do equilíbrio “ni” a fase
de vapor será composta de 100% do componente B. Desta forma poderemos dimensionar
colunas de fracionamento para problemas específicos de separação.

2.4 – MICRODESTILAÇÃO

Em alguns casos a quantidade de material a separar é muito pequena para se colocar


num aparelho de destilação. Para isto pode-se usar técnicas de microdestilação bastante
simples, coforme ilustrado na figura 3.6.

Figura 3.6 - Esquema para microdestilação. (a) um tubo de vidro é dobrado formando dois “U”.
A amostra é colocada na parte da esquerda e esta extremidade é então selada. A primeira
dobra em “U” (que contém a amostra) é aquecida e os vapores serão condensados na
segunda dobra em “U” que é colocada num banho de gelo. (b) a amostra é colocada no bulbo
inferior e então aquecida. Os vapores se condensam na parede do tubo refrigerada e o líquido
condensado pode ser recolhido com uma seringa ou capilar nos bulbos laterais.

3 – SUBLIMAÇÃO

A sublimação é uma propriedade que alguns sólidos tem de passar diretamente do


estado sólido para o estado de vapor, como por ex. a naftalina e a cânfora. Estes compostos
podem ser eficientemente purificados por técnicas de sublimação, figura 3.7, que consiste em
aquecer o sólido pulverizado aquém de seu ponto de fusão. Os vapores oriundos da
sublimação voltam a solidificar no condensador interno tipo dedo frio de onde é posteriormente
recuperado. O aparelho de sublimação pode ser conectado a uma linha de vácuo para diminuir
a pressão de vapor do sólido.

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Os processos de destilação e sublimação estão intimamente relacionados. Com o


aquecimento de substâncias termicamente estáveis ocorre a vaporização que poderá ocorrer
de três maneira distintas:

a) se a substância for líquida nas condições ordinárias, ela entra em ebulição a uma
temperatura definida que depende da pressão,
b) se a substância for sólida nas condições ordinárias, a medida em que for aquecida,
primeiramente sofrerá o processo de fusão a uma temperatura definida e finalmente entra
em ebulição como um líquido ordinário,
c) um sólido pode volatilizar antes de entrar em processo de fusão, a uma temperatura
definida que depende da pressão.

saída de água entrada de água

condensador
vácuo
tipo dedo frio

composto sublimado

material a ser sublimado


banho maria

Figura 3.7 - Esquema de um aparelho de sublimação

Por outro lado, a condensação do vapor de uma substância estável poderá ocorrer de
três maneiras diferentes:
a) o vapor condensa voltando a fase líquida,
b) o vapor é liqüefeito e em seguido se solidifica,
c) o vapor condensa diretamente para o estado sólido sem a formação intermediária de um
líquido.
A compreensão do fenômeno da sublimação pode ser alcançada com o estudo dos
equilíbrios sólido-líquido-vapor mostrado na figura 3.8. Como se pode observar, no diagrama

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representando o equilíbrio entre as fases sólida-líquida-gasosa quando se relaciona


temperatura e pressão, a linha “TW” representa a curva de pressão de vapor do líquido para o
sistema líquido vapor, a linha “TV” representa o processo de fusão (observe que este processo
praticamente independe da pressão) e a linha ST representa a curva de pressão de vapor do
sólido (condições de temperatura e pressão em que sólido e vapor estão em equilíbrio). O
encontro das três linhas é chamado de ponto tríplice T.

O fenômeno da sublimação ocorre quando o vapor é submetido a uma pressão abaixo


do ponto tríplice e resfriado suficientemente para atingir a linha ST. Para que um sólido possa
sublimar não se deve deixar a pressão de vapor exceder o ponto tríplice o que pode ser
alcançado aplicando uma pressão negativa e aquecendo aquém do ponto de fusão do sólido.
Por ex. o ponto tríplice da cânfora é determinado pela temperatura 179 0C e 370 mmHg de
pressão.

Figura 3.8 - Diagrama de equilíbrio entre fases sólida, líquida e gasosa.

4- EXTRAÇÃO

A extração é uma das técnicas mais empregadas para a separação de um produto


orgânico de uma mistura de reação ou para isolar uma substância ou grupo delas a partir de
suas fontes naturais utilizando um solvente volátil extrator.

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Os solventes mais empregados nos procedimentos de extração são na sua ordem


crescente de polaridade: Éter de Petróleo, Hexano, Benzeno, Éter Etílico, Cloreto de Metileno,
Clorofórmio, Acetato de Etila, Acetona, n-Butanol, Etanol e Água.
A extração é a transferência de um soluto de uma fase para outra. O soluto é removido
de uma fase pela adição de um solvente imissível no qual o soluto também é solúvel. Em
geral, a regra de que semelhante dissolve semelhante é adequada na escolha do solvente
extrator.
Existem várias técnicas de extração envolvendo duas fases líquidas de solventes
imissíveis, extração líquido-líquido ou de uma fase líquida e outra fase sólida, extração líquido-
sólido. Em cada trabalho devemos selecionar o método mais adequado.

4.1- EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO: K = CA/CB

A extração líquido líquido baseia-se na distribuição de um soluto entre duas fases


líquidas imissíveis. Em Química Orgânica uma das fases normalmente é aquosa e a outra um
solvente orgânico.
Um soluto X, colocado num sistema de dois solventes imissíveis, deverá ser distribuído
nas duas fases (partição) em função de sua solubilidade relativa em cada um dos dois
solventes. O sistema atinge um equilíbrio de transferência de fase dado pela equação:

onde XA e XB são as concentrações do componente X nas fases A e B

Esta expressão segue a Lei de Ação das Massas para o Equilíbrio dado pela equação:

(X A )
Kp = (X B )

onde Kp é a Constante de Equilíbrio de Distribuição ou Constante de


Partição
XA e XB são as concentrações do componente X nas fases A e B

A determinação de Kp de um componente X entre dois líquidos imissíveis fornece


informações adequadas para a escolha do sistema de extração para o isolamento e purificação
de espécies envolvendo estas técnicas. Permite também calcular quantas extrações são

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necessárias e qual o volume de solvente extrator mais adequado para uma completa
recuperação do soluto X.
Considerando a extração de um soluto X a uma concentração de 5 g em 300 ml de
água, cujo Kp = 10 num sistema água/éter, é extraído com 100 ml de éter. Quando o
equilíbrio for atingido:

( X eter )
K p = ( X água ) 10 =
(5 − x 100 )
'

x'
300

operando esta equação teremos:


x’ = 1,5 g (quantidade do soluto X na fase aquosa)
(5 – 1,15) = 3,85 que é a quantidade do soluto X na fase orgânica (éter)
Este resultado mostra que três extrações com porções de 100 ml de éter resulta na
remoção de 98,8 % do soluto X da fase aquosa (permanecendo, portanto 0,06g do soluto X
na fase aquosa).
Se no lugar de três extrações com porções de 100 ml de éter fosse feita uma única
extração com 300 ml de éter, aplicando os cálculos o resultado seria a extração de apenas
91% do soluto X, restando 0,45 g do soluto X na fase aquosa. Estes dados mostram
claramente que um maior número de extrações é mais eficiente que o uso de uma maior
quantidade de solvente extrator numa única extração.
Em alguns casos não é possível ter um coeficiente de partição favorável para a
extração de um determinado componente de tal modo que “n” extrações se faz necessário.
Assim podemos estimar o número de extrações necessárias para que se tenha uma
adequada recuperação do soluto aplicando a seguinte equação:

n
⎛ ⎞
( )
(C A ) = C .⎜⎜ VA ⎟⎟
0

⎝ KV B+VA ⎠
A

(CA) = concentração final do soluto na fase aquosa


(C0A) = concentração original do soluto na fase aquosa
K = coeficiente de distribuição
VA e VB = volume das fases A e B respectivamente
n = número de extrações

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Quando o coeficiente de distribuição Kp for particularmente desfavorável para a


extração de um determinado componente, o mais adequado é o uso de extração líquido-líquido
ou líquido-sólido contínua.
A figura 3.9 ilustra algumas técnicas de extração líquido-líquido. Para trabalhos em
macro-escala, faz-se uso do funil de separação. Em laboratório de Química Orgânica são
disponíveis funis de separação de 2000ml, 1000ml, 500ml, 250 ml, 100ml, 60 ml e 30 ml. Se o
solvente orgânico extrator for mais denso que a água, por ex. numa extração entre clorofórmio-
água, o clorofórmio forma uma fase inferior que é facilmente drenada ao abrir a torneira do funil
de separação. Se o solvente orgânico extrator for menos denso que a água, como por ex. um
sistema constituído de éter-água, o solvente orgânico forma a fase superior. Neste caso, após
a separação das fases, primeiro se remove a fase aquosa inferior para então recuperar o
solvente orgânico extrator. Nas extrações com pequenas quantidades de material, trabalha-se
em micro escala. Neste caso a separação das duas fases pode ser feita na própria pipeta
Pasteur (fig. 3.9 A). Alternativamente, a extração pode ser realizada em um tubo de centrífuga
(fig. 3.9 B) onde a fase inferior é removida com uma pipeta Pasteur

Figura 3.9 - Ilustração de técnicas de extração líquido-líquido. A) uso do funil de


separação e pipeta Pasteur para quantidades muito pequenas, B) uso de tubos de
centrífuga.

A extração líquido-líquido é um excelente método para a separação de ácidos e bases


orgânicas, pois o controle do pH da fase aquosa permite um grande aumento ou grande
diminuição da solubilidade destas espécies químicas em água conforme se apresentam na
forma iônica ou molecular respectivamente.

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Bases orgânicas, como as bases nitrogenadas, quando colocadas em solução aquosa


ácida passa para a forma iônica tornando-se muito solúveis em água. Em pH alcalino,
adquirem a forma molecular e ficam insolúveis em água. Um bom exemplo é a anilina. Em
meio ácido ocorre a formação do do íon anilínium:
+
NH2 NH3

+ H3O + H2O

insolúvel em água solúvel em água

Da mesma forma os ácidos em pH alcalino se apresentam na forma iônica e, portanto,


solúveis em água. A pH ácido, voltam a forma molecular e se tornam insolúveis em água. Por
Ex., O ácido bemzóico que é insolúvel em água, em meio alcalino se torna solúvel:
_
COOH COO
_
+ HO + H2O

insolúvel em água solúvel em água

Considerando uma mistura de ácido bernzóico (ácido mais forte), fenol (ácido mais

fraco), anilina (base) e tolueno (composto neutro), cada componente desta mistura pode ser

facilmente separado na sua forma pura, aplicando o procedimento de extração ácido-base. O

procedimento é ilustrado como segue:

Primeiro se faz uma extração com água acidificada com HCl para remover a anilina na
forma de íon anilinium. A anilina é então recuperada após uma segunda extração com éter
etílico da fase aquosa basificada com hidróxido de sódio.
A fase orgânica contendo Tolueno, Ácido Benzóico e Fenol é primeiramente extraída
com solução aquosa de bicarbonato de sódio (uma base fraca) para a extração do ácido
benzóico (ácido mais forte) na forma de benzoato. Segue uma segunda extração com solução
aquosa de hidróxido de sódio (base forte) para extrair o fenol (ácido mais fraco) na forma de
fenolato, deixando o tolueno puro. O ácido benzóico e o fenol são posteriormente recuperados
após a acidificação das respectivas fases aquosas, extração com éter etílico seguido de
remoção do éter por destilação.
A formação de emulsões ocorre com bastante freqüência sobretudo quando se agita
muito vigorosamente e também conforme for a composição do material que está sendo
extraído. Em geral a emulsão se desfaz com o tempo ou aplicando um movimento circular
suave ao funil de separação. Em sistemas mais fortemente emulsionados, estas podem

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romper-se aplicando-lhe uma agitação vigorosa com um bastão de vidro ou através de uma
centrifugação. Uma outra maneira de romper a emulsão é a saturação da fase aquosa com
NaCl que também traz uma vantagem adicional de diminuir a solubilidade de moléculas
orgânicas em água devido ao efeito salino.

4.2 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-LÍQUIDO CONTÍNUA

Nos casos em que o coeficiente de partição for altamente desfavorável o que deve
requerer infinitas extrações e quando o sistema forma emulsões estáveis, recorre-se aos
métodos de extração contínua.
As extrações líquido-líquido contínua empregam um dos dois aparelhos mostrados na
figura 2.10. que permitem o tratamento automático de soluções aquosas com resultados
semelhante ao que se obteria com infinitas extrações empregando pequenas quantidades de
solvente extrator. A escolha de um dos dois aparelhos de extração líquido-líquido contínua
ilustrado abaixo depende da escolha do solvente extrator:
Com solvente extrator menos denso que a água usa-se o aparelho I. O solvente
orgânico é colocado no balão de destilação “D” e submetido a ebulição. Os vapores são
condensados no condensador “A” que ao cair é conduzido ao fundo do balão extrator “C”
através do tubo “B”. Cada gota de solvente ao subir através do leito de fase aquosa extrairá a

Figura 3.10 - Aparelhos para extração líquido-líquido contínua. I) quando o solvente extrator é
menos denso que a água. II) quando osolvente extrator é mais denso que a água. A=solvente
extrator, B=material extraído, C=amostra de onde está sendo extraído os componentes, E=tubo
que conduz o solvente extrator ao fundo do baão onde se encontra a amostra, D=condensador

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quantidade de soluto regida pela lei do equilíbrio de distribuição. Quando a fase orgânica
superior atingir o nível de comunicação entre os dois balões, retorna ao balão “D” acumulando
aí os solutos extraídos.
Para a utilização de solventes mais densos que a água, escolhe-se o aparelho II. O
solvente extrator é colocado no balão “D” e posto em ebulição. Os vapores ao serem
condensados em “A” gotejam sobre a fase aquosa extraindo os solutos durante sua descida
ao fundo do balão “B”. O solvente extrator retorna ao balão “B” através do tubo comunicador
que liga o fundo do balão extrator ao colo do balão “D” concentrando aí os solutos extraídos da
fase aquosa.

4.3 - EXTRAÇÃO LÍQUIDO-SÓLIDO

A extração líquido-sólido é utilizada para a separação ou isolamento de substâncias


sólidas, líquidas ou oleosas contidas numa matriz sólida. Podemos exemplificar alguns usos
deste tipo de extração na obtenção de óleos de diversos grãos e cereais, obtenção de extratos
com princípios ativos de plantas, análise de material orgânico em solos, determinação de óleos
e graxas em água para avaliar grau de poluição, etc. Neste tipo de extração a matriz sólida
contendo as substâncias de interesse é colocada em íntimo contato com o solvente extrator. O
solvente extrator deverá ser suficientemente volátil para permitir sua completa remoção sem
prejuízo do rendimento e propriedades do material extraído. No caso da obtenção de extratos
de plantas, o material é triturado com o objetivo de romper os tecidos vegetais. Em contato com
o solvente (meio hipotônico) as células sofrem plasmólise derramando os metabólitos
intracelulares que são arrastados pelo solvente. O resultado da extração líquido-sólido é
influenciado por vários fatores como o tamanho da partícula que compõe a matriz sólida,
natureza do solvente, temperatura , pH do meio e tempo de extração. As condições de
extração devem ser selecionadas em função do resultado que se deseja obter. Para isso
temos várias técnicas de extração líquido-sólido.

4.3.2 – DECOCÇÃO
Decocção ou cozimento consiste submeter a matriz sólida submersa, em água sob
fervura por alguns minutos. Se por um lado a fervura aumenta o poder extrativo da água, por
outro lado tem a desvantagem de degradar substâncias mais termolábeis. Assim deve-se ter
muito cuidado na escolha do método de extração.

4.3.1 – INFUSÃO
A técnica de extração por infusão consiste em adicionar água fervente sobre a matriz
sólida previamente fragmentada em pequenas peças e deixar repousar por alguns minutos. O
processo conhecido popularmente por chá, é uma boa técnica de extração de metabólitos
secundários de plantas. Mesmo as substâncias que não são solúveis em água são extraídas

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para o meio aquoso. Isto é possível porque, com o extravasamento do conteúdo celular em
consequência da plasmólise, no meio aquoso estarão presentes substâncias tais como ácidos
graxos que tem a função de produzir micelas carregando no seu interior os compostos apolares
e aí permanecem na forma de colóides ou dispersas em microgotículas que as mantém em
suspensão.

4.3.3 - PERCOLAÇÃO
A percolação consiste na passagem de um solvente através de um leito preparado com
a matriz sólida a ser extraída. A matriz sólida previamente triturada é colocada dentro de um
percolador (Figura 3.11). Um solvente apropriado é adicionado até cobrir toda a matriz sólida.
Abre-se o registro na parte inferior do percolador e se deixa o solvente fluir a uma determinada
velocidade.
Em farmácias de manipulação, para obtenção de tinturas ou extratos a partir de plantas
medicinais, este procedimento é feito com alcool de cereais. Porém na pesquisa de plantas
medicinais, o procedimento de extração pode envolver outros solventes e assim obter vários
extratos da mesma matriz vegetal. Com este procedimento é possível, por ex., extrair
separadamente grupos distintos de produtos naturais ao se fazer extrações sucessivas com
solventes de polaridades crescente como hexano, éter, acetato de etila, n-butanol e etanol.

4.3.4 - MACERAÇÃO
A técnica de extração por maceração consiste em deixar o solvente extrator em contato
com a matriz sólida, devidamente triturada, por um certo tempo a temperatura ambiente. Uma
variação que permite um aumento no poder extrativo é aquecer o sistema entre 30-40 0C. O
aumento da temperatura além de aumentar a solubilidade dos compostos aumenta a
capacidade extrativa do solvente devido a diminuição de sua viscosidade.

Figura 3.11 - Percolador utilizado na obtenção de tinturas e extratos de plantas medicinais

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O processo de maceração pode ser feito num percolador (figura 3.11) desde que se
mantenha o registro fechado durante o período de maceração. Como na percolação, a
maceração também pode ser feita com diferentes solventes usando a mesma matriz vegetal. A
vantagem da maceração é a obtenção de extratos com rendimentos muito superiores aos
obtidos pelo processo de percolação.

4.3.5-EXTRAÇÃO LÍQUIDO-SÓLIDO CONTÍNUA – SOXHLET

É a extração repetida e contínua de uma matix sólida por um líquido extrator. O


aparelho de Soxhlet , Figura 2.12, utilizado para esta finalidade compõe-se de três partes: Um
balão de destilação no qual se coloca o solvente extrator, uma peça intermediária que é o
extrator propriamente dito e onde é c olocada a matrix sólida a ser extraída, e na parte superior
do sistema fica o condensador.
O solvente extrator é colocado no balão o qual é aquecido à ebulição do líquido
extrator. Seus vapores são conduzidos ao condensador através do tubo lateral do extrator. Ao
condensar, o solvente extrator goteja sobre a matriz sólida colocada dentro do extrator. Quando
o solvente atingir o nível do sifão cobrindo toda a matriz sólida, retorna ao balão de ebulição
carreando o material extraído, e de onde é novamente evaporado para repetir o ciclo.

Figura 3.12 - Esqueme do aparelho de Soxlet para extração líquido sólido contínua

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4.3.6 - EXTRAÇÃO COM FLUIDO SUPERCRÍTICO (CO2 SS)

Alguns gases com o CO2 quando submetidos a determinadas condições de


temperatura e pressão adquirem um certa fluidez. Nestas condições apresentam propriedades
físico-químico próprias. Possuem as propriedades de um gás e a fluidez de um líquido e são
chamados de fluídos supercríticos. A grande vantagem dos fluídos supercríticos na extração é
que possuem um alto poder de extração e ao saírem do sistema voltam a ser gás deixando os
solutos extraídos livres de solvente instantaneamente.

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5 - CROMATOGRAFIA

O termo cromatografia, primeiramente descrito em 1906 pelo botânico russo Mikhail


Semenovich Tswet para a separação de pigmentos naturais, sobre uma coluna de carvão,
refere-se a uma variedade de técnicas de separação fundamentadas na migração diferencial
dos componentes de uma mistura quando são seletivamente retidos por uma fase estacionária.

A Cromatografia pode ser definida como sendo uma série de métodos de separação e
purificação de misturas moleculares por distribuição diferencial entre duas fases. A distribuição
de uma molécula entre duas fases é regida por um equilíbrio que depende das propriedades
físico-química da molécula e das fases na qual ela está sendo distribuída.
Os processos de separação cromatográfica estão fundamentados nos equilíbrios de
interação físico-química entre três componentes: soluto, fase estacionária e fase móvel:
a) fase estacionária - A fase estacionária pode ser um Líquido ou um Sólido de grande área
superficial, que permanece estacionário e interage com as moléculas do soluto “segurando-
as” seletivamente conforme suas propriedades físico-químicas.
b) fase móvel - A fase móvel poded ser um Líquido ou um Gás que flui através da Fase
Estacionária, a uma determinada velocidade e interage com as moléculas do soluto
“arrastando-as” consigo.
c) soluto - Denominamos de Soluto os componentes da mistura molecular que se deseja
separar.

5.1 - O SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Todas as formas de cromatografia apresentam um sistema básico de componentes que


constituem o Sistema Cromatográfico conforme ilustrado esquematicamente na Figura 3.13:

a- Fase Móvel - pode ser um líquido, gás ou fluído super crítico.


b- Injetor - dispositivo para a introdução da mistura a ser separada no sistema
cromatográfico. O modo pelo qual a mistura é introduzida no sistema depende do tipo de
cromatografia que se está desenvolvendo. O sucesso de uma separação cromatográfica
depende em parte de uma boa técnica de introdução da amostra no sistema.
c- Fase Estacionária - pode ser um Líquido imobilizado na superfície de um suporte sólido
ou um Sólido de grande área superficial. A Fase Estacionária é o coração do sistema
cromatográfico, pois é aí que ocorrem as interações que resultam na separação dos
componentes da mistura
d- Registro do resultado obtido - Todo resultado de uma separação cromatográfica deve
ser registrado. O mais comum é o registro na forma de um gráfico correlacionando o
tempo de análise em função da resposta do detetor. O gráfico assim obtido denominado
de Cromatograma

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Figura 3.13 - Esquema de um Sistema Cromatográfico

5.2 - EQUAÇÃO FUNDAMENTAL PARA A DISTRIBUIÇÃO DE UM SOLUTO ENTRE DUAS


FASES NUM SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Durante o processo cromatográfico, ocorre uma série de equilíbrios envolvendo as


moléculas do soluto, a fase móvel e grupos químicos existentes na superfície da fase
estacionária. Assim as moléculas do soluto interagem com a fase estacionária e com a fase
móvel. A fase móvel interage com a fase estacionária e com as moléculas do soluto. Deste
modo, a concentração das moléculas do soluto em cada fase, é regida por um equilíbrio
dinâmico o qual é definido por uma constante de distribuição característica de cada composto
orgânico em particular e da natureza das fases móvel e estacionária. Estes eqilíbrios múltiplos
estão ilustrados na Figura 3.14.
Num determinado par de FE-FM, cada composto químico tem uma constante de
distribuição cujo valor é característico dela própria, como uma constante física, e depende
essencialmente de sua natureza química e propriedades moleculares.

SFM ⇔ SFE KD = [S]FM / [S]FE

KD = Constante de distribuição
[S]FM = Concentração do Soluto na Fase Móvel
[S]FE = Concentração do Soluto na Fase Estacionária

Observe que no esquema da Figura 3.14, os equilíbrios são competitivos. Um “sito


ativo” da fase estacionária interage competitivamente com grupos químicos do soluto e com as
moléculas da fase móvel. Do mesmo modo, as fases móvel e estacionária competem com as
moléculas do soluto. Da grandeza destas interações é que são definidas as concentrações
relativas do soluto nas fases móvel e estacionária como descrita pela equação da Constante de
Distribuição .

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Figura 3.14 - Esquema ilustrando as multiplas interações entre as moleculas do soluto e as


fases móvel e estacionária.

5.3 - TIPOS DE CROMATOGRAFIA - CLASSIFICAÇÃO

Hoje existem inúmeras técnicas de separação baseadas no princípio básico da


cromatografia: a distribuição diferencial dos componentes de uma mistura entre duas
fases.
Pra facilitar o estudo, os vários tipos de cromatografia podem ser classificados em
relação a determinados critérios, tais como a) estado físico da fase móvel, b) estado físico da
fase estacionária, c) mecanismo de separação, d) quantidade de material a ser separado, e)
técnicas experimentais.

5.3.1 - QUANTO AO ESTADO FÍSICO DA FASE MÓVEL


Levando em consideração o estado físico da fase móvel, os métodos cromatográficos
podem ser divididos em dois grandes grupos
Cromatografia Gasosa - Quando a fase móvel é um gás.
Cromatografia Líquida - Quando a fase móvel é um líquido.

5.3.2 - QUANTO AO ESTADO FÍSICO DA FASE ESTACIONÁRIA


A Fase Estacionária de um sistema cromatográfico pode ser um Sólido ou um Líquido
não volátil imobilizado na superfície de um sólido. Segundo este critério podemos ter:

Cromatografia de Fase Estacionária sólida


Cromatografia de Fase Estacionária líquida
Da combinação destes dois critérios de classificação surgem quatro tipos básicos de
cromatografia:

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA:

Cromatografia Líquido Líquido (C L L) = FM líquido e FE líquido.

Cromatografia Líquido Sólido (C L S) = FM líquido e FE sólido

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CROMATOGRAFIA GASOSA:
Cromatografia Gás Sólido (C G S) = FM gás e FE sólido
Cromatografia Gás Líquido (C G L) = FM gás e FE líquido

5.3.3 - QUANTO AO MECANISMO DE SEPARAÇÃO


Os quatro tipos básicos de cromatografia acima definidos, podem ser subdivididos
segundo o mecanismo envolvido na separação cromatográfica. O mecanismo de separação
cromatográfica por sua vez depende essencialmente da natureza da Fase Estacionária. Desta
forma poderemos ter a separação dos componentes de uma mistura orientada por inúmeros
mecanismos conforme o tratamento que dermos para a Fase Estacionária. Segundo os
mecanismos de sepração, as cromatografia mais empregadas são:

CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (FASE DIRETA)


CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO (FASE REVERSA, FASE LIGADA)
CROMATOGRAFIA DE FASE QUIRAL
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO (GEL FILTRAÇÃO)
CROMATOGRAFIA DE COMPLEXAÇÃO

5.3.4 - SEGUNDO A QUANTIDADE DE MATERIAL A SER SEPARADO


Do ponto de vista experimental e em função do objetivo a ser alcançado, a
cromatografia pode ser realizada em escala analítica, semi-preparativa e preparativa
conforme for a quantidade de mistura a ser usada na separação. Na cromatografia analítica,
objetiva-se obter o cromatograma da mistura o qual dará informações quanto a quantidade de
cada componente e sua identificação, onde se obtém um perfil da amostra. Nas cromatografias
semi-preparativa e preparativa objetiva-se isolar fisicamente cada componente da mistura a
fim de submete-los as análises físico-químicas e espectroscópicas e outros estudos ou
aplicações que requerem compostos puros.

CROMATOGRAFIA ANALÍTICA ( ATÉ 1 mg)


CROMATOGRAFIA SEMI-PREPARATIVA (1-100 mg)
CROMATOGRAFIA PREPARATIVA (MAIS DE 100 mg)

5.3.5 - DO PONTO DE VISTA EXPERIMENTAL


De acordo com as técnicas experimentais utilizadas no desenvolvimento das
separações cromatográficas, a cromatografia pode ainda ser classificada em:

a) CROMATOGRAFIA PLANAR:
Na cromatografia planar a fase estacionária é depositada em uma superfície plana na
forma de uma fina camada. A fase móvel líquida flui através da fase estacionária por

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capilaridade e o resultado da separação é visualizado na superfície da própria fase


estacionária.

Varias técnicas cromatográficas utilizam a cromatografia planar:


Cromatografia em Camada Fina (CCF) - Uma fina camada de fase estacionária (Alumina,
Silica Gel, Celulose, etc) é depositada na superfície de uma lâmina de vidro ou de Alumínio.
Eletroforese - No caso de eletroforese a fase estacionária é o próprio acetato de celulose que
compõe as fitas e os solutos migram ao se aplicar uma diferença de potencial.

Cromatografia de papel - é desenvolvida em papel filtro. A fase estacionária é a própria


celulose que compõe o papel.

b) CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A fase estacionária é colocada no interior de um tubo (geralmente de vidro ou de aço)
como se fosse um recheio. A fase móvel líquida é introduzida no topo da coluna e flui através
dela por ação da gravidade. Na extremidade inferior da coluna, uma torneira controla a
velocidade de fluxo da fase móvel. O resultado da separação é visualizado quando os
componentes da mistura efluem da coluna, onde pode ser adaptado alguma forma de
detecção.

c) CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA - CLAE (HPLC)


É um tipo particular de cromatografia em coluna cujo tamanho das partículas da fase
estacionária é tão pequeno que para a fase móvel líquida fluir através dela é necessário ser
bombeada a alta pressão. É a pressão e o pequeno tamanho das partículas da fase
estacionária e proporcionam a alta eficiência da separação.

d) CROMATOGRAFIA GASOSA DE COLUNA EMPACOTADA


Na cromatografia gasosa tradicional a fase estacionária líquida ou sólida é colocada
como recheio de uma coluna de vidro ou aço (geralmente de 2mm de diâmetro interno por 2-6
m de comprimento).

e) CROMATOGRAFIA GASOSA DE ALTA RESOLUÇÃO - CGAR


A cromatografia gasosa de alta resolução, também chamada de cromatografia gasosa
capilar, usa um tubo capilar de vidro ou sílica fundida onde a fase estacionária é imobilizada
na superfície interna deste tubo capilar. As dimensões da coluna capilar geralmente são de 10
a 50 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e um filme líquido de 0,25 μ.

f) CROMATOGRAFIA POR GOTAS EM CONTRA CORRENTE - DCC


É um tipo especial de cromatografia líquido-líquido onde as fases móvel e estacionária
são líquidos imissíveis de diferentes densidades. A fase líquida estacionária permanece dentro
de colunas de vidro, em número de 60 colunas (geralmente 3 mm de diâmetro po 30 cm de
comprimento), e a fase estacionária flui através dela na foram de uma gota ascendente ou

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descendente conforme for menos densa ou mais densa que a fase estacionária. As gotas de
fase móvel ao passar pela fase estacionária vão extraindo a moléculas de soluto como se
fosse uma extração líquido líquido e a separação se dá pelos diferentes coeficientes de
partição dos componentes da mistura.

O esquema na Figura 3.15, ilustra a classificação da cromatografia levando em conta


os critérios acima descritos. Os dois grandes grupos de cromatografia (Cromatografia Gasosa e
Cromatografia Líquida) e suas subdivisões do ponto de vista experimental. Observe que cada
tipo de cromatografia pode ser desenvolvida segundo um ou mais mecanismos de separação.

Figura 3.15 - Esquema ilustrando os tipos de cromatografia

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5.4 - MECANISMOS DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA

5.4.1 CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO


As técnicas cromatográficas que usam Fase Estacionária Sólida com superfície ativa
(presença de grupos químicos) tais como Cromatografia Líquido Sólido e Cromatografia Gás
Sólido fazem a separação segundo o mecanismo de adsorsão.
Na Cromatografia por Adsorção, a separação cromatográfica depende do Equilíbrio
Adsorsão-Desorsão. A adsorsão é um fenômeno de superfície onde moléculas do soluto “se
grudam” na superfície de um sólido através das forças de interação intermoleculares como as
fracas forças de van der Walls e interações polares como interações dipolo-dipolo e pontes de
hidrogênio. A desorsão é a remoção das moléculas da superfície do sólido promovida por
outras forças de interação (Soluto-Fase, Móvel e Fase Móvel-Fase Estacionária) que
substituem aquelas forças envolvidas no fenômeno de Adsorsão.
Dentro do sistema cromatográfico temos um equilíbrio dinâmico envolvendo interações
intermoleculares entre moléculas do Soluto com moléculas da Fase Móvel, entre moléculas do
Soluto e a superfície da Fase Estacionária e entre moléculas da Fase Móvel e a superfície da
Fase Estacionária. Este conjunto de interações atinge um equlíbrio de Adsorsão-Desorsão que
é regido pela competição entre moléculas do Soluto (S) e moléculas da Fase Móvel (M) por
um sítio na superfície ativa da Fase Estacionária. Este conjunto de equilíbrios pode ser
representado pela equação de equilíbrio:

SFM + nMFE SFE + nMFM K ad =


[S FE ][M FM ]
[S FM ][M FE ]
Onde: SFM = moléculas do soluto na fase móvel
SFE = moléculas do soluto na fase estacionária
MFE = moléculas da fase móvel adsorvidas na fase estacionária
MFM = moléculas de fase móvel na fase móvel
n = número de moléculas de fase móvel adsorvidas que devem ser deslocadas pela
adsorsão de S.

A intensidade com que uma molécula é adsorvida à superfície da Fase Estacionária


varia consideravelmente e depende essencialmente da natureza de sua polaridade. Assim
podemos ter moléculas fracamente adsorvidas (onde a única interação são as fracas forças
de van der Walls, até moléculas fortemente adsorvidas com o envolvimento de ligações de
hidrogênio. Estas forças interativas são de natureza física e o fenômeno envolvido é a
Fisisorsão. Porém, dependendo da natureza química das moléculas do soluto, estas podem se
combinar com os grupos químicos da superfície da Fase Estacionária através de uma ligação
química covalente, resultando em Quimisorsão. O fenômeno da quimisorção geralmente tem
lugar entre moléculas altamente polares e fases estacionárias muito ativas como óxidos de
alumínio, florisil e sílica. Esta é a grande desvantagem da cromatografia de adsorsão que pode

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inviabilizar a separação de compostos altamente polares por se adsorverem irreversivelmente


à fase estacionária.
A cromatografia por adsorsão tem a vantagem de ser um método de separação
bastante versátil, de baixo custo e de fácil aplicação em trabalhos rotineiros de purificação. Os
adsorventes são bastante estáveis quimicamente e podem ser facilmente recuperados e
reutilizados inúmeras vezes. Por outro lado tem a desvantagem de proporcionar adsorsões
irreversíveis (quimisorsão) em presença de moléculas muito polares. Os adsorventes mais
comuns como a sílica (que é fracamente ácida) e alumina (que é fracamente básica) podem
também decompor moléculas de soluto sensíveis a troca de pH como também permitir a
quimisorsão. Em alguns casos uma lavagem com ácido ou base é recomendada para remover
as moléculas quimisorvidas. Em geral os adsorventes podem ser recuperados por tratamento
com agentes oxidantes em meio ácido, como por ex. água oxigenada.

Fatores que influem na separação por cromatografia de adsorsão

a) Polaridade das moléculas do soluto – A força com que moléculas do soluto se adsorvem
a Fase Estacionária está diretamente relacionada a sua polaridade. Por exemplo, na fase
estacionária sílica, a superfície hidroxílica interage com os grupos funcionais das moléculas de
soluto e dependendo da força desta interação adsorve preferencialmente um ou outro soluto. A
tabela abaixo lista os grupos funcionais em ordem crescente de força com que se
adsorvem.Além da polaridade, certas características estruturais do soluto também são
muitoimportantes na separação. Isto pode ser exemplificado pela separação dos isômeros o,
m, p-hidroxianilina em sílica gel (Fig. 3.16). Os isômeros meta e para interagem com os
grupos hidroxilas da superfície da sílica através de duas ligações de hidrogênio ao passo que o
isômero orto faz apenas uma destas interações. A diferenciação entre os isômeros meta e
para se faz pelas diferentes intensidades das interações devido as direfentes distâncias em
que se encontramos grupos hidroxi e amino.

Figura 3.16 - Ilustração das


interações entre os isômeros orto,
meta e para hidroxi anilina com a
superfície da sílica gel.

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Polaridade da fase móvel (força da Fase Móvel) – A capacidade da fase móvel de remover
moléculas do soluto adsorvidas a superfície da Fase Estacionária está diretamente relaciona
com sua polaridade. Aumentando a polaridade da Fase Móvel, ocorre uma maior competição
ente soluto e fase móvel pelos sítios ativos na superfície da fase estacionária. Esta maior
interação da fase móvel com a fase estacionária e menor interação do soluto com a fase
estacionária, facilita a desorção do soluto que é arrastado para fora da Fase Estacionária. O
efeito do aumento da polaridade da fase móvel pode ser observado na Figura 3.17 que ilustra a
separação de duas cumarinas de distintas polaridades em óxido de alumínio como fase
estacionária.

solvente fraco

H3C

H3C O O
O
O O
H

O O O O O O O O O O O O O O O O O O
Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al

solvente forte H3C O

H3C O
H3C O HC
CH3 3
O H3C
H3C O
CH3 O H3C O
O
H3C
H3C
O CH3
H3C CH3 H3C H3C H3C
CH3 H3C CH3 CH3 CH3
O H3C CH3
H
O O O O
O O
O O O O O O O O O O O O O O O O O O O
Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al Al

alumina

Figura 3.17 - Ilustração das interações do soluto com a fase estacionária alumina, num
solvente fraco (hexano) e num solvente mais forte (acetona), que compete com o soluto
pelos sítios ativos da fase estacionária.

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c) Atividade do Adsorvente (Força do Adsorvente) – A atividade dos adsorventes está


relacionada com grupos químicos polares existentes na sua superfície. A presença destes
grupos químicos também permite introduzir modificações químicas na Fase Estacionária,
alterando sua atividade quanto as interações polares.
Na tabela que segue, na primeira coluna estão relacionados categorias de solutos em
ordem crescente de polaridade. Na segunda coluna, uma série eluotrópica dos solventes mais
comuns utilizados como Fase Móvel. Na terceira coluna estão relacionados os Adsorventes
mais usados como Fase Estacionária, em ordem crescente de atividade.

SOLUTO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA


(SOLVENTE) (ADSORVENTE)
Hidrocarbonetos éter de petróleo Celulose
Olefinas Ciclohexano Amido
Éteres Benzeno Açúcares
Comp. . Diclorometano Silicato de Mg
Halogenados
Comp. . Éter etílico Sulfato de Ca
Aromáticos
Cetonas Clorofórmio Sílica
Aldeídos Acetato de etila Florisil
Ésteres Acetona Óxido de Mg
Amidas n-propanol Aluminas
Aminas Etanol Carvão ativo
Álcoois Metanol
Ácidos e bases Água
fortes
Ácido fórmico

d) Relação Quantidade Soluto-Adsorvente - A fase estacionária deverá ser dimensionada


de acordo com a quantidade de material a ser separado. Assim a quantidade de fase
estacionária deverá proporcionar uma superfície suficientemente grande para que todas as
moléculas do soluto possam interagir com a fase estacionária. Para uma mesma quantidade de
fase estacionária, aumentando-se a quantidade de amostra a ser separada mais sitios ativos
serão utilizados até que num determinado ponto chega-se a saturação do sistema com toda a
superfície da fase estacionária comprometida com as moléculas do soluto. A partir deste ponto
crítico, as moléculas excedentes de soluto deslizam umas sobre as outras sem interagir com a
fase estacionária e o sistema perde a capacidade de separação. O fenômeno da saturação do
sistema cromatográfico está ilustrado na figura 3.18.

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Figura 3.18 – Ilustração mostrando a capacidace de um sistema cromatográfico e sua


saturação.

Neste ponto devemos introduzir um outro termo utilizado na cromatografia: a Eluição


cromatográfica que pode ser definida como a passagem do solvente (Fase Móvel) através da
Fase Estacionária arrastando seletivamente as moléculas do soluto.
A eluição cromatográfica pode ocorrer de duas formas:
a) Eluição no modo Isocrástico – Neste modo seleciona-se um sistema de solventes
(um único solvente, uma mistura binária ou ternária) como fase móvel para a
eluição do sistema do início ao fim sem que sua composição varie.
b) Eluição no modo Gradiente – Neste modo seleciona-se um par de solventes sendo
um apolar e outro mais polar para compor a fase móvel. A eluição inicia com o
solvente apolar seguido do aumento gradativo da polaridade da fase móvel pelo
aumento da proporção do solvente mais polar.

5.4.2- CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO

Na cromatografia de partição, cromatografia líquido líquido, o soluto é particionado


entre duas fases líquidas imissíveis. A separação depende da solubilidade relativa das
moléculas do soluto na fase móvel líquida e fase estacionária líquida. A concentração relativa
do soluto nas fases móvel e estacionária é regida pela grandeza da constante equilíbrio de
partição :

K part . =
[S FM ]
[S FE ]

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A fase estacionária é constituída por um líquido que está de alguma forma


imobilizado na superfície de um suporte sólido finamente dividido a fim de proporcionar uma
grande área superficial. Portanto a fase estacionária forma um delgado filme líquido na
superfície dos grânulos do suporte sólido. A interação do soluto com a fase estacionária
líquida é um processo de absorção, ou seja, as moléculas do soluto passam para o interior da
fase estacionária onde são solubilizadas.
O filme líquido que constitui a fase estacionária na cromatografia de partição pode ser
um líquido polar ou não polar. Quando a fase estacionária for polar, a fase móvel deverá ser
apolar e denominamos de cromatografia líquido líquido ou de fase direta. Quando a fase
estacionária for apolar, a fase móvel deverá ser polar e denominamos de cromatografia líquido
líquido em fase reversa. Isto é essencialmente necessário para evitar a miscibilidade de fases.
A eluição pode ser no modo isocrástico usando um único sistema de solvente do início
ao fim do processo de separação. Na cromatografia líquido líquido de fase reversa a eluição no
modo gradiente, ao contrário da cromatografia de adsorsão, inicia com o solvente mais polar.
Ao contrário da cromatografia de partição, na cromatografia em fase reversa a ordem de
eluição do soluto é do mais polar para o menos polar. Como ilustrado na Figura 3.19,
moléculas mais apolares tendem a se dissolver mais na fase estacionária apolar. Em
conseqüência disto a fase móvel polar interage nenos com o soluto deixando-o mais tempo
retido na fase estacionária. Por outro lado, moléculas mais polares interagem mais
intensamente com a fase móvel polar sendo por ela arrastadas com maior facilidade.
Consequentemente sua retenção na fase estacionária é bem menor.

FASE ESTACIO NÁRIA APO LAR - C-18 FASE MÓ VEL PO LAR


O O
Si O H H H H
O
Si O O O
H H
O
Si O H O
O H H
O H
Si O O O
O H H
Si O O
O O H H H
Si O H H
O H O O
H H
Si O O H
O
O H H
Si O
O O
O H H
Si O H
O
H
parte apolar parte polar
O
H
SO LUTO

Figura 3.19 - Ilustração de uma separação por Cromatografia de partição em fase


reversa.

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Na cromatografia gasosa, onde a fase móvel é um gás, o soluto quando na fase móvel
também estará na fase gasosa. Deste modo a velocidade com que as moléculas do soluto
passam da fase líquida estacionária para a fase móvel gasosa depende fundamentalmente de
sua pressão de vapor (volatilidade) que está intimamente relacionada com seu ponto de
ebulição. Assim, de modo geral, a ordem de eluição obedece a ordem de seu ponto de
ebulição. Porém devemos ressaltar que as fases líquida estacionária preparadas para a
cromatografia gasosa pode ter vários graus de polaridade o que proporciona outras interações
com o soluto também influindo na ordem de eluição.

5.4.3 – CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO

A cromatografia por exclusão também chamada de gel filtração, separa as moléculas


do soluto por ordem de tamanho. Neste tipo de cromatografia a fase estacionária deve ser
quimicamente inerte, portanto não ocorre nenhum tipo de interação física ou química, é
simplesmente um processo mecânico como uma filtração.
A fase estacionária é um gel constituído por grãos porosos. Cada tipo de gel tem grãos
com porosidades distintas que podem excluir moléculas em determinadas faixas de peso
molecular. As moléculas pequenas entram nos poros existentes nos grãos do gel ficando aí
retidas por determinado tempo. As moléculas grandes, que não cabem nos poros, são
rapidamente arrastadas pelo solvente. Moléculas de tamanhos intermediários, algumas entram
nos poros outras não, tendo retenção intermediária.
Considerando que o único fenômeno envolvido é a difusão molecular, a o tamanho das
moléculas do soluto depende de seu raio hidrodinâmico, isto é, o raio definido pela rotação da
molécula em torno de seu centro. Deste modo a retenção também depende da topografia
molecular. Assim, dentro da mesma faixa de peso molecular, moléculas com grandes cadeias
lineares são retardadas em relação as moléculas curtas (mais ramificadas).
O equilíbrio estabelecido na cromatografia por exclusão é descrito pela equação:

K=
[S FE ] = k ' ⎛⎜ VFM ⎞⎟
[S FM ] ⎜⎝ VFE ⎟⎠
Onde: SFM e SFE são as quantidades de soluto na fase móvel e estacionária
K = coeficiente de distribuição
VFM = volume intersticial total da fase móvel
VFE = volume da fase móvel dentro dos poros disponível para o soluto

No processo de permeação, assume-se que todos os poros são acessíveis a um


soluto, então [SFE] = [SFM] e K = 1. Se nenhum poro está disponível ao soluto, [SFE] = 0 e K = 0.
Deste modo os valores da constante de distribuição K podem variar de 1 a 0, isto quer dizer
que todos os componentes do soluto eluem num volume finito.

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5.4.4 – CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA

A cromatografia por troca iônica utiliza como fase estacionária sólidos porosos,
geralmente resinas, contendo grupos iônicos ligados a sua estrutura. Estas resinas trocadoras
de ions podem ser de dois tipos conforme sua natureza iônica:
-Resinas Catiônicas – São aquelas cujo grupo iônico é um ânion e são utilizadas para a
separação de cátions.
-Resinas Aniônicas – São resinas cujo grupo iônico é um cátion e são utilizadas para a
separação de ânions.
Este método de separação é geralmente aplicado a compostos iônicos ou ionizáveis
como ácidos e bases. O processo de troca iônica pode ocorrer tanto em meio aquoso como em
meio não aquoso, porém a fase móvel deverá conter um contra ion oposto em carga ao grupo
iônico da superfície da resina para manter com ela um equilíbrio na forma de um par iônico.
Geralmente sistemas tampões são bastante adequados como fase móvel.
Numa resina catiônica, por ex., os cátions do soluto interagem eletrostaticamente com
a superfície da fase estacionária negativamente carregada deslocando o contra íons aí
presente. Este cátion só será deslocado quando um outro cátion, que constitui a fase móvel,
ocupar o seu lugar. Deste modo temos uma competição entre os íons do soluto e da fase
móvel pela superfície iônica da fase estacionária numa forma de equilíbrio conforme ilustrado
na Figura 3.20 representando resinas catiônica e aniônica.

Figura 3.20 – Ilustração da estrutura de resinas catiônicas e aniônicas com a representação


dos equilíbrios de troca iônica.

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O equilíbrio do processo de troca de ânions estabelecido numa resina trocadora de


íons pode ser representado pela equação:

K=
[NR ⊕
][ ]
X − Cl −
[NR ][ ]
4

4 Cl − X −

O coeficiente de distribuição K depende de parâmetros experimentais como pH, carga iônica,


raio iônico, porosidade da resina, força iônica e solvente.
Diferentes íons podem ser seletivamente removidos da superfície iônica da fase
estacionária alterando a composição iônica da fase móvel. Por ex. na separação de
aminoácidos, estes podem ser separados em função de seus pontos isoelétricos variando o
pH do sistema tampão que constitui da fase móvel.

5.4.5 – CROMATOGRAFIA DE FASE QUIRAL

A cromatografia quiral utiliza fases estacionárias quirais especialmente preparadas


para problemas de separação de misturas quirais. Moléculas quirais apresentam as mesmas
forças de interação com fases estacionais comuns (adsorsão e partição) devido que possuem
os mesmos grupos químicos na molécula, a diferença é que uma molécula é a imagem
especular da outra. Veja o exemplo mostrado na Figura 3.21

OH OH

C C
R R
G G

Figura 3.21 – Representação de um par de nantiomeros

Uma fase quiral especialmente preparada reterá apenas uma espécie do par de
enantiômeros por permitir uma melhor interação com a fase estacionária. como ilustrado na
figura abaixo. A Figura 3.22 ilustra os mecanismos de separação para as cromatografias de
adsorção, partição, toca iônica, exclusão e cromatografia quiral.

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Figura 3.22 - Ilustração dos mecanismos de separação para as cromatografias de adsorção,


partição, toca iônica, exclusão e cromatografia quiral.

5.5 - TEORIA DA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA


ALGUNS PARÂMETROS RELEVANTES

5.5.1 - RETENÇÃO CROMATOGRÁFICA


A Retenção Cromatográfica é um parâmetro que descreve o quanto as moléculas do
soluto interagem com a fase estacionária e depende da estrutura molecular do soluto. Num
determinado sistema cromatográfico, cada composto orgânico tem uma retenção
cromatográfica que lhe é própria como uma propriedade física qualquer. Por isto mesmo é
utilizado para a identificação dos compostos orgânicos por cromatografia.

A retenção cromatográfica pode ser medida de diversas maneiras dependendo do tipo


de cromatografia:

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I - TEMPO DE RETENÇÃO: t’R = tR- tM

tR é o tempo contado desde o momento da injeção de uma substância no sistema


cromatográfico até a mesma sair da coluna.
tM = TEMPO MORTO é o tempo em que a fase móvel levaria para percorrer toda a extensão
da fase estacionária sem fazer nenhuma interação com a fase stacionária.
t’R = TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO é o tempo real em que o soluto permanece na fase
estacionária.
No cromatograma hipotético da figura 3.24, o tempo de retenção medido
experimentalmente é 6 min. O tempo de retenção ajustado calculado pela equação t’R = tR- tM
é de 5 min.

Figura 3.24 - Cromatograma hipotético mostrando os parâmetros de retenção cromatográfica


relacionadas ao tempo

O tempo de retenção é o parâmetro de retenção mais utilizado na cromatografia


gasosa e na cromatografia líquida de alta eficiência.

II - VOLUME DE RETENÇÃO: v’R = vR - vM

v’R = VOLUME DE RETENÇÃO AJUSTADO é definido como o volume real de fase móvel
necessária para eluir o soluto.
vM = Volume morto é o volume intersticial de uma coluna, isto é o volume de fase móvel
dentro da coluna.
O volume de retenção é usado em cromatografia gasosa e em cromatografia líquida
em coluna e pode servir para calcular a quantidade de solvente necessário para efetuar a
separação de determinada mistura.

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III - FATOR DE RETENÇÃO:


Rf = dS / dM

dM = distância percorrida pela fase móvel desde a origem a frente do solvente.


dS = distância percorrida pelo soluto
O fator de retenção ou retenção relativa (Rf) é o parâmetro de retenção utilizado na
cromatografia planar e refere-se o quanto uma substância migra em relação a frente do
solvente. A figura 3.25 ilustra o cálculo do fator de retenção num sistema cromatográfico
hipotético.

Num determinado sistema cromatográfico (fase estacionária-fase móvel) cada


composto orgânico tem um fator de retenção (Rf) que lhe é próprio e é o parâmetro de
comparação para diferenciar e identificar os componentes de uma mistura.

Figura 3.25 - Hipotética cromatografia em camada fina mostrando os fatores de retenção.


Como se pode observar, a frente da fase móvel deslocou 12 unidades, o componente deslocou
6 unidades. Aplicando a esqução, obtem-se um Rf = 0.5 para este hipotético composto.

5.5.2 - RESOLUÇÃO

O objetivo da cromatografia é separar os componentes de uma mistura dentro de uma


zona de separação e tempo razoáveis. A resolução é um parâmetro que define o quanto dois
componentes podem ser separados um do outro num determinado sistema cromatográfico.

Considerando o cromatograma da figura 3.26 para a separação de uma mistura binária,


a resolução entre os dois picos é dada pela equação:

t R 2 − t R1
R=
(w2 − w1 ) / 21

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Figura 3.26 - Cromatograma mostrando a resolução entre os componentes de uma mistura


binária, onde: tR2 e tR1 = tempo de retenção medido desde o momento de introdução da
amostra no sistema cromatográfico até o máximo do pico, respectivamente para os
componentes 1 e 2. w1 e w2 = largura da base do pico para os componentes 1 e 2
respectivamente.

Considerando que a largura de dois picos correspondentes a dois compostos que


eluem em tempos de retenção muito próximos não varia (w1 = w2) a resolução pode ser dada
por:

Δt SELETIVIADE
R= =
w2 EFICIÊNCIA

A equação que define a resolução é função direta da diferença dos tempos de


retenção (SELETIVIDADE) e inversa da largura do pico (EFICIÊNCIA). Portanto a resolução
depende de dois fatores:
a) - LARGURA DO PICO = EFICIÊNCIA
b) - DISTÂNCIA ENTRE OS MAXIMOS = SELETIVIDADE

5.5.3 - EFICIÊNCIA
A eficiência de uma coluna cromatográfica é determinada pela largura do pico, isto é a
extensão em que cada componente de uma mistura se espalha pela fase estacionária.
A eficiência é função dos parâmetros da coluna:
- FLUXO DA FASE MÓVEL
- GRADIENTE DE ELUIÇÃO
- NATUREZA DA F. M.

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- PRESSÃO
- NATUREZA DA F. E.
- TEMPERATURA
- GRANDEZA DA PARTÍCULA
- DIÂMETRO DA COLUNA OU ESPESSURA DA CAMADA DELGADA

O NÚMERO DE PRATOS TEÓRICOS (N) é a expressão quantitativa da eficiência do


sistema cromatográfico e é definido pela equação:

2 2
⎛t ⎞ ⎛t ⎞
N = ⎜ R ⎟ = 16⎜ R ⎟
⎝σ ⎠ ⎝w⎠

onde tR éo tempo de retenção e σ é o desvio padrão do pico (Fig. 3.22). O pico cromatográfico
é a distribuição Gausina do componente na coluna cujos limites na prática são dados pela
largura do pico: w = 4σ.
O número de pratos teóricos é um conceito originário da teoria da destilação e usamos
aqui para medir a eficiência da coluna (ou da capa fina). Basicamente a formula compara a
largura do pico com o tempo em que o componente permanece na coluna. Assim uma coluna
eficiente leva a obtenção de picos estreitos.
Como a largura do pico depende do tempo em que o componente permanece na
coluna, o número de pratos teóricos depende do comprimento da coluna (ou da distância
percorrida pela frente do solvente na cromatografia planar). Desta forma definimos um outro
termo mais geral para expressar quantitativamente a eficiência e comparar colunas de
diferentes comprimentos, é a altura equivalente a um prato teórico (H).

H =L
N
Na prática o número de pratos teóricos pode ser calculado a partir dos dados de um
cromatograma como segue como ilustrado na Figura 3.27.

Figura 3.27 - Cromatograma típicomostrando o tempo de retenção (tR), a largura do


pico (w) e o desvio padrão (σ) tomado a meia altura.

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5.5.4 - FONTES DE ALARGAMENTO


A largura do pico depende do tempo em que o soluto permanece na coluna. Quanto
mais tempo um componente permanece na coluna maior a probabilidade de se espalhar pela
fase estacionária devido a uma série de fenômenos que ocorrem durante a eluição. Porém
podemos descrever três fontes principais que contribuem para o alargamento: a) caminhos
múltiplos, b) difusão molecular e c) transferência de massas.

A - CAMINHOS MÚLTIPLOS:
As moléculas de um mesmo componente atravessam a coluna (ou a capa fina) a
diferentes velocidades resultando em tempos de retenção diferentes como mostra a ilustração
da figura 3.28. O máximo do pico representa o tempo médio. Assim:
- a velocidade média é que determina o TEMPO DE RETENÇÃO ( tR)
- diferentes velocidades causam ZONA DE DISPERSÃO (ALARGAMENTO)
A expressão para zona de alargamento é dada por:

HP = 2λ dp

HP = contribuição das diferentes velocidades


dp = diâmetro da partícula de fase estacionária
λ = empacotamento, regularidade com que as partículas de FE são acomodadas
na coluna

Figura 3.28 - Variações na velocidade do fluxo da fase móvel devido ao empacotamento e


diferentes tamanhos de partícula.

B - DIFUSÃO MOLECULAR:
A difusão molecular é um fenômeno físico bastante conhecido. Qualquer soluto ao ser
colocado num meio líquido ou gasoso, suas moléculas tendem a se dispersarem até ficarem
uniformemente distribuídas por todo o meio. Num sistema cromatográfico a difusão longitudinal
ocorre tanto na fase estacionária como na fase móvel. Porém a difusão na fase estacionária é
tão lenta que pode ser ignorada para efeitos práticos.

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A difusão molecular depende do tempo de permanência do soluto na F. E. Assim, a


difusão aumenta com a diminuição do fluxo da fase móvel. Na figura 3.29 são ilustradas a
distribuição do soluto na fase móvel em função da velocidade da fase móvel.

A contribuição da difusão molecular para a altura equivalente a um prato teórico é


dada pela equação:
Dm = coeficiente de difusão molecular do soluto na
fase móvel
Hd = 2 γ Dm / ν
ν = velocidade do fluxo da F. M.
γ = fator tortuosidade (empacotamento)

Figura 3.29 - Ilustração da distribuição do soluto com o aumento da difusão molecular.

5.6 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA

5.6.1 - Preparo da ccf


A cromatografia em camada fina é um tipo de cromatografia planar em que a fase
estacionária é espalhada numa superfície plana tal como uma placa de vidro, folha de alumínio
ou outro material apropriado. As placas de cromatografia em camada fina podem ser
preparadas no laboratório em placas de vidro com dimensões variadas, sendo que as mais
utilizadas são placas 20 x 20 cm para análise de até 20 amostras, placas 5 x 20 cm para
análise de até seis amostras ou laminas de microscópio (2,5 x 7,5 cm para análise de até cinco
amostras. A espessura da camada de fase estacionária é de aprocimadamente 0,2 mm para
propósitos analíticos e de até 2 mm para separações preparativas.
Para confeccionar as placas de ccf de sílica gel, prepara-se uma suspenmsão de sílica
em agua destilada na proporção de 1 parte de sílica gel para 1/3 partes de água,

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homogenizando bem até a obtenção de uma suspensão de consistência apropriada. Espalha-


se esta suspensão sobre placas de vidro, manualmente ou com auxílio de aplicadores
especiais. Deixa-se as placas secarem ao ambiente em uma superfície plana e nivelada. Antes
do uso as placas de ccf devem ser ativadas em estufa a uma temperatura de 110 ºC por um
período mínimo de 30 minutos.
Alternativamente, existem placas prontas de ccf sobre folhas de alumínio em
embalagens de 20 placas de dimensões 20 x20 cm. Esta placas podem ser cortadas com
tesoura ou estilete no tamanho desejado.

5.6.2 - Aplicação da Amostra


As amostras a serem analisadas por ccf devem ser aplicadas diretamente na placa,
sobre uma linha imaginária a 1 cm de uma das extremidades da placa e a pelo menos 1 cm
das laterais. A amostra deve ser previamente dissolvida num solvente volátil apropriado e a
uma concentração que não permita asaturação do ponto de aplicação. Com auxílio de um
capilar de vidro é feita a amostragem da amostra dissolvida e então aplicada na placa na forma
de um pequeno pnto. O ponto de aplicação deve ser o menor possível para minimizar os
problemas de alargamento de banda. Nas camadas preparativas, a amostra previamente
dissolvida deve ser aplicada ininterruptamente ao longo de uma linha imaginária dista a 1 cm
de uma das extremidades e das laterais da placa cromatográfica. A figura 3.30 ilustra a técnica
de aplicação da amostra num sistema analítico (Fig. 3.30 A) e prepartivo (Fig. 3.30 B).

Figura 3.30 -: Ilustrando a aplicação da amostra na ccf: A) analítica, B) preparativa.

5.6.3 - Escolha da fase móvel


Dois fatores são importantes na escolha da fase móvel: a força e a seletividade. A
força do solvente Fase Móvel faz com que o Soluto migre na superfície da Fase Estacionária e
a seletividade permite a migração diferencial de dois ou mais componentes. Assim, se a FM for

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muito forte (ou seja, muito polar na cromatografia de adsorção) ela carrega os componentes da
mistura para a extremidade da placa sem permitir sua separação. Se a FM for muito fraca, por
outro lado, ela deixa os componentes da mistura próximo ao ponto de aplicação. No entanto,
uma FM com força intermediária e boa seletividade, promove a separação eficiente dos
componentes da mistura. A figura 3.31 ilustra estas situações.

Figura 3.31 – Ilustração da análise de uma amostra mostrando a eluição com uma FM fraca,
FM forte e uma FM ideal.

A escolha adequada da FM é um dos fatores mais importantes no sucesso de uma


separação cromatográfica. A escolha da FM ideal pode ser feita rapidamente testando misturas
binárias de solventes do seguinte modo: em uma plaquinha de ccf aplica-se três pontos com a
amostra e espera evaporar o solvente. A seguir, com auxílio de um capilar, dispesar diferentes
FM sobre os pontos e permir que o solvente se espalhe radialmente carreando os
componentes da amostra. Observa-se visualmente a melhor separação como ilustrado na
figura 3.32.

Figura 3.32 - Escolha da Fase Móvel: A) FM fraca, B) FM forte demais, C) FM ideal

5.5.4 – Eluição e Análise


Uma vez que as amostras a serem analisadas forem aplicadas na linha de origem da
placa de ccf como mostr a figura 3.31. A placa é colocada numa cuba contendo a fase móvel e
a mesma é permitida “subir” por capilaridade através da camada de fase estacionária,

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arrastando seletivamente os componentes da amostra. A figura 3.33 ilustra a sequência de


eluição de uma cromatografia em camada fina (ccf).

Figura 3.33 – Ilustração para a eluição de uma placa de ccf.

Após a eluição a placa ccf pode ser visualisada numa câmara sob luz UV ou através de
revelarores químicos, como ilustra a figura 3.34. A migração de cada componente da amostra é
uma característica de sua estrutura e pode ser utilizada como identificação. Esta migração é
quantificada pleo fator de retenção (Rf) que é calculado pela rasão entre a distância de
migração do componente dx pela distância de migração do eluente ds (linha superior mostrada
nas ccf da figura 3.31): Rf=dx/ds. Os componentes da amostra podem então serem
identificados através da comparação dos seus Rf com os de padrões eluídos nas mesmas
condições como ilustra a figura 3.35.

Figura 3.34 – Ilustração de ccf visualisada com revelarores químicos

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Figura 3.35 – Ilustração de uma análise por ccd hipotéticas com a identificação dos
componentes da amostra através da comparação com padrões.

5.7 – CROMATOGRAFIA EM COLUNA

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