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LA ESTABILIDAD GENETICA EN LA MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS

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LA VARIABILIDAD GENÉTICA Y SU DETECCIÓN EN LA MICROPROPAGACIÓN DE PLANTAS

(Revisión Bibliográfica) Acosta Pineda Roberto Carlos.
Biólogo con énfasis en Biotecnología, Especialista en Docencia. Estudiante de Maestría en Biotecnología, Universidad de Córdoba

RESUMEN. La variación somaclonal es la variación genética o epigenética que se genera durante el cultivo in vitro de plantas (cultivos celulares de tejidos u órganos) que provenga de células somáticas. En programas de mejoramiento genético, la variación somaclonal puede constituirse en un recurso importante que genera variabilidad. Sin embargo, durante la micropropagación y en bancos de germoplasma in vitro, este tipo de variación es indeseable. En vista de lo anterior, se han utilizado una serie de técnicas moleculares para su detección que son mucho más precisas que los métodos fenológicos. En esta revisión bibliográfica se presenta una descripción de las causas y consecuencias de la variación genética en la micropropagación de plantas y las técnicas moleculares útiles en la detección de las mismas. Palabras clave: Cultivo de tejidos, marcadores moleculares, mutaciones, variabilidad genética, micropropagación. ABSTRACT. Somaclonal variation is genetic or epigenetic variations generated during in vitro cultivation of plants (cell cultures of tissues or organs) that comes from somatic cells. In breeding programs, somaclonal variation can be an important resource that generates variability. However, during micropropagation and in vitro gene banks, such variation is undesirable. In view of the above, have used a variety of molecular techniques for detection are much more accurate than phenological methods. In this review presents an overview of the causes and consequences of genetic variation in plant micropropagation and molecular techniques useful in detecting them. Key words: Tissue culture, molecular markers, mutations, genetic variability, micropropagation. INTRODUCCIÓN. Uno de los aspectos más relevantes de la micropropagación de plantas es la variabilidad genética que se presenta como consecuencia de múltiples factores inherentes al cultivo in vitro de tejidos vegetales, como lo son el método de cultivo in vitro y patrón de desarrollo, la edad del cultivo, el número de subcultivos, y algunos componentes del medio como los reguladores de

propia de las células vegetales en condiciones normales. N y JIMENEZ. Durante el cultivo in vitro de plantas puede existir una variabilidad genética que surge como consecuencia de las desdiferenciación celular. En ocasiones estos cambios pueden llegar a crear nuevas variedades. ya que la mutación ocasional sólo puede ser detectada tardíamente. et al. Algunos factores externos son: (1) método de cultivo in vitro y patrón de desarrollo. cambios de color o mosaicos (clorosis. En esta revisión bibliográfica se describe en detalle las causas y consecuencias de la variabilidad genética en plantas in vitro y las técnicas moleculares que se utilizan para su detección. En plantas con ciclos de vida largos. et al. Además de la tasa normal de variación. hay factores externos. si el principal objetivo es la propagación clonal in vitro o la transformación. Por otro lado. la formación de embriones y la regeneración de plantas. pigmentación. Las variaciones somaclonales suelen consistir en la aparición de plantas más pequeñas. producción.crecimiento (SANCHEZ. forma o resistencia a enfermedades) o por medio de marcadores bioquímicos y moleculares que son mucho más precisos (SAHIJRAM et al. El comportamiento celular normal es el resultado de una compleja cascada de programas genéticos que son sensibles a la disrupción por estreses bióticos y abióticos. et al. 2007). conocida también como variación somaclonal. 2003). 2009). (2) edad del cultivo y subcultivos. que se manifiestan en el fenotipo. forma de las hojas. y (3) algunos componentes del medio de cultivo. en un órgano y planta intactos. A. puede ser resultado de un cambio en la expresión de los genes. 2002). calidad. Cuando la variación somaclonal es heredable o genética se le asocia con rearreglos cromosomales. 2004). así como en plantas regeneradas de los mismos (MUJIB. juvenilidad más prolongada). 2005). 2004). (CARDONE. formando parte de un tejido. LA VARIABILIDAD GENÉTICA. Esta variación. N y JIMENEZ. La variación somaclonal puede detectarse por cambios fenotípicos visibles (en el vigor. perdida de quimeras). La variación somaclonal es de interés práctico debido a su uso potencial en el mejoramiento de plantas. V. este fenómeno constituye una desventaja para la micropropagación. El cultivo in vitro puede ser muy estresante para las células vegetales e involucra procesos mutagénicos durante el establecimiento del explante. V. propios del cultivo in vitro. (SANCHEZ. M. reversible y no heredable (SMULDERS. la inducción de callo. se refiere a los cambios que ocurren in vitro en el material genético de cultivos celulares. cambios en el hábito de crecimiento (vigor. porte erecto) y cambios en la productividad (esterilidad. se define como la variación fenotípica y genética entre plantas propagadas clonalmente a partir de un clon donador simple (KAEPPLER. 2000). cuando la variación somaclonal es epigenética. durante los estadios de desarrollo del árbol o aun en su descendencia (MEDINA. sin embargo. 2007). deleciones y mutaciones (NORO. este tipo de variación es un fenómeno no deseado (POLANCO y RUIZ. Este fenómeno llamado “variación somaclonal”. 2009) . que pueden inducir acumulación de variaciones genéticas y epigenéticas.. de tejidos y órganos. et al.

(GEORGE 1993. organogénesis y embriogénesis somática). cambios epigenéticos y mutaciones (CARDONE et al. 2001). SAHIJRAM et al. SWARTZ (1991) citado por ALONSO (2002) plantea que las causas de las variaciones producidas en el material cultivado in vitro pueden clasificarse en: • Expresión de variación que existía en los explantes inicialmente. principalmente aquellos con naturaleza auxínica. cruzamientos somáticos y poliploidía o aneuploidía (PINTOS. Por ejemplo. En ese sentido. por ejemplo quimeras debido a la rápida proliferación o a la regeneración adventicia que se produce in vitro. el patrón de desarrollo que sigue un explante durante su morfogénesis in vitro es un elemento clave que se relaciona con la variación somaclonal. La composición del medio de cultivo es otro de los factores que puede inducir variación somaclonal. Cambios genéticos permanentes debidos a un cambio en el DNA heredable como alteraciones mitóticas. axilares y embriones (SAHIJRAM et al. una deficiencia en la oxigenación del callo causa la producción de etanol que puede actuar como mutágeno (CARDONE et al. 2009). V. En otro ejemplo. causando así cambios epigenéticos (RAKOCZYTROJANOWSKA 2002. tensión superficial y daños mecánicos). La variación somaclonal se puede generar en todos los métodos comúnmente empleados para el cultivo in vitro de plantas (cultivo de yemas. Lo anterior probablemente se debe a la acumulación de alteraciones genéticas. (2003) mencionan que la variación somaclonal puede aparecer después de tres a ocho subcultivos. 2003) Asimismo. N y JIMENEZ. Por ejemplo. Edad del cultivo y subcultivos. Se ha encontrado que los reguladores de crecimiento. citado por SANCHEZ. Amarelinho) cultivados en un sistema de inmersión temporal (medio líquido) presentaron tasas mayores de variación somaclonal que en cultivos semisólidos (FEUSER et al. en el caso de diferentes variedades de banano. El estado físico del medio de cultivo (líquido o sólido) también puede influir en la aparición de variantes somaclonales. se puede generar mayor variación somaclonal que cuando ocurre un desarrollo directo hacia regeneración a partir de yemas apicales.). La proporción de variantes somaclonales aumenta en cultivos envejecidos y en plantas con varios subcultivos. 2004). pueden promover la metilación del ADN. Alteraciones temporales en el comportamiento de las plantas por cambios epigenéticos o efectos fisiológicos que están caracterizadas • • . Sin embargo. cuando un tejido altamente diferenciado pasa por una etapa de desdiferenciación con una alta tasa de división celular.El método de cultivo in vitro y el patrón de desarrollo. 2004). ya que un mismo tejido se comporta de diferente manera frente a los factores físicos asociados (oxigenación. El medio de cultivo y sus componentes. se encontró que explantes de piña (Ananas comosus cv. 2003).

los cuales constituyen el tema específico de esta revisión. se amplifican utilizando imprimadores definidos. pero en algunos casos también para el estudio de estabilidad genética en el cultivo de plantas in vitro (PATZAK 2003). Ocurre en un alto porcentaje de las poblaciones propagadas a través de un proceso inducible. tales como estudio del cariotipo (análisis citológico). 2004). son aplicables a cualquier tipo de material vegetal. Para su aplicación. y revelar la ocurrencia de cambios genéticos entre dos o más individuos (AZOFEIFA. 2006) Estos marcadores moleculares son fenotípicamente neutros. que se basan en la presencia de isoformas de enzimas específicas. etc. Los resultados son visualizados como patrones de bandas en un gel. (b) patrones isoenzimáticos. pueden ser evaluados desde los primeros estados de desarrollo de las plántulas. 2007). Los marcadores moleculares basados en ADN se definen como segmentos particulares de ADN que evidencian polimorfismos que puede localizarse en una región codificante o no codificante. las limitaciones de los métodos tradicionales. y un marcador genético como cualquier gen cuya expresión permite un efecto fenotípico que puede ser detectado fácilmente (por ejemplo. o combinando ambos procedimientos (PRADO et al. tamaño. MARTÍN-CUEVAS et al. dirigido y reversible como la habituación o también por el desarrollo de caracteres ontogénicos. pero con diferente estructura molecular (SEO et al. 2008). Marcadores basados en ADN. permiten la identificación correcta de la variedad sin necesidad de muchos caracteres y están libres de los efectos epistáticos (RALLO et al.. y (d) aquellos basados en el ADN (PICCA et al. forma de la hoja.por cambios no heredables en el fenotipo. (2004) clasifica las técnicas basadas en marcadores moleculares de . color de las flores. presentan mayor segregación o polimorfismo que los morfológicos. PICCA et al. (AZOFEIFA. 2002). 2004). Como se mencionó anteriormente. son independientes de la época del año en que se realiza el análisis. los marcadores moleculares se han utilizado principalmente en estudios de diversidad genética. 2006) y que idealmente son representativos a nivel del genoma completo (AGARWAL et al. o bien. ARN o ADN de tamaño o peso molecular conocido que sirve para monitorear o calibrar la separación de las mismas utilizando electroforesis o cromatografía. 2004).. en la gran mayoría de los casos. 2004. que tienen la misma actividad. Por otro lado. un gen que ocasiona resistencia para algún antibiótico). (c) los basados en proteínas de reserva de las semillas (CAMPA et al. MARCADORES MOLECULARES Un marcador se refiere a cualquier molécula de proteína. el ADN extraído es digerido por enzimas específicas. La variación somaclonal puede ser caracterizada por diversos tipos de marcadores: (a) morfológicos. gracias a los avances en la biología molecular se han desarrollado métodos de identificación y caracterización de variantes somaclonales basados en el uso de marcadores moleculares que superan.

Este último tiene mayor resolución. Marcadores basados en hibridación del ADN. Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restriccción o RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) Los RFLPs son polimorfismos entre individuos dados por el tamaño de los fragmentos que son cortados por enzimas de restricción. las cuales cortan en sitios específicos del ADN al reconocer una secuencia particular de cuatro a seis pares de bases. 2004). 2005). en banano. Este proceso es realizado por una enzima ADN polimerasa termoestable (ARAVANOPOULOS 2003. 2001). 2002).ADN de acuerdo con la naturaleza del procedimiento que conllevan en: (1) Marcadores basados en hibridación del ADN. PICCA et al. Si n embargo. Amplificación aleatoria del ADN polimórfico o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) La RAPD consiste en la amplificación de secuencias de ADN con un iniciador de una longitud de diez pares de bases con secuencia aleatoria (decámero). Región amplificada de una secuencia caracterizada o SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) Los SCAR son fragmentos de ADN amplificados por PCR mediante la utilización de imprimadores específicos de 15 a 30 pares de bases. Marcadores moleculares basados en PCR. diseñados de acuerdo con la secuencia obtenida de marcadores RAPD polimórficos que se desea hacer aún más específicos (CHAVES-BEDOYA Y NÚÑEZ 2007). (2) Marcadores basados en la amplificación de ADN por PCR (reacción en cadena de la polimerasa. muchas veces es necesario evaluar gran cantidad de iniciadores antes de encontrar aquellos que son informativos (en algunos casos se han probado más de 8. los fragmentos de ADN son separados según su movilidad electroforética y visualizados en un gel de agarosa o poliacrilamida. por sus siglas en inglés) y (3) Marcadores mixtos que utilizan métodos de hibridación y amplificación.900 iniciadores hasta encontrar la combinación adecuada) (GOSTIMSKY et al. Mediante Southern blot se transfieren los fragmentos de ADN separados según su movilidad electroforética a una membrana y luego se hibridan con sondas específicas marcadas (ARAVANOPOULOS 2003). Por ejemplo. La PCR está basada en la síntesis de millones de copias de un fragmento de ADN comprendido entre secuencias complementarias a dos oligonucleótidos llamados imprimadores (también conocidos como iniciadores o cebadores). y permite determinar los polimorfismos en gran cantidad de muestras (MARTÍN et al. se desarrolló un marcador SCAR específico para la detección de variantes somaclonales . 2004). que se hibridiza con el ADN (ARAÚJO et al. Posteriormente. Diferencias en el patrón de bandas detectadas entre individuos evidencia diferencias en su secuencia de bases (PICCA et al. Esta técnica es simple y efectiva.

por sus siglas en inglés) o con el método SssI metilasa descrito por Schmitt et al. (b) se realiza ligamiento de adaptadores en ambos extremos. En plantas desarrolladas por embriogénesis somática. los productos son separados en un gel de poliacrilamida. el iniciador es marcado con [γ33P] ATP y. como en los RFLPs. posteriormente. 2004) y es altamente reproducible (AZOFEIFA-DELGADO 2006). (JALIGOT et al. diseñados tomando en consideración las secuencias de los sitios de restricción de las enzimas y de los adaptadores empleados (SÁNCHEZTEYER et al. se visualizan en geles de poliacrilamida. Después. 2004) Los niveles de metilación son medidos en columnas de cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa (RP-HPLC. 2003). 2004). primero con una enzima sensible a la presencia de sitios de metilación (HpaII o MspI) y luego con una enzima insensible a la metilación (EcoRI). Esta técnica también se utilizó en papa (Solanum tuberosum) para evaluar plantas micropropagadas (JOYCE y CASSELLS 2002). los fragmentos son ligados a adaptadores en la doble banda y se amplifica la secuencia con imprimadores complementarios a éstos. (1997) y Jaligot et al. Estas secuencias se amplifican por medio de PCR utilizando imprimadores específicos para las . 2004) debido a que: (a) involucra dos enzimas de restricción. microsatélites o SSR (Short Sequence Repeats) Los SSRs son regiones hipervariables que se componen de secuencias de unos pocos pares de bases (uno a cuatro) repe tidas muchas veces. como en los RAPDs. se determinó la variación somaclonal y se detectaron polimorfismos causados por metilación en las secuencias CCG que se relacionan con la producción de órganos florales anormales (Jaligot et al. y (c) ocurre amplificación de segmentos de ADN con imprimadores específicos. Polimorfismo de amplificación sensible a mutilación o MSAP (Methylationsensitive amplification polymorphism) Esta técnica está basada en una doble digestión. Polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados o AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) Esta técnica es considerada como una combinación entre RFLP y PCR (PICCA et al. Los AFLPs presentan un alto poder de detección de variabilidad genética debido a que exploran simultáneamente la presencia o ausencia de sitios de restricción. Secuencias simples repetidas. Este método compara el estatus de metilación de las secuencias CCGG y ha sido usado ampliamente en palma aceitera. Este marcador dominante es una herramienta mucho más poderosa que los RAPDs porque permite amplificar secuencias más largas de oligonucleótidos (lo que incrementa significativamente la especificidad). (2000). y la ocurrencia o no ocurrencia de amplificación. G: guanina). Para asegurar que los fragmentos generados son los sensibles a sitios de fácil metilación CCG (C: citosina. no requiere información previa de la secuencia del ADN (PICCA et al. Marcadores mixtos. 2004).enanos utilizando secuencias previamente identificadas por RAPD (RAMAGE et al. Una vez que los fragmentos han sido amplificados.

por el tamaño de los fragmentos amplificados. que se identifiquen por medio de marcadores moleculares. producto de cambios en la secuencia de ADN de regiones no codificantes. Los STS o STMS (por su nombre en inglés “Sequence Tagged Sites o Sequence Tagged Microsatellite SitesSTMS”) son otro tipo de microsatélite. Sin embargo. Por otro lado. AGARWAL.regiones que flanquean las secuencias repetidas. dependiendo de la técnica utilizada y las enzimas de restricción o cebadores seleccionados. Los STS se diferencian únicamente porque utilizan imprimadores un poco más grandes (alrededor de 20 pares de bases) (PATZAK 2003). o bien. 2002. en consecuencia. pocos autores hacen referencia a su uso con la detección y evaluación de variación somaclonal. Tesis . H. 2008. que producen alteraciones en el fenotipo. hay que considerar que puede dejar variantes sin detectar (falsos negativos). este tipo de cambios no constituye un problema para su actividad. También hay que considerar que la variación somaclonal contempla. también aquellos cambios epigenéticos. La interpretación de los polimorfismos está basada en la variabilidad del número de repe ticiones y. Como se evidencia en el presente trabajo. Debido a que es una técnica relativamente nueva. varias técnicas moleculares se han utilizado para la detección de variantes somaclonales en especies vegetales. N. Esta técnica permite detectar diferencias hasta de una base. Si bien es cierto que la utilización de técnicas moleculares ha demostrado ser útil para la detección de variación somaclonal. que corresponde al mínimo de longitud en un polimorfismo (PICCA et al. hay que tomar en cuenta también que. BIBLIOGRAFÍA. La mayoría de las técnicas descritas anteriormente no permiten discriminar estos variantes. PADH. puede haber variantes somaclonales. por el solo hecho de que no se está estudiando únicamente la región del genoma donde ocurrieron las modificaciones. Biotecnología aplicada a la mejora de Pelagorium. y que podría conllevar al descarte prematuro de plantas fenotípicamente idénticas a las originales. el análisis por medio de técnicas moleculares puede no evidenciar ciertos variantes fenotípicos. 2004). esta técnica requiere de mucho trabajo debido a que se puede analizar sólo un locus a la vez (AZOFEIFADELGADO 2006). ALONSO. es factible la semiautomatización y pueden ser identificados en bases de datos. pero que no tengan ningún efecto sobre el fenotipo. Plant Cell Reports 27: 617-631. Desde el punto de vista comercial enfocada en la micropropagación de plantas. Advances in molecular marker techniques and their applications in plant sciences. Los SSRs tienen ventajas sobre los RAPDs debido a que son codominantes. Los STS siguen los mismos principios que el procedimiento de los SSR. SHRIVASTAVA. Sin embargo. además de los cambios genéticos. detectar variación que no tiene ninguna consecuencia. M. M. al no producir cambios fenotípicos. Es importante considerar que la utilización de las técnicas descritas con anterioridad permite detectar cambios genéticos aun en etapas tempranas de cultivo.

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