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CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

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CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA

OBJETIVOS:
‡ Conocer la cromatografía en columna como técnica de separación de mezclas de sustancias, sus características y los factores que en ella intervienen. ‡ Utilizar la cromatografía en columna para la purificación de una sustancia contaminada con un colorante. ‡ Controlar con cromatografía en capa fina el proceso de separación de mezclas por cromatografía en columna

FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía es la técnica que valga la redundancia agrupa una serie de técnicas que permiten analizar, purificar o separar una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (liquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser sólida o líquida, por lo que es uno de los métodos más eficientes y más utilizados actualmente en los laboratorios de química. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía. Es difícil definir rigurosamente el término de cromatografía, ya que se ha aplicado ese nombre a varios sistemas y técnicas. Sin embargo, todos esos métodos tienen en común el uso de una fase estacionaria y una fase móvil. Sin embargo este nombre proviene de la primera experiencia cromatográfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas. La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett en 1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta 1930 cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como adsorbentes alúmina y carbonato de calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el verdadero desarrollo de la cromatografía. Para explicar el fenómeno cromatográfico es necesario establecer dos tipos de fundamento, uno remoto y otro próximo:

Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos en sólidos finamente divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en cromatografía liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si. - El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo más completo posible.

Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico - químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica.

Así. Por la parte superior se introduce la sustancia a separar disuelta adecuadamente. Se realiza generalmente en columna (también es posible en capa fina). El sistema es bañado por un solvente que fluye a través de la columna para comprobar el funcionamiento de la misma. se tiene la realidad del fenómeno cromatográfico. Los adsorbentes más utilizados. auténticos instrumentos. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan so ³movilidad´ entre si y con respecto a la fase móvil. por tanto. Los eluatos son recogidos para su determinación posterior. lo que conduce a los tipos de cromatografias Forma de realizar el proceso cromatográfico. la cromatografía no conlleva a un sistema de detección. lo que constituye las distintas técnicas cromatográficas Tipos de cromatografías: Si es un sólido. La base de la separación cromatográfica será. que se rellena de un adsorbente adecuado.Si se transforma la idea del equilibrio estático establecido entra las dos fases en un equilibrio dinámico. que permanece inmóvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases cromatográficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La elección de una técnica cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y cantidad de la muestra. Las separaciones se basan en las diferencias de distribución de los solutos entre el adsorbente (fase estacionaria) y el disolvente (fase móvil) de acuerdo con sus respectivas isotermas de adsorción. normalmente por un método espectroscópico (espectrofotometría. De hecho las técnicas de separación suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. al menos en una extensión esta en equilibrio con la fase móvil. mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva incorporado dicho sistema siendo. fluye a través de la otra. del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible Puede hacerse una primera distinción entra las técnicas cromatográficas atendiendo a la integración continua o no del sistema de detección. por tanto. Se deja fluir por la columna. Como se ha indicado anteriormente. es decir. ordenados de mayor a menor actividad son: ‡ Alúmina ‡ Sílice ‡ Carbonato cálcico . una de las fases. sufriendo durante su arrastre interacciones de polaridad con el sólido adsorbente. y que. denominada fase móvil. cabe distinguir entre:  Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals). Clasificaciones: Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos criterios básicos: Fundamento del proceso cromatográfico. Antes de que ésta quede totalmente seca se incorporan los disolventes de acuerdo con la solubilidad de las sustancias. espectrofluorimetría). La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. la diferencia en la velocidad de migración de los mismos. a la que se denomina fase estacionaria.

nucleótidos y. Existen dos clases principales de soportes (cambiadores). Por lo tanto las moléculas se eluyen por su tamaño decreciente. en general. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. también llamada de filtración en gel o cromatografía de permeación en gel. carboxilo y sulfónico se utilizan como cambiadores catiónicos.  Cromatografía de exclusión (o de geles). ‡ Aniónicos: con grupos positivos y que intercambian iones negativos. Es una técnica reproducible. Este tipo de cromatografía se usa para la separación de aminoácidos. dependiendo de su naturaleza. etc. se basa en la diferencia de penetración de las moléculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separación obtenida depende del tamaño de la molécula. se utilizan para la separación de hemoglobinas. derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. el sólido es un gel formado por polímeros no iónicos porosos que retienen a las moléculas de soluto según su tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. En clínica. isoenzimas. escalable y rápida. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. Cromatografía de cambio iónico o intercambio iónico: El sólido es un cambiador de iones (fuerzas electrostáticas). Los grupos cargados de la matriz insoluble determinan el tipo y la fuerza del cambiador. Cuando la mezcla iónica a separar se pone en contracto con la fase inmóvil. En resumen los factores que determinan la separación de las moléculas son el tamaño del poro. Este tipo de separación por tamaño difiere de las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. se utilizan como cambiadores aniónicos. en condiciones oportunas de fuerza iónica y pH. por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. mecánica y químicamente. péptidos. tener bajo contenido en grupos iónicos. el tamaño de la partícula y el flujo de elución. se produce el intercambio iónico formándose sales y asociaciones iónicas entre la fase estacionaria y la móvil: ‡ Los grupos fenólico. Esta técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. ‡ Los grupos amino. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen. etc. esteroides. El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los mismos. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño.  Cromatografía de afinidad: . para los compuestos que tengan naturaleza iónica. La cromatografía de exclusión. según el tipo de grupos enlazados que posea: ‡ Catiónicos: con grupos cargados negativamente y que intercambian iones del medio con carga positiva. alifático y aromático. de esto se deduce que el volúmen disponible para las moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. La fase cargada inmóvil está inicialmente neutralizada por cationes o aniones (contraiones). Esta cromatografía está basada en las interacciones electrostáticas que se producen entre los grupos ionizables de los productos a separar y los grupos cargados unidos a un soporte inerte (fase estacionaria). uniformidad de poro y tamaño. proteínas. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). derivados de agarosa (Sepharosa).

Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizada. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases. Si es un fluido supercrítico. exclusión. por tanto. avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir. y Cromatografía liquido-sólido (CLS) en la que la fase estacionaria es sólida (adsorción. la técnica cromatográfica correspondiente recibe el nombre de dicha fase móvil: Si es un líquido. El soluto se reparte entra la fase móvil (liquido o gas) y la fase estacionaria. Si es un líquido que se encuentra soportado en un sólido inerte. De esta forma. afinidad). cromatografía de gases. Dependiendo de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros. se trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS). que es una cromatografía de adsorción. y que en este caso es un líquido o mezcla de varios líquidos. se trata de la Cromatografía de partición. sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Si es un gas. que es una cromatografía de partición. y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis.Es un tipo especial de cromatografía de adsorción. lo que provocará su separación. Éste es el principio fundamental de la cromatografía. Es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o cualitativa de análisis. utilizada especialmente en bioquímica. Según la naturaleza de la fase móvil. cabe distinguir: y Cromatografía liquido-liquido (CLL) en la que ambas fases son liquidas y. en la que un sólido tiene enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo. una fija que suele llamarse fase estacionaria. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina. cambio iónica. que puede ser de partición o de adsorción. Para ello un ligando de afinidad se une al soporte de la FE. Los intercambiadores iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa). la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. se trata de una cromatografía de partición. puede ser: y y Cromatografía gas-liquido (CGL). Las sustancias que permanecen más tiempo libre en la fase móvil. Cromatografía en columna: . Una vez concluida la separación hay que provocar la salida de la sustancia que dio la reacción específica. Técnicas cromatográficas: 1. Cromatografía gas-sólido (CGS). un indicador enzimático o un anticuerpo. Un ejemplo notable es la cromatografía de intercambio iónico. pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica). (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura crítica. Cuando la muestra atraviese la columna solo se retendrá la sustancia capaz de reaccionar con dicho ligando. cromatografía liquida. Las columnas más utilizadas son las de sílice. la muestra queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática.

También se denomina el lecho de la columna. Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna.En la cromatografía en columna la separación se consigue haciendo fluir la mezcla a través de una columna de adsorbente. o reparto Fase estacionaria Líquido adsorbido sobre un sólido Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. y pueden ser recogidos en fracciones separadas. Las fases móviles se usan en función de la polaridad de los compuestos a separar. Los compuestos emergen de la columna a tiempos diferentes. Cromatografia plana: La fase estacionaria esta colocada en una superficie plana que en realidad es tridimensional. Adsorción Intercambio iónico Distribución/exclusión Distribución entre un gas y un líquido Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Adsorción Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Líquido-fase unida químicamente. aunque una de sus dimensiones es muy reducida. aunque incorrectamente. Comúnmente se suele usar como adsorbente alúmina o sílice. 2) por capilaridad. longitud de la columna. Clasificación general Cromatografía de líquidos (LC) (fase móvil: líquida) Método específico Líquido-líquido. En una columna cromatográfica se deben tener en cuenta los siguientes términos: y y y y matriz de la columna. 3) por gravedad. Se utiliza un tubo cilíndrico. volumen muerto de la columna. Sólido Resina de intercambio iónico Líquido en los intersticios de un sólido polimérico Líquido adsorbido sobre un sólido Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Sólido Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Tipo de equilibrio Distribución entre liquidos inmiscibles Distribución entre líquido y la superficie enlazada. o adsorción Intercambio iónico Exclusión por tamaño Cromatografía de gases (GC) (fase móvil: gas) Gas-líquido Gas-fase unida químicamente Gas-sólido Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) (fase móvil: fluido supercrítico) Es de destacar que en la actualidad. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. el término de cromatografia en columna suele aplicarse a la cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia plana ya que. Líquido-sólido. El flujo de la fase móvil ( líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue: 1) Por presión. volumen de la columna. Se divide en dos tipos generales: . por lo que puede considerarse bidimendional. obviamente la cromatografia de gases solo puede realizarse en columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. en cuyo interior se coloca la fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil.

una cromatografía se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. ácido silícico u otros. . Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas. por lo que se le considera como la fase polar. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución y evaporando el disolvente. tal como gel de sílica. Después de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Debido a que las distintas moléculas en la muestra presentan diferente coeficiente de reparto. La separación de mezclas de moléculas mediante la cromatografía de capa fina se basa en el principio del reparto entre dos fases. se extiende en una capa delgada sobre una placa. En la cromatografía de capa fina. Luego el disolvente empleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. Al recorrer la placa la fase móvil va arrastrando a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionario dando lugar a la separación. generalmente de vidrio. La gota se deja secar y si se desea poner más muestra se pueden aplicar más gotas. la fase móvil "lavará" a los distintos componentes con diferente eficiencia. alumina. La placa seca se sumerge en un pequeño volumen de fase móvil (mezcla de solventes). En cromatografía de capa fina la fase estacionaria está hidratada. de modo que aquellos que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídos más rápido que los que sean preferencialmente solubles en la fase estacionaria. La placa desarrollada se deja secar y se revela con un reactivo que tiña a las substancias de interés. Un segundo medio(la fase móvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a través de ésta para "lavar"(eluír) a las moléculas en la muestra. cuidando de que la mancha no se haga demasiado grande. Para que adquiera firmeza y no se desmorone. dividida por la distancia recorrida por el frente de solvente al momento de sacar la placa del solvente. la fase estacionaria es una delgada capa de un soporte sólido granulado. entre otras cosas permite: Determinar el grado de pureza de un compuesto Comparar muestras Realizar el seguimiento de una reacción Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en cromatografía de columna. La movilidad relativa o Rf es la relación entre la distancia recorrida por la mancha de un compuesto. aluminio u otro soporte inerte. La polaridad de la mezcla de solventes se elige de acuerdo a la mezcla de compuestos que se desea separar.En general. Esto es. Las muestras se aplican añadiendo pequeñas gotas de solución en un pequeño círculo cerca del extremo inferior de la placa. La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. y Cromatografia en capa fina: en la que un sólido actúa como fase estacionaria (cromatografia de partición). Como sólo la base de la placa queda sumergida. que se depositan sobre una placa de vidrio. Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos ya que pese a no ser una técnica muy potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. el solvente comienza a mojar la fase estacionaria y asciende por capilaridad. la capa de fase estacionaria se aglutina con una pequeña cantidad de sulfato de calcio u otro agente cementante. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección del disolvente y la del papel de filtro. La técnica de cromatografía en capa fina (TLC).y Cromatografia en papel: en la que el papel actúa como soporte de la fase estacionaria (cromatografia de partición). se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil en el fondo.

se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie rígida. o a veces de banda. de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. La separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil. su única función es la de transportar el analito a través de la columna. un sólido. En cromatografía en capa fina. Generalmente. cambio ionico o exclusión. es el mismo para ambas técnicas En la cromatografía plana. Una vez seca la mancha o banda. en cromatografía plana el analito no abandona el lecho cromatográfico. manteniendo todo el sistema cromatográfico en una cámara cerrada. Cromatografia plana: La cromatografia plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria esta extendida sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. la cromatografía será de partición. La fase móvil siempre es un liquido. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. es decir. también existen en el comercio papeles impregnados (v. os años cincuenta per en la actualidad se encuentra practicamante eclipsada debido a la mayor rapidez. sorbente o soporte de la fase estacionaria. Cromatografía de gases Es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. normalmente una capa de vidrio o polietileno. Dependiendo de las características del sólido utilizado. la celulosa actúa como soporte de la fase estacionaria que suele ser agua (cromatografia de partición). mientras que la fase estacionaria puede ser un liquidosoportedo en un sólido (cromatografia de particion) o un sólido sorbente (cromatografia de adsorción. que amplían la aplicabilidad de esta técnica. . En lo que se refiere al fenómeno en que se fundamenta la separación. En esta técnica. la fase móvil no interactúa con las moléculas del analito. cambio ionico o exclusión). Aproximadamente solo el 4% de las publicaciones sobre las distintas técnicas cromatográficas se dedican a la cromatografía en papel. 3. el extremo del plano próximo a la misma se pone en contacto con la fase móvil. a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano.El flujo de la fase móvil puede conseguirse de dos formas: 1) por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente).i. adsorción. con cambiadores ionicos) o tratadas químicamente (v. por lo que ésta siempre es líquida. En la cromatografia plana queda excluido el uso de un gas como fase móvil. La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en. El flujo de la fase móvil se produce: o o Por capilaridad (cromatografia horizontal y ascendente) Por capilaridad y gravedad (cromatografia descendente) Esta clase de cromatografia es considerada la más simple de todas las técnicas cromatograficas. No obstante. la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano que contiene la fase estacionaria en forma de mancha. 2. como gel de sílice o alúmina. grupos cambiadores incorporados al esqueleto polimérico de la celulosa). con silicona para separaciones en fase invertida. Cabe distinguir dos tipos de cromatografia plana: En papel (CP) y en capa fina (CCF). eficacia y versatilidad de la cromatografía en capa fina. A diferencia de los otros tipos de cromatografía.i. difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. a diferencia de la cromatografía en columna. de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado una determinada zona del plano. La diferencia principal con la cromatografia en columna es de tipo técnico.

lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. La GC se lleva a cabo en un cromatógrafo de gases. se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. 4. es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada. y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones. Luego de sembrar la muestra en la parte superior. De esta manera. que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. la cual está rellena con la fase fija. Precisamente este proceso de adsorción. If the red x still appears. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones. Cromatografía de alta perfomance (HPLC) La cromatografía líquida ³clásica´ se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio. Éste consta de diversos componentes como el gas portador. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. and then open the file again. que no es lineal. En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción. ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. siendo esta última la que se utiliza más ampliamente.Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas -sólido (GSC) y la cromatografía gas-líquido (GLC). la columna (generalmente dentro de un horno). Restart y our computer. Your computer may not hav e enough memory to open the image. y ou may hav e to delete the image and then insert it again. . y el detector. nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. or the image may hav e been corrupted. el sistema de inyección de muestra. The image cannot be display ed.

En concreto.5. o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su detección en HPLC. . se aplica a compuestos no volátiles o térmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC. CONCLUSIONES: y Se concluye sabiendo que por medio de la cromatografía es posible identificar de que sustancias está compuesta una mezcla. que combina lo mejor de ambas técnicas. Cromatografía en fluidos supercríticos La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una técnica híbrida entre la cromatografía de gases (GC) y la HPLC. Esta técnica es importante porque permite la separación de mezclas en las que no es adecuada la aplicación de la GC ni de la HPLC.

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