UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRONOMIQUES (ESSA) DEPARTEMENT DES EAUX ET FORETS FORMATION CONTINUE ET D.E .

A Session 2003 Promotion "RENIALA"

MEMOIRE EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDE APPROFONDIE (DEA) EN SCIENCES AGRONOMIQUES Option : Foresterie, Développement et Environnement

MISE AU POINT DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET LA REGENERATION "IN VITRO" DE Kalanchoe synsepala (BAKER)
Présenté par :
RABOTOVAO Andrisoa Sylvain

Devant le jury composé du: Président : Pr RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscène Examinateurs : Dr RAMAMONJISOA Lolona Dr RAKOTOBE Etienne Alphonse Rapporteur : Dr RAKOTONDRADONA Rémi

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRONOMIQUES (ESSA) DEPARTEMENT DES EAUX ET FORETS FORMATION CONTINUE ET D.E .A Session 2003 Promotion "RENIALA"

MEMOIRE EN VUE DE L’OBTENTION DU DIPLOME D’ETUDE APPROFONDIE (DEA) EN SCIENCES AGRONOMIQUES Option : Foresterie, Développement et Environnement

N° : 06 / 2004

MISE AU POINT DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET LA REGENERATION "IN VITRO" DE Kalanchoe synsepala (BAKER)
Présenté par :
RABOTOVAO Andrisoa Sylvain

Devant le jury composé du: Président : Pr RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscène Examinateurs : Dr RAMAMONJISOA Lolona Dr RAKOTOBE Etienne Alphonse Rapporteur : Dr RAKOTONDRADONA Rémi

Remerciements
Avant de présenter ce travail, permettez moi d’adresser mes vifs remerciements aux:

Professeur RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscène, Directeur Scientifique de la formation troisième cycle, Professeur titulaire à l’Ecole Supérieure des Sciences Agronomiques, qui a bien voulu m’autoriser à soutenir et accepter de présider le jury de ce mémoire, Docteur RAMAMONJISOA Lolona, Enseignant à l’ESSA Forêt, Production du Silo National des Graines Forestières (SNGF), Chef du Département

Docteur RAKOTOBE Etienne Alphonse, Directeur du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP), qui a bien voulu accepter de faire partie des membres du jury de ce mémoire, Mon encadreur, Docteur RAKOTONDRADONA Rémi, Directeur des Etudes de l’Ecole Normale Supérieure, pour ces précieux directives et ses critiques constructives tout au long de ce travail. Il n’a ménagé pas ses efforts pour diriger nos travaux de recherche malgré ses multiples occupations,

Monsieur RAKOTOMARO Ndriatsimaniry Joël, qui nous a aidé dans les traitements statistiques des résultats, malgré ces nombreuses tâches et occupations au sein du Département des Eaux et Forêts,

Je témoigne également toute ma gratitude aux: Docteur RABOTOVAO Laurence, Chef du Centre d’Etude et de Recherche en Sciences Naturelles (CER) de l’Ecole Normale Supérieure, Responsable du Sous projet F@DES SP02V3-01 intitulé : «Valorisation d’une plante endémique malgache à propriété immunostimulante, Kalanchoe synsepala (BAKER) », de nous avoir donné le thème de ce travail,

Personnels chercheurs et techniciens, du Laboratoire de Microbiologie de L’Environnement (LME), Annexe CNRE de Tsimbazaza, qui nous a permis d’effectuer les travaux de recherche et de nous avoir conseillés tout au long du stage,

Administration et Corps Professoral de l’Ecole Supérieure de Sciences Agronomiques (ESSA), et de l’Ecole Normale Supérieure (ENS), pour les enseignements théoriques et pratiques qu’ils nous ont prodigués durant les années d’étude,

Toute ma famille, de nous avoir soutenu, dans cette formation, à tous nos amis et collègues de la promotion FIARO (ENS, SN) et amis de notre promotion RENIALA (ESSA, Troisième cycle),

Tous les personnes qui ont, de près ou de loin, contribué à la réalisation et la finalisation de ce travail.

MERCI!

RESUME Le fondement de la gestion durable d’une ressource naturelle est la maîtrise de sa régénération, tant par voie sexuée (graine) que par voie végétative (apex, feuille etc.). Ainsi, ce travail a contribué à la valorisation d’une espèce non ligneuse, endémique de Madagascar, Kalanchoe synsepala (BAKER), en adoptant différentes techniques de multiplication sexuée et non sexuée "in vitro", par l’élaboration de protocoles expérimentaux pour la germination et la régénération de l’espèce. En effet, la richesse de cette espèce à vocation médicinale est relativement importante due au faite que son extrait est classé parmi les agents immunostimulants. Ainsi, dans le but de sa conservation, divers protocoles de multiplication "in vitro" ont été élaborés et mis au point pour la sauvegarde de l’espèce. Ce travail se divise en deux grandes parties: - la première consiste à déterminer des protocoles de décontamination avec des produits détergents antiseptiques et d’élaborer des protocoles de germination de graines sur différents milieux de culture. -la seconde contribue à la régénération "in vitro" de l’espèce en adoptant trois techniques de multiplication végétative "in vitro ", à savoir : la culture de méristème, la micropropagation et l’embryogenèse somatique. Pour chaque technique proposée, des protocoles de décontamination des explants ont été effectués ainsi que des procédés de régénération des explants en plantule. A partir des expérimentations, on a constaté que l’espèce est totipotente. De plus, l’espèce possède une faculté germinative très élevée puisque la capacité et la vitesse de germination des graines se situent aux environs de 75 %. Le pourcentage de régénération, pour la culture du méristème apical est de 28 %, pour la technique de micropropagation, de 36%. Enfin, le potentiel de régénération de l’espèce est de 64% dans des conditions de culture bien définies et en établissant les milieux de culture et les hormones de croissance adéquates. Mots clés : Kalanchoe synsepala (BAKER), endémique, germination, culture de méristème, micropropagation, embryogenèse somatique, Madagascar. ABSTRACT The key of sustainable management of natural resources is to know how to handle its regeneration, whether by sexual means (seeds) or by asexual means (meristem, leaf etc). Therefore, in this study, we want to enhance the value of our unwoody species of Kalanchoe synsepala (BAKER), wich is endemic to Madagascar. To do so, we have carried out experiment on seed germination and in vitro culture, and the results are recorded in protocols. Actually, the value of this plant lays on the stimulant properties of its extract; therefore, it pays to work for its conservation. Two main parts are seen in this work: - the first one is to establish protocols on how to eradicate seed contaminations and on seed germination using different media. - the second one is to focus on in vitro culture using different techniques such as: culture of meristem, micropropagation and somatic embryogenesis. Along our experiment, we have noticed that cells obtained from different part of this plant present high level of totipotency. Moreover, it has some high percentage of germination around 75%; of regeneration around 36%. At last, potential regeneration of explants is 64% in cultural condition well defined, in establishing a cultural medium with adequate growing hormone. Key words: Kalanchoe synsepala (BAKER), endemic, germination, culture of meristem, micropropagation, somatic embryogenesis, Madagascar.

LISTES DES TABLEAUX Tableau 1 : Les observations phénologiques concernant l’espèce .......................................................... 6 Tableau 2 : Les facteurs physiques et biologiques des milieux d’études .............................................. 14 Tableau 3 : Les espèces caractéristiques du type d’habitat où pousse l’espèce .................................... 15 Tableau 4 : Les usages thérapeutiques de l’espèce ............................................................................... 18 Tableau 5 : Statut UICN de conservation des plantes grasses............................................................... 19 Tableau 6 : Statut UICN et CITES de 4 genres appartenant à la Famille ............................................. 20 Tableau 7 : Rappel de la méthodologie adoptée.................................................................................... 30 Tableau 8 : La démarche méthodologique adoptée ............................................................................... 32 Tableau 9 : Les caractéristiques des graines suivant l’écotype ............................................................ 33 Tableau 10 : Dispositifs expérimentaux pour la décontamination des graines avec Na Cl O à 12%.... 35 Tableau 11 : Dispositifs expérimentaux pour la décontamination des graines avec Ca (O Cl2) à 5% .. 35 Tableau 12 : Les milieux de germination des graines élaborés............................................................. 36 Tableau 13 : Dispositifs expérimentaux pour la germination des graines............................................. 37 Tableau 14 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination par Na Cl O à 12% .. 43 Tableau 15 : Résultats bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Ca (O Cl2) à 5%...... 43 Tableau 16 : Analyse de variance de l’effet des détergents sur le taux de germination........................ 44 Tableau 17 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur l’effet des détergents ............................ 44 Tableau 18 : Résultats bruts des essais relatifs à la capacité de germination de l’espèce ..................... 47 Tableau 19 : Résultats bruts des essais relatifs à la vitesse de germination de l’espèce ....................... 47 Tableau 20 : Analyse de variance de l’effet des facteurs sur la capacité de germination ................... 48 Tableau 21 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% .................................................................... 48 Tableau 22 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Na Cl O à 12% ........ 54 Tableau 23 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Ca (O Cl2) à 5 %..... 54 Tableau 24 : Analyse de variance de l’effet des détergents sur la régénération des explants ............... 55 Tableau 25 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur l’effet des détergents ............................ 56 Tableau 26 : Résultats des essais relatifs à la culture "in vitro" de l’espèce ......................................... 57 Tableau 27 : Résultats de la régénération en plantules de l’espèce....................................................... 64 Tableau 28 : Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la germination ............ 70 Tableau 29 : Protocoles expérimentaux proposés pour la régénération de l’espèce ............................. 72

LISTES DES FIGURES Figure 1: Morphologie générale du Kalanchoe synsepala (BAKER)..................................................... 5 Figure 2: Les aires de répartition de Kalanchoe synsepala (BAKER).................................................. 10 Figure 3: Les milieux naturels de Kalanchoe synsepala (BAKER). Vue d’ensemble des massifs A : Ambatokely, B : Antongona, C et D : Manerinerina, E : Ambalavao et F : Ampanihy..... 16 Figure 4: Vues rapprochées de la communauté végétale étudiée G et I : Kalanchoe synsepala, H : plantes pionnières Xerophyta dasylirioides, Aloe vahombe, J : Angraecum sororium, K et L : Kalanchoe synsepala poussant sur les rocailles à Ampanihy et Ambatokely............. 17 Figure 5: Orientation de la culture "in vitro" à l'aide de deux hormones (en mg/l) .............................. 25 Figure 6: Morphologie de la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER) vue au Microscope électronique à balayage (MEB)................................................................................................ 33 Figure 7: Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Na Cl O à 12% ................ 44 Figure 8: Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Ca (O Cl2) à 5% .............. 45 Figure 9: Clichés résumant les différentes étapes de la germination de la graine................................. 53 Figure 10: Clichés résumant les différentes étapes de la culture de méristème .................................... 60 Figure 11: Clichés résumant les différentes étapes de la micropropagation ........................................ 61 Figure 12: Callogenèse chez Kalanchoe synsepala (BAKER) ............................................................. 62 Figure 13: Bourgeonnements végétatifs intenses chez Kalanchoe synsepala (BAKER)...................... 63 Figure 14: Clichés des différentes étapes de la régénération en plantules de l’espèce.......................... 66

LISTE DES ANNEXES

III III IV VVI VII VIII IX-

Préparation Solution Mère : Muraschige et Skoog (1962) Préparation Solution Mère : Gresshof et Doy (1974) Composition des Vitamines de Morel (Morel et Wetmore, 1951) Composition des milieux de culture utilisés dans la culture de méristème, l’embryogenèse somatique, la micropropagation Composition des milieux de culture utilisés pour la régénération des l’espèce Tableau résumant la capacité et vitesse de germination des graines traitées avec l’hypochlorite de sodium et l’hypochlorite de calcium Fiche technique de Kalanchoe synsepala (BAKER) Analyse de variance et test de NEWMAN et KEULS Résultats des tests statistiques sur Logiciel STAT ITCF, version 4

LISTE DES ABREVIATIONS 2-4 D AIA AIβ ANA BAP CDB CITES CNARP CNRE CIV CV d.d.l ENS ESSA FOFIFA GD HR IMRA ITCF LME MEB MS ONE P. PLARM SIBIO S.C.E UICN V. WCMC Acide 2-4 dichloro-phénoxy-acétique Acide indole acétique Acide β indol-butirique Acide naphtylacétique 6- Benzylaminopurine Convention sur la Diversité Biologique Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora Centre National d'Application de Recherches Pharmaceutiques Centre National de Recherches sur l’Environnement Culture "in vitro" Coefficient de Variation Degré de liberté Ecole Normale Supérieure Ecole Supérieure des Sciences Agronomiques Foibe Fikarohana ho Fampandrosoana ny tontolo eny ambanivohitra Gressoft et Doy Humidité relative Institut Malgache de Recherche Appliquée Institut Technique des Céréales et des Fourrages Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement Microscope électronique à balayage Muraschige et Skoog Office National pour l'Environnement Probabilité Inventaire et étude des plantes aromatiques et médicinales des Etats de l'Océan Indien Système d'information sur la Biodiversité Somme des Carrées des Ecarts International Union for Conservation of Nature Variance World Conservation Monitoring Center

GLOSSAIRE Biodiversité Conservation ex situ Conservation in situ : Synonyme de diversité biologique : Conservation d’éléments constitutifs de la diversité biologique en dehors de milieu naturel (CDB*) : Conservation des écosystèmes et des habitats naturels et maintien et reconstitution de populations viables d’espèces dans leur milieu naturel et, dans le cas des espèces domestiquées et cultivées, dans le milieu où se sont développées leurs caractères distinctifs (CDB) : Variabilité des organisme vivant de toute origine y compris, entre autres, les écosystèmes terrestres, marins et autres écosystèmes aquatiques et les complexes écologiques dont ils font partie; cela comprend la diversité au sein des espèces et entre espèces ainsi que celle des écosystèmes (CDB) : Echantillon d’une espèce modifié par rapport au type fondamental par suite par suite de l’action du milieu environnant : Toute espèce dont le processus d’évolution a été influencée par l’homme pour répondre à ses besoins : Lieu ou type de site dans lequel un organisme ou une population existe à l’état naturel (CDB) : Propriété que possède un organisme d’être réfractaire à certains agents pathogènes, ensemble de réactions qui tendent à éliminer des substances étrangères de l’organisme infecté. : Substance organisme qui stimule la résistance anti-infectieuse d’un

Diversité biologique

Ecotype

Espèces cultivées ou domestiquées Habitat Immunité

Substance immunostimulante Utilisation durable

: Utilisation des éléments constitutifs de la diversité biologique d’une manière et à un rythme qui n’entraînent pas leur appauvrissement à long terme, et sauvegardent ainsi leur potentiel pour satisfaire les besoins et les aspirations des générations présentes et futures (CDB) : Toute zone géographiquement délimitée qui est désignée, ou réglementée, et gérée en vue d’atteindre des objectifs spécifiques de conservation (CDB)

Zone protégée

* CDB : définition dans la Convention sur la Diversité Biologique (Rio de Janeiro, 3-14 juin 1992)

SOMMAIRE INTRODUCTION ................................................................................................................................. 1 PARTIE I : ETAT DE CONNAISSANCE.......................................................................................... 3 I.1 GENERALITES SUR Kalanchoe synsepala (BAKER), Famille des CRASSULACEAE. ....... 3 I .1.1 Description botanique et biologique du matériel d’étude .................................................... 3 I .1.1.1 Systématique..................................................................................................................... 3 I.1.1.2 Morphologie...................................................................................................................... 5 a) Feuille..................................................................................................................................... 5 b) Tige ........................................................................................................................................ 5 c) Racine..................................................................................................................................... 5 d) Stolons ................................................................................................................................... 5 I.1.1.3 Biologie florale................................................................................................................... 6 a) Inflorescence .......................................................................................................................... 6 b) Graine..................................................................................................................................... 6 I.1.1.4 Phénologie de l’espèce....................................................................................................... 6 I.1.1.5 Mode de multiplication ..................................................................................................... 7 I.1.1.6 Mode d’adaptation écophysiologique: Métabolisme C.A.M ........................................ 7 I.1.2 Ecologie...................................................................................................................................... 8 I.1.2.1 Exigence écologique de la plante...................................................................................... 8 I.1.2.2 Répartitions géographiques et variabilité biologique de l’espèce ................................ 9 I.1.2.3 Milieu d’étude.................................................................................................................. 11 a) Le site Ambatokely .............................................................................................................. 11 b) Le site Antongona ................................................................................................................ 11 c) Le site de Manerinerina........................................................................................................ 12 d) Le site d’Ambalavao ............................................................................................................ 12 e) Le site d’Ampanihy.............................................................................................................. 13 I.1.3 Propriété biologique et phytochimique du Kalanchoe synsepala (BAKER)..................... 18 I.1.3.1 Propriété biologique........................................................................................................ 18 I.1.3.2 Propriété phytochimique ................................................................................................ 19 I.1.4 Statut de conservation des CRASSULACEAE, plante grasse de Madagascar................ 19 I.1.5 Conservation ex situ de l’espèce ............................................................................................ 20 I.2 GENERALITES SUR LES TECHNIQUES DE CULTURE .................................................... 22 I.2.1 Germination "in vitro" .......................................................................................................... 22 I.2.2 Culture "in vitro"................................................................................................................... 22 I.2.2.1 Techniques de multiplication "in vitro" ........................................................................ 23 a) La culture de méristème................................................................................................... 23 b) L’embryogenèse somatique ............................................................................................. 23 c) La micropropagation........................................................................................................ 23 I.2.2.2 Les milieux de culture................................................................................................... 24 I.2.2.3 Les hormones de croissance.......................................................................................... 24

PARTIE II: APPROCHE METHODOLOGIQUE-EXPERIMENTATIONS.......................... 27 II.1 Approche méthodologique ...................................................................................................... 27 II.1.1 Problématique................................................................................................................... 27 II.1.1.1 Les critères de menace pour l’espèce ou cause directe:la dégradation de leur habitat 27 a) Le défrichement ............................................................................................................... 27 b) Les feux de brousse ......................................................................................................... 27 c) La surexploitation ............................................................................................................ 27 d) L’exploitation des carrières ............................................................................................. 28 II.1.1.2 Autres critères de menaces indirecte : manques d’information ................................... 28 II.1.2.3 Difficultés inhérentes à la physiologie de l’espèce...................................................... 28 II.1.2.4 Difficultés inhérentes à la technique de multiplication ............................................... 29 II.1.2 Hypothèse ......................................................................................................................... 29 II.1.3 Objectifs............................................................................................................................ 30 II.1.4 Cadre méthodologique .................................................................................................... 30 II.1.4.1 Récolte de données ...................................................................................................... 30 a) Recherche bibliographique .............................................................................................. 30 b) Descente sur terrain ......................................................................................................... 31 II.1.4.2 Analyse des données.................................................................................................... 31 II.1.4.3 Expérimentation au laboratoire.................................................................................... 31 II.2 MATERIELS ET METHODES ................................................................................................ 33 II.2.1 Germination "in vitro" des graines de Kalanchoe synsepala (BAKER).................... 33 II.2.1.1 Matériels ...................................................................................................................... 33 a) b) a) Le matériel végétal ...................................................................................................... 33 Le matériel technique .................................................................................................. 34 Dispositifs pour la décontamination des graines ......................................................... 34

II.2.1.Techniques expérimentales............................................................................................. 34 a.1) Avec Na Cl O à 12%..................................................................................................... 35 a.2) Avec Ca (O Cl2) à 5%................................................................................................... 35 b) Influences des facteurs pour la germination des graines ............................................ 36 II.2.1.3 Critère de germination ................................................................................................ 38 II.2.1.4 Traitements de données .............................................................................................. 38 II.2.2 La culture " in vitro" de Kalanchoe synsepala (BAKER)............................................ 39 II.2.2.1 Matériels ...................................................................................................................... 39 II.2.2.2 Méthodes de travail...................................................................................................... 39 a) Partie I : Induction de cal et bourgeonnement végétatif.............................................. 39 a.1) Méthode de stérilisation et désinfection............................................................................ 39 a.2) Mise en culture ou inoculation .......................................................................................... 40 a.3) Critères d’évaluation ......................................................................................................... 40 a.3.1) Formation de cals idéaux ........................................................................................... 40 a.3.2) Etablissement de suspensions cellulaires embryogènes ou SCE ............................... 40 a.3.3) Formations d’embryons ............................................................................................ 40 a.3.4) Potentiel de régénération ........................................................................................... 41

a.4) Choix du dispositif expérimental et expérimentations ...................................................... 41 a.4.1) Dispositifs expérimentaux pour la stérilisation et la désinfection des explants......... 41 a.4.2) Dispositifs expérimentaux pour la culture "in vitro" ................................................. 41 b) Partie II : Régénération en plantules ........................................................................... 42 b.1) Méthode de travail ............................................................................................................ 42 b.2) Choix du dispositif et expérimentation ............................................................................. 42 PARTIE III : RESULTATS et INTERPRETATIONS ................................................................... 43 III.1 Résultats des essais sur la germination des graines............................................................. 43 III.1.1 Résultats des essais sur la décontamination des graines.............................................. 43 III.1.1.1 Avec Na Cl O à 12% .................................................................................................. 43 III.1.1.2 Avec Ca (O Cl2) à 5% ................................................................................................ 43 III.1.1.3 Traitements des données ............................................................................................ 44 a) b) Analyse de variance .................................................................................................... 44 Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% ............................................................... 44

III.1.2.1 Essais relatifs à la capacité de germination ............................................................... 46 III.1.2.2 Essais relatifs à la vitesse de germination ................................................................. 47 III.1.2.3 Traitements des données ............................................................................................ 48 III.2 Résultats des essais sur la régénération "in vitro" de l’espèce........................................... 54 III.2.1 Résultats des essais sur la décontamination des explants............................................ 54 III.2.1.1 Avec Na Cl O à 12% .................................................................................................. 54 III.2.1.2 Avec Ca (O Cl2) à 5% ................................................................................................ 54 III.2.1.3 Traitements des données ............................................................................................ 55 a) b) Analyse de variance .................................................................................................... 55 Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%............................................................... 55

III.2.2 Résultats des essais sur la culture " in vitro" de l’espèce............................................ 56 III.2.3 Résultats des essais sur la régénération en plantules de l’espèce................................ 64 III.2.4 Limites des techniques de multiplication effectuées. ................................................... 67 IV. DISCUSSIONS.............................................................................................................................. 68 IV.1 Discussions méthodologique .................................................................................................. 68 IV.2 Discussions des résultats ........................................................................................................ 68 V. PROPOSITION DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET REGENERATION DE Kalanchoe synsepala (BAKER) .................................................................. 70 V.1 Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la germination .............. 70 V.2 Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la régénération ............. 72 V.3 Perspectives pour la culture "in vitro" de l’espèce ............................................................... 74 CONCLUSION.................................................................................................................................... 75 BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................................. 77

Introduction __________________________________________________________________________________

INTRODUCTION
La communauté internationale est, à présent, sensibilisée au problème de l’utilisation durable des ressources naturelles et de la préservation de la qualité de l’environnement, pour les générations présentes et futures. On assiste à la naissance d’une éthique de l’environnement qui suggère d’utiliser sans abuser et de réduire les contraintes de l’environnement. Le grand public, est très concerné, dans de nombreuses régions du monde, en particulier par la déforestation dans les pays tropicaux, par la dégradation de l’environnement découlant de la transformation de certains produits forestiers ligneux et non ligneux dans les pays industrialisés (Unasylva 169, vol 43,1992). Il est, par conséquent, nécessaire de prévoir les besoins du futur car la destruction, voire l’extinction même de diverses espèces, se fait sentir et cela exige des moyens immédiats pour une gestion durable, d’où la nécessité des recherches fondamentales ou appliquées, des aménagement forestiers, du transfert de technologies et d’assistance financière pour chaque espèce. Actuellement, des recherches effectuées sur plusieurs filières ligneuses et non ligneuses, reflètent cette volonté de préserver et d’améliorer la gestion de certaines espèces: Prunus africana, soignant la prostate ou du Raffia farinifera, représentant l’une des ressources les plus importantes pour l’exportation. Remarquons que la gestion durable de ces ressources naturelles se base sur la maîtrise de la régénération de ces espèces, surtout à Madagascar où l’on constate une dégradation permanente et continue de ces ressources. De plus, la Commission de la sauvegarde des espèces de l’UICN (International Union for Conservation of Nature) recommande la reproduction en nombre de certaines espèces malgaches qui sont en voie d’extinction. Cette régénération des espèces fait partie de la "biotechnologie" qui offre une panoplie de techniques à savoir: la multiplication des végétaux "in vitro", la sélection génotypique "in vitro"ou embryogenèse somatique, la conservation "in vitro" de matériel génétique, ainsi qu’une technique appartenant au domaine de la génétique moléculaire: marqueurs moléculaires, transformations génétiques, etc. La multiplication végétative s’effectue en éprouvette ou dans un récipient analogue au laboratoire, c’est pour cette raison que l’on qualifie cette technique de multiplication végétative "in vitro". A l’heure actuelle, les généticiens du monde entier s’acharnent à accroître la production des explants sélectionnés, grâce aux techniques de cultures "in vitro": culture de méristème, micropropagation, ou embryogenèse somatique, des techniques développées depuis une dizaine d’année. En effet, les êtres vivants ont un caractère de pouvoir se reproduire. Divers processus ont été développés mais, malgré leur diversité, ils peuvent être groupés en deux grands types: le premier est la reproduction sexuée, faisant intervenir des structures reproductrices particulières. Chez les plantes supérieures, il s’agit des fleurs, qui, après fécondation des ovules par les anthérozoïdes, forment des graines capables d’évoluer en organismes similaires à ceux qui les ont générées. Le second type est la reproduction asexuée, par laquelle un organisme est capable d’en générer un autre sans l’intervention de structures reproductrices spécifiques. L’homme a largement exploité les possibilités de reproduction asexuée des végétaux; il s’agit de penser à l’importance qu’ont pris, actuellement, des techniques comme le greffage, le bouturage ou le

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-1-

Introduction __________________________________________________________________________________ marcottage. Nous allons mettre en exergue dans ce travail la maîtrise de la régénération "in vitro" de plantes supérieures non ligneuse grâce aux divers processus de reproduction par voie sexuée et par voie végétative (asexuée). Ces diverses techniques de multiplication vont être effectuées sur une plante endémique malgache, qui fait l’objet d’une recherche intense actuellement, grâce à sa propriété thérapeutique. En effet, c’est une plante crassulescente dont les extraits sont classés parmi les substances Kalanchoe synsepala (BAKER). L’objectif de ce travail est d’élaborer et de mettre au point des protocoles expérimentaux pour la germination des graines et la régénération par voie végétative "in vitro" de cette espèce, par l’application des différentes techniques expérimentées sur des espèces ligneuses et non ligneuses, aux différents centres de recherches (CNRE, IMRA, CNARP, FOFIFA et aux laboratoires étrangers : Muséum des Sciences Naturelles de PARIS). Ainsi, dans la première partie du travail, l’application de la technique de multiplication par voie sexuée, c’est-à-dire, l’essai de germination des graines, va être effectué et les protocoles à expérimenter résident surtout dans les techniques de décontamination des graines suivies de la germination proprement dite. Dans la seconde partie, le protocole de régénération par voie végétative sera mis au point, en expérimentant trois techniques de culture "in vitro" à savoir: la culture de méristème, la culture d’organe différencié et l’embryogenèse somatique. Dans chaque cas, il s’agit d’élaborer le protocole de décontamination des explants et le protocole de culture proprement dite en maîtrisant les différents facteurs qui peuvent influencer sur la régénération des explants mis en culture. Le recoupement de toutes ces techniques aboutira à l’élaboration de techniques spécifiques visant à court terme, à la régénération et multiplication en nombre de l’espèce et à long terme, à la valorisation de l’espèce (conservation et gestion durable). Notre plan d’étude est ainsi caractérisé en premier lieu par: immunostimulantes. Le matériel végétal est donc une plante succulente appartenant à la famille des CRASSULACEAE:

-

une synthèse bibliographique concernant le matériel d’étude et les différentes techniques de

germination et de culture "in vitro"; les descriptions de la démarche méthodologique et l’expérimentation des différentes techniques de

multiplication "in vitro": la germination des graines, la régénération "in vitro" par les techniques de culture de méristème, la micropropagation et l’embryogenèse somatique;

- et les résultats obtenus avec les différentes techniques de culture, suivis de la proposition des
protocoles expérimentaux favorables à la germination des graines et à la régénération de l’espèce.

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-2-

Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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PARTIE I : ETAT DE CONNAISSANCE I.1 GENERALITES SUR Kalanchoe synsepala (BAKER), Famille des CRASSULACEAE.
La généralité sur l’espèce consiste à l’établissement d’une base de donnée aussi complète que possible, résumant ainsi, tous les travaux antérieurs (bibliographique, enquêtes etc.) et les travaux en cours. Ces travaux se situent dans le cadre biologique sur la morphologie externe de l’espèce avec ses différents organes, l’écophysiologie: tout ce qui concerne le métabolisme et la phytochimie: concernant sa structure et son utilisation.

I .1.1 Description botanique et biologique du matériel d’étude
Etymologiquement, Kalanchoe vient d’un mot chinois signifiant: " qui tombe et qui pousse " (ALLORGE-BOITEAU L, 1996) et l’espèce synsepala, signifiant une espèce de Kalanchoe à sépale soudé, (BOITEAU P, 1995). L’espèce appartient aux catégories des produits forestiers dites accessoires car l’espèce est une plante médicinale. En effet, les extraits de la plante sont utilisés principalement pour soigner et guérir certaines maladies liées surtout à l’immunodépression (RABOTOVAO L, 1993). Kalanchoe synsepala (BAKER) est une plante herbacée, non ligneuse, grasse, succulente et endémique de Madagascar, appartenant à la Famille des CRASSULACEAE, où le nombre de chromosome est égal à 17 (FRIEDMANN F, 1975). C’est une espèce rupicole, poussant sur les versants et massifs dénudés ou des inselbergs et s’établit surtout sur de l’humus caractérisé par des substances organique et minérale prépondérantes (RABOTOVAO A S, 2001). L’espèce constitue donc une richesse qui reste encore à explorer profondément à l’heure actuelle tant au niveau biologique, physiologique et immunologique mais aussi en vue de sa conservation pour une gestion durable de l’espèce.

I .1.1.1 Systématique
D’après Berger en 1930, l’étude taxonomique de l’ensemble de la sous-famille des Kalanchoïdeae, appartenant à la famille des CRASSULACEAE, a différencié 3 genres, à savoir : Kitchinga, Bryophyllum et Kalanchoe (RAVELOMANANA D, 1993). Cette dernière est bien représentée à Madagascar, surtout par les nombreuses espèces qui sont toujours intéressantes et parfois très brillantes (PERRIER DE LA BATHIE, 1923). On trouve les Kalanchoe hors de Madagascar: en Afrique et en Asie, sur les terres qui entourent l’Océan Indien et au Brésil. Le genre Kalanchoe, crée par ADANSON en 1763 et dans l’acception de
HAMET R

en 1908, comporte 60 espèces à Madagascar (FRIEDMANN F, 1975). Kalanchoe synsepala

(BAKER) appartient donc au Groupe Naturel Fermé de Kalanchoe malgache: ces carpelles sont convergentes et la corolle est étranglée sur les carpelles ou nettement rétrécie sur une partie, les styles sont plus longues que les carpelles et les inflorescences sont axillaires (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Pour la clé des espèces, seul les inflorescences de Kalanchoe synsepala (BAKER) se transforment en stolons, tous les deux nœuds (CREMERS G et SELL Y, 1986). Synopsis du Kalanchoe synsepala (BAKER) La classification systématique de notre matériel d’étude Kalanchoe synsepala (BAKER): Règne : VEGETAL Sous règne : EUCARYOTE Embranchement : CORMOPHYTES Sous-embranchement : ANGIOSPERME Classe : DICOTYLEDONE Sous-classe : ROSIDAE Ordre : ROSALES Famille : CRASSULACEAE Sous-famille : KALANKHOIDEAE Groupe : TRICHANTAE (XIIème Groupe) Genre : Kalanchoe Espèce : synsepala Nom vernaculaire: sofimbitro, sofimbato, sofingoaika, zahana sur les Hauts plateaux sofintsofiny, mongy vola, mongy vato dans le Sud Ouest.

Echelle 1/5ème

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Figure 1 : Morphologie générale du Kalanchoe synsepala (BAKER)

I.1.1.2 Morphologie
Kalanchoe synsepala (BAKER) est une espèce herbacée, vivace, atteignant rarement 20 cm de hauteur, avec quelques stolons de 20 à 40 cm de longueur (RABOTOVAO A S, 2001). Elle croit sur des pentes rocailleuses, dans des endroits légèrement abrités du grand soleil ou dans des stations isolées sur des rochers dénudées (CREMERS G et SELL Y, 1986).

a) Feuille
Ces feuilles sont glabres, plus glauques, toujours vertes pendant toute l’année, plus ou moins garnies de dents irrégulières molles et bordées d’une couleur plus foncée ou marron rose que le reste du limbe (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). L’espèce est remarquable par ces feuilles toujours au nombre de 4, opposées décussées. Chaque groupe de feuille étant séparé des feuilles de l’année suivante par des feuilles rudimentaires qui se développent en saison sèche (PERRIER DE LA BATHIE, 1923).

b) Tige
C’est une espèce acaule (ALLORGE-BOITEAU L, 1996), c’est-à-dire que la tige est courte. Elle demeure très courte si bien que les feuilles semblent être disposées en rosette au ras du sol, il n’existe donc pas de tige véritable, parfois, avec des entre-noeuds très courts (RABOTOVAO A S, 2001). Seulement quand la plante devient âgée, il apparaît une tige ligneuse aérienne, assez haute et robuste, possédant des traces de pétioles, atteignant 40 cm au plus. Cette tige est toujours érigée, sans ramification, portant toujours des feuilles opposées décussées (RABOTOVAO L, 1993).

c) Racine
La racine a généralement peu d’importance, souvent courte et fasciculée et ne s’enfonce guère dans le sol et ne s’étend point (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Elle est superficielle, latérale possédant de nombreuses racines secondaires, se développe toujours sur un sol humique plus humide et prenant moins d’extension (RABOTOVAO A S, 2001).

d) Stolons
L’espèce synsepala présente une mode de multiplication végétative asexuée assez particulière: les stolons. Ils naissent à l’aisselle des feuilles, le plus souvent, de deux feuilles opposées. Ils sont constituées par une hampe florale d’environ 40 à 50 cm de long, pourvus de deux bractées opposées et supportant une plantule par stolons. Ils sont produits en même temps que les inflorescences. Souvent, ce sont ces inflorescences qui sont avortées en stolons, sinon, ils sont produits plus hauts sur l’axe orthotrope que celle-ci (CREMERS G et SELL Y, 1986). Leur rôle est de propager l’espèce pendant une période végétative très lente en surface. La jeune plante est non seulement nourrie par la plante mère, mais encore retenue par le stolon sur le roc lisse

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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jusqu’à ce qu’elle s’y cramponne en accumulant des débris végétaux grâce au développement de racines adventives à leur pied (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).

I.1.1.3 Biologie florale a) Inflorescence
L’inflorescence est souvent compacte, en dichasium, comportant une trentaine de fleurs dressées. Les fleurs sont petites, blanche ou rosée; le calice est vert pâle, couvert de poils glanduleux très courts (RABOTOVAO L, 1987).

b) Graine
Les graines de l’espèce sont généralement très petites, de l’ordre du millimètre. L’observation à la loupe binoculaire montre une grande homogénéité des graines de toutes les espèces étudiées dans les différentes stations. Elle se présente comme une petite bourse resserrée à une extrémité, arrondie à l’autre, présentant des sillons longitudinaux observables. L’ornementation du tégument séminal, par contre, n’est perçue qu’en employant un grossissement important avec un microscope électronique à balayage. Ainsi, l’aspect pubescence obtenue à fort grossissement est une extension de la cuticule, donnant des plis divers à la fois par leur longueur, leur orientation et leur forme. Cette ornementation joue sans doute un rôle dans la dissémination de la graine par le vent (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).

I.1.1.4 Phénologie de l’espèce
Les observations phénologiques ont pour but de connaître : le cycle biologique de la plante, c’est-à-dire, la période de floraison et de la fructification de ces espèces la période de maturation des fruits et des graines. Ainsi, des observations phénologiques ont été effectuées dans cinq (5) localités où poussent l’espèce étudiée : Ambatokely, Antongona, Manerinerina, Ambalavao, et Ampanihy. Les observations ont été effectuées dans toutes les localités et se sont déroulées pendant la période de Septembre 2003 à Mars 2004. Les résultats de ces observations sont résumés dans le tableau suivant: Tableau 1 : Les observations phénologiques concernant l’espèce Kalanchoe synsepala (BAKER) Localités Ambatokely Manerinerina Antongona Nom vernaculaire Zahana Sofintsofiny Sofingoaika Floraison Fev-Mars Mai-Juin Fev-Mars Fructification Mai Août Mai Date de maturation des fruits Juillet Octobre Juillet

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Ambalavao Ampanihy

Sofimbato Mongy vola

Avril-Mai Juin-Juillet

Juillet Août

Août Septembre-Oct

I.1.1.5 Mode de multiplication
La plante possède deux modes de multiplication comme nous l’avons énoncé auparavant, sexuée: à partir de la graine disséminées par le vent et asexuée: à partir de la formation des stolons empruntés à l’inflorescence. Seulement à cause de la précarité des conditions où se trouve l’espèce, rares sont les graines qui germent en l’absence des conditions optimales de germination telle une température ambiante adéquate, humidité relative suffisante. On constate par ailleurs que la régénération naturelle par la graine autour d’une plante mère reste insignifiante. Seules subsistent les plantules déjà pourvues des deux premières feuilles et des racines adventives qui commencent à accumuler quelques débris de matières organiques, provenant de la plante-mère, lesquelles restent attachées au stolon jusqu’à 4 ou 5 mois. Des études plus récentes ont montré que l’écotype d’Ambatokely (Carion) présente une certaine forme de bulbilles racinaires qui se forment sur des racines secondaires.

I.1.1.6 Mode d’adaptation écophysiologique: Métabolisme C.A.M
L’adaptation au manque d’eau de l’espèce est très remarquable car la plante peut survivre même après un mois tout en étant déracinée. Telle des adaptations morphologiques comme la crassulescence des feuilles, son positionnement vertical pouvant assurer une protection efficace contre la transpiration et l’épaississement de la cuticule ou la formation de revêtements cireux ou résineux réfléchissant la lumière (RABOTOVAO A S, 2001). Mais parmi ces diverses modes d’adaptation, la plus importante reste l’adaptation physiologique et anatomique qui est le métabolisme "C.A.M" (Metabolism Acid Crassulaceae) de l’espèce (RABOTOVAO L, 1993). En effet, la plante présente un type de photosynthèse spéciale, flexible, particulière se déroulant avec un comportement stomatique particulier car l’ouverture des stomates à lieu pendant la nuit et leur fermeture au cours de la journée. Toutes les plantes présentant ce type de photosynthèse particulière sont situées dans des zones où elles ont à subir des alternances d’humidité et de sècheresse selon des échelles des temps différentes et à devoir surmonter une contrainte hydrique prolongée. Ce mode de photosynthèse "C.A.M" présente donc l’avantage écophysiologique d’éviter les pertes d’eau excessives tout en préservant l’entrée de carbone à l’intérieur de la plante. Notre espèce présente ce type de photosynthèse "C.A.M" extrême, pour laquelle, l’absorption du CO2 se fait uniquement la nuit (réalisant la meilleure économie d’eau).

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Ceci a été étudié à partir de la mesure de la composition isotopique des feuilles pour le carbone: pour notre espèce: δ
RAVELOMANANA D,
13

C = - 11,15 (Origine échantillon CATAT) (KLUGE et al, 1991 in:

1993).

I.1.2 Ecologie I.1.2.1 Exigence écologique de la plante
Etant donné les variations morphologiques intraspécifiques de l’espèce (RABOTOVAO L, 1987), on peut tout de suite s’attendre à une diversité des niches écologiques dans lesquelles les plantes subsistent, allant des inselbergs du Plateau Central de Carion, sur le massif gneissique d’Ambalavao, et les grés sédimentaires d’Ampanihy. Kalanchoe synsepala serait donc adapté aux rocailles dénudées, après la disparition du couvert (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). L’espèce est adaptée aux conditions d’aridité climatique et vivant dans des zones présentant, au cours de l’année, des périodes de sécheresse. Dans certains cas, le sol reste pauvre et la croissance dépendra surtout de la disponibilité en eau et de la température qui activera son métabolisme. Dans ce cas, il est primordial pour l’espèce d’assimiler le maximum de nutriments par la photosynthèse et la nutrition minérale avec un minimum de perte en eau. Le stress hydrique dû à une longue période de sècheresse et une augmentation incessante de la température de plus de 60° C (RAVELOMANANA D, 1993), bloquent rapidement le mécanisme d’échange de la plante avec le milieu extérieur et la plante se dessèchent. Les études pédologiques dans les aires de répartition de l’espèce montrent qu’elles poussent toujours sur des "lithosols". Ce sont des affleurements rocheux de composition Quartz-feldspathique (roche acide), tels que granite, gneiss, leptynite, migmatite ou grès argileux. Sous l’action du couple altération-désagrégation, ces roches présentent des fissures qui emmagasinent les produits d’altération, à savoir les minéraux I (sables de nature quartzeux, feldspathiques, micas,...), les minéraux II (argiles, complexes hydroxylés,...) et les matières organiques (feuilles mortes, etc.) du milieu environnant pour former des complexes "organo-minéraux" de couleur noire et d’épaisseur variable entre 5 à 10 cm selon la fissure. Ce milieu organo-minéral constitue le sol favorable au développement de l’espèce. Ce sont des lithosols à roche mère aride conditionnée par une humidité importante; c’est la raison pour laquelle, les espèces poussent toujours en altitude élevée. De ce fait, elles absorbent directement leurs éléments nutritifs sur ces roches en voie d’altération. Ces éléments sont sous forme solubles, d’où l’importance de l’humidité pour solubiliser ce complexe organo-minéral. L’étude de la régénération naturelle a montré qu’il est très rare d’observer aux alentours de 20 à 30 cm de la plante adulte, des plantules issues de la germination des graines. Seules subsistent quelques plantules accrochées aux stolons jusqu’à ce qu’elles s’enracinent et pourront accumuler de l’humus pour s’y fixer. Néanmoins, la rareté de l’espèce dans toute l’île est perçue et on la trouve de moins en moins témoignant ainsi une diminution progressive de l’effectif.

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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I.1.2.2 Répartitions géographiques et variabilité biologique de l’espèce
Des recherches, entreprises par RABOTOVAO L depuis 1987, concernant la variabilité biologique de l’espèce, ont montré que l’espèce pouvait être subdivisée en sous-espèce ou variété, souvent morphologiquement peu distincte, mais présentant une localisation géographique différente. Ces différences morphologiques s’atténuent ainsi, au point qu’elles ne soient plus distinctes que par des caractères physiologiques comme la teneur en principe actif de la plante. Elles se trouvent alors simplement dans des stations écologiquement différentes, on les appelle ainsi : écotype, qui est donc un représentant ou un échantillon de l’espèce modifié par rapport au type fondamental par suite de l’action du milieu environnant. Il a été démontré ainsi l’existence de 8 écotypes correspondant se répartissent dans 5 localités, à savoir: • Ambatokely (CARION), au Pk 30, sur RN2, au versant ouest d’un dôme granitique; Position géographique: S 18°53.146; EO 47°41.044 Altitude: 4 653 à 4 671 pieds* soit 1 418,2 à 1 423,7 m • Antongona, Pk 32, sur la route d’Arivonimamo (bifurcation Imerintsiatosika); Position géographique: S 18°56.424; EO 47°16.994 Altitude: 4 561 à 4 782 pieds soit 1 390,2 à 1 457,5 m • Manerinerina, Pk 135, sur RN4, route de Majunga (pont Andranofeno Nord); Position géographique: S 18°05’ 125; EO 47°10.552 Altitude: 4 144 à 4 163 pieds soit 1 263,1 à 1 268,9 m • Ambalavao, sur RN7, route menant vers Tuléar; Position géographique: S 22°04'112; EO 46°12'646 Altitude: 4 589 à 4 678 pieds soit 1 398,7 à 1 425,8 m • Ampanihy, sur RN10, route menant vers Fort Dauphin; Position géographique: S 24°41'802; EO 44°41’ 521 Altitude: 4 121 à 4 140 pieds soit 1 256,1 à 1 261,9 m. _____________________________________________________________________________
* 1 pied = 0,3048 m (unité anglo-saxon)

dans toute l’île, grâce à des analyses

statistiques sur des mesures prises concernant les organes reproducteurs et végétatifs. Les 8 écotypes

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Figure 2 : Les aires de répartition de Kalanchoe synsepala (BAKER)

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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I.1.2.3 Milieu d’étude
Les cinq localités représentant les écotypes de l’espèce ont servi de milieu d’étude.

a) Le site Ambatokely
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome d’ Antananarivo, sous-préfecture de Manjakandriana, situé entre 18°53,146 de latitude Sud et 47°41,044 de longitude Est. Il se trouve à environ 30 km sur la RN2, et constitué de dômes granitiques atteignant 1 400 m, présentant aux alentours quelques forêts secondaires de montagne et se trouve à une altitude de 1 418,2 à 1 423,7 m. L’aire d’importance de l’espèce est localisée sur des inselbergs (Figure 3A), définis comme des communautés locales isolés sur des affleurements de rochers, en milieu tropical. L’inselberg constitue des biotopes remarquables avec une forte proportion d’espèces endémiques (Euphorbia, Kalanchoe, Pachypodium etc.). La végétation des sommets granitiques est fragmentaire et très riche en xérophytes et plantes succulentes formant de large tapis sur sol humifère très peu profond. . Facteurs climatiques : le climat est celui du Plateau Central de l’île avec deux saisons marquées, nuancées localement par des brumes matinales même pendant la saison sèche. Il est arrosé de 1 226,9 mm de pluie, pendant l’été, avec une température moyenne annuelle de 17 à 28 °C et une période hivernale sèche de 4 à 7 mois (climat sub-humide). . Relief et topographie : en général, le relief est élevé constitué par plusieurs massifs granitiques et des îlots rochers nus et lisses (des inselbergs). . Pédologie : elle est constituée par des vieilles roches granitiques, ayant subi des dégradations dans le temps ont formé des gisements latéritiques épais de 30 m d’épaisseur environ. Les roches sont teintées de rouge par la présence d’oxydes de fer et se sont érodées, pour former des îlots montagneux. Ceux-ci sont fréquemment de formes régulières, aplaties et polies par le cours rapide des eaux. . Flore : le site est non afforesté. La végétation de ces sommets sont fragmentaires et abritent des formations végétales plus ou moins intactes dues au fait qu’ils sont protégés par les feux de brousse, ces inselbergs sont constitués principalement des plantes crassullescentes endémiques.

b) Le site Antongona
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome d’Antananarivo, Région de l’Itasy, Préfecture d’Arivonimamo, il est situé entre 18°56.424 de latitude Sud et 47°16.994 de longitude Est à une altitude d’environ 1 390,2 à 1 457,5 m, soit au environ de 1 400 m vers la route menant au "Rova d’Antongona". La formation géologique est constituée par des ortho-gneiss de nature quartzo-feldspathique avec de minéraux Fe-Mg, biotite et amphibole. Cet affleurement rocheux se trouve en altitude élevée avec humidité importante (Figure 3B).

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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. Facteurs climatiques : le climat est celui du Plateau Central de l’île. La précipitation annuelle est de 1 481,3 mm, principalement l’été, avec une température moyenne annuelle de 17 à 24 °C et une période hivernale sèche s’étalant trois mois de Juin à Août. . Relief et topographie : la topographie est élevée et constituée par des reliefs de dessiccation des massifs cristallins. . Flore : la végétation de ces reliefs abrite des formations végétales plus ou moins semblables à celles d’Ambatokely. Les reliefs granitiques abritent également des plantes crassullescentes telles les aloès et les xérophytes.

c) Le site de Manerinerina
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome d’ Antananarivo, Région de Vonizongo Marovatana, dans la préfecture d’Ankazobe, sur le plateau de Tampoketsa, situé entre les coordonnées S : 18° 05’ 125’’et EO : 47° 10’ 552’’, à une altitude 1 263,1 à 1 268,9 m et traversé par le fleuve d’Andromba, au pont d’ Andranofeno. La nature des roches- mères est un gneiss et leptynite de composition quartzo-feldspathique. Cet affleurement est traversé par une rivière favorisant l’altération et l’humidité du milieu (Figure 3C-D). L’espèce s’installe avec d’autres plantes grasses dans des zones d’altération rocheuse contenant des litières superficielles avec les minéraux détritiques quartzo-feldspathique et des argiles d’altération , comme dans les autres localités. . Facteurs climatiques : le climat est celui du Centre de l’île: il est arrosé par 1 430,1 mm de pluie, principalement l’été, avec une température moyenne annuelle varie de 17 à 23 °C avec une période hivernale sèche de 4 mois (Mai à Août). . Relief et topographie : en général, le relief est aplati, formant le plateau de Tampoketsa. Le site résultait donc d’un aplanissement de relief et de dessiccation de massifs cristallins. . Flore : la végétation de ces plaines est constituée par des Graminées et une végétation dégradée par le passage des feux de brousse chaque année. Néanmoins, sur les affleurements des rochers abritent des plantes crassullescentes et xérophytiques.

d) Le site d’Ambalavao
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome de Fianarantsoa, Région de Horombe, Préfecture d’Ambalavao et situé entre les coordonnées S : 21° 57’ 155’’ et EO : 46° 44’ 337’’ à une altitude de 1 398,7 à 1 425,8 m, sur la route menant vers Tuléar. La formation géologique est constituée par des ortho-gneiss de nature quartzo-feldspathique avec de minéraux Fe-Mg, biotite et amphibole. Cet affleurement rocheux se trouve en altitude élevée avec humidité importante (Figure 3 E). L’altération et la désagrégation sévissent également, entraînant toujours la formation des fissures,

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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accumulant les produits d’altération (minéraux lourds, argile d’altération,...) et les matières organiques environnants. Cette formation constitue le complexe organo-minéral superficiel sur la roche-mère acide, favorable au développement du Kalanchoe (lithosols). . Facteurs climatiques : le climat est de type tropical d’altitude (LE BOURDIEC, 1969 in :
PLARM), la pluviométrie annuelle est de 1265,1 mm et les mois les plus arrosés sont Décembre et

Janvier. La saison sèche dure quatre mois, de Mai - Août. La température ne dépasse pas 25°C pendant le mois le plus chaud (Octobre) et peut atteindre jusqu’à 6,1°C durant le mois le plus froid (Juillet). . Relief et topographie : comme dans les autres localités, le relief est élevé, constitué par un plateau cristallin très abrupt. Le massif granitique comprend une série de dômes rocheux gigantesques et une chaîne de rochers aux arêtes étroites. . Flore : elle est surtout caractérisée par une végétation herbacée très pauvre et la zone est presque entièrement couverte par des graminées parcourues régulièrement par le feu.

e) Le site d’Ampanihy
. Localisation : le site d’Ampanihy se trouve dans la province Autonome de Tuléar, Région d’Atsimo Andrefana, dans la Sous-préfecture d’Ampanihy, situé entre S : 24° 41’ 802’’et EO : 44° 41’ 521’’, à une altitude de 1 256,1 à 1 261,9 m. L’espèce pousse sur un grès sédimentaire altéré d’Andriamisara. Dans cette région, l’espèce pousse sur les affleurements gréseux (à argilites rouges). Le site se trouve à une altitude moyenne pouvant ainsi préserver l’humidité et favorisant la solubilité du complexe organo-minéral (Figure 3 F). . Facteurs climatiques : le climat est de type semi-aride avec une précipitation moyenne de 656,28 mm et caractérisé par une saison sèche prolongée très marquée à hiver froid. La période sèche dure sept mois sur douze. La température moyenne est de 23,8°C. . Relief et topographie : le relief est généralement plat, constitué de massifs gréseux formant les aires d’importance de la plante, accompagnée de plusieurs espèces d’Euphorbia en particulier Euphorbia et Alluaudia. . Pédologie : le sol gréseux se présente sous forme de cuirasses et, il y a des fissures

d’altération qui emmagasinent les sables et argiles d’altération avec les matières organiques (feuilles, tiges mortes etc.) des plantes environnantes. Une formation organo-mineral est présente (couche A) d’une épaisseur variant entre 10 à 15 cm sur ces cuirasses. . Flore : elle est constituée par des Fourrés xérophiles dégradés ou des Fourrés xérophiles à dominance du bush. Notons que le sol est occupé par les défrichements continus pour des cultures permanentes de maïs.

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Tableau 2 : Les facteurs physiques et biologiques des milieux d’études

Ambatokely Localisation S 18°53,14 EO 47°41,04

Antongona S 18°56.42 EO 47°16.99

Manerinerina

Ambalavao S 21°57’15 EO 46°44’33

Ampanihy S 24°41’80 EO 44°41’ 52

S 18°05’12 EO 47°10’55

Altitude

1 418,2 à 1 423,7 m

1 390,2 à 1 457,5 m

1 263,1 à 1 268,9 m

1 398,7 à 1 425,8 m

1 256,1 à 1 261,9 m.

Situation Précipitation annuelle Température moyenne annuelle Type de climat (LE BOURDIEC, 1969)

Plateau Central 1 226,9 mm 17 à 18°C Tropical d’altitude Inselberg Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques rajeunis, enrichis en minéraux peu altérables, à structure plus ou moins dégradée Forêt dense humide

Centraleouest 1 481,3 mm 17 à 18°C Tropical d’altitude Dôme granitique Domaine du socle cristallin

Centre-nord 1 430,1 mm 17 à 18°C Tropical d’altitude Affleurement rocheux Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques fortement rajeunis à structure plus ou moins dégradée

Centre-sud 1265,1 mm 11 à 12°C Tropical sec Dôme granitique Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques rajeunis, enrichis en minéraux peu altérables, friables Forêt dense humide de moyenne altitude Végétation graminéenne

Sud 656,28 mm 23,8°C Tropical semi-aride Massif gréseux Domaine sédimentaire

Facteurs physiques

Relief et géologie

Géomorphologie

Pédologie

Sols ferralitiques à faciès humifère sous forêts.

Sols sableux rouge à faciès humifère local

Facteurs biologiques

Principales formations climaciques et climatiques Principales formations dégradées

Forêt dense scélorphylles

Foret ripicoles ou alluviale

Fourrés xérophiles dégradés

Végétation graminéenne

Végétation graminéenne

Végétation graminéenne

Savoka

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Les études effectuées dans ces différentes zones montrent que le milieu pédologique du Kalanchoe est caractérisé par : un lithosol formé par des affleurements rocheux de nature quartzo-feldspathique et riche en silico-alumineux qui s’altèrent en complexe minéraux argileux, une association de débris rocheux (sablo-argileux) provenant de l’action altération-désagrégation qui s’accumulent dans des fissures, et s’associent entre les matières organiques des plantes environnantes pour former des couches ou horizons superficielles "organo-minérales" favorables au développement de la plante. Ce milieu se trouve en général, dans une zone à haute altitude, entre 1 250 et 1 425 m d’altitude avec une humidité importante, facilitant, l’absorption directe par la plante des éléments dissous tels que K+, Na+, Ca++ provenant de l’altération des roches mères acides. Sur les rochers recouverts de pelouses à xérophytes du Domaine central et du Sud de Madagascar, les habitats se diffèrent par leurs conditions édaphiques et microclimatiques d’où la notion d’écotype entre les espèces (RABOTOVAO L, 1993). La végétation est exposée à de fortes radiations solaires, à des températures élevées, et les déficits hydriques provoquent des contraintes sévères, accentuées par l’absence ou la faible profondeur des sols. Les conditions climatiques ne sont viables que lorsque la plante développe des stratégies adaptatives comme la crassulescence des feuilles, l’émission des organes modifiés pour la multiplication végétative et enfin une adaptation physiologique telle que le "Métabolisme Acide des Crassulaceae " (C.A.M) de l’espèce. Lorsque la pente est localement faible, on constate une implantation d’espèces pionnières, puis un sol recouvert d’humus avec des îlots de végétation. Des relevés floristiques ont été effectués et ont permis d’observer des communautés végétales d’importance variable telles que : des rosettes d’Aloe capitata (LILIACEAE), de Kalanchoe synsepala (CRASSULACEAE), des espèces d’Orchidée (ORCHIDACEAE) et enfin de Xerophyta dasylirioides (VELLOZIACEAE). Ces plantes sont soit isolées, soit réunies, formant des microcommunautés sur quelques dm2 de surface (Figure 4). Tableau 3 : Les espèces caractéristiques du type d’habitat où pousse l’espèce
Nom scientifique Famille LILIACEAE LILIACEAE ORCHIDACEAE ORCHIDACEAE VITACEAE ASCLEPIADACEAE EUPHORBIACEAE EUPHORBIACEAE CRASSULACEAE CRASSULACEAE CRASSULACEAE APOCYNACEAE APOCYNACEAE ASTERACEAE VELLOZIACEAE VELLOZIACEAE Nom vernaculaire

Aloe capitata Aloe macroclada Angraecum magdalenae Angraecum sororium Cissus quadrangularis Cynanchum perrieri Euphorbia milii var.breoni Euphorbia milii var. splendens Kalanchoe tubiflora Kalanchoe prolifera Kalanchoe synsepala Pachypodium brevicaule Pachypodium rosulatum Senecio crassissimus Xerophyta dasylirioides Xerophyta pinifolia

Sahondra Vahona Vakoambatolahy Tohitohy Songosongo Tingotingo Sodifafana Sofintsofiny Kimonoina Somona Tongotrakoho Ringimbato

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Figure 3 : Les milieux naturels de Kalanchoe synsepala (BAKER). Vue d’ensemble des massifs A : Ambatokely, B : Antongona, C et D : Manerinerina, E : Ambalavao et F : Ampanihy

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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G

Figure 4 : Vues rapprochées de la communauté végétale étudiée G et I : Kalanchoe synsepala, H : plantes pionnières Xerophyta dasylirioides, Aloe vahombe, J : Angraecum sororium, K et L : Kalanchoe synsepala poussant sur les rocailles à Ampanihy et Ambatokely

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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I.1.3 Propriété biologique et phytochimique du Kalanchoe synsepala (BAKER) I.1.3.1 Propriété biologique
Depuis très longtemps, la plante a été utilisée par les paysans, surtout en médecine traditionnelle et cela a été vérifié par des enquêtes ethnobotaniques que nous avons effectuées dans diverses régions de l’île. Elle peut guérir plusieurs sortes de maladies et considérée comme plante endémique de Madagascar et non toxique (BOST R, 1961 in: PLARM). Les réserves d’eau contenues dans les feuilles épaisses sont utilisées par les indigènes qui les mâchent pour se désaltérer lorsqu’ils voyagent dans les montagnes où pousse la plante (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Pour l’usage traditionnel, les utilisations sont regroupées dans le tableau 4 suivant, d’après les enquêtes effectuées sur terrain auprès des tradipraticiens, "tangalamena ", matrones, populations locales, etc. Tableau 4 : Les usages thérapeutiques de l’espèce
Plante Indications (Traumatisme) Brûlures et entorses (Paludisme) Fébrifuge (Maladie cutanée et lèpre) Ulcère Oreillons Plante entière Partie utilisée Plante entière Préparation et posologie Feuilles fraîches pilées et appliquées en cataplasme Jus des feuilles fraîches pillées et filtrées, à boire Broyage de feuilles et une cuillerée par jour du jus utilisation décoctée de la plante comme désinfectant Feuille chauffée et utilisée comme compresse, décoction de 7 jeunes feuilles à bouillir et à boire Massage du corps avec des feuilles chauffées sur des braises, préparation en cataplasme Décoction de racine séchée, demitasse trois fois par jour, à boire Feuilles pillées et non filtrées; application du jus sur la plaie Jus des feuilles fraîches pillées et filtrées, à boire. Décoction des feuilles mûres Jus des feuilles fraîches pillées et filtrées, à boire Massage avec un extrait de la plante mélangé à l’huile de coco

Feuille

Kalanchoe synsepala (BAKER)

(Maladie ostéocuticulaire) Rhumatisme, inflammation (Maladie métabolique) Goutte (Maladie intestinale) Anti-diarrhéique (Maladie de l’appareil génitale) Blennorragie, maladie vénérienne (Maladie de l’appareil respiratoire) Toux - Asthme (Inflammation estomac) Gastrite chronique Douleur articulaire

Feuille

Plante entière

Racine

Feuille

Feuille

Feuille Feuille

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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I.1.3.2 Propriété phytochimique
L’étude phytochimique du genre montre différents types de molécules par isolement et identification : des lipides, des glycoprotéines, des technoïdes et des flavonoîdes. Les substances les plus notables biosynthétisées appartiennent à deux familles: les bufadiénolides et les glucosides de flavonoîdes (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Des composés phénoliques sont surtout abondants au sein de l’espèce. L’isolement et le séquençage du principe actif de l’espèce sont en cours actuellement. D’après le fractionnement des extraits bruts afin de mettre en évidence les groupes de produits responsables l’activité biologique ,les résultats nous montrent que les extraits sont constitués majoritairement de composés polaires (solubles dans les solvants) tels que l’eau : phase aqueuse. Les composés moyennement polaires (fraction acétate d’éthyle) sont présents, mais en faible quantité. Les produits apolaires dissous dans le solvant polaire, le n-hexane, sont presque à l’état de trace (Travaux non publiés). D’autres propriétés d’intérêts pharmacologiques ont été mises en évidence très récemment. La recherche de nouvelles substances immunomodulatrices naturelles est à l’origine d’un criblage d’extrait vis-à-vis de l’activité du système immunitaire. L’étude de l’activité immunostimulante, effectuée sur des écotypes, a permis de confirmer, non seulement la variabilité au sein de cette espèce (variabilité dans la teneur en protéine et de la teneur en principe actif), mais également elle a conduit à classer l’extrait de l’espèce dans la catégorie des immunostimulants (RABOTOVAO L, 1993). En effet, la plante possède des substances qui sont capables de stimuler et d’augmenter la résistance antiinfectieuse d’un organisme infecté par des agents pathogènes (IVAN M ROITT et al, 1985).

I.1.4 Statut de conservation des CRASSULACEAE, plante grasse de Madagascar
Les plantes grasses sont traitées comme un groupe de taxons important parmi les plantes ornementales car plusieurs espèces font actuellement l’objet de collecte intensive pour les commerces locaux et internationaux. Neuf familles sont principalement concernées, avec 69% des espèces uniques à Madagascar (endémiques), 27% inconnues, 1% en danger et 3%, introduites. La famille des CRASSULACEAE est, la plus riche en espèces ornementales et la plus commercialisée, avec 119 espèces appartenant au genre Kalanchoe. Plus de 60% des espèces des plantes grasses malgaches sont endémiques, y compris notre matériel d’étude, alors que le statut UICN de ces espèces est inconnu à presque 78%. Tableau 5 : Statut UICN de conservation des plantes grasses
En danger 5% Insuffisamment connu 30 % Non menacées Hors de danger

Inconnu

Indéterminé

Rares

Vulnérables

47 %

2%

3% 1% 11 % 1% Source : Monographie de la Biodiversité, 1998

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Un certain nombre de plantes succulentes (24 espèces), de 3 Familles les plus exploitées sont déclarées très menacées, certaines en voie de disparition (Monographie de la biodiversité, SIBIO d’après WMCM, 1998).Dans cette famille, quatre (4) genres ont un statut propre au niveau UICN. Tableau 6 : Statut UICN et CITES de 4 genres appartenant à la Famille

Genre Crassula cordifolia (BAKER) Crassula humbertii (Descoings) Kalanchoe beharensis (Drake) Kalanchoe viguieri (RaymondHamet)

UICN Rare Rare Rare Rare

CITES Source : Monographie de la Biodiversité, 1998

On constate que l’espèce ne bénéficie d’aucun statut de conservation UICN et CITES jusqu’à présent. Toutefois, la présence de l’espèce dans une Aire protégée (Parc National de l’Isalo) ou des Sites touristiques protégées ("Rovan’Antongona") constitue une sorte de protection pour celle-ci. Par contre, les autres habitats exclusifs se trouvent dans les aires non protégées (Ambatokely, Manerinerina, Ambalavao, Ampanihy).

I.1.5 Conservation ex situ de l’espèce
Comme beaucoup de menaces pèsent sur l’espèce, en particulier, la diminution en nombre, due au faite que la régénération naturelle est ralentie par divers facteurs d’origine anthropique (feux de brousse, surexploitation etc.) et d’origine naturelle (conditions écologiques très précaires, mode de multiplication naturelle très lente etc.), la recherche de solutions afin de résoudre ces problèmes s’avère être plus que nécessaire dans ce cas. Comme la conservation « in situ » demande trop de moyens : les aires de répartition des espèces ne se trouvant pas dans des aires protégées ; par conséquent, l’une des solutions immédiates seraient la multiplication en nombre de l’espèce afin d’augmenter le nombre d’individu. Les techniques couramment employées sont les techniques de multiplication végétative comme le bouturage, le greffage et le marcottage: ces techniques sont plus simples à effectuer et n’exigent pas trop de matériels et moyens. Seulement, le greffage et le marcottage sont des techniques qui sont inadéquates avec la biologie et la morphologie de l’espèce. En effet, le greffage et le marcottage se font surtout avec des plantes ligneuses ou au moins subligneuses possédant des tiges et racines bien définies, alors que notre espèce est en état de rosette pendant toute l’année. Pour le bouturage, elle peut se faire dans des conditions d’humidité favorables, le bouturage des feuilles donne naissance à deux ou trois plantules, après quatre semaines de culture, par conséquent, avec une plante-mère possédant au moins quatre (4) feuilles deux à deux opposées, on pourrait obtenir au moins 12 plants qui pourront être repiqués. Or, avec l’exploitation d’autres techniques de multiplication végétative dite "in vitro": techniques s’effectuant au laboratoire, avec un explant d’au moins 1 cm3 (méristème apical, morceaux de feuille, de tige ou de racine), on pourrait

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Généralités sur Kalanchoe synsepala (BAKER)
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avoir des centaines, voire des milliers de plantules identiques à la plante-mère. En effet, un de avantages de cette technique de culture "in vitro" est la production en quantité très importante de plantules génétiquement homogènes, en un laps de temps plus court (BOUTHERIN D et BRON G, 1989), en un an, on peut produire en théorie, plus de 4 millions de plants d’une espèce, à partir d’un seul apex alors que traditionnellement, on en obtient 50 (technivit/techniquesciv.htm, 2004) : on constate un très grand potentiel de multiplication, en gros 1 000 fois plus élevé que la multiplication végétative traditionnelle, la production de plants "in vitro" permet aussi de s’affranchir des saisons, la réduction du nombre de pieds mères nécessaire à la production de boutures, et surtout, la multiplication des espèces difficiles à reproduire naturellement etc. C’est la raison pour laquelle, on a choisi de développer et d’exploiter différentes techniques de multiplication végétative "in vitro" pour les besoins de l’espèce. Pour l’étude de la germination "in vitro" des graines, cette technique permet aussi une multiplication en nombre, en utilisant des graines. L’objectif de cette technique est aussi d’exploiter tous les potentiels de l’espèce pour l’augmentation en nombre des individus. L’étude portera donc sur la recherche des divers facteurs qui pourront influencer sur la faculté germinatrice des graines (lumière, température, milieu de culture etc.). Dans ce cas, on pourrait influencer le nombre de graine germée au laboratoire, pour avoir plus de plants et enfin des plantules qui pourront toujours être repiquées. Seulement, cette technique reste toujours en dernier recours car, elle nécessite un matériel végétal ou une structure reproductrice déjà différenciée en graine. C’est pour cela que les différentes techniques de multiplication végétative "in vitro" tiendront une place importante. Dans ce travail, la conservation "ex situ" de l’espèce consiste à : - la création d’une banque de donnée complète sur Kalanchoe synsepala (BAKER) au point de vue botanique, écophysiologique et phytochimique : par des recherches bibliographiques, des enquêtes effectués sur terrain, - la multiplication en nombre de l’espèce avec la recherche de différentes techniques de multiplication de l’espèce pour sa pérennisation, avec les expérimentations des techniques "in vitro" avec la culture du méristème apical, la micropropagation (culture d’explant différencié: feuille) et l’embryogenèse somatique. Les plantules obtenues seront ainsi domestiquées pour l’obtention de matériel végétal saine et en grand nombre. Après la description biologique, physiologique et écologique de notre matériel d’étude, nous allons entreprendre une description détaillée des différentes techniques de germination et de multiplication végétative "in vitro" existantes.

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Généralités sur les techniques de culture « in vitro »
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I.2 GENERALITES SUR LES TECHNIQUES DE CULTURE "in vitro"
Pour les techniques de culture employées, deux techniques ont été mis en évidence, afin de palier à la diminution en nombre de l’espèce: il s’agit de l’essai de germination "in vitro" des graine et la régénération à partir de différentes techniques de culture "in vitro" déjà proposées dans divers centres de recherche. L’objectif est donc la maîtrise parfaite des différentes techniques de germination et de multiplication "in vitro" en nombre.

I.2.1 Germination "in vitro"
La germination "in vitro" des graines est l’ensemble de processus afin d’obtenir une plantule capable de croître normalement, à partir d’une graine. Du point de vue physiologique, la germination est la perforation des enveloppes par la radicule due à un allongement des cellules radiculaires représentant la phase finale de la germination (RABOTOVAO L, 1987). Pour la réussite de cette technique, l’obtention de graines saines est prépondérante, par conséquent, il nous faut maîtriser la technique de décontamination des graines avec des produits désinfectants comme l’alcool et l’hypochlorite de calcium ou l’hypochlorite de sodium, utilisés à des concentrations variables. Après, on effectuera des techniques expérimentales pour la germination proprement dit des graines aseptisées "in vitro". La germination s’effectue dans des boites de Pétri contenant des milieux de culture préétablis. Elle se déroule dans une armoire de culture avec luminosité ou dans une étuve de germination, dans l’obscurité.

I.2.2 Culture "in vitro"
La culture "in vitro" est une méthode de multiplication végétative asexuée. Ce type de multiplication est basé sur une propriété importante des cellules végétales, inexistante chez les cellules animales. Une cellule végétale différenciée peut devenir indifférenciée, se diviser à nouveau activement et puis se différencier à nouveau en une autre cellule. Cette propriété est nommée la totipotence de la cellule végétale (HOBBELINK H, 1988). Notons que la totipotentialité de notre espèce a été déjà mise en évidence dans les travaux ultérieurs et il s’agit maintenant de mettre en évidence les facteurs extrinsèques qui pourraient influencer sur la régénération "in vitro". La technique consiste à prélever un fragment d’organe, appelé : explant, à le placer dans un milieu nutritif approprié de façon à ce que ce fragment puisse régénérer une plante entière. Le processus de régénération de la plante est, généralement, sous le contrôle de substances particulières : les régulateurs de croissance, ou hormones végétales (BOUTHERIN D et BRON G, 1989). Pour notre étude, seules trois techniques ont été expérimentées : - la culture d’organe non différencié ou culture de méristème, - la culture d’organe déjà différencié ou micropropagation (feuilles, tiges, racines), - et l’embryogenèse somatique (induction de cals). En effet, seules ces trois techniques sont les plus couramment utilisées et employées dans les centres de recherches où nous avons fait notre expérimentation et qui ont donné des résultats satisfaisants.

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Généralités sur les techniques de culture « in vitro »
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L’objectif de la régénération "in vitro" est d’élaborer un protocole expérimental favorable pour la régénération de notre espèce, c’est-à-dire, un protocole expérimental de décontamination et de désinfection des explants élaboré suivi du protocole de régénération proprement dit ou protocole pour la mise en culture de l’espèce à partir d’organe végétatif différencié et non différencié.

I.2.2.1 Techniques de multiplication " in vitro"
Les techniques que nous avons utilisées pour la régénération de l’espèce sont donc la micropropagation, la culture de méristème et l’embryogenèse somatique. Ces techniques reposent sur l’utilisation des régulateurs de croissance synthétiques pour induire soit une organogenèse ou la formation d’organe comme des feuilles ou des racines, soit une embryogenèse ou la dédifférenciation des tissus mis en culture suivie de la formation des tissus embryogènes (cals).

a) La culture de méristème
Les méristèmes sont des zones de cellules à divisions intenses, situés au cœur des bourgeons et des extrémités de racines et à l’origine des tiges feuillées ou du système racinaire. En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet ont montré que les méristèmes étaient indemnes de virus (SCRIBAN R, 1988). La culture du méristème apical est une culture aseptique sur un milieu artificiel du dôme apical sans ébauche foliaire. Il mesure 0,2 à 0,3 mm de coté et la dissection se fait sous la loupe binoculaire. La technique peut être associée à de la thermothérapie : culture à température élevée, pour favoriser l’élimination des virus (technivit/techniquesciv.htm, 2004). Les plantes produites sont saines : sans virus, ni champignons, ni bactéries et répondent aux normes phytosanitaires d’échanges internationaux. On obtient des variétés conformes à la variété d’origine et que l’on peut multiplier en grande quantité (SCRIBAN R, 1988).

b) L’embryogenèse somatique
L’embryogenèse somatique est une forme de multiplication végétative permettant d’obtenir une multitude de plantules identiques génétiquement à la plante donneuse d’explants. C’est l’obtention d’embryons à partir de cellules somatiques, c’est-à-dire non sexuelles (HOBBELINK H, 1988). Elle consiste à provoquer de nombreuses divisions cellulaires à partir de tissus cultivés grâce à l’apport d’une forte dose d’auxine. Un cal est alors obtenu, c’est-à-dire un amas de cellules indifférenciées et qui pourront donner naissance à des embryons bipolaires qui vont se comporter comme des embryons zygotiques, (issus de la fécondation entre une cellule sexuelle femelle et une cellule sexuelle mâle) (technivit/techniquesciv.htm, 2004).

c) La micropropagation
La micropropagation "in vitro" dérive des phénomènes naturels de multiplication végétative. On cultive, stérilement, des explants végétaux sur un milieu artificiel et dans un environnement contrôlé. Suites aux cultures successives, on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l’on peut multiplier à l’infini (SCRIBAN R, 1988).

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Généralités sur les techniques de culture « in vitro »
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Il s’agit donc de produire en grande quantité des plantes. Cette technique est appliquée à des plantes portant des intérêts particuliers ou difficiles à reproduire naturellement. Les plantes obtenues sont génétiquement identiques à la plante ou variété de départ et la puissance du clonage "in vitro" et permet une production d’un grand nombre de plantes génétiquement homogènes en un laps de temps court. Elles sont de grandes qualités car en très bon état sanitaire, avec un enracinement régulier, des ramifications nombreuses, donc d’une vigueur accrue. Cette méthode est encore appelée microbouturage (technivit/techniquesciv.htm, 2004).

I.2.2.2 Les milieux de culture
De nombreux milieux de culture ont été déjà établis afin de régénérer "in vitro" plusieurs espèces ligneuses et non ligneuses. Ces milieux de culture sont généralement composés de macroéléments, de micro-éléments, de vitamines, d’hormone de croissance et de quelques substances organiques dont les concentrations varient suivant les besoins d’une espèce prédéfinie ou suivant l’objectif de la culture. Les milieux de base établis et dont les compositions restent inchangées sont le milieux de MURASCHIGE et SKOOG (1962) et le milieu de GRESSHOFF et DOY (1974). Leurs compositions respectives sont énumérées en ANNEXE I et ANNEXE II. La différence entre ces deux milieux résident dans l’apport en macroéléments, microéléments, vitamines, et la concentration de certains éléments (RABOTOVAO A S, 2001). Ainsi, dans un premier temps, il est nécessaire de préparer des solutions mères complexes concentrées comprenant tous les éléments minéraux sauf les sels de calcium pour éviter les précipitations : une solution mère de macroéléments concentrés 100 fois, une solution mère de microéléments concentrée 1000 fois, une solution mère de chélate de fer, Fe-EDTA (x 100), une solution mère comprenant les vitamines de groupe B (x 1000), et des solutions mères pour les régulateurs de croissance à la concentration de 0,1 g/l soit 0,1 mg/ml (BOXUS P, 1989). Le milieu de culture est solidifié par de l’agar ou gélose de l’ordre de 6 à 10 g/l, nécessitant un chauffage à l’ébullition au préalable pour se dissoudre (R Augé et al, 1984). Un ajustement de pH s’avère être nécessaire et doit être au environ de 5,8. A la fin, le milieu de culture devra être stérilisé dans autoclave à une température de 120 °C pendant 20 min sous une pression de 1 bar (RAMANANKIERANA H, 2000).

I.2.2.3 Les hormones de croissance
Diverses hormones de croissance sont utilisées pour la régénération "in vitro" de l’espèce à savoir les auxines et les cytokinines. Les auxines faibles comme l’acide indol-acétique (AIA) ou l’acide β indol-butirique (AIβ), stimulent la formation des racines ou rhizogénèse et la croissance cellulaire. Les auxines fortes comme l’acide naphtylacétique (ANA) ou l’acide 2,4 dichloro-phénoxyacétique (2,4 D) sont employés pour la prolifération cellulaire mais sont rapidement toxiques à forte concentration.

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Généralités sur les techniques de culture « in vitro »
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Les cytokinines induisent la multiplication cellulaire et le métabolisme en général et la néoformation des bourgeons (BOXUS P, 1989). Les équilibres hormonaux, entre l’auxine et la cytokinine (Figure 5), ont été testés afin d’atteindre les objectifs fixés comme la régénération à partir de cals embryogènes ou par la production de cal cicatriciel ou encore la régénération à partir de la néoformation des bourgeons ou des plantules. Ainsi, avec R = concentration en auxine / concentration en cytokinine Si R = 1 : formation de cal uniquement Si R ≤ 1 : formation de fleurs ou de feuilles sur le cal Si R ≥ 1 : formation de racine sur le cal.

Figure 5 : Orientation de la culture "in vitro" à l’aide de deux hormones (en mg /l) (technivit/techniquesciv.htm, 2004) Ainsi, à partir de ce tableau, on a pu tirer divers protocole d’équilibre hormonale, entre l’auxine et la cytokinine, en vue de connaître le rapport entre les effets hormonaux et la régénération "in vitro" de l’espèce. Les régulateurs de croissance devront être stérilisés par filtration avec un filtre millipore de porosité 0,22µ, puis ajoutés au milieu de culture après autoclavage (LEE T S G, 1886). Après les descriptions du matériel d’étude et des techniques de multiplication sexuée et asexuée, nous allons maintenant élaborer les méthodologies à suivre afin de mettre en évidence les potentialités de l’espèce à la germination et la multiplication en nombre.

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Approche méthodologique- Expérimentations
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PARTIE II: APPROCHE METHODOLOGIQUE-EXPERIMENTATIONS II.1 Approche méthodologique II.1.1 Problématique
On a remarqué une surexploitation massive et irrationnelle de l’espèce, entraînant une diminution en nombre des individus.

II.1.1.1 Les critères de menace pour l’espèce ou cause directe : la dégradation de leur habitat
forêt constitue une réserve des essences, des plantes Des milieux naturels autres que la

médicinales, ainsi que des plantes ornementales. Mais en raison de l’agression croissante et irraisonnée de l’Homme sur la Nature, ce patrimoine est actuellement menacé.

a) Le défrichement
Le défrichement est la cause majeure de la dégradation de l’environnement. Cette pratique s’est nettement accélérée depuis 10-50 ans en relation avec les problèmes démographiques, mais aussi et surtout avec la baisse des Ressources foncières des populations rurales. Le défrichement est aussi lié à la recherche de terre cultivable surtout dans le Sud de l’Ile où pousse l’espèce avec la coupe rase des Fourrés xérophiles pour des champs de maïs. En effet, il y a défrichement pour obtenir des terrains pour les cultures permanentes, qui prime sur l’exploitation forestière et les cultures itinérantes.

b) Les feux de brousse
Les incendies provoqués par les feux de brousse, avant la saison des pluies, peuvent être intentionnels et visent à produire un pâturage de meilleure qualité pour le bétail, ou involontairement, lorsqu’il s’agit d’extensions non maîtrisées, de feux allumés en vue de la culture sur brûlis. En moyenne, 435 000 Ha sont brûlées chaque année durant la période 1991-1995. Dans la région de Mahajanga, 181 973 Ha sont brûlés durant 10 ans et ces feux se propagent surtout sur la plaine de Tampoketsa où l’espèce subsiste. Dans la région de Fianarantsoa, la superficie détruite durant 10 ans est de 88 739 Ha (PACT, Août 2000 in : TBE, 2002), alors que l’espèce y subsiste.

c) La surexploitation
L’une des grandes menaces est l’exploitation intense et massive, la collecte intensive et destructive, le commerce local et national illicite dont ces plantes font l’objet. A cela s’ajoute la disparition progressive des habitations, pouvant réduire ces populations au niveau de la survie de leurs espèces. En effet, c’est la grande famille des CRASSULACEAE (surtout Kalanchœ), avec 119 espèces, qui figurent parmi les familles des plantes grasses les plus riches en espèces ornementales commercialisées (Monographie de la Biodiversité, 1998).

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Approche méthodologique- Expérimentations
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La surexploitation massive constitue donc une menace pour ces espèces qui sont très prisées : en horticulture, à cause de leur port : une forme en rosette, feuille charnue persistante toujours verte, et surtout la couleur de la fleur et de l’inflorescence en dichasium. En médecine traditionnelle : le jus des feuilles après broyage est fortement tonifiant, avec un goût parfois amer. En pharmacologie : les extraits contiennent plusieurs alcaloïdes possédant des propriété anti-cancéreuse et immunostimulants.

d) L’exploitation des carrières
On a observé aussi que les exploitations des matières premières (activités minières) peuvent dégrader les milieux naturels de l’espèce. Un des exemples le plus évident est l’exploitation de carrière qui constitue surtout un grand impact des phénomènes géologiques sur l’environnement et l’habitat naturel de l’espèce poussant surtout sur les dômes granitiques ou rochers cristallins. En effet, la carrière n’est pas sélective pour toutes les roches. Elle exploite n’importe quelle roche cristalline et surtout des roches granitiques sauf les roches d’altération. La production journalière d’une carrière granitique est en moyenne 250 à 450 m3 (TSIKABY Leguy, 1996). Ces carrières produisent plusieurs autres causes néfastes comme l’empierrement des rizières et des champs aux proximités de la carrière. Cette exploitation constitue donc une très grande menace car on a tendance à minimiser impacts de ces activités par rapport aux ouvrages édifiés.

II.1.1.2 Autres critères de menaces indirecte : manques d’information
En effet, on constate qu’il y a peu de données et de renseignements concernant l’espèce, les travaux relatifs à son étude se résument seulement à quelques ouvrages et thèses d’où un manque de connaissance contribuant aux sous valorisations de l’espèce et entraînant la favorisation de sa destruction. Les données recueillies sont faibles et ne portent l’attention que sur sa richesse floristique, comme plante grasse ornementale. La propriété phytochimique de l’espèce est en cours d’étude et porte surtout sur ses vertus thérapeutiques comme plante immunostimulante.

II.1.2.3 Difficultés inhérentes à la physiologie de l’espèce
L’espèce se reproduit par stolon or une plante n’émet que deux stolons opposés chaque année et ces derniers ne se détachent de la plante mère qu’après 5 à 6 mois. Dans des conditions très rares, des bourgeons se développent sur les racines latérales mais très lentement. Les jeunes poussent provenant de ce mode de reproduction arrivent très rarement à maturité. Ces nombreuses menaces dites directe et indirecte constituent des problématiques en amonts, concernant l’espèce proprement dite. A partir de ces diverses menaces, les activités que nous allons entreprendre seront l’enrichissement de la base de donnée contribuant ainsi à sa valorisation et adoptée un protocole expérimental pour la multiplication en nombre "in vitro". Plusieurs techniques et méthodes existent déjà et entrepris et exploités par de nombreux centre de recherches concernant plusieurs espèces, seulement d’autres problèmes subsistent quant à

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Approche méthodologique- Expérimentations
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l’application de ces méthodes et techniques sur la multiplication en nombre de l’espèce et sa régénération constituant d’autres problèmes dite en avals.

II.1.2.4 Difficultés inhérentes à la technique de multiplication
Comme la méthodologie adoptée pour palier à ces divers problèmes, est la multiplication en nombre à partir des techniques de germination et de culture "in vitro", on constate aussi qu’on est en présence d’autres problèmes concernant l’adoption de ces techniques. En effet, pour la régénération "in vitro", les protocoles déjà émis et testés sont propres à chaque espèce, et varient surtout avec sa nature (ligneuse ou non ligneuse). Les protocoles existants sont donc non adaptés à notre espèce. Quant à la multiplication "in vitro", le problème reste le même, il n’y a pas de protocole universel et adéquat pour toute espèce confondue. Les protocoles varient suivant des critères et les matériels dont on dispose. La difficulté réside surtout dans la nature de l’espèce qui est une plante non ligneuse et crassulescente. L’espèce ne possède pas ni de ramification latérale donc pas de bourgeon axillaire ni de tige bien définie : des explants idéaux pour une multiplication "in vitro".

II.1.2 Hypothèse
A partir de ces problématiques, on constate que le nombre d’individu diminue progressivement : et les jeunes plants juvéniles issus de la germination et la multiplication par stolon ne constituent qu’une formation basse et trop lente. Ainsi, la solution immédiate serait d’essayer de limiter cette diminution en essayant d’augmenter artificiellement le nombre d’individus à partir de techniques de germination des graines et de la régénération "in vitro". Diverses hypothèses ont été alors émises: L’hypothèse générale stipule donc une maîtrise des techniques de multiplication végétative pour l’espèce. En effet, il existe diverses techniques de culture "in vitro" permettant de multiplier en nombre les espèces mais que chaque espèce possède sa propre technique de mise en culture. Ainsi, il n’existe pas donc de protocoles adéquats ou universels car divers facteurs intrinsèques (biologie et physiologie) et facteurs extrinsèques (facteurs environnementaux) influent cette multiplication. L’élaboration de protocoles expérimentaux pour la germination et la multiplication "in vitro" sera donc nécessaire. Mais comme les facultés germinatrices et le taux de régénération de l’espèce dépendent surtout de plusieurs facteurs entre autre la décontamination des explants et l’élaboration de milieux de culture, plusieurs hypothèses spécifiques sont énumérées: hypothèse spécifique 1: la propriété germinative et la taux de régénération de l’espèce dépendent des protocoles de décontamination. hypothèse spécifique 2: la propriété germinative et le taux de régénération dépendent de divers facteurs extrinsèques comme la luminosité, la température et les milieux de culture.

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Approche méthodologique- Expérimentations
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II.1.3 Objectifs
L’objectif général de ce travail est la conservation "ex situ" de l’espèce par l’adoption de technique de multiplication "in vitro" par voie générique (à partir de la graine) et par voie végétative (à partir des organes végétatives). Les objectifs spécifiques sont : - l’élaboration de protocole de décontamination, c’est-à-dire élaboration de protocole de stérilisation et de désinfection pour les graines et protocole de stérilisation et de désinfection des explants (feuille et méristème) pour la culture "in vitro". - l’établissement de protocole de mise en culture, c’est-à-dire élaboration de protocole pour la germination des graines et l’élaboration de protocole pour la régénération en plantules. Tableau 7 : Rappel de la méthodologie adoptée
Hypothèse générale Hypothèses spécifiques Indicateur Objectivement Vérifiable Méthodes Dispositifs

Hg1 : il existe des facteurs qui ont une influence sur la faculté germinative des graines et sur la régénération des explants "in vitro"

H sp1 : la propriété germinative des graines et le taux de régénération des explants dépendent du protocole de décontamination H sp2 : la propriété germinative et le taux de régénération dépendent des facteurs extrinsèques : luminosité, température et milieu de culture.

Indice de vérification ou indice de confirmation : probabilité de retour

Analyse de variance suivie du test de
NEWMAN et KEULS au seuil

de 5% par le logiciel Statitcf version4 Analyse de variance suivie du test de
NEWMAN et KEULS au seuil

1 facteur à Randomisation totale (pas d’influence de bloc)

Indice de vérification ou indice de confirmation : probabilité de retour

de 5% par le logiciel Statitcf version 4

3 factoriels à Randomisation totale (pas d’influence de bloc)

II.1.4 Cadre méthodologique
La méthodologie effectuée, afin d’atteindre les objectifs fixés, se divisent donc en trois partie, à savoir: la récolte de données, suivie de l’analyse et enfin l’expérimentation au laboratoire.

II.1.4.1 Récolte de données
La récolte de donnée s’est effectuée en deux grandes parties : la recherche bibliographique et la descente sur terrain.

a) Recherche bibliographique
La recherche bibliographique consiste à améliorer les données et connaissances concernant l’espèce et les différentes techniques de multiplication "in vitro" qu’on pourrait appliquer à notre

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Approche méthodologique- Expérimentations
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espèce. En plus, des stages et entretiens dans des laboratoires de recherches ont été nécessaires pour se familiariser avec les diverses techniques. Les données recueillies vont donc servir de base dans l’expérimentation.

b) Descente sur terrain
La descente sur terrain a été effectuée dans plusieurs endroits de l’île à savoir : Ambatokely, Antongona, Manerinerina, Ambalavao et Ampanihy. Elle a pour but d’enrichir les connaissances en effectuant des enquêtes ethnobotaniques auprès des populations locales et les tradipraticiens concernant les autres vertus de la plante et ses utilisations. De plus, elle nous a permis d’effectuer la récolte du matériel végétal pour les expérimentations.

II.1.4.2 Analyse des données
L’analyse de données consiste à l’exploitation des informations recueillies, en ce qui concerne le matériel d’étude et les techniques de multiplication végétative. Pour la culture "in vitro", l’analyse des données se rapporte à la détermination des activités à entreprendre et de connaître les différents facteurs et variables à tester pour l’expérimentation. Un des objectifs de cette étude est aussi de mettre en exergue la relation étroite entre les études morphologiques, écologique et surtout physiologique de l’espèce et l’adoption de techniques de multiplication végétative correspondante.

II.1.4.3 Expérimentation au laboratoire
L’expérimentation des techniques s’est effectuée au Centre de recherche CNRE-Tsimbazaza, au sein du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement de Tsimbazaza. Le stage effectué a duré huit (8) mois et l’expérimentation proprement dite a duré environ sept mois après la récolte des matériels d’étude dont les graines et les explants végétatifs. Par conséquent, on a ainsi adopté deux techniques de multiplication "in vitro": la première technique consiste à la germination des graines de l’espèce "in vitro" afin de déterminer la vitesse et la capacité de germination des graines au laboratoire et la deuxième technique consiste à la régénération de l’espèce par voir végétative, c’est-à-dire, à partir de méristème et d’organe foliaire afin de déterminer le taux de régénération de l’espèce. Chaque expérimentation (germination de graine et régénération en plantule) est indépendante mais les deux techniques ont été effectuées en parallèle pour un gain de temps. En effet, les manipulations au laboratoire suivies des répétitions successives pour les traitements statistiques demandaient beaucoup de temps. La démarche méthodologique est représentée dans le tableau 8 suivant :

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Approche méthodologique- Expérimentations
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Tableau 8 : La démarche méthodologique adoptée

RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES CIV ESPECE STAGE AU LABORATOIRE DESCENTE SUR TERRAIN

ENTRETIEN ET RECHERCHE SUR LA CULTURE " in vitro"

PROSPECTION, RECOLTE DE MATERIEL D’ETUDE

ELABORATION DE PROTOCOLE DE RECHERCHE de CIV

ELABORATIONS DE FICHES TECHNIQUES DE L’ESPESCE

MISE EN PLACE DES DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX "IN VITRO"

ESSAIS DE MISE EN CULTURE POUR LA GERMINATION ET LA CULTURE "IN VITRO"

TRAITEMENT DE DONNEES

REDACTION

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Approche méthodologique- Expérimentations
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II.2 MATERIELS ET METHODES II.2.1 Germination "in vitro" des graines de Kalanchoe synsepala (BAKER)
Pour la pérennisation de l’espèce, une étude sur la germination a été entreprise pour évaluer la capacité et la potentialité des graines à germer, dans des conditions expérimentales bien définies. Il s’agit en outre de mettre en évidence la propriété germinative des graines de l’espèce. Des études ultérieures avaient été effectuées sur des essais de germination des graines. Le taux de germination dans trois localités a montré une très bonne capacité des graines à germer (RABOTOVAO L, 1987). Dans notre étude, il s’agira d’élaborer les protocoles de décontamination et de germination "in vitro" des graines.

II.2.1.1 Matériels a) Le matériel végétal
Le matériel d’étude est la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER), les récoltes sur terrain ont porté essentiellement sur des fruits à maturité. Le fruit est un follicule comprenant de nombreuses graines très petites et présentant des ornementations (RABOTOVAO L, 1993). Des essais de germination ont été effectués sur les écotypes cités ci-dessous dont les caractéristiques des graines sont résumées dans le tableau 9 suivant: Tableau 9 : Les caractéristiques des graines suivant l’écotype

Kalanchoe synsepala Ecotype Nom vernaculaire Zahana Sofintsofiny Sofingoaika Sofimbato Mongy vola Famille Site de récolte S 18°53'146 EO 47°41’04 S 18°56'424 EO 47°16’99 S 18°05'125 EO 47°10’55 S 21°57’15 EO 46°44’33 S 24°41’802’ EO 44°41’52 Date de récolte Unité de dispersion

Poids de 1000 unités de dispersion (g) 0,0738 0,0687 0,0714 0,0708 0,0662

Ambatokely Antongona Manerinerina Ambalavao Ampanihy

C R A S S U L A C E A E

13/11/03 18/01/04 21/02/04 04/03/04 09/04/04

graine graine graine graine graine

Les semences étudiées ont été récoltées au début de la saison sèche (de Février à Mai), elles sont de petites tailles et celles-ci rendent plus difficiles leur tri et leur manipulation ; il s’effectue toujours sous loupe binoculaire ou sous un stéréoscope.

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Approche méthodologique- Expérimentations
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La dissémination des semences est, en général, assurée par le vent étant donné leur poids très faible et la présence des ornementations longitudinales autour des graines (Figure 6).

Figure 6 : Morphologie de la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER) vue au Microscope électronique à balayage (MEB)
4- Grossissement allant de 60 à 260, pour la taille de la graine (x 130) 5- Grossissement allant de 400 à 1 000, pour les sillons transversaux (x 800) 6- Grossissement allant de 2 200 à 4 500 pour l’ornementation des téguments (x 4 500)

On constate à travers ce schéma que les sillons de la graine sont collés aux téguments qui sont plissé-ridulés (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).

b) Le matériel technique
Plusieurs matériels de laboratoire, ont été utilisés pour la réalisation des divers essais : des bocaux, boites de Pétri, tube à essais en verre, divers produits (réactifs, hormones), un Ph-mètre, un autoclave, une balance de précision pour la préparation des milieux de culture. Une armoire de culture, une étuve bactériologique, une hotte à flux laminaire pour la culture proprement dite. Divers produits antiseptiques comme l’éthanol, l’hypochlorite de calcium et l’hypochlorite de sodium.

II.2.1.Techniques expérimentales
Pour la germination des graines, deux dispositifs expérimentaux ont été établis, le premier consiste à la décontamination et la deuxième consiste à la germination proprement dite.

a) Dispositifs pour la décontamination des graines
Il est primordial que les cultures "in vitro" soient dépourvues de champignons et bactéries. On arrive à ce résultat par stérilisation des récipients et des milieux de culture en autoclave, du matériel végétal par immersion dans des liquides antiseptiques. Les produits de décontamination testés sont des produits couramment utilisés : il s’agit de l’éthanol à 70°, l’hypochlorite de sodium (Na Cl O) et l’hypochlorite de calcium [Ca (O Cl2)] à différentes concentrations. Nous avons pris comme protocole de base, celui utilisé pour la désinfection des graines de
LEGUMINEUSES élaboré au CNRE (Travaux non publié), à savoir : un trempage des semences dans

de l’éthanol à 70° pendant 5 minutes, suivi d’un trempage dans l’hypochlorite de sodium (Na Cl O) à 12% pendant 5 minutes et d’un grand rinçage dans l’eau distillée stérile. On a fait varier la durée du trempage dans les produits antiseptiques sans en modifier la concentration (Tableau 10).

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Un autre protocole a été aussi testé, il a été appliquée à une espèce du genre Coffea au laboratoire de culture "in vitro" de l’IMRA. Il consiste en un trempage des explants dans l’éthanol à 70° pendant 1 minute et un trempage dans l’hypochlorite de calcium [Ca (O Cl2)] à 5% pendant 10 minutes. On a aussi fait varier le temps de trempage des graines (Tableau 11). Les résultats obtenus rapportent le nombre de graine germée donc non contaminée sur le nombre de graine inoculée, au bout de 30 jours de culture. Quatre essais ont été effectués et désignés sous le nom de Bloc. Chaque bloc est indépendant, c’est-à-dire qu’il n’y a aucune relation entre Bloc.

a.1) Avec Na Cl O à 12%
Tableau 10 : Dispositifs expérimentaux pour la décontamination des graines avec Na Cl O à 12%

Milieu de culture

Produits de désinfection et de stérilisation des graines Et OH à 70° / Na Cl O à 12% T1 : 0 min T2 : 0 min T3 : 5 min T4 : 5 min T5 : 5 min / / / / / 0 min 5 min 0 min 5 min 2 min 30 5 min 2 min30

Dispositifs expérimentaux 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc

Eau distillée + agar à 7 g/l

T6 : 2 min 30 / T7 : 2 min 30 /

a.2) Avec Ca (O Cl2) à 5%
Tableau 11 : Dispositifs expérimentaux pour la décontamination des graines avec Ca (O Cl2) à 5%
Produits de désinfection et de stérilisation des graines Et OH à 70° / Ca (O Cl2) à 5 % T8 : 0 min T9 : 0 min Eau distillée + agar à 7 g/l T10 : 10 min T11 : 30 s T12 : 1 min T13 : 30 s T14 : 1min / / / / / / / 0 min 10 min 0 min 10 min 10 min 15 min 15 min 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Répétitions de bloc, 30 graines par bloc

Milieu de culture

Dispositifs expérimentaux

Remarques: * 14 traitements différents ont été effectués concernant la décontamination des graines. Chaque traitement s’effectue avec trois (3) rinçages successifs dans de l’eau distillée stérile. * Pour avoir une reproductibilité des résultats, chaque traitement a été effectué quatre (4) fois, constituant les 4 blocs. Il est constitué de 30 graines réparties dans 3 boites de Pétri, ainsi, 10 graines

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sont ensemencées dans chaque boite et mis en culture dans une armoire de culture ou une étuve de germination. La répétition des traitements, a été nécessaire afin de tester l’homogénéité de l’essai.

b) Influences des facteurs pour la germination des graines
Pour la germination proprement dite des graines, divers facteurs ont été testés : - le facteur température : en effet, le taux de germination d’une semence varie souvent avec la température à laquelle elle est soumise. Les essais de germination s’effectuent dans une étuve à thermostat, permettant de stabiliser des températures allant de 20 à 65 °C et dans une armoire de culture avec une photopériode et une température variable. Ainsi, trois niveaux de température, basé sur les variations de température de l’atmosphère, ont été testés : T1 : 25 °C, T2 : 30 °C et T3 :35 °C. - le facteur lumière : l’analyse du comportement des graines de certaines espèces, éclairées à la lumière blanche a permis de les classer en trois catégories : semences à photosensibilité positive (activée par la lumière), semences à photosensibilité négative (inhibée par la lumière et activée par l’obscurité) et semences non photosensibles (germant aussi bien à la lumière qu’à l’obscurité). Pour notre expérimentation, deux conditions ont été définies : dans l’obscurité avec une étuve de germination et à la lumière blanche, dans une armoire de culture "in vitro". - les facteurs eau et milieu de culture : l’eau assure la reprise de la vie de la semence par un phénomène d’osmose et son lessivage par élimination des inhibiteurs tégumentaires s’il y en existe. Les prétraitements comme dénudation, scarification manuelle n’ont pas été appliqués car les graines ne semblent posséder aucune dormance inhibitoire des téguments (RABOTOVAO L, 1987). Pour respecter les conditions naturelles des semences et leur état de déficit hydrique, nous avons séché les semences dans une étuve à température variant de 30° jusqu’à 35°C pendant 4 semaines. Afin de tester la potentialité des semences à germer, nous avons élaboré quatre (4) milieux de culture. Les graines devraient donc germer et croître dans un milieu convenable jusqu’à ce qu’elles puissent être repiquées sur un milieu de croissance et développement. Tableau 12 : Les milieux de germination des graines élaborés

Désignation M1 M2 et M3 M4 -

Milieux de culture Eau gélosée à 7 g/l MS/2 : à Macro et micro-élément dilué de moitié Muraschige et Skoog (MS) MS/4 : à Macro et micro-élément dilué de quart Gressoft et Doy (GD)

l’eau gélosée à 7 g/l, comme milieu témoin, le milieu de culture de Muraschige et Skoog dilué de moitié (MS/2) (ANNEXE I) et dilué de le milieu de Gressoft et Doy. Les vitamines employées lors de la culture sont les

quart (MS/4), milieu fortement employé lors de culture "in vitro",
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compositions de la Vitamine de Morel, plus riches en Vitamine B5 indispensable pour les tissus en culture (ANNEXE II).

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Pour ces essais, on a testé les influences de facteurs : luminosité, température et milieu de culture sur la capacité de germination au bout de 30 jours de mise en culture et la vitesse de germination, au bout de 6 jours d’inoculation. Concernant l’étude de la germination proprement dite, un dispositif en "split-plot" a été effectué mesurant les effets des divers milieux de culture comme traitement principal, les influences de la température de l’armoire de culture et les effets de la luminosité de la chambre de mise en culture comme traitements subsidiaires (Tableau 13). Tableau 13 : Dispositifs expérimentaux pour la germination des graines Luminosité Température 25°C Milieu de culture Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 Bloc 4

Lumière

30°C

35°C

25°C

Obscurité

30°C

35°C

Remarques : * Les blocs représentent la répétition des essais de germination sur les mêmes milieux de culture * A chaque traitement effectué, correspondant à une température et un milieux de culture bien déterminée, le nombre de graines inoculées a été de 120, répartie dans 12 boites de Pétri, ce qui a fallu, pour l’ensemble des traitements 2 880 graines viables et triées.

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II.2.1.3 Critère de germination
Une graine est considérée comme germée lorsque la radicule a percé les téguments et lorsque la graine a donné une plantule capable de croître normalement, ce qui correspond à la phase de la germination (EVENERI, 1986 in : RABOTOVAO L, 1987). Le même auteur distingue en outre trois phases dans la germination, à savoir : une phase d’activation, une phase de mitose et une phase terminale d’allongement de la radicule. La germination présente plusieurs critères à savoir : le délai de germination, le pouvoir germinatif, la capacité de germination, la vitesse de germination, l’effet de stockage des semences etc. Pour notre étude, nous n’allons prendre en considération que deux critères qui sont : la capacité de germination et la vitesse de germination. - La capacité de germination est le pourcentage des graines capables de germer dans des conditions bien définies ; on calcule le rapport, exprimé en pourcentage, entre les semences germées et les semences semées et viables au bout de 30 jours de mise en culture. - La vitesse de germination est exprimée par le pourcentage de germination obtenu quelques jours après le semis (RAHAINGOSOLO Z et MAKA L, 1994). On a considéré la vitesse de germination comme le temps mis par les semences pour germer et celle-ci peut s’exprimer par le pourcentage de semences germées ou taux de germination, au bout de 6 jours après l’ensemencement.

II.2.1.4 Traitements de données
Les pourcentages de germination obtenus pour les différents traitements ont été soumis, à une analyse de variance suivie d’une comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5 % à l’aide du logiciel STAT-ITCF version 4. Pour chaque traitement, l’hypothèse nulle consiste à considérer que tous les niveaux de facteur étudié ont même effet. Le paramètre statistique le plus déterminant dans le tableau de l’analyse de variance est la valeur de la probabilité de l’interaction des deux facteurs étudiés. Lorsque celle-ci est inférieure à la valeur de la probabilité théorique (P = 0,05 dans notre cas), on parle de différence significative entre les traitements. Dans le cas contraire, les facteurs étudiés n’ont pas une interaction positive sur le paramètre mesuré. Lorsque les facteurs étudiés présentent une interaction significative, l’interprétation du tableau s’achève par l’application de test de NEWMAN et KEULS qui permet de distinguer les groupes de traitements statistiquement homogènes (ANNEXE IX). Dans les tableaux de résultats, les valeurs sont suivies d’une lettre ou d’un groupe de lettres. Dès qu’il y a une lettre commune entre deux valeurs, ces derniers appartiennent à un groupe homogène, c’est-à-dire qu’elles ne diffèrent pas significativement au seuil de probabilité P = 0,05. (GOUET J-P et PHILIPPEAU G, 1989).

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II.2.2 La culture " in vitro" de Kalanchoe synsepala (BAKER)
Pour notre expérimentation, nous avons adopté trois (3) techniques, à savoir : la culture de méristème, la culture d’organe différencié ou la micropropagation et l’embryogenèse somatique. L’objectif de la culture "in vitro" est de déterminer le protocole expérimental favorable pour la régénération de notre espèce : un protocole expérimental de désinfection élaboré et un protocole de régénération à partir d’organe végétatif différencié et non différencié. Il s’agit aussi de déterminer les relations entre les milieux de culture et les équilibres hormonaux avec la régénération de l’espèce.

II.2.2.1 Matériels
Le matériel végétal utilisé en culture "in vitro" est appelé : "explant ". - Pour la culture de méristème, l’explant utilisé est le méristème apical de l’espèce, mesurant au plus 2 mm, de poids insignifiant et de couleur blanchâtre tacheté de rose. Il est de taille réduite, d’où la nécessité d’une loupe binoculaire pour le prélever à l’aide d’un scalpel très fin, sous une hotte. Cette technique exige une délicate attention car il n’y a qu’un seul méristème apical sur une plante. - Pour la micropropagation et l’embryogenèse somatique, les explants utilisés sont de jeunes feuilles prélevées dans des conditions aseptiques. On a utilisé deux types de feuilles : celles issues de plantes récoltées dans leur milieu naturel et celles des jeunes plantules issues de la germination.

II.2.2.2 Méthodes de travail
La première partie du travail consistera à l’induction de cal ou callogenèse, puis à l’obtention de bourgeonnement végétatif, c’est-à-dire des microfeuilles ou de plantules. Ces résultats seront obtenus à partir des équilibres hormonaux effectués. Après, les produits obtenus : des cals friables et des bourgeonnements végétatifs seront repiqués sur d’autres milieux, qui constituera la deuxième partie de notre travail : la régénération en plantule.

a) Partie I : Induction de cal et bourgeonnement végétatif
Pour l’obtention du cal, il s’agit d’exploiter surtout la propriété de totipotence cellulaire, c’est-àdire, provoquer à partir d’un équilibre hormonal la dédifférenciation cellulaire de l’explant mis en culture pour la formation d’un amas de cellules indifférenciées ou cal. Pour l’induction de bourgeons foliaires néoformés, il s’agit de stimuler les capacités naturelles de multiplication végétative de l’espèce par l’induction d’une nouvelle organogenèse de bourgeons et de racines.

a.1) Méthode de stérilisation et désinfection
Les explants utilisés "in vitro" devront être toujours stérilisés car des contaminants, se développant très rapidement dans le milieu nutritif vont endommager tout l’ensemble du milieu jusqu’à l’épuisement et entraînant la destruction et la dégénérescence de l’explant mis en culture. Les produits de stérilisation des explants sont les mêmes que pour les graines, à savoir le l’éthanol à 70° : ce produit favorise aussi la pénétration des agents secondaires, ensuite, l’hypochlorite

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de calcium à 5% ou l’hypochlorite de sodium à 12%. Le rinçage dans l’eau distillée stérile est nécessaire, à cause de la toxicité des produits antiseptiques, pour les tissus mis en culture.

a.2) Mise en culture ou inoculation
Après stérilisation des explants, ils seront mis en culture sur des milieux nutritifs à composition variable suivant les objectifs à atteindre, dans des boites de Pétri et placés dans l’armoire de culture. La mise en culture de l’explant se fait comme suit : on prélève l’explant stérilisé et décontaminé avec une pince stérile, sous hotte à flux laminaire, et on le pose délicatement dans une boite de Pétri en verre ou dans un tube à essai stérile contenant environ 25 ml de milieu nutritif gélosé choisi et les substances organiques additives. Ensuite, la boite de Pétri ou le bocal en verre devra être recouverte et entourée d’une couche de film alimentaire pour éviter toute contamination venant de l’extérieur et maintenir l’humidité relative dans la boite de Pétri. Les explants sont cultivés dans des conditions standards: 28 °C, sous une intensité lumineuse continue de 1200 lux ou une photopériode de 18/6 h et une humidité relative d’environ 70%. Ces conditions internes de mise en culture sont les conditions optimales pour la régénération « in vitro ».

a.3) Critères d’évaluation
Des critères communs sont nécessaires pour évaluer l’efficacité de la technique utilisée et pour faciliter les échanges d’information entre techniciens et chercheurs. Ainsi, ce critère d’évaluation a été déjà proposé dans la régénération du bananier effectué par HANNELORE STROSSE et al, 2000. Des indicateurs qualitatifs et quantitatifs relatifs ont été proposés et suivis : a.3.1) Formation de cals idéaux Pour la technique de la culture de méristème, % de cals idéaux = nombre de cals idéaux / nombre de méristème inoculés Pour la technique de la micropropagation, % de cals idéaux = nombre de cals idéaux / nombre d’explant inoculés. Le cal idéal et de bonne qualité est formé par des agrégats cellulaires homogènes. Cette homogénéité est observée après de nombreux mois de culture. a.3.2) Etablissement de suspensions cellulaires embryogènes ou SCE Pour les deux techniques de culture "in vitro", % de SCE = nombre de SCE / nombre de cals idéaux (CI) placés en milieu de culture a.3.3) Formations d’embryons Le nombre d’embryons obtenu par volume de cellules étalées est le critère clé qui permet d’évaluer la qualité d’une suspension. Par exemple, 1 ml de cellules sédimentées peuvent générer entre 100 et 300 000 embryons (GRAPIN et al. 1996, COTE et al. 1996, STROSSE et al. Sous presse) Taux de réussite de formation d’embryons = nombre d’embryons / ml de cellules étalées

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a.3.4) Potentiel de régénération Le pourcentage de germination est souvent utilisé pour évaluer le processus de régénération. Les critères suivants ont été proposés : % de germination = nombre de plantules d’embryons obtenues / nombre d’embryons mis sur un milieu de germination Une autre façon d’évaluer les résultats du processus de régénération est de calculer la capacité de régénération. Capacité de régénération = nombre de vitroplants produits / ml de cellules étalées (HANNELORE
STROSSE

et al, 2000).

a.4) Choix du dispositif expérimental et expérimentations a.4.1) Dispositifs expérimentaux pour la stérilisation et la désinfection des explants Pour la stérilisation des explants employée dans les trois techniques proposées au départ, les produits déjà utilisés lors de la décontamination des graines ont été proposés. La seule modification réside dans les temps de trempage des explants. Il s’agit ensuite de déterminer à partir de plusieurs essais les durées de trempage optimales pour la décontamination des explants. On a donc établi plusieurs dispositifs pour la décontamination. a.4.2) Dispositifs expérimentaux pour la culture "in vitro" Après acquisition du protocole de décontamination des explants, il reste à élaborer le protocole de mise en culture de l’espèce. Les travaux consisteront à élaborer les milieux de culture et les équilibres hormonaux favorables pour la régénération "in vitro". Les milieux de culture expérimentés seront le milieux de MURASCHIGE et SKOOG (1962) et le milieu de GRESSHOFF et DOY (1974). Notons que l’ajout d’un anti-oxydant a été nécessaire dans les milieux nutritifs car l’espèce contient de nombreux composés phénoliques mis en évidence avec l’apparition de tâche violette et sombre tout autour des explants mis en culture au bout de quelques jours d’inoculation. Les produits de l’oxydation sont toxiques pour les explants inoculés. Les antioxydants sont des produits courants de laboratoire comme l’acide citrique, le charbon actif etc. Pour les régulateurs de croissance, les équilibres hormonaux entre auxine et cytokinine choisis seront en fonction des objectifs fixés. Dans notre cas, les objectifs sont respectivement, la régénération de l’espèce avec l’obtention de micro feuilles ou le développement de système racinaire des explants. Ensuite, avec l’obtention de cals friables qui donneront des embryons mâtures, chaque embryon donnera ensuite une plantule génétiquement identique à l’espèce.

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Approche méthodologique- Expérimentations
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b) Partie II : Régénération en plantules
L’objectif, pour cette deuxième partie du travail, consiste à la régénération en plantules des embryons individuels et des bourgeons foliaires avec des repiquages sur un milieu d’enracinement. Il s’agit, dans ce cas, d’effectuer une technique de microbouturage "in vitro" des explants sur de nouveaux milieux d’induction de racine. Comme l’objectif fixé auparavant, était la propagation en nombre des individus, on a aussi élaboré d’autre milieux pour induire de nouveaux une embryogenèse somatique pour la formation de cal friable et donc, pour avoir plus de plantules régénérées.

b.1) Méthode de travail
La méthode de travail consiste à repiquer les explants obtenus (embryons individuels et microfeuilles) sur de nouveaux milieux de culture pour la régénération en plantules. Les embryons (embryogenèse somatique) et les microfeuilles (culture de méristème et micropropagation) obtenus sont détachés et éparpillés. On choisira les explants plus vigoureux et plus mâtures avec un scalpel stérile sous hotte, et on les repique des bocaux stériles contenant le milieu de culture choisi pour l’induction de la rhizogénèse afin d’obtenir des plantules ou "vitroplant". Les milieux de culture choisis pour la rhizogénèse et l’induction de cal ont été des milieux de culture établis pour la régénération du bananier, un milieu de culture établis par des chercheurs du Laboratory of Tropical Crop Improvement de KULeuven et du laboratoire de biologie cellulaire du Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement (Cirad, laboratoire Biotrop).

b.2) Choix du dispositif et expérimentation
Pour la régénération et la multiplication "in vitro" de l’espèce, il s’agit surtout de multiplier l’espèce en grand nombre, par conséquent, pour le choix de notre dispositif expérimental, nous avons choisi ces deux techniques à employer. - pour l’induction de la racine et la régénération des embryons et microfeuilles, un milieu d’enracinement constitué par le milieu MS dilué de moitié avec l’équilibre hormonal favorisant le développement racinaire. - pour la régénération des microfeuilles issus de la culture de méristème et la micropropagation, deux milieux de repiquage, le premier pour induire l’enracinement et le deuxième milieu pour un nouveau induction de cal.

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Résultats et interprétations
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PARTIE III : RESULTATS et INTERPRETATIONS III.1 Résultats des essais sur la germination des graines III.1.1 Résultats des essais sur la décontamination des graines III.1.1.1 Avec Na Cl O à 12%
Les résultats par bloc déterminent le rapport entre le nombre de graine non contaminé et qui ont germé sur le nombre de graine inoculé. Ainsi, au bout de 30 jours d’inoculation, dans une étuve de germination et à une température optimale variant de 26 à 28°C. Les résultats sont consignés dans le tableau 14 ci-dessous. Tableau 14 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination par Na Cl O à 12%

Milieu de culture

Eau distillée + agar à 7 g/l

Produits de désinfection et de stérilisation des graines Et OH à 70° / Na Cl O à 12 % T1 : 0 min / 0 min T2 : 0 min / 5 min T3 : 5 min / 0 min T4 : 5 min / 5 min T5 : 5 min / 2 min 30 T6 : 2 min 30 / 5 min T7 : 2min 30 / 2min 30

Bloc 1

Bloc 2

Bloc 3

Bloc 4

0/30 1/30 1/30 1/30 28/30 15/30 19/30

1/30 2/30 0/30 2/30 21/30 17/30 21/30

0/30 1/30 2/30 2/30 27/30 11/30 18/30

0/30 0/30 1/30 3/30 29/30 8/30 15/30

III.1.1.2 Avec Ca (O Cl2) à 5%
Avec ce deuxième type de détergent, le dispositif expérimental effectué est le même, en variant le temps d’immersion des semences dans les produits, tout en gardant constant le milieu de culture. Les résultats sont montrés dans le tableau 15 suivant : Tableau 15 : Résultats bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Ca (O Cl2) à 5%
Produits de désinfection et de stérilisation des graines Et OH à 70° / Ca (O Cl2) à 5 % T8 : 0 min / 0 min T9 : 0 min / 10 min T10 : 10 min / 0 min T11 : 30 s / 10 min T12 : 1 min / 10 min T13 : 30 s / 15 min T14 : 1min / 15 min

Milieu de culture

Bloc 1

Bloc 2

Bloc 3

Bloc 4

Eau distillée + agar à 7 g/l

1/30 0/30 1/30 3/30 25/30 23/30 15/30

0/30 0/30 2/30 11/30 28/30 30/30 21/30

1/30 1/30 1/30 2/30 27/30 27/30 9/30

0/30 0/30 0/30 8/30 22/30 23/30 18/30

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Résultats et interprétations
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III.1.1.3 Traitements des données a) Analyse de variance
Les résultats de l’analyse de variance sont consignés dans le tableau 16 suivant: Tableau 16 : Analyse de variance de l’effet des détergents sur le taux de germination
S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. RESIDUELLE1 4723.5 4516.5 2.9 D.D.L 38 13 105 CARRES MOYENS 124.30 347.42 0.02 TEST F. 41.96 PROBA 0.0000 2.88 28.8% E.T C.V

DISPOSITIF INITIAL DE L’ESSAI : RANDOMISATION TOTALE NOMBRE D’OBSERVATIONS : 56 NOMBRE DE VARIABLES : 5
Source : Logiciel Statitcf

Interprétation La valeur calculée de F dans le tableau est supérieure à la valeur de F donnée par la table de
SNEDECOR pour le DDL correspondant. En plus, la probabilité calculée du facteur étudié est égale

à

0 donc inférieure à la probabilité théorique P = 0,05 (5%). Par conséquent, on peut dire qu’il y a une différence significative entre les 14 traitements effectués. Ainsi, on procède alors à un test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5%, pour connaître le ou les traitements prépondérant(s).

b) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
Tableau 17 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur l’effet des détergents
FACTEUR 13 12 5 7 14 6 11 4 10 2 8 3 1 9
Source : Logiciel Statitcf

LIBELLES T13 T12 T5 T7 T14 T6 T11 T4 T10 T2 T8 T3 T1 T9

MOYENNES 26.67 26.67 25.33 19.33 15.00 14.33 5.33 1.67 1.33 1.33 1.00 1.00 0.50 0.50

GROUPES HOMOGENES A A A B B B C C C C C C C C

Interprétation D’après le test de NEWMAN et KEULS, les 14 traitements ont été regroupés en trois groupes homogènes différents: A, B et C suivant leurs moyennes respectives. On constate que les traitements T13 :1 min/10 min avec Ca (O Cl2), T12 :30s/15 min avec Ca (O Cl2) et T5 : 5 min/2 min 30

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Résultats et interprétations
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avec Na Cl O à 12% forment un même groupe homogène A ayant la moyenne la plus élevée, par conséquent, ce sont les traitements adéquats pour la germination des graines. Nous pouvons en conclure que, la décontamination des graine est réussi en utilisant deux produits détergents à base de chlore : avec l’hypochlorite de sodium et l’hypochlorite de calcium à différente concentration et ayant leur durée de trempage respective, suivie toujours d’un rinçage à l’eau distillée stérile 3 fois successives. Les courbes représentatives du pourcentage de germination des graines avec les produits de antiseptiques Na Cl O à 12% et Ca (O Cl2) à 5% sont montrées respectivement dans la figure 7 et figure 8 suivantes. Les figures représentent le pourcentage de germination en fonction du nombre de jours de culture, relatives aux produits antiseptiques utilisés.
Courbe de germination de Kalanchoe synsepala à 12% avec avec NaClo12% Na Cl O à % de
germination 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
T1

jours 3 5 7
T2

9 11 13 15 17 19 21 23 25
T3 T4 T5 T6 T7

Figure 7 : Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Na Cl O à 12% Interprétation D’après les courbes représentant les taux de germination relatifs aux 7 traitements de graines, toutes les courbes présentent toutes une phase ascendante, jusqu’à un certain niveau et un palier représenté par une droite constante. La phase ascendante représente la vitesse de germination des graines à partir du premier jour d’inoculation et le palier à partir du 23ème jour, représente la capacité de germination des graines. En effet, à partir de ce moment, le taux de germination des graines ne varie plus et reste constant. On constate que la courbe représentant le traitement T5 est la plus élevée suivie des courbes T7, T6 et T4. Les courbes T3, T2 et T1 restent relativement inférieures et varient que très faiblement. Les résultats montrés par ces courbes représentatives vérifient les tests statistiques effectués auparavant. La courbe suivante (Figure 8) représente le pourcentage de germination des graines avec l’autre produit antiseptique Ca (O Cl2) à 5%.

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Résultats et interprétations
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% de germination 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1

Courbe de germination de Kalanchoe synsepala avec Ca (OCl)2 à 5%

avec Ca (O Cl2) à 5 %

jours 3
T'1

5

7
T'2

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
T'3 T'4 T'5 T'6 T'7

Figure 8 : Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Ca (O Cl2) à 5% Interprétation Les résultats obtenus à partir de ces courbes représentatives vérifient toujours les tests statistiques effectués concernant les protocoles de décontamination les plus appropriés pour l’espèce. D’après les résultats des expérimentations, le premier protocole de décontamination avec Na Cl O à 12 % est le traitement T5 : 5 min / 2 min 30, le deuxième protocole avec un autre produit de décontamination Ca (O Cl2) à 5% est celui de deux traitements : T12 : 1 min / 10 min et T13 : 30 s/ 15 min suivis toujours d’un rinçage à l’eau distillée stérile trois fois successives. Ces résultats nous montrent l’efficacité de l’action des détergents composés de chlore comme antiseptique très actif pour la destruction des bactéries et champignons, mais ces derniers devront être utilisés à des concentrations plus modérées pour ne pas détruire les graines mises en culture. Ainsi, c’est le protocole de décontamination avec le produit détergent Na Cl O à 12 % et le traitement T5 : 5 min / 2 min 30, que nous allons utiliser dans les suites des expérimentations, en testant les effets de divers facteurs (luminosité, température et milieu de culture) sur la capacité et la vitesse de germination des graines de l’espèce.

II.1.2 Résultats des essais sur la germination des graines III.1.2.1 Essais relatifs à la capacité de germination
Les résultats des essais relatifs à la capacité de germination des graines de l’espèce sont obtenus au bout de 30 jours de mise en culture et résumés dans les tableaux 18 et 19 suivants.

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Résultats et interprétations
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Tableau 18 : Résultats bruts des essais relatifs à la capacité de germination de l’espèce
Luminosité Température Milieu de culture Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 Bloc 4

25°C

Lumière

30°C

35°C

25°C

Obscurité

30°C

35°C

Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD

0/30 1/30 15/30 1/30 17/30 11/30 19/30 1/30 09/30 06/30 11/30 3/30 07/30 01/30 07/30 1/30 10/30 1/30 17/30 1/30 1/30 0/30 1/30 3/30

1/30 2/30 10/30 2/30 19/30 09/30 21/30 2/30 08/30 09/30 21/30 01/30 11/30 12/30 10/30 2/30 11/30 2/30 20/30 2/30 10/30 3/30 2/30 01/30

0/30 1/30 08/30 2/30 28/30 02/30 18/30 2/30 11/30 01/30 07/30 2/30 10/30 09/30 08/30 2/30 08/30 7/30 12/30 2/30 1/30 0/30 1/30 2/30

0/30 0/30 11/30 3/30 20/30 10/30 10/30 10/30 07/30 08/30 13/30 08/30 20/30 03/30 21/30 3/30 09/30 10/30 11/30 4/30 0/30 0/30 0/30 0/30

III.1.2.2 Essais relatifs à la vitesse de germination
Les résultats, obtenus dans un intervalle de temps fixé, au bout de 6 jours de mise en culture, Tableau 19 : Résultats bruts des essais relatifs à la vitesse de germination de l’espèce
Luminosité Température 25°C Milieu de culture Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Eau gélosée MS/2 MS/4 GD Bloc 1 0/30 1/30 5/30 1/30 6/30 3/30 6/30 0/30 3/30 2/30 3/30 1/30 2/30 0/30 2/30 0/30 3/30 0/30 6/30 0/30 0/30 0/30 1/30 1/30 Bloc 2 1/30 1/30 4/30 1/30 7/30 3/30 7/30 1/30 2/30 3/30 7/30 0/30 2/30 4/30 3/30 0/30 3/30 0/30 7/30 0/30 3/30 1/30 0/30 0/30 Bloc 3 0/30 0/30 3/30 1/30 9/30 1/30 6/30 1/30 4/30 1/30 2/30 1/30 3/30 3/30 2/30 0/30 2/30 2/30 4/30 1/30 0/30 0/30 1/30 1/30 Bloc 4 0/30 0/30 1/30 1/30 7/30 3/30 9/30 1/30 6/30 3/30 4/30 3/30 6/30 1/30 6/30 1/30 3/30 3/30 3/30 1/30 0/30 0/30 0/30 0/30

Lumière

30°C

35°C

25°C

Obscurité

30°C

35°C

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Résultats et interprétations
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III.1.2.3 Traitements des données a) Analyse de variance de l’effet des facteurs sur la capacité de germination
Les résultats de l’analyse de variance sont indiqués dans les tableaux 20 et 21 suivantes: Tableau 20 : Analyse de variance de l’effet des facteurs sur la capacité de germination
CARRES MOYENS 42.47 108.38 272.38 402.28 259.62 15.82 48.07 61.49 13.20

S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. FACTEUR2 VAR. FACTEUR3 VAR.INTERF1*2 VAR.INTERF1*3 VAR.INTER 2*3 VAR.INTER1*2*3 VAR.RESIDUELLE 4034.50 108.38 544.75 1206.83 519.25 47.46 288.42 368.92 950.50

D.D.L 95 1 2 3 2 3 6 6 72

TEST F. 8.21 20.63 30.47 19.67 1.20 3.64 4.66

PROBA 0.0045 0.0000 0.0000 0.0000 0.3165 0.0034 0.0005

E.T

C.V

3.63

52.8%

NOMBRE D’OBSERVATIONS : 96 NOMBRE DE VARIABLES : 9 DISPOSITIF DE L’ESSAI : FACTORIEL 3 FACTEURS EN RANDOMISATION TOTALE
Source : Logiciel Statitcf

b) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
Tableau 21 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%

FACTEUR 1 1 2 1 2 2 1 2 1 1 2 1 2 1 1 2 2 2 1 2 1 2 2 1 2 2 2 3 1 1 1 2 3 2 1 3 2 2 3 3 2 1 1 3 1 3 3 1 1 3 3 3 1 3 3 1 1 2 2 2 2 4 4 1 4 4 4 4 2 3 2 1

LIBELLES Lum-30-gel Lum-30-ms/4 Obs-30-ms/4 Lum-35-ms/4 Obs-25-gel Obs-25-ms/4 Lum-25-ms/4 Obs-30-gel Lum-35-gel Lum-30-ms/2 Obs-25-ms/2 Lum-35-ms/2 Obs-20-ms/2 Lum-30-gd Lum-35-gd Obs-35-gel Obs-30-gd Obs-25-gd Lum-25-gd Obs-35-gd Lum-25-ms/2 Obs-35-ms/4 Obs-35-ms/2 Lum-25-gel

MOYENNES 21.00 17.00 15.00 13.00 12.00 11.50 11.00 9.50 8.75 8.00 6.25 6.00 5.00 3.75 3.50 3.00 2.25 2.00 2.00 1.50 1.00 1.00 0.75 0.25 A A A B B B B B B B

GROUPES HOMOGENES

C C C C C C C C

D D D D D D D D D D

E E E E E E E E E E E

F F F F F F F F F F F

G G G G G G G G G G G G G G G G G

H H H H H H H H H H H H H H H H

Source : Logiciel Statitcf

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Résultats et interprétations
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Interprétation D’après l’analyse de variance, on constate que pour les facteurs étudiés : facteur luminosité (F1), facteur température (F2), facteur milieu de culture (F3), et les interactions entre facteur F 1*2, F 2*3 et F 1*2*3 ; les probabilités calculées sont toutes inférieures à 0,05. Seule la probabilité calculée de l’interaction de facteur F 1*3 est supérieure à la probabilité théorique P = 0,05. Ainsi, on peut affirmer qu’il y une différence significative entre les facteurs étudiés : luminosité, température et milieu de culture et qu’il y a aussi une grande interaction ou interdépendance entre les facteurs: lumièretempérature, température-milieu de culture et surtout entre ces trois facteurs lumière-températuremilieu de culture. Pour l’interaction entre facteur F1*3, la probabilité est supérieure à la probabilité seuil, par conséquent, on peut dire qu’il n’y a pas d’interaction ou d’interdépendance entre le facteur lumière et le facteur milieu de culture. On procède après à un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour vérifier les groupes homogènes de chaque facteur étudié. D’après le test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, on constate la présence de 8 groupes homogènes, selon les interactions entre les trois facteurs F1, F2 et F3 étudiés et suivant leurs moyennes respectives. On peut tirer alors les groupes homogènes prépondérants (groupe A avec des moyennes plus élevées) ainsi que les interactions des facteurs qui sont les plus importantes, à savoir : l’interaction entre facteur luminosité-température-milieu de culture: lumière-30°C-eau gélosée, suivie du l’interaction entre facteur: lumière-30°C-MS/4, et l’interaction entre facteur : obscurité30°C-MS/4. On constate à partir de ces résultats que l’interaction entre trois facteurs (luminosité, température, et milieu de culture) joue un rôle prépondérant dans la capacité de germination. On obtient ainsi un pourcentage de germination plus élevé des graines au bout de 6 jours d’inoculation, dans une meilleure condition d’asepsie et de mise en culture en maîtrisant parfaitement les facteurs: luminosité, température dans l’armoire de culture et les milieux de culture établis. On constate par ailleurs un taux de germination très élevé de l’espèce, aux environs de 75%, dans une condition parfaitement équilibrée et constante : dans une armoire de culture en présence de la lumière, sous une température de 30°C et dans un milieu eau gélosée (7g/l) ou dans un milieu MS/4 sans hormone. Seulement, les plantules obtenues au bout d’une semaine de culture sont très fragiles, à cause sans doute de leur taille, et ne peuvent subir aucun "stress", qui entraînerait rapidement leur dégénérescence. C’est à cause de cette grande vulnérabilité des jeunes plantules que la régénération naturelle par voie sexuée est très faible dans leur milieu d’origine. Ces trois facteurs étudiés : luminosité, température et milieu de culture sont donc les facteurs limitants pour la germination de l’espèce (loi du minimum) et il y a une interaction étroite entre ces trois facteurs.

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Résultats et interprétations
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c) Analyse de variance de l’effet des facteurs sur la vitesse de germination
Les résultats de l’analyse de variance sont indiqués dans les tableaux 22 et 23 suivants: Tableau 22 : Analyse de variance de l’effet des facteurs sur la vitesse de germination
CARRES MOYENS 5.32 24.00 30.01 50.79 24.03 1.08 10.84 7.03 1.53

S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. FACTEUR2 VAR. FACTEUR3 VAR.INTERF1*2 VAR.INTERF1*3 VAR.INTER2*3 VAR.INTER1*2*3 VAR.RESIDUELLE 504 .96 24.00 60.02 152.38 48.06 3.25 65.06 42.19 110.00

D.D.L 95 1 2 3 2 3 6 6 72

TEST F. 15.71 19.64 33.25 15.73 0.71 7.10 4.66

PROBA 0.0002 0.0000 0.0000 0.0000 0.5531 0.0000 0.0006

E.T

C.V

1.24

55.4%

NOMBRE D’OBSERVATIONS : 96 NOMBRE DE VARIABLES : 9 DISPOSITIF DE L’ESSAI : FACTORIEL 3 FACTEURS EN RANDOMISATION TOTALE
Source : Logiciel Statitcf

d) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
Tableau 23 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
FACTEUR 1 2 1 1 2 3 2 2 3 2 1 3 1 3 1 2 1 1 1 1 3 1 3 3 2 2 1 1 3 2 1 2 2 2 2 2 1 3 4 1 1 4 2 1 2 2 3 4 2 3 1 1 2 4 1 1 2 2 3 3 2 2 4 1 1 1 2 1 4 2 3 2 LIBELLES Lum-30-gel Lum-30-ms/4 Obs-30-ms/4 Lum-25-ms/4 Lum-35-gel Obs-25-gel Lum-25-ms/4 Lum-35-ms /4 Obs-30-gel Lum-35-ms/2 Lum-30-ms/2 Obs-30-ms/2 Lum-35-gd Lum-25-gd Obs-25-ms/2 Obs-35-gd Obs-35-gel Lum-30-gd Lum-25-ms /2 Obs-35-ms/4 Obs-30-gd Lum-25-gel Obs-35-gd Obs-35-ms/2 MOYENNES 7.25 7.00 5.00 4.25 3.75 3.50 3.25 3.00 2.75 2.50 2.50 1.25 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25 0.25 0.25 GROUPES HOMOGENES A A B B B B B B B B B C C C C C C C C C C C

D D D D D D D D D

E E E E E E E E E D D D D D D D

E E E E E E E E E E

Source : Logiciel Statitcf

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Résultats et interprétations
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Interprétation D’après l’analyse de variance, on constate que pour les facteurs étudiés: facteur luminosité (F1), facteur température (F2), facteur milieu de culture (F3), et les interactions entre facteur F1*2, F2*3 et F1*2*3, les probabilités calculées sont inférieures à 0,05. Seule la probabilité calculée de l’interaction entre facteur F1*3 est supérieure à la probabilité théorique P = 0,05. Il y a donc une différence significative entre les facteurs étudiés: luminosité, température et milieu de culture et une grande interaction entre les facteurs luminosité-température, température-milieu de culture et surtout entre ces trois facteurs luminosité-température-milieu de culture. Pour l’interaction entre facteur F1*3, la probabilité est supérieure à la probabilité seuil, par conséquent, on peut dire qu’il n’y a pas d’interaction ou d’interdépendance entre le facteur lumière et le facteur milieu de culture. On procède après à un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour vérifier les groupes homogènes de chaque facteur étudié. D’après le test de NEWMAN-KEULS, au seuil de 5%, on constate la présence de 6 groupes homogènes, selon les interactions entre les trois facteurs F1, F2 et F3 étudiés et suivant leurs moyennes respectives. Les groupes homogènes prépondérants groupe A suivis du groupe B, déterminent les interactions entre facteurs les plus importantes, à savoir: l’interaction entre facteur luminosité-température-milieu de culture: lumière-30°C-eau gélosée, suivie de l’interaction: lumière-30°C-MS/4, et l’interaction: obscurité-30°C-MS/4. On constate toujours à partir de ces résultats que l’interaction entre les trois facteurs joue un rôle prépondérant dans la vitesse de germination. On obtient toujours un pourcentage de germination plus élevé des graines au bout de 6 jours d’inoculation, dans une meilleure condition d’asepsie et de mise en culture en maîtrisant parfaitement les facteurs : luminosité, température et les milieux de culture établis. On constate également que les résultas obtenus par la détermination de la capacité et la vitesse de germination sont à peu près égaux et ne varient pas beaucoup. Ces trois facteurs étudiés constituent donc les facteurs limitants de la germination de l’espèce. On peut confirmer aussi que les graines de l’espèce sont photosensibles, c’est-à-dire qu’elles ont besoin d’une certaine quantité de lumière pour germer. Les hypothèses spécifiques concernant la germination des graines ont été donc démontrées. En effet, à partir des résultats d’analyse des tests statistiques, la germination des graines: en particulier, la capacité et la vitesse de germination, dépendent surtout de plusieurs facteurs: le protocole de décontamination des graines, d’une part et les protocoles de mise en culture d’autre part, en jouant sur trois facteurs prépondérants: luminosité-température-milieu de culture.

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Résultats et interprétations
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La germination des graines (Figure 9) s’effectue comme suit : - au bout 6 jours d’ensemencement, la graine s’imbibe d’eau par phénomène d’osmose et se gonfle. Les téguments de la graine se déchirent à un bout (Figure 9.3). - après 12 jours de culture, la racine de la plantule apparaît et après 21 jours ou environ trois semaines, la tige se dresse, coiffée de l’ensemble du reste de la graine (Figure 9.4). La germination de l’espèce est donc épigée et ces cotylédons sont orbiculaires, de forme arrondie. Le jeune plant est très fragile et mesure moins de 10 mm de longueur au bout d’un mois de mise en culture. - après 1 à 2 mois de culture, les jeunes plants pourront être repiqués sur de nouveaux milieux de développement et d’enracinement pour se développer et croître pleinement (Figures 9.5 et 9.6).

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Résultats et interprétations
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Figure 9.1 : Graines récoltées viables

Figure 9.2 : Graines triées avec une loupe

Figure 9.3 : Germination au bout de 6 jours

Figure 9.4 : Développement au bout 1 mois

Figure 9.5 : Repiquage des graines dans un milieu de croissance

Figure 9.6 : Plantules âgées de 2 mois

Figure 9 : Clichés résumant les différentes étapes de la germination de la graine

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Résultats et interprétations
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III.2 Résultats des essais sur la régénération "in vitro" de l’espèce III.2.1 Résultats des essais sur la décontamination des explants III.2.1.1 Avec Na Cl O à 12%
Les résultats des expérimentations sont résumés dans le tableau 22 suivant: Tableau 22 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Na Cl O à 12%

Explant

Feuille et méristème

Produits de désinfection et de stérilisation Et OH à 70° / Na Cl O à 12% T1’ : 0 min / 0 min T2’ : 0 min / 5 min T3’ : 5 min / 0 min T4’ : 5 min / 5 min T5’ : 5 min / 2 min 30 T6’ : 2 min 30 / 5 min T7’ : 2min 30/ 2 min30

Bloc1 : boite de Pétri avec 5 explants 0/5 1/5 1/5 1/5 5/5 5/5 1/5

Bloc 2 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5

Bloc 3 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5

On constate qu’après 3 à 4 jours d’inoculation, il y a apparition d’une voile blanchâtre tout autour des explants traités avec T’1, T’2, T’3, T’4 et T’7. Seuls les explants traités avec T’5 et T’6 (produit détergent antiseptique: Na Cl O à 12%) sont sains, non contaminés et continuent leur développement dans le milieu témoin.

III.2.1.2 Avec Ca (O Cl2) à 5%
Les résultats des expérimentations sont représentés dans le tableau 23 suivant: Tableau 23 : Résultas bruts des essais relatifs aux produits de décontamination Ca (O Cl2) à 5%
Produits de désinfection et de stérilisation Et OH à 70° / Ca (O Cl2) à 5 % T8’ : 0 min / 0 min T9’ : 0 min / 10 min T10’ : 10 min / 0 min T11’ : 30 s / 10 min T12’ : 1 min / 10 min T13’ : 30 s / 15 min T14’ : 1min / 15 min

Explant

Bloc1 : boite de Pétri avec 5 explants 0/5 1/5 1/5 1/5 5/5 5/5 3/5

Bloc 2 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5

Bloc 3 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 2/5

Feuille et méristème

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Résultats et interprétations
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Pour les traitements T’8, T’9, T’10, T’11 et T’14, on constate toujours après quelques jours d’inoculation l’apparition de tâche blanchâtre et de nombreux points noirs se développant tout autour des explants. Seuls les explants traités avec T’12 et T’13 restent sains. Ces observations montrent la présence de champignons et de bactéries sur les explants. Par conséquent, les protocoles de décontamination n’ont pas été réussis pour la plupart des traitements sauf pour T’12 et T’13 [produit antiseptique: Ca (O Cl2) à 5%]. On constate par ailleurs que la nature des explants (méristème apical et feuille) n’influe pas sur le protocole de décontamination. En effet, les protocoles de décontamination restent inchangés quelques soient les explants à utiliser. On constate par ailleurs que les concentrations des détergents sont utilisées à faible dose (5 à 12%) car à une forte concentration, le produit chloré devient très toxique pour l’explant mis en culture et entraînerait leur dégénérescence. Ainsi, les explants, après trempage dans ces produits, nécessitent toujours un grand rinçage dans de l’eau distillée stérile aux moins trois fois de suite pour éliminer toutes traces de produits détergents.

III.2.1.3 Traitements des données a) Analyse de variance
Les résultats de l’analyse da variance sont consignés dans le tableau 24 suivant : Tableau 24 : Analyse de variance de l’effet des détergents sur la régénération des explants
CARRES MOYENS 3.29 8.88 0.39

S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. RESIDUELLE1 125.12 115.45 9.67

D.D.L 38 13 25

TEST F. 22.97

PROBA 0.0000

E.T

C.V

0.62

27.8%

NOMBRE D’OBSERVATIONS : 42 NOMBRE DE VARIABLES : 4 DISPOSITIF DE L’ESSAI : RANDOMISATION TOTALE
Source : Logiciel Statitcf

Interprétation A partir de l’analyse de variance effectuée, on peut dire que la probabilité calculée du facteur étudié est égale à 0 donc inférieure à la probabilité théorique P = 0,05 ou 5%. Par conséquent, on peut dire qu’il y a une grande différence significative entre les traitements. Ainsi, on procède alors à un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour connaître le ou les traitements prépondérant(s).

b) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
Le tableau 25 suivant montre les résultats du test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, mettant en évidence les groupes homogènes avec leurs moyennes respectives, correspondant aux traitements effectués.

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Résultats et interprétations
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Tableau 25 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur l’effet des détergents

FACTEUR 12 5 6 13 14 11 4 9 2 8 7 1 10 3
Source : Logiciel Statitcf

LIBELLES T’12 T’5 T’6 T’13 T’14 T’11 T’4 T’9 T’2 T’8 T’7 T’1 T’10 T’3

MOYENNES 5.00 5.00 4.67 4.33 2.00 1.67 1.67 1.67 1.67 1.00 1.00 0.67 0.50 0.50

GROUPES HOMOGENES A A A A B B B B B B B B B B

Interprétation D’après le test de NEWMAN-KEULS, les 14 traitements ont été regroupés en deux groupes homogènes différents : A et B suivant leurs moyennes respectives. On constate que les traitements T’12 :1 min/10 min et T’13 :30s/15 min avec Ca (O Cl2) à 5% suivis de T’5 : 5 min/2 min30 et T’6 : 2 min 30/5 min avec Na Cl O à 12% forment une même groupe homogène ayant une moyenne élevée. Par conséquent, ce sont les traitements adéquats pour la décontamination des explants. L’autre groupe homogène B est formé par les autres traitements qui ont eu des moyennes plus faibles, donc des traitements inefficaces. Le tableau des résultats nous révèle seulement deux groupes homogènes A et B, puisque, avec l’élaboration des dispositifs expérimentaux, les traitements effectués ont été réduits en nombre à cause de la quantité moindre des explants. Ainsi, c’est le protocole de décontamination avec le produit détergent Na Cl O à 12% et le traitement T’5 : 5 min / 2 min 30, que nous allons utiliser dans les suites des expérimentations, pour la stérilisation des explants lors de la culture "in vitro". En effet, le coût de ce produit (hypochlorite de sodium ou eau de javel) est plus abordable et facile à trouver.

III.2.2 Résultats des essais sur la culture " in vitro" de l’espèce
Les résultats obtenus sur la culture "in vitro" sont résumés dans le tableau 26 suivant selon des intervalles de temps différents auxquels, on a noté plus de modifications. En effet, pour cette technique, on ne pouvait pas traiter les résultats statistiquement, avec le logiciel utilisé, car les nombres des explants mis en culture ont été très faibles, et les résultats obtenus risquent de ne pas être représentatifs. Par conséquent, on a noté les modifications observables, au niveau des explants mis en culture, selon des intervalles de temps différents.

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Résultats et interprétations
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Tableau 26 : Résultats des essais relatifs à la culture "in vitro" de l’espèce
auxine/ cytokinine 0/0 0,1 / 0,06 MS 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 Feuille MS/2 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 GD 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 GD 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 Après 4-5 semaines Racine Cal compacte jaunâtre Racine Cal compacte Cal compacte Racine Cal Racine Cal compacte Cal compacte Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine Cal Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine Aucune modification Aucune modification dégénérescence Aucune modification

Explant

Milieu

8 semaines Racine Cal compacte jaunâtre Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Racine Cal friable Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine Cal friable Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine Aucune modification Aucune modification dégénérescence Aucune modification

12 semaines plantule Germination de plantules Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille plantule Embryons Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine Embryons Microfeuille dégénérescence Microfeuille Racine dégénérescence dégénérescence dégénérescence dégénérescence

MS

MS/2

Méristème

Observations : Les explants mis en culture non contaminés, devront être observés et suivis pendant les 15 premiers jours sous une loupe binoculaire ou un stéréoscope. Les observations et modifications, qui s’effectuent au niveau des explants, sont alors notées et interprétées. Ces modifications morphologiques se sont manifestées par la formation des cals, l’apparition de bourgeonnement foliaire ou apparition de microfeuille, la formation des racines et pour certains explants, leurs dégénérescences.

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Résultats et interprétations
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Bourgeonnement foliaire ou microfeuille (Figure 10 et Figure 13) On a observé cette modification au niveau des explants méristématiques et les explants foliaires. - A environ 4-5 semaines de culture, . les explants méristématiques (Figure 13.4) et explants foliaires (Figure 13.5) deviennent jaunâtres, et un cal d’aspect blanchâtre apparaît (cal de cicatrisation), puis ils augmentent de volume et s’allongent. - A environ 8-12 semaines de culture, . on constate l’apparition de bourgeonnement végétatif ou de nombreuses microfeuilles qui apparaissent sur les explants méristématiques, au début de forme blanchâtre, et après quelques jours, ces microfeuilles changent de couleur et deviennent vertes (Figure 10.1). - Après 3 mois de culture, . les microfeuilles sont plus développées et pourront être repiquées sur de nouveaux milieux

d’induction de racine (Figure 10.5) ou des milieux d’induction de cals (Figure 10.4). Les milieux de culture favorables aux bourgeonnements foliaire sont les milieux MS-6/3 et MS- 0,05 / 0,01 pour les explants méristématiques. Notons qu’avec le milieu GD, on n’a obtenu aucun résultat satisfaisant. Formation de cal (Figure 12): L’induction de cal dépend des milieux de culture utilisés et surtout de l’équilibre hormonal entre auxine/cytokinine. Ainsi, entre les équilibres hormonaux: 0,1/0,06 ; 0,05/0,01 et 6/3 avec les milieux respectifs MS et MS dilué de moitié, on a obtenu la formation de cals de différentes natures : il y a des cals friables ou cals idéaux (Figures 12.2 et12.3), des cals jaunes (Figure 12.1) et des cals compacts (Figure 12.5) non embryogènes. Dans notre culture, avec la formation de cal, on a distingué les phases suivantes : - De 0 à 4 semaines : . on constate une dédifférenciation du tissu foliaire en cal aqueux pour la culture de méristème et des explants foliaires. . une apparition de cal de cicatrisation (cal compact) de couleur verdâtre pour certains explants foliaires. . une augmentation de volume des explants foliaires en s’enroulant sur lui-même. - A environ 4-5 semaines de culture : . on constate l’apparition de globules méristématiques de couleur blanchâtre sur l’explant; ces globules s’augmentent petit à petit de volume et de quantité.

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Résultats et interprétations
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- A environ 8 semaines de culture : . une augmentation de l’enflure du corme et une grande augmentation des cals nodulaires d’aspect laiteux et de couleur blanchâtre, ce sont les cals embryogènes ou cals friables. - A environ 12 semaines de culture . un développement de cals embryogènes constitués par d’embryons individuels et friables. Ce sont les cals idéaux pour une Suspension Cellulaire Embryogène (SCE), une culture sur milieu liquide agité. - A 1 mois et plus, les cals embryogènes deviennent bruns puis verdâtres et les embryons individuels donneront de futures plantules composées de deux feuilles opposées. - Après 2 mois de culture, il reste à repiquer ces embryons individuels sur un nouveau milieu nutritif pour la formation des racines et l’obtention de nouvelles plantules. Les milieux de culture avec les équilibres hormonaux favorables pour l’induction des cals friables ont été les milieux MS/2 ou milieu MS dilué de moitié avec un rapport auxine sur cytokinine: 0,1/0,06 que ce soit pour la culture de méristème ou pour la culture de tissus différenciés. Les milieux nutritifs : MS et MS/2 ont donné des cals compacts mais qui n’ont pas évolué.

Régénération en plantules - A environ 6 semaines de culture, . des racines se sont développées sur quelques explants foliaires dont les milieux de culture sont des milieux MS et MS/2 sans hormone ou dont les équilibres hormonaux étaient de l’ordre de 0,1/0,01; c’est-à-dire, en quantités très infimes (Figure 11.4). - A environ 12 semaines de culture, . des plantules apparaissent au niveau des racines et continuent leur multiplication (Figure 11.5). Notons que sur le milieu de culture GD avec ces différents équilibres hormonaux, on n’a constaté aucun changement notable que ce soit au niveau des explants foliaires que méristématiques. Après des semaines de culture, les explants finissent par se brunir et se dégénèrent petit à petit. Ce milieu de culture ne semble donc pas être favorable pour la régénération de l’espèce. Après la première phase de la culture "in vitro", c’est-à-dire, l’induction de cal et la formation des embryons individuels ainsi que l’obtention de microfeuilles, on a effectué la deuxième phase de la culture. Cette seconde phase consiste surtout à la régénération des plantules en repiquant des embryons individuels pour induction de rhizogénèse, sur un milieu de culture approprié. Pour les microfeuilles: deux milieux de cultures ont été élaboré.

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Résultats et interprétations
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Figure10. : Inoculation d’un méristème apical 1. Au bout de 4-5 semaines 2. Au bout de 8 semaines 3. Au bout de 12 semaines

Figure 10.2 : Bourgeonnement végétatif prêt pour le repiquage

Figure 10.3 : Culture de méristème dans une armoire de culture

Figure 10.4 : Repiquage dans un milieu d’induction de cal

Figure 10.5 : Repiquage dans un milieu d’induction de racine

Figure 10 : Clichés résumant les différentes étapes de la culture de méristème

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Résultats et interprétations
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Figure 11.1 : Inoculation de 2 jeunes feuilles dans une boite de Pétri (milieu d’induction de cal)

Figure 11.2 : Micropropagation de feuilles dans des tubes à essais (milieu d’induction de racine)

Figure 11.3 : Explant au bout de 4-5 semaines dans un milieu d’induction de cal

Figure 11.4 : Explant au bout 4-5 semaines dans un milieu de rhizogénèse

Figure 11.6 : Explant au bout de12 semaines

Figure 11.5 : Explant au bout de 12 semaines

Figure 11 : Clichés résumant les différentes étapes de la micropropagation

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Résultats et interprétations
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Figure12.1 : Cals non embryogène, nodulaires et jaunes

Figure 12.2 : Cals idéaux (embryogènes)

Figure 12.3 : Cals idéaux translucides

Figure 12.4 : Cals idéaux avec embryons individuels

Figure 12.5 : Cals compacts (non embryogène)

Figure 12.6 : Cals compacts avec embryons

Figure 12 : Callogenèse chez Kalanchoe synsepala (BAKER)

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Résultats et interprétations
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Figure13 : Bourgeonnement végétatifs (explant foliaire) 13.1 : Au Faible Grossissement 13.2 : Au Moyen Grossissement 13.3 : Au Fort Grossissement

Figure 13. 4 : Evolution de bourgeonnement foliaire d’une microfeuille

Figure 13.5 : Développement et croissance de bourgeonnement foliaire issu d’un méristème

Figure 13 : Bourgeonnements végétatifs intenses chez Kalanchoe synsepala (BAKER)

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Résultats et interprétations
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III.2.3 Résultats des essais sur la régénération en plantules de l’espèce
Après 18 jours (3 semaines) de repiquage sur de nouveaux milieux, à savoir: un milieu d’induction de racine et milieu d’induction de cal, pour les explants "microfeuilles" et deux milieux d’induction de racine pour les embryons individuels, on obtient les résultats suivants: Tableau 27 : Résultats de la régénération en plantules de l’espèce

Explant Embryons individuels

Milieu MS MS/2 MS MS/2

Microfeuille

auxine/ cytokinine 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06

Après 4-5 jours Racine Racine Racine Racine -

2 semaines Racine Racine Racine Racine Cal friable

4 semaines Racine Cal compacte Racine Cal friable Racine Cal compacte Racine Cal friable

- A environ 4 -5 jours de culture : . pour les embryons individuels, on constate le début de formation d’une touffe minuscule de racine, visible seulement au microscope binoculaire et au fort grossissement, avec le milieu d’enracinement MS et MS/2 sans hormone (Figure 14.3). . pour les microfeuilles, on constate la formation de cals nodulaires qui se développent petit à petit, visible au microscope binoculaire, avec les milieux MS et MS/2 sans hormone (Figure 14.4). - A environ 4 semaines de culture : . pour les embryons individuels, sur les milieux MS/2 avec équilibre hormonal 0,1 / 0,06; les racines se sont développées et l’on obtient des plantules enracinées (Figure 14.7). . pour les embryons individuels et microfeuilles, sur les milieux MS/2 avec 0,1 / 0,06; les cals friables embryogènes continuent leur développement et se multiplient activement (Figure 14.8).

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Résultats et interprétations
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Figure 14.1 : Embryons individuels

Figure 14.2 : Microfeuilles

Figure14.3 : Repiquage des embryons

Figure14.4 : Repiquage des microfeuilles

Figure 14.5 : Sur milieu d’enracinement

Figure14.6 : Sur milieu d’induction de cal

Figure 14.7 : Vitroplants (3 mois)

Figure14.8 : Formation de cal (1 mois)

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Résultats et interprétations
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Figure 14 : Clichés des différentes étapes de la régénération en plantules de l’espèce

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Résultats et interprétations
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III.2.4 Limites des techniques de multiplication effectuées.
Au cours des expérimentations, on a constaté divers problèmes: concernant la méthodologie, l’élaboration et le choix des dispositifs expérimentaux ont posé quelques problèmes. Ces derniers se sont manifestés au cours des manipulations au laboratoire: en effet, le problème général réside avec l’obtention d’une condition d’asepsie très rigoureuse pour la réussite de la culture, une seule spore de champignon pouvant contaminée toute une culture ou les milieux employés. On constate toujours un décalage entre les protocoles édités et les expérimentations proprement dites. Pour la germination "in vitro" des graines, les problèmes existent également dans les triages des graines viables et dans leur manipulation à cause de leur taille très petite. De plus, la notation des graines germées par jour dans les boites de Pétri fut très difficile à effectuer. Des obstacles apparaissent et nécessitent d’être étudiées très profondément quant à la suite des travaux : - il y a tout d’abord une grande difficulté sur le coût des diverses techniques : leurs applications exigent d’énormes d’infrastructures (laboratoire équipé et spécialisé), de matériaux sophistiqués (hotte à flux laminaire, autoclave, armoire de culture) et des produits et consommables très coûteux (hormones végétales etc.). Dans le cadre de notre recherche, ce sont ces problèmes qui sont apparus pendant les travaux: recherche de laboratoire équipé et les produits consommables etc. Ainsi, faute de moyens et de matériels, on a limité toujours notre dispositif expérimental pour réduire les dépenses occasionnées par tous ces frais de laboratoire. C’est aussi la raison pour laquelle ces techniques sont souvent peu développées et non expérimentées à Madagascar comme la technique de la suspension cellulaire embryogène, faute de moyens et de budgets. - les limites de la culture au point de vue technique réside également dans ce que nous appelons: la variation somaclonale ou vitrovariant. La régénération par culture "in vitro" est l’un des outils de plus en plus utilisés dans le cadre des biotechnologies végétales. Toutefois, au cours de ces régénérations, il arrive que de nouveaux phénotypes apparaissent. En effet, le passage par cal ou le nombre de cycles de culture "in vitro" sont des facteurs pouvant induire des variants, c’est-à-dire que des plantes dont le génome est sensiblement différent de celui de la plante de départ ( mutation ou somation). Mais en contre partie, on pourrait donc exploité cette technique en créant de la variabilité chez certaine espèce avec l’introduction des pressions de sélection tels le froid, les toxines etc. Ainsi, au moment de la régénération, on pourrait obtenir des plantes nouvellement résistantes à de nombreux facteurs. Mais pour notre espèce, nous pensons que les éléments de base de la variabilité peuvent être: la durée de la culture "in vitro", les milieux de culture et surtout la concentration des régulateurs de croissance. Dans de prochains travaux, nous essayerons de déterminer s’il y existe de variants au niveau de nos vitroplants avec l’utilisation de la biologie moléculaire. Cette technique est très récente permettant de révéler la diversité génétique cachée au cœur des chromosomes des cellules. De plus, elle permet également d’identifier les espèces, des variétés ou des clones pour la valorisation des ressources phytogénétiques à Madagascar.

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Discussions
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IV. DISCUSSIONS IV.1 Discussions méthodologique
La discussion porte tout d’abord sur la méthodologie adoptée pour la germination et la régénération "in vitro" de l’espèce. En effet, on a constaté l’importance tenue par les études bibliographiques concernant l’écologie et la physiologie de l’espèce. C’est à partir des ces données recueillies qu’on a pu mettre en place les dispositifs expérimentaux en établissant les différents facteurs qui peuvent influencer sur la germination et la régénération de l’espèce. Par exemple, l’influence de la luminosité la température, l’humidité relative, et les milieux de culture dans les sites d’étude. Par conséquent, pour une étude approfondie de ces techniques, les études écologique et physiologique doivent être très poussées afin de déterminer les différentes corrélations ou interdépendances entre ces facteurs. Concernant les protocoles expérimentaux pour la décontamination des explants, la technique a été déjà employée dans la régénération de plusieurs espèces "in vitro" mettant en évidence le rôle primordial de l’asepsie dans ces types de culture. En effet, il a été déjà prouvé que la condition de réussite de la culture "in vitro" repose surtout sur l’asepsie des explants mis en culture. Pour notre cas, on a toujours exploité cette technique de décontamination en employant plusieurs détergents chlorés, comme l’hypochlorite de sodium et l’hypochlorite de calcium, pour effectuer la décontamination. Seulement cette technique de décontamination demande beaucoup de temps puisque il a fallu effectuer plusieurs protocoles de décontamination selon les produits détergents, leur concentration respective et les temps d’immersion des explants dans les produits. De plus, l’élaboration de ces protocoles a été faite par "tâtonnement" puisque les bases de données concernant la physiologie germinative de l’espèce sont presque inexistantes. On a basé notre protocole sur des données recueillies de quelques espèces comme pour le cas des GRAMINEES dont la morphologie générale des graines se ressemble. Il faut aussi déterminer des protocoles de décontamination en fonction de la nature des explants, c’est-à-dire, la nature de la graine.

IV.2 Discussions des résultats
Concernant les résultats des divers techniques de multiplication végétative sexuée et asexuée, pour la germination des graines de l’espèce, on a constaté donc une grande relation entre les facteurs extrinsèque et le taux de germination de l’espèce, entre autre l’influence de la lumière, de la température de mise en culture et des milieux choisis. De plus, ces résultats montrent une certaine relation avec des résultas obtenus concernant la germination des graines de quelques espèces de
GRAMINEES. En effet, l’étude des propriétés germinatives de quelques semences d’adventices du

Sud-Ouest de l’île a montré que la température optimale pour la germination de semences est de 30°C et que les grandes semences germent mieux et plus vite que les petites. De telles différences de comportements ne sont pas exceptionnelles dans les régions subissant de fortes fluctuations des conditions écologiques (RASOLOFOSON V F, 1997). Seulement, les semences des adventices ont subi

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Discussions
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des prétraitements comme la scarification manuelle, la dénudation et des traitements avec des produits chimiques permettant d’améliorer la capacité de germination. De plus la luminosité ne semble pas influencer le taux de germination des semences des GRAMINEES. Pour la germination "in vitro" de l’espèce, les tests statistiques adoptés ont été toujours l’analyse de variance suivi du test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% afin de mettre en évidence les différences significatives entre les traitements effectués et les groupes homogènes correspondant aux moyennes les plus élevées. Néanmoins, des tests de corrélation devraient être effectués pour les traitements les plus prépondérants, suivant le taux de germination de l’espèce. Les expériences faites à partir de graines montrent que toutes jeunes plantes peuvent croître semblablement sur des milieux divers. Ce n’est qu’après épuisement des réserves nutritives des graines qu’elles se développent différemment sur les milieux différents. Ainsi, la méthode suivante peut être utilisée: on sème sur un milieu privé des éléments dont on veut étudier les effets (eau gélosée). C’est par la suite qu’on effectue des repiquages systématiques sur des milieux à tester. . Pour la culture "in vitro" de l’espèce, les techniques expérimentées établies, que ce soit pour la décontamination ou pour la culture proprement dite, ont été basées sur celles qui sont en vogue actuellement dans les centres de recherche pour la régénération d’espèces médicinales ayant de grande potentialité économique pour le pays, comme les techniques de régénération "in vitro" de Catharantus roseus, Prunus africanum etc. Seulement, les tests de comparaison du taux de principe actif du vitroplant et celui d’une plante récoltée dans le milieu d’origine n’ont pas encore été réalisés et doivent être effectués afin d’améliorer la potentialité de cette technique. . Les résultats donnés par ces expériences sont obtenus seulement avec des explants foliaires, on n’a pas pu effectué la régénération avec d’autres organes végétatifs limités par les moyens. . Avec le test statistique, on ne peut se rendre compte avec précision des résultats des expériences sous forme numérique comme le nombre de feuilles de chaque plantule, la longueur moyenne des tiges, dimension des racines, etc. Ainsi, d’autres tests statistiques et des mesures devront être effectués permettant de juger de l’effet de tel milieu ou hormone, non seulement sur la croissance totale du végétal, mais aussi sur le développement de chacun des organes, parfois même sur sa multiplication et les résultats numériques apportés par ces expériences n’ont de valeur que si elles sont obtenues à partir d’un grand nombre de plantes et permettant de conclure d’une façon très satisfaisante. . Enfin, pour les repiquages successifs des plantules, l’influence d’un élément donné, à une dose déterminée, peut varier avec la composition chimique de l’ensemble du milieu nutritif. Des rapports et des balancements entre les diverses hormones en présence entrent en jeu. Ces espèces doivent avoir une alimentation équilibrée et l’insuffisance de tel ou tel élément indispensable peut gêner le développement du vitroplant.

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Propositions de protocoles expérimentaux
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V. PROPOSITION DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET REGENERATION DE Kalanchoe synsepala (BAKER) V.1 Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la germination des graines
Tableau 28 : Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la germination des graines

Protocole expérimental 1 : Protocole pour la stérilisation et désinfection des graines Explant Graine séchée dans une étuve à 35°C pendant 30 jours Explant Graine séchée dans une étuve à 35°C pendant 30 jours Graine séchée dans une étuve à 35°C pendant 30 jours Produits de décontamination et durée de trempage Ethanol à 70° pendant 5 min Na Cl O à 12% pendant 2 min 30 Produit de rinçage Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min chacune Produit de rinçage Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min chacune Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min chacune

Produits de décontamination et durée de trempage Ethanol à 70° pendant 1 min Ethanol à 70° pendant 30 min Ca (O Cl2) à 5% pendant 10 min Ca (O Cl2) à 5% pendant 15 min

Protocole expérimental 2 : Protocole pour la germination des graines Explant Graine décontaminée et stérilisée Luminosité dans l’armoire de culture Photopériode 16h/8H Température 30°C Milieu de culture Eau gélosée à 7g/l ou MS dilué de quart sans hormone

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Propositions de protocoles expérimentaux
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Résumé : SEMIS DES GRAINES et REPIQUAGE 1Désinfection des graines dans une solution d’hypochlorite de sodium à 12% ou d’hypochlorite

de calcium à 5%, suivie d’un rinçage à l’eau distillée stérile. L’hypochlorite de calcium est le plus souvent utilisé car il ne pénètre pratiquement pas dans les tissus. Remarque : Avec leur poids et leur faible taille, l’utilisation d’un papier filtre en forme de

"cornet" stérilisé est nécessaire pour la décontamination des graines dans les produits de désinfection. 2Prélèvement des graines décontaminées avec une pince stérile (passée à la flamme) et semées

dans des boites de Pétri contenant le milieu de germination. Remarque : L’opération nécessite une condition d’asepsie parfaite : . Passage des mains à l’alcool à 70°, . Port d’une blouse propre, . Manipulation sous hotte à flux laminaire stérile, . Manipulation des graines près d’une flamme d’un Bec Bensen (moins de 20 cm). 3Après une durée de 1 à 2 mois de culture, les jeunes plants issus de la germination sont

repiqués sur un nouveau milieu dit milieu de développement, dans des boites de Pétri ou dans des bocaux stériles. 4Après une durée de 2 à 3 mois dans ce milieu de développement, les plantes sont sorties des

flacons, les racines bien nettoyées à l’eau claire pour enlever la gélose. Les jeunes plantes âgées de 2 à 3 mois sont alors repiquées en pot : sable fin, sable et engrais, dans un milieu d’acclimatation ou serre en garantissant une température et une humidité relative constante.

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Propositions de protocoles expérimentaux
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V.2 Protocoles expérimentaux proposés pour la décontamination et la régénération "in vitro"
Tableau 29 : Protocoles expérimentaux proposés pour la régénération de l’espèce

Protocole expérimental 1 : Protocole pour la décontamination des explants méristématiques et foliaires Explant Méristème et feuille Méristème et feuille Explant Méristème et feuille Méristème et feuille Produits de décontamination et durée de trempage Ethanol à 70° Na Cl O à 12% pendant 5 min pendant 2 min 30 Ethanol à 70° Na Cl O à 12% pendant 2 min 30 pendant 5 min Produits de décontamination et durée de trempage Ethanol à 70° Ca (O Cl2) à 5% pendant 1 min pendant 10 min Ethanol à 70° Ca (O Cl2) à 5% pendant 30 min pendant 15 min Produit de rinçage Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min Produit de rinçage Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min Eau distillée stérile, 3 fois, 5 min

Protocole expérimental 2 : Protocole pour la culture « in vitro » des explants Explant Méristème Méristème Feuille Feuille Feuille Technique de culture Culture de méristème Culture de méristème Micropropagation Embryogenèse somatique Micropropagation Objectifs Callogenèse Bourgeonnement végétatif Bourgeonnement végétatif Callogenèse Rhizogénèse Milieu de culture MS/2 + 0,1/0,06 MS + 0,1/0,01 MS + 6/3 MS/2 + 0,1/0,06 MS ou MS/2 sans hormone

Protocole expérimental 3 : Protocole pour la régénération en plantule Explant Embryon individuel Microfeuille Microfeuille Objectifs Rhizogénèse Rhizogénèse Callogenèse Milieu de culture MS ou MS/2 sans hormone MS ou MS/2 sans hormone MS/2 + 0,1/0,06

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Propositions de protocoles expérimentaux
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Ainsi, pour la culture "in vitro" de l’espèce, les critères d’évaluation obtenus nous donnent les résultats suivants : - Formation de cals idéaux Pour la technique de la culture de méristème, le pourcentage (%) de cals idéaux est d’environ 28%, c’est-à-dire le nombre de cals idéaux par rapport au nombre de méristèmes inoculés. Pour la technique de la micropropagation, le pourcentage (%) de cals idéaux est de 36%, c’est-à-dire le nombre de cals idéaux par rapport au nombre d’explants inoculés. Le cal idéal est formé par des agrégats cellulaires homogènes. Cette homogénéité est observée après 3 à 4 mois de culture. - Etablissement de suspensions cellulaires embryogènes ou SCE Pour ces deux techniques de culture "in vitro", La technique de Suspension Cellulaire Embryogène (SCE), s’effectuant sur milieu liquide agité, ne pouvait pas être expérimentée, faute de temps car les cultures sur milieu liquide demande plusieurs mois pour que les embryons puissent se développer pleinement. - Formations d’embryons Le taux de réussite de formation d’embryons avec les cellules embryogènes (embryogenèse somatique) est d’environ 12%. Seuls certains embryons déjà mâtures ont été repiqué à cause d’une manipulation très difficile sous loupe binoculaire, à l’aide d’une pince fine sous hotte. - Potentiel de régénération Le potentiel de régénération de l’espèce, avec les repiquages successifs sur différents milieux, est élevé, car on a obtenu de résultats au bout de 2 jours de repiquage des microfeuilles et des embryons. Ainsi, le potentiel de régénération de l’espèce est de 64%.

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Propositions de protocoles expérimentaux
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V.3 Perspectives pour la culture "in vitro" de l’espèce
Pour l’amélioration de ces différentes techniques de germination et de culture "in vitro", les données bibliographiques et les techniques employées doivent être très enrichies et toujours mises à jour. Pour notre espèce, des essais d’amélioration des techniques de décontamination et de culture devront être entreprises, avec l’application d’autres produits antiseptiques ou la manipulation s’effectuant à une certaine température élevée détruisant les champignons et bactéries. Pour la culture "in vitro", avec l’adoption de nouvelles techniques comme l’obtention d’haploïdes: les individus haploïdes (possédant un seul jeu de chromosomes) constituent un matériel privilégié pour l’étude de l’expression des gènes; ils permettent également de produire rapidement, par doublement chromosomique, des individus totalement homozygotes (dont tous les gamètes porteront les mêmes gènes). Des haploïdes peuvent apparaître naturellement, par parthénogénie spontanée ou lors d’hybridations interspécifiques. Le phénomène est toutefois peu fréquent, et des méthodes de production d’haploïdes ont été recherchées. Les plus employées sont les techniques de culture "in vitro" d’organes reproducteurs mâles ou femelles immatures, voire même de cellules sexuelles : pollen, ovules. La culture et fusion de protoplastes : les protoplastes sont des cellules végétales débarrassées, par un traitement enzymatique, de leur paroi pecto-cellulosique et qui peuvent ainsi être fusionnées entre elles. Cette fusion permet la création d’hybrides interspécifiques qui ne peuvent être obtenus par fécondation. Ces hybrides présentent de plus la particularité de posséder à la fois les noyaux et les cytoplasmes des deux cellules initiales (lors d’une fécondation, seul le noyau de la cellule mâle passe dans l’ovule. Le transfert de gènes de résistance aux insectes, aux virus ou aux herbicides est en cours de validation agronomique. A plus long terme, l’introduction de gènes modifiant la qualité des produits ou codant pour des molécules d’intérêt pharmaceutique sera réalisée. Dans les recherches futures, les essais d’acclimatation de la plante ou conduite sous serre devront être développés pour avoir une grande disponibilité de plantules. Il s’agit dans ce cas d’étudier les effets de divers substrats qui auront plus d’influence sur la croissance et le développement des plantules. Plus tard, des essais de transplantation de plantes dans leur milieu naturel devront être aussi effectués pour déterminer s’il y a des variations phénotypiques (au niveau morphologique) entre les vitroplants et une plante mère. Pour la culture "in vitro" proprement dite, nous avons constaté, que le potentiel de régénération d’un espèce non ligneuse est aussi élevé que celui d’une espèce ligneuse, malgré leur particularité morphologique et physiologique (absence de tige, d’entrenoeud, Métabolisme CAM etc.) Ainsi, dans les recherches futures, ces protocoles édités pourront servir aussi de base pour la régénération d’espèce ligneuse ou non présentant des difficultés au niveau de leur multiplication et leur préservation. Il s’agira ensuite d’établir une relation entre les protocoles expérimentaux et la nature même de l’espèce considérée.

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Conclusion
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CONCLUSION
L’espèce Kalanchoe synsepala (BAKER), famille des CRASSULACEAE, une plante herbacée non ligneuse, d’après les différentes techniques de multiplication sexuée et non sexuée employées, peut être multipliée par voie sexuée (graine) et par voie végétative (méristème apical et feuille). La propriété de totipotence cellulaire, déjà prouvée dans les études ultérieures a été confirmée et on a aussi montré que l’espèce possède une faculté germinative élevée en respectant les conditions optimales de culture comme la luminosité, la température, et les milieux de culture. Dans ce travail, les hypothèses spécifiques ont été vérifiées. En effet, à partir des résultats obtenus et vérifiés par des tests statistiques, on constate que la germination des graines et la régénération "in vitro" des explants est en relation étroite avec les protocoles de décontamination élaborés. Ces protocoles de décontaminations sont constitués par les produits antiseptiques à base de chlore utilisés avec leurs différentes concentrations respectives [Na Cl O à 12% et Ca (O Cl2) à 5%] et suivant la durée de trempage du matériel végétal. Les protocoles de décontamination sont toujours suivis d’un grand rinçage à plusieurs reprises du matériel végétal avec de l’eau distillée stérile. De plus, la germination des graine et la régénération en plantule dépend étroitement aussi des divers conditions de mise en culture, à savoir: la luminosité et la température de l’armoire de culture ou de l’étude de germination, et des divers milieux de culture élaborés. Pour la germination des graines, ces trois facteurs sont les plus prépondérants et considérés comme facteur limitant de la germination. Pour la régénération des explants "in vitro", le facteur prépondérant est l’équilibre hormonal entre l’auxine et la cytokinine. On a pu mettre en évidence ainsi, le rôle primordial joué par les milieux de culture et les équilibres hormonaux sur la régénération "in vitro" de l’espèce. L’hypothèse générale a été donc vérifiée, car on a pu établir que la faculté germinative des graines et les potentiels de régénération "in vitro" des explants sont dépendant de l’interaction de plusieurs facteurs extrinsèques, mais le facteur primordial reste le facteur qui est en relation avec le métabolisme de l’espèce, il s’agit de la totipotentialité des tissus de l’espèce. Dans l’élaboration de ces divers protocoles, on a aussi constaté l’intérêt porté par d’autres études (chimique, pédologique) sur les techniques de culture "in vitro". En effet, l’étude chimique a permis de mettre en évidence certains composés comme le phénol dans la plante dont les produits d’oxydation sont très toxiques pour les tissus mis en culture. Ainsi, pour faire face à ce problème, on a ajouté des anti-oxydants comme l’acide citrique ou acide ascorbique dans les produits de décontamination, de rinçage et dans les milieux de culture mais à de faible dose aux environs de 1,5%. L’étude pédologique a montré que l’espèce pousse sur des produits d’altération de roche riche en minéraux ferro-magnésien d’où le choix des milieux de culture riche en fer et magnésium, très utiles pour la plante et qui ont donné de meilleurs résultats dans la régénération de l’espèce. Enfin, on peut dire que les résultats obtenus ont été satisfaisants avec un pourcentage assez élevé de 75% pour la germination des graines et un pourcentage de 64% pour la régénération "in vitro" de

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Conclusion
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l’espèce mais à des intervalles de temps plus longues. Par conséquent, ces divers protocoles de multiplication asexuée et végétative "in vitro" pourront être exploités dorénavant pour la sauvegarde et la multiplication en nombre de l’espèce et pourront être adopté aussi à d’autres espèces du même genre ou même Famille pour concilier la gestion durable d’une espèce et son utilisation. Enfin, l’objectif principal de ce travail, a été réalisé, avec l’acquisition et la maîtrise parfaite des différentes techniques de germination et de culture "in vitro" existant, surtout au niveau national. On peut aussi dégager, à partir des résultats obtenus, des principes essentiels découlant de trois lois fondamentales: - les explants utilisés devront être toujours stérilisés et décontaminés avec des produits antiseptiques (loi de décontamination ou d’asepsie), - la réussite d’une culture "in vitro" dépend surtout de la composition des milieux de culture établis (macroéléments, microéléments, vitamines et hormones), - il y a une grande interdépendance (loi d’interaction) entre divers facteurs extrinsèques (température, humidité relative, milieu de culture etc.) et les facteurs intrinsèques (biologie et physiologie de l’espèce : espèce photosensible etc.). L’élément qui se trouve en plus faible quantité par rapport aux besoins de l’espèce détermine l’importance du rendement (loi du minimum). Le choix de plante-mère ou porte graine vigoureuse et saine contribue également à la réussite de la technique.

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Bibliographie
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Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE I
PREPARATION SOLUTION MERE : Muraschige et Skoog (1962)
1) Macroéléments : mg /l K NO3 NH4 NO3 Mg SO4, 7H2O KH2 PO4 Ca Cl2, 2 H2O 2) Micro-éléments : mg/l H2BO3 Mn SO4, 4 H2O Zn SO4, 7H2O Na Mo O4, 2 H2O Co Cl2, 6 H2O KI Fe SO4, 7 H2O Na2- EDTA 3) ALT inas : mg/l C° x 10 1 900 1 650 370 170 440 (264 anhydre) C° x 100 6,2 15,5 8,6 0,25 0,25 0,83 27,8 (15,16 anhydre) 37,3 C° x 10 1L x 100 Thyamine hydrochloride Pyridoxine hydrochloride Acide nicotinique Myoinositol Sucrose Ph 30 . 103 5,8 0,5 0,5 0,5 100 5 5 5 100 250 cc x 10 1,25 1,25 1,25 250 250 cc x 100 125 125 125 2 500 1L x 100 620 1 560 860 25 25 83 2 780 (1 516) 3 730 250 cc x 100 155 390 215 6,25 6,25 20,75 695 (379) 932,5 C° x 10 (1L) 19 000 16 500 3 700 1 700 4 400 (2640) C° x 10 (250cc) 4 750 4 125 925 425 1 100 (660)

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE II
PREPARATION SOLUTION MERE : GRESSHOF et DOY (1974) 1) Macroéléments : mg /l Ammonium nitrate Calcium nitrate 4 H2O Na2-EDTA Ferrous sulfate 7H2O Magnesium sulfate Manganese sulfate H2O Potassium chloride Potassium nitrate Potassium phosphate monopotassique 2) Micro-éléments : mg/l Acide borique Cobalte chloride 6 H 2O Cupric sulfate 5 H2O Molybdic acid 2H2O (sodium ALT) Potassium iodide Zinc sulfate 7H2O 3) Vitamines : mg/l D-Biotine Glycine (Freebase) Myoinositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Sucrose Ph 30 . 103 5,8 0,2 4 10 0,1 0,1 1 C° x 100 5 100 250 2,5 2,5 25 0,3 0,025 0,025 0,025 0,8 0,3 C° x 1000 (250 cc) 75 6,25 6,25 6,25 200 75 C° x 10 1 000 241,2 37,25 27,85 17,099 1 65 1 000 300 C° x 10 (1L) 2 500 603 93,12 69,62 42,72 2,5 162,5 02 500 750

ANNEXE III
COMPOSITION des VITAMINES de Morel (Morel et Wetmore, 1951) Biotine Calcium panthotenate Myo-inositol Acide nicotinique Chlorure de pyridoxine Chlorure de thiamine Concentration (mg/l) 0,01 1 100 1 1 1

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Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE IV
Composition des milieux de culture utilisés dans la culture de méristème, l’embryogenèse somatique, la micropropagation Milieu MS Macro-éléments Micro-éléments Vitamines Acide ascorbique (mg/l) Myo-inositol (mg/l) AIA (mg/l) BAP (mg/l) 2-4 D (mg/l) Glucose (g/l) Gélose nutritive (g/l) pH MS MS Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,8 Milieu MS/2 MS/2 MS/2 Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,7 Milieu MS/4 MS/4 MS/4 Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,9 Milieu GD GD GD Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,8

ANNEXE V
Composition des milieux de culture utilisés pour la régénération des l’espèce Macro-éléments Micro-éléments Fe-EDTA Vitamines AIA (mg/l) BAP (mg/l) 2-4 D (mg/l) Acide ascorbique Glucose (g/l) Gélose nutritive Ph Milieu de régénération MS MS + Morel 0,1 0,01 30 7 5,8 Milieu d’induction de cal MS/2 MS/2 + Morel 0,1 0,06 30 7 5,8

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Annexe _________________________________________________________________________________ ANNEXE IV Tableau résumant la capacité et vitesse de germination des graines traitées avec l’hypochlorite de sodium
jours 0 T1 Traitements (%) T2 T3 T4 T5 T6 T7 1 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 0 1 5 3 3 3 0 0 0 4 9 4 9 4 0 0 0 5 5 5 0 0 0 5 6 6 0 0 0 5 6 7 0 0 1 6 6 8 0 0 1 6 7 9 0 1 1 8 8 10 11 12 13 0 1 2 9 0 1 2 1 1 2 1 1 2 14 1 1 2 12 57 15 47 15 16 17 18 19 1 2 2 1 2 3 1 2 3 1 3 3 1 3 3 20 1 3 3 25 97 28 66 21 1 3 3 26 97 37 66 22 1 4 3 27 97 47 66 23 1 4 4 28 97 47 67 24 25 1 4 4 1 4 4 26 1 4 4 28 98 48 67

10 11 12

13 14 16 19 21 66 88 93 96 97 16 17 19 21 24 51 56 59 61 64

28 28 97 98 48 48 67 67

15 17 21 24 28 36 43 45 49 54 10 11 13 14 10 12 15 16 18 25 35 37 42 45

Tableau résumant la capacité et vitesse de germination des graines traitées avec l’hypochlorite de calcium
jours 0 T8 Traitements (%) T9 T10 T11 T12 T13 T14 1 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 3 3 3 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 6 0 0 0 1 7 0 0 1 1 8 0 0 1 1 9 0 1 1 1 10 11 12 13 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 14 1 1 1 2 15 16 17 18 19 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 2 1 1 3 20 2 1 1 4 97 95 58 21 2 1 1 4 97 96 59 22 2 1 1 4 97 96 60 23 2 1 1 4 98 97 61 24 25 2 1 1 4 2 1 1 5 26 2 1 1 5 98 97 61

7 10 15 17 21 24 28 36 43 45 61 78 8 13 18 25 28 38 44 67 73 7 10 12 15 16 18 25 35 37 42 45

81 81 79 80 46 47

83 84 89 95 82 83 91 93 47 50 54 57

98 98 97 97 61 61

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE VII
FICHE TECHNIQUE DE Kalanchoe synsepala (BAKER) Famille : CRASSULACEAE Espèce : Kalanchoe synsepala (BAKER) Noms vernaculaires : Sofimbitro, sofingoaika, sofimbato (Partie centrale) et sofintsofiny, mongy vato, Borodoke (Sud de l’île) Habitat : Madagascar : Partie centrale et Partie Sud de l’île, sur les rocailles et les sols dénudés (Massif granitique, roche sédimentaire) un peu à l’abri du soleil Floraison : Février - Mai Origine : Plante endémique de Madagascar Description : Plante herbacée à rameau et entre-nœud très court, portant toujours 4 feuilles opposées 2 à 2, crassulescente et grasse, toujours vertes Appareil végétatif : • • • • Tige toujours dressée mais à entre-nœud très court 4 feuilles opposées 2 à 2, grasses, épaisses, vertes, bords pigmenté de roux, à limbe simple à peine dentée, nervure peu visible Absence de bulbilles sur les feuilles, racine superficielle Mode de multiplication particulière en stolon

Appareil reproducteur : • • • • • • Inflorescence en paniculiforme ou corymbiforme Fleur hermaphrodite de type 4 comprenant: Un calice à préfloraison valvaire Une corolle tétra-fide gamopétale 8 étamines glabres, soudés à la corolle 4 carpelles légèrement soudés, ovaire supère sec : follicule comprenant de nombreuses graines très petites et présentant des

Fruit

ornementations Indications : Racine: anti-diarrhéique, feuille utilisée comme cataplasme, extrait des feuilles contre les Infections Sexuellement Transmissibles (IST) Note : Plante dont l’extrait est classé comme agent immunostimulant.

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE VIII
ANALYSE DE VARIANCE ET TEST DE NEWMAN KEULS ILes comparaisons de variances: Loi « F » de FICHER

L’analyse de variance à un facteur pour le dispositif complètement randomisé est proposée afin de tester, statistiquement, la différence significative existante entre des traitements. Ainsi, le test F de Ficher est utilisé. Ce test est obtenu par l’analyse de variance à une dimension dont le modèle linéaire s’écrit comme suit : x
ir

= µ + α1 + ε

ir

tel que ε

ir

~N (O,σ) V i,r. µ représente la réponse de la modalité « i » et α 1
ir

l’effet moyen de la modalité « i » et enfin ε variance égale à σ.

l’erreur expérimentale, qui suit la loi normale de

Le test d’hypothèse nulle, qui est l’absence d’un effet du facteur contrôlé, peut se formuler comme Ho = α 1 = 0 Vi. Cette hypothèse est acceptée si la valeur de F obtenue est inférieure à la valeur Fα lue dans les tables de Ficher à k-1 et N-k degrés de libertés, dans le cas contraire, l’Ho est rejetée. Le tableau de l’analyse de variance se construit comme suit:
Sources de variations Entre variantes du facteur contrôlé Variation résiduelle Total Sommes des Carrées des Ecarts (SCE) Degré de Libertés (ddl) Probabilité de retour

Carrés moyens (CM)

Test de Ficher (F)

SCE f = ∑ni (xi. - ¯x)2 SCE r = ∑ni (xir -¯xi.)2 SCE t = ∑ni (xir. - ¯x)2

k-1 N-k N-1

CM f = SCE f / k-1 CM r = SCE r / N-k

F f = CM f / CM r

P

Source: DAGNELIE P, 1986 IILes comparaisons de moyennes : test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5% A la suite d’un test F significatif, (si F observé est inférieur au F lu dans la table de SNEDECOR, au seuil α choisi) on compare les moyennes à l’aide de test dont les hypothèses sont les mêmes que pour l’analyse de variance. La méthode de NEWMAN et KEULS est basée sur la comparaison des amplitudes observées pour des groupes de 2,3, ...,p moyennes, avec l’amplitude maximum attendue à un niveau de signification α donné. Pour effectuer cette comparaison, on doit calculer la « plus petite amplitude significative » relative à des groupes de 2, 3, ...,p moyennes ( « p.p.a.s. »). Le tableau de Newman et Keuls montre à la fin les résultats des moyennes comparées par ordre et met en évidence de groupes homogènes. On a toujours des chevauchements mais les conclusions sont sensiblement différentes de celles obtenues avec la « plus petite différence significative ». Le test « F » est réalisé à un niveau global LG = 0,05 (5%). Ce seuil est par définition la probabilité de trouver au moins une différence entre moyennes comme significative alors que les moyennes de toutes les populations ne sont pas différentes.

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________ IIIChoix du test

En ce qui concerne les comparaisons de variances, lorsque les effectifs des différents échantillons sont égaux ou que si l’on voudrait comparer plusieurs variances, on peut utiliser le test de
BARTLETT. Ce test est très sensibles à la non normalité des populations, c’est une méthode

approximative qui n’est pas satisfaisante que si les effectifs ni des échantillons sont suffisamment grand (ni ≥ 4), et si le nombre d’échantillons k n’est pas trop élevé par rapport aux effectifs ni. Il est à noter que ce test n’est pas applicable que lorsque l’on dispose de vraies répétitions. Pour deux populations, le test de BARTLETT est équivalent au test F si les effectifs sont égaux. Pour les comparaisons des moyennes, si l’on veut comparer deux moyennes, on peut utiliser le test « t » de STUDENT ou la comparaison de deux moyennes. Par contre, pour la comparaison de multiples moyennes, on a le test de NEWMAN et KEULS, le test de DUNCAN, la méthode de
DUNNETT (comparaison de p moyennes à un témoin), la méthode de GUPTA (recherche des

moyennes les plus élevées), la méthode des contrastes (comparaisons orthogonales de moyennes) et la méthode de SCHEFFE (méthode des contrastes permettant de tester simultanément la signification de tous les contrastes). Dans le cas où les traitements jouent à priori un rôle symétrique, on peut utiliser la méthode de
NEWMAN et KEULS ou celle de DUNCAN, pour rechercher les moyennes les plus élevées. En

revanche, si les traitements ne jouent pas à priori un rôle symétrique, on doit utiliser la méthode des contrastes, sous réserve que ceux-ci figurent dans le protocole expérimental, sinon lorsqu’ils sont définis à posteriori, on peut utiliser la méthode de SCHEFFE. Dans le cas où l’on a témoin, on peut utiliser le test de DUNNETT (PHILIPPEAU G, 1989).

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________

ANNEXE IX
Résultats des tests statistiques sur Logiciel STAT ITCF, version 4
***** A N A L Y S E D E V A R I A N C E *****

CARACTERISTIQUES DU FICHIER : C:GRAIN TITRE : NACLO NOMBRE D’OBSERVATIONS : 56 NOMBRE DE VARIABLES : 5

***** NO ET NOMS DES VARIABLES ***** 1. DET / 2.REPET / 3.PARCE / 4. GERM / 5. REG /

DISPOSITIF INITIAL DE L'ESSAI : RANDOMISATION TOTALE ==================================================== FACTEUR = 14 DETERGENT 1 = NACLO1 (T1 ) 4 = NACLO4 (T4 ) 5 = NACLO5 (T5 ) 8 = CACLO8 (T8 ) 9 = CACLO9 (T9 ) 12 = CACLO12 (T12) 13 = CACLO13 (T13) 4 REPETITIONS 1

2 = NACLO2 (T2 ) 6 = NACLO6 (T6 ) 10 = CACLO10 (T10) 14 = CACLO14 (T14)

3 = NACLO3 (T3 ) 7 = NACLO7 (T7 ) 11 = CACLO11 (T11)

DISPOSITIF ANALYSE : RANDOMISATION TOTALE ==================================================== FACTEUR = 14 DETERGENT 1 = NACLO1 (T1 ) 4 = NACLO4 (T4 ) 5 = NACLO5 (T5 ) 8 = CACLO8 (T8 ) 9 = CACLO9 (T9 ) 12 = CACLO12 (T12) 13 = CACLO13 (T13) 3 REPETITIONS 1

2 = NACLO2 (T2 ) 6 = NACLO6 (T6 ) 10 = CACLO10 (T10) 14 = CACLO14 (T14)

3 = NACLO3 (T3 ) 7 = NACLO7 (T7 ) 11 = CACLO11 (T11)

1 VARIABLE(S) A ANALYSER ==========================1re VARIABLE : (GERM) GE LISTE DES OBSERVATIONS ANALYSEES -------------------------------* = donnée estimée OBS. No 1 2 3 5 6 7 9 10 11 13 14 15 17 18 19 21 22 23 25 26 27 29 30 IDENT. No 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43 51 52 53 61 62 63 71 72 73 81 82 PARC. No 101 403 801 102 404 802 103 501 803 104 502 804 201 503 901 202 504 902 203 601 903 204 602 F.1 T1 T1 T1 T2 T2 T2 T3 T3 T3 T4 T4 T4 T5 T5 T5 T6 T6 T6 T7 T7 T7 T8 T8 ------ VARIABLES GERM 0.00 1.00 0.50* 1.00 2.00 1.00 1.00 0.00 2.00 1.00 2.00 2.00 28.00 21.00 27.00 15.00 17.00 11.00 19.00 21.00 18.00 1.00 1.00* -----

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________
31 33 34 35 37 38 39 41 42 43 45 46 47 49 50 51 53 54 55 83 91 92 93 101 102 103 111 112 113 121 122 123 131 132 133 141 142 143 904 301 603 1001 302 604 1002 303 701 1003 304 702 1004 401 703 1101 402 704 1102 T8 T9 T9 T9 T10 T10 T10 T11 T11 T11 T12 T12 T12 T13 T13 T13 T14 T14 T14 1.00 0.50* 0.00 1.00 1.00 2.00 1.00 3.00 11.00 2.00 25.00 28.00 27.00 23.00 30.00 27.00 15.00 21.00 9.00

======================================= ANALYSE DE LA 1re VARIABLE : GE (GERM) ======================================= DONNEES ESTIMEES : -----------------1re Donnée estimée :

2e

3e

.5 Observation No 3 facteur 1 = DETERGENT, niveau répétition No 3 Donnée estimée : 1 Observation No 30 facteur 1 = DETERGENT, niveau répétition No 2 Donnée estimée : .5 Observation No 33 facteur 1 = DETERGENT, niveau répétition No 1 VARIABLE GERM : GE

1

= NACLO1

(T1)

8

= CACLO8

(T8)

9

= CACLO9

(T9)

HISTOGRAMME DES RESIDUS ======================= 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

I 12 I 13 I 22 I 31 I 33 I 42 I 43 I 61 I 11 81 I 21 82 I 23 83 I 32 91 I 41 93 I 71 102 I 52 73 122 51 I 63 92 123 53 I 113 111 101 133 62 112 I 143 131 121 103 141 72 132 142 I---------------------------------------1 4 -3.00 -4.50 -6.00 2 10 18 4 3.00 1.50 6.00 1 2 6.00 4.50 INTERVALLE : 1.50

EFFECTIFS BORNES -6.00

0.00 -1.50 MAXIMUM :

MINIMUM :

INDICES DE NORMALITE (coefficients de K.PEARSON) ------------------------------------------------SYMETRIE (valeur idéale théorique = 0) : BETA 1 = APLATISSEMENT (valeur idéale théorique = 3) : BETA 2 = RESIDUS SUSPECTS (méthode de GRUBBS) NEANT

0.01 4.60

PROBA = 0.7902 PROBA = 0.0258

-------------------------------------

___________________________________________________________________________

Annexe _________________________________________________________________________________
TABLEAU DES ECARTS-TYPES DES RESIDUS ==================================== ECARTS-TYPES FACTEUR 1 = DETERGENT ----------------------------F 1 : 1 (T1) 2 (T2) 3 (T3) 4 (T4) (T9) 10(T10) 11(T11) 12(T12) 0.50 0.58 1.00 0.58 0.50 0.58 4.93 1.53 13(T13) 14(T14) 3.51 6.00 KHI2 = 29.10 PROBA = 0.0039 ANALYSE DE VARIANCE =================== VAR.TOTALE VAR.FACTEUR 1 VAR.RESIDUELLE S.C.E. 4723.50 4516.50 207.00 DDL 38 13 25 CARRES MOYENS 124.30 347.42 8.28 TEST F 41.96 PROBA 0.0000 2.88 28.8% E.T. C.V.

5 (T5) 3.79

6 (T6) 3.06

7 (T7) 1.53

8 (T8) 0.00

9

1

TABLEAU DES MOYENNES ==================== MOYENNE GENERALE = 10.00 ---------------MOYENNES FACTEUR 1 = DETERGENT ------------------------F 1 : 1 (T1) 2 (T2) 3 (T3) (T9) 10(T10) 11(T11) 12(T12) 0.50 1.33 1.00 0.50 1.33 5.33 26.67 13(T13) 14(T14) 26.67 15.00 PUISSANCE DE L'ESSAI ==================== FACTEUR 1 : DETERGENT ---------------------------ECARTS en % V.Absolue 5.00% 0.50 10.00% 1.00 Moyennes observées test de NEWMAN-KEULS - seuil = 5% ================================= FACTEUR 1 : DETERGENT ---------------------------NOMBRE DE MOYENNES 9 10 11 VALEURS DES PPAS 7.96 8.14 8.30 NOMBRE DE MOYENNES VALEURS DES PPAS 2 12 4.84 8.44 13 8.57 14 8.69 5.85 6.46 6.90 7.24 7.52 7.75 3 4 5 6 7 8 RISQUE de 1ere ESPECE 5% 10% 20% PUISSANCE A PRIORI 5% 10% 20% 5% 11% 21% PUISSANCE A POSTERIORI 99% 99% 99%

4 (T4) 1.67

5 (T5) 25.33

6 (T6) 14.33

7 (T7) 19.33

8 (T8) 1.00

9

F1 13 12 5 7 14 6 11 4 10 2 8 3 1 9

LIBELLES T13 T12 T5 T7 T14 T6 T11 T4 T10 T2 T8 T3 T1 T9

MOYENNES 26.67 26.67 25.33 19.33 15.00 14.33 5.33 1.67 1.33 1.33 1.00 1.00 0.50 0.50

GROUPES A A A B B B C C C C C C C C

HOMOGENES

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