P. 1
Culturi in Vitro

Culturi in Vitro

|Views: 3,755|Likes:
Published by Emanuel Baltes

More info:

Published by: Emanuel Baltes on Jul 26, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

01/03/2016

pdf

text

original

INTRODUCERE ÎN CULTURILE DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE

Sfârşitul mileniului doi se caracterizează printr-o puternică implicare a biotehnologiei în viaţa omului, în toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au făcut progrese uriaşe în crearea de noi genotipuri de plante şi rase de animale cu însuşiri favorabile şi cu randamente sporite faţă de materialul de la care s-a plecat. Dezvoltarea biologiei moleculare din ultima jumătate de secol s-a făcut, în principal, pe organisme simple ca mod de organizare (bacterii, drojdii, alge, etc.), organisme unicelulare. Odată cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dacă noţiunile acumulate anterior erau valabile şi dacă existau şi alte procese specifice modului complex de organizare. Cunoscându-se comportamentul organismelor simple, cercetătorii au început să se gândească la cultura pe medii artificiale a unor porţiuni de plante sau chiar celule. Problema care a apărut a fost aceea a menţinerii viabilităţii acestor celule, de la prelevarea de pe planta mamă până la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe până la regenerarea (refacerea) unei noi plante. Ajungerea la cultura in vitro nu a fost aşa de simplă cum s-a presupus fiind necesar mult timp şi multe cercetări, la început fără succes, dar apoi totul s-a clarificat. În 1882, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform căreia plantele îşi sintetizează substanţele ce determină formarea organelor, substanţe ce au o dispunere polară, iar primele încercări de culturi de ţesuturi au fost făcute în 1902, de către Haberland, din nefericire, fără rezultatele dorite. Primele rezultate privind cultura de celule şi ţesuturi încep să apară din anul 1922, când Knudson reuşeşte germinarea seminţelor de orhidee in vitro iar Robbins obţine prima cultură de ţesut de rădăcină în condiţii artificiale. Pe baza conceptului de totipotenţă celulară, conform căruia fiecare celulă conţine informaţia genetică necesară obţinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, în anul 1952 Morel şi Martin au stabilit şi au perfecţionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelor meristematice caulinare, obţinând prin creşterea in vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze, pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze. În acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rată de multiplicare într-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiţionale de înmulţire vegetativă, evitânduse şi degenerarea soiurilor din cauza infecţiilor virale, transmisibile prin înmulţire vegetativă. În anul 1962, după mulţi ani de studii şi încercări, Murashige şi Skoog, au reuşit să elaboreze un mediu de cultură considerat ca fiind de bază , care – cu mici modificări – poate fi utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de ţesuturi. Reuşita experienţelor lui Coking în 1960 privind izolarea enzimatică a protoplaştilor din mezofil foliar, a făcut posibilă obţinerea unor populaţii mari de protoplaşti iar apoi producerea de hibrizi somatici. Anul 1966 este considerat drept începutul etapei moderne a cercetărilor privind cultura de explante vegetale in vitro. Această etapă s-a caracterizat, în primul rând prin elaborarea de tehnici eficiente în generarea, cultivarea şi fuzionarea protoplaştilor vegetali. Cu ajutorul protoplaştilor, odată cu descoperirea noilor tehnici (electrofuziune, vectori virali transmiţători de gene izolate) s-au obţinut plante rezistente la acţiunea unor agenţi stresanţi cum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc. Atât pe continentul american cât şi pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite în special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale şi fructifere, dar şi pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetică.

CAPITOLUL I 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIŢIE, CARACTERIZARE ŞI APLICABILITATE
1.1.1 Definiţie În sens general, prin cultura in vitro se înţelege creşterea pe medii artificiale, în condiţii de asepsie deplină şi de factori ambientali bine controlaţi, a unor organe, părţi de organe, ţesuturi sau celule vegetale. Reuşita culturii depinde de o multitudine de factori şi este vizibilă în momentul în care explantul creşte. Explantul, numit şi inocul, este porţiunea de plantă (organ, ţesut, celulă) care se desprinde de pe planta donor (planta mamă), şi se inoculează în condiţii sterile pe un mediu artificial de cultură. Evoluţia explantului este dirijată de operator în funcţie de scopul urmărit. Acesta poate evolua formând o nouă plantă (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltării organelor aeriene (tulpina şi frunzele) şi a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea înmulţirii nediferenţiate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conţine în celule întreaga informaţie genetică a plantei mamă şi pe baza totipotenţei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. Totipotenţa, este însuşirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce şi de a forma o plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celulă vie este totipotentă, însă în practică s-a observat că nu toate celulele au capacitatea de a-şi exprima acest caracter, datorită pe de o parte diferenţierii celulare şi îmbătrânirii, iar pe de altă parte gradului mare de specializare al acelor celule. Astfel, s-a demonstrat practic că, într-o plantă matură, celulele specializate care constituie ţesuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipseşte citoplasma şi nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul că întreaga informaţie genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odată cu înaintarea în vârstă, o parte din celule îşi pierd capacitatea de totipotenţă sau aceasta se reduce foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor este intensă, având loc diviziunea şi formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni, poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică şi nucleu mare dispus central şi prezintă o membrană celulozică, formând ţesutul cu denumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creşterii în lungime şi grosime a plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât şi în rădăcini. 1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiţională, unde se operează cu seminţe sau porţiuni mari de plantă (marcote, butaşi, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaşti), explante care în condiţii normale de cultură nu ar reuşi să crească opunând rezistenţă agenţilor patogeni şi sintetizându-şi singure substanţele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuşita culturii de celule şi ţesuturi se cer respectate următoarele condiţii: -prepararea unui mediu de creştere care să asigure o bună nutriţie heterotrofă a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uşor accesibil explantelor;

-asigurarea şi controlarea factorilor de mediu (temperatură, lumină, umiditate) în limitele optime pentru fiecare specie, soi şi fază de creştere, în funcţie de cerinţele acestora şi scopul urmărit; -stimularea creşterii şi diferenţierii sau dediferenţierii organelor prin utilizarea corespunzătoare a substanţelor stimulatoare de creştere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecţia materialului vegetal, sterilizarea mediului şi a vaselor de cultură, precum şi efectuarea tuturor operaţiilor în hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt utilizate în prezent în agricultură, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria uşoară, etc. În agricultură, în general şi în horticultură în special, culturile de ţesuturi şi celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obţinerea de metaboliţi secundari. Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim: -asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantităţi mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponenţială, prin care în circa 6 luni se pot obţine 1 milion de plante; -se poate produce material săditor liber de viroze şi micoplasme, material mai viguros, precoce şi productiv; -necesită spaţii mici de cultură şi se valorifică bine spaţiul din laborator prin cultura pe verticală pe 3-5 nivele suprapuse; -obţinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de ţesuturi generative (cu n cromozomi); -dă posibilitatea obţinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care în condiţii normale sunt imposibil de obţinut; -selecţia de plante rezistente la stres, boli şi dăunători; -se evită efectul sezonier de pepinieră; -se pot obţine seminţe artificiale; -se pot obţine plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire; -asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiţii normale de cultură; -asigură păstrarea materialului în faza de plantulă până la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro şi care, deocamdată rămân să fie înmulţite tradiţional. Există însă şi câteva impedimente în utilizarea acestei metode pentru înmulţirea în masă a plantelor, cum ar fi: -necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalaţii şi aparate indispensabile activităţilor de micropropagare, care sunt costisitoare; -necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală şi manipularea in vitro; -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi şi puţin accesibili tuturor unităţilor de producţie; -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la metodele cunoscute de multiplicare; -există riscul apariţiei şi multiplicării mutaţiilor recesive, cu afectarea autenticităţii soiurilor;

unele funcţii sunt reduse sau simplificate în timp ce altele sunt amplificate. în funcţie de rolul îndeplinit de celule. Pe măsura diferenţierii. divizându-se continuu. Inoculii pot fi menţinuţi într-o stare primară de organizare cum ar fi: culturi de celule în suspensie (fără a intervenii formarea de agregate celulare) sau de calus.1 Diferenţierea Celulele meristematice. se extinde vacuomul care împinge citoplasma şi nucleul la periferia celulei. cresc şi suferă o specializare morfofiziologică ce poartă numele de diferenţiere. cromoplaste sau amiloplaste. Odată cu avansarea proceselor de diferenţiere peretele celular poate suferi modificări secundare de genul depunerilor de celuloză. scade raportul nucleoplasmatic. După diferenţiere şi generarea de noi celule se ajunge la situaţia în care celulele neoformate tind să se reorganizeze structural şi funcţional suferind o citodifereţiere. după dediferenţierea celulelor şi regenerarea de noi celule. recâştigând aptitudinea de a se divide. de seria de operaţiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculări. 1. evoluându-se spre calităţi proprii specializării funcţionale a diferitelor tipuri de ţesuturi sau organe în alcătuirea cărora celulele mature vor intra. histodiferenţiere. În primele faze de diferenţiere se remarcă o modificare ultrastructurală şi funcţională a celulelor. treptat. ce servesc la organizarea acestora în formaţiuni funcţionale. cu organizarea de ţesuturi (histogeneză). fenomen denumit citodiferenţiere. evoluţia acestora poate fi dirijată. 1.-riscul apariţiei germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se comportă bine la acest tip de cultură. volumul celulei creşte. gelificare sau chiar lichefiere. Celulele odată diferenţiate nu se mai divid. Plastidomul este constituit din cloroplaste. dau naştere la noi şi noi celule care. ori pot fi induse procese de citodiferenţiere.2 PROCESE MORFOFIZIOLOGICE EXPLANTELOR CULTIVATE IN VITRO LA NIVELUL Explantele inoculate pe medii aseptice îşi vor relua activitatea metabolică.2.2. de morfogeneză sau organogeneză. 1. îşi vor reamorsa procesele fiziologice vitale şi vor începe un nou ciclu de viaţă. de condiţiile de cultură şi de scopul urmărit. de natura inoculilor. mineralizare. Substanţele elaborate de celule pot difuza înspre celulele învecinate exercitând un anumit rol în dezvoltarea acestora fenomen denumit inducţie. şi care stă la baza interrelaţiilor dintre ţesuturi. care conduc treptat la o îngreunare a comunicării intercelulare. intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor (de exemplu la sclerenchim). În procesul de diferenţiere se pierd caracterele citologice şi fiziologice de tip embrionar specifice celulelor meristematice. respectiv la organogeneză. Celulele care compun un ţesut sau organ nu posedă acelaşi ritm de creştere şi se află sub un permanent endocontrol fitohormonal. Diferenţierea celulară in vitro nu este foarte variată. citoplasma devine peliculară şi parietală.2 Dediferenţierea celulară Dediferenţierea constă în transformarea progresivă a celulelor din starea de celulă specializată în celulă meristematică. lignină. de organe (organogeneză) şi în final regenerarea unei noi plante. se vor integra noilor condiţii de viaţă. cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele specii. . În dependenţă de mediul de cultură.

Aptitudinea celulelor de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită în corpul plantelor şi chiar şi în cadrul subunităţilor structurale. de calus. toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. de obicei fitohormonal. natura balanţei hormonale şi echipamentul enzimatic. starea lor fiziologică şi vârsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin în procesele de regenerare. cu celule aplatizate asemănătoare ca aspect şi structură cu cambiul. care alcătuiesc un organism. capacitatea de a se dediferenţia. prin proliferarea celulelor dediferenţiate. conţinutul în hormoni. a unui calus neorganizat. gradul de diferenţiere. de promeristeme sau meristemoizi (centre organogene).3 Regenerarea Regenerarea este capacitatea organismelor vii de a-şi reface oricare parte le-a fost distrusă. La nivelul acestui ţesut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni. Factorii endogeni ce joacă un rol esenţial în regenerare sunt: vârsta celulelor. condiţiile de cultură. Procesul de dediferenţiere este complex şi se instalează în momentul în care celulele primesc un impuls inductiv. 2. În cadrul unui ţesut nu toate celulele dediferenţiază. prin androgeneză şi ginogeneză. la locul rănirii. fitohormonii. pentru a putea să-şi reorganizeze un mod de viaţă.prima faza de dediferenţiere: -amorsarea proceselor de dediferenţiere. 1.Dediferenţierea naturală a celulelor poate fi observată în organele care se ramifică sau în cazul traumatizării organelor şi al generării.dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem primar. capacitatea regenerativă este manifestată sau nu de către o celulă vegetală sau de un grup de celule în funcţie de numeroşi factori endogeni şi exogeni. existând diferenţe mari în ceea ce priveşte capacitatea de a se dediferenţia. Deci. respectiv se pune în valoare manifestarea integrală a totipotenţialităţii celulare. iar din acestea regenerarea de plante. Fazele de dediferenţiere celulară pot fi caracterizate astfel: 1. Prin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor. ţesuturilor sau celulelor vegetale se exploatează la maxim capacitatea regenerativă a celulelor explantelor. natura ţesuturilor implicate. -producerea dediferenţierii celulelor până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice unui ţesut meristematic de tip secundar. iar din celule generative. -generarea. Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice. -generarea. ori de embrioni somatici. apte de multiplicare. sau regenerat plante haploide. la celule aparţinând aceluiaşi organ sau chiar ţesut. trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural şi funcţional în celule meristematice. Aptitudinea celulelor explantelor inoculate in vitro de a se dediferenţia este foarte inegal răspândită la specii.2. structurat omogen.a doua fază de dediferenţiere: . Ca şi în cazul dediferenţierii celulare. În caz de traumatism organele din ţesuturile lezate beneficiază de acumularea unor substanţe cu rol esenţial în inducerea şi stimularea proceselor de dediferenţiere. impuls ce declanşează transformări la nivel molecular. organe şi ţesuturi variate. Teoretic. puţine celule devin centrii generatori de noi şi noi celule suficiente pentru a asigura îndeplinirea fenomenelor de restituţie. se poate spune că şi în regenerare există o mare variabilitate în ceea ce priveşte reactivitatea celulară. din meristemele neoformate. morfofuncţionale. Factorii exogeni implicaţi în regenerare . Din celule somatice sau obţinut plante diploide.

temperatura. celulele epidermei hipocotilului. exprimarea totipotenţei depinde de stadiul de dezvoltare al explantelor. stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiţionează regenerarea şi reacţia explantului . pe de altă parte sunt numeroase referiri bibliografice care evidenţiază relaţia care există între genotip şi competenţa morfogenetică a explantelor cultivate in vitro. Alţi factori care influenţează regenerarea sunt: starea fiziologică a plantei donor. stresul (biotic sau abiotic). în special al unor aminoacizi. Astfel. inflorescenţele foarte tinere şi microsporii generează calusuri regenerative. specifice acestui tip de cultură. -sărurile minerale prezente în mediul de cultură (mai ales natura sursei de azot). dar şi specii care pot regenera atât lăstari cât şi embrioni in vitro. 1. Bibliografia existentă până în prezent subliniază dependenţa capacităţii morfogenetice de natura explantelor. Specia.4 Morfogeneza in vitro Întrucât la culturile in vitro morfogeneza prezintă aspecte particulare.2. Natura explantului. Deci. rădăcini sau embrioni. -natura şi concentraţia glucidului din mediul de cultură. precum şi condiţiile de mediu. compoziţia mediului de cultură. adeseori. natura şi concentraţia gazelor (O2. Numărul celulelor dintr-o populaţie cultivată in vitro care-şi exprimă potenţialul organogen sau embriogen se află sub controlul mai multor factori. intensitatea şi calitatea luminii. ce au permis o regenerare uşoară din orice tip de ţesut. adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen. celulele nucelei şi sinergidele. respectiv organogeneza şi embriogeneza. Calusurile iniţiate din ţesuturi tinere regenerează mult mai bine decât cele provenite din explante mature. Morfogeneza la culturile in vitro este influenţată. de exemplu la graminee numai embrionii imaturi. La unele specii (lucerna) toate tipurile de explante generează calus regenerativ. pot da naştere la tulpini. Folosirea unor explante mai tinere sau mai avansate în dezvoltare. -prezenţa. în mare măsură de anumiţi factori: -conţinutul endogen în fitohormoni şi aportul exogen de regulatori de creştere. În embriogeneza somatică directă. Sunt capabile sa parcurgă embriogeneza directă celulele embrionare. -prezenţa în substrat a unor compuşi organici.sunt:traumele şi natura acestora (stresul datorat introducerii unui explant în cultura in vitro). C2H4) dizolvate în mediu sau existente în atmosfera din recipientele de cultură. Genotipul. în condiţii specifice. vom adopta termenul de morfogeneză în sens larg iar în acest context. dar şi genotipuri recalcitrante. CO2. Acestea sunt celule competente morfogenetic în a răspunde la variaţi stimuli şi care. Există specii la care regenerarea are loc în special prin organogeneză şi specii care regenerează prin embriogeneză. La altele însă obţinerea plantelor in vitro este condiţionată de utilizarea anumitor explante. Totipotenţa este deţinută de către fiecare celulă a plantelor dar exprimarea sa aparţine numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. Vasil (1984) a considerat ca factor decisiv în menţinerea capacităţii morfogenetice. Vârsta explantelor. s-au evidenţiat genotipuri „culturabile”. . fotoperioada. vârsta culturii. S-a constatat că nu toate soiurile aparţinând unei specii cultivate au potenţial regenerativ. la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a făcut cu mare dificultate şi cu rezultate slabe. starea fiziologică şi de dezvoltare a explantului. faţă de cel optim. altfel spus un răspuns morfogenetic corespunzător a fost obţinut numai atunci când explantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. vom descrie procesele de morfogeneză sesizabile la nivelul explantelor cultivate in vitro.

Factorii care condiţionează menţinerea acesteia şi mai ales.4. sau a cărbunelui activ. lipsit de auxină (Teixeira. -factorii fizici (lumina. Cu toate acestea. din cauza dimensiunilor sale reduse şi a detaşării sale. sau în ce măsură schimbările intervenite în compoziţia mediului.-prezenţa în substrat a unor extracte complexe. pe o durată lungă de timp. Până în momentul explantării ţesuturilor.2. Deci lumina. în acest mediu. de aprovizionarea cu săruri minerale. mai ales în cazul studiilor de embriogeneză somatică şi de înrădăcinare a tulpinilor recalcitrante în a genera rădăcini adventive.1 Organogeneza in vitro Organogeneza in vitro este un proces foarte complex care depinde care depinde de o serie întreagă de fenomene biologice. 1981). starea fizică a acestuia. A. aflate în antecedenţa momentului explantării ţesuturilor. in vitro. se produce o pierdere a capacităţii rizogene. Uneori. În acest caz factorul genetic. trepte în care diferitele cerinţe fiziologice au fost satisfăcute. de substanţele introduse iniţial în mediul de cultură sau de către complexul ionic. starea fiziologică a celulelor pe care le deţine. alegerea explantului constituie factorul determinant în evoluţia acestora in vitro. vor depinde. Aspectele menţionate au fost foarte clar relevate. prealabile explantării.Rizogeneza in vitro Un anumit fragment explantat se comportă. capacitatea regenerativă şi mai ales organogeneza la nivelul inoculilor. se impune un pretratament. potenţialul osmotic al mediului. rădăciniţe s-au diferenţiat şi au crescut numai după ce explantele caulinare au fost scoase şi reinoculate pe un alt mediu. temperatura. împreună cu sistemul cărora le aparţineau. De exemplu. de temperatura mediului ambiant. s-a putut reţine faptul că factorul endogen este dominant în obţinerea unei anumite reacţii şi că pe lângă operarea unei modificări în condiţiile de incubare ale inoculilor. a lor cu soluţie nutritivă. De modul în care au fost asigurate aceste cerinţe. Din cele prezentate. ca o consecinţă a autoclavării. temperatura). reacţia explantelor. conţinând 100 mg/l AIB. mărimea explantului vârsta plantei mamă. afectează morfogeneza. cei care cauzează pierderea aptitudinii rizogene sunt în mică măsură cunoscuţi. Explantul însă. mai ales ca urmare a practicării unor repicări (subculturi) succesive. derivaţi din acestea. tipul vaselor de cultură sunt factori care pot influenţa în sens negativ morfogeneza. nu mai beneficiază de susţineri pe care să le primească de la muguri sau de la frunze şi rămâne în totalitate dependent de mediul de cultură. de scurtă durată. nici o tulpină nu a înrădăcinat dacă tulpinile au fost păstrate. de origine biologică. . în mare măsură. anumite trepte ale ciclului vital. El diferă de un butaş normal. Dintre aceste cerinţe amintim raportul endogen în fitohormoni şi conţinutul endocelular în nutrienţi. format în substrat. în procesele de morfogeneză. sub acţiunea inoculilor. Mugurii şi frunzele pot şi după desprinderea fragmentului de planta mamă să sintetizeze anumiţi compuşi hormonali. însă. are muguri şi eventual frunze. Se pune problema păstrării sau a redobândirii capacităţii rizogene. în linii mari. mai mult sau mai puţin. 1. întrucât cel clasic deţine bogate rezerve endogene. sunt tot atâţia factori care concură la evoluţia ulterioară a inoculului. celulele viitorului explant au parcurs. Nu se cunoaşte încă dacă morfogeneza este influenţată şi în ce măsură. ambele fiind dependente de iluminarea plantelor. ca un minibutaş. pentru inducerea înrădăcinării tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase.

denumită şi caulogeneză. poate perturba polaritatea. în condiţiile asocierii acestora cu auxinele. adeseori. a formării de muguraşi şi tulpiniţe. Alteori. variază mult. Dar nu există reguli general valabile. la nivelul . Rădăcinile se formează la polul radicular al explantului. în inducerea caulogenezei. într-o primă etapă. Aportul de auxină. Uneori. la orhidee. Uneori. respectiv formarea de centri vegetativi. B. uneori. de provenienţa şi natura inoculului. Temperatura optimă pentru rizogeneză este aceea de 26 oC. ci şi a realizării unui anumit raport al cărui eficienţă este variabilă în funcţie de specie. se poate declanşa caulogeneza reducând concentraţia de auxină. dar administrată în concentraţie mare. Dacă după o perioadă de menţinere a protocormilor pe mediu agarizat (câteva săptămâni) se submersează protocormii. asociată eventual cu o citochinină.Caulogeneza in vitro Formarea de muguraşi in vitro. la balanţa hormonală din substrat. a auxinei şi a unui mediu bogat în glucide. Inducerea caulogenezei. prin acoperirea lor cu soluţie nutritivă diluată. este esenţială atunci când se urmăreşte. dar este inhibată organogeneza. Trecerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declanşează organogeneza. rezultate pozitive prin cultivarea succesivă a acestuia. Cu toate că numeroase specii necesită o anumită fotoperioadă pentru inducţie florală. Adeseori această capacitate. Factorii externi (lumina. fie în prezenţa unei auxine mai slabe ca eficienţă. pe un mediu fie cu o concentraţie foarte ridicată de 2. Reuşita formării muguraşilor presupune nu doar prezenţa celor două tipuri de fitohormoni. sau cu apă distilată sterilă. Acţiunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor şi de etapele parcurse anterior. generat prin hibridare somatică. cel mai mare număr de muguraşi este atins atunci când se folosesc concentraţii relativ ridicate de citochinină. Astfel. ci şi natura şi concentraţia compuşilor utilizaţi ca regulatori de creştere. în prezenţa luminii. multiplicarea sau „reconstituirea” unei noi plante ori a unui genotip. formarea rădăcinilor este localizată polar. în concentraţie moderată. temperatura. în general se apreciază că formarea de muguraşi este independentă de fotoperioadă. La monocotiledonate capacitatea caulogenă este mai moderată.Lumina poate exercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slabă sau în urma unei perioade scurte de acţiune (600 lucşi mai puţin de o oră/zi). în dependenţă de tipul materialului vegetal. ar putea conduce cu succes la declanşarea procesului de înmugurire. Aptitudinea cerealelor de a forma muguri in vitro este foarte variabilă. calităţile fizice ale mediului) sunt controversaţi în ceea ce priveşte efectele lor asupra caulogenezei. iar reacţia explantelor. se obţin.4D. Temperatura recomandabilă pentru desfăşurarea optimă a proceselor de caulogeneză este aceea de 25 oC. La calus. se cunoaşte că menţinerea protocormilor în stare submersă favorizează multiplicarea acestora. Folosirea alternativă a mediilor lichide şi a celor solide poate exercita un efect benefic asupra producerii proceselor de morfogeneză. însă. se recomandă practicarea unei alternanţe între o temperatură scăzută (5-15 oC) şi ridicată. este stimulată de prezenţa în mediul de cultură a citochininelor. În cele mai multe cazuri. De asemenea trebuie menţionat şi faptul ca formarea de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii celor două categorii de fitohormoni. la nivelul inoculilor cultivaţi in vitro. În concentraţii optime auxina stimulează rizogeneza. se reuşeşte o stimulare a proceselor de organogeneză (Cachiţă. în timp ce generarea mugurilor este localizată la polul foliar. în concentraţie ridicată. Acest calus subcultivat pe un mediu cu aport scăzut în auxină şi cu un conţinut ridicat în citochinină. 1983). Se poate spune deci. de exemplu. Adeseori fiecare experienţă reprezintă un caz aparte. că nu este important doar raportul fitohormonal.

aflate din abundenţă în acest produs natural. Embrionii somatici sunt. 1959). aparent banală şi că această aptitudine nu este numai un apanaj al zigotului rezultat din fecundare. Embriogeneza somatică este fenomenul prin care din celule somatice iau naştere embrioni. unele dintre ele neîncadrate încă în această categorie de manifestări fiziologice. Habituaţia nu se referă numai la reacţia inoculilor în raport cu fitohormonii exogeni. Mecanismul habituaţiei este încă necunoscut. respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celulară şi de histogeneză finalizate cu formarea unui embrion se numeşte embriogeneză. în raport cu cerinţele de aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice. 1. pot prezenta un comportament deosebit (Gautheret. tipice cunoscute în embriogeneza clasică şi anume: celula generatoare dă naştere la un masiv celular care. -atât embrionul zigotic. cât şi cel somatic trec prin faze morfologice identice. trece prin transformări particulare.2.2. 1.calusului. există anumiţi factori de mediu care favorizează instalarea acestor fenomene. se pierde în timp.5 Habituaţia sau anergismul Habituaţia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se referă la totalitatea schimbărilor ereditare survenite spontan. -embrionul în formare are un anumit grad de autonomie şi nu este strict dependent de prezenţa unui anumit mediu constituit din albumen. Astfel.4D) şi temperaturile ridicate. Astfel. prealabil desprinderii lor din corpul plantei. Embriogeneza somatică in vitro a fost semnalată la morcov de către Steward şi colab. acestea privesc lipsa de reacţie. Indiferent de tipul embriogenezei. stadiul cordiform. . lipsit de punctul vegetativ (dominanţa apicală). ci priveşte o gamă mai largă de probleme. ci se sistează şi eventuala prezenţă a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimică controlau şi blocau dezvoltarea haotică a celulelor unui organism. regulatori de creştere sau vitamine. aşa cum este cazul la embrionul zigotic. moment în care se rup nu numai legăturile trofice şi fitohormonale avute. la un moment dat. deci. un rezultat al multiplicării repetate a unei celule somatice şi nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative. punctul de plecare în formarea viitoarei plante este o unică celulă. pe cale sexuată se pot genera embrioni care se aseamănă foarte mult cu embrionii zigotici. Celulele sale. Aşadar dintr-o celulă a sporofitului. s-a putut stabili: -capacitatea embriogenă este conţinută în fiecare celulă. Dintre ei amintim: auxinele (mai ales 2. explantul detaşat. la anumiţi fitoefectori. a materialului biologic. În embriogeneza somatică prin izolarea şi detaşarea explantelor se realizează eliberarea celulelor din intercorelaţiile fiziologice în care se aflau integrate. prezenţi în mediul de cultură. (1958) şi de către Reinert (1958. devenind autonome.4. specifice noii stări fiziologice. stadiul de torpilă sau torpedo. treptat suferă o succesiune de transformări denumite arbitrar stadiul globular. 1980). de răspuns.2 Embriogeneza somatică Procesul de formare a embrionului. Se ştie doar că. În inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adăugarea în mediul de cultură a laptelui din nucă de cocos datorită citochininelor naturale. pe măsura practicării unor subcultivări succesive (mai ales la grâu). Prin dezvoltarea tehnicilor de embriogeneză somatică s-a reuşit o cotitură în cercetările de embriologie experimentală.

giberelinelor. -inducerea proceselor de diviziune celulară. în cazul acestui fenomen. palisadic şi lacunar. etc. Aceste probleme au fost parţial rezolvate odată cu identificarea regulatorilor de creştere endogeni de tipul auxinelor (primul grup de fitohormoni recunoscut). vârf de creştere sau mugure). S-a constatat că prin adăugarea cărbunelui vegetal în mediul de cultură se elimină sau se reduce foarte mult procesul de vitrificare. pe lângă aspectul tehnologic. Ele suferă transformări morfofiziologice. Tehnicile de cultură in vitro. lumină. rădăcină. În condiţii aseptice. pH. 1980). cum ar fi formarea de noi lăstari (micropropagarea). valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus. devenind translucide. în anumite condiţii (cum ar fi exces de umiditate). pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creştere. compoziţia mediului de cultură. umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiţii artificiale de mediu. pornesc de la aceeaşi premiză: posibilitatea de a controla într-un mod optim factorii de mediu (temperatură.6 Vitrificarea sau sticlozitatea Fenomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor şi tulpinilor şi a fost semnalat la culturile de salată în seră (Gautheret. uneori ondulate şi casante. ne permit rezolvarea unui număr de probleme: -menţinerea unui explant viabil şi activ din punct de vedere vegetativ. -permiterea creşterii normale a unui explant reprezentat de o structură organizată (meristem. Studiile amănunţite asupra structurii frunzei au arătat că frunza nu are celulele diferenţiate în cele două ţesuturi.) rezultând o nouă organizare tisulară. -inducerea proceselor de diferenţiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe sau embrioni somatici. fapt pentru care li se acordă prima atenţie atunci când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice. în încercarea de a analiza funcţiile sale fiziologice sau de a-l conduce într-o anumită direcţie.8% de agar duc însă la scăderea ratei de multiplicare şi de aceea este foarte dificil de îmbinat cele două aspecte.2. înlocuindu-se aerul din ele. Concentraţii mai mari de 0.1 FENOMENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de plante.1% reduce vitrificarea (Orlikowska. De asemenea ridicarea concentraţiei de agar la 11. hipertrofiată. peţiol. Celulele sunt mult hidratate şi conţin clorofilă mai puţină. prezentând o creştere malformată. Meristemele lăstarilor vitrificaţi sunt mai mici decât la cei normali. Aceste substanţe par a determina orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială. . frunză. 1985). frunzele lor recurbându-se. Aspectul general este degenerat. rugoase. Se apreciază că. -inducerea proceselor de dediferenţiere. citochininelor. sticloase. CAPITOLUL II 2.1. plante vitroase pot să apară brusc. în cazul unor explante formate din celule diferenţiate (fragmente de tulpină. organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o consecinţă a infiltrării apei în spaţiile intercelulare.

-acţionează numai în interacţiune cu alţi fitoregulatori. etilena. în concentraţie mare sunt toxice. Primii fitohormoni descoperiţi au făcut parte din clasa auxinelor. sunt numite regulatori de creştere şi au anumite caracteristice comune: -acţionează într-o concentraţie foarte mică.1 Acidul β.indolil acetic (Fig. Etilena poate avea fie efect stimulator. identificat în anul 1965 şi substanţele fenolice identificate câţiva ani mai târziu.1.1 Auxinele Auxinele au fost descoperite în urma unor experimente asupra coleoptilului la Gramineae. fie efect inhibitor asupra plantelor. Numele de auxine provine din grecescul auxein – a creşte. Este un compus ce are la bază nucleul indolic cu formula de bază C10H9O2N cunoscut sub numele de acid β. funcţia lor fiind determinată de balanţa hormonală stabilită între ei. Proprietăţile fiziologice ale auxinelor . Toate aceste substanţe. Fig. sintetice sau naturale. a fost recunoscută ca regulator de creştere atunci când metodele de măsurare a acesteia au permis detectarea sa în organele plantelor. giberelinele şi citochininele fiind descoperite mai târziu. de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide. Aceste trei tipuri de regulatori de creştere exercită o acţiune stimulativă asupra metabolismului celular.1). De asemenea. O diferenţă substanţială între fitoregulatorii de creştere artificiali şi cei naturali constă în faptul că cei endogeni pot fi controlaţi de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminaţi suficient de repede.indolil acetic A. Există şi fitoregulatori de creştere artificiali cu formule chimice asemănătoare celor naturali. ceea ce înseamnă că sunt sintetizate de plante.2. Numeroase lucrări ştiinţifice privitoare la aceste subiect au evidenţiat prezenţa lor. Există şi substanţe cu efecte inhibitoare asupra creşterii şi dezvoltării celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic. determinând elongarea celulelor (auxesis – creştere ce se referă în special la mărimea celulei decât la numărul de celule).1. Aceste substanţe sunt endogene.1. pe când cei artificiali persistă mult mai mult fiind deseori preferaţi aplicaţiilor practice. în anii ’50. un compus gazos.1 Regulatorii de creştere Existenţa hormonilor vegetali a fost bănuită încă de la începutul secolului trecut. prezentând o acţiune fiziologică similară. dar nu leau putut identifica decât mult mai târziu. 2. -intervin într-un număr de fenomene fiziologice ce implică mai multe moduri de acţiune astfel încât noţiunea de hormon (cu un efect rizogenic sau caulogenic specific) a fost abandonată. în jurul anului 1934.

numite calus. Acest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui număr de celule asemănătoare. pentru a asigura multiplicarea şi elongarea celulelor. Sinteza auxinelor are loc la nivelul frunzelor tinere. Au fost descoperiţi receptori şi pentru alte tipuri de fitoregulatori de creştere. -influenţează în general metabolismul celular şi în particular sinteza ARN-ului ribozomal (ribozomii participă la sinteza proteinelor). Astfel. -au acţiune rizogenică fiind folosite în special în micropropagarea speciilor ornamentale destinate comerţului de flori tăiate. auxinele sunt prezente într-o concentraţie suficientă în vârful plantelor în creştere. Apoi rezistenţa peretelui scade şi celula creşte în lungime. ceea ce duce la o descărcare de ioni de H+. Auxinele circulă de la vârful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunţată în organele tinere. s-au sintetizat compuşi chimici similari acestora. în particular asupra fenomenelor de dominanţă apicală. Auxinele în plante Toate plantele sintetizează auxine. -modifică permeabilitatea membranei plasmatice. în mugurii florali sau foliari. etilena intervine în schimb în reglarea nivelului de auxină cel puţin la nivelul vaselor conducătoare. Pe baza acestei ipoteze au rezultat următoarele concluzii: -în funcţie de prezenţa sau absenţa unuia sau a celuilalt receptor apar diferenţe de reacţie în concordanţă cu originea celulei ce reacţionează la acest fitohormon. ceea ce confirmă . de aici se poate extinde ideea existenţei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni. care au generat în celulele vegetale efecte similare auxinelor endogene. sinteză modulată de stadiul de dezvoltare ale acestora. fie citoplasmatici specifici auxinei. Studiind câteva din efectele lor s-a putut concluziona că: -exercită o acţiune clară asupra elongării celulare. a mugurilor şi în florile şi fructele tinere. determinând o creştere a acidităţii responsabilă de diminuarea rezistenţei peretelui celular şi o absorbţie de ioni de K+. Aceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din acţiunea singulară a auxinei deoarece concentraţia optimă este diferită pentru fiecare tip de acţiune în parte şi se schimbă în funcţie de concentraţia celorlalţi fitoregulatori. B. C. -determină întârzierea căderii frunzelor şi a fructelor. Nu se poate da un răspuns precis. -acţionează asupra sintezei etilenei într-o anumită concentraţie. Auxinele sintetice De când au fost identificate auxinele. ceea ce înseamnă că auxinele sunt în concentraţie mai mare în apropierea situsurilor de sinteză. Modul de acţiune al auxinelor. dar cercetările în domeniu au evidenţiat existenţa unor receptori fie membranari. -în funcţie de afinitatea receptorului pentru auxină unii sunt angrenaţi mai repede decât alţii. -acţionează asupra tropismului plantelor şi asupra corelaţiei dintre organe. aceste efect urmează creşterii plasticităţii peretelui celular şi penetrării apei în celulă. dar în cursul transportului lor sunt descompuse de auxin-oxidaze. -stimulează diviziunea celulelor cu origine cambială (acest tip de acţiune a determinat insuccesele din primele încercări de iniţierea a culturilor in vitro). iar acţiunile lor depind de concentraţiilor şi de interacţiunile cu alţi regulatori de creştere.Auxinele intervin în multe fenomene fiziologice.

cele mai importante sunt: -acidul. Primele observaţii (1926) au fost făcute pe plante de orez atacate de o ciupercă (Giberella fujikuroi) care prezentau internoduri mult elongate şi frunze clorotice. Această primă descoperire a fost urmată de descoperirea altor gibereline până când în plante şi în ciuperci au fost identificate în total aproximativ cincizeci de gibereline. . giberelinele folosite sunt extracte purificate. -acidul 2. ca urmare a efectului invers exercitat de acidul abscisic. De aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dacă implică un risc mai mare de toxicitate.indolil butiric (AIB). Mai mult.3) şi mai puţin folosite sunt amestecul GA4+GA7 sau GA7.2 Giberelinele Asemeni auxinelor. În practică. Aceştia sunt toţi compuşi endogeni. În aplicaţiile agricole. Printre numeroasele substanţe folosite. 2. Prima giberelină identificată a fost acidul giberelic sau GA3 (un complex izolat în 1939 şi numit „giberelina A”).4 D). Şi în domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleaşi substanţe urmărindu-se în principal efectele rizogenice şi de multiplicare a celulelor pe care acestea le generează. -acidul naftalen acetic (ANA – Fig. având în vedere că primele gibereline sintetice au fost obţinute prin anii ’80. ceea ce a condus la ideea existenţei unei substanţe responsabile de aceste efecte.4 diclorfenoxiacetic (2. compuşii auxinici sunt folosiţi pentru cicatrizarea rănilor rezultate în urma tăierilor anuale din pomicultură. Cea mai folosită giberelină este GA3 (Fig.existenţa receptorilor pentru auxine. efectul giberelinelor a fost evidenţiat înainte ca acestea să fie identificate. în evidenţierea fructelor partenocarpice sau pentru întârzierea căderii frunzelor sau a fructelor până la recoltare. Este posibil ca în următorii ani să fie folosite gibereline sintetice.2 Acidul naftalen α-acetic În practică. Extractul apos din ciupercă a provocat simptome similare la plantele testate. Fig. auxinele endogene pot fi folosite. fiind influenţaţi mai puţin de activitatea auxinenzimelor . fiind mai puţin toxice dar şi mai puţin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibată de acţiunea auxin-oxidazelor.1.2) şi derivaţii săi: acidul naftooxiacetic (ANOA) şi naftilacetilamida (NAD). vor putea avea un efect prelungit în plante.1.

care. unele sunt inactive sau doar forme intermediare. -acţionează asupra înfloririi. ceea ce le face dificil de studiat. în acest caz. care acţionează direct sau după asocierea cu un receptor. în absenţa acestora. dar nu asupra tuturor speciilor. şi sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei auxin-oxidazelor. acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor laxe). -în organogeneză. împiedică maturizarea timpurie (cu 15 până la 20 de zile la Cyclamen) sau alungirea inflorescenţelor prea dezvoltate (ex: la viţele de vie cu ciorchini denşi. sau stimulează înflorirea speciilor ce necesită temperaturi scăzute pentru a înflori. mandarin. ce necesită de asemenea temperaturi scăzute pentru înflorire. procesele fiziologice normale. astfel încât în prezenţa giberelinelor aceste specii înfloresc şi fără temperaturi scăzute (morcov). o enzimă cu rol în transformarea amidonului în zaharuri solubile. Astfel. în general varietăţile pitice nu reacţionează la efectul de elongare al acidului giberelic. acţionând însă . -în cultura in vitro giberelinele acţionează şi la nivelul meristemelor. pe când în celălalt caz asupra procesului de înflorire.3 Acidul giberelic Toţi aceşti compuşi au un nucleu similar (nucleul giberelic) diferind doar prin calitate şi poziţia substituenţilor în nucleu. neputând fi folosite in vitro în acest scop. Principalele proprietăţi ale acidului giberelic sunt: -acţionează asupra elongării internodurilor. prezintă un aspect globular. este datorată acidului giberelic. acţiunea giberelinelor poate fi antagonică. atunci când condiţiile climaterice (temperaturi scăzute) nu permit acest lucru. Aceste contradicţii în aparenţă au o explicaţie simplă: în plantele prezentate mai sus frigul acţionează doar asupra creşterii tulpinii. Nu toate giberelinele au activitate similară. inducând şi ramificarea sau creşterea ramurilor la Hydrangea. în prezenţa auxinelor. La alte specii. giberelinele.Fig. cum ar fi cazul pomilor fructiferi. A. acumularea α-amilazei. prun. uneori determinând rezultate spectaculoase (ex: s-au obţinut plante de varză cu tulpina de 3 m). nu toate plantele posedă aceleaşi gibereline. Giberelinele acţionează. de asemenea. -stimulează metabolismul celular deoarece favorizează sinteza enzimelor hidrolitice. -exercită o acţiune complexă asupra germinării seminţelor sau pornirii în vegetaţie a mugurilor dorminzi. Par a se opune fenomenului de dediferenţiere. Proprietăţile fiziologice ale giberelinelor Proprietăţile fiziologice ce urmează a fi descrise corespund acidului giberelic (GA3). iar mai mult. -acţionează asupra formării fructelor partenocarpice la păr. S-a dovedit că la seminţele de orz. îşi exercită doar rolul de stimulatori ai elongaţiei neinfluenţând. Doar unele dintre varietăţile pitice ale unor specii pot atinge talii normale în urma aplicării de GA3. având ca efect fie inhibarea inducerii florale. prezenţa giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fără formarea florilor (sfeclă). Acidul giberelic acţionează şi asupra pedunculilor florali.

S-a descoperit şi acum este bine cunoscut faptul că adiţia de lapte de nucă de cocos în mediile artificiale de cultură are un efect favorabil asupra multiplicării celulare şi în lăstărire.4) -izopenteniladenina.9). Aceste rezultate au dat posibilitatea continuării cercetărilor asupra purinelor şi în 1956. b) kinetina Se mai folosesc şi alţi înlocuitori ai adeninelor. în mugurii foliari şi florali. Unele gibereline se pot întâlni doar în plante. Citochininele sunt înlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscuţi doi compuşi endogeni: -zeatina (Fig.1. Giberelinele în plante Giberelinele au fost descoperite atât în plante cât şi în ciuperci cu o distribuţie inegală. în alte specii se află şi acţionează mai multe tipuri de gibereline.4) (6furfurilaminopurina) şi benziladenina (BAP) (6-benzilaminopurina).3.asupra meristemelor apicale sau axilare şi asupra butonilor florali. 2. Auxinele favorizează duplicarea ADN. o substanţă activă numită „chinetina”.4. cele două complementându-se reciproc. Skoog a izolat. În acest proces citochininele sunt indispensabile. Cercetările ce au încercat să descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui complex chimic activ de natură purinică. a cărei compuşi sintetici sunt: chinetina (Kin –Fig. în vârful rădăcinilor şi în embrioni.1. dar ineficiente fără acţiunea auxinelor. în lăstarii activi. . din ARN denaturat. Locurile de sinteză a giberelinelor se află la nivelul frunzelor foarte tinere. a) b) Fig. Proprietăţile fiziologice ale citochininelor Citochininele sunt foarte active în plante şi asemeni celorlalte două clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprietăţi dintre care: -au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. liberi sau în asociere cu zaharuri. prin stimularea creşterii şi dezvoltării acestora.4 Citochinine: a) zeatina. care nu a putut fi iniţial identificat. fiind însă antagonice rizogenezei. iar citochininele permit separarea cromozomilor. eliberându-se în situsurile ţintă.7. A. B. Unele plante posedă doar un fel de gibereline. -au un rol la fel de important în organogeneză stimulând formarea lăstarilor.3 Citochininele Citochininele au fost descoperite în timpul studiilor efectuate asupra ţesuturilor vegetale cultivate in vitro. Giberelinele circulă liber prin plantă fără existenţa unei polarităţi fiind asociate deseori zaharurilor. sintetici. altele doar în ciuperci şi unele în ambele grupe (acizii giberelici 1.

Citochininele prezintă o importanţă deosebită în domeniul culturii in vitro deoarece au permis obţinerea unor progrese importante în micropropagarea plantelor. -are acţiune favorabilă asupra tuberizării. prin rolul ce-l joacă în compoziţia ARN-ului de transfer şi protejând metaboliţii de acţiunea enzimelor hidrolitice.5 Etilena Principalele proprietăţi ale acestui regulator de creştere sunt: -determină iniţierea procesului de maturare a fructelor. corelaţii de creştere) iar unele antagonice (căderea frunzelor şi fructelor. o proprietate folosită în horticultură. Citochininele în plante Prima citochinină endogenă a fost identificată în 1963 în embrioni imaturi de porumb. urmată de izopentenil adenina (IPA). Aceste proprietăţi au unele puncte comune cu auxinele (înflorirea Bromeliaceaelor. Proprietăţile citochininelor permit rezolvarea dificultăţilor enumerate mai sus. Se presupune ca ele circulă într-o formă inactivă şi că rămân localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior. ca în cazul aplicaţiilor pe frunze. favorizând sinteza proteinelor. orientarea celulelor spre dediferenţiere.4 Etilena Etilena (fig. Citochininele se pot asocia cu zaharurile şi circula prin plante fără polaritate.5) este un compus gazos identificat cu mult timp în urmă în încăperile de depozitare a fructelor sau plantelor. tuberizarea). B. stimularea diviziunii celulare. . dar funcţia sa de regulator de creştere nu a fost evidenţiată până în momentul dezvoltării tehnicilor de analiză în plante. Creşterea în dimensiuni a tuberculilor şi fructelor se datorează prezenţei citochininelor endogene localizate în aceste organe. -exercită un efect antagonic asupra dominanţei apicale stimulând lăstărirea axilară. Toate plantele conţin citochinine sintetizate în special în rădăcini şi în embrioni. Fig. Acest efect determină întârzierea senescenţei până la punctul în care frunzele mature tratate cu citochinine se comportă asemănător celor tinere din punct de vedere metabolic.1. descoperită puţin mai târziu în plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens.1. Aplicarea citochininelor pe frunze determină atragerea substanţelor nutritive spre aceste zone datorită efectului de stimulare a metabolismului exercitat de citochinine la acest nivel. Etilena se află în plante în cantităţi infime şi poate fi produsă de toate părţile acesteia. -modifică ritmul de creştere prin acţiunea pe care o exercită asupra polarităţii transportului auxinelor. cum ar fi menţinerea viabilităţii celulelor vegetale. fiind folosită atunci când se urmăreşte recoltarea mecanizată a fructelor la cireşi şi măslini. -accelerează procesele de cădere a frunzelor şi fructelor.-exercită un efect de stimulare a metabolismului celular. 2. etilena fiind folosită la început pentru coacerea fructelor la lămâi. de unde şi numele de zeatină. -induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae (ananas). iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la măr şi cireş.

printre substanţele endogene enumerându-se compuşii fenolici şi acidul abscisic. într-un număr mare în plante. dificil de utilizat în starea sa gazoasă. Existenţa acidului abscisic în celule este una din cauzele cărora plantele supuse unor factori stresanţi îşi încetinesc activitatea metabolică. însă cantitatea cea mai mare se sintetizează în fructe. la început prin încetinirea creşterii acestora urmată de stoparea totală a acesteia. Nu se ştie exact rolul şi mecanismul lor în inducerea stării de latenţă. Inhibitorii fenolici Inhibitorii fenolici. unde se oxidează cauzând brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea explantelor. Toate părţile plantelor sunt capabile să sintetizeze etilena. Fig. 2. inhibă metabolismul şi intervine în multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de creştere. unde se eliberează etilena. aplicat prin pulverizare penetrează ţesuturile.5 Inhibitori ai creşterii Multe substanţe au efecte inhibitoare asupra creşterii plantelor. cele mai importante proprietăţi ale acidului abscisic sunt: . fie ca inhibitori ai reacţiilor metabolice. Ei intervin în inducerea stării de latenţă a mugurilor şi seminţelor. În culturile in vitro aceşti compuşi sunt deseori sintetizaţi şi eliberaţi în mediul de cultură. A.Acţiunea antagonică a etilenei pare a depinde de interacţiunea dintre cele două substanţe ce pot controla sinteza. Acest produs. B. Acest inhibitor pare să fie sintetizat de fiecare dată când o plantă este supusă unor condiţii stresante (lipsa apei. rănire. au făcut progrese doar după descoperirea acidului 2-cloro-etan fosforic. căldură excesivă). Aplicaţiile practice ale etilenei.6 Acidul abscisic Proprietăţile acidului abscisic sunt similare celor ale compuşilor fenolici. cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea înrădăcinării la altoii de măr.1. apoi într-o concentraţie mai mică în flori şi organe rănite.6) a fost identificat în 1965 şi de atunci a fost descoperit în toate plantele. Există câteva exemple referitoare la folosirea substanţelor fenolice în cultura in vitro. Astfel. de aceea în unele medii de cultură se utilizează substanţe anti-oxidante sau adsorbanţi pentru a detoxifia mediul. Încetinirea activităţii plantelor este reversibilă atunci când condiţiile de stres sunt trecătoare şi poate induce starea de latenţă sau chiar decesul plantei atunci când condiţiile nefavorabile sunt prelungite.1. Acidul abscisic Acidul abscisic (fig. concentraţia şi circulaţia lor.

se induce rizogeneza. Aceste observaţii pot conduce la supoziţia că nopţile lungi favorizează sinteza acidului abscisic. indică faptul că fiecare celulă deţine toate informaţiile necesare regenerării unei plante întregi. -acţionează asupra înfloririi. poate inhiba complet înflorirea acestora (Volubilis) sau inhiba parţial (Chenopodium rubrum). şi în funcţie de speciile folosite şi de condiţiile de cultură utilizate poate induce reacţii foarte diferite şi greu de interpretat. comportamentul fiziologic al explantelor va fi: -dacă raportul auxine – citochinine este mare. însă cu cât cercetările avansează. capabil să reacţioneze în condiţii artificiale de cultură unde să evolueze spre multiplicare clonală mai mult sau mai puţin semnificativ în funcţie de răspunsul obţinut. Aplicarea acidului abscisic la plantele de zi scurtă cultivate în condiţii perfecte de periodism. Micropropagarea face posibilă obţinerea . -dacă raportul este apropiat de unitate. de exemplu un explant. dar în cele mai multe cazuri aceştia au doar rol stimulator sau favorizant şi rareori esenţial.2 ALEGEREA EXPLANTULUI Celulele vegetale vii au capacitatea potenţială de a intra în diviziune şi de a reproduce un individ întreg similar plantei donor. Lolium temulentum). Raportul citochinină–auxină influenţează procesele fiziologice din explante. Această schemă generală este întotdeauna valabilă. 2. Concentraţiile lor se schimbă în cursul diferitelor stagii fiziologice şi sunt diferite pentru fiecare parte a plantei. Chiar dacă toate celulele au totipotenţă nu este uşor. ceea ce poate influenţa închiderea stomatelor. -dacă raportul este subunitar se induce lăstărirea. determinând evoluţia acestora în diferite sensuri în funcţie de concentraţia celor doi fitohormoni. -determină creşterea permeabilităţii celulelor faţă de ionii de potasiu. Concluzii Regulatorii de creştere endogeni sunt prezenţi în plante pe tot parcursul vieţii acestora. după Skoog. cel puţin pentru moment. acidul abscisic poate inhiba înflorirea atunci când plantele sunt supuse unor condiţii normale de fotoperiodism (spanac. Aplicat asupra plantelor de zi lungă.-acţiune favorabilă asupra căderii frunzelor şi fructelor. chiar dacă există variaţii în funcţie de tipul de explant şi mai ales în funcţie de specia luată în cultură. cu atât numărul acestora va creşte. explantele tind spre o funcţionare caulogenică. Este mai uşor de ales un grup de celule. explantele au tendinţa să genereze formaţiuni calusare. Această capacitate denumită „totipotenţa celulară”. Astfel. dintre care cele mai importante sunt auxinele şi citochininele. În cazul în care plantele de zi scurtă sunt supuse unor condiţii de zi lungă poate induce înflorirea unora dintre specii şi inhibarea altora. pentru aceeaşi etapă fiziologică. Tehnicile de cultură in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal. să se folosească în practică această calitate. proprietate ce este tot mai mult exploatată în culturile in vitro. sau chiar stimula înflorirea (Plumbago). dar această supoziţie este prea simplă pentru explicarea modului diferit de acţiune a acidului abscisic. dar prezenţa acestora nu este constantă. Acidul abscisic este foarte puţin folosit în culturile in vitro. Pe lângă aceşti fitoregulatori principali există şi alţi regulatori de creştere ce s-ar putea dovedi indispensabili. Variaţia continuă în plante a conţinutului în regulatori de creştere determină problemele legate de alegerea momentului de recoltare a explantului.

celule responsabile de creşterea tulpinii. de această dată somatici. şi o parte internă sau corpus. diferenţierea celulară intervine ca urmare a două cauze: pe de o parte. De creşterea plantelor sunt responsabile două tipuri de meristeme: meristemul caulinar ce determină creşterea părţii aeriene a plantei şi meristemul radicular. Într-o secţiune transversală se poate observa o parte apicală unde celulele au o activitate mitotică redusă. De la acest stadiu începe diferenţierea celulară. în aranjamentul filotaxic al frunzelor (distribuţie . ce determină creşterea părţii subterane a plantei. în care acţionează programul embriogenic. putându-se păstra şi rezista condiţiilor nefavorabile din mediul înconjurător. că ciclul de viaţă al unei plante se împarte în patru stadii principale.2. Stadiul vegetativ Când condiţiile externe sunt favorabile şi starea de latenţă este întreruptă seminţele germinează şi din embrion ia naştere o nouă plantă. 2. ce induce intrarea embrionului în starea de latenţă. după ce substanţele sunt depozitate în albumen sau cotiledoane. hipocotilul. nu se cunoaşte pe deplin mecanismul diferenţierii celulare. Meristemul caulinar are o funcţionare ritmică programată genetic cu o precizie aflată. Seminţele pot fi apoi diseminate. iar spre interior în parenchim cortical şi vase conducătoare. Oul astfel format este protejat de ovul unde începe să se dividă. iar pe de altă parte. Sfârşitul acestei prime etape este marcat. datorită eredităţii genetice a celulei (fiecare celulă are acelaşi echipament informaţional genetic). Aceste structuri filtrează informaţiile şi permit sau împiedică circulaţia unuia sau altui semnal capabil să modifice programul informaţional spre un anumit tip de celulă. Înainte de a decide criteriile de selecţie ale unui explant este necesară cunoaşterea evoluţiei fiziologice ce va ajuta la înţelegerea diferenţelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plantă atunci când este detaşat de planta mamă. fiind alcătuit dintr-o parte externă. de deshidratarea seminţei. în general. ce modulează funcţionarea fiecărei celule. datorită poziţionării specifice a celulei care va fi recunoscută de structurile membranare. dar şi cu mediul de cultură. Meristemul caulinar are o structură bine definită. În momentul de faţă. Embriogeneza Embriogeneza începe cu fecundarea unei oosfere de către un anterozoid. determină un schimb de semnale biochimice. Celulele se organizează la început într-o masă sferică (faza globulară a embrionului). înconjurată de un inel de celule aflate în diviziune activă. în primul rând. epiderma de două sau trei straturi numită tunica. apoi se dezvoltă forme simetrice reprezentând cotiledoanele rudimentare (faza cordiformă a embrionului dicotiledonat) după care se dezvoltă structurile cotiledonare. Centrul este umplut de meristemul medular. Diviziunea începe de la inelul iniţial: zona epidermală diferenţiază în frunze rudimentare spre exterior. În contextul ipotezei mai sus menţionate.1 Etapele fiziologice ale unei plante În contextul reproducerii sexuate se poate preciza. B. însă uneori este şi sursă de variabilitate genetică atunci când explantul este supus anumitor condiţii. gemula şi radicula (stadiul de torpedou al embrionului). Specializarea celulelor este încă foarte puţin datorată unei funcţionări programate şi mai mult datorită unui program genetic ce se va păstra şi în celulele mature ce în anumite condiţii se vor comporta similar unor celule gametice. dând naştere unor organe sau embrioni.de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă. într-o manieră simplistă. Se presupune că poziţionarea celulelor în relaţie cu celelalte celule. A.

rădăcinile primesc de la frunze substanţe nutritive bogate în glucozide. plantula este hrănită din rezervele nutritive aflate în endospermul seminţei. Această arhitectură poate fi modificată prin curăţarea de uscături sau ramuri nefolositoare. În contrast frunzele îşi menţin forma. Aceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante. deseori conturate în interiorul embrionului. stabilind corelaţii de creştere între sistemul aerian şi cel subteran al plantei. vitamine şi de asemenea în regulatori de creştere. Se remarcă aici că florile ce permit identificarea şi clasificarea plantelor se bazează aproape exclusiv pe caracterele morfologice. Fig. Ipoteza prezentată mai sus privitoare la diferenţierea celulelor în interiorul embrionului poate fi luată în considerare similar celei privitoare la meristeme. etc). rădăcinile transportă spre frunze sărurile minerale şi compuşii organici odată cu regulatorii de creştere. În schimb. sunt diferite de frunzele adulte. vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar. tulpini întortochiate sau împrăştiate. specie specifice.corespunzătoare unei simetrii particulare fiecărei specii) şi. Fig. prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de creştere. Planta creşte şi devine capabilă să se hrănească singură. în forma frunzelor. fiind cunoscute sub denumirea de frunze juvenile.7 Meristem apical Corelaţiile. în al doilea rând. ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecărei plante (arbore. tufiş. La început. primele frunzuliţe.8 Meristem radicular .

Se pot cita câteva modele de culturi in vitro. Inelul iniţial încetează progresiv să mai funcţioneze şi se observă că celulele centrului latent intră în diviziune activă iniţiind formarea florii sau a inflorescenţei. alături de alţii). Stadiul de senescenţă Stadiul de senescenţă urmează stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfârşitul vieţii lor. umiditate). Modificările modului de acţiune pot fi controlate fie de plantă şi în aceste condiţii variaţiile climatice nu au nici un efect. un an pentru plantele bienale sau mai mulţi ani pentru cele perene. Această succesiune. Cercetările asupra naturii stimulilor ce acţionează asupra meristemelor florale nu sunt concludente. secetă. caz în care planta percepe aceste variaţii şi drept răspuns emite stimuli ce vor direcţiona meristemul spre stadiul reproductiv. perioadele de creştere alternând cu cele de repaus. ce devine mult mai sensibilă la toate tipurile de atac. formarea frunzelor şi a părţilor aeriene. această etapă începe prin încetinirea funcţiilor rădăcinilor odată cu debilitarea întregii plante. schimburile de substanţe nutritive se reduce şi plantele se pregătesc de iernare. sau părţile aeriene ale plantelor ierboase se usucă. etc). Aceste nou program este la fel de precis ca şi precedentul şi se presupune că mecanismele de diferenţiere sunt similare. care reflectă adaptarea plantei la climatul mediului înconjurător. cerenţelGeum urbanum. în general. sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane. asigurând prin fertilizare. Plantele ce intră în perioada de latenţă îşi sistează creşterea. Această caracteristică permite plantei să supravieţuiască mai mulţi ani (Saintpaulia. fructificarea epuizând rezervele. În ultimul caz. existenţa un timp îndelungat a condiţiilor nefavorabile de mediu poate duce la împiedicarea înfloririi. D. Dacă aceste meristeme sunt induse artificial să înflorească. Florile angiospermelor sunt considerate lăstari modificaţi constituite dintr-un ax central şi anexele sale sterile (periantul) sau fertile (staminele şi pistilul). Diferenţierile încep la margini unde se formează staminele şi părţile fertile ale plantei: staminele şi pistilul. umiditate. de la câteva săptămâni la câteva luni pe an. Floarea constituie ultimul stadiu în viaţa unui meristem.Această diferenţă indică faptul că principalele corelaţii implică. lumină. în funcţie de specie. C. fie de variaţiile climatice (temperatură. Atunci când revin condiţiile favorabile (latenţa mugurilor este indusă de obicei de temperaturile scăzute) reîncep creşterile. care e controlată mai degrabă de fenomene de creştere relative decât de moştenirea genetică. continuitatea speciei. Instalarea stării generative este progresivă şi la început poate fi reversibilă. iar frunzele speciilor lemnoase cad. . plantele înfloresc şi mor comportându-se asemeni unei plante anuale. substanţele glucizidice nefolosite sunt păstrate în rezerve. informaţii despre întâietatea mugurilor. căpşun. Stadiul reproductiv Stadiul reproductiv este marcat de modificările de ritm în funcţionarea meristemului caulinar. este determinată de stimulările sau inhibările reliefate ca răspuns la variaţiile condiţiilor de mediu (temperatură. La unele specii. Nu este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor să intervină cel puţin la începutul acestui stagiu fiziologic (acidul abscisic şi etilena. La unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. lumină. La speciile perene. rădăcinile nu mai hrănesc planta în mod normal. etc). ştiindu-se doar că intervin unii fitohormoni dar şi alte substanţe. radiculare sau chiar reproductive. în care. Stadiul vegetativ durează. variind componentele mediului de cultură şi proporţia fitoregulatorilor de creştere s-au putut obţine meristeme caulinare. în unele condiţii este posibil să se revină la starea vegetativă.

ceea ce a permis specificarea cerinţelor nutritive pentru cultura ţesuturilor speciilor studiate. embrionii pot fi excizaţi din ovul şi inoculaţi pe mediul de cultură dacă se află în stadiul globular. plantele tinere sunt sursa cea mai potrivită de explante. Datorită acestui fapt. această tehnică permite studierea cerinţelor speciale necesare unui embrion izolat. interacţiunile pe distanţă scurtă. cu excepţia arborilor adulţi. când embrionii pot fi avortaţi sau mor imediat în ovul.2 Selecţia explantelor în funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei mamă În funcţie de stadiul fiziologic şi vârsta plantei donor explantele pot reacţiona diferit la condiţiile culturii in vitro. echilibrul endogen dintre regulatorii de creştere evoluează continuu şi reflectă la un moment dat. Acesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniţiate din explante bătrâne. ţesutul prelevat prezintă un răspuns favorabil in vitro şi este sursa multor succese în domeniu. În acest stadiu.2. Un altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din sămânţă. În unele cazuri aceasta este singura cale cunoscută. potenţialul de adaptabilitate al explantelor la condiţiile artificiale de viaţă diminuându-se cu vârsta plantei mamă. Astfel. ce depinde de stadiul fiziologic şi de vârsta plantei donor. ci şi ultimele evenimente petrecute cu acea celulă. În cursul embriogenezei. În cursul deplasării lor fitohormonii sunt controlaţi de sistemele enzimatice existente în plante. Aceste interacţiuni sunt de aşa natură încât de-a lungul unui ciclu de viaţă al unei plante. La aceste specii. La aceste specii ţesuturile de origine ale noilor lăstari sunt genetic apropiate de stadiul juvenil. dar şi de organul de pe care se prelevă. deoarece în stadiul tânăr aceştia au o capacitate rizogenică ridicată. precum şi de mărimea şi natura fragmentului excizat. 2. În unele cazuri. Ţesuturile embrionare sunt uşor regenerative. iniţierea culturii doar din butaşi nu mai este posibilă. pentru multe specii. dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obţinut rezultate notabile. calitatea tehnică a lemnului nu este măsurabilă. putând reproduce un individ normal şi complet.Această scurtă prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieţii unei plante ne permite înţelegerea importanţei interacţiunilor ce reglează morfogeneza plantelor. După germinarea în stadiul juvenil. Planta va putea să se adapteze noilor condiţii datorită schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizaţi în anumite locusuri. predominant genetice. Altoiul . Alt tip de interacţiuni sunt interacţiunile dintre organe ce permit plantelor să recunoască mediul înconjurător şi variaţiile ce intervin la nivelul acestuia. În general. -a doua tehnică este aplicată pentru multiplicarea speciilor pomicole şi arboricole tropicale şi a coniferelor. Pe de altă parte. probabil datorită faptului că se află în apropierea rădăcinilor. Această tehnică permite rejuvenilizarea şi obţinerea de altoi. circulând în direcţia unui punct ţintă ce răspunde la acel stimul. această tehnică permite creşterea şi dezvoltarea normală a acestor embrioni. au loc la nivelul embrionilor şi al meristemelor vegetative şi regenerative. la recoltarea unui explant trebuie să se ţină seama de valoarea acestui echilibru. de încrucişare interspecifică sau intergenerică. Există două tehnici ce permit obţinerea de puieţi la speciile pomicole şi arboricole: -una ar fi utilizarea lăstarilor tineri de la baza speciilor pomicole şi arboricole. potenţialul de cultură in vitro a explantelor prelevate de la acesta se diminuează. nu doar starea prezentă a mediului înconjurător al celulei. Această tehnică prezintă un interes scăzut atunci când se are în vedere micropropagarea (potenţialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu excepţia cazului strict de autogamie). şi în mod deosebit la arbori. Odată cu înaintarea în vârstă a plantei donor. Acest fenomen este specific mai ales plantelor perene. În acest caz lăstarii par a avea caracteristici juvenile şi înrădăcinează mai repede (de exemplu la nuc şi eucalipt). totuşi.

creşte şi este apoi înlăturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. După mai multe altoiri altoiul începe să prezinte caracterele juvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butăşire. La culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. Prima frunzuliţă ce se formează are caractere juvenile (prima frunzuliţă a meristemului la viţă de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din sămânţă, de asemenea, şi la orhidee meristemele dezvoltă, în cultura in vitro, protocorm identic cu cel obţinut din sămânţă). Rejuvenilizarea observată este deseori obţinută din prima subcultură, însă uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obţine aceste efect, în funcţie de specie. Întoarcerea la stadiul juvenil poate fi datorată supresiei de informaţii citoplasmatice sau datorită diminuării considerabile a acestora determinând astfel posibilitatea regenerării de noi celule. Mecanismele exacte ce determină aceste fenomen nu sunt încă pe deplin cunoscute. Se pare că citochininele sunt implicate, cel puţin parţial, în acest proces, dar ele nu acţionează singure. Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci când plantele donor sunt în stadiul reproductiv. Se pare că schimbările ce apar în ritmul de funcţionare al meristemelor este favorabil şi determină în ţesuturi un echilibru optim culturii in vitro. Se pot obţine culturi din ţesuturi prelevate de la plante aflate în stadiul de senescenţă, dar rezultatele sunt în general slabe sau incomplete. 2.2.3 Selecţia explantelor în funcţie de vârsta explantului Problemele legate de vârsta explantului apar la speciile perene în care se poate distinge un stadiu activ şi unul lent, latent, între care reacţiile fiziologice sunt diferite. Astfel, primele experimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au eşuat atunci când s-a încercat iniţierea unei culturi de ţesuturi din meristeme prelevate de pe ramuri în vegetaţie, dar au avut succes atunci când s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi. De-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimbă. Primăvara organele cresc şi analizele relevă prezenţa regulatorilor de creştere de tipul auxinelor, giberelinelor şi citochininelor. Vara transportul fitohormonilor prin vasele conducătoare se diminuează, iar toamna se sintetizează inhibitorii creşterii. De aceea, nu e surprinzător faptul că explantele, prelevate de la aceeaşi plantă în perioade variate ale vegetaţiei, vor da răspunsuri diferite chiar dacă vor fi plasate pe acelaşi tip de mediu. De aceste considerente trebuie să se ţină seama atunci când se are în vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Unele explante au tendinţa de a înrădăcina uşor atunci când sunt prelevate în anumite faze de vegetaţie, în special dacă sunt excizate în perioada de vegetaţie, când concentraţia de auxină este maximă. La speciile cunoscute deja ca „recalcitrante” la cultura in vitro, pentru realizarea rejuvenilizării se poate supune planta mamă, pentru o perioadă scurtă, unui tratament cu temperaturi scăzute, unui regim de lumină particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern în vederea stimulării rizogenezei. 2.2.4 Selecţia explantelor în funcţie de amplasarea plantei donor După determinarea stadiului şi perioadei optime explantele pot fi prelevate. După tipul de organizare a fragmentului ce urmează a fi cultivat in vitro se pot lua în considerare două cazuri:

1.Explantele ce au o structură rudimentară sau organizată, cum e cazul mugurilor, apexurilor caulinare, meristemelor şi apexurilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi, deoarece acestea sunt receptive şi ridică cele mai puţine probleme, generând cu uşurinţă, în condiţiile unui mediu de cultură adecvat, structuri organizate (de exemplu, organe). Dacă mediul de cultură nu este potrivit poate tulbura funcţiile explantului şi conduce la dediferenţierea celulelor, generând calus. Utilizarea acestui tip de explante este similară unei microbutăşiri şi este tehnica cel mai des folosită atunci când se urmăreşte micropropagarea pe scară largă a unei specii. Interesant de amintit este faptul că explantele posedă un fel de memorie a tipului de creştere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind în special întâlnit la speciile lemnoase. La mai multe plante la care corelaţiile de creştere sunt puternice, explantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rădăcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pământ şi nu erecte. Unele cercetări au evidenţiat faptul că această „memorie” aparţine celui mai apropiat internod de lângă meristem. 2.Explantele constituite din diferite tipuri de ţesuturi, cum ar fi fragmente de tulpină, frunze, flori şi fructe, cărora, inoculate pe mediu de cultură, li se induce o reversie completă cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide şi de a-şi câştiga din nou capacitatea organogenică. Pentru aceste explante, în funcţie de specie, s-a dovedit că toate părţile plantei sunt capabile să urmeze procesul dediferenţierii conducând spre o nouă organizare structurală. Dar, în acest caz, diferenţele între specii sunt uriaşe. Unele specii, cum ar fi violetele de Parma, sunt capabile să regenereze din toate părţile plantei (peţiol, limb, rădăcini, petale, stamine, polen, ovule), alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi Actinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obţinute doar din fragmente de tulpină. Unele specii sunt total recalcitrante, nereuşindu-se iniţierea culturii de ţesuturi din explantele amintite, iar la unele conifere s-a reuşit obţinerea de propaguli doar din cotiledoane. În general, cele mai bune rezultate au fost obţinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar şi tulpini tinere. 2.2.5 Selecţia explantelor în funcţie de mărimea şi natura acestora Mărimea explantului ce urmează a fi cultivat prezintă cea mai mare importanţă. Cu cât explantul este mai mare cu atât echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant şi mediul de cultură va avea o influenţă limitată. În cazul explantelor de dimensiuni mici direcţionarea acestuia în sensul dorit se face mai uşor, deoarece explantul este receptiv la substanţele din mediul de cultură, şi anume la regulatorii de creştere existenţi. Explantele organizate cuprind în general un nod, un apex sau un mugure (solzii protectori sunt înlăturaţi), fiind o unitate suficient de completă pentru care mediul va favoriza creşterea, sau în cazul diferenţierii axilare, va bloca creşterea apicală. Pentru meristemele ce trebuie să aibă dimensiuni foarte mici, există o mărime minimă ce conţine domul meristematic cu două primordii foliare. Sub această mărime supravieţuirea explantului este foarte dificilă şi pierderile sunt mari, peste această dimensiune, răspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , însă în detrimentul eliminării virusurilor. Dimensiunile explantelor variază între 5 şi 10 mm, ceea ce corespunde unei manipulări uşoare a materialului vegetal, sub aspectul excizării sau prelevării, fasonării şi inoculării acestora. De exemplu, prin cultivarea pe acelaşi mediu de cultură, a mai multe fragmente de peţiol de Saintpaulia, de 1,5; 3; 5 şi 7 mm, s-a observat că doar fragmentele de peste 3 mm au generat plantule normale. Fragmentele de 1,5 mm au generat două tipuri de rezultate: unele explante s-au veştejit, iar altele au format doar rădăcini. Fără îndoială, în

ultimul caz, auxinele prezente în mediu au jucat cel mai important rol, pe când în cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat în joc şi fitohormonii endogeni. Se pot fasona explante din diferite tipuri de ţesuturi: epidermal, cortical, parenchim medular, dar şi răspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de ţesut este cel epidermal. Ţesuturile corticale şi cambiale prezintă de asemenea rezultate bune, dar rămân deseori în stadiul de calus. Parenchimul medular este ţesutul cel mai puţin regenerant, aceste ţesuturi cer o armonizare perfectă între regulatorii de creştere, un exemplu fiind dat de Skoog, care a folosit măduvă de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre auxine şi citochinine. Din ţesuturi epidermale de câteva straturi grosime a fost posibilă orientarea regenerării spre stadiul caulogenic (lăstari), rizogenic (rădăcini), calusogenic sau reproductiv. Acest experiment confirmă ipoteza unei activităţi crescute a fitohormonilor asupra explantelor de dimensiuni reduse. Cel mai mic explant este constituit dintr-o singură celulă, cum e cazul protoplaştilor izolaţi mecanic sau enzimatic. Protoplaştii sunt capabili de a se divide şi a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

2.3 RĂSPUNSUL EXPLANTELOR ÎN CULTURĂ
Prima problemă ce trebuie rezolvată, atunci când se iniţiază o cultură in vitro este menţinerea viabilităţii (pe lângă problema asepsiei) explantului. Deseori se poate observa, după fasonarea explantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin în contact direct cu mediul de cultură, fenomen datorat oxidării substanţelor fenolice sintetizate în mediu, oxidare ce are efect toxic asupra celulelor vegetale. Mai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre explant şi mediul de cultură. Nu toate speciile prezintă fenomenul de brunificare a explantelor, deoarece la aceste specii problema este parţial rezolvată prin imersia explantelor într-o soluţie antioxidantă (soluţie de acid ascorbic cu acid citric în proporţie de 0,5 % respectiv 0,05%), imediat după fasonarea acestuia sau prin adiţia în mediul de cultură a unor substanţe adsorbante sau detoxificante, cum ar fi cărbunele activ (1 până la 4 g/l) sau polivinilpirolidonă (5 până la 10g/l). Odată rezolvată această problemă este necesară orientarea explantului, în funcţie de natura sa, în direcţia dorită de operator. 2.3.1 Explante cu structură rudimentară Explantele din această categorie pot fi cultivate prin două metode. Prima metodă constă în inducerea creşterii apicale prin adiţia în mediul de cultură a fitohormonilor din clasa auxinelor şi/sau a giberelinelor, foarte rar se pot adăuga şi citochinine, întotdeauna într-o doză foarte mică. După iniţierea pe acest tip de mediu se observă apariţia unor formaţiuni calusare la baza explantelor. Este de dorit ca aceste explante să rămână de dimensiuni mici, deoarece dacă acest calus creşte în dimensiune, ceea ce deseori se întâmplă, indică existenţa unui dezechilibru între substanţele minerale sau fitohormonii din mediul de cultură. După formarea calusului, ce are rol protector (asemeni calusului format la o rană) se formează prima frunzuliţă, apoi prima rozetă de frunze şi mai târziu are loc elongarea tulpinii (axului principal). Aceste etape morfogenice pot avea loc pe acelaşi tip de mediu la unele specii ornamentale (crizanteme, garoafe) sau pe două medii succesive, la speciile lemnoase. Primul mediu va iniţia creşterea, putând fi utilizat ulterior şi pentru propagarea fragmentelor cu un nod (microbutăşire). Al doilea mediu, îmbogăţit cu auxine (cel mai frecvent, acidul indolil acetic), serveşte ca mediu de înrădăcinare (Actinidia, măr, numeroase specii lemnoase).

se observă în primul stadiu formarea de calus (calusogeneza). adică celulele ce răspund uşor culturii pe mediu artificial. ce poate avea loc pe acelaşi mediu de cultură sau pe alt mediu. un minim de variabilitate. Aceste celule se vor organiza într-un meristem. dispar moleculele specializate. unde celulele regenerante se divid activ. În al doilea stadiu. care va dezvolta ulterior o plantulă întreagă cu tulpini şi rădăcini. rădăcini) sau generativ (ax floral. fruct). în special cele provenite din tunică. urmând etapele embriogenezei. stadiu denumit histogeneză. dar şi de genotipul de la care se prelevă celulele generatoare. La alte specii. Acest tip de reversie este mai uşor de obţinut la celulele vegetale şi mai greu la cele animale. acelaşi mod de a se dezvolta ca şi explantele organizate. cu vacuole mici şi nucleu voluminos. a unei formaţiuni calusare cu rol protector. numit organogeneză. petale. nu se mai formează calus şi deci tot explantul moare. se dezvoltă meristemul ce va da naştere noii plantule. în funcţie de specie. mai puţin frecvent. Ca o trăsătură generală. inducerea embriogenezei depinde în cea mai mare măsură de compoziţia mediului de cultură. Celulele aflate în imediata apropiere a mediului sunt primele ce încep să se dividă şi să se dediferenţieze. În unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultură pentru înrădăcinarea lăstarilor.2 Explante constituite din diferite tipuri de ţesut Aceste explante sunt compuse din diferite celule asociate în ţesuturi fără o organizare structurală. descris pentru prima dată la celule de morcov. Celulele ce răspund la cultura in vitro trebuie să treacă prin procesul de dediferenţiere. Lăstarii regeneraţi pot fi izolaţi şi crescuţi pe mediu pentru creştere. putând proveni din orice parte a sistemului vegetativ (tulpină. doar că se cere un mediu mai complex pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltării complete până la stadiul de plantulă. nucleul se măreşte. şi doar în al doilea stadiu. Observând un explant în cultură se observă formarea. sepale. Când se formează meristemul prezintă. stamine. Al doilea proces de organizare. frunze. este acela în cursul căruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat. este precedată de formarea de calus. a fost descoperit la mai multe specii. adică sa se întoarcă la stadiul de celule nediferenţiate. Utilizarea acestui tip de explante este importantă deoarece asigură posibilitatea efectuării unui număr foarte mare de subculturi şi. atât anuale cât şi perene. Observaţiile asupra acestui tip de celule au evidenţiat câteva modificări ce intervin în procesul dediferenţierii: se reduce volumul vacuolar. ovul.3. uşor de realizat prin adiţia în mediul de cultură a auxinelor.A doua metodă constă în blocarea creşterii apexului caulinar favorizând regenerarea şi dezvoltarea lăstarilor laterali (axilari). celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza perişorilor glandulari. fără hormoni sau cu acid giberelic în concentraţie mică. Vom vorbi astfel de embrioni sau embriogeneză somatică. dar celulele fiice vor fi capabile să se organizeze într-o masă meristematică ce se va dezvolta întrun nou individ. mediu adiţionat în general cu auxine. După realizarea acestor modificări celulele încep să se dividă. cum este cazul la Begonia şi Saintpaulia. 2. dar pot avea şi alte origini. Celulele păstrează capacitatea de a se divide. Acest fenomen. de exemplu la Begonia rex. sunt cele epidermale. cum ar fi Pelargonium. citoplasma devine mai densă. mai întâi. din punct de vedere genetic. citoplasma celulară devine şi mai densă. polen. . În multe cazuri embriogeneza somatică. Dacă celulele ce vin în contact cu mediul brunifică. caz în care mediul de cultură este adiţionat cu citochinină (de la 1 la 10mg/l). în acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv (Fig 9). Celulele ce răspund la cultura in vitro au o poziţie precisă. În general celulele ţintă.

caz în care. iar al doilea va induce germinarea embrionilor. Fig. Primul asigură formarea embrionilor. în timpul acestor subcultivări are loc diluţia fitohormonilor la nivel celular permiţând astfel dezvoltarea normală a celulelor. cea mai mare rată de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus. apoi apare simetrie între forme şi embrionul evoluează spre stadiul cordiform şi apoi într-un embrion capabil să genereze o plantulă (Fig 10). sau modificări citoplasmatice). c) generând o plantulă În al doilea rând. În funcţie de răspuns. putând servi şi ca mediu de micropropagare. Această variabilitate poate fi suficient de mare şi în unele cazuri a fost chiar folosită pentru inducerea de mutanţi.În cursul dezvoltării se observă cum celulele se divid şi embrionii ajung în stadiul globular. 9 Embrioni somatici de morcov regeneraţi din calus Utilizarea explantelor diferenţiate este foarte avantajoasă deoarece sursa de explante este nelimitată şi rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. b) în stadiul cordiform. aceste explante prezintă unele dezavantaje la nivel genetic. datorită ritmului intens de diviziune celulară numeroase celule pot prezenta modificări la nivel genetic (modificări cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei.10 Embrioni somatici de citrice: a) în stadiul globular. Uneori sunt necesare mai multe subcultivări pe medii fără hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici şi creşterea plantulelor. Pentru celulele capabile să genereze embrioni somatici sunt suficiente două medii de cultură. celulele ce dau naştere noilor plantule sunt somatice şi există probabilitatea ca celule mutante să genereze embrioni din care să ia naştere noi plante. a b c Fig. În primul rând. prin stimularea formării calusului pe medii adecvate fitohormonal şi chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creşterea .

ce sunt încă incomplete. camera de aclimatizare. lipsite de igrasie. laboratorul de preparare a mediilor. s-a observat că printre plantulele neoformate unele prezentau modificări morfologice evidente mai ales citoplasmatice. modificarea pH-ului şi astfel dezvoltarea explantelor este inhibată. prelevarea. curent electric. În consecinţă. atât a materialului biologic cât şi a mediului de cultură. Orice defecţiune poate perturba desfăşurarea normală a lucrărilor efectuate în acest laborator. dar pe de altă parte. dimensionarea şi inocularea explantelor vegetale se realizează în condiţii aseptice. a căror echilibru în mediul de cultură este determinant pentru orientarea celulelor să funcţioneze într-un ritm ales de operator. camera de distilare a apei. -zona sterilă – este constituită dintr-o cameră sau incintă sterilă. sunt baza de la care s-a pornit în realizarea multor aplicaţii practice. grupate în funcţie de lucrările care se execută în ele. ceea ce duce la modificarea proprietăţilor substratului de cultură. praful şi murdăria constituind surse de infecţii. cum ar fi: repartizarea mediilor de cultură. eliberarea de toxine. În toate compartimentele laboratorului trebuie asigurată o curăţenie perfectă. Dimensionarea încăperilor şi dotarea lor cu aparatură depinde de specificul muncii prestate (cercetare. CAPITOLUL III 3. seră şi solarii. În cazul în care această asepsie nu este asigurată. să prezinte instalaţii de iluminare. cercetările asupra culturilor ce au pornit de la explante diferenţiate au permis înţelegerea modului de acţiune al fitoregulatorilor de creştere. . laboratorul de testare a infecţiilor. camera pentru sterilizarea sticlăriei şi a mediilor de cultură. în mediul de cultură pot apărea infecţii microbiene şi fungice în circa 2-5 zile de la inoculare. de fiecare dată când propagarea unei specii necesită trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calităţii genetice a plantelor obţinute. toate în perfectă stare de funcţionare. ţinând cont de echilibrul endogenic. Aceste cercetări. producţie sau miniproducţie). O condiţie esenţială în reuşita unei culturi in vitro constă în realizarea unei asepsii perfecte. aceştia din urmă permit cercetătorilor manipularea materialului biologic în sensul dorit.1 Organizarea spaţiilor într-un laborator de culturi in vitro Laboratorul de culturi in vitro trebuie să cuprindă mai multe încăperi.probabilităţii mutaţiilor. Ca o concluzie a celor spuse mai sus. canalizare. 3. în două zone: -zona nesterilă – cuprinde: spălătorul. Toate operaţiunile.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE CELULE ŞI ŢESUTURI VEGETALE Încăperile destinate cultivării in vitro a explantelor vegetale trebuie să fie: luminoase. camera frigorifică.1. După fragmentarea calusurilor şi inocularea lor pe medii pentru regenerare. unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a început să fie tot mai mult folosit. Nu se ştie nici în prezent care este modalitatea de a determina exact concentraţia şi balanţa hormonală atunci când se apelează la fitoregulatori exogeni. camera de creştere.

curent electric.Camera pentru sterilizare Destinaţie: este locul în care se efectuează sterilizarea mediilor de cultură. -în cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea să fie autoclavate înainte de a fi deschise pentru a se evita răspândirea infecţiei în laborator. în funcţie de volumul de muncă existent în laborator. pH-metru (Fig. pupinele pentru presterilizarea instrumentarului. -pardoseala trebuie să fie acoperită cu un material uşor lavabil. a apei distilate şi a vaselor de cultură. Organizare: -trebuie să fie prevăzută cu pardosea din ciment şi instalaţie de canalizare. băi marine. -este dotată cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate. coşuri pentru gunoi. sterilizarea vaselor cu mediu de cultură se realizează în casolete metalice sau coşuri de sârmă. -în unităţile cu activitate mai redusă sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate se poate face şi în kukte. gaz. conectată la curent electric şi să posede o sursă de apă.A. -această încăpere va fi dotată cu etuve. -se elimină resturile de mediu şi resturile vegetale din vasele de cultură. trebuie să existe două tipuri de autoclave: unul conectat la reţeaua de curent electric (fig. Această încăpere trebuie să fie organizată astfel: -să fie prevăzută cu ciment pe jos şi cu canalizare în pardoseală. -este dotată cu etuve pentru sterilizarea sticlăriei. -poate să fie dotată şi cu un distilator pentru apă. -spălarea sticlăriei se va face în bazine de capacitate corespunzătoare. agitatoare magnetice. -mediile de cultură cu agar se colectează şi se aruncă la gunoi. 1) iar celălalt având ca sursă de energie gazul metan. Modul de spălare: -se pregăteşte sticlăria care urmează a fi spălată. -se clăteşte sticlărie în apă de robinet şi apoi în două reprize de apă distilată.2). congelator. 2. frigider. . -se efectuează spălarea propriu-zisă folosind perii utilizate în spălarea sticlăriei. -să fie dotat cu o chiuvetă cu apă caldă şi rece. -trebuie să fie dotată cu instalaţii de canalizare. dulapuri pentru depozitarea sticlăriei. suporturi pentru uscarea sticlăriei. apă curentă. Se consideră sticlăria curată atunci când la suprafaţa acesteia nu mai aderă nici o picătură de apă.Spălătorul Destinaţie: este încăperea în care are loc spălarea sticlăriei şi recipientelor destinate culturilor in vitro. -se pune sticlăria la înmuiat în apă caldă cu detergent. Organizare: -trebuie să fie spaţioasă şi iluminată corespunzător. Zona nesterilă 1. 3. iar mesele să fie placate cu faianţă sau folie melaminată pentru a fi uşor de întreţinut. sa fie racordată la reţeaua de gaze. în bazinele destinate spălării. -se aşează sticlăria pe suporturile speciale destinate uscării acesteia.Camera pentru prepararea mediilor de cultură Destinaţie: este încăperea în care se realizează prepararea mediilor de cultură.

sistem de climatizare. realizând o intensitate luminoasă de 3000-4000 lucşi.Camera de creştere Destinaţie: este destinată păstrării inoculilor în condiţii optime în vederea creşterii şi dezvoltării acestora. între 22-24oC. şi colab. Zona sterilă Camera sterilă Destinaţie: în această încăpere se execută repartizarea mediului de cultură precum şi prelevarea. -nivelul temperaturii trebuie să fie. dar fără apă curentă şi canalizare. Organizare: -trebuie să fie cât mai izolată de restul încăperilor din zona nesterilă pentru a preîntâmpina vehicularea germenilor. -cea mai importantă dotare din camera sterilă este hota cu flux de aer steril.1995) reliefează că durata “zilei” poate fi redusă fără probleme la 10-12 ore realizându-se astfel importante economii de energie. -fotoperioada în camera de creştere trebuie să fie. . 1994. în camera de creştere trebuie sa existe unui sistem de agitare. 4. balanţă tehnică şi balanţă analitică (Fig. cuptor cu microunde. -pentru culturile pe mediu lichid.2 micrometri. precum şi un variat sortiment de sticlărie. reducerea umidităţii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultură cu consecinţe grave asupra plantelor.distilator (Fig. în general. Organizare: -trebuie să fie perfect curată. având poliţe situate la distanţe de 40-50 cm. -hota cu flux de aer steril trebuie să posede sistem propriu de iluminare şi posibilitatea ataşării a 1-2 becuri de gaz. cele mai folosite sunt hotele cu flux de aer orizontal. -alte dotări în camera sterilă sunt: scaune rotative pentru personalul care lucrează la hotă. scopul urmărit şi tipul de cultură aceasta poate varia între 15-30oC. -iluminarea se realizează cu tuburi fluorescente. -camera va fi ocupată cu rafturi pe care se aşează vasele de cultură. pentru asigurarea oxigenării ţesuturilor explantului inoculat.. fiecare poliţă având sistem de iluminare ce poate fi întrerupt separat. iar pereţii cu faianţă. sterilizarea şi inocularea explantelor sau subcultivarea materialului biologic crescut in vitro.3). sunt două tipuri de hote – cu flux de aer orizontal şi flux de aer vertical. faianţată.4). -umiditatea din camera de creştere trebuie să fie cuprinsă între 70-75%. bine izolată de mediul extern. -pardoseala va fi placată cu gresie. dotată cu instalaţie de curent electric. de regulă. -înainte de începerea lucrului cu cel puţin 20 minute hota se porneşte pentru a se realiza sterilizarea incintei de lucru. de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. ele trebuie să permită lucrul a două persoane concomitent. măsuţe pentru depunerea vaselor cu medii şi a celorlalte materiale folosite în perioada de lucru. dulapuri pentru sticlăria sterilă. studii recente (Teodorescu Al. curent electric. ambele fiind dotate cu baterii de filtre ce permit reţinerea particulelor mai mari de 0. B. -trebuie să fie prevăzută cu instalaţii de gaz. în acelaşi timp se pune în funcţiune lampa UV şi se pulverizează alcool în interiorul hotei. în funcţie de specie.

-compuşi organici. cu ocazia primei utilizări. -pH-metru. cuţite. pentru inoculări. baloane cotate. -substanţe indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal. -aparat de distilat şi bidistilat apa. -bisturie.2 Dotările necesare într-un laborator de culturi in vitro Sticlăria Se utilizează toate tipurile de recipiente de sticlă. pentru a evita pasarea repetată a plăntuţelor chiar dacă mediul de cultură nu a fost epuizat. pâlnii. iar în camera sterilă se va clăti cu alcool şi va purta echipamentul specific: halat alb. praf de curăţat. Aparatura şi dispozitivele Dotările necesare într-un laborator de culturi in vitro sunt (Fig. De aceea. -aparat de fotografiat. boneta şi mască pe figură. vase Petri. ceea ce conduce la risipă de substanţe chimice. Substanţe necesare În laboratorul de culturi in vitro se utilizează o serie de substanţe: -săruri anorganice. După această operaţiune se poate utiliza în inoculări. -foarfeci. alcool. 3. compuşi toxici în mediul de cultură. care sunt livrate steril. De reţinut: orice recipient nou din sticlă eliberează. sticle şi borcane pentru reactivi.-înainte de începerea lucrului personalul se va spăla pe mâini în antecameră.1. Într-un laborator sunt necesare pipete. -microscoape şi lupe binoculare. -aparat pentru repartizarea mediului de cultură. pahare Berzelius. -reactivi de uz comun. Este bine ca vasele să fie din sticlă termorezistentă de tip Pyrex sau din silicat de bor. -etuve. -balanţe analitice şi tehnice. -frigidere de mare capacitate. . -alte materiale chimice: detergenţi. după care se umple cu apă bidistilată şi se autoclavează de 2-3 ori câte 30 minute.11): -hota cu flux de aer steril. lame de ras. se recomandă ca sticlăria nouă să fie spălată cu apă şi detergent şi apoi limpezită. cilindri gradaţi. folosite într-un laborator de chimiebiologie. -agitatoare magnetice. seringi. săpunuri. se folosesc vase speciale din material plastic autoclavabile şi cutii Petri din material plastic de unică folosinţă. Se are în vedere tipul de vase utilizate pentru inocularea materialului biologic. Instrumentar În lucrările de culturi in vitro se lucrează cu instrumentar de tip chirurgical: -pense de diferite forme şi mărimi. Din ce în ce mai des. -centrifugă. pahare Erlenmayer. anse. amestec cromic. -ace. -autoclav.

i) autoclav .a b c d e f g h i Fig. d) lupă binoculară. e) distilator. g) centrifugă. c) microscop binocular. f) balanţă analitică.11 Dotările necesare într-un laborator de culturi de celule şi ţesuturi vegetale a) etuvă. h) balanţă tehnică. b) pH-metru.

Compuşii anorganici şi rolul lor Apa Apa reprezintă componentul esenţial al vieţii. În funcţie de scopul urmărit. pentru asigurarea succesului culturii. Pentru menţinerea explantelor la suprafaţă şi pentru ca acestea să nu fie asfixiate. au nevoie de condiţii speciale de cultură. Pierderea apei din ţesuturi provoacă perturbări metabolice direct proporţionale cu cantitatea de apă pierdută. În prezent se cunosc destul de bine modificările pe care le suferă plantele când elementele chimice sunt în exces sau în deficit. Nitsch. Compoziţia mediului de cultură este specifică pentru fiecare specie. Trebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare şi concentraţia soluţiilor utilizate în funcţie de starea .1 CERINŢELE NUTRITIVE ALE ŢESUTURILOR VEGETALE CULTIVATE ÎN CONDIŢII ASEPTICE 4.1. Soluţia nutritivă complexă lichidă sau solidă se numeşte mediu de cultură sau substrat de cultură. chiar în cadrul aceluiaşi soi. să fie protejate de agenţii patogeni (asepsie totală) şi să aibă ca sursă de hrană o soluţie nutritivă complexă. el trăieşte heterotrof pe baza substanţelor existente în mediu. formată din apă. al materiei vii. substanţe organice şi fitohormoni.1 Compoziţia chimică A. În prezent se cunosc şi se utilizează o serie de medii de cultură ce poartă numele celor care le-au creat: White. cerinţele fiind diferite şi în funcţie de explantul folosit. În această ultimă fază plantele sunt capabile de rehidratarea ţesuturilor puse în condiţii favorabile de umiditate. studii privind absorbţia şi desorbţia. cât şi prin studii ale sevei brute şi elaborate la diferite specii. schimbul ionic care există între plantă şi mediul înconjurător.1. soi şi fază de dezvoltare. Gamborg. Compoziţia mediului s-a stabilit atât prin tatonări repetate cu diferite substanţe. dacă deficitul de apă se menţine plantele mor. după desprinderea de planta donator. evoluţia explantului poate fi dirijată prin modificarea compoziţiei mediului. La culturile in vitro există momente când explantele pot să-şi piardă turgescenţa prin pierderea apei. deoarece soluţiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenţilor patogeni.1 Mediul de cultură Explantele vegetale pentru a putea trăi. obţinându-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei. Stresul hidric este suportat de plante dacă este de scurtă durată şi dacă nu se atinge nivelul de veştejire.1). momente în care trebuie acordată atenţia cuvenită. Sterilizarea materialului vegetal este o etapă critică din acest punct de vedere. Heller (Tabelul 4.CAPITOLUL IV 4. până la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente şi elemente de diluţie până la concentraţia dorită. Murashige-Skoog. Trebuie evitate pe cât posibil aceste stări de stres pentru plante atât la cultura în câmp. Acest mediu de cultură trebuie sa fie steril şi cu o compoziţie complexă deoarece explantul nu are capacitate de a se hrăni autotrof. 4. de la spălarea materialului vegetal şi a vaselor de cultură.1. săruri minerale. cât mai ales la culturile in vitro. momentul de prelevare şi zona din care s-a prelevat. Este utilizată în tot „fluxul tehnologic” de producere a plantelor in vitro. mediul de cultură se solidifică cu un agent de solidificare.

O. fosfaţii. Mo. Na. Mg. pentru evitarea pierderii apei prin exosmoză.01 0.75 0. vasele trebuie să fie închise pentru a evita pierderea apei prin transpiraţie. deci eliberată de ionii minerali pe care îi conţine. Cele mai utilizate sunt: azotaţii. Manipulările sub hotă trebuie făcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidratează relativ uşor explantele care stau descoperite. Fe. etc. apa trebuie distilată.03 1. H.8 10.0 0. utilizarea uneia sau alteia din săruri este în funcţie de cerinţele fiecărei specii şi de faza de vegetaţie. sterilizare ce se face în autoclav odată cu sterilizarea mediului sau separat. Cu.025 27. Mg.0 0.025 750 600 250 125 75 65 720 16. 1977) Constituenţi Heller White Nitsch mg/l Macroelement KCl NaNO3 MgSO4 x 7H2O NaH2PO4 x H2O CaCl2 x 2H2O CaCl2 KNO3 Na2SO4 (NH4)2SO4 NH4NO3 KH2PO4 Ca(NO3)2 x 4H2O Microelemente FeSO4 x 7H2O Na2EDTA x 2H2O MnSO4 x H2O MnSO4 x 4H2O KI NiCl2 x 6H2O CoCl2 x 6H2O ZnSO4 x 7H2O CuSO4 x 5H2O 0. La spălarea materialului vegetal după sterilizare se foloseşte apă sterilă. N.3 25 10.8 37. Zn.3 0.03 7.5 80 200 300 185 166 950 720 68 370 440 1900 1650 170 250 150 150 2500 134 Murashige Skoog Gamborg .0 0.3 22. K. Tabelul 4. -microelemente sau oligoelemente.025 2.utilizate în concentraţii de ordinul milimolilor – C. Al. Ca.8 37. Pe timpul creşterii explantelor în camera de creştere.1 Principalele medii de cultură utilizate în culturi in vitro (după Street. prin rănile care sunt mari comparativ cu mărimea lui. clorurile şi sulfaţii de Ca. altfel datorită dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraţie.83 0. S. P. Absorbţia elementelor din mediu se face sub formă de ioni.75 3.01 0.025 8. utilizate în concentraţii de micromoli. Mn.0 0. Pentru respectarea strictă a concentraţiilor soluţiilor stoc sau a mediului. ce ar determina concentrarea mediului în elemente nutritive.0 27. K.025 27. Prelevarea explantelor trebuie făcută repede.0 0. ar provoca crăparea mediului şi ca atare slaba creştere a culturilor. Sărurile anorganice Substanţele anorganice sunt introduse în mediu sub formă de săruri.de vegetaţie a materialului vegetal.6 0. În funcţie de cantitatea de elemente ce se foloseşte în mediu. elementele se împart în: -macroelemente .

25 100 1.5 0. deci târziu. Magneziul întră în compoziţia clorofilei. reglează permeabilitatea membranelor celulare. care controlează întreg procesul metabolic al plantelor.25 100 0. Dozele pe litru sunt de cca. Principalele surse de carbon sunt glucidele. Se adaugă în mediu sub formă de compuşi simpli sau complecşi. de natura explantului.0 0. intervine în schimbul ionic la nivelul membranelor. În prezent se cunosc principalele reţete utilizate pentru speciile cultivate care se pretează la cultura in vitro. Dintre glucide zaharoza răspunde cel mai bine cerinţelor culturilor in vitro. Împreună cu calciul. Compuşii organici Sursele de carbon Viaţa in vitro este aproape în exclusivitate heterotrofă. .0 2% 10.0 0.0 1. cisteina. 2-3% în funcţie de faza de vegetaţie şi tipul de explant folosit.5 0. Carenţa de N duce la acumulări de antociani în vacuolele celulelor.01 3.5 2 0. iar dacă aceasta persistă provoacă dereglări în metabolismul glucidelor şi proteinelor. alanina.03 - 1.5 0. până la formarea unui număr suficient de mare de frunze pe fiecare plantulă sau lăstar. Principalii aminoacizi utilizaţi sunt: glicina. de concentraţia lui.H3BO3 FeCl3 x 6H2O Na2MoO4 x 2H2O AlCl3 Fe(SO4)3 Constituenţi organici Inozitol Acid Nicotinic Piridoxină HCl Tiamină HCl Glicină Acid folic Biotină Zaharoză 1.5 0.01 0. faşă de azotul organic care este mai greu accesibil. carenţa provocând dereglări grave în structura frunzei. Acolo unde nu s-a experimentat încă. cu valoare biologică ridicată de tipul enzimelor.2 0.5 2. Potasiul influenţează creşterea ţesuturilor.0 10 2% Diferenţele ce există între diferite reţete de mediu. în funcţie de forma lui nitrică sau amoniacală influenţează vitrificarea.05 2% 6. constau în raportul dintre diferiţi ioni.05 0.0 1. când nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. trebuie făcute tatonări pentru găsirea celei mai adecvate compoziţii pentru mediu. Carenţele pentru elementele minerale in vitro se manifestă după 2-3 subculturi. glutamina etc.25 100 5 0. a fluidităţii protoplasmei. De exemplu N are rol important în embriogeneza somatică. Rolul fiziologic al fiecărui element depinde de forma chimică în care se găseşte în mediu. B.5 0. Datorită acestei nutriţii heterotrofe mediul de cultură trebuie să conţină un compus care să asigure carbonul organic necesar în metabolism. carenţa determină o dezvoltare slabă. asparagina.0 0.1 2. Acestea sunt substanţele cele mai utilizate şi mai accesibile plantelor ca sursă energetică.0 3% 3. Microelementele exercită roluri metabolice şi fiziologice diferite de cele ale macroelementelor. în special în primele faze ale existenţei. acidul aspargic. Intră în compoziţia multor combinaţii organo-metalice complexe. Aminoacizii Sunt utilizaţi ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule şi ţesuturi.

4D (acidul 2. -acidul para-aminobenzoic. uneori cu ocazia autoclavării. rol în metabolismul celular. este considerat atât vitamină cât şi glucid.01 mg/l. -vitamina E (tocoferolul). este activator general al metabolismului celular. -biotina (vitamina H).1 mg/l. Acţiunea auxinelor este foarte complexă datorită intreacţiunii pe care o are cu alte substanţe regulatoare şi intervenţiei asupra unor procese fiziologice.5 mg/l. inhiba sau controla procesele fiziologice de creştere şi dezvoltare. pantotenatul de calciu se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0. citochininele şi giberelinele. sintetizaţi de plante şi fitohormoni exogeni sau de sinteză. 1 mg/l. Auxina naturală descoperită este AIA (acidul indolil-acetic) care se produce şi prin sinteză pe cale industrială. rol în metabolismul intermediar. 0. mezo-inozitolul.Vitaminele Plantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor. 2.influenţează alungirea celulelor prin mărirea plasticităţii peretelui celular. inhibitor al creşterii rădăcinilor. Majoritatea vitaminelor sunt termolabile. ANA (acidul naftilacetic). Rolul auxinelor poate fi redat astfel: -stimulează diviziunea celulară. -piridoxina (vitamina B6). stimulează creşterea vegetativă. 0. 0. precursor a unor coenzime. fiind necesară adăugarea lor în mediul de cultură pentru a asigura o bună creştere a explantelor. se foloseşte în concentraţii cuprinse între 0. rezistent la temperaturi ridicate (234-237oC). la întuneric are efect toxic. Fitoregulatorii Fitohormonii. Cele mai folosite auxine de sinteză sunt: -IBA (acidul 3 indolil butiric).1-1 mg/l.5-5 mg/l. măreşte sensibilitatea celulelor la auxine. . prin autoclavare se distruge în bună parte. stimulează biosinteza acidului pantotenic şi a biotinei. Cei mai folosiţi fitohormoni în culturile in vitro sunt auxinele. -acidul folic. sporirea biomasei produsă in vitro. stimulează sinteza nucleoproteidelor.5-2. 100-1000 mg/l. -acidul pantotenic (vitamina B5).4 diclorfenoxiacetic). hexahidroxi-ciclohexan). -riboflavina (vitamina B2). aneurina). rezistentă la temperaturi ridicate (280oC). dar nu şi ţesuturile cultivate in vitro. . dar s-a observat că şi substanţele reziduale au rol favorabil asupra culturii. -acidul nicotinic (vitamina B3.1-10 mg/l. catalizând reacţii de baza în metabolismul aminoacizilor. niacina). ANOA (acidul beta naftoxiacetic). 0. -acidul ascorbic (vitamina C). 0. fitoregulatorii sau substanţele regulatoare de creştere sunt substanţe organice utilizate în cantităţi mici cu rol de a stimula. stimulează creşterea ţesuturilor meristematice şi proliferarea celulelor.1-1 mg/l. Ţesuturile in vitro nu sunt capabile să-şi sintetizeze întreaga cantitate de care au nevoie. Auxinele – sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogeneză alături de citochinine. 1-100 mg/l. Există fitohormoni endogeni. stimulează diviziunea celulară. Principalele vitamine utilizate în mediile de cultură sunt: -tiamina (vitamina B1. este mai puţin utilizat ca atare. efect stimulator asupra creşterii ţesuturilor la lumină. S-a demonstrat experimental ca in vitro ţesuturile şi plantulele răspund favorabil la adaosul exogen de vitamine în cantităţi mici. -inozitolul (mio-inozitolul. sunt distruse la temperaturi ridicate. este mai rar folosită. -cobalamina (vitamina B12).

-modifică permeabilitatea membranelor plasmatice pentru apă şi ioni. În prezent se folosesc pentru culturile de ţesuturi patru citochinine dintre care două naturale (2 IP şi zeatină) şi doua de sinteză (chinetina şi BAP). Cel mai mult se folosesc ANA şi 2. în mugurii activi. -induce senescenţa ţesuturilor. -stimulează formarea lăstarilor laterali. La alte tipuri de explante nu se recomandă giberelina deoarece inhibă dediferenţierea celulară. Cea mai utilizată giberelină este acidul giberelic (GA3) fiind şi cea mai activă. -inhibă formarea rădăcinilor. utilizarea mediului lichid fiind limitată doar la unele experienţe şi la cultura de suspensii celulare. -stimulează formarea mugurilor adventivi şi din calus. -rol important în dominanţa apicală. etc. seminţe. Rolul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel: -exercită un control asupra creşterii permeabilităţii membranelor.. -stimulează creşterea frunzelor şi rădăcinilor. Sunt substanţe termostabile suportând uşor autoclavarea. iar ca structură au la bază adenina şi un nucleu purinic. experimentată cu succes la culturile in vitro. -se produce în cantităţi mai mari în ţesuturile şi celulele rănite. -inhibarea creşterii ţesuturilor şi organelor pe timpul stocării. Pentru meristeme giberelina este indispensabilă în vederea alungirii lor.4D care sunt mai stabile. Prima citochinină izolată a fost chinetina. -stimulează sinteza proteică. Efectul fiziologic al citochininelor constă în: -acţionează asupra diviziunii celulare alături de auxine. nu se oxidează în prezenţa luminii. La scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina (BAP). Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obţinut din alge şi are următoarele caracteristici: . în embrioni şi vârful rădăcinilor. frunze. Giberelinele sunt substanţe care acţionează la nivelul întregii plante şi nu asupra celulei. Agenţii de solidificare Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid. Citochininele sunt substanţe ce se găsesc în cantităţi relativ ridicate în fructe. Biosinteza citochininelor endogene are loc în rădăcini şi în embrioni. -are rol antagonist cu auxinele şi giberelinele. iar migrarea este dependentă de cea a glucidelor. Acidul abscisic este implicat în procesele de latenţă a mugurilor şi seminţelor. 2. Poate fi utilizat pentru: -inducerea latenţei embrionilor somatici. Auxinele sunt sintetizate în partea aeriană a plantelor în muguri. Etilena a fost recunoscută ca fitoregulator mult mai târziu şi este utilizată puţin în culturile in vitro. înfloririi şi fructificării.4D este mult utilizată pentru inducerea şi creşterea calusului şi pentru rizogeneză. circulând în plante prin vasele liberiene. fructele tinere şi bobocii florilor de unde circulă în toată planta. -inhibă formarea embrionilor somatici în suspensiile celulare. -inducerea latenţei seminţelor artificiale în vederea păstrării lor o perioadă mai lungă. Acţiunea fiziologică este următoarea: -produce alungirea internodiilor tulpinilor. -are rol în transportul auxinei. -inhibă extensia celulară. cu rol în stimularea creşterii. Giberelinele sunt sintetizate în frunzele şi fructele tinere. La calus asigură friabilitate mare uşurând separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare şi în embriogeneza somatică.

cisteina HCl (100 mg/l). evitând oxidarea lor. Se foloseşte în concentraţii de 1. Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu diferă în funcţie de consistenţa dorită. -nu conţine elemente minerale care să afecteze echilibrul dintre ioni în mediul de cultură. la speciile ce conţin substanţe fenolice în cantităţi mari. Cu rol similar în solidificarea mediului de cultură se mai folosesc: -agaroza are un înalt grad de purificare şi se foloseşte mai ales pentru cultura protoplaştilor şi în prepararea gelului pentru electroforeză. Polivinilpirolidona (PVP) este un poliamid utilizat pentru absorbţia şi blocarea fenolilor. Uneori se mai pot folosi şi alte substanţe cu rol de a îmbunătăţii. favorizează formarea mugurilor adventivi. în special cu AIA. -nu reacţionează cu constituenţii mediului. Are o acţiune sinergică cu a auxinelor. sucul de tomate. rămânând solid în condiţii normale de cultură. Dintre substanţele antioxidante. stimulează creşterea şi alungirea apexurilor cât şi rata de multiplicare. împiedicând astfel oxidarea lor cu brunificarea şi moartea explantului. Se folosesc fie ca soluţii în care se ţine materialul vegetal înaintea prelevării explantelor. în doză de 40-80 mg/l. -nu este toxic pentru plante şi nu este asimilat de plante. Se utilizează mai ales la speciile care necesită un pH mai acid. După unii autori are rol în prevenirea degradării auxinelor. de a completa compoziţia mediului. între 0. în special.1-10 mg/l. are acţiune de inhibare a formării calusului.-formează cu apa un gel care se topeşte la 100oC şi se solidifică la 45 oC.5-1%. mai ales la măr.0 % şi se gelifica la 27-31oC. favorizează înrădăcinarea. Substanţele antioxidante se utilizează pentru prevenirea brunificărilor explantelor şi a mediului. Dintre compuşii fenolici cel mai utilizat este fluoroglucinolul şi procaina. Floroglucinolul este mult utilizat în multiplicarea meristematică a pomilor şi arborilor. Dozele utilizate sunt cuprinse între 0. stimulează creşterea biomasei explantelor. fie se adaugă în mediul de cultură. stimulează embriogeneza. Procaina are rol în multiplicarea şi respiraţia celulelor.5-2. a conţinutului în pigmenţi. cele mai folosite sunt: acidul ascorbic (50-100 mg/l). C. creşterea lăstarilor şi a ratei de multiplicare. asigurând solidificarea mediului şi în aceste condiţii. stimulează germinaţia seminţelor şi creşterea plantelor. faţă de reţeta de mediu folosită. Compuşii fenolici stimulează creşterea calusului. Cărbunele activ este un cărbune vegetal. Poate avea acţiune şi asupra fitohormonilor (auxine). -phytagelul (Gelrite) produce un gel limpede. bine mărunţit ce se adaugă mediului. Alte substanţe utilizate Adenina are rol regulator în mediul de cultură. suspensiilor celulare şi pentru încapsularea embrionilor somatici în vederea obţinerii seminţelor artificiale. Se pare că are o acţiune sinergică cu a citochininelor putând fi un precursor al acestora. . cum sunt: laptele de cocos. Prezenţa acestora în mediul de cultură este facultativă. -acidul alginic se foloseşte pentru cultura protoplaştilor. se găseşte în seva brută. Se foloseşte în concentraţii de 250-1000 mg/l. acidul citric (150 mg/l). blocându-le parţial efectul. De regulă se foloseşte sub formă de sulfat de adenină. cu scopul de a absorbi şi bloca substanţele toxice din mediu. sucuri de fructe. favorizează formarea rădăcinilor.

pe când înrădăcinarea lăstarilor a fost stimulată de creşterea acesteia. Trecerea unor explante pe mediu lichid poate constitui o fază necesară în procesul de micropropagare.1. Rădăcini de cicoare cultivate pe hârtie de filtru îmbibată cu mediu lichid pot produce doar lăstari vegetativi. parafilm. Masa calusului de cartof se dublează atunci când concentraţia de agar-agar din mediu creşte de la 0. Dacă în alte tipuri de culturi nu se acordă o mare importanţă schimbului de gaze.1%. De aceea. 4. ce dispare atunci când concentraţia agarului creşte la 1. Schimburile de gaze se realizează prin difuzie.8 în timpul preparării mediului de cultură. folie de aluminiu. Mai multe experimente au dovedit că difuzia liberă a oxigenului în ţesuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenică a acestora. prezintă o importanţă deosebită.1.6% . Totuşi. de calitatea agarului folosit şi de pH-ul mediului. În cazul garoafelor.2. este demn de luat în considerare şi tipul de vas de cultură folosit pentru culturile de celule şi ţesuturi. 4. diferenţele de concentraţie între gazele din interiorul containerelor şi cele din mediul ambiant exterior. Organogeneza indirectă la morcov este stimulată de reducerea concentraţiei de oxigen. precum şi variaţiile de temperatură influenţând aceste schimburi. În general.2 Caracteristicile fizice ale unui mediu de cultură Metabolismul unui ţesut vegetal poate fi modificat integral în funcţie de consistenţa mediului de cultură.2 FACTORII FIZICI CARE INFLUENŢEAZĂ CULTURILE DE ŢESUTURI Principalii factori ai mediului înconjurător sunt lumina şi temperatura. Se ştiu încă foarte puţine despre efectele acestor variaţii ale pH-ului şi despre cauzele determinante.1 Lumina Cerinţele faţă de lumină pot fi divizate în mai mulţi parametri: . ajustarea pH-ului se face la 5.4. concentraţia de agar-agar. precum şi calitatea acestuia au un efect distinct. Viteza de agitare a mediilor lichide este în general scăzută atunci când se cultivă organe (cca 1rpm) şi ridicată în cazul culturii de suspensii celulare (cca 100 -150rpm). precum şi de capacele utilizate: capace cu burete. Un alt factor important pentru mediul de cultură şi implicit pentru plăntuţele regenerate in vitro este pH-ul. La mediul solid. Alegerea tipului de mediu de cultură. meristemele izolate sunt cultivate în mediu lichid cu agitare pentru a induce lăstărirea axilară multiplă. În practică.5-5. la culturile in vitro schimbul de gaze cu exteriorul prezintă o mare importanţă pentru inoculi. lichid sau solid. în dese cazuri pH-ul mediului scade în timpul autoclavării sau chiar în timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. consistenţa mediului de cultură creşte odată cu pH-ul acestuia. etc. iar microbutaşii de anghinare prezintă fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraţie de agar-agar de 0. Alte studii au demonstrat că intervenirea unei modificări în schimburile de gaze dintre ţesuturile cultivate in vitro şi mediu a indus apariţia unor modificări în morfologia plantulelor. Umiditatea relativă este irelevantă atâta timp cât în interiorul vaselor de cultură aceasta atinge valori de aproximativ 100%. Concentraţia optimă de agar variază în funcţie de tipul de organ cultivat. în timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. ca în inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus în mediu lichid.8 la 1%.

C. astfel că. Lumina albastră (cca 467nm) sau violetă (cca 419nm) induce formarea de lăstari din calus de tutun. A. Utilizarea unei intensităţi luminoase de 50 W/m 2 (aproximativ 10000lucşi) în camerele de creştere. duce la încetinirea creşterii şi scăderea capacităţii de regenerare la multe specii vegetale. anterele cultivate în primele şase săptămâni la întuneric. După această perioadă. iar lumina numită „lumină albă” conţine radiaţii roşii. o combinaţie între cele două tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivită pentru culturile incubate în camerele de creştere. în faza a treia a micropropagării. Cerinţele faţă de durata de iluminare. Numeroase studii au dovedit că lumina este indispensabilă reglării multor procese morfogenetice. aşa cum există dovezi clare ale influenţei acestui parametru asupra plantelor donor. marea majoritate a camerelor de creştere au o durată a iluminării de 16-18 ore/zi. se urmăreşte creşterea treptată a intensităţii luminoase în vederea aclimatizării plantulelor la condiţiile de lumină din fitotron. lumina „de zi” conţine radiaţii în principal albastre. . iar cea roşie (cca 660nm) induce rizogeneza. În mod normal. În practică. la grâu. vor forma un procent mai ridicat de produşi androgenetici. cum ar fitocromul. intensitate folosită în mod obişnuit în fitotron. În ultimul timp au apărut în comerţ două tipuri de tuburi fluorescente: tuburi cu „lumină caldă” şi tuburi cu „lumină rece”.Intensitatea luminoasă O intensitate luminoasă foarte mare poate duce la pierderi importante în culturile in vitro. -calitatea spectrală a luminii primite de plante. calitatea luminii (intensitatea × durata luminii) este importantă dezvoltării armonioase a plantulelor în condiţii aseptice de cultură. deseori. in vivo. în cazul culturii de antere. scopul urmărit dar şi de specia la care se experimentează. dar nu se cunosc cu exactitate curbele spectrale de emisie ale acestora. ceea ce este total neadecvat necesităţilor unei plante). exprimată în ore/zi.Durata iluminării Nu există multe date cu privire la influenţa fotoperiodismului asupra morfogenezei ţesuturilor in vitro.-intensitatea luminii pe unitatea de suprafaţă exprimată în W/m2 (unitatea lux nu ar mai trebui folosită ca unitate de măsură a intensităţii luminoase. Astfel. tuburile fluorescente albe aflate în comerţ sunt adecvate culturilor de ţesuturi. unele cercetări au evidenţiat că fotosinteza nu este eliminată în totalitate din culturile de ţesuturi vegetale. Se pare că în medie. dar este considerabil redusă probabil datorită prezenţei zaharurilor în mediu. Aceste rezultatele asemănătoare altora indică faptul că procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenţii fotoreceptori. fotosinteza nu este o activitate necesară atâta timp cât energia este furnizată sub forma carbohidraţilor. Intensitatea luminoasă optimă culturilor in vitro variază între 5 şi 25 W/m2 (1000-5000 lucşi) cele mai folosite valori fiind de 10 până la 15 W/m2. culturile vor fi incubate în condiţii normale de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. B. Pentru culturile de ţesuturi. în vederea obţinerii de produşi androgenetici. din camerele de creştere sunt diferite în funcţie de natura explantului. Totuşi.Calitatea luminii Numeroase studii au evidenţiat că spectrul luminos influenţează procesele fiziologice şi morfologice ale celulelor cultivate in vitro. În general. s-a dovedit că. deoarece depinde de fiziologia ochiului uman. -durata iluminării.

în momentul inoculării. peste 180 oC se poate produce degradarea calităţii acesteia şi eliberarea de compuşi toxici în mediul de cultură. în realizarea culturilor de celule şi ţesuturi vegetale. dacă a fost sterilizată prin autoclavare. iar pentru cele tropicale la 25±1 oC. în care temperatura să poată fi reglată în funcţie de necesităţile explantelor şi tipurilor de culturi existente. instrumentar dar şi a suprafeţelor în care se desfăşoară astfel de activităţi. se recomandă ca fiecare unitate de cercetare să beneficieze de cel puţin două camere de creştere. influenţează pozitiv formarea minituberculilor. ci şi a tuturor celorlalte componente unei culturi in vitro. Durata expunerii sticlăriei la temperatură ridicată depinde şi de modul în care aceasta a fost spălată. cultura de antere necesită o temperatură de cca 27oC. sau a dezvoltării întârziate a unor germeni care au stat în stare latentă în ţesuturile profunde ale inoculilor. temperatura folosită în camerele de creştere este de 22-24oC. iar reproducerea lor în camera de creştere ar fi fără îndoială avantajoasă. De aceea. temperatura în camera de creştere va fi diferită şi în funcţie de scopul urmărit în cultura in vitro. În natură.1. datorită ineficienţei sistemului de închidere a vaselor de cultură.2 Temperatura În general. respectiv. prin căldură umedă. Practic. s-a observat că o temperatură de cca 19 oC. Apoi se va proceda la o resterilizare a recipientelor cu medii. a sticlăriei. precum şi în dependenţă de gradul de infectare al atmosferei din laborator. timp de 2-3 ore. CAPITOLUL V 5. a manipulării lor neatente. Astfel. plantele sunt supuse unor fluctuaţii de temperatură. în etuve. Speciile provenite din climatul temperat sunt obişnuite la temperaturi mai scăzute decât speciile tropicale. Sterilizarea prin căldură uscată se va face la 160 oC.1 ASEPSIA ŞI ASEPSIZAREA O condiţie esenţială. deoarece în interiorul vaselor de cultură temperatura poate fi cu 2 până la 4oC mai mare decât în camera de creştere. atât în faze incipiente. de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate să se seteze temperatura în camera de creştere la 20±1 oC . mediului de cultură şi materialului biologic se poate produce foarte uşor. este asigurarea unei perfecte sterilizări. 5.1 Sterilizarea recipientelor de cultură Întrucât.4.2. Aceste temperaturi sunt la pragul critic. se recomandă presterilizarea prin căldură uscată. temperatura din camera de creştere trebuie să fie cu 2 oC mai mică decât cea necesară speciei cultivate in vitro. întrucât există anumite forme de bacterii termorezistente. Dacă însă se depăşeşte temperatură de sterilizare a sticlăriei. Căile posibile de infecţie trebuie excluse cu rigurozitate. prin autoclavare. prealabil introducerii mediului de cultură în recipiente. . prealabil deschiderii flacoanelor infectate. o serie de microorganisme au spori rezistenţi la temperaturi ridicate şi la diferiţi agenţi sterilizanţi. în timp ce la grâu. Contaminarea cu microorganisme a recipientelor. cât şi în momentul repicării culturilor. prea puţine studii au fost făcute în aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevantă. Totuşi. alteori infecţiile se produc în mod pasiv. la cartof. nu doar a mediului de cultură şi a recipientelor. cum ar fi materialul biologic. De asemenea.

căldura umedă fiind aceea care distruge germenii. la 120 oC. Metodele moderne utilizate în ultimul timp presupun utilizarea recipientelor de cultură din material plastic.1. faţă de spălarea manuală. 5. Subautoclavarea mediilor duce la dezvoltarea de colonii de microorganisme şi care fac ca mediul să fie inutilizabil. întrucât o spălare incorectă poate reprezenta primul pas în realizarea unei infecţii în masă a flacoanelor cu pierderi uriaşe de material biologic şi mediu de cultură. care să asigure asepsizarea corectă a mediilor de cultură. În acest caz. În vederea autoclavării. distrugând germenii. lupă binoculară. cutiile Petri. după cum urmează: -vase de mediu conţinând între 20-50 ml – 20 minute la 121oC . fie de unică folosinţă. Sticlăria nouă va fi folosită abia după spălarea şi autoclavarea acesteia. în primul rând o corectă curăţire a sticlăriei. pipetele. ele fiind transportate cu un risc minim de a mai putea fi contaminate. lamele de microscop. se împachetează în hârtie. recipientele de cultură se introduc în autoclav dintr-o încăpere situată în afara perimetrului steril şi se vor scoate printr-o a doua uşă. fie reutilizabile care pot fi sterilizate prin autoclavate. întrucât astfel creşte operativitatea muncii. beneficiind astfel şi de o temperatură mai ridicată a apei de spălare. respectiv de mediul introdus în flacoane. în cel mai scurt timp se va proceda la autoclavarea acestora. durata menţinerii recipientelor cu medii în autoclav depinde de volumul de lichid. cu orientare verticală sau orizontală. avându-se în vedere şi faza de transport a lor de la autoclav până la hota cu flux de aer steril. etc. Obiectele din sticlă. Esenţial este ca autoclavul să funcţioneze la parametri stabiliţi. -vase de mediu conţinând între 500-5000 ml – 35 minute la 121oC. vasele prevăzute cu dopuri înfiletante nu vor fi închise etanş pentru a permite astfel accesibilitatea aburului încălzit în recipientele cu mediu. direct în camera sterilă. iar pachetele se aşează în tăvi metalice şi se sterilizează în etuvă. în caz contrar. În condiţii de producţie se recomandă chiar utilizarea autoclavelor cu deschidere dublă. în condiţii de căldură uscată. În unităţile cu activitate intensă se recomandă spălarea mecanică a sticlăriei. pentru a preîntâmpina trecerea unor ioni din sticlărie în mediul de cultură. timp de 1-2 ore. -vase de mediu conţinând între 50-500 ml – 25 minute la 121oC . . doar căldura nefiind suficientă în sterilizarea substratului de cultură folosit in vitro. Spălarea se va face cu multă atenţie. sterilizarea mediilor se produce defectuos. prin manipularea corectă a acestora. de capacitate mare sau mică. O foarte bună curăţire a recipientelor poate fi asigurată prin spălarea acestora cu ajutorul ultrasunetelor. prin menţinerea acesteia minim patru ore în amestec cromic. în primul rând.2 Sterilizarea mediilor de cultură şi a apei distilate După prepararea mediilor de cultură. Supraautoclavarea mediilor de cultură conduce la o alterare a proprietăţilor şi calităţilor acestora şi la o deteriorare a raportului ionic. Pentru a ne asigura că nu ratăm o serie experimentală este indicat să amânăm inocularea şi câteva recipiente cu mediu să le ţinem 2-3 zile într-un incubator la 37 oC. Preîntâmpinarea infecţiilor derivate din incorecta pregătire a recipientelor de cultură se face. În acest mod ne vom convinge de calitatea sterilizării substratului de cultură. la temperatura de 121 oC (echivalentă cu presiunea de 1 atmosferă). livrate steril de către furnizor. Există diferite tipuri de autoclave. În general se recomandă autoclavarea mediilor şi a apei distilate. umpluta fiind cu apă distilată.) se va face prin ştergerea lor periodică cu alcool 70 o. fără a altera şi degrada substanţele încorporate în substratul de cultură. Asepsizarea aparatelor introduse în hota cu flux de aer steril (microscop.Pentru a preîntâmpina infecţiile rebele se recomandă. electrice sau folosind gazul ca sursă de energie.

ceea ce ridică probleme deosebit de complicate privind depistarea şi prevenirea dezvoltării lor. precum şi organele cu pilozitate ridicată prezintă inconvenientul aderării sporilor şi a germenilor la nivelul formaţiunilor epidermale. Avantajul acestor nuci filtrante este ca se pot refolosi. din momentul în care a început să se evacueze aburul prin supapă. dar foarte multe bacterii. Mugurii şi tulpinile cu lenticele. acestea evaporându-se uşor. sau pentru sterilizarea unor cantităţi reduse de mediu de cultură. ceea ce creează serioase impedimente în sterilizare cu atât mai mult cu cât.5-0. Dezinfectantul trebuie să fie suficient de puternic încât. prin spălări succesive cu apă distilată sterilă.3 Sterilizarea materialului biologic Provenienţa materialului vegetal va constitui un prim reper în alegerea modului de sterilizare a organelor donatoare de explante. în momentul imersiei lor în soluţia dezinfectantă. se interpune. Filtrele Millipor au porozitatea cuprinsă între 0. acidul giberelic. Estimările de acest tip se fac fie prin aprecieri de ordin subiectiv. Dezinfectanţii utilizaţi frecvent asigură o sterilizare de suprafaţă. Deschiderea kuktei se va face după depresurizarea acesteia. Sterilizarea la rece a unor substanţe termolabile se mai poate face şi prin dizolvarea lor în alcool. astfel încât să se asigure umiditatea necesară formării vaporilor. iar după aprindere va fi plonjat în apă distilată sterilă. între suprafaţa epidermei şi soluţie. 5.2 microni. piridoxina ) se sterilizează prin filtrare folosind filtre de unică folosinţă (Millipor) şi se adaugă în mediul de cultură la o temperatură a acestuia cuprinsă între 45-50oC. fiind livrate steril de către producători. O altă condiţie pe care trebuie să o îndeplinească agenţii dezinfectanţi este aceea de a putea fi îndepărtaţi cu uşurinţă de pe materialul biologic. totodată. dar şi pentru a cunoaşte cu exactitate natura lor. peliculă care împiedică accesibilitatea dezinfectantului la epidermă. rădăcinile sau organele subterane sunt purtătoare de nenumăraţi germeni. iar sterilizarea lor poate ridica probleme. după care substanţa solidă solubilizată se va dizolva în apă distilată sterilă şi apoi în condiţii aseptice se va adăuga mediului de cultură aseptic. tiamina. este obligatorie efectuarea unui control fitopatologic sever al plantelor donatoare de explante. care nu deţin în dotarea lor autoclave. Pentru a reduce posibilitatea apariţiei unor astfel de infecţii. concentraţia acestora şi durata sterilizării vor fi selecţionate în funcţie de calitatea materialului biologic.1. se pot utiliza kukte în care se va introduce apă. Pentru acest mod de sterilizare sunt preferate nucile filtrante din sticlă cu porozitatea de 1 micron. să distrugă microorganismele aderente la suprafaţa organelor dar. Gradul de infecţie şi procentul de viabilitate realizat în cultură ne ajută în adoptarea celei mai bune metode de sterilizare. în scurt timp. Durata sterilizării va fi de 15-25 minute.În laboratoarele de mică capacitate. un strat de aer. Substanţele termolabile folosite la prepararea mediilor de cultură (zeatina. ceea ce presupune utilizarea lor numai în hota cu flux de aer steril. virusuri sau micoplasme sunt localizate în celule situate în profunzimea organelor. în funcţie de volumul de mediu. La unele plante (muşcate. . prin filtrare. eter etilic sau acetonă. Substanţele alese pentru asepsizarea materialului biologic. Mediile de cultură lichide pot fi sterilizate şi la rece. Pentru micşorarea tensiunii superficiale în soluţia de sterilizat se vor adăuga câteva picături de Tween 20 sau Tween 80. Astfel materialul se introduce în alcool (96 o) după care acesta va fi trecut rapid trecut prin flacără. De regulă. să nu pătrundă prea mult în profunzimea acestora. kiwi) se pot lua măsuri mai speciale de dezinfectare. fie pe baza executării unor experimente de tatonare.

5.1. decât viitorul inocul (pentru a proteja celulele explantului de necrozele provocate de către agentul sterilizant). necesită o continuare a sterilizării cu unul dintre agenţii de sterilizare utilizaţi frecvent (tabelul 5. imersie în alcool şi apoi în apă distilată sterilă. Pentru îndepărtarea soluţiei dezinfectante se recomandă clătirea repetată. bună f. Ca atare.4 Sterilizarea încăperilor şi a suprafeţelor O primă măsură. operaţiunea are drept scop extragerea clorului prezent în straturile superficiale de celule.1). ca dimensiune. acidulând astfel uşor apă distilată sterilă. se procedează la imersia în dezinfectant a unor fragmente mult mai mari. fragmentele de organe vor fi plonjate un timp foarte scurt în alcool (30-60 secunde) după care vor fi introduse rapid în apă distilată sterilă.1 Agenţii de sterilizare utilizaţi frecvent în culturile in vitro (după Street. 1. Înainte de efectuarea tuturor operaţiunilor dintr-un astfel de laborator. Compus chimic Hipoclorit de calciu Hipoclorit de sodiu Apă oxigenată Apă bromată Azotat de argint Clorură mercurică Antibiotice Concentraţia utilizată 9-10 % 2-5 % 10-12 % 1-2 % 1% 0. Întrucât zonele albite sunt traumatizate. 7. în cinci reprize. a câte 10-15 minute fiecare. bună Satisfăcătoare Destul de bună Hipocloritul este puternic alcalin şi. bună f. coagulează proteinele. 5. ceea ce ne dă şi o certitudine privind eficacitatea dezinfectantului. hipocloritul cauzează o albire a zonelor traumatizate. Trebuie avut în vedere faptul că alcoolul este liposolubilizant. crt. La nivelul suprafeţelor secţionate. Tabelul 5. se recomandă ca în prima clătire cu apă distilată sterilă să se adauge câteva picături de acid clorhidric diluat. De regulă. în unele cazuri. ele vor fi îndepărtate.Un dezinfectant cu utilizare frecventă. Atât în cursul sterilizării cât şi al clătirii. bună f. în momentul delimitării şi fasonării explantelor. . 6. 3. Obişnuit se utilizează soluţiile de hipoclorit de calciu şi sodiu în concentraţii variabile. după pătrunderea lui în celule şi cauzează o deshidratare puternică a ţesuturilor. cu apă distilată sterilă.1-1 % 4-50 mg/l Uşurinţa de înlăturare +++ +++ +++++ + + + ++ Durata sterilizării (minute) 5-30 5-30 5-15 2-10 5-30 2-10 30-60 Eficacitate f. unde se execută cea mai importantă etapă – inocularea pe medii aseptice. cu caracter preventiv. sub acţiunea directă a clorului. 1977) Nr. după spălare în apă. constă în menţinerea unei curăţenii exemplare în încăperile destinate laboratorului de culturi de celule şi ţesuturi vegetale. se impune sterilizarea cu radiaţii UV a încăperilor şi mai ales a camerei sterile. bună f. 2. respectiv distruse de către agentul sterilizant. materialul vegetal trebuie agitat continuu. 4. Materialul biologic puternic infectat. cu acţiune rapidă şi eficientă este alcoolul etilic.

înainte de începerea activităţii. prealabil deschiderii lor vor fi trecute prin flacără.) pentru a se răci. acestea vor evita discuţiile între ele. iar apoi vor fi plonjate într-un recipient cu apă distilată sterilă. pentru a evita expirarea direct pe materialul vegetal. instrumentele vor fi introduse în alcool şi flambate. să fie echipaţi corespunzător. în caz contrar.Radiaţiile UV vor fi întrerupte. timp de cca o oră. pericolul de contaminare cu germeni este minim. la hotele care permit lucru a două persoane concomitent. după introducere în alcool. cu halate albe. Dacă se lucrează şi se inoculează la cca 20 cm de flacără. rotindu-se gâtul acestora astfel încât flacăra să ajungă în contact cu toată circumferinţa deschiderii. după autoclavare. Înainte de începerea activităţilor de inoculare în hota cu flux de aer steril. vor fi stocate în apropierea surselor de UV. Este indicat ca personalul să-şi spele mâinile cu apă şi săpun. la hota cu flux de aer steril. este indicată îndepărtarea bijuteriilor. după care atât înainte cât şi în mod repetat. Flacoanele cu medii. întrucât periclitează sănătatea operatorilor. în timpul operaţiunilor efectuate. În cazul în care mediile. temperatura ridicată a acestora poate traumatiza profund explantul. Instrumentarul cu care se va lucra în camera sterilă. Mediile de cultură sunt foarte favorabile dezvoltării bacteriilor şi ciupercilor. rezumându-se la strictul necesar. trebuie să fie bine instruiţi din punct de vedere teoretic. la 4 oC. atunci când modul de obturare îl permite. ele pot fi păstrate pentru câteva zile în camerele frigorifice. creşterea cărora este mult mai rapidă decât cea a celulelor vegetale şi duce la inhibarea proceselor fiziologice ale ţesuturilor cultivate. Ozonul acumulat în încăperi. sau prin menţinerea acestora sub acţiune directă a razelor UV. Ele vor fi utilizate pentru dimensionarea explantelor abia după răcire.1 Aspecte generale privind condiţiile aseptice de cultură Prima condiţie în realizarea cu succes a unei culturi de celule sau ţesuturi in vitro este asepsia. CAPITOLUL VI 6. În perioada executării operaţiunilor în hota cu flux de aer steril. Casoletele cu recipiente.1. cu aproximativ 30 minute înainte de începerea operaţiunilor în zona sterilă. a ceasului şi brăţărilor de pe mâini şi sterilizarea cu alcool 70 o a degetelor. iar incinta sterilă se pune în funcţiune cu 20-30 minute înainte de orice activitate pentru ca fluxul de aer steril să baleeze suprafaţa de lucru. timp de o fracţiune de secundă. Principalele cauze ale apariţiei infecţiilor în culturile in vitro sunt: 1) Aerul care conţine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor. Operatorii care execută lucrări în camera sterilă. De aceea un laborator de culturi de ţesuturi este organizat şi păstrat într-o asepsie strictă asemeni unei săli de operaţie. Înainte de începerea operaţiunilor. să se clătească cu alcool 70 o. se şterge suprafaţa de lucru cu alcool 70 o. fie în baia electrică de aseptizat instrumentar chirurgical fie în pupinel. După scoaterea dopurilor.1 INIŢIEREA UNEI CULTURI IN VITRO 6. tăviţe folosite doar în hotă. apoi vor fi aşezate pe diverse suporturi (cutii Petri sterile. nu sunt utilizate imediat. apoi se execută inoculare urmând ca la final operaţiunea de flambare să se repete. etc. . De asemenea. conţinând mediile sterile sau flacoanele după inoculare. sau capacelor. flacoanele vor fi flambate din nou. în cursul iradierii va fi lăsat să difuzeze pasiv din zonele sterilizate. Instrumentele tăioase. insistând la unghii. bonetă şi mască pe figură. se trec prin flacără. este bine să fie presterilizat.

În momentul de faţă toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevăzute cu hote cu flux laminar de aer steril. care distrug doar o parte din spori. -cloridă mercurică. -etanol 70-80%. c) Aerul cald: la 120oC timp de 20 minute (autoclav). în vasele conducătoare libero-lemnoase sau în spaţiile intercelulare. în general pH-ul este de 5. Pe parcursul preparării se vor bifa.5-5. b)Becuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. -mercurobutol. corecţiile. căldură umedă pentru sterilizarea mediilor de cultură şi a apei sau 180 oC timp de 2-3 ore. tuberculi). e) Sisteme de filtrare a aerului: se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai mari de 0. în funcţie de cantitatea de mediu din recipient. 5)Adăugarea vitaminelor şi hormonilor (sterilizaţi prin filtrare) în mediu se face atunci când temperatura mediului ajunge la 40-50 oC.1. Se vor nota cu atenţie toate detaliile legate de provenienţa substanţelor chimice sau a soluţiilor stoc. caz în care este imposibilă sterilizarea ţesuturilor. calitatea apei. care distrug microorganismele: -hipoclorit de sodiu.şi microelemente. ţinându-se seama cu stricteţe de volumul final al mediului. iar folosirea antibioticelor nu este recomandată.22µm. Observaţii Mediile de cultură pot fi preparate în vase Erlenmeyer. 2)Măsurarea pH-ului. Etapele preparării unui mediu de cultură sunt: 1)Diluţia sărurilor minerale: macro. Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvoltă în pământ (rădăcini. corectarea cu KOH 10N. -produse bactericide şi fungicide.2) Ţesuturile vegetale sunt acoperite la suprafaţă cu fungi şi/sau bacterii. -hipoclorit de calciu. Filtrarea este realizată de un ventilator-extractor ce asigură o ventilaţie constantă cu o viteză optimă şi are avantajul de a menţine steril aerul din incinta hotei cu flux laminar. dar în realitate succesul unei culturi depinde într-o foarte mare măsură de calitatea mediului şi implicit de factorii menţionaţi mai sus. . 3) Corpul uman. apoi ajustarea la volumul final. bulbi. pe rând. iar agarul este sterilizat odată cu mediul prin autoclavare în kuktă. care se adaugă în ploaie în timp ce mediul este amestecat tot timpul. care poartă numeroase microorganisme pe piele sau în respiraţie.8. provenienţa agarului. erorile. Metodele de eliminare ale acestor surse de infecţie sunt: a) Produsele chimice. d) Razele ultraviolete. 6. toate elementele măsurate şi introduse. Bacteriile şi ciupercile se dezvoltă şi în interiorul ţesuturilor. 6)Repartizarea mediului în vasele de cultură sterile se face imediat după adiţia vitaminelor şi fitohormonilor.2 Prepararea mediului de cultură Datorită faptului că în prepararea unui mediu de cultură intervin mai mulţi factori este necesară alcătuirea unei liste de materiale înainte de a se trece la prepararea lui. dacă se prepară cantităţi mici (mai puţin de un litru). căldură uscată (etuvă) pentru sterilizarea sticlăriei. În aparenţa sunt factori ce nu prezintă o mare importanţă. 4)Sterilizarea mediului de cultură la 120oC între 20-30 minute. 3)Adiţia zaharurilor (sucrozei) urmată de adiţia agarului.

de aceea ajustarea acestuia se face înainte de adiţia celor două componente. identic cu planta donor. părţile aeriene ale unei plante sunt mult mai puţin infectate cu bacterii şi fungi decât cele subterane.Pentru cantităţi mai mari de un litru se folosesc vase speciale. 6. -imersia în hipoclorit de calciu 4% timp de 12 minute. pot fi distinse două tehnici obligatorii: -stabilirea unei culturi aseptice din ţesuturi prelevate de la o plantă întreagă cultivată în condiţii nesterile (prima etapă a micropropagării vegetale). Dacă se folosesc vase de cultură din plastic achiziţionate din comerţ sterilizate. Dificultatea sterilizării constă în necesitatea absolută de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice. -menţinerea asepsiei unei culturi deja iniţiate prin transplantarea inoculilor în condiţii aseptice pe alte medii de cultură (etapele a doua şi a treia în tehnica de micropropagare vegetativă). Din punct de vedere al asepsiei. borcane cu capac termorezistent. astfel încât să nu se distrugă şi celulele vegetale (care sunt cel puţin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii). A. Pentru a se evita infectarea soluţiilor stoc este recomandabilă folosirea unor recipiente auxiliare. Acest procedeu se execută în hota cu flux laminar de aer steril. din care se va lua cu ajutorul pipetei cantitatea optimă.3 Izolarea şi inocularea explantelor Din punct de vedere teoretic. În general. . A se evita hârtia de pH deoarece aceasta nu dă rezultate precise şi importanţa stabilirii unui pH corect se reflectă în succesul culturii in vitro. Dacă mediul conţine substanţe labile termic. cu agitarea continuă a vasului în care se realizează imersia. toate părţile unei plante pot constitui explante pentru iniţierea unei culturi de ţesuturi. după ce gura vasului Erlenmeyer în care se află mediul s-a trecut prin flacără pentru flambare.1. este absolut necesară stabilirea unui timp optim de imersare a ţesuturilor în soluţiile sterilizante. proprietate a celulei vegetale de a regenera în mod normal un individ întreg. De aceea. datorită totipotenţei celulare. -efectuarea a trei clătiri succesive cu apă distilată sterilă pentru îndepărtarea agentului de sterilizare. Ajustarea pH-ului se face de preferat cu pH metrul înainte de sterilizarea mediului. Prima categorie prezintă cele mai mari dificultăţi deoarece implică efectuarea unei sterilizări corect a ţesuturilor ce urmează a fi introduse în condiţii aseptice de cultură. adiţia mediului de cultură sterilizat se va face de asemenea în condiţii sterile. pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt: -fasonarea peţiolului în fragmente de aproximativ 1cm lungime. în care se va goli o cantitate aproximativ egală cu cea necesară preparării mediului de cultură. -imersia fragmentelor de peţiol în etanol 70% timp de 20 secunde. la gura becului de gaz unde temperatura este de aproximativ 40oC. substanţele vor fi dizolvate separat. Agarul şi zaharoza nu schimbă pH-ul mediului.Sterilizarea ţesuturilor Sterilizarea materialului vegetal înainte de iniţierea unei culturi in vitro este dificilă deoarece gradul de infectare al ţesuturilor este variabil şi pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substanţe chimice. în diferite concentraţii cu durate diferite de timp pentru imersarea ţesuturilor. Drept exemplu. apoi sterilizate prin filtrare şi incorporate în mediul autoclavat în prealabil.

acest produs este comercializat în pungi de plastic cu titrul colorimetric de 48o. .01% până la 0.Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca(OCl)2 deoarece nu penetrează ţesutul vegetal. după înmuierea în alcool 90%.se şterg.hârtia de filtru sau aluminiu folosită ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizează prin autoclavare. La acest tip de hotă. filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil. în special suprafaţa de lucru. este recomandabilă folosirea concomitentă a câte trei bucăţi din fiecare instrument. .Pregătirea echipamentului necesar sterilizării şi lucrului la hota cu flux laminar steril Înainte de realizarea sterilizării materialului vegetal şi începerea operaţiilor de fasonare şi inoculare pe mediu de cultură artificial a materialului vegetal. HgCl2 – este un sterilizant foarte eficient.se pulverizează alcool în toate colţurile şi colţişoarele interiorului hotei. Mercurobutol – este de asemenea un sterilizant foarte bun şi se poate găsi în farmacii. Este totuşi un produs puţin stabil în soluţie apoasă şi trebuie preparat imediat înainte de utilizare cantitatea dorită de hipoclorit este dizolvată în apă prin agitare continuă timp de aproximativ 10 minute.instrumentele se imersează în alcool etilic 70% în vase de sticlă dacă nu se foloseşte flambarea şi în alcool de 90-96% dacă se doreşte flambarea acestora. după care. toate suprafeţele orizontale şi verticale din interiorul hotei insistându-se pe suprafaţa de lucru. . activităţi ce se realizează în condiţii sterile. locul unde se vor realiza etapele precizate. trei clătiri cu alcool etilic de 70%. să se şteargă cu alcool etilic 70% toate suprafeţele interioare. iar filtratul se utilizează imediat.se flambează instrumentele de metal la flacăra becului de gaz.se pulverizează puţin alcool pe filtrele de aer ale hotei. cu o bucată de vată înmuiată în alcool etilic de 70%. este necesară pregătirea hotei cu flux laminar de aer steril. . . Acest produs penetrează ţesuturile putând cauza leziuni la nivel celular ducând la scăderea capacităţii regenerative a ţesuturilor cultivate in vitro. iar după cinci minute se porneşte şi ventilaţia. Sterilizarea hotei necesită parcurgerea mai multor etape: . În cazul hotelor cu flux de aer laminar (alcătuit din lamele dispuse în straturi paralele) steril este suficient. Conţine un detergent ce-i măreşte puterea de penetrarea şi eficienţa. iar timpul de imersie variază între 5 şi 30 de minute. Timpul necesar pentru realizarea unei sterilizări optime la o diluţie de 5% este de la 5 minute la 30 de minute.se porneşte lampa UV. soluţia formată se filtrează. fiind recomandate cinci-şase clătiri comparativ cu trei în alte cazuri. Concentraţiile standard folosite sunt de 4% şi 8%. Trebuie subliniat faptul că sterilizarea materialului biologic vegetal se realizează numai la suprafaţă şi dacă accidental ţesuturile sunt infectate în interior nu este posibilă sterilizarea lor. În unele cazuri sterilizarea explantelor nu este necesară. Se folosesc concentraţii între 5% şi 20% v/v. cum ar cazul meristemelor bine protejate de numeroase frunzuliţe rudimentare sau a anterelor protejate în spic. B. Pregătirea instrumentarului se face înainte de începerea lucrului: . folosit în doze mici de ordinul 0. . ca înainte de utilizare. Alţi produşi chimici ce pot fi folosiţi pentru sterilizarea materialului vegetal sunt: Hipocloritul de sodiu.05%. Este dificil de înlăturat deoarece are aderenţă crescută la ţesuturi. Biclorura mercurică (otravă puternică). NaOCl . necesitând clătiri repetate. dar este foarte dificil de înlăturat necesitând efectuarea a două.

.înainte de a începe lucrul la hotă. . vaselor Erlenmeyer şi sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacăra becului de gaz.explantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor şi intrarea în contact cu germenii. formează miceliu de culoare închisă cu aspectul unor fructificaţii de culoare neagră. . operatorul trebuie să-şi spele mâinile cu săpun (preferabil cu mercurobutol sau altă substanţă sterilizantă). ovulelor. 6. 6. .mediul de cultură sterilizat se va turna în vase de sticlă sau plastic sterilizate în prealabil doar la hotă. iar capacele pot fi plasate cu gura în jos.explantele se fasonează cu ajutorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fină. din pachetele de hârtie sau din cutiile de metal speciale în care au fost sterilizate. . mai ales când se doreşte obţinerea unor explante de dimensiuni mici. sau extrase cu ajutorul pensetelor cu vârf subţire. pentru clătirea materialului vegetal. cum e cazul meristemelor. .gâturile borcanelor. Odată cu instalarea culturilor se va urmări apariţia infecţiilor. pentru siguranţă.mâinile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de 70%. . când aceasta este pornită.dopurile de vată nu vor fi lăsate niciodată pe masa de lucru. Dacă este generată de o ciupercă. . să-şi frece palmele. încheieturile mâinilor şi antebraţele cu alcool 70% sau cu mercurobutol şi să se clătească cu apă distilată sterilă.1. de cele mai multe ori de culoare albă sau gri. în cazul anterelor. se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o textură mată sau pufoasă. .se pregătesc vasele de cultură cu sau fără mediu. sau a instrumentarului în cazul când acesta este introdus doar în alcool. culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de 12W/m2 (aproximativ 2500 lucşi) la o temperatură de 20-25o şi un fotoperiodism de 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. şi se sterilizează prin flambare sau imersie în alcool şi clătire cu apă distilată sterilă.instrumentarul se schimbă des. .. va fi eliminat.1.se pregătesc două borcane cu apă distilată sterilă. Penicillium generează un miceliu de culoare gri mat. doar în hota sterilizată. După simptomele manifestate putem să ne dăm seama dacă infecţia este cauzată de o ciupercă sau de o bacterie. haine.Operaţiunile ce se execută la hota cu flux de aer steril Menţinerea condiţiilor aseptice se face urmând câteva reguli stricte şi necesare: . .4 Menţinerea culturilor În general. etc).orice explant ce a căzut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva în afară de hârtia de lucru sterilă. care se văd în general după câteva zile.odată cu terminarea lucrului. . sau aruncare. de fiecare dată când vin în contact cu materiale nesterile (păr.5 Infecţiile şi cauzele apariţiei acestora Apariţia infecţiilor în culturile in vitro are mai multe cauze. care se şi multiplică foarte repede şi care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor înainte de deschidere şi spălare. pe când Rhizopus nigricans. etc. C. alcoolul rămas va fi păstrat în containere închise. să-şi suflece mânecile halatului până mai sus de coate. viteza de lucru fiind un factor important în succesul culturilor in vitro. după două până la maximum cinci explante.vasele Petri sterilizate în prealabil în etuvă la 180oC timp de 2-3ore se scot. fără flambare.

care sunt rareori identice. În continuare se prezintă câteva exemple concludente: . Atunci când se observă dezvoltarea unui miceliu de Penicillinium se constată o capacitate de lucru slabă a operatorului.unele capace căptuşite conţin cleiuri toxice ce pot. să otrăvească ţesuturile. culturile pot fi infectate şi cea mai sigură cale este subcultivarea lor pe mediu adiţionat cu 2g/l peptonă (un component obligatoriu în mediile de creştere ale bacteriilor).1 Cultura de rădăcini Cultura de rădăcini constă în creşterea pe medii aseptice a rădăcinilor detaşate. este recomandată îndepărtarea acestor căptuşeli înainte de folosirea capacelor. 6. se utilizează rădăcina primară. de aceea este necesară clătirea sticlăriei în clorură lichidă. iar alteori. caz în care mediul de cultură folosit nu permite dezvoltarea acestora.1. sursa poate fi aerul. generând infecţii ale culturilor se poate datora: vorbitului în timpul lucrului la hota cu flux de aer laminar steril. sterilizarea necorespunzătoare şi insuficientă a instrumentarului. În general. Se va observa dacă infecţia a pornit de la zona de contact dintre ţesut şi mediul de cultură. sterilizarea ineficientă a mediului sau din apa condensată pe capacul recipientului de cultură. de aceea atenţia şi meticulozitatea sunt calităţi absolut necesare unui operator in vitro. condiţiile climaterice din camera de creştere se pot schimba.condensul apei în vasele de cultură apare atunci când temperatura din exteriorul vasului este cu câteva grade mai mică decât cea din interior. Un singur detaliu minor în aparenţă. cauza putând fi expunerea directă a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare. să nu se observe apariţia unei infecţii cu bacterii. 6. de aceea.1. Tehnicile de cultivare in vitro a rădăcinilor au fost realizate încă în etapa de pionierat a cercetărilor efectuate în această direcţie. . White a dovedit că rădăcini detaşate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat.7 Metode de iniţiere a unor tipuri de culturi din diferite explante 6.creşterea volumului vasului de cultură poate încetini schimbul de gaze cu exteriorul ceea ce duce la încetinirea creşterii inoculilor. sporii unor bacterii pot rezista autoclavării. obţinând culturi de ţesuturi libere de bacterii. Astfel. din fericire rare. în cursul culturii. prin evaporare sau prin dizolvare în apa condensată. Manipularea necorespunzătoare a materialului vegetal şi aplicarea ineficientă a tehnicilor de cultură in vitro.Dacă infecţiile se datorează unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lăptoase în interiorul mediului şi pe suprafaţa acestuia. în . Principala problemă care se ridică. În unele cazuri.7.6 Probleme tehnice minore ce pot cauza pierderi în culturile in vitro Se poate întâmpla ca unele culturi să meargă foarte bine în anumite condiţii. embrionară. . prin subculturi repetate. Această pastă este uneori colorată roz sau galben. Totuşi. în aceleaşi condiţii să meargă prost sau deloc. Problema poate fi dată de condiţiile de cultură.utilizarea parafilmului încetineşte considerabil schimbul de gaze şi poate modifica funcţionarea ţesuturilor.1. şi dacă e aşa se poate concluziona că sursa de infecţie este însuşi explantul. Dacă infecţia porneşte din alt punct al mediului de cultură. . Se poate ca. transportul microorganismelor de la explantele infectate la cele neinfectate. s-a schimbat tipul vasului de cultură sau calitatea sticlei acestuia. Prin această metodă se testează culturile şi de elimină vasele de cultură infectate. poate schimba întreaga evoluţie a culturii. prelevată de la plantulele formate prin germinarea seminţelor în condiţii aseptice.

De obicei. sau pe explante radiculare. Se poate constata că mediul de cultură recomandat este unul simplu lipsit de microelemente. Prin extrapolarea acestor rezultate.acest caz. clasice. timp de 48 ore. iar ca sursă de carbon organic poate fi folosită glucoza în loc de zaharoză. în dozele normale. prin aplicarea sub cutia Petri a unei hârtii milimetrice.1. are ţesuturi embrionare neinfectate. 1982). ca urmare a infiltrării apei sub tegument. în creşterea lor.5%. Sămânţa sănătoasă. se rezumă la ramificarea acestora în radicele secundare. meristeme primare găsim şi în straturile profunde ale rădăcinilor şi tulpinilor. după 21 zile de cultură se constată o plafonare a creşterii. când rădăciniţa plantulei atinge lungimea de aproximativ 20 mm. în formarea rădăcinilor. în aproximativ 250 ml alcool etilic 70o. se detaşează vârful rădăciniţei (cca 5-10 mm) şi se inoculează tot în vase Petri. de tip primar. fiind meristeme apicale. în condiţii aseptice. cu rol în creşterea în lungimea organelor. an de an. ca şi compoziţie şi consistenţă. se introduc întrun vas Erlenmayer. s-a reuşit îmbogăţirea. Utilizând culturi de rădăcini. îngroşări. formând mereu noi celule. moment în care se recomandă subcultivarea rădăcinilor. după care. De asemenea. izolării şi cultivării in vitro poate fi cel al unei rădăcini primare prelevate de la o plantulă de mazăre.7. a cunoştinţelor privind funcţionarea rădăcinilor şi rolul lor în metabolismul general. cu tegumentele întregi. După clătire se îndepărtează seminţele devenite translucide. întâlnim meristeme . 6. iar după cca 10 secunde se decantează etanolul iar peste seminţe se adaugă soluţie de hipoclorit de calciu 10%. este oportună introducerea în mediul de cultură a tiaminei şi a acidului nicotinic. provenit din rădăcini. Astfel. în tot cursul vieţii plantelor. Subcultura se poate face şi la interval de 7 zile. din cultura de rădăcini se poate obţine uşor calus. După cele 20 minute se decantează soluţia de hipoclorit de calciu iar seminţele se clătesc în trei reprize de apă distilată sterilă. prin excizarea apexului şi transferarea lui pe mediu proaspăt. Aproximativ 20 seminţe de mazăre. toate operaţiunile efectuându-se în camera sterilă. pH-ul fiind 5. Street precizează că auxina stimulează atât creşterea în lungime a fragmentelor de rădăcini de tomate cât şi diviziunea celulelor meristemului apical. în condiţii controlate. cu tegumentul întreg. Seminţele pot fi dezinfectate folosind agenţi puternici de sterilizare întrucât prezenţa tegumentului protejează formaţiunile embrionare de toxicitatea soluţiei de sterilizare. capacitatea de a prolifera. în care a fost repartizat un mediu de cultură MS (Murashige-Skoog) simplu constituit din soluţia stoc de macroelemente şi agar 6. Procesele de organogeneză. nelezate. este aceea a realizării unei perfecte sterilizări a seminţelor. La organele ce suferă procese de modificare secundară morfo-anatomică. După aproximativ două subculturi. mai ales din cele principale sau din cele îngroşate secundar. tot în condiţii sterile.2 Cultura de meristeme Meristemele sunt ţesuturi de tip formativ. cu celule tinere. 1-2 explante/vas. Zilnic se poate urmări dezvoltarea radicelelor secundare.8 (Reinert şi Yeoman. Geneza de muguraşi şi tulpiniţe are loc la nivelul ţesutului calusal. la nivelul rădăcinilor netransformate în calus. Seminţele se incubează la întuneric. s-a putut stabili efectul diferiţilor fitohormoni de creştere. timp de 20 minute. Se pot utiliza şi medii mai complexe. pe diferite tipuri de medii. se agită seminţele. în vase Petri. un exemplu de realizare a sterilizării. Prin cultura de rădăcini s-a putut cerceta efectul auxinelor asupra celulelor radiculare. Creşterea rădăcinilor in vitro are loc pe medii de cultură lichide neagitate. ce-şi menţin. respectiv proprietatea de a se divide. Meristemele sunt localizate în vârful ramificaţiilor organelor (tulpini sau rădăcini). utilizate pentru alte tipuri de explante. precum şi urmările carenţării celulelor lor în anumite elemente. pe un mediu de cultură constituit din macroelemente şi zaharoză. iar seminţele întregi se inoculează. al elementelor chimice sau al unor substanţe organice. vitamine sau hormoni.

30 mm lungime (Kartha. respectiv neoformarea de meristeme. respectiv cambiul şi felogenul. prin termenul de cultură de meristeme se înţelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale. cultivate in vitro. Centrifug. Ţesuturile inoculate pe medii aseptice. au mitocondrii numeroase. respectiv în componente florale. dinspre centru spre periferia mugurelui. În evoluţia in vitro a explantelor meristematice. Meristemul caulinar terminal este localizat în vârful ramurilor şi de regulă. În raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice. Celulele meristematice deţin caracteristici structurale particulare. caulinar variază mult la diferitele specii dar. se întâlnesc primordii transformate fie în frunzuliţe. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziţie radială. graţie faptului că deţin ţesuturi tinere. celulele meristematice sunt mici. Primordiile florale recoltate în faze prea avansate de dezvoltare. dar arbitrar. diferenţiate morfofuncţional. nemodificaţi secundar. un rol important îl are stadiul de dezvoltare al primordiilor. sunt uniforme din punct de vedere anatomic. fără spaţii intercelulare. 1982) sau altfel spus. Cu timpul. până la reîntoarcerea lor la starea de meristem primar. ce le conferă capacitatea de a se menţine într-o continuă stare de proliferare. De regulă. din ce în ce mai mari. slab diferenţiate şi celule meristematice. Mugurii şi bobocii au capacitate regenerativă ridicată. -vacuolele sunt mici şi nu deţin metaboliţi.1 mm diametru şi 0. cu nucleoli bine reliefaţi. De regulă. pe măsură ce se îndepărtează de apex se diferenţiază funcţional. respectiv toate celulele generate dintr-o celulă meristematică mamă sunt dispuse liniar. Meristemele apicale posedă o relativă autonomie. iar protuberanţele rezultate constituie primordiile. caulinare. El poate fi apical. straturile de celule componente sunt subîmpărţite în tunica şi corpusul. Meristemele primare au celule de forma poligonală iar meristemele secundare au formă tabulară. 1981). Mugurele este constituit dintr-un ax. celulozici. Adeseori.secundare. nucleul este mare. în apexul căruia se află meristemul. cca 0. Celulele meristemului apical. este protejat în mugur. mărimea şi conformaţia meristemului apical. fie în boboci. Prin diviziunea continuă a meristemului rezultă celule care. cambiul constituie o principală zonă regenerativă. funcţie de specie. meristemul la gimnosperme şi meristemul de angiosperme. aceşti muguri devin mai bombaţi. în primordiile florale se produce o creştere a intensităţii ratei de multiplicare celulară.25-0. în mare. se transformă în floare. Celulele externe ale masivului tisular (numit con de creştere sau vârf vegetativ) se pliază. Masivul de celule care alcătuieşte meristemul apical se apreciază că măsoară maximum 500 µ (Margara. fapt încă insuficient argumentat şi dovedit experimental. cum ar fi: -au pereţii celulari subţiri. Celulele din zona centrală se diferenţiază în xilem. primordiile se diferenţiază în primordii foliare sau florale. perpendicular pe celula ce le-a dat naştere. Cambiul şi felogenul sunt meristeme prezente în organele îngroşate secundar sau în cele metamorfozate (rădăcini tuberizate). Fenomenul de dediferenţiere . Forma. trebuie să se dediferenţieze. fenomen ce se petrece în etape succesive. mai voluminoşi. -sunt bogate în citoplasmă. vorbim despre o cultură de apex. s-au delimitat trei tipuri principale structurale: meristemul criptogamelor vasculare. La meristemul radicular păturile celulare prezintă o structură diferită de aceea descrisă la tulpină. la angiosperme. De regulă. caulinar. strâns unite între ele. de regulă. axilar sau adventiv. la nivelul învelişurilor florale se poate induce neogeneza de formaţiuni meristematice adventive. floem şi ţesut parenchimatic. În cazul în care se depăşeşte această dimensiune.

precum şi ale altor autori. au o origine comună. în raport cu condiţia funcţională a meristemului in situ. Problema transformărilor morfologice şi structurale. temperatură – sau endogeni – specie. funcţie de originea lor se împart în mai multe categorii: . cu direcţie de dezvoltare nedeterminată. din vegetativ în floral. sau în meristem generator de tulpini. Haight şi Koehnert (1969). în condiţiile inoculării lui împreună cu primordiile. prin cultivarea lor in vitro. această capacitate este mascată de corelaţiile existente ca urmare a prezenţei alături de meristem şi a celorlalte ţesuturi. La conopidă. Organogeneza constituie momentul de bază în asigurarea multiplicării vegetative. cultivat pe medii aseptice. În prezent. generatoare de rădăcini sau tulpini. prin rediferenţiere. în evoluţia filogenetică. Se ştie că meristemul radicular al angiospermelor se deosebeşte funcţional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil. Dezvoltarea in vitro a meristemului solitar. aflate întrun stadiu tânăr. vor lua naştere organe. Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiţie a formării de promeristeme şi de iniţiere a organogenezei. fie în muguri floriferi. în cazul meristemoizilor pot fi deja identificate trei tipuri de meristeme ce evoluează în: meristem proliferativ. există şi un alt termen. meristemul este prelevat împreună cu două primordii foliare subiacente acestuia. Margara (1982) se pot distinge trei categorii de meristeme: vegetativ. precum şi a celor legate de reversia meristemelor iniţial florale. în meristeme vegetative constituie punctul de plecare în multiplicarea vegetativă in vitro. abia schiţate. sau al genezei de rădăcini secundare din celulele periciclului radicular. dediferenţiere primară. probabil. aparent identice din punct de vedere morfologic. chiar în faza în care frunzele sunt abia schiţate.celulară se produce şi spontan. Din aceste meristeme. de exemplu în cazul iniţierii unor meristeme. cu toate că axa caulinară şi cea radiculară. Meristemele radiculare. Diferenţierea funcţională a meristemului se face. hormoni. în faza de preinflorescenţă. în stadiul de promeristem. Aceste experimente au relevat potenţialitatea organogenetică a diferitelor părţi ale apexului. meristem generator de rădăcini şi meristem de tip caulogen. au permis stabilirea faptului că tinerele mucroane foliare se află într-o stare nedeterminată încă morfofuncţional. din care se poate ajunge la un stadiu de dediferenţiere secundară. când o parte din celulele calusului se transformă în meristeme. nediferenţiat funcţional în meristem generator de rădăcini. Steeves (1962). Dar nu se cunoaşte dacă aceşti meristemoizi sunt identici sau prezintă deja amprenta determinismului lor funcţional. este dependentă de fitohormonii de creştere prezenţi în mediul de cultură. Este evident faptul că un meristem izolat. Experienţele de microchirurgie ale lui Wardlaw (1949). Tot legat de activitatea meristematică incipientă. depinde de o serie de factori exogeni – fotoperioadă. sau a celui însoţit de primordii. precum şi a rolului primordiilor. Definitivarea direcţiei de evoluţie a meristemului apical. În cultura de meristeme. În condiţiile cultivării unor explante in vitro. radicular şi caulinar. o atenţie deosebită se acordă studiilor privind cunoaşterea reacţiei meristemului cultivat in vitro. îşi poate manifesta totipotenţialitatea sa reală. se pot transforma fie în frunze. Ball (1946) a fost primul care a obţinut plantule din meristeme de Lupinus albus şi Tropaeolum majus. 1966). Această noţiune se referă la formaţiuni meristematice. Se pare că primordiile. pornind de la explante constând din boboci sau din învelişuri florale. întâlnit în literatura de specialitate – meristemoid (Torrey. ori in situ. de generare a inflorescenţei şi de formare a florilor. fiind numite promeristeme. Dediferenţierea celulelor inoculate in vitro poate consta în formarea de calus. De multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaţiuni meristematice. în cadrul proceselor de tranziţie care au loc în trecerea stării vegetative a meristemului în stare florală. celulele ţesuturilor inoculate pe medii aseptice suferă un proces de dediferenţiere şi generează meristeme.

îndeosebi a celor horticole şi a unor specii silvice. în fapt. Ele variază ca aspect şi potenţialitate. Meristemele mai pot fi clasificate şi în alte două categorii: -meristeme histogene – care produc obişnuit numai ţesuturi. cât şi neogeneza de rădăcini. Spre deosebire de meristemele radiculare. Potenţialitatea regenerativă a acestor meristeme este. Ele se adaptează bine la condiţiile in vitro. care sunt foarte simple ca structură şi funcţiune. acest tip de meristem este frecvent folosit în tehnicile de multiplicare şi de propagare accelerată a plantelor. -meristeme organogene – care dau naştere la ţesuturi ce formează organe.-meristem apical – situat în vârful rădăcinilor. la plantele superioare există o diversitate de meristeme clasificate. Formarea meristemelor şi organogeneza sunt procese care se petrec treptat. -meristeme adventive – formate pe diverse organe. Explantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite în tehnicile de multiplicare şi de micropropagare a o serie de specii de interes economic. suportă uşor traumatismul provocat de explantare. se traduc printr-o regresie a capacităţii regenerative a celulelor lor. Meristemele caulinare pot fi împărţite astfel: -meristeme apicale (terminale) – derivate din muguraşul embrionului. Hormonii sau regulatorii de creştere de sinteză constituie factori cu rol hotărâtor în direcţionarea proceselor de diferenţiere a meristemelor. un microbutaş. Excepţie fac plantele perene din zonele temperate. -meristem lateral – format pe rădăcina principală. . cu nutrienţi şi hormoni. ca o varietate de meristem adventiv. terminale sau laterale. terminale. se poate concluziona faptul că. Inducerea formării acestor meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicării vegetative prin butaşi. În final. -meristem adventiv – provocat în a se forma la nivelul tulpinilor. -meristeme axilare – aflate la axila frunzelor. Astfel. Auxinele intervin în reglarea formării meristemelor radiculare iar citochininele în neogeneza de muguraşi. Acest fapt presupune atât creşterea axei mugurelui şi a primordiilor sale. în funcţie de balanţa hormonală prezentă în mediul de cultură. pe medii aseptice. pe plan funcţional. Prin intermediul culturii de meristeme – apicale. întrucât ele aparţin unor plante perene. multianuale. constituie. cu dezvoltarea frunzuliţelor. extrem de mare. sub control genetic şi hormonal. generând plante. după localizarea lor în plantă. meristemele caulinare sunt deosebit de complexe structural şi funcţional. ceea ce îngreunează o alimentare optimă a lor cu apă. care în mod natural nu sunt purtătoare de rădăcini. de talie mare. Factorii de mediu pot şi ei stimula inducerea şi viteza de desfăşurare a proceselor de organogeneză. caulinare ale plantelor lemnoase ridică probleme speciale. de la o specie la alta. inoculat in vitro îşi formează un propriu sistem radicular. -meristeme neoformate la nivelul calusului. în meristeme radiculare sau caulinare. soldată cu o scădere a totipotenţialităţii acestor meristeme. Meristemele terminale. se poate realiza o rapidă multiplicare clonală a plantelor. reluându-şi activitatea în urma trecerii lor pe medii aseptice. În consecinţă. de regulă. în partea sa bazală. marcote sau organe de rezervă. Meristemele caulinare. Meristemul apical se formează în momentul organizării embrionului şi rămâne activ în tot cursul vieţii plantei. la care meristemul apical în decursul sezonului de iarnă se află în stare de latenţă. apical sau axial generează una sau mai multe plante. întrucât vârful vegetativ al plantei. Acest lucru constituie impedimente fiziologice care. frunzelor sau al altor organe. meristemul terminal. -meristeme neoformate – generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro.

Prin cultivarea in vitro a meristemelor se obţine o regenerare de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mamă donatoare. Cea mai redusă infecţie virală a fost semnalată în sucul extras din frunzele aflate încă în mugur. Ball a reuşit să obţină plante din apexuri meristematice la Lupinus albus şi la Trapaeolum majus. abia începând din anul 1949. scad potenţialul productiv al acestora. cu 1-2 primordii foliare. Numai propagarea plantelor prin seminţe poate asigura. o cultură sănătoasă de garoafe (Rudelle. a gradului de răspândire şi a evaluării intensităţii virozării organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distanţe de apex. temporară. Dacă meritul de a fi reuşit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Ball. a infecţiilor virale. are drept consecinţă şi o perpetuare a unor mutaţii somatice. au fost virozate în proporţie de 60%. Ei au constatat o distribuţie inegală a virusurilor în corpul plantelor şi au observat un gradient mai scăzut de infecţie virală. eradicarea parţială. respectiv de meristemul apical. pe măsura apropierii de vârful vegetativ. cultivate în condiţii variate de mediu. chiar şi prin seminţe se transmit o serie de viroze. revine lui Morel (1959-1960). pe care s-a amplasat exclusiv calota meristematică. prin vectorii biologici prezenţi în cultură. devirozate. lezată printr-o scarificare superficială. în 1946. Pe de altă parte. prin analize serologice. fapt deosebit de important în horticultură. a virozelor. înmulţite timp de cinci ani prin butăşire clasică. dar fără mare succes. multe din ele. multiplicarea vegetativă. ceea ce a făcut ca înmulţirea acestora pe cale vegetativă să constituie unica metodă de multiplicare a lor. la unele soiuri. prin metode tradiţionale. de diferite dimensiuni. este acela al obţinerii de material săditor sănătos. a condus la degenerarea descendenţilor ca o consecinţă a perpetuării. întrucât reduc vigurozitatea plantelor. Dar nenumărate plante horticole nu se pot înmulţii prin seminţe sau. Virozele plantelor aduc mari daune culturilor. ori seminţele nu sunt fertile. la cartofi şi căpşun. Totodată. la mazăre şi porumb. 1977). Plantulele generate in vitro din meristeme. aseptic o calotă de ţesut apical sau meristem şi câteva primordii foliare şi au depus-o pe o frunză tânără de tutun. într-o oarecare măsură. Inspirat fiind de rezultatele obţinute între anii 1949-1950 de către Limasset şi Cornuet. producţia realizată este mediocră şi produsele agricole au un grad înaintat de depreciere a calităţii lor. Experienţele efectuate de Limasset şi Cornuet au constat în urmărirea. Morel a avut intuiţia de a cultiva in vitro meristeme apicale de aproximativ 75-100 µm lăţime şi 150200 µm înălţime. prin cultura in vitro a meristemelor apicale. deosebit de păgubitoare şi imposibil de evitat şi de combătut în condiţiile înmulţirii vegetative a plantelor. Limasset şi Cornuet au extirpat. multiplicarea plantelor pe cale asexuată. Pe de altă parte. multiplicarea prin seminţe este dificilă (orhidee). Pornind de la aceste fapte. Până în jurul anilor 1949-1950 cultura propriu-zisă de meristeme nu era cunoscută. din cauza menţinerii în cultură a unor plante virozate se creează pericolul transmiterii virusurilor şi la alte plante. an de an. Butaşii obţinuţi din plante virozate au o capacitate redusă de înrădăcinare şi realizează un procent scăzut de prindere. în schimb prioritatea în ceea ce priveşte obţinerea de plante sănătoase. precum şi cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii. Ulterior. care derivă din înmulţirea meristematică a plantelor. în floricultură şi în arboricultură. prin lucrările lui Wetmore şi Morel s-au pus bazele cercetărilor sistematice privind cunoaşterea reacţiei explantelor meristematice la condiţii de cultură. Primele încercări de cultivare a extremităţilor de tulpini şi de rădăcini sunt citate ca fiind realizate încă din 1922. După trecerea unei perioade de incubaţie s-a putut constata că frunzele de tutun. însoţite numai de prima pereche de primordii foliare. Un alt aspect. recoltate de la plante bolnave. asigurându-se astfel o multiplicare clonală. de către Kotte şi de către Robbins. ştiut fiind faptul că. cauzând degenerări. în ţesuturile căruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen. prin metode de înmulţire vegetativă clasică. în . a prezentat o răspândire în masă a virozelor. Astfel. sunt libere de viroze. foarte important.

Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor. prin procedeul imaginat şi pus în practică de către Morel şi Martin. Cercetările recente au dovedit însă. De exemplu. Unele virusuri pot exista chiar şi în meristemele apicale (Hollings. mersitemele sunt prelevate de la plante supuse. cu randament economic asigurat. apical. eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. Aceştia au dat naştere la plante libere de viroze. prealabil explantării. apexul se alungeşte iar virusurile. cu atât şansa prelevării de celule lipsite de virusuri este mai mare. asigură şi eliminarea din materialul săditor a fungilor şi a bacteriilor. rămân în celulele bazale ale conului vegetativ. la plante. având ca obiectiv obţinerea de flori de calitate superioară. multiplicarea in vitro a plantelor. sau care prezintă o infecţie virală slabă. la cartof. prin înmulţire meristematică. donatoare de meristeme ori chiar de butaşi. În consecinţă. Dar. virusul X poate fi înlăturat. plantaţie executată în condiţii speciale de protecţie. cu aceleaşi rezultate. Aceste experienţe ia condus pe Limasset şi Cornuet la concluzia că în apexul caulinar migrarea şi înmulţirea virusurilor este oprită. în această situaţie. numai în procent de 1%. În 1957. Quak a remarcat că metoda lui Morel şi Martin este posibil de aplicat.timp ce frunzele pe care s-au aplicat ţesuturi subiacente meristemului (primordii foliare mai îndepărtate de meristem) s-a infectat în procent de 100%. neposedând rădăcini. Astfel. timp de 2-4 săptămâni. se poate obţine o plantă sănătoasă. tratamentului termoterapeutic. ceea ce înlesneşte prelevarea unor explante apicale mai mari de până la 1 mm. pornind de la plante virozate. 1979). Pe durata termoterapiei. În cursul aplicării termoterapiei virusurile nu se multiplică. în acelaşi timp. plantele devirozate nu sunt imune la viroze. lipsite de infecţii virale. 1977). Din acel moment s-au demarat cercetările în scopul stabilirii unor metode intensive. descreşte vitalitatea plantelor donatoare. Tulpinile generate in vitro. Dacă prelevarea se face de la o plantă neinfectată. la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecţii cu Fusarium roseum. la garoafe. Combinând cultura de meristeme cu termoterapia se realizează. prin explante meristematice. de controlare şi producere a unui material săditor sănătos. că nu toate meristemele sunt libere de infecţii virale. dar cu cât inoculul meristematic este mai mare. Au urmat apoi cartofii şi orhideele. Aceasta constă în supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse între 35-39oC. din plantele devirozate. Ele se pot îmbolnăvi tot atât de repede ca şi oricare altă plantă. Nu toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de înmulţire meristematică (Martin. Invazia meristemelor cu virusuri este dependentă de tipul meristemului. au fost transformate în minibutaşi. Această ipoteză a fost atestată de către Morel şi Martin prin experienţe efectuate cu plante de dalie. concomitent cu scăderea capacităţii de supravieţuire şi de regenerare a celulelor meristematice. atunci cresc şi mai mult şansele de a preleva explante meristematice. industriale. cu atât este mai ridicată capacitatea lor regenerativă. tot pe medii aseptice. micşorând . nemultiplicându-se. iar la Pelargonium şi Diffenbachia eradicarea bacteriozelor sistemice (Walkey. Încă din 1952. caracterele genetice ale plantei mamă. Din păcate. conservând. Termoterapia a fost elaborată de către Kunkel. prin minibutaşi. încât plantele să fie ferite de atac zoopatogen. Cu cât explantele meristematice sunt mai mici. prin explantarea şi cultivarea in vitro a meristemului caulinar. în 1936. cu şanse foarte mari de reuşită. Termoterapia vine în ajutorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de combatere a infecţiilor virale. De regulă. sau se induce formarea de colonii de propagule. ele rămân la nivelul celulelor în care au fost surprinse în momentul declanşării tratamentului termoterapeutic. sau se constituie o plantaţie mamă. al virusului şi de specia plantei parazitate. Concomitent cu eradicarea virozelor. aflate in vitro se asigură multiplicarea lor. 1962). În acest mod a fost elaborată ipoteza imunităţii potenţiale a celulelor meristematice la atacul viral. Morel şi Martin au intuit faptul că.

În partea centrală a glomerulului se disting câteva fascicule vasculare. constituită dintr-un parechim. soldată cu suprimarea atacului viral. în decursul unui an. numit protocorm. se pot obţine cca 4 milioane de noi plante de orhidee. Protocormul produs in vitro este asemănător cu protocormul de germinaţie. prin fragmentări şi subcultivări repetate ale protocormilor. Această eradicare endogenă a virozei. Fragmentând periodic această masă şi cultivând-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativă a celulelor detaşate. În anul 1978. (1969) la cireş. altă ipoteză. explantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei. sau a meristemului floral. de până la 1 mm lungime cu 2-3 primordii foliare. Acestea se refereau la faptul că meristemele de orhidee. cu celule mari. în ceea ce priveşte utilizarea unor enzime implicate în procese de restituţie. Walkey. Kassanis (1950) a dovedit că unul din virusurile cartofului. În anul 1978. astăzi. sărace în citoplasmă şi cu vacuole întinse. ca o consecinţă a traumatizării celulelor excizate. experimentând cu meristeme excizate de la crizanteme. este imposibil să regenerăm anumite specii de plante din fragmente atât de mici de ţesuturi. capacitatea lor regenerativă şi de creştere va fi mai ridicată. . ceea ce compensează epuizarea fiziologică. Prin această tehnică. Astfel. Dar tot Kassanis a precizat că la tomate există virusuri a căror activitate este suprimată abia la 80oC. de culoare verde. sau că substanţele generate în urma traumatizării celulelor ar suprima virusurile prezente în celule. poate fi inactivat la nivelul tuberculilor. a fost mai mare (Walkey. ţesuturile deţinând nealterată. Astfel. au constatat că prelungirea duratei de termoterapie de la 10-20 zile la 30 zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate. poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat. susţine că celula meristematică utilizează ARN viral. În unele cazuri. Prin ruperea şi cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o masă globuloasă. se poate realiza distrugerea virusului din vârful meristematic şi în decursul cultivării ţesuturilor in vitro. un glomerul de cca 3-4 mm slab diferenţiat histologic. efectuată în condiţii aseptice. întreaga lor capacitate regenerativă. Explicaţiile privind modul în care celulele meristematice rezistă infecţiilor înclină spre justificări de ordin molecular. în interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice. 1980). localizat în frunze. iar Walkey şi colab. de la câteva zile la câteva luni şi să ridice temperatura de la 35 la 40oC (Quak. Trebuie subliniat şi marele merit pe care Morel l-a avut în intuirea importanţei deosebite a descoperiri posibilităţii de a obţine plante sănătoase din plante bolnave. dintr-un meristem de orhidee. cauzată de termoterapie. infectate cu germeni fitopatogeni. Martin a intuit posibilitatea creării unei bănci cu explante. de la 9 la 90% dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste această durată de timp (până la 50-60 zile)nu a condus la depăşirea procentului de plante devirozate. cu atât traumatismul a fost mai puternic şi efectul endogen. Morel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. materialul vegetal generat in vitro este uşor conservat. în anul 1963. cultivate pe medii aseptice. Cele mai mari realizări le-a avut Morel în multiplicarea in vitro la orhidee. Murashige afirma că. nu poate fi realizată o traumă de o aşa amploare încât să se producă o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele explantate. Hakkaart şi Quak (1964). au reuşit această performanţă la garoafe. 1977).pericolul recoltării unor ţesuturi subiacente meristemului. generează un glomerul de 1-2 mm. De regulă însă. distructiv. exercitat asupra virusului. Una din ipoteze susţine că există o competitivitate între celula gazdă şi parazit. în care să fie conservat materialul biologic meristematic sănătos. a reuşit obţinerea de plante sănătoase şi prin cultivarea in vitro a ţesutului gametofitic femel. În consecinţă. precum şi a direcţiilor aplicative pe care le-a deschis această tehnică. prin aplicarea termoterapiei. fiind mai mari. Cu cât a fost mai mic fragmentul de ţesut excizat. Hollings şi Stone (1964). rezultat din embrionii seminţelor. ori în alte condiţii. respectiv ovare sau ţesut nucelar. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe cercetători să prelungească durata termoterapiei. În 1959.

-altele au în vedere obţinerea unui număr foarte mare de plantule. Conservarea calităţilor sale genetice se datorează metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare. în timp scurt utilizând explante mai mari de 1-5 mm sau impulsionând diferenţierea de meristeme axilare şi de muguri adventivi pe apexul iniţial. imposibil de realizat prin metode tradiţionale de înmulţire vegetativă. pentru studierea proceselor regenerative. Cartoful este atacat de nenumărate virusuri care. -creşterea la maximum a coeficientului de multiplicare. Multiplicarea acestui cultivar s-a făcut în miliarde de exemplare. lungimea explantelor fiind de până la 500 μm. Infecţiile virale afectează nu numai calitatea florilor. respectiv genotipuri valoroase.7 mm. căpşun. pot fi prezente concomitent în ţesuturi. în regim industrial a predominat factorul economic rezultat. necesarul de material săditor solicitat pe piaţă. a plantelor mamă. -eliminarea agenţilor fito sau zoopatogeni. comparativ cu virusul X. Astfel. explantele constând din meristeme recoltate împreună cu prima pereche de primordii foliare. respectiv 0. ce să asigure. la cartof. în Franţa. În laboratoarele unei singure unităţi se produc anual. din aspectele fitosanitare. în primul rând. la arbori şi arbuşti. multiplicarea unor clone. dintre toate virusurile prezente foarte des în cultură (A. cca 10 000 de garoafe. 90% dintre acestea provenind din mutaţii de culoare. S. Din nefericire. plată extrem de importantă atât în hrana omului şi pentru industrializare dar şi în hrana animalelor. respectiv din obţinerea unor culturi viguroase. Y. Este de dorit ca ele să fie sănătoase şi să se afle într- . -altele privesc obţinerea de material săditor devirozat. nu toate tipurile de virusuri pot fi în egală măsură combătute. la pomi fructiferi. ocupă locul doi iar exportul horticol francez este reprezentat în proporţie de 80% de garoafe. în cel mai scurt timp. Se practică diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar şi anume: -unele procedee vizează cultivarea exclusivă a celulelor conului meristematic. obţinerea de material săditor devirozat la garoafe. de cele mai multe ori. fără primordii foliare. în 1939. Înmulţirea meristematică a permis vindecarea garoafelor şi de boli vasculare. De o mare importanţă este cultura orhideelor. ci reduce foarte mult şi capacitatea de înrădăcinare a butaşilor. in vitro. în categoria florilor tăiate. cartoful. cifra de afaceri realizată. Pierderile sunt cifrate la 15-25%. generat in vitro. Dar cultivarea in vitro a meristemelor nu înseamnă urmărirea. -conservarea prin temperaturi scăzute a inoculilor meristematici. a unui exemplar vegetal. ca scop în sine. şi a bacteriozelor Pseudomonas caryophylli şi Pectobacterium parthenii. cultivând in vitro meristemele caulinare. sănătoase. oricând. prin vânzarea garoafelor. a beneficiat primul de extinderea metodelor de redresare a vigurozităţii culturilor prin eradicarea virozelor. Astfel. Fusarium oxysporum. cu mare atenţie şi pricepere. apicale. Astfel. ceea ce epuizează planta şi scade. În extinderea rapidă a acestor practici. pentru a avea un stoc permanent. pentru o lungă perioadă de timp. -conservarea germoplasmei în bănci de gene. În oricare din cazuri trebuie să avem în vedere selectarea. donatoare de explante. X) virusul A este mai uşor de îndepărtat. -obţinerea unui material săditor juvenilizat. respectiv eradicarea atacului de Phialophora cinerescens. numai eradicarea bolilor ci pur şi simplu.25-0. Această metodă este cu atât mai importantă cu cât se pleacă de la un material iniţial devirozat. crizanteme. considerabil recolta. în dependenţă de dimensiunea redusă a explantelor şi de consecinţele traumatismelor provocate. practicate la tipul american de garoafă creat de William Sim.Valoarea mare a culturii de meristeme constă deci în: -asigurarea uniformităţii genetice a materialului săditor. într-o anumită fază de dezvoltare. Multiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare şi la garoafe. M.

în timp ce numai 18% din mugurii laterali au format noi plante. generând plante mature. În literatura de specialitate sunt recomandări şi cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru prelevarea şi inocularea unui anumit tip de meristem. Ele vor fi transferate în ghivece mici. se specifică că meristemele de garoafe supravieţuiesc. dezvoltarea lor şi apoi capacitatea adaptativă a acestora la mediul normal sunt influenţate atât de factori endogeni.5 mm dar nici să fie mai mic de 0. în proporţie mai mare. În acest caz. cât mai ales de cei exogeni. Concentraţia fitohormonilor de creştere variază în diferitele faze de evoluţie ale meristemelor. vitamine. de cele mai multe ori. respectiv de temperatură. terminali. cerute de un anumit tip de cultură. Astfel. prelevate din mugurii axilari. 1964). de regulă.8 este indicat ca fiind optim. deoarece. Alegerea explantelor. pot fi folosite în culturile de meristeme. mai ales în cazul în care ele se fală în latenţă. tipul de mediu de cultură folosit.chiar neînrădăcinaţi. în acest caz. se utilizează medii de cultură solide. sterilizarea organelor. lumina trebuie intensificată la 3500-4000 lucşi. iar la conifere se poate ajunge chiar la o intensitate de peste 10 000 lucşi. Buys (1969) . de diviziune şi de regenerare precum şi sensul desfăşurării histo şi organogenezei. Plantele complet formate prezentând rădăciniţă şi tulpiniţă vor fi scoase din condiţiile in vitro. aminoacizi şi o sursă de carbon organic. De regulă meristemele caulinare. În alte cazuri. Citochininele stimulează creşterea meristemelor. care însă folosite timp îndelungat pot duce la inhibarea creşterii rădăcinilor. terminale. Astfel. La crizanteme din 5000 de vârfuri meristematice. iar în decurs de o săptămână de la cultivarea ţesuturilor.5-5. dacă sunt recoltate primăvara sau toamna devreme. de timpuriu.4. Un pH iniţial scăzut inhibă formarea rădăcinilor. apicale. în funcţie de scopul urmărit. În cazul în care s-a aplicat corect termoterapia explantul poate fi mai mare. pentru a stimula emergenţa meristemelor. Latenţa organelor uneori ridică probleme speciale şi implică aplicarea unor tratamente termice sau hormonale. au crescut. La cartof. de până la 1 mm. reprezentată. În ceea ce priveşte substratul de cultură. Natura hormonilor şi concentraţia acestora variază de la o specie la alta. Când se are în vedere obţinerea de plante libere de viroze la garoafe. Se poate realiza transferul lăstăraşilor în mediul septic. se recomandă subcultivarea explantelor pe medii lipsite de auxine. pH-ul de 5. meristemele recoltate primăvara sau vara. Mărimea explantelor se stabileşte în funcţie de specie şi de scopul urmărit. această operaţiune putând determina înrădăcinarea lor.2 mm. în regim de fotoperioadă cu 16 ore lumină şi 8 ore întuneric. În compoziţia mediilor de cultură sunt incluse macro şi microelemente. Temperatura trebuie să fie stabilizată între 22-25oC. Astfel. în special de balanţa hormonală şi de regimul de lumină. dovedesc cea mai rapidă creştere. de regulă de zaharoză în concentraţie de 2-3%. precum şi formarea de nenumăraţi muguraşi. La cartof. după autoclavare. regimul din camerele de creştere influenţează supravieţuirea explantelor. PH-ul mediului de cultură poate constitui un factor limitativ al creşterii şi dezvoltării meristemului cultivat in vitro. meristemele recoltate iarna înrădăcinează mai uşor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze (Van Os. este dificilă înrădăcinarea plantulelor generate din meristeme. potrivit unei anumite specii sau corespunzător unei anumite etape de dezvoltare a inoculilor. Restabilirea proceselor biologice. garoafe şi la alte specii se pot folosi şi mediile lichide. FeEDTA. În camerele de creştere intensitatea luminii se recomandă să fie de 2400-2600 lucşi. pentru înrădăcinare se folosesc cu precădere ANA şi AIA. diferenţierea de plante. fiind trecute în condiţiile mediului septic. pH-ul descreşte până aproape de 5. în amestec de perlit cu pământ. Cu toate acestea şi meristemele laterale. Uneori există indicaţii stricte cu privire la regimul termic şi de iluminare. pH-ul scade. înrădăcinează mult mai repede în raport cu cele care sunt prelevate şi inoculate la finele anului. explantul nu trebuie să depăşească 0.o perioadă de creştere activă. 32% din mugurii apicali.

îndeosebi pentru coborârea gradată a temperaturii. În aceste condiţii se asigură reducerea tuturor funcţiilor metabolice. constând în conservarea îndelungată a plantelor. 1984). Cultura poate fi menţinută astfel 10-11 luni. generate in vitro. prin repicări repetate şi cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinină. întrucât rădăciniţele generate in vitro sunt în mică măsură folositoare în sol. Dale şi colab. În anul 1980. în recipientele lor de cultură. prin menţinerea lor la temperaturi de 2-4oC. Primele încercări de crioconservare au fost făcute de către Seiberg în anul 1976. fie că sunt cultivate în teren. el îşi poate păstra întreaga capacitate regenerativă. citată de Cachiţă. prezintă un grad de juvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminţelor. Atunci când plantele sunt suficient de mari. sau culturile apropiate. Crioconservarea poate fi realizată la temperaturi extrem de scăzute. Pentru a uşura exactitatea investigaţiilor este de dorit să se facă o analiză a infecţiilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme. există dispozitive speciale. O altă problemă deosebită de biologie se ridică în cazul plantelor generate in vitro. constând în proliferarea a noi muguri axilari. La căpşun. respectiv formarea cristalelor de gheaţă. în timp ce frunzele plantelor bătrâne sunt trifoliate. pe medii aseptice. materialul de plantat. Metodele criobiologice de prezervare a materialului obţinut in vitro sunt economice şi indispensabile pentru conservarea. Generarea de frunzuliţe întregi sistează la inoculi în momentul în care se depăşeşte faza de morfogeneză. Derrick. În 1977. Meristemul se pretează cel mai bine conservării prin crioconservare. Astfel. celulele îşi reiau activitatea metabolică şi fiziologică normală. marcotaj. eventuala prezenţă a virusurilor şi gradul de infecţie. Juvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatată morfologic. se va testa serologic. la garoafe. în regim de 8 ore lumină pe zi si o intensitate de 300 lucşi. Plantele provenite atât din meristeme cât şi din explante de altă natură. întrucât în momentul repunerii lui în condiţii optime de mediu. Au pus la punct o metodă de stocare la temperaturi scăzute a unor graminee sau a unor plante legumicole. metode de mare sensibilitate în determinările de virusologie vegetală. pe termen lung. După stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele să fie menţinute în condiţii speciale fie că ele sunt prezervate în condiţii de temperaturi scăzute. iar prelungirea duratei de menţinere a plăntuţelor în flacoanele de cultură. este superior celui obţinut prin metodele tradiţionale: butăşire. celule sau protoplaşti. mediu în care se produce descreşterea gradată a temperaturii. diferenţiate din meristeme. iar în 1973. metodele fiind menite să realizeze evitarea unei reinfectări a plantelor. Pentru executarea operaţiunilor de congelare. 1981. generat in vitro. a germoplasmei precum şi a unei cantităţi limitate de material iniţial. Clark şi Adams au pus la punct un procedeu ELISA de identificare a prezenţei virusurilor. Ulterior sa reuşit şi conservarea altor tipuri de inoculi: calus. Meristemul este ţesutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi scăzute. O metodă accesibilă preconizează introducerea flacoanelor cu inoculi într-o baie de alcool. Tehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substanţe crioprotectoare. de exemplu la plantulele de căpşun.recomandă transferarea timpurie în sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro. precum şi în cultura. altoire. Astfel. ridică nejustificat costul materialului plantat rezultat. după care se recomandă ca aceasta să fie transferată pe mediu proaspăt. graţie alcătuirii particulare a celulelor lui. frunzele tinere sunt întregi. . devirozat. celulele lui fiind sărace în vacuole şi având o citoplasmă densă. într-un perimetru ferit de infecţii. Cele mai folosite substanţe crioprotectoare sunt dimetilsulfoxidul (DMSO) şi glicerolul (Kartha. cu rol în prevenirea daunelor cauzate de îngheţarea bruscă a celulelor. a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie. Metodele de testare a virozelor şi natura acestora variază de la o specie la alta.

Sfecla constituie un alt exemplu de plantă a cărei ţesuturi adulte prezintă o foarte scăzută capacitate organogenetică. Un anumit tip de calus se produce şi în mod natural. De aceea se recomandă inducerea formării de meristem prin repicări succesive. cu o auxină (AIA). transformarea unui mugur vegetativ. în mugure florifer. într-o stare primară. Instabilitatea genetică a celulelor sale şi poliploidizarea facilă a lor. prelevarea unui mic explant din apexul preinflorescenţei şi cultivarea lui pe mediu lichid. într-o anumită fază de dezvoltare a plantelor sau a organelor. alteori apariţia şi dezvoltarea lui poate fi un dezavantaj. Astfel. se formează muguri axilari sau adventivi acolo unde altfel. de specie şi de condiţiile de mediu. Un exemplu îl constituie plantele lemnoase. normal ar trebui să se formeze boboci. întrucât în cazul în care se inoculează un meristem vegetativ. tutun. O problemă deosebită o constituie aceea a menţinerii meristemului vegetativ. provoacă reveria ţesuturilor din florifere în vegetative. rapidă a unei specii. să grăbim. când este tânăr. Multiplicarea clonală. fac din calus si din cea de celule. având rol în cicatrizarea rănilor. geneza de plante din calus este extrem de dificilă. Inocularea in vitro. La numeroase plante.1984). crizanteme din calus se pot obţine uşor plante. via calus nu este posibilă tocmai din cauza facilei poliploidizări a celulelor sale. Reglarea fotoperioadei şi sporirea cantităţii de zaharoză din mediu la 40-50 g/l sunt factori care par să determine transformarea apexului vegetativ în florifer. 1974. La conopidă. posedă celule nediferenţiate. în anumite condiţii de cultură. fie se formează la baza butaşilor plantaţi pentru înrădăcinare.7. selectându-se linii cu calităţi speciale. iar din acestea a unei culturi de protoplaşti. un material biologic valoros asupra căruia agenţii mutageni şi factorii stresanţi pot opera modificări. detaşarea meristemelor florale şi cultivarea lor in vitro imprimă ţesuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative. dirijate corect. cu sau fără fitohormoni. altoiri de apexuri de plante adulte pe tinere plantule. Explantele sau butaşii prelevaţi de la astfel de plante îşi pierd capacitatea de înrădăcinare.Un caz particular este acela al reîntineririi unor organe de pe care urmează să fie prelevate meristeme apicale. Ambele tipuri de meristeme. Originea comună a meristemului vegetativ şi a celui florifer face ca transformarea. La specii ierboase (bumbac)sau la plante lemnoase (stejar). Pe această cale se practică însă înmulţirea regenerativă. obţinerea de calus poate constitui un scop în sine. Reuşita este dependentă de vârsta ţesutului. care se divid activ. Atunci când se urmăreşte multiplicarea clonală rapidă. prelevat de pe o tulpină floriferă. Inducerea formării de calus cât mai friabil constituie scopul principal atunci când se urmăreşte iniţierea unei culturi de celule. De regulă. a unor fragmente desprinse din inflorescenţe tinere conduce la formarea a numeroşi muguri. poate fi înmulţită planta pe cale vegetativă (Crisp şi colab. constituind zona de geneză a rădăcinilor adventive.1. inoculat pe medii aseptice. pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante. citat de Cachiţă. La aceste plante se practică diferite metode de reîntinerire a materialului biologic prin butăşiri sau microbutăşiri in vitro. generând muguraşi. fără a avea siguranţa conservării genotipului. La unele specii: morcov. multianuale. în direcţia diferenţierii morfologice şi funcţionale să fie posibilă. există pericolul ca anumiţi factori de mediu să inducă formarea florilor sau invers. 6. În funcţie de obiectivul urmărit.. Adeseori. fie la nivelul zonelor traumatizate. pe medii. formarea de calus în porţiunea bazală a explantului sau transformarea întregului inocul într-o masă de calus constituie un .3 Cultura de calus Calusul este o formaţiune particulară constituită dintr-o masă nedeterminată de celule deţinând o structură histologică uniformă. prin reglarea fotoperioadei şi a altor factori de mediu.

În general. Cele mai eficiente auxine în inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul 2. concentraţiile ridicate de auxină conduc la formarea de calus. legate între ele. Se pare că zaharoza intervine prin presiunea osmotică pe care o creează. 1977. prezenţa luminii şi natura acesteia intensifică acumularea în celule a antocianilor. de pe un ţesut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniţial. în dependenţă de natura ţesuturilor din care a provenit şi de condiţiile în care a fost cultivat. întrucât el poate fi înmulţit şi cultivat la nesfârşit.5 triclorfenoxiacetic (2. Provenienţa calusului şi natura inoculului iniţial influenţează sinteza antocianilor. citat de Cachiţă. Astfel. prezenţi în mediile de cultură. Temperatura scăzută. sau pot fi mai laxe.4.5 T). în profunzime se diferenţiază centri vasculari. sau spumos.fenomen care perturbă dirijarea proceselor de morfogeneză. 1959. Astfel. În general. Fiecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspăt. 1981). carenţa de azot şi conţinutul ridicat al mediului de cultură în glucide stimulează sinteza de antociani. se formează unul sau mai mulţi muguraşi. situat în porţiunea bazală a coloniei de propaguli.4D. chiar şi din ţesuturi cu structură definitivă. datorită formării şi acumulării de antociani în sucul vacuolar. Creşterea calusului este considerată ca fiind nedefinită. atunci când se procedează la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale (Saintpaulia şi Gerbera). Calusul crescut la 25oC se recomandă a fi repicat la un interval de 4-6 săptămâni. periodic. Formarea. de natura organelor din care au fost detaşate explantele generatoare de calus. Numai prin subcultivări repetate poate fi conservată vitalitatea celulelor sale. calusul poate fi generat cu uşurinţă din material vegetal de provenienţă diferită.4. din gălbui. De regulă. 1984). s-a constatat că anaerobioza inhibă formarea antocianilor (Gautheret. uneori culoarea calusului devine roşiatică sau vişinie. atunci când. Celulele ţesutului calusal pot fi mai compacte. decât la gimnosperme sau la monocotiledonate. Pe măsură ce calusul depăşeşte un număr de zile de cultură. meristeme.4 diclorfenoxiacetic (2. Street (1973) precizează că trecerea calusului în suspensie celulară duce la scăderea substanţială a cantităţii de antociani. iar citochininele stimulează formarea antocianilor (Street. mai greu dezagregabile. auxina inhibă. galben-verzui ori verde. muguri. Astfel. formând un calus friabil. de tipul fitohormonilor de creştere prezenţi în substratul de cultură şi uneori de condiţiile de cultură. cauzând dezvoltarea preponderentă a rădăcinilor. La plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai multă uşurinţă. Fitohormonii de creştere şi natura acestora influenţează şi ei sinteza antocianilor. Antocianii sunt sintetizaţi însă şi la întuneric. separabil în fragmente granulate. face ca la baza explantului să se genereze calus. ce se separă în formaţiuni tisulare fine. grunjos. Kalinin. de mărimi diferite. creşterea şi aspectul calusului sunt dependente de natura şi concentraţia fitohormonilor de creştere. a izolat o linie celulară cu un conţinut foarte ridicat de antociani. prin inocularea de liber secundar. Această metodă se practică cu succes. se ajunge uşor la formarea de calus. . natura ţesuturilor din care a provenit calusul şi vârsta acestora.4D) şi acidul 2. devenind cenuşie sau galben-brună. internodii. fragmente de frunze. masa tisulară îşi schimbă culoarea. Consistenţa şi friabilitatea ţesutului calusal depind de specie. constând în desprinderea de propaguli. se procedează la repicarea. Astfel Eriksson (1967) iradiind o cultură de celule de Haplopappus cu raze UV. se produce o îmbătrânire a celulelor sale. iar pentru inducerea rizogenezei fiecare muguraş trebuie detaşat şi subcultivat pe un mediu cu sau fără auxină. întrucât şi un conţinut ridicat de NaCl stimulează formarea acestor pigmenţi. administrarea unei balanţe hormonale neechilibrate. adecvat pentru iniţierea unei culturi de celule. ori noduli organoformatori. De altfel. respectiv la fragmentarea lui. folosite în concentraţii cuprinse între 1-10 mg/l. în defavoarea diferenţierii muguraşilor sau invers. pe mediu bogat în 2. Dacă calusul nu este subcultivat în timp util. În morfo şi organogeneza calusului un rol determinant îl au mediul de cultură şi condiţiile de cultură.

din el diferenţiindu-se rădăcini. şi uneori muguraşi. brunie sau verde. nu constituie medii corespunzătoare producerii calusului de tip regenerativ. fiind mai friabil. De altfel. cu celule nediferenţiate. adecvate creşterii optime a ţesutului calusal. desfăcându-se uşor în pachete de celule. Regiunile friabile prezintă celule mari. în continuare. de culoare albă. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic. după producerea acestei reversibilităţi procesul este definitiv. Nabors a remarcat şi faptul că ceea ce la un anumit moment. Aceste regiuni generează rădăcini şi mai rar muguraşi dar niciodată plante. În general. Tot Nabors a observat că acest calus regenerativ tinde să devină neregenerativ. La cereale se recomandă adăugarea în mediu a acidului 2. de numărul repicajelor făcute. în timp ce calusul regenerativ are o creştere mult mai lentă. În general. îşi menţin o potenţialitate ridicată de a regenera plante (la tutun). calusul care provine din rădăcini de plantule de cereale posedă mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ. Dintr-un inocul iniţial se obţine calus de tip primar. Dacă regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care să impulsioneze şi să susţină procesele regenerative. Pentru a preîntâmpina dezvoltarea neomogenă a calusului se urmăreşte obţinerea unui calus regenerativ omogen sau cel puţin predominant ca masă. ori galbenă-verde. Calusul obţinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna dă naştere la noi plante şi un calus de tip neregenerativ ce prezintă. cele două tipuri de calusuri necesită fitohormoni diferiţi. intervenindu-se periodic.4. de regulă. întrucât cele două forme sau tipuri de calusuri.5 triclorfenoxiacetic. Calusul embriogen este dens. Aceste două tipuri de calus au mai fost denumite calusuri embriogene şi neembriogene. Pe altă cale se pot identifica şi izola insulele de calus regenerativ. calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. dar niciodată plante (Nabors. chiar şi pe medii potrivite scopului menţinerii unei creşteri susţinute a acestuia. ce pot fi izolate şi subcultivate (Cachiţă. prin menţinerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creşterii acestuia şi nefavorabil obţinerii de plante. Calusul neembriogen este constituit dintr-o masă cristalină. nu sunt interconvertibile. într-o populaţie de celule calusale. poate genera. ce conţine un număr de aproximativ 50 000 celule. respectiv sărace în azot cu pH-ul 5. Frecvent. chiar şi după cinci ani. într-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului. mediul Linsmaier-Skoog (1965) sau cele de compoziţie similară. Nabors a fost primul care a dovedit că cea mai ridicată capacitate regenerativă. în raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. realizându-se transferarea lor pe un mediu de creştere adecvat. celulele lui vor da în final naştere la plante. Acest mediu însă nu este cel mai potrivit pentru inducerea şi menţinerea proceselor regenerative. ce pot genera embrioni sau embrioizi. denumit de tip regenerativ. Calusul provenit din plantele monocotiledonate (cereale) are o capacitate regenerativă scăzută.Capacitatea organogenă sau embriogenă a ţesutului calusal este dependentă atât de factorii endogeni şi exogeni. diferite funcţional. având efect pozitiv în susţinerea creşterii calusului. Calusul transferat pe mediu proaspăt. regiuni regenerative.5 sunt de preferat. cele mai bune medii de cultură. Dar şi la calusul bogat în zone regenerative acestea reprezintă numai cca 1-10% din totalul masei calusale. pare să fie ţesut de tip neregenerativ. evaluată la câteva săptămâni (Conger. 1984). menţinută timp îndelungat o prezintă calusul embriogen. o creştere luxuriantă. prin subcultivări de întreţinere. transparentă. atât pentru impulsionarea şi susţinerea creşterii cât şi pentru diferenţiere. pe măsură ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ. Acest tip de calus prezintă o consistenţă mai laxă. Calusul de tip regenerativ poate fi obţinut şi din calusul secundar. 1981). mult vacuolizate. 1982). în doze variate. Citologic se remarcă zone compacte. din care ulterior se vor forma plante complet formate. de condiţiile de cultură şi de vârsta calusului. translucid sau opac de culoare albă-lăptoasă. După cca şase săptămâni. spre galbenă. . De regulă. calusul neregenerativ creşte abundent. se numeşte calus secundar.

După două subcultivări ale calusului de tip regenerativ. aminoacizi şi fitohormoni). ţesut de rezervă. are loc formarea de plante. la diverse intervale de timp. fiind obligatorie pentru menţinerea viabilităţii calusului. vitamine. cultivându-l pe medii lichide. pe un mediu conţinând auxină. antere. însă. Dacă calusul este mixt. astfel din calusul de tip regenerativ. Nabors (1982) a reuşit să obţină calus şi apoi plante rezistente la concentraţii . -urmărirea proceselor de organogeneză sau de embriogeneză funcţie de condiţiile în care a fost cultivat calusul. -observarea proceselor de formare a calusului şi urmărirea creşterii acestuia se face periodic. pe mediu lipsit de fitohormoni de creştere. din porţiunile de calus de tip regenerativ. frunze. calusul de tip regenerativ nu va mai creşte. în cca 2-5 săptămâni după transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative. -sterilizarea recipientelor şi a mediilor de cultură. urmând ca după 1-2 săptămâni. Ţesutul calusal are o utilizare variată. La calusul de grâu. ovare. folosind diverse procedee în funcţie de tipul de explant utilizat. Este importantă ţinerea unei evidenţe stricte a numărului de subcultivări suportate de către fiecare fragment de ţesut calusal. în cultură se diferenţiază şi plante. Procentul de formare al calusului regenerativ creşte însă la calusul crescut în condiţii de întuneric. pentru a favoriza continuarea creşterii acestuia. -dimensionarea explantelor este diferită în funcţie de specia la care se lucrează şi de tipul de organ folosit ca sursă de explante. La grâu. de regulă la temperatura de o 25 C. concomitent. plantele bine înrădăcinate. ramuri. Pe un astfel de mediu. -prepararea mediilor de cultură şi alegerea tipului de mediu se vor face în funcţie de scopul propus. Subcultivarea se efectuează la cca 4-6 săptămâni. Regiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la întuneric. calusul trebuie transferat la interval de cinci săptămâni. să fie transferate în ghivece cu pământ în amestec cu perlit. -incubarea inoculilor se face fie la întuneric. obţinând-se astfel suspensiile celulare folosite în diferite scopuri. pe mediu potrivit inducţiei diferenţierii de plante. de provenienţă şi de vârsta acestuia. Calusul poate fi folosit şi în obţinerea unei culturi de celule. potrivit inducerii neoformării de plante. El constituie unul din materialele biologice asupra căruia se pot aplica diferiţi agenţi selectivi. -subcultivarea periodică se realizează prin fragmentarea calusului şi inocularea fragmentelor pe medii proaspete. iar solidificarea mediului se realizează cu agar. regenerarea se realizează pe un mediu lipsit de fitohormoni de creştere. în scopul obţinerii de linii rezistente. din care se va executa prelevarea explantelor. Atunci când scopul este doar obţinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultură oarecare. embrioni. care va fi udat cu apă de la robinet. pentru selecţionarea de plante care să fie tolerante la prezenţa în mediul lor de viaţă a unui anumit factor de stres. se recomandă transferarea calusului rămas. fie pe mediu solid fie pe mediu lichid când însă este necesară agitarea în vederea aerării culturii. -inocularea explantelor se realizează în condiţii aseptice. componenta neregenerativă continuă să crească mult. Calusul poate fi obţinut din explante provenite din diverse surse: seminţe. -pregătirea materialului vegetal în vederea dimensionării explantelor. conţinând perlit. rădăcini. Se realizează curăţirea organelor şi dezinfectarea lor. În vederea obţinerii de calus se parcurg următoarele etape: -alegerea materialului vegetal. fie la lumină. la hota cu flux de aer steril.În decursul timpului s-a constatat că se obţine mai mult calus din inoculii cultivaţi la întuneric decât din cei crescuţi la lumină. conţinând substanţe anorganice (macro şi microelemente) şi substanţe organice (sursă de carbon organic. Plantele obţinute sunt detaşate de calus şi sunt plasate în vase deschise.

şi apoi. în calus de tip regenerativ şi neregenerativ. sub acţiunea unor anumiţi factori. substanţă introdusă în concentraţii crescânde în mediul de cultură.1. În concluzie. permiţând efectuarea unor experimente de fiziologie privind: creşterea.4 Cultura de embrioni şi endosperm Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practică în diferite scopuri. Pentru a fi atinsă o stabilă toleranţă. 12-24 ore. după care. În cazul în care se utilizează ca material biologic de iniţiere a culturii de calus. fitohormoni (2.ridicate de NaCl. Astfel. se detaşează embrionii. care este utilizat ulterior în alte . evitându-se lezarea acestora şi inoculându-i pe mediu de cultură. fie se adaugă în substratul de cultură destinat repicării calusului. Van Qverbeek şi colab. precum şi la Avena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la 0. Metodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecţionate continuu. calusul de tip neregenerativ este inutilizabil în acest gen de experimente. transmisibile descendenţilor. (1941) au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui Lee (1955) şi Morel (1956) să efectueze experienţe de multiplicare in vitro folosind ca material iniţial embrioni extraşi din seminţe coapte. prin subcultivări repetate. sau sunt cultivaţi în scopul obţinerii de calus. obţinând plantule transferabile în sol.6-0. 6. interspecii şi intergenuri. o varietate în mod natural mai rezistentă la acţiunea dăunătoare a agentului selectiv în cauză. cel mai bun calus. respectiv durata de timp în care s-a operat selecţia. Seminţele au fost sterilizate. în urmărirea unor modificări ultrastructurale. Orisa şi Pennisetum tolerante la concentraţii ridicate de NaCl (0. Agenţii selectivi la care dorim să obţinem toleranţă pot fi introduşi fie în mediul de cultură. testarea viabilităţii celulare. Hanning a demonstrat posibilitatea cultivării pe medii aseptice a embrionilor de Raphanus şi Cachlearia pe soluţii minerale cu adaos de zaharoză. dezvoltat în condiţiile germinării cariopselor pe medii aseptice. ca atare sau se operează detaşări de fragmente embrionare. reacţia la pesticide. Embrionii pot fi cultivaţi in vitro. boabele de grâu se sterilizează. S-a constatat că stabilitatea caracterelor dobândite este dependentă de durata în care s-a petrecut imprimarea acestor caractere. Numai din calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante.7. chiar şi în condiţiile absenţei îndelungate din mediu a agentului selectiv. cu caracterele dobândite stabilizate. Calusul poate fi utilizat şi ca instrument de cercetare în diferite experimente de fiziologie. La grâu. vitamine. Atunci când se urmăreşte cultivarea in vitro a embrionilor imaturi.4D sau 2. noxe.03%. la microscop. a biogenezei unor produşi primari sau secundari de metabolism.4. Menţionăm că şi în situaţia unor experimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenţierii capacităţii regenerative a calusului. în condiţii aseptice a fost izolat embrionul. Mediul de cultură recomandat pentru grâu (cariopse sau embrioni imaturi) este Linsmaier-Skoog. atât pentru cercetări de fiziologie a seminţei cât şi în experienţe de hibridări intersoiuri. ioni grei. se realizează o reducere a timpului de obţinere a unei linii rezistente. morfo şi organogeneza. care răspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obţinut din rădăciniţa embrionară.5 T) şi agar. după care au fost îmbibate în apă. a raportat obţinerea de plante de Triticum.9%). calusul poate fi utilizat ca monitor al reacţiei celulei vegetale la o serie de substanţe sau condiţii de cultură. administraţi exogen sau în dependenţă de natura inoculilor din care a provenit calusul. respiraţia. Încă din 1904. sursă de carbon (zaharoză). în studierea problemelor de morfogeneză. sunt necesare cel puţin şase luni de călire şi selecţie. conţinând macro şi microelemente. în analize de ordin biochimic. preparat pentru inducerea formării de calus.

adecvat continuării proceselor de creştere şi de dezvoltare. respectiv când începe diferenţierea internă a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogenă a structurii embrionare variază de la specie la specie şi uneori este dependentă de condiţiile meteorologice. sau prezintă chiar un uşor avans în creştere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt plăpânde. să fie imposibilă. uneori conduce la obţinerea de plantule malformate. chiar dacă mediile de cultură au o compoziţie adecvată dezvoltării acestora. din clipa formării zigotului şi până la inocularea lui in vitro. după polenizare. Deci. complexe. . care are în compoziţia sa săruri minerale şi o componentă glucidică. pretratamentul florilor femele cu anumiţi regulatori de creştere. În mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi. recoltaţi foarte tineri. Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi. asemenea celorlalte tipuri de explante. Problemele ridicate de cultura embrionilor sunt. Embrionii maturi necesită un mediu de cultură simplu. realizaţi între grâu şi secară. În această etapă explantarea embrionului şi inocularea lui pe medii aseptice creează probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim. ceea ce a făcut ca explantarea embrionilor şi cultivarea lor in vitro. În unele cazuri. Ovulul fertilizat adăposteşte zigotul care. aminoacizi. În timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similară cu cei dezvoltaţi în condiţii naturale. cu cât stadiul în care au fost prelevaţi a fost mai timpuriu cu atât şi factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai complecşi şi greu de reprodus. pe medii aseptice. Există şi practici constând în grefarea de embrioni pe endospermul aparţinând altor specii sau genuri. cultura de embrioni maturi este mult mai uşor de realizat. sau dacă se detaşează ovulul în întregime realizându-se astfel inocularea lui pe medii aseptice. pentru a asigura stimularea creşterii unui anumit organ sau pentru inducerea formării de calus. corespunzătoare ca şi compoziţie. la dicotiledonate. suc din fructe de tomate sau extract de endosperm. aşa cum este cazul hibrizilor sexuali intervarietăţi interspecii şi intergenuri. pentru creşterea şi dezvoltarea lor ele au nevoie de: glucide. începe să se dividă şi se hrăneşte din rezervele endospermului. În această fază celulele embrionului sunt heterotrofe. Adăugarea la mediul de bază a vitaminelor (acidul nicotinic. cu succes. Taira şi Larter (1978) au tratat ovulele fertilizate cu acid E-aminon-caproic. În general. dezvoltarea embrionilor a fost extrem de lentă. vitamine şi hormoni. poate fi realizată o creştere corespunzătoare a acestuia numai dacă embrionul este izolat împreună cu nucela sau cu ţesutul nutritiv. în continuare parcurgerea evoluţiei fireşti a proceselor de ontogeneză şi să se respecte integritatea lor morfoanatomică. facilitând astfel. iar în sol dovedesc o creştere mai lentă şi sunt mai firave. după formare. iar adăugarea fitohormonilor de creştere are drept scop urmărirea evoluţiei embrionilor în prezenţa acestora. perioadă care exprimă vârsta embrionului în zile. operaţie denumită hibridare in vitro. Un rol deosebit revine momentului în care se execută explantarea embrionului. embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice în momentul în care sunt formate cotiledoanele. depăşind barierele fiziologice care împiedicau creşterea acestora. piridoxină) impulsionează creşterea ţesuturilor. acidul ascorbic. impulsionează creşterea embrionilor până la faza în care ei pot fi extraşi şi cultivaţi.experimente. după polenizarea interspecifică sau intergenerică. lapte din nucă de cocos. adesea se recomandă adiţionarea unor extracte naturale: hidrolizat de caseină. creşterea embrionilor hibrizi. Prin cultura in vitro de embrioni se poate preîntâmpina avortarea sau dezvoltarea anormală a embrionilor ca urmare a instalării unei incompatibilităţi între embrion şi ţesutul nutritiv. Cultura de embrioni imaturi. respectiv timpul scurs după fecundare. În unele cazuri. dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural. cu condiţia ca ei să fie explantaţi în acea fază de formare care să le permită. când este importantă izolarea timpurie a embrionului de sub acţiunea plantei mamă. De regulă. care ridică mari probleme. sau al formării de hibrizi sterili.

la 12 zile de la polenizare. îmbinându-se caracterul de perenitate cu cel al calităţii furajului realizat (Evans. De asemenea. odată cu detaşarea şi desprinderea lor de sub acţiunea megagametofitului. Cea mai veche cultură de embrioni la gimnosperme este citată ca fiind efectuată de către Schmidt în anul 1924. Tsuga canadensis şi Pseudotsuga menziensii şi a demonstrat. în timp ce pe un mediu cu numai 1-2% zaharoză. nu creşte pe medii aseptice. Phaseolus. Lotus. În unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de latenţă. pentru reuşita iniţierii culturii este important stadiul în care se află diferenţierea celulelor embrionului. Deci. rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor. Straus şi La Rue în 1954. doar la câteva specii sau varietăţi. embrionii pot să servească şi ca ţesuturi de plecare în multiplicarea şi propagarea rapidă a unor plante (la specii ornamentale) atunci când acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de explante. O atenţie deosebită trebuie acordată aspectelor teoretice şi practice pe care le ridică problemele de embriologie experimentală la gimnosperme. Endospermul de porumb. obţinându-se hibrizi interspecifici de Melilotus. şi Medicago. gimnospermele având un endosperm de tip primar. Experimentele ulterioare au reliefat faptul că embrionii de gimnosperme pot fi crescuţi in vitro. Cultura de endosperm constituie un excelent instrument pentru studierea problemelor de morfogeneză şi se referă la cultura endospermului de tip secundar. Mai târziu. când a cultivat pe un mediu organic embrioni de Pinus sylvestris. de regulă endospermul este consumat în primele faze ale dezvoltării embrionului. cun un conţinut de 3-6% zaharoză şi hormoni. presiunea osmotică. embrionii de Pinus strobus. în anul 1947. Rezultate bune s-au obţinut şi în regenerarea de plante din embrionii altor specii furajere. atunci când embrionii sunt excizaţi şi sunt cultivaţi in vitro. Dintre acestea numai la unele specii se manifestă procese de organogeneză. La Rue. totodată. corespunde scopului inducerii formării de calus şi anume: Zea mays. în 1936 Rue a reuşit cultivarea in vitro a embrionilor proveniţi de la câteva specii: Pinus resinosa. în lipsa megagametofitului (Cachiţă. generează o masă . la 8 zile după polenizare. Coffea arabica. vor genera plantule. Picea canadensis. sau sursa de carbon organic. muguraşi şi chiar plantule. Ricinus. Croton. Prin cultivarea in vitro a embrionilor de Taxaus embryo s-a reuşit scoaterea acestora din starea de latenţă. pe mediu Murashige-Skoog. Ambele tipuri de endosperm deţin un rol important în alimentarea şi susţinerea creşterii embrionilor. până la stadiul de plantulă. de ricin. Petroselinum hortense.Prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante mature din hibrizi de trifoi 2n x 4n. Cele mai bune varietăţi. formează uşor rădăciniţe. potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat. Primele experimente constând în proliferarea endospermului imatur de porumb au fost efectuate încă din anul 1933 de către Lampe şi Mills. De exemplu. Lolium. prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metodă eficientă în scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor. La cultura de embrioni. 1984). derivând din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar. Santalum. Endospermul matur. că embrionul imatur de gimnosperme (de 2-4 mm) poate fi cultivat pe medii aseptice. Cercetările menţionate au deschis calea unor experimente prin care s-a dovedit că acest ţesut iniţial are o capacitate ridicată de proliferare. Endospermul de porumb. a realizat creşterea nelimitată a endospermului de porumb. se constată o serioasă limitare a dezvoltării primordiilor radiculare. au obţinut rezultate excelente cultivând endosperm de porumb. La plantele dicotiledonate. având celule triploide. joacă un rol important în evoluţia acestora. Tot prin cultura de embrioni s-a reuşit obţinerea de plante la specii ale căror seminţe nu germinează (banane) sau a celor care se înmulţesc greu prin seminţe (specii forestiere). 1962). În această direcţie. precum şi la alte specii.

1. pe de altă parte. cultivate pe medii aseptice.de calus în continuă creştere. de ordin endogen şi anume: o primă selecţie a polenului se face la nivelul stigmatului. ovule şi de ţesut nucelar În hibridare poate exista. respectiv a tuburilor polinice. maturitatea organelor sexuale se face în momente diferite.5 Cultura de ovare. ca partener femel. a antezei şi a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. substanţele secretate de către celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba. se practică în cazul speciilor compatibile sexual. a pistilului. ori prin punerea în contact a polenului. Alteori. Experimentele de polenizare şi fecundare artificială in vitro trebuie precedate de o cunoaştere a bilogiei florilor cu care se doreşte efectuarea experienţelor. Aplicarea polenului pe stigmatul pistilelor. generată de faptul că plantele care trebuie încrucişate prezintă diferenţe morfologice constând în mărimea polenului. la nivelul stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic. pentru o anumită perioadă de timp.7. uneori. fără organogeneză. în formarea şi creşterea embrionilor. procesele de depozitare ale substanţelor de rezervă în ţesuturi. dar operând cu ovare sau ovule. fie acceptarea de către ovule a autopolenizării ori a polenizării încrucişate. de vârsta embrionului. când nu există impedimente morfofiziologice. însă. oferind importante informaţii privind interferenţa diferitelor etape metabolice cu regulatorii de creştere. 6. cu factorii care pot intervenii. Incompatibilitatea dintre ovule şi polen este provocată de către diferite cauze. facilita fie accesul polenului la ovul. pentru menţinerea viabilităţii părţilor componente ale pistilului. citat de Cachiţă. în condiţiile utilizării tehnicilor constând în folosirea. polenul să fie recoltat şi să fie conservat. Pe de altă parte trebuie făcute testări prealabile cu privire la mediile de cultură adecvate menţinerii microsporilor la un potenţial biologic şi într-o stare optimă de viabilitate. germinarea polenului precum şi creşterea tubului polinic. o incompatibilitate între partenerii sexuali. 1984). natura umedă sau uscată a suprafeţei stigmatului poate constitui un impediment în reţinerea polenului pe stigmat şi în crearea mediului optim. în prealabil. amplasarea anterelor în floare etc. Aceasta poate prezenta o conformaţie morfologică necorespunzătoare. în schimb la Petunia violacea. pozitiv sau negativ. constituind un sistem de tip monitorial în redarea fazelor de creştere ale diferitelor părţi componente ale embrionilor. 1965. caz în care se impune ca. a celor de incompatibilitate la încrucişări. De aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate. deci.motiv pentru care s-a trecut la reproducerea aceloraşi încrucişări. În unele cazuri există o autoincompatibilitate naturală. specie autocincompatibilă s-a constatat că autopolenizarea in vitro a fost urmată de o creştere a pistilului dar după un timp acesta s-a brunificat (Shivanna. împiedicând angrenarea ornamentaţiilor exinei polenului pe vilozităţile stigmatului. Polenizarea şi fecundarea artificială in vitro se poate face. adeseori. etapele de morfogeneză cât şi a compatibilităţii şi a incompatibilităţii. 1965). Prin această metodă s-a reuşit autopolenizarea la Antirrhinum majus (Usha. atât în ceea ce priveşte morfologia. . privind fixarea şi germinarea polenului la nivelul stigmatului. învingându-se astfel barierele de autoincompatibilitate. în timp ce la nivelul valusului de Petroselinum se observă embriogeneza. Aceste etape pot fi studiate în dependenţă de natura substratului de cultură. Deseori. pentru asigurarea creşterii tubului polinic. operaţiunile fiind făcute în scopul obţinerii de seminţe viabile. polenizarea şi fecundarea in vitro a ovulelor au eşuat. cu ovarele sau cu ovulele excizate. în funcţie de condiţiile de mediu. Cultura de embrioni oferă un important instrument în cercetările de embriologie şi în embriogeneza experimentală.

cu rezultate favorabile. cultivate fiind pe un mediu aseptic. ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic până la sacul embrionar. care a reuşit cultivarea in vitro a ovarelor de Lycopersicon pimpinellifolium. în anul 1970. înlăturându-se barierele incompatibilităţilor genetice şi obţinerea. cultivate pe medii aseptice. în final. favorizând formarea şi maturarea seminţelor. Phaseolus vulgaris şi Nicotiana tabacum. La Oryza sativa şi la Haworthia turgida. normal. În cazul în care florile au fost excizate şi inocularea s-a făcut la opt zile după polenizare. au constatat la Iberis amara formarea unor fructe normale. Hibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare între cei doi părinţi. La Rue cultivând in vitro ovule de Erythronium americanum. cultivate in vitro. În general cultura de ovare serveşte la inducerea artificială a poliembrioniei. În acest mod. ovulele s-au maturizat şi au format seminţe viabile. Mediile de cultură au fost complexe şi au conţinut ca fitohormoni: acidul 2. cultivate in vitro. White a încercat să cultive ovule de Antirrihinum. dar a obţinut calus. Pot fi cultivate in vitro atât ovule fertilizate cât şi ovule nefertilizate. Apoi. Ovarele au fost recoltate fie înainte de polenizare fie după ce polenizarea s-a petrecut în mod natural. în condiţiile cultivării in vitro a acestora. fie sămânţa rezultată se dovedeşte inaptă în a suporta dezvoltarea embrionului. în condiţiile inoculării lor la o zi după polenizare. pe placentă de Capsicum. Maheshwari şi Lal (1961. In vitro ele au crescut. Lipsa caliciului poate fi suplinită prin adăugarea în mediul de cultură a unui surplus de zahăr.4. În această perioadă. Substanţele respective nu prezintă o specificitate. au fost grefate. S-a constatat că ţesutul placentar exercită un efect pozitiv asupra creşterii ovulelor cultivate in vitro. Încă din anul 1932. s-a observat apariţia fenomenelor de poliembrionie. Plantele rezultate au fost asemănătoare cu Festuca rubra. observat o creştere a acestora fără ca să obţină maturizarea lor. de seminţe viabile. 1975). Ovulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate în condiţiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor. În condiţiile cultivării acestora in vitro. utilizându-se ovule detaşate din floare. În anumite cazuri. Majumdar a obţinut. Prin tehnicile de cultură in vitro a ovarelor au fost obţinuţi hibrizi din încrucişarea hibrizilor diploizi de Brassica chinensis şi autotetraploidul Brassica pekinensis (Inomata. Embrionii izolaţi au continuat să prolifereze numeroşi alţi embrioni (Zatyko. Astfel. de exemplu la ovulele de Ribes rubrum. lipsa caliciului nu a mai fost resimţită. dar în final nu au format seminţe. neobţinând. acestea prezentau caliciu. la cinci zile de la polenizare.Meritul primei culturi de ovare îi revine lui La Rue (1942). Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct între polen şi ovule.5 triclorfenoxiacetic. 1984) experimentând cu flori excizate. provenind de la diferite specii sau genuri. sunt monoembrionare. s-a realizat actul de fecundare între indivizii îndepărtaţi filogenetic. Cucumis angeria. Se presupune că ţesutul placentar cedează ovulelor anumite substanţe stimulatoare. În literatură se citează hibridul realizat între Lolium perene şi Festuca rubra. numai dacă. plantule din ovare nepolenizate. interspecifice şi intergenerice care în condiţiile obişnuite.4 diclorfenoxiacetic şi acidul 2. la seminţele care. 1968). Există numeroase cercetări care atestă rolul deosebit pe care îl joacă părţile florale în dezvoltarea fructului. în natură duc fie la incapacitatea embrionului format în a-şi menţine viabilitatea. Există perspective mari în ceea ce priveşte realizarea prin culturi in vitro a unor polenizări încrucişate. întrucât ovule fertilizate. însă în final seminţe viabile. Nitsch (1949-1951) a cultivat in vitro ovare de Lycopersicon esculentum. Mitra (1972) a reuşit obţinerea de embrioizi din pereţii ovarelor nepolenizate de Citrus aurantifolia şi Citrus sinensis. . generat din integumentele ovulului. citaţi de Cachiţă.

a formării embrionului. compoziţia mediului şi condiţiile de cultură (Street. recoltat în perioada iniţierii culturilor de ovule. Mediul de cultură optim. din celulele căruia s-au diferenţiat embrioizi. este necesar să se aproximeze dacă tubul polinic are o lungime corespunzătoare pentru a fi asigurată accesibilitatea lui la ovule. ceva mai mari decât embrionii zigotici. întrucât prin înmulţirea sexuată se poate reînnoi continuu. polenul să fie testat în ceea ce priveşte capacitatea germinativă. pot prezenta un interes economic major şi care în mod natural nu pot fi obţinuţi prin hibridare sexuată. fiind mai redus în momentul iniţierii culturii şi mult mai accentuat în perioada optimă de creştere. în vederea asigurării unei creşteri optime a tubului polinic.Învingerea barierelor morfo-fiziologice creează posibilitatea realizării de hibrizi interspecifici care. depinde de durata creşterii celulelor în cultură. de cultivare la celulele de gimnosperme diferă de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate. fie polen conservat. va fi facilitată fecundarea şi se preîntâmpină epuizarea celulei generative. În ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculării. De asemenea ele pot fi şi rezultatul unor repetate diviziuni celulare. Ulterior deşi frecvenţa diviziunilor scade. ovare sau de pistile.6 Cultura de celule Poate fi definită ca o creştere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu de cultură lichid. precum şi a ansamblelor de componente florale a permis completarea cunoştinţelor actuale privind funcţionarea organelor respective şi privind biologia fecundării. în caz contrar se renunţă la cultura de pistile şi ovulele vor fi excizate şi cultivate ca atare. gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare. specie în mod normal monoembrionară. Astfel. Plantulele rezultate au fost viabile. Unul din constituenţii mediului de cultură de care depinde menţinerea . într-o suspensie celulară. fapt deosebit de important. 1976). fără separarea celulelor. îmbogăţindu-se zestrea ereditară.1. Pentru a reduce numărul de agregate se practica filtrarea culturii. În cazul în care polenizarea se face la nivelul stigmatului. Din ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar. S-au reuşit realizarea de experimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei.7. Mullins şi Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera – Cabernet Sauvignon. În acest mod. a separării şi individualizării parţiale a acestora. originea acestora. 6. Gradul de dispersare a celulelor. în viitor. dar şi faţă de mediul folosite la dicotiledonate. ovarelor. în 1976. Agregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente dezmembrări a celulelor inoculate. 1977). În funcţie de momentul în care se face aprecierea acestui aspect. cu caracterele moştenite de la doi părinţi. iar în astfel de cazuri frecvenţa agregatelor creşte pe măsura atingerii perioadei maxime de diviziune celulară. în decursul parcurgerii traseului de la stigmat. până la sacul embrionar (Cachiţă. a seminţei şi a fructului. uniforme din punct de vedere genetic (Street. posedând acumulări genetice diferite. Pornind de la acest tip de ţesut. respectiv conservarea şi susţinerea întregului potenţial biologic al celulei generative şi a celei vegetative. mai ales în cazul urmăririi realizării de polenizări interspecifice sau intergenerice. mărirea agregatelor celulare se datorează creşterii în volum a celulelor. Agregatele care persistă şi după filtrare vor deţine maximum 4-10 celule. creşterea tubului polinic şi să se studieze comparativ eficienţa câtorva reţete de medii de cultură. Aceste cunoştinţe servesc la obţinerea de noi succese în învingerea barierelor incompatibilităţilor existente în hibridarea sexuată. 1984). Cultivarea in vitro a pistilelor. in vitro se poate induce poliembrionia. Cea mai perfectă cultură de celule nu este alcătuită numai din celule libere. La fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspăt. ovulelor şi a altor părţi florale. potenţialul biologic al plantelor.

Există şi sisteme închise de cultură care asigură reîmprospătarea continuă a mediului consumat. Celulele cultivate într-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse în acelaşi flacon de cultură. 1984). după care. De asemenea s-a constatat că procesele de agregare celulară sunt influenţate şi de prezenţa în mediul de cultură a etilenei dar şi de creşterea concentraţiei în glucide. Numai o cultură de celule individualizate. În aceste condiţii creşterea încetează atunci când nutrienţii de bază din mediu s-au redus sau au fost epuizaţi. obţinute prin clonarea unei singure celule. Dea asemenea oxigenul şi glucidele din mediu pot influenţa creşterea. menţinută în condiţii care să păstreze stabilitatea nucleară. Durata menţinerii în condiţii de viabilitate a unei culturi. Pentru menţinerea celulelor într-o stare activă de diviziune şi astfel creşterea gradului de agregare. Din momentul iniţierii unei culturi celulare şi până în momentul practicării unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numeşte ciclu de creştere a culturii. de epuizarea din mediu a constituenţilor. Prin încorporarea în mediul de cultură a unor concentraţii reduse de enzime se poate realiza separarea celulelor. Faza de creştere exponenţială este extinsă în condiţiile în care cultura este iniţiată cu o densitate redusă a celulelor per unitatea de volum (Cachiţă. nu influenţează negativ rata de creştere. până la oprirea diviziunilor. depinde de specie. de un anumit tip. fără o subcultivare a celulelor.celulelor în suspensie sunt fitohormonii de creştere care pot influenţa cultura celulelor in vitro prin natura lor şi concentraţia folosită. descreşte capacitatea celulelor de a se separa (Torrey şi Reinert. 1962). în izolarea de linii celulare. astfel că o reducere a celor două componente determină reducerea sau chiar stoparea creşterii celulelor. raportată la unitatea concentraţiei de biomasă este constantă. finalizat cu oprirea diviziunilor. În decursul acestui ciclu se produc schimbări în ceea ce priveşte viteza de diviziune şi de creştere a celulelor. întrucât enzimele. iar reducerea conţinutului în acest fitohormon. Se distinge o fază incipientă de creştere a vitezei de multiplicare celulară. constituie un material biologic valoros pentru operaţiunile de mutageneză. Pentru a menţine culturile într-o fază de creştere exponenţială trebuie prevenită situaţia limitării nutrienţilor din mediu ca o consecinţă a epuizării acestora. Faza exponenţială de creştere se caracterizează ca o perioadă finită de timp. imediat după inoculare. de pH. fără a se produce modificări. constă într-o întârziere a declanşării proceselor de multiplicare şi de creştere. Culturile de celule de lungă durată manifestă o diversitate genetică în cadrul populaţiei de celule (Cachiţă. urmând apoi faza de staţionare şi apoi faza de declin. 1984). Subcultivarea celulelor înainte de finalizarea perioadei exponenţiale de creştere a celulelor permite obţinerea unor populaţii de celule mai stabile. Rata de creştere a numărului de celule în decursul ciclului de creştere a culturii se modifică din momentul iniţierii culturii. În acest sens se impune subcultivarea frecventă a celulelor. de condiţiile de cultură. în selectarea de mutanţi. O primă fază. apare un declin. Astfel un conţinut ridicat de auxină determină creşterea numărului de celule în suspensie. suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp. care pot limita diviziunea şi creşterea. permiţând obţinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic şi metabolic. O cultură celulară ideală trebuie să fie omogenă din punct de vedere morfologic şi biochimic. În acest sistem se realizează un echilibru între cantitatea de mediu introdusă în sistem şi mediul evacuat. în diluţii adecvate. Eriksson a subcultivat cultura de Haplopappus . în care rata de creştere a biomasei. urmată de o perioadă de plafonare a frecvenţei diviziunilor. dar în următoarele 10 zile numărul de celule per unitatea de volum creşte exponenţial. celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de cultură acţiune care asigură funcţionarea sistemului şi recoltarea biomasei produse.

De asemenea. pentru ca să se realizeze o dispersare a celulelor şi a agregatelor ce alcătuiesc masa de calus. metale grele. -fitostate – chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate în care rata de creştere şi densitatea celulară sunt menţinute constante. de organogeneză şi embriogeneză pot fi controlate şi dirijate în sensul dorit (morcov.4 diclorfenoxiacetic. Dorre şi colab. (1971) au realizat subculturile la un interval de 7 zile. viabilitatea acestora. Unul din marile obiective urmărite prin culturile de celule îl constituie acela al selectării de mutante biochimice. condiţie ce poate fi îndeplinită prin efectuarea unor subculturi repetate de calus. . Prin astfel de experimente au fost create linii celulare mutante. se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul lichid şi recultivarea lor. pe medii cu balanţă hormonală adecvată scopului respectiv. în care mediul proaspăt se adaugă în momentul creşterii turbidităţii culturii şi a eliberării. Selectarea liniei celulare se poate face uşor prin etalarea suspensiei pe medii de cultură solide. astfel că. 1976). La o cultură de Acer pseudoplatanus. cultura de celule prezintă avantaje deosebite în efectuarea unor studii la nivel celular. prin fixarea unei rate de introducere a factorilor nutritivi şi hormonali. Densitatea celulelor în subcultură nu trebuie să depăşească iniţial 0. În cazul în care gradul de dispersie al calusului este redus. etc. în acelaşi scop. se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului şi diluarea agregatelor celulare mici în mediu de cultură proaspăt. Cultura de suspensii celulare se menţine prin inocularea unei cantităţi de mediu. prin spălare şi eliminare a excedentului de celule. erbicide. dintro cultură deja existentă. -chemostate – pentru cultura continuă. recoltarea efectuându-se în perioada creşterii exponenţiale (Cachiţă. Capacitatea regenerativă depinde de gradul de agregare al celulelor. stabilit iniţial. Pentru culturile de celule se pot folosi următoarele tipuri de dispozitive: -fermentatoare – de cca 1 l sau chiar mai mari. O cultură de celule poate fi obţinută pe mai multe căi. obţinând o densitate iniţială de 2 x 105 celule/ml. 1984).5-2. Există specii care constituie modele în ceea ce priveşte reacţia la condiţiile create şi la care procesele de citodiferenţiere. Cea mai folosită metodă constă în realizarea în mediul de cultură lichid a unei suspensii utilizând ca material iniţial calus. În decurs de 15-25 zile densitatea va creşte până la cca 4 x 106 celule/ml (Street. coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci când se reiniţiază suspensia celulară (Street. tutun). în diferite concentraţii.gracilis şi la un interval de 48 ore. săruri. -turbiostate – sistem deschis de cultură continuă. Cultura de celule prezintă foarte multe avantaje. fiind constituită într-o populaţie omogenă de celule se poate folosi în vederea inducerii variabilităţii genetice şi selecţiei de mutanţi. având o densitate cunoscută de celule. Cel mai folosit fitohormon este acidul 2. cum ar fi mutante rezistente la antibiotice. deschisă. citat de Cachiţă. De asemenea cultura de celule. ale metabolismului celular. vârsta culturii. privind aspecte ale creşterii. prin expunerea culturii la acţiunea unor anumiţi agenţi fizici sau chimici. iar modificările genetice operate la nivel celular pot fi regăsite în plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaţie.5 x 105 celule/ml. în omogenizator de sticlă şi apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate. citodiferenţierii. Astfel. din nou pe mediu solid. compoziţia substratului şi de condiţiile de cultură. În acelaşi scop se pot utiliza protoplaşti obţinuţi prin digestie enzimatică. O altă metodă constă în omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderată. utilizate şi în cultura cu volum de mediu limitat. chiar şi în condiţiile agitării mediilor de cultură lichide. 1984). diluând-o cu mediu proaspăt.

astfel că se reduc atât suprafeţele de lucru cât şi timpul necesar obţinerii rezultatelor dorite. nefiind excretaţi în mediul de cultură. sezonul în care s-a recoltat organul. Culturile de celule au implicaţii practice deosebite în industria aşa zisă de tip fermentativ. prin cultura de celule se poate păstra timp îndelungat prin crioconservare. minibutaşi – frecvent au generat calus. a cărei intensitate depinde de specie. ruperea lanţului de carbon. produşii secundari de metabolism sunt depozitaţi în vacuole.7 Cultura altor tipuri de explante Teoretic. La nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de organogeneză. cultivate pe mediu de bază cu adaos de AIA (2 mg/l) şi BA (2mg/l) s-a constatat că.(1978) s-au ocupat de această problemă şi au ajuns la concluzia că în realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie să se aibă în vedere selectarea de celule care produc multă clorofilă. cotiledoanelor şi mai rar. Vigurozitatea slabă a celulelor crescute în astfel de condiţii a fost explicată printr-o activitate fotosintetică scăzută. în porţiunea internodală a tulpinilor se constată existenţa unei capacităţi regenerative. durata de fermentaţie este de cca 10 ori mai mare decât la culturile de tip microbian. modul de sterilizare. datorată unor deficienţe de cultură. În plus materialul biologic valoros obţinut. De regulă.7. Un aspect particular îl constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma precursori sau anumiţi compuşi prezenţi în mediul de cultură. înregistrându-se o rată scăzută a creşterii acestora. la nivelul nodurilor. dar numai la o concentraţie scăzută de zaharoză. glicozidare. peţiol. orientarea lui pe mediu de cultură. Celulele cultivate pe medii aseptice deşi au clorofilă nu pot supravieţui în lipsa zahărului din mediul de cultură. eliminaţi în mediu. cu explante de crizantemă de natură diferită. prin tehnicile de culturi in vitro aceste experimente se simplifică. orientarea lor pe mediu precum şi balanţa hormonală folosită în mediul de cultură. pe suprafaţa superioară. oricare parte a plantei poate fi folosită ca explant pentru iniţierea culturilor in vitro. al inflorescenţelor. Lumina puternică stimulează sintetizarea clorofilei. de vârsta organului din acre se prelevează ţesuturile.Întrucât experienţele de ameliorare şi genetică din câmp sunt costisitoare. La plantele superioare. formare de muguraşi . 6. în afară de meristeme. Inducerea neoformării de ţesuturi este dependentă de specie. care împiedică dezvoltarea cloroplastelor şi a fotosintezei. Şi în culturile de celule s-a asimilat şi adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele în care se cultivă celule. În încercările făcute pe medii aseptice s-a constatat că succesul cultivării ţesuturilor şi celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim. Culturile în mediu lichid prezintă avantajul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienţii. Prezenţa în mediul de cultură a unor concentraţii ridicate de zaharoză inhibă sinteza clorofilei. Biotransformarea poate fi utilizată pentru diferite tipuri de reacţii: hidroxilare. se evită neajunsurile provocate de o eventuală orientare polară neadecvată. în afară de meristemele apicale. Yamada şi colab. natura ţesuturilor prezente în explant. de natura organului. O problemă deosebită este aceea a obţinerii de culturi de celule fotoautotrofe. după modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele în scopuri industriale. adiţia de carbon. inflorescenţa. spre deosebire de microorganisme. alte tipuri de explante folosite – de la peduncul floral. de compoziţia mediului sau de condiţiile din camera de creştere. Într-un experiment efectuat de Lazăr şi Cachiţă (1980-1982). necesitând multă forţă de muncă şi suprafaţă mare de teren. doar în laborator. reducându-se activitatea. La suspensiile celulare. dehidrogenare.1. derivând din plantele superioare. în azot lichid. în prima fază. mărimea explantului. precum şi depozitarea şi concentrarea în jurul celulelor a produşilor de metabolism. compoziţia mediului de cultură. hidrogenare. de mărimea explantului. se asigură un schimb de gaze optimizat. al frunzelor.

ceilalţi rămânând în diferite faze de creştere. internod). au generat. Din meristemele apicale. astfel că se pot depista pentru fiecare specie de cultură. după două luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante. în funcţie de specia la care se doreşte experimentare. experienţa cercetătorului poate permite depistarea prin tatonări a celor mai bune metode în vederea realizării obiectivelor în acest domeniu. în schimb au dat naştere la muguraşi. Plantele formate din meristeme au avut o conformaţie proporţionată şi s-au adaptat bine la viaţa mediului septic. ceea ce atestă că din celulele calusului se pot diferenţia plantule cu o conformaţie particulară. inoculii constând din internod şi mai ales cei dimensionaţi din peţiol au generat mult mai mult calus decât cei de formă şi mărime similară. nefiind asigurată. din care s-au format plante (Lazăr şi Cachiţă. diferenţierea plantelor s-a făcut mai lent. Procesul de organogeneză a fost şi mai scăzut la fragmentul desprins din mijlocul peţiolului frunzelor. aşadar. Dintre aceştia unul până la trei s-au dezvoltat. chiar dacă explantul a fost acoperit de calus. Există. sursele de explante cele mai potrivite în vederea realizării unor astfel de experienţe. Explantele dimensionate din porţiunea limbului foliar. diferită de aceea a plantelor din care au provenit. au prezentat o pregnantă polaritate morfogenetică. Se poate deci concluziona că. generarea de rădăciniţe. în care nervura principală a frunzei era bine reprezentată. iar rezultatul preconizat a se obţine este influenţat de o serie de factori. lăstăraşii formaţi la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpiniţelor formate din meristeme. un număr variabil de muguraşi. 1982). În general. .iar pe cea inferioară. Iar acolo unde literatura nu oferă posibilităţi de inducere a culturilor de celule. ornamentală sau forestieră. obţinuţi din peduncul floral. dar ţinând cont şi de scopul urmărit. natura explantului este diferită. Concluzia finală a constat în aceea că regenerarea şi diferenţierea rapidă a noi plante sa realizat din inoculii meristematici. o „gamă” variată de posibilităţi de inducere a unei culturi in vitro. de la compoziţia mediului de cultură. În general. separaţi şi subcultivaţi pe medii proaspete au format rădăciniţe şi s-au dezvoltat normal. Inoculii constând din explante de formă cilindrică (ex. pe această cale înmulţirea clonală. natura fitohormonilor de creştere şi concentraţia acestora. Explantele nodale şi cele constând din teaca frunzelor. au generat o cantitate mai redusă de calus. Din meristemele axilare. complet conformate. Lăstarii pot fi transformaţi în minibutaşi şi prin aceasta se ridică coeficientul de multiplicare a clonei respective. până la vârsta organului donor sau condiţiile din camerele de creştere. pe un explant.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->