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TP d’histologie La méthode peut prendre entre 10 jours et 15 minutes.

But de la méthode : Débiter en coupe mince (5 à 6 m) un tissu, un organe, de le colorer et qu’il résiste des dizaines d’années. Les différentes étapes : • Fixation • Rinçage • Inclusion • Coupe • Coloration • Montage La fixation Le tissu doit être le plus frais possible. Il peut venir de l’abattoir. On doit d’abord tuer les cellules en appliquant une coagulation irréversible du cytoplasme. Ainsi, on empêche l’autolyse et la décomposition post-mortem. Pour que le fixateur agisse correctement sur l’ensemble du tissu, celui-ci ne doit pas excéder les 10mm de diamètre. Les différents fixateurs : Ethanol 96% Mais il provoque une brusque déshydratation du tissu entraînant des artéfacts. Formol Il s’agit de formaldéhyde qui peut être pur : 40% ou bien à 10%. Il pénètre vite et bien dans le tissu mais il a tendance à durcir ce dernier, qui sera alors plus dur à couper. Acide picrique Il s’agit de poudre jaune explosive qui est diluée dans de l’eau picriquée saturée. Les protéines précipitent alors sous forme de picrate. La coloration sera, par la suite, très bonne mais ce fixateur ne convient pas pour tous les tissus qui ont alors tendance a gonfler (surtout quand il présente beaucoup de collagène) Acide acétique glacial Il est utilisé pur, à 100% (dans le vinaigre, il est a 80%). Il est très bon pour les structures nucléaires mais il a tendance à détruire ces structures si on le laisse agir trop longtemps. Tétroxyde d’osmium (OsO4) Il est très bon pour tous les systèmes membranaires mais coûte très cher et est très toxique

Dans la pratique, on mélange ces différents fixateurs pour obtenir par exemple le liquide de Bouin de couleur jaune :

- 75 mL d’eau picriquée saturée - 25 mL de formol 40% - 5 mL d’acide acétique glacial Mais ce liquide lyse beaucoup de globules rouges et a tendance à faire gonfler le collagène. Attention, la fixation n’est pas éternelle, à l’exception du formol qui est également un conservateur. Le temps de la fixation varie en fonction de la taille de la pièce : - 5 mm de diamètre : 24heures de fixation - 2 cm « 3 jours « Si la pièce est plus grosse, après quelques heures dans le fixateur, on fait une incision dans le tissu pour que le fixateur rentre aussi par l’intérieur. Le rinçage On sort la pièce du fixateur puis on la baigne dans du carbonate de lithium pour enlever la coloration jaune s’il y a lieu. Sinon, pour un fixateur comme l’acide picrique, on passe juste la pièce sous l’eau courante. L’inclusion On inclut ensuite la pièce dans de la paraffine, substance à la fois dure et molle, ou bien dans du cellomidine, de la gélatine, ou encore de la résine hypoxie, substance beaucoup plus dure, utilisée pour des coupes très minces. Il faut d’abord déshydrater le tissu car la paraffine est très hydrophobe. On utilise pour cela des alcools de degré croissant : 40% puis 90% et enfin l’alcool absolu. Mais la paraffine n’est pas non plus miscible avec l’alcool. Il faut donc laver le tissu. On le plonge alors dans trois bains successifs de 24h d’hydrocarbures benzéniques (qui peuvent causer les leucémies). On peut également utiliser le butanol, qui a pour avantage de finir une déshydratation, qui aurait été mal faite. Le butanol est pourtant un alcool, mais il se mélange très bien avec la paraffine. On place ensuite la pièce déshydratée dans trois bains de paraffine liquide, en étuve, à 58 ou 60°C, pendant trois fois 24h. Puis on coule la pièce dans de la paraffine liquide qui va se solidifier. La pièce est conservable ainsi pendant des siècles. La coupe On utilise un appareil très lourd et très coûteux : un microtome. On récupère ensuite la coupe que l’on place sur une lame de verre. L’adhésion doit être bonne. On peut utiliser divers liquide pour la faciliter, puis on laisse sécher. La coloration Si on ne colore pas, on ne peut rien observer du tout. Il existe différents types de coloration : 1/ La coloration topographique : trichrome de Masson

2/ La coloration histochimique : APS = Acide périodique réactif de Schiff 1/ La coloration topographique Elle fait appel à des colorants à base d’eau. • Il faut d’abord enlever la paraffine, sinon, le colorant ne peut pas entrer dans le tissu. On utilise donc trois bains de toluol de 5 minutes. On réhydrate la coupe avec des bains d’alcool décroissants : 100%, 90% et 70% puis un bain d’eau distillée. Le 1er colorant, basique, l’hématoxyline, colore tout ce qui est acide, comme le noyau, en bleu foncé : 5 minutes On lave a l’eau courante (si elle est basique) pour renforcer la coloration qui deviendra bleue/noire. Le 2ème colorant, acide, la fuscine Ponceau, colore quasi toutes les protéines, en rose pour le cytoplasme, en rouge pour la kératine par exemple. 5 minutes. On rince ensuite à l’eau acidifiée, c'est-à-dire de l’eau distillée avec 1% d’acide acétique. On effectue un 2ème rinçage à l’eau acidifiée. On plonge la coupe dans un mélange : orange G (colorant acide qui se fixe sur les globules rouges et les colore en orange) / acide phosphomolibdique (qui annule l’effet de la fuscine ponceau au niveau du tissu conjonctif et rend le collagène et l’élastine transparente) : 5 minutes On rince deux fois la coupe à l’eau acidifiée. 3ème colorant, le vert lumière, se fixe au conjonctif, surtout le collagène et le colore en vert : 5 minutes. On rince deux fois la coupe à l’eau acidifiée et on peut l’y laisser 2heures.

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2/ La coloration histochimique : APS Elle met en évidence les glucides en général, mais sans précision. Les deux 1ères étapes de cette coloration sont identiques à la précédente. • Il faut d’abord enlever la paraffine, sinon, le colorant ne peut pas entrer dans le tissu. On utilise donc trois bains de toluol de 5 minutes.

On réhydrate la coupe avec des bains d’alcool décroissants : 100%, 90% et 70% puis un bain d’eau distillée. On plonge la coupe dans un bain d’acide périodique (Hi O4). Il va se produire une oxydation modérée entraînant la formation d’aldéhydes à partir d’hydroxydes : 5 à 10 minutes. On lave la coupe à l’eau du robinet. On la plonge dans du réactif de Schiff où la fuscine est décolorée par le dioxyde de souffre. Dès 10 minutes, les aldéhydes sont révélés en rouge magenta : 20 minutes On rince à l’eau distillée puis à l’eau du robinet Pour voir les noyaux, on effectue une contre coloration, avec l’hématoxine, ce qui permet de mieux discerner les cellules. On rince à l’eau courante.

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Le montage Pour éviter que la coupe ne s’abîme, on va la protéger par une lamelle qui sera collée grâce à un baume synthétique. Mais ce dernier n’est pas miscible à l’eau. Il faut donc de nouveau déshydrater la coupe. Mais cette fois-ci, on la baignera rapidement dans deux bains successifs d’alcool à 100% pour éviter que le vert lumière ne diffuse. On baignera ensuite la coupe dans un bain de toluol, miscible au baume synthétique. La coupe est maintenant prête à être montée : On pose une lamelle sur la table, on y dépose au centre une goutte de baume et on applique délicatement la lame avec la préparation dessus. Une fois collée, on retourne rapidement la lame et on vérifie qu’il n’y ait pas de bulles. Dans le cas contraire, on écrase un peu la lamelle pour faire échapper l’air qui se trouve en dessous. Enfin, on place le tout en étuve pendant 24 heures.