P. 1
Diagnosis Virus Patogen Tanaman

Diagnosis Virus Patogen Tanaman

|Views: 839|Likes:

More info:

Published by: Sarah Juniar Siahaan on Jul 13, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/10/2013

pdf

text

original

Diagnosis virus patogen tanaman (tugas klintan 3

)
DIAGNOSIS VIRUS PATOGEN TANAMAN
Oleh: SADATIN GHURRI

Diagnosis OPTK golongan virus merupakan langkah penting untuk menentukan virus penyebab penyakit yang terbawa media pembawa. Diagnosis menggambarkan tentang rangkaian kegiatan deteksi dan identifikasi patogen penyebab penyakit, sehingga dapat ditentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa tersebut. akan memudahkan Petugas Karantina melakukan tindakan pengujian di laboratorium. Metode diagnosis virus penyebab penyakit tanaman ada beberapa antara lain pengujian melalui pengamatan badan inklusi virus, pengujian menggunakan tanaman indikator, pengujian secara serologi/ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), dan secara molekuler. Sensitifitas masing-masing metode tergantung pada jenis virus dan jumlah titer virus pada tanaman terinfeksi. Untuk virus-virus golongan Tobamovirus dapat diamati badan inklusinya dengan mudah namun tidak demikian halnya dengan virus golongan lain. 1. Prosedur Preparasi Sampel Media Pembawa Media Pembawa sebagai sasaran pengujian antara lain biji, umbi, stek, daun, batang, akar, plantlet, dan polen. Prosedur preparasi sampel merupakan proses penyiapan sampel media pembawa sebelum dilakukan pengujian di Laboratorium. Prosedur preparasi sampel dilakukan hanya untuk media pembawa yang perlu ditumbuhkan (biji dan umbi), sedangkan untuk media pembawa selain biji dan umbi dapat langsung dilakukan pengujian. Penumbuhan biji dan umbi ditujukan untuk meningkatkan konsentrasi virus serta meminimalkan konsentrasi senyawa inhibitor pada media pembawa yang akan mengganggu proses pengujian. 1.1 Prosedur Preparasi Sampel Bentuk Biji Instruksi Kerja : - Siapkan sampel kerja (sesuai Petunjuk Teknis Pengambilan Sampel Bentuk Biji, (Pusat Karantina Tumbuhan tahun 2007), - Tanam biji di dalam nampan yang telah dialas 3-5 lembar kertas towel/ kertas sejenis yang lembab, Tutup nampan dengan plastik penutup bening (cling wrap), - Simpan nampan yang telah berisi biji selama 3-5 hari pada tempat cukup cahaya dan bersuhu ruang (nampan juga dapat disimpan di Growth Chamber bersuhu 27ºC dengan pengaturan lampu selama 12 jam terang dan 12 jam gelap). Catatan: Perkecambahan dapat dipercepat dengan cara merendam biji sampel kerja pada air mengalir selama kurang lebih 3-12 jam. Cara ini dilakukan sebelum biji ditanam pada nampan. 1.2 Prosedur Preparasi Sampel Bentuk Umbi Instruksi Kerja : Siapkan sampel kerja, - Umbi yang belum bertunas, antara lain kentang, caladium, disimpan di tempat yang kering dan

Bahan pewarna : trypan blue. Alat dan Bahan: . Metode Diagnosis secara Biologi 2. Catatan : Badan inklusi yang berada pada jaringan terinfeksi virus kadang-kadang dapat digunakan sebagai pengenalan awal virus ke dalam suatu grup. hingga tumbuh tunas 0.Alat pemotong (pisau/ gunting/ silet).Amati dibawah mikroskop. Dahlia Mosaic Virus.1. 2001) Instruksi Kerja untuk Pengamatan Nekrosis pada Jaringan Floem : . . Instruksi Kerja untuk Pengamatan Badan Inklusi : . Warnai jaringan dengan Phloroglucinol.Gelas obyek dan gelas penutup.Kamera untuk dokumentasi .Dokumentasikan tanaman atau bagian tanaman yang menunjukkan gejala infeksi virus tanaman. terjadinya nekrosis pada jaringan floem. Catatan : . . agar gejala penyakit yang ada pada tanaman atau bagian tanaman dapat terlihat dengan lebih jelas. Tobacco Mosaic Virus.Tanaman atau bagian tanaman yang akan diperiksa dilihat dengan menggunakan kaca pembesar.cukup cahaya selama 5 hari. atau deposisi enzim kalose (Hunter D. Jaringan nekrosis akan tampak berwarna lebih gelap dibanding jaringan yang tidak mengalami nekrosis. . .5 ± 1 cm. Red Clover Vein Mosaic virus. Cauliflower Mosaic Virus. Pemeriksaan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman Pemeriksaan berdasarkan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman (termasuk benih) dapat membantu diagnosis awal penyebab penyakit tanaman oleh virus. Tobacco Etch Virus.Umbi bertunas antara lain lilium. Tanaman atau bagian tanaman dengan gejala spesifik dapat di deteksi berdasarkan metode ini. Beberapa virus dapat diamati badan inklusinya antara lain Bean Yellow Mosaic Virus. dan Watermelon Mosaic Virus (Hunter D.Lakukan pemotongan jaringan tanaman menggunakan pisau/ silet steril dan letakkan di atas gelas obyek.Irislah bagian jaringan floem pada batang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek.Kaca pembesar/ loup/ Mikroskop cahaya . phloroguicinol. umbi lapis. Pemeriksaan dapat dilakukan terhadap keberadaan badan inklusi partikel virus. Turnip Mosaic Virus.Amati badan inklusi virus akan tampak berwarna biru tua menggunakan mikroskop cahaya . pengujian dapat langsung dilakukan dengan mengambil mata tunas. . . sehingga dapat dijadikan bukti ilmiah untuk dilakukan identifikasi lebih lanjut menggunakan metode yang lebih valid. Tetesi jaringan dengan trypan blue. 2. tutup dengan kaca penutup. . 2001).

kelembaban lingkungan tanaman dijaga.Amati dibawah mikroskop.Buffer Fosfat pH 7 mengandung 1% B-mercapthoethanol (yang ditambahkan sesaat sebelum digunakan) Aquadest Alat pemotong (pisau atau gunting) steril Kain kasa Sentrifuge Tabung sentrifuge Sarung tangan karet . bagian tanaman yang diinokulasi dibilas dengan menggunakan aquadest. Lakukan persiapan sap dalam kondisi dingin . yang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek. Buat sap dari tanaman atau bagian tanaman yang terinfeksi virus dengan cara menggerus jaringan terinfeksi dengan 0. 4. 2.01 M buffer fosfat dingin pH 7 dengan perbandingan 1:10 b/v (berat/volume). Simpan/ inkubasi tanaman di Rumah Kaca/Growth Chamber. Kalose yang terdeposit pada jaringan floem akan mengalami perubahan menjadi biru. . Saring sap tanaman dengan menggunakan kain kasa. Karborundum ditaburkan pada bagian tanaman indikator yang akan diinokulasi.Karborundum 600 mesh Instruksi Kerja: 1. 2001). bila diperlukan.Irislah bagian jaringan umbi atau floem pada batang. Untuk dapat menerapkan metode deteksi ini.Warnai jaringan dengan resorcin blue. Oleskan sap menggunakan jari tangan bersarung karet pada bagian tanaman indikator yang telah ditaburi dengan karborundum. 6. Selama masa inkubasi. Catatan : Metode uji ini umum digunakan untuk deteksi Potato Leaf Roll Virus pada batang atau umbi kentang (Hunter D.Infeksi tanaman kentang oleh Potato Leaf Roll Virus akan menginduksi terjadinya nekrosis pada jaringan floem pada umbi dan batang kentang. 2. 3. Nekrosis yang terjadi dapat diamati di bawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan dengan phlorogucinol (Hunter D. agar mendukung perkembangan infeksi virus yang . 5. . terlebih dahulu harus diketahui sifat dari virus yang akan diuji.2 Penggunaan tanaman indikator Ada beberapa jenis tanaman yang sangat rentan terhadap virus tertentu dan menunjukkan gejala yang khas sehingga dapat dimanfaatkan sebagai metode untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus tertentu (Walkey 1991). Setelah inokulasi. Instruksi Kerja untuk Uji Igel Lange (pengamatan deposisi kalose ) : . 2001). diantaranya cara penularan dan jenis gejala yang ditimbulkan pada tanaman yang dijadikan tanaman indikator Alat dan Bahan: Tanaman indikator dipilih berdasarkan Virus yang akan diuji Mortar dan pistil .

2001). diantaranya adalah pengujian standar (direct) DAS ELISA dan indirect ELISA. konjugate. Perbedaan kedua metode ini adalah pada tempat enzim terikat. Penggunaan antibodi dalam jumlah sedikit 3. Substrat Buffer) Non fat dried milk Plate ELISA ELISA reader ELISA washer Multichanel mikropipet dan mikrotip . kontrol positif. 1998): 1. Keunggulan metode ini (Dijkstra et al. Memungkinkan untuk mendapatkan hasil secara kuantitatif (nilai absorbansi) disamping hasil kualitatif (perubahan warna) Dalam perkembangannya. Gejala akan tampak setelah 3 ± 7 hari setelah inokulasi. Hollings (1957). Coating buffer. TAS ELISA (Modifikasi Indirect ELISA) Alat dan Bahan: Sampel tanaman . ELISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate ELISA yang terbuat dari bahan plastik (Dijkstra et al. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun 1971. Yarwood (1953) dalam Noordam 1973) Catatan Lakukan inokulasi ke tanaman indikator pada pagi atau sore hari. 1998). ekstrak buffer. Jika terjadi reaksi kompatibel antara antibodi dengan antigen akan ditunjukkan dengan adanya perubahan warna yang terjadi.1. 7. metode ini mengalami modifikasi dalam prosedur pelaksanaan pengujian. kontrol negatif). .diinokulasikan. tetapi bila konjugasi enzim dilakukan pada imunoglobulin dari serum darah hewan maka metode tersebut diklasifikasikan sebagai Indirect ELISA. Hasil pengujian pada sap tanaman sama baiknya dengan pengujian pada suspensi virus yang dimurnikan 4. 3. Pengujian dapat diaplikasi pada sampel pengujian dalam jumlah besar 5.Bahan-bahan buffer ELISA (Washing Buffer. Bila konjugasi enzim dilakukan pada imunoglobulin antivirus maka metode itu termasuk DAS ELISA.Kit antisera tersedia komersial (antisera. (Berg (1962). Pengujian dapat distandarkan dengan menggunakan kit bahan pengujian 6. : 3 Metode Diagnosis Secara Serologi Prinsip kerja serologi didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dan antibodi (antiserum) sehingga terbentuk reaksi conjugate antibody-enzyme (Hunter D. Dapat mendeteksi virus padakonsentrasi rendah (1-10 ng/ml) 2.

5 sebanyak 100 l. 4 Metode Diagnosis Secara Molekuler Identifikasi patogen penyebab penyakit dilakukan dalam rengka menentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa. 13. Jangan sentuh pNPP dengan tangan atau terpapar cahaya yang kuat. 12.Botol sprayer pNPP Pistil Plastik penggerus Timbangan analitik Refrigerator bersuhu Inkubator bersuhu 37ºC Instruksi Kerja: 1. Isi lubang mikroplate dengan larutan no. Hasil dikatakan positif apabila nilai sampel lebih dari 2 kali ratarata nilai kontrol negatif kit antisera.8 sebanyak 100 l. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. 2. Isi lubang mikroplate dengan 100 l antibodi virus target yang telah dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan sesuai petunjuk kit antisera.kira 15 menit sebelum waktu inkubasi berakhir dengan perbandingan 1 :1 (mg/ml). Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam atau pada suhu 4º C selama 1 malam. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. 7. 3. Siapkan pula kontrol positif dan kontrol negatif. Isi mikroplate dengan larutan 5 % nonfat dried milk dalam PBST. Kemudian keringkan mikroplate dengan cara dibalik dan ditepuk-tepukan pada permukaan yang telah dialasi kertas towel. Kosongkan mikroplate kemudian cuci dengan PBST 4-8 kali. 8. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam. 11. 6. ada indikasi bahwa sampel yang diuji positif 14. Untuk menghentikan reaksi tambahkan 50 l NaOH 3M. Siapkan larutan pNPP dalam substrat buffer kira. 5. . Pengelolaan sampel kerja (Media Pembawa) dalam identifikasi virus penyebab menggunakan metode molekuler akan memudahkan Petugas Karantina melakukan tindakan pengujian di laboratorium. Inkubasi mikroplate pada suhu ruang dalam kotak lembab selama 30 -60 menit. 9. Pengamatan secara visual terhadap perubahan warna yang terjadi pada larutan. Larutkan antisera 1 dengan menggunakan conjugate buffer dengan perbandingan sesuai kit antisera. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 1 jam. Isi mikroplate dengan 100 l larutan pNPP. Larutkan antisera 2 (conjugate universal) dengan menggunakan conjugate buffer dengan perbandingan sesuai kit antisera. 4. Cuci mikroplate seperti pada tahap 2. Isi lubang mikroplate dengan larutan no. Isi lubang mikroplate dengan sampel tanaman yang telah digerus menggunakan coating buffer dengan perbandingan 1 : 10 (berat/volume) sebanyak 100 l. Pembacaan hasil juga dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan panjang gelombang 405 nm. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 2 jam atau pada suhu 4º C selama 1 malam. Bila terjadi perubahan warna. Inkubasikan pada kotak lembab pada suhu 37 oC selama 1 jam. 10.

Tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap.2. disingkat ELISA telah banyak mengalami peubahan sejak pertama kali teknik ini dipublikasikan ciri utama teknik ini adalah dipakai indikator enzim untuk reaksi imunilogi. 94± 96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Kemudian primer melekat pada posisi target dari masing-masing untai DNA (2) pada saat annealing. . dan menunjukan antibodi didalam serum dari hospes pada penyakit-penyakit tertentu dimana penyebab penyakit tidak dapat diisolasi. proses ini biasanyadilakukan pada suhu 76°C. Latar belakang Serologi adalah ilmu yang mempelajari prosedur-prosedur diagnostik dan eksperimental yang berhubungan dengan imunologi dan menyangkut reaksi-reaksi serum. penemuan spesifik antibodi adalah penting sekali untuk membantu diagnosa. Secara prinsip. Salah satu teknik serologi yang bersifat lebih sensitif dibandingkan dua metode serologi yang diuraikan terlebih dahulu. Setelah itu taq polimerase melakukan ekstensi DNA dari ujung 3¶ primer pada tahap ekstensi.html A. PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20±30 kali. Ini dilakukan pada suhu antara 45±60°C. Akibat denaturasi dan renaturasi. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain.com/2011/04/diagnosis-virus-patogen-tanaman-tugas. Penempelan ini bersifat spesifik. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. 3.blogspot. http://sadatin091089. Pada denaturasi awal (1) Dna akan dipisah menjadi untai tunggal. Fragmen DNA. ELISA telah berkembang sampai pada tingkatan yang sangat sulit untuk membuat generasi tentang kemampuan kinerja berbagai konfigrasi. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai dalam jumlah yang melimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNApolimerase yang dipakai. Tahap penempelan atau annealing. Enzyme linked immunisorbent assay. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat.Tes-tes serologi ini digunakan untuk. Durasi tahap ini 1±2 menit.4. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1. yang pada awalnya terdapat dalam konsentrasi yang sangat rendah akan diperbanyak menjadi cetakan fragmen DNA baru yang cukup untuk dapat divisualisasi pada gel agarosa . Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat ("patokan") bagi primer. siklus diulang kembali mulai tahap 1. Dengan Taq-polimerase. Tahap pemanjangan atau elongasi. Lepas tahap 3. Durasi tahap ini 1±2 menit. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi. Posisi fragmen DNA yang spesifik tersebut ditentukan oleh sepasang primer yang akan menjadi cetakan awal untuk proses perbanyakan fragmen DNA selanjutnya dengan bantuan enzim polimerase dan deoxyribonucleotide triposphate (dNTPs) yang dikondisikan pada suhu tertentu. 2. Identifikasi mikroorganisme-mikroorganisme.1 Polymerase chain reaction (PCR) Polymerase chain reaction (PCR) merupakan sebuah metode yang digunakan untuk memperbanyak suatu fragmen DNA yang spesifik secara invitro.

enzim konjugat.25 g Tween-20 dan 1 g susu kering nonfat kadalam 250 ml PBST pH 7. bahan-bahan pembuat bufer. BAHAN DAN METODE A. Selain dapat mengidentifikasi penyakitpenyakit dan sistem imun. Setelah waktu inkubasi tersebut akan terjadi perubahan warna pada cairan di dalam sumuran plat mikrotiter. pipet mikrotiter. selanjutnya dilakukan pencatatan hasil dan analisis kuantitatif dengan spektrofotometer 405 nm. yaitu dengan mencampurkan 1. 97 ml Diethanolamina) dimasukkan kedalam sumuran plat mikrotiter dan diinkubasi selama 30-60 menit. kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 2 jam.02%) ditambahkan pada setiap buffer bila perlu pengawetan. antiserum. ELISA reader B. Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki sifat antigenik. PEMBAHASAN Perkembangan lain dari teknik ELISA yaitu ditemukannya teknik micro-ELISA asai. yang menandakan reaksi positif. Melakukan pengamatan reaksi warna pada sumuran hasil teknik serologi. pertama-tama menyiapkan bufer ekstraksi (milk extrack buffer). teknik ELISA juga dapat menganalisa penyakit karena gangguan . 0. Plat mikrotiter dicuci lagi sebanyak 4-8 kali dengan PBST. 12H2O.4 (8.2 g KH2PO4.2 gNaCl. Enzim konjugat yang sudah diencerkan dimasukkan ke dalam sumuran plat mikrotiter sebanyak 100 ul. 2001) Perkembangan teknik ELISA sangat bermanfaat dalam ilmu kedokteran secara umum.1 g Magnesium chlorida. Tujuan Memperkenalkan teknik serologi dengan meode ELISA. Prosedur micro-ELISA dapat mengatasi permasalahan keterbatasan sample yang sering ditemukan dalam analisa kuantitatif di laboratorium (Wiese et al. substrate untul alkalin fostatase.9 g Na2HPO4.Konfigurasi yang paling umum mengunakan substrat padat. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Metode Adapun metode yang dilakukan dalam teknik ELISA ini antara lain.2 g Sodium azidae. NAN3 (0. bakteri antigen dan antibodi. Cairan perasan tanaman yang dihasilkan diambil sebanyak 100 ul kemudian dimasukkan kedalam sumuran plat mikrometer. Sebanyak 100 ul bufer PNP (0. Reaksi segera dihentikan dengan penambahan sodium hidroksida (3M). Setelah itu daun tanaman digerus dalam bufer ekstraksi tersebut (1/10 b/v). plat mikrotiter. B. p-nitrophenyl phosphate.. NAOH (3N). Alat dan Bahan Alat dan bahan yang diperlukan antara lain. Plat mikrometer ditutup dengan kertas basah/lembab dan disimpan dalam kotak plastik yang telah diberi alas kertas basah selama semalam pada suhu 4°C atau selama 2 jam pada suhu kamar. Selanjutnya plat mikrotiter dicuci 4-8 kali dengan PBST. dan kemudian disaring dengan kain kasa. Beberapa di antaranya adalah hormon.´ Ini adalah tes immunochemical cepat yang melibatkan sebuah enzim (protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia). terutama protein (sebagai lawan dari molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium. yaitu warna kuning.2 g KCl dalam 1000 ml H20 dan 5% Tween20). 0. Juga melibatkan antibodi atau antigen (kekebalan molekul). untuk mendeteksi virus penyebab patogen pada tanaman kacang panjang dan tembakau. 0. ELISA singkatan dari ³enzim-linked Immunosorbent assay. 2.

. Perkembangan lain dari teknik ELISA yaitu ditemukannya teknik micro-ELISA asai. adalah sebuah biokimia teknik yang digunakan terutama di imunologi untuk mendeteksi keberadaan antibodi atau antigen dalam sampel. dan lebih ramah lingkungan. Teknik ini menggunakan microarray platform yang dikembangkan berdasarkan metode sandwich ELISA. juga disebut ELISA. dan kemudian dicuci antibodi spesifik di atas permukaan sehingga dapat mengikat antigen. dan di langkah terakhir ditambahkan suatu zat enzim yang dapat appropriate mengkonversi ke beberapa sinyal terdeteksi. cepat. Prosedur micro-ELISA dapat mengatasi permasalahan keterbatasan sample yang sering ditemukan dalam analisa kuantitatif di laboratorium (Wiese et al. berwarna bening menunjukkan reaksi negatif. Cairan perasan tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit terinfeksi virus merupakan bahan utama yang digunakan untuk mendeteksi virus. Teknik ini dalaporkanlebih sensitive. setiap antigen / antibodi kompleks akan fluoresce sehingga jumlah antigen dalam sampel dapat disimpulkan melalui besarnya fluoresensi. berwarna bening C1 dan C2 = virus TMV murni.. ketika cahaya dari panjang gelombang yang tepat adalah menyinari sampel. berwrna kuning pudar (+) menunjukkan reaksi positif F1 dan F2 = kacang panjang 1 (mozaik sakit) berwarna bening G1 dan G2 = kacang panjang 2 (mozaik sakit) berwarna bening H1 dan H2 = Cenopodium amaranti color (klorosis). 2002). dalam jumlah yang tidak diketahui ELISA antigen yang ditempel ke permukaan. Time-resolved immunofluorometric assay sebenarnya hasil perkembangan dari teknik ELISA. kontrol positif berwarana kuning (++++) D1 dan D2 = G glubosa. Teknik ini menggunkan pewarnaan fluorescents yang telah sukses untuk menganalisis hormon insulin (Lovendahl and Purup. Jadi dalam kasus fluoresensi ELISA. Setelah waktu inkubasi akan terjadi perubahan warna pada cairan di dalam sumuran plat mikrotiter. Teknik ELISA juga dapat digunakan untuk mengidentifikasi virus penyebab pathogen tumbuhan Kelemahan yang ada pada prosedur asai dengan menggunakan ELISA yaitu lamanya waktu inkubasi dapat dipecahkan dengan teknik ini. Sementara keperluan deteksi virus dianbil dari ekstak tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit yang dimasukkan kedalam sumuran plat mikrotiter yang telah diberi enzim konjugat. Tween 20 dan PBST sebagai buffer ekstraksi.fungsi hormonal tubuh. Tes ELISA telah digunakan sebagai diagnostik alat dalam bidang kedokteran dan patologi tanaman. serta pengawasan mutu pemeriksaan di berbagai industri. Antibodi ini dihubungkan dengan enzim. yaitu warna kuning yang menandakan reaksi positif Hasil uji serologis pada tanaman tembakau dan kacang panjang yang sakit Keterangan : A1 dan A2 = buffer. Enzim-linked immunosorbant assay. Metode ini menggunakan susu kering nonfat. E1 dan E2 = tembakau sakit. 2001). berwarna kuning (+++) ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA yang digunakan). berwarna bening menunjukkan reaksi negatif B1 dan B2 = kontrol negatif (tembakau sehat). akurat. ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi tanaman . Dalam istilah yang sederhana. ELISA merupakan metode uji serologi yang umum digunakan untuk menentukan pengujian terhadap patologi tanaman.

tianr08. Pengantar Virologi Tumbuhan.google. 1990. Teknik ini digunakan untuk berbagi keperluan.id diakses tanggal 13 Desember 2009 http://leli.student. salah satunya adalah untuk mendeteksi virus yang menginfeksi tanaman tembakau dan kacang panjang dan mendeteksi berbagai macam antibodi yang terkandung dalam sampel serta mengetahui reaksi warna pada sample.clinchem.ac.co.co. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press http://www. DAFTAR PUSTAKA Bos.org/cgi/content/full/51/12/2415 diakses tanggal 13 Desenber 2009 http://info. L.id/2010/06/20/laporan-teknik-elisa/ .medion.yang tidak terinfeksi atau tanaman yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi. Peralatan yang digunakan dalam uji serologis melalui ELISA Microreader plate mirotiter Pipet multi channel Micro Aerosol Filter Pipet Tips Pipet mikro tube mikro Elisa plte reader Spectophotometer KESIMPULAN Teknik ELISA merupakan salah satu metode serologi yang lebih intensif.ipb.id/#hl=id&source=hp&q=ELISA&btnG=Telusuri+d diakses tanggal 13 Desember 2009 http://www.

Diagnosis yang benar akan menentukan ketepatan rekomendasi pengendalian dan bermanfaat dalam kegiatan survei penyakit tungro. dan efisien. gejala penyakit tungro sering dikacaukan dengan penyakit yang disebabkan oleh virus yang lain atau akibat kekurangan unsur hara. akurat. . strain. sedangkan apabila hanya terinfeksi oleh RTSV maka tanaman tidak menunjukkan gejala. PCR merupakan salah satu teknik diagnosis secara molekuler dengan prinsip penggandaan DNA secara in vitro. baik secara konvensional maupun modern. Metode diagnosis secara molekuler berdasarkan hibridisasi asam nukleat menggunakan PCR membuktikan bahwa bahan genetik yang diekspresi dan produk ekspresi gen dapat diisolasi. Apabila hanya terinfeksi oleh RTBV maka gejala yang ditimbulkan lebih ringan. spesies. Metode diagnosis secara konvensional seperti teknik biologi sudah jarang dilakukan karena selain kurang akurat juga memerlukan waktu yang relatif lama. Terdapat beberapa metode diagnosis penyakit tungro. Secara visual. efektif. Metode diagnosis yang berkembang saat ini adalah teknik serologi dan hibridisasi asam nukleat. Proses PCR berjalan berdasarkan cara replikasiDNA dengan bantuan enzim DNA polimerase dan perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu yang terjadi secara simultan dari primer yang komplementer dengan DNA target. Diagnosis secara molekuler mempunyai spesifisitas tinggi terhadap patogen (genus. patogen baru).Diagnosa dan Deteksi Penyakit Tungro Pada Tanaman Padi Diagnosis Penyakit Tungro Tanaman padi yang terinfeksi dua jenis virus tungro akan menunjukkan gejala yang komplek.

http://www. Tingkat infeksi awal penyakit tungro ditentukan oleh populasi wereng hijau infektif yang migrasi ke pertanaman.menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan deteksi menggunakan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). virus tungro juga dapat berkembang pada beberapa gulma. sehingga dapat ditentukan spesies virus penyebab penyakit yang terbawa oleh media pembawa tersebut. Deteksi virus tungro pada persemaian dan wereng hijau menggunakan teknik PCR dengan primer spesifik untuk virus tungro.com/2011/04/diagnosis-virus-tanaman. Eradikasi sumber inokulum pada tahap pascapanen sampai pratanam diperlukan untuk menekan sumber inkulum primer sekecil mungkin dan menghindari infeksi awal virus tungro. Eradikasi gulma di areal pertanaman dan sekitarnya akan mengeliminasi perkembangan virus tungro dan menghilangkan tempat bertahan hidup vektor setelah tidak tersedia pertanaman padi. Alur pekerjaan diagnosis dari awal hingga mendapatkan patogen penyebab. Oleh karena itu.blogspot. gulma di sekitar lahan. Deteksi Virus Tungro Ketersediaan sumber inokulum merupakan faktor penyebab terjadinya serangan tungro.Penggunaan teknik PCR dengan spesifik primer untuk virus tungro akan mempercepat proses diagnosis penyakit tungro dan menghasilkan data yang akurat.html Alur Kerja Penanganan Pengujian Media Pembawa . Umumnya. akan memudahkan kita untuk melakukan tindakan pengujian di laboratorium http://diagnosisvirustanaman. sedangkan perkembangan selanjutnya ditentukan oleh tingkat infeksi awal dan kepadatan wereng hijau generasi pertama. Diagnosis menggambarkan tentang rangkaian kegiatan deteksi dan identifikasi patogen penyebab penyakit.net/read/full/agriwacana/2011/01/09/diagnosa-dan-deteksi-penyakit-tungropada-tanaman-padi. deteksi dini virus tungro pada ratun tanaman padi. dan wereng hijau yang ada di wilayah tersebut harus dilakukan sebagai usaha antisispasi perkembangan virus tungro di pertanaman.html Diagnosis Virus Tanaman METODE IDENTIFIKASI/DIAGNOSIS VIRUS TANAMAN Diagnosis OPTK golongan virus merupakan langkah penting untuk menentukan virus penyebab penyakit yang terbawa media pembawa. Selain berkembang pada ratun tanaman padi yang sebelumnya tertular tungro.agrilands. gejala tungro belum muncul pada tahap persemaian. persemaian. namun mulai terlihat pada 21-30 hari setelah tanam. terutama RTBV.

Pemeriksaan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman Pemeriksaan berdasarkan gejala penyakit pada tanaman atau bagian tanaman (termasuk benih) dapat membantu diagnosis awal penyebab penyakit tanaman oleh virus. sehingga dapat dijadikan bukti ilmiah untuk dilakukan identifikasi lebih lanjut menggunakan metode yang lebih valid. Gelas obyek dan gelas penutup. atau deposisi enzim kalose (Hunter D. Alat dan Bahan: Kaca pembesar/ loup/ Mikroskop cahaya Kamera untuk dokumentasi Alat pemotong (pisau/ gunting/ silet). terjadinya nekrosis pada jaringan floem. Dokumentasikan tanaman atau bagian tanaman yang menunjukkan gejala infeksi virus tanaman. antara lain Bean Yellow Mosaic Virus. METODE DIAGNOSIS SECARA BIOLOGI 1. Tetesi jaringan dengan trypan blue. Beberapa virus dapat diamati badan inklusinya (Gambar 4). phloroguicinol. Amati badan inklusi virus akan tampak berwarna biru tua menggunakan mikroskop cahaya . Bahan pewarna : trypan blue. Turnip Mosaic Virus. Lakukan pemotongan jaringan tanaman menggunakan pisau/ silet steril dan letakkan di atas gelas obyek. Tanaman atau bagian tanaman dengan gejala spesifik dapat di deteksi berdasarkan metode ini. tutup dengan kaca penutup. .I. 2001). Pemeriksaan dapat dilakukan terhadap keberadaan badan inklusi partikel virus. agar gejala penyakit yang ada pada tanaman atau bagian tanaman dapat terlihat dengan lebih jelas. Cara Kerja untuk Pengamatan Badan Inklusi : Tanaman atau bagian tanaman yang akan diperiksa dilihat dengan menggunakan kaca pembesar. Catatan : Badan inklusi yang berada pada jaringan terinfeksi virus kadang-kadang dapat digunakan sebagai pengenalan awal virus ke dalam suatu grup.

terlebih dahulu harus diketahui sifat dari virus yang akan diuji. Dahlia Mosaic Virus. Penggunaan tanaman indikator Ada beberapa jenis tanaman yang sangat rentan terhadap virus tertentu dan menunjukkan gejala yang khas sehingga dapat dimanfaatkan sebagai metode untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus tertentu (Walkey 1991). 2001). 2001). dan Watermelon Mosaic Virus (Hunter D. Red Clover Vein Mosaic virus. Untuk dapat menerapkan metode deteksi ini. 2. Amati dibawah mikroskop. Warnai jaringan dengan Phloroglucinol. Kalose yang terdeposit pada jaringan floem akan mengalami perubahan menjadi biru. Tobacco Mosaic Virus. 2001) Instruksi Kerja untuk Pengamatan Nekrosis pada Jaringan Floem : Irislah bagian jaringan floem pada batang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek. Warnai jaringan dengan resorcin blue. Tobacco Etch Virus. yang terinfeksi virus menggunakan pisau/ silet steril lalu letakkan pada gelas obyek. Jaringan nekrosis akan tampak berwarna lebih gelap dibanding jaringan yang tidak mengalami nekrosis. Instruksi Kerja untuk Uji Igel Lange (pengamatan deposisi kalose ) : Irislah bagian jaringan umbi atau floem pada batang. Catatan : Metode uji ini umum digunakan untuk deteksi Potato Leaf Roll Virus pada batang atau umbi kentang (Hunter D.Cauliflower Mosaic Virus. Catatan : Infeksi tanaman kentang oleh Potato Leaf Roll Virus akan menginduksi terjadinya nekrosis pada jaringan floem pada umbi dan batang kentang. diantaranya cara penularan dan jenis gejala yang ditimbulkan pada tanaman yang dijadikan tanaman indikator Alat dan Bahan: Tanaman indikator dipilih berdasarkan Virus yang akan diuji Mortar dan pistil . Amati dibawah mikroskop. Nekrosis yang terjadi dapat diamati di bawah mikroskop setelah dilakukan pewarnaan dengan phlorogucinol (Hunter D.

Selama masa inkubasi. Karborundum ditaburkan pada bagian tanaman indikator yang akan diinokulasi. - Saring sap tanaman dengan menggunakan kain kasa.01 M buffer fosfat dingin pH 7 dengan perbandingan 1:10 b/v (berat/volume). - Setelah inokulasi. Lakukan persiapan sap dalam kondisi dingin . agar mendukung perkembangan infeksi virus yang diinokulasikan. bagian tanaman yang diinokulasi dibilas dengan menggunakan aquadest. kelembaban lingkungan tanaman dijaga. Yarwood (1953) dalam Noordam 1973) Catatan : Lakukan inokulasi ke tanaman indikator pada pagi atau sore hari. Oleskan sap menggunakan jari tangan bersarung karet pada bagian tanaman indicator yang telah ditaburi dengan karborundum. (Berg (1962). II.- Buffer Fosfat pH 7 mengandung 1% B-mercapthoethanol (yang ditambahkan sesaat sebelum digunakan) - Aquadest Alat pemotong (pisau atau gunting) steril Kain kasa Sentrifuge Tabung sentrifuge Sarung tangan karet Karborundum 600 mesh Cara Kerja: - Buat sap dari tanaman atau bagian tanaman yang terinfeksi virus dengan cara menggerus jaringan terinfeksi dengan 0. bila diperlukan. METODE DIAGNOSIS SECARA SEROLOGI . Simpan/ inkubasi tanaman di Rumah Kaca/Growth Chamber. - Gejala akan tampak setelah 3 ± 7 hari setelah inokulasi. Hollings (1957).

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Metode pengujian ini mulai berkembang sejak tahun 1971. ELISA merupakan suatu metode pengujian serologi yang melekatkan kompleks ikatan antara antibodi dengan antigen di dalam sumuran plate ELISA yang terbuat dari bahan plastik (Dijkstra et al. Jika terjadi reaksi kompatibel antara antibodi dengan antigen akan ditunjukkan dengan adanya perubahan warna yang terjadi. Beberapa posisi pengikatan antibodi pada sumuran ELISA 1. Penggunaan antibodi dalam jumlah sedikit http://diagnosisvirustanaman.Prinsip kerja serologi didasarkan pada reaksi spesifik antara antigen dan antibody (antiserum) sehingga terbentuk reaksi conjugate antibody-enzyme (Hunter D. Keunggulan metode ini (Dijkstra et al.blogspot.com/2011/04/diagnosis-virus-tanaman.html . 1998). 1998): 1. Dapat mendeteksi virus padakonsentrasi rendah (1-10 ng/ml) 2. 2001).

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->