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Aislamiento y cuantificacin de glucgeno

Jess Diez Dapena, Carmen Alicia Padilla Pea, Emilia Martnez Galisteo, Jos Antonio Brcena Ruiz, Concepcin Garca Alfonso
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba

RESUMEN

El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente. Las propiedades fsicas y qumicas de muchos polisacridos neutros difieren lo bastante de las de otras biomolculas, para permitir su fcil aislamiento. El glucgeno se puede liberar del hgado por calentamiento con una base fuerte, hasta la destruccin total del tejido. Al aadir cido tricloroactico al homogeneizado anterior, precipitan numerosas sustancias de peso molecular elevado, como las protenas y los cidos nucleicos, en tanto que el glucgeno continua disuelto. El glucgeno puede separarse de los monosacridos y otros compuestos hidrosolubles por precipitacin con alcohol, porque los polisacridos son mucho menos solubles en alcohol acuoso que los monosacridos. La determinacin del grado de pureza de la preparacin obtenida se puede realizar mediante el tratamiento con antrona y comparando con una solucin estndar de glucgeno. Ttulo corto: Purificacin y cuantificacin de glucgeno. Palabras clave: aislamiento, cuantificacin, glucgeno, pureza. Abreviaturas empleadas. TCA: tricloro actico.

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS El glucgeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hgado y en el msculo representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso hmedo, respectivamente. Est formado por unidades de glucosa unidas por enlaces (1-4) y ramificaciones (1-6) (Figura 1).

HOH2C

HOH2C

H H OH OH H

O H OH

H O

H H OH H

O H OH

H O
Enlace (1,6) H2C
H H O H OH H O

Enlace (1,4)

OH H

Figura 1. Estructura del glucgeno

El glucgeno acta como regulador de la glucosa sangunea, almacenndola como glucgeno durante una buena alimentacin (glucogenognesis) y liberndola por fosforolisis (glucogenolisis) durante el ayuno, ya que en esta situacin no hay absorcin intestinal. La duracin del glucgeno heptico en ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este momento, la concentracin en sangre se mantiene por sntesis de glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos (gluconeognesis) (figura 2). En estos mecanismos de control, actan la adrenalina y el cortisol.
HOH 2C

HOH 2C O H OH H O H H OH H O H OH H O
Fosforilasa

HOH 2C H H OH OH
Pi

HOH 2C

H H OH OH H

O H

H OPO
-2 3

H H OH OH

O H

H O
R

H OH Gluc osa-1-fosfato
-2 OPOH 2C 3
2

H OH Glu cgen o (n-1 residu os)

Glu cgen o (n res idu os)

Fosfogluc omut as a

H H OH OH

O H

H OH

Glu cogenognes is

Glic erol (grasas) Am inocid os (p rotenas) Lactato ( gluc gen o mu scul ar)

H OH Gluc osa-6-fosfato
H 2O Pi Glu coneognesi s Glu cosa-6 fosfat a

HOH 2C H H OH OH H O H OH H OH

Glu cosa

Figura 2. Degradacin del glucgeno

El glucgeno se libera de los tejidos que lo contienen por calentamiento con una base fuerte (KOH) hasta la destruccin total del tejido.

La separacin del glucgeno del tejido se consigue mediante la adicin de etanol (precipita polisacridos y elimina los monosacridos solubles) y sulfato de sodio (coprecipitante). As, se produce un precipitado que contiene una mezcla de glucgeno, protenas y cidos nucleicos, que han resistido el calentamiento anterior. El tratamiento posterior con cido tricloroactico (TCA) hace que precipiten las protenas y cidos nucleicos de la mezcla. El glucgeno aislado se vuelve a precipitar con etanol, obtenindose una preparacin con un alto grado de pureza. El tratamiento con antrona (que contiene (H2SO4) es un mtodo rpido para la determinacin de hexosas y alopentosas constituyentes de un polisacrido. Mediante este mtodo, el glucgeno es hidrolizado por un cido (H2SO4) hasta sus unidades elementales (monosacridos), que pueden ser luego deshidratadas dando furfural, y ste ltimo, reacciona con la antrona y se forma un producto coloreado (azul-verdoso) con un mximo de absorbancia a 620 nm. El valor resultante se compara con los obtenidos al preparar una recta estndar con glucosa pura, usando el mismo mtodo. Los objetivos fundamentales de esta prctica son dos: Extraccin de glucgeno de hgado de cerdo y cuantificacin por pesada y colorimetra. Estimacin del rendimiento de la purificacin del mismo.

2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO 2.1.Equipamiento Bao de agua hirviendo. Bao de hielo y agua del grifo. Centrfuga de mesa. Balanza. Estufa a 35C. Colormetro. Agitador de tubos. 2.2.Material Tubos de vidrio (2,2 x 16 cm; 1,5 x 16 cm) y gradilla. Tubos de centrfuga cnicos de plstico con tapn. Guantes de latex. Pipetas automticas (0,1 y 1,0 mL) (puntas). Pipetas de vidrio (5,0 y 10 mL). Propipeta. Papel de filtro. Pinzas de madera. 2.3.Reactivos Hgado de cerdo troceado. Solucin de hidrxido potsico. Solucin de tricloroactico. Solucin de sulfato de sdio. Etanol.
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Solucin de glucosa . Glucgeno aislado y desecado de hgado de cerdo (apartado 3,1). Solucin de antrona en cido sulfrico. Solucin amortiguadora de fosfato sdico . Agua destilada.

3. PROTOCOLO A REALIZAR 3.1. Aislamiento de glucgeno de hgado de cerdo 3.1.1. Se ponen 3 mL de la solucin de hidrxido potsico al 30% en un tubo de ensayo de vidrio grueso. 3.1.2. Se pesan 4 g de tejido (aproximadamente) y se introducen en el tubo anterior. Anotad el peso exacto. 3.1.3. Se calienta en un bao de agua hirviendo, agitando con cuidado para acelerar el proceso, durante 20 minutos (o hasta su digestin). USAD UN TROZO DE PAPEL HIGINICO O PINZAS DE MADERA PARA MANIPULAR LOS TUBOS. PRECAUCION: ALCALI HIRVIENDO!! 3.1.4. Se enfra el tubo bajo el grifo una vez acabada la digestin. 3.1.5. Una vez enfriado el tubo de ensayo (comprobadlo por contacto con el dorso de la mano), se aaden 0,2 mL de la solucin saturada de Na2SO4 y se mezclan fuertemente. Dejad reposar 5 minutos. 3.1.6. Se precipita el glucgeno que est en solucin por adicin de 7 mL de etanol al 95%. Se agita y deja en fro en un bao de hielo durante 5 minutos. 3.1.7. Se pasa la solucin a tubos de centrfuga cnicos de plstico con tapn, y se centrifuga a la mxima velocidad (5.000 x g) durante 5 minutos. Se desecha el sobrenadante y se coloca el tubo invertido sobre papel de filtro. 3.1.8. Se aaden 5 mL de la solucin de TCA al 10% al tubo y se disuelve totalmente el sedimento agitando fuertemente. 3.1.9. Se centrifuga de nuevo 5 minutos a 5.000 x g. 3.1.10. Se pesa un tubo de centrfuga cnico de plstico vaco y anota el peso. Marcadlo con una seal para su posterior identificacin. 3.1.11. Se aade el sobrenadante obtenido en la ltima centrifugacin a un tubo de ensayo largo, al que previamente se han aadido 10 mL de etanol al 95%, desechando el sedimento de la centrifugacin. Se deja reposar 5 minutos para que se produzca la precipitacin del glucgeno. 3.1.12. Se traslada la solucin al tubo de centrfuga de plstico, previamente pesado, y se centrifuga durante 5 minutos ms a 5.000 x g. 3.1.13. Una vez acabada la centrifugacin se tira el sobrenadante. El sedimento obtenido representa el glucgeno prcticamente exento de sustancias contaminantes. Dejadlo secar en la estufa a 35C hasta su utilizacin.

3.2. Determinacin de la pureza del glucgeno obtenido 3.2.1. Se pesa en la balanza el tubo con el glucgeno desecado, obtenido en la parte anterior, y se anota el resultado.
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3.2.2. Se disuelve este glucgeno a razn de 8 mg de dicho glucgeno por mL de tampn fosfato 0,02 M pH 7,0 que contenga NaCl 0,005 M, (el in que activa la -amilasa). De esta manera queda preparado el glucgeno para las siguientes determinaciones. 3.2.3. Se prepara una dilucin 1/50 del glucgeno disuelto anteriormente (0,1 mL en 5 mL de agua). 3.2.4. Se preparan tres tubos de ensayo como se describe en la Tabla 1:
Tabla 1. Determinacin de la pureza del glucgeno A B Tubo (n) Glucosa (9 mg/mL) 1 mL --Agua ----Glucgeno (dilucin 1/50) --1 mL Antrona (2 g/L H2SO4) 5 mL 5 mL

C --1 mL --5 mL

3.2.5. Una vez preparados los tubos, se sumergen en un bao con agua hirviendo durante 5 minutos. Pasado este tiempo, se enfran en un bao de hielo. (Precaucin al coger los tubos. Usad pinzas de madera). 3.2.6. Se mide la absorbancia a 620 nm ajustando a 0 con el tubo C (blanco). 3.2.7. Para calcular el porcentaje de pureza se aplica la relacin: A620 GLUCGENO / A620 GLUCOSA 3.2.8. Se expresa la relacin de absorbancia obtenida como mg de glucgeno/g de tejido, (rendimiento).

4. RESULTADOS ESPERADOS Una vez finalizada la parte prctica, hay que presentar los resultados obtenidos. Para ello se debe indicar el rendimiento total en glucgeno y calcular el contenido en glucgeno del hgado, expresndolo en mg de glucgeno por g de tejido fresco. A continuacin se muestra un ejemplo representativo de resultados esperados: En la Tabla 2 se muestran las absorbancias determinadas en las muestras
Tabla 2. Absorbancia a 620 nm Glucosa Glucgeno 1,420 0,527

Porcentaje de glucgeno obtenido: A620 nm glucgeno x 100 0,527 x100 % de glucgeno =_______________________________ = ___________________= 37,1% A620 nm glucosa 1,420 Rendimiento de glucgeno en hgado: Clculo de los g glucgeno puro en 25 mg del precipitado obtenido a partir de 4,54 g de hgado utilizado como muestra:

mg precipitado x % glucgeno glucgeno puro (mg) =

_______________________________________

= 9,257 mg

100 mg mg de glucgeno puro Rendimiento =

_______________________________

= 2,04 mg glucgeno puro/g hgado

g de hgado muestra

5. DISCUSIN Y COMENTARIOS El mtodo de aislamiento utilizado en este protocolo se basa en las propiedades qumicas del glucgeno no compartidas por otras sustancias presentes en el hgado.

6. BIBLIOGRAFA Alemany M, Font S (1983): Prcticas de Bioqumica, 1 ed. Editorial Alhambra (Madrid, Espaa), pp 99-107. Clark JM (1966): Biqumica Experimental, 1 ed. Editorial Acribia (Zaragoza, Espaa), pp 40-42. Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial Omega (Barcelona, Espaa), pp 304-305. Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert (Barcelona, Espaa), pp 577-580.

ANEXO 1: MEDIOS, SOLUCIONES Y MATERIAL BIOLGICO EMPLEADO Solucin de KOH 30%

Tabla 3. Solucin de KOH KOH Agua destilada 300 g Hasta 1 litro

Solucin de tricloroactico TCA 10%

Tabla 4. Solucin de TCA TCA Agua destilada 100 g Hasta 1 litro

Solucin saturada de Na2SO4

Tabla 5. Solucin de Na2SO4 Na2SO4 10 g Agua destilada Hasta 30 mL

Solucin de glucosa (9 mg/mL)

Tabla 6. Solucin de glucosa Glucosa 90 mg Agua destilada Hasta 10 mL

Solucin amortiguadora: tampn fosfato sdico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH 7,0

Tabla 7. Solucin de fosfato sdico pH 7,0 Na2HPO4 1,70 g NaH2PO4 1,59 g NaCl 0,30 g Agua destilada Hasta 1 L
Ajustar el pH a 7,0 si fuera necesario

Solucin de glucgeno: a partir del glucgeno obtenido en el apartado 3.1.

Tabla 8. Solucin de glucgeno Glucgeno Fosfato sdico 0,02 M; NaCl 0,005 M pH 7,0 80 mg Hasta 10 mL

Solucin de antrona 0,2% en H2SO4

Tabla 9. Solucin de antrona Antrona H2SO4 1g Hasta 500 mL