23/11/2009

ELETROFORESE

CONCEITO:

É uma técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função de aplicação de um campo elétrico. É a migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico. É uma técnica laboratorial de separação de frações de proteínas, enzimas, DNA e RNA.

Unidade II

HISTÓRICO

Técnica de eletroforese

A eletroforese de proteínas foi realizada pela primeira vez em 1937 (Arne Tiselius).

“Eletroforese livre”: soro sanguíneo em cinco frações protéicas principais; Prêmio Nobel: 1948

Separação de material orgânico que apresentam cargas elétricas definidas em pH específicos
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Atualmente é utilizadas em vários setores: químicos, bioquímicos, industrias farmacêuticas, ciência forense, etc.

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Cuba eletroforética; Eletrodos (pólos positivos e negativos); Solução tampão: pH específico Suporte para eletroforese; Amostra a ser investigada.

Princípios da eletroforese
 

Composição dos aminoácidos

Conhecimento da química das proteínas Fatores que determinam a sua migração eletroforética.

Um aminoácido é composto por um grupo amino(NH3) e um grupo carboxil (COOH), ligados a um átomo de carbono. Um grupo “R”, também ligado a este átomo de carbono,(dependendo da composição do grupo R), formam diferentes tipos de aminoácidos.

Aminoácidos (seqüência caracteriza suas propriedades básicas)

São eletrólitos e carregam uma carga positiva(+) ou negativa (-) : em uma solução tamponada e dependendo do pH do meio.

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23/11/2009 Cargas dos aminoácidos  Ponto isoelétrico (pI)  Meio alcalino (pH > 7): – negativamente carregados por se comportarem como um ácido. – positivamente carregados por se comportarem como uma base. aplicando uma carga elétrica aos mesmos. tem mais cargas negativas.  Solução neutra: – pI baixo: indica que a proteína ou o aminoácido. Estado de equilíbrio formando íon dipolar ( negativas e positivas ao mesmo tempo) Estruturas das proteínas A estrutura das proteínas depende da ligação de seus aminoácidos formadores:     Utilização da eletroforese  Estrutura primária ( carboxil de um aa+ amino do outro aa) Estrutura secundária ( cadeia de aa se dobra:helicóide)  Emprega-se uma corrente contínua para separar os componente do sangue. terc)  Eletroforese de hemoglobinas Eletroforese de proteínas 2 .  Meio ácido (pH < 7) – É a denominação que se dá a um estado do aminoácido em que suas cargas positivas e negativas estão em equilíbrio. urina. líquor e outras soluções. Componentes com pouca ou nenhuma carga ? Estrutura terciária (forma helicoidal se torna globular) Estrutura quaternária (junção de subunidades de est. Quanto maior a carga maior será a velocidade com que se moverá uma substância em relação a outra que possui menor carga.

Vantagens: – Alto grau de definição analítica das frações separadas. O tamanho do poro do gel é controlado pelo grau de pureza do amido. hemoglobinas.23/11/2009 Suportes utilizados em eletroforese       Acetato de celulose Gel de agarose Gel de amido Gel de poliacrilamida Focalização isoelétrica Eletroforese capilar Acetato de celulose    Gel de àgar (agarose)  Kohn. enzimas. 1957 É um meio de fracionamento de substâncias que se processa com ligeireza e eficiência Vantagens: –  – – – A absorção das substâncias analizadas se processa homogeneamente (microporosidade e composição química relativamente pura) Fracionamento rápido Aplicação de pequenas quantidades de amostra transparentização  Polissacarídeo (paredes celulares de algas marinhas) Consistência na forma simplificada é considerada firme a partir de concentrações de 1 Vantagens: – – – Facilidade de manuseio Conservação ideal Baixo custo operacional Gel de àgar (agarose)  Gel de Amido    Tipos: – – Ágar especial Agarose Fracionamento de proteínas séricas Superior ao obtido no acetato de celulose  Utilização do gel de agarose: – –   Smithies. Desvantagens: – Dificuldade na preparação do gel (tempo X material) – Tempo de migração excessiva (12 a 16 h) – Dificuldade na coloração das frações separdas 3 . 1955 Análises de ptnas.

1959 Separação de macromoléculas Produto de polimerização da acrilamida e da metilenibisacrilamida Confeccionamento do gel: – – Tubos (géis cilindricos) Placas de vidro (géis em placa) 4 .23/11/2009 Gel de Poliacrilamida     Raymond e Wintraub.

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