CONTROLLO EPIGENETICO

La perdita della membrana nucleare, da parte dello spermatozoo, determina la liberazione del corredo genetico nell’oocita (le membrane nucleari della cellula uovo e spermatozoo sono atipiche, perché non ancorate al citoscheletro). Il nuovo genoma mantiene le informazioni sia materne che paterne.

La blastocisti (2°-3° giorno) è una formazione cava con all’interno cellule in attiva proliferazione; le cellule dell’amnios (che circondano le cellule pluripotenti che daranno origine ai tre foglietti) formeranno la placenta e hanno un elevato rate di mutazioni; ciò può causare diagnosi errata di malattia cromosomica con l’analisi del cariotipo del liquido amniotico, poiché il programma differenziativo dell’amnios e dell’embrione è differente. L’informazione genetica dello zigote è già definitiva, cioè possiede tutte le informazioni che definiscono quello specifico individuo; ma al contempo è presente un programma differenziativo (cascata lineare e progressiva di specializzazione delle cellule in tessuti ed organi differenti; quindi l’embriogenesi è una cascata progressiva di specializzazione delle cellule staminali). Lo sviluppo fetale dipende dal programma differenziativo. La differenziazione origina dai tre foglietti (endoderma, ectoderma, mesoderma) e durante la specializzazione si ha il mantenimento delle cellule non-committed (che sono precursori in grado di riformare il tessuto) e delle cellule committed (cellule specifiche delle differenti linee tissutali). Fino allo stadio di morula, le cellule sono tutte non-committed (ognuna può potenzialmente dare origine a un individuo completo). Durante la differenziazione si assiste ad una restrizione del programma differenziativo (vengono spenti i geni che porterebbero la cellula verso un altro committment).

Le cellule staminali si classificano (in maniera dinamica, non statica) in: - totipotenti (non-committed, possono dare origine all’intero individuo) - pluripotenti (danno origine a tutti i tipi cellulari di un tessuto) - multi potenti (danno origine a tutte le cellule di una linea differenziativa di un tessuto) - progenitrici (committed, cellule differenziate specifiche)

L’embriogenesi è anche una cascata progressiva di accensione e spegnimento di geni secondo un piano prestabilito. Il programma differenziativo dipende dall’attivazione dei fattori di trascrizione, che avviene in acuto, in cronico e in accumulo. Il processo di differenziazione è irreversibile: una volta che la cellula diventa parzialmente committed, continuerà lo sviluppo e non potrà ritornare staminale.

TIPOLOGIE DI DIVISIONE CELLULARE NELLE CELLULE STAMINALI

Interazione tra informazione genetica e programma epigenetico.

Il controllo dell’espressione genica si attua mediante le seguenti modificazioni epigenetiche:

Tra i fattori che regolano la cromatina troviamo i cromatine binding factors (trithorax, polycomb) che legano la cromatina e partecipano alla sua modificazione. Le cellule staminali sono le stesse nel corso della vita, ma vengono mutate a seconda dell’ambiente in cui io vivo. Inoltre, negli anziani viene persa l’attività telomerasica (che è valida nelle cellule tumorali e nelle staminali “giovani”). Le modificazioni epigenetiche fanno rilassare o condensare la cromatina, rendendola più o meno esprimibile; quindi le modificazioni epigenetiche sono: - stabili, perché mantenute tra i cicli di replicazione - modulabili, perché si attua il rimodellamento della cromatina Il programma differenziativo porta al silenziamento genico (spengo le porzioni geniche che non interessano a quella specifica linea differenziativa) tramite deacetilazione degli istoni e metilazione del DNA. Il silenziamento genico è quindi in bilancio tra l’attività di vari enzimi: DNMT (DNA methyl transferase), HDAC (histone deacethylase), HMT (histone methyl transferase), NURF (nucleosomal remodelling factors). Questi processi causano uno stato repressivo ereditabile sul promotore o sulle sequenze codificanti di alcuni geni, causando silenziamento genico. Il silenziamento serve allo sviluppo e la differenziazione. Patologicamente, può essere una delle cause dello sviluppo del cancro.

1) METILAZIONE DEL DNA

La metilazione del DNA causa il silenziamento genico. Dnmt1 mantiene la metilazione del DNA nel tempo (serve quindi a mantenere il programma epigenetico). Dnmt1 mantiene la metilazione utilizzando come stampo il filamento parentale di DNA (metila il filamento figlio in base al filamento padre). Viene ereditato in toto. Dnmt3a/b causano la nuova metilazione (de novo). Metilano il filamento di DNA senza utilizzare un filamento stampo. Viene regolato da fattori trascrizionali. Il DNA all’origine è demetilato. Dnmt3a/b metilano de novo solo quando è necessario il silenziamento, quindi formano un doppio filamento metilato. Con la successiva divisione cellulare, il filamento parentale rimane metilato, mentre quello di nuova sintesi non è metilato. Qui interviene Dnmt1, che metila il filamento figlio utilizzando come stampo il filamento parentale (riportando così il DNA dallo stato emimetilato allo stato totalmente metilato).

La metilazione del genoma avviene su due livelli: - genome wide metilation (metilazione aspecifica di tutta la cromatina) - isole CpG di metilazione (aree del genoma ipermetilate, ricche in CG, chiamate “CpG Island”) I tumori hanno un basso livello di metilazione genome wide (metilazione aspecifica), invece hanno una alta metilazione nelle CpG Island (metilazione specifica). Il tumore è ipermetilato (inibito) in regioni specifiche che guidano il differenziamento; invece è ipometilato (non inibito) nelle regioni che guidano la staminalità. La metilazione comprende sia sequenze codificanti che sequenze non codificanti. Quindi la cellula differenziata è ipermetilata, mentre la cellula staminale è ipometilata. Inoltre il grado di metilazione influisce sulla cinetica di trascrizione; la metilazione del solo promotore non è sufficiente a bloccare totalmente la trascrizione, poichè occorre anche la metilazione di CpG Island a monte. Lo spegnimento genico può avvenire tramite: metilazione del promotore (CpG Island, agisce in cis) o metilazione di una regione enhancer (lontana dal promotore, agisce in trans).

PATTERN DI METILAZIONE DEL DNA

2) CODICE ISTONICO Gli istoni, le proteine che compongono il nucleosoma, hanno due domini funzionali: - dominio che lega il DNA, permettendone il compattamento - dominio che lega gli altri istoni, permettendo la formazione del nucleosoma. Questa regione responsabile del compattamento è a livello delle code, e quindi agendo su di esse (acetilazione, metilazione, fosforilazion) causo una variazione di conformazione che permette di compattare o aprire il nucleosoma, modificando l’espressione genica di quel tratto. Il nucleosoma è quindi formato da otto istoni (2 x H2A, 2 x H2B, 2 x H3, 2 x H4), e a cause delle modifiche sulla coda può assumere una conformazione più compatta (DNA non attaccabile dai fattori di trascrizione) o più rilassata (DNA attaccabile dai fattori di trascrizione). Gli aminoacidi terminali degli istoni, soprattutto quelli localizzati nella coda aminica, sono soggetti a varie modifiche post-traduzionali (tra cui metilazione, acetilazione, fosforilazione, ubiquitinazione, sumorilazione, citrullinazione e ADP-ribosilazione).

Il controllo epigenetico viene ereditato, e permette l’espressione solo dei geni necessari in quel luogo e in quel momento (il controllo epigenetico determina le differenziazioni tissutali, tramite la regolazione sui fattori di trascrizione). Ad esempio, le Dnmt per la metilazione richiedono altre proteine che mantengano o alterino il controllo epigenetico.

Meccanismo molecolare per il rilassamento della cromatina (metilation switch).

Silenziamento genico tramite metilazione del DNA e modificazioni istoniche.

3) ORGANIZZAZIONE DEI NUCLEOSOMI E CROMATINA

4) TELOMERI I telomeri sono sistemi di protezione, specie-specifici. Una cellula differenziata perde la sua attività telomerasica, mentre una cellula staminale conserva attività telomerasica. I tumori si comportano in parte come cellule staminali, perché proliferano, e in parte come cellule differenziate, perché la proliferazione è specifica per una linea differenziativa, comportandosi come dei neo-organi. L’attività telomerasica varia durante la vita.

5) MICRO RNA Meccanismi di espressione di miRNA intronici ed esonici.

Attività dei miRNA.

I miRNA sono modulatori epigenetici: regolano funzioni complesse ed hanno molti target. Generalmente hanno un effetto inibitorio in trans (degradazione dell’mRNA o inibizione della sintesi proteina), che si manifesta fenotipicamente come l’inibizione di una funzione (gene suppressors) o l’attivazione di una funzione (gene activators) (per inibizione di un inibitore).

I miRNA sono importanti anche nella cancerogenesi (la loro attività può essere simile a quella di un oncogene o di un oncosoppressore).

QUADRO RIASSUNTIVO DELLE MODIFICAZIONI EPIGENETICHE

QUADRO PROSPETTICO DELLE PRINCIPALI MODIFICAZIONI EPIGENETICHE

INDIVIDUALITA’ E SVILUPPO L’espressione genica dipende dal rapporto tra cromatina aperta (non metilata, esprimibile) e cromatina compattata (metilata, non esprimibile). Il programma epigenetico dura per tutta la vita del soggetto. Il grado di metilazione (cioè la capacità di non trascrivere quel gene) determina la progressione verso lo sviluppo embrionale (le cellule durante lo sviluppo sono sempre più metilate e esprimono sempre meno genoma).

Prima della fecondazione, sia la cellula uovo che lo spermatozoo sono ipermetilati, perché il genoma deve solo essere trasportato e non espresso (il grado di metilazione nello spermatozoo è maggiore). Con la fecondazione, si ha la fusione del pronucleo maschile con il pronucleo femminile; l’mRNA della cellula uovo innesca la replicazione, poiché lo spermatozoo non ha citoplasma né mitocondri. Nel momento della fusione dei due pronuclei, ognuno ha la propria individualità, e si forma un nuovo individuo (nuovo equilibrio) dalla fusione di due individualità. Dopo la fecondazione si verifica, quantitativamente, un’ondata di demetilazione (si ha un minore quantitativo di nucleotidi metilati); ma la demetilazione è un processo passivo, e avviene perché non sono presenti enzimi che mantengono lo stato di metilazione (cioè non sono presenti Dnmt1, che metilano il filamento figlio partendo dallo stampo del filamento parentale). Quindi, con la fusione del genoma, entrambi i filamenti sono metilati; dopo la prima mitosi, i filamenti figli non acquisiscono lo stato di metilazione, e quindi la quantità totale di filamenti metilati si dimezza; e così via per i successivi cicli mitotici (gli unici filamenti metilati sono quelli originari dello spermatozoo e della cellula uovo). Questi fenomeni corrispondono all’onda di demetilazione, che si verifica dallo stadio di zigote (1 cellula) allo stadio di morula (8 cellule, 1-3 giorni). Successivamente, la morula esprime Dnmt1, e quindi si ha una ondata di rimetilazione verso la blastocisti. Ciò ha due importanti correlazioni funzionali: - tra zigote e morula, non è espressa Dnmt1, le cellule si demetilano, quindi staminali totipotenti - tra morula e blastocisti, è espressa Dnmt1, le cellule si rimetilano, quindi staminali pluripotenti All’interno della blastocisti, ci sono due tipologie cellulari differenti (con programmi epigenetici differenti): cellule esterne del blastocele (daranno origine a placenta e annessi) e cellule interne del cumulus (daranno origine all’embrione). All’interno del cumulus, le cellule prenderanno il commitment per uno dei tre foglietti embrionali di sviluppo tissutale. Il differente programma

epigenetico (differente grado di metilazione) è correlato alla funzione: le cellule del blastocele che danno vita all’amnios e ai villi coriali necessitano di alto rate proliferativo, e quindi sono soggette a scarso controllo genetico. Quindi l’amniocentesi è puramente un’analisi statistica: la linea cellulare è diversa da quella del feto, e quindi eventuali anomalie dell’amnios non sono necessariamente correlate ad anomalie del feto. Zigote => (demetilazione) => morula => (rimetilazione) => blastocisti L’onda di demetilazione (replicazione cellulare verso la morula) è stimolata dallo spermatozoo. Il DNA dello spermatozoo non è legato ad istoni, ma a protammine, che bloccano il DNA dello spermatozoo. Dopo la formazione del nuovo nucleo si ha (per attività proteasica) la degradazione delle protammine. Ciò lascia libero il DNA dello spermatozoo, che si riassembla con istoni; inizia la duplicazione cellulare, e quindi inizia l’onda di demetilazione (il genoma paterno trascina il genoma materno). Nell’onda di demetilazione, il DNA paterno è demetilato subito, mentre quello materno successivamente e più lentamente. Quando, appena prima dello stadio di morula (la morula rappresenta il picco di demetilazione), si riattivano Dnmt1 e Dnmt3a/b, ricomincia la metilazione.

IMPRINTING GENOMICO espressione genetica dipndente dall’origine gametica

Quando avviene la fusione dei due pronuclei avvengono il crossing over e la cancellazione dei geni imprinted dello spermatozoo e della cellula uovo. Durante la gametogenesi, i marcatori di imprinting sono cancellati; altri marcatori agiranno dopo la fecondazione. Quindi all’individualità genetica (crossing over) si aggiunge l’individualità epigenetica (nella gametogenesi c’è cancellazione dell’imprinting materno e paterno, con formazione di un nuovo imprinting individuo-specifico). Dall’unione dei gameti, dopo qualche ora ho la cancellazione dell’assetto di imprinting paterno e poi di quello materno; viene mantenuta una qualche differenza paterno/materno (posso sempre distinguere il gene paterno dal gene materno), ma il nuovo imprinting dell’embrione è differente da quello dei genitori, e viene mantenuto per tutta la vita. Ci sono molti parallelismi tra l’epigenetica dell’imprinting e l’inattivazione del cromosoma X.

Ci sono 100 geni imprinted, raggruppati in cluster, ognuno dei quali è controllato da ICR (regione di controllo sull’imprinting), tramite azione in cis. Le malattie da imprinting si possono manifestare in base all’origine dell’allele mutato (s. di Angelman VS s. di Prader-Willi). Patologie correlate ad imprinting: s. di Beckwith-Wiedemann (ipercrescita, macroglossia, difetti della parete addominale, emi-ipertrofia, ipoglicemia, tumori), s. di Prader-Willi, s. di Angelman, s. di SilverRussell (ritardo di crescita, asimmetria corporea, dismorfismo), m. di Wilms (nefroblastoma), diabete mellito parossistico neonatale, paraganglioma familiare, (s. di Turner). Malattie complesse con manifestazioni dipendenti dai genitori: asma, autismo, s. di Tourette, psoriasi, diabete tipo1, diabete tipo2, alcolismo, m. di Alzheimer, bipolarismo, schizofrenia.

ICR (regioni di controllo dell’imprinting) Le ICR sono regioni di DNA di 1-2 kb, ricche in CG. Le ICR esibiscono modificazioni istoniche e metilazione del DNA allele-specifico. Si dividono in: - ICR metilati durante l’oogenesi, sul cromosoma di origine materna. La maggioranza delle ICR vengono metilate nella linea germinativa materna, e sono spesso promotori per trascritti il cui prodotto è associato alla repressione locale - ICR metilati durante la spermatogenesi, sul cromosoma di origine paterna.

Il programma epigenetico è attivo dalle prime fasi della fecondazione: ogni cellula della morula ha un suo programma specifico e definito. Nella morula, infatti, viene espressa Dnmt (traslocata dal citoplasma al nucleo). L’orientamento spaziale delle cellula è responsabile dei differenti pattern di metilazione del DNA, che condurrà a specificità tissutali diverse.

MODELLI DI PROGRAMMAZIONE EPIGENETICA Il programma epigenetico si esplica a partire dallo zigote, e da qui si passa a genomi sempre più ristretti nell’espressione (tramite metilazione, acetilazione,...); le modifiche epigenetiche sono fondamentali per la differenziazione. Il programma epigenetico deve sia permettere il differenziamento (embriogenesi) sia mantenere un reservoir di cellule staminali nell’adulto. Ci sono tre modelli di funzionamento (nessuno esclude l’altro, sono evoluzioni dello stesso concetto): 1) MODELLO DI ATTIVAZIONE GERARCHICA Ogni fase dipende da fattori a monte che inducono quella fase. I segnali sono interni (accensione di geni) o esterni (fattori di crescita paracrini). Secondo questo tipo di controllo, non tutti i geni sono sotto crontrollo epigenetico.

2) MODELLO DELL’ACCESSIVITA’ GLOBALE Il genoma inizialmente è demetilato, poi va incontro a metilazione. Ma questo modello non tiene conto dell’esistenza dei geni strutturali (che non possono essere metilati in modo specifico, poichè non contengono CpG Island). I geni strutturali non vengono metilati perchè le ICR e le CpG Island permettono di distinguere quali geni vanno metilati e quali non vanno metilati: i geni strutturali mancano di CpG Island e hanno poche binding protein nel promotore; sono quindi geni housekeeping (vengono sempre trascritti, perchè sono strutturali, e quindi non devono essere downregolati).

3) MODELLO “MARKING LOCALISED” Le modificazioni epigenetiche sono considerate in modo regionale; vi sono regioni “marcatori” controllate dal programma epigenetico. Il programma epigenetico controlla quindi regioni, non singoli geni, tramite gli ETCM (early transcription competence marks).

COMPLESSO POLYCOMB (controllore del controllore) Le proteine del complesso Polycomb (PRC) permettono l’aggancio dei fattori epigenetici (Dnmt). La metilazione controlla l’espressione, e il complesso Polycomb controlla (permette) la metilazione. Quindi il complesso Polycomb controlla il legame alla cromatina delle proteine che modificano la cromatina; permette l’ingresso nel committment, regolando l’ingresso nelle varie linee differenziative. Silenziamento genico tramite il complesso Polycomb.

Polycomb permette di modificare l’espressione genica durante la differenziazione.

Il programma epigenetico è continuo (da pochi minuti dopo la fecondazione alla morte). Con l’età, il numero di cellule staminali midollari diminuisce, poichè queste si evolvono con l’individuo (il numero di cellule staminali in proliferazione asimmetrica è maggiore di quelle in proliferazione simmetrica; inoltre nell’adulto diminuisce l’attività telomerasica). Le modifiche epigenetiche permettono l’adattamento all’ambiente (perchè sono influenzate dall’ambiente). L’adattamento all’ambiente si attua quindi in due modi: - modificazioni a livello organico (immediate,) (vasodilatazione o vasocostrizione) - modificazioni epigenetiche (ereditate, mantenute nel tempo) Genotipo => (sviluppo embriogenico: fattori ambientali uterini vs fattori intrinseci) => Epigenotipo1 => (mantenimento dell’epigenoma: fattori ambientali esterni vs fattori intrinseci) => Epigenotipo2 => Epigenotipo3 => Epigenotipo4. Il fenotipo cambia in modo continuo (i fattori ambientali, uterini o postnatali, danno la possibilità di modificare il fenotipo, modificando tramite modifiche epigenetiche le cellule staminali dell’individuo).

SVILUPPO E INVECCHIAMENTO La metilazione della cromatina è correlata alla conservazione della memoria. Nell’Alzheimer si hanno aree modificate di metilazione sull’ippocampo, che modificano la via di trasmissione della LTP (long term potentiation). L’ac. valproico è un demetilante, e viene utilizzato per il trattamento della schizofrenia. Quindi anche la plasticità sinaptica, la formazione della memoria e l’allenamento dipendono da modificazioni epigenetiche. L’invecchiamento è un processo passivo che accade per il completamento naturale del programma attivo epigenetico. I cambiamenti epigenetici modificano lo sviluppo embrionale e morfologico dell’organismo. L’invecchiamento delle cellule staminali è associato ad una riduzione nell’attività telomerasica (anche le sindromi da invecchiamento precoce sono associate a riduzione dell’attività telomerasica), mentre il cancro è associato a un aumento dell’attività telomerasica. Lo stress, il fumo e l’obesità contribuiscono a una riduzione dell’attività. L’invecchiamento dell’individuo non è determinato dall’invecchiamento fisico del tessuto, ma è dovuto alla deplezione delle cellule staminali.

CORRELAZIONI TRA STAMINALI, STRESS, INVECCHIAMENTO E CANCRO

STRESS Topine gravide furono sottoposte a stress, e quindi dopo la nascita i topini furono sottoposti a deficit di cure materne. I topolini della prima generazione, stressati dalla nascita, avevano ipermetilazione del promotore del gene per i glucocorticoidi nell’ipotalamo (minore produzione di cortisolo, per diminuire la reazione di lotta-fuga, che altrimenti sarebbe costante e mortale). I topolini della seconda generazione, non sottoposti a stress, mantengono il programma epigenetico di metilazione del promotore, e hanno quindi una maggiore soglia allo stress (non sanno rispondere normalmente a stress normali, perchè i genitori sono stati abituati a vivere a livelli di stress più elevati). In un altro esperimento, la madre fu sottoposta a malnutrizione, e i figli andavano incontro a obesità e diabete con maggiore frequenza.

Visto che il silenziamento epigenetico (metilazione) dipende dalla disponibilità di metili, è influenzato dalla presenza di donatori di metili (ac. folico, metionina, serina, colina). Somministrando folati in gravidanza riduco l’incidenza della spina bifida nel nascituro, ma dopo 10-15 anni aumentano i rischi di carcinoma per la madre. L’esistenza di questi “epialleli metastabili” (alleli il cui fenotipo dipende dallo stato di metilazione del genotipo) è stata dimostrata nei topi, in cui un’alimentazione privata o supplemetata di metili influisce sul colore della pelliccia. I gemelli monoclonali condividono lo stesso genotipo (derivano dallo stesso zigote), ma il loro fenotipo (ad es: incidenza di malattia) è differente poichè hanno diverse modifiche epigenetiche.