Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Université Henri Poincaré - Nancy 1

INITIATION A LA MANIPULATION
2ème année

Année universitaire 2004-2005

Avertissement

Ce polycopié d’initiation à la manipulation regroupe des informations précieuses pour les divers TP de votre scolarité. Il sera d’une grande utilité durant toutes vos années d’études et doit être considéré comme un outil de référence. A ce titre, conservez-le à portée de main et au besoin, relisez-le. Il est recommandé de venir à la séance de TP ou de TD en ayant pris connaissance du contenu de la séance.

Pour les séances de Travaux pratiques, vous devez apporter: votre poly d’Initiation à la manipulation, votre cahier de laboratoire, une blouse blanche, un feutre-marqueur pour le verre, une calculatrice, et des feuilles de dessin format A4. En outre, les étudiants présentant une allergie au latex doivent se procurer des gants de vinyle (en supermarché) pour pouvoir manipuler les produits dangereux.

Photo de couverture : Microscope du roi Stanislas Leszczynski, construit par Alexis Magny, en 1751. - Musée Lorrain, Nancy.

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PLAN

1 - SUIVI ET RENDU DES RESULTATS
PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE APPRENTISSAGE DE LA REDACTION D’UN COMPTE-RENDU RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL D’INCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS EXERCICES D’APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE

4
5 7

8 31

2 - REGLES D’HYGIENE ET DE SECURITE AU LABORATOIRE
PRODUITS CHIMIQUES PRODUITS BIOLOGIQUES GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX

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33 40 41 46

3 - MESURE DES VOLUMES ET DES MASSES
VERRERIE, PIPETAGE, PESEE VERRERIE ET VOLUMETRIE

47
48 59

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4 – MICROSCOPIE
LE MICROSCOPE A FOND CLAIR EXAMEN A L’ETAT FRAIS ET A L’IMMERSION MICROMETRIE NUMERATION D’ELEMENTS FIGURES

60
61 72 74 76

5 – METHODES DE SEPARATION ET D’ANALYSE QUALITATIVE
ELECTROPHORESE DE ZONE CENTRIFUGATION CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

79
80 86 87

6 - DOSAGES COLORIMETRIQUES ET NEPHELEMETRIQUES
NEPHELEMETRIE SPECTROMETRIE

95
96 97

7 - NOTIONS DE METROLOGIE, CALCULS D’INCERTITUDE, CONTROLE DE QUALITE
APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE

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103 104

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SUIVI ET RENDU DES RESULTATS

PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE

APPRENTISSAGE DE LA REDACTION D’UN COMPTE-RENDU

RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL D’INCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS

EXERCICES D’APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE

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PRESENTATION DU CAHIER DE LABORATOIRE
V.PICHON

1. But
Cette procédure définit les règles de base à suivre pour l’élaboration, la rédaction et la bonne tenue d’un cahier de laboratoire de travaux pratiques. C’est une initiation aux « bonnes pratiques de laboratoire » ainsi qu’à la tenue d’un cahier de manipulations que le futur diplômé sera amené à mettre en pratique dans le cadre de ses fonctions professionnelles, aussi bien en recherche, en industrie, dans le milieu hospitalier ou à l’officine. Ce cahier doit permettre à l’étudiant de garder une trace écrite de ce qu’il fait en TP et d’acquérir la rigueur indispensable à la prise de notes lors d’un travail expérimental. Il permettra également de rédiger le compte rendu de TP correspondant. Les modalités particulières, répondant à des objectifs pédagogiques propres adaptés à certains TP, sont précisées dans le polycopié relatif à chaque TP.

2. Etendue
Cette procédure s’applique à l’ensemble des travaux pratiques du cursus des études pharmaceutiques.

3. Elaboration
Le cahier de laboratoire est un document de travail personnel dont le contenu doit pouvoir être utilisé par toute autre personne (cf paragraphe 3.2.). A ce titre il doit être tenu sous une forme bien définie et être rédigé de manière claire et lisible. 3.1. Format Le cahier, fourni à l’étudiant au début de la 2ème année, sera de format 21,0 × 29,7 cm, broché (sans spirales), et toutes les pages devront être numérotées. Son prix sera ajouté à la carte de polycopiés. 3.2. Rédaction Sur la première page (page 001), l’étudiant indiquera : nom, prénom, année d’étude, année universitaire. Les pages 002 à 005 seront réservées à l’écriture de la table des matières qui sera actualisée au fur et à mesure des séances. Ce cahier est un document de travail, il doit donc être complété sur place et à chaque séance, si besoin est. Le cahier de laboratoire doit être suffisamment complet pour qu’on puisse s’y référer et réaliser à nouveau l’expérience décrite dans les mêmes conditions expérimentales et obtenir les mêmes résultats dans les limites d’erreur établies. On pourra trouver dans ce cahier et pour chaque séance : - le titre de l’expérience - la démarche expérimentale - les conditions expérimentales - les observations - les mesures - un exemple de calcul et/ou un traitement préliminaire des données - ainsi que tout commentaire ou appréciation utile au bon déroulement de la manipulation y compris les problèmes rencontrés et les solutions apportées.

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Tous ces éléments sont indispensables à la rédaction du rapport de TP correspondant à la séance ; le but n’est pas de recopier le polycopié. 3.3. Tenue Le cahier étant numéroté, aucune page ne pourra être arrachée. Une encre ineffaçable sera utilisée à la rédaction. Ecrire directement dans le cahier sans rien retranscrire, pas de feuilles volantes. Si une erreur est constatée, il faudra la rayer proprement sans la faire disparaître et écrire à côté la correction ainsi que le motif.

4. Contrôle
Les enseignants contrôleront chaque cahier lors des travaux pratiques, vérifieront qu’il est régulièrement rédigé et le viseront. A l’issue des TP, s’il a été constaté que ce cahier est inexistant ou non tenu à jour régulièrement, un retrait de points est prévu sur la note finale. Cette évaluation est laissée à l’appréciation des enseignants responsables.

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APPRENTISSAGE DE LA REDACTION D’UN COMPTE-RENDU

CONSIGNES POUR LA PRISE DE CROQUIS

Les observations faites au microscope donnent lieu à des dessins, vous permettant de conserver un souvenir précis de ce que vous avez observé. L’exécution de ces dessins nécessite une observation et une interprétation très précises des préparations microscopiques. De plus, ils permettent la vérification du travail. Ils seront rendus dès la fin de la séance. Ces dessins, exécutés uniquement au crayon de papier, doivent être la représentation aussi exacte que possible des objets observés. C'est pourquoi il faut respecter les proportions relatives des divers éléments, et représenter tous les détails très scrupuleusement. Le trait de crayon doit être fin et net, les raccords imperceptibles. Les hachures et les autres symboles (croix, ronds…) qui peuvent être employés dans les schémas, doivent être proscrits de tout dessin de détail. Il est inutile de représenter l'observation au faible grossissement (sauf dans quelques cas qui seront signalés au moment voulu) : apporter au contraire tous les soins à l'observation au fort grossissement qui est, le plus souvent, la seule intéressante. Les dessins doivent comporter une légende précise, comportant notamment le grossissement utilisé, et des annotations détaillées (faire mention de la forme, de la couleur, de la quantité éventuellement). Des traits de rappel indiqueront tous les détails intéressants du dessin. Dans la mesure du possible, ils seront horizontaux et ne se recouperont pas. Ils seront placés à droite du dessin bien centré. Les légendes seront écrites également au crayon de papier. Les dessins seront faits uniquement du côté recto de chaque feuille.

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RAPPEL SUR TRACE DES COURBES, CALCUL D’INCERTITUDE, PRESENTATION DES RESULTATS NOTIONS DE METROLOGIE
V. PICHON On ne connaît bien le phénomène que lorsqu’il est possible de l’exprimer en nombres. Lord Kelvin La métrologie est l’art de la quantification, c’est-à-dire la représentation numérique des phénomènes physiques qui peuvent alors être comparés, vérifiés et reproduits. Les grandeurs sont mesurées à l’aide d’unités qui constituent un système. Celui-ci doit être reconnu par tous les utilisateurs, il doit être simple et cohérent ; cependant, il ne peut être définitif car il est tributaire de l’évolution des connaissances et des techniques. Depuis 1989, la Conférence Générale des Poids et Mesures a pour rôle d’étudier les problèmes posés par la Métrologie et d’imposer un système unique. En France, le seul système légal est le Système International ou S.I.

1 - Les grandeurs
La notion de grandeur ne peut être définie de manière irréfutable. Il s’agit d’entités qui représentent entre elles une analogie (masse, longueur, temps). Elles peuvent varier et on peut définir des quantités ou des états. 1.1. Les grandeurs mesurables Une grandeur est mesurable si on peut définir le rapport de deux grandeurs de l’espèce considérée. La mesure sera donc dépendante du choix de l’unité. Ces grandeurs peuvent être : - additives : il est alors possible de définir l’égalité et la somme (exemple: la masse) - non additives : l’addition n’a pas de sens physique (exemple: température, masse volumique) - à individualité unique : elles ne sont pas susceptibles de variation. Il s’agit des constantes universelles (constante de Planck, constante molaire des gaz parfaits) ; ces grandeurs n’ont pas d’unité, mais leur valeur numérique dépend du système utilisé. 1.2. Les grandeurs repérables On ne peut pas définir le rapport entre deux grandeurs identiques. On peut seulement donner une hiérarchie (intensité olfactive, échelle de dureté de Mohs).

2 - Dimensions des grandeurs – Unités
2.1. Définition Il faut, préalablement à cette étude, établir une classification. a) Les grandeurs fondamentales L’analyse dimensionnelle montre que l’ensemble des grandeurs n’a que trois degrés de liberté. Il suffit donc de choisir trois grandeurs indépendantes l’une de l’autre pour définir toutes les autres. La longueur, la masse et le temps ont été retenus.

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b) Les grandeurs principales Pour des raisons pratiques, le Système International utilise non pas trois mais sept grandeurs de référence. - Longueur - Masse - Temps - Température - Intensité du courant électrique - Intensité lumineuse - Quantité de matière On y ajoute : - L’angle plan - L’angle solide c) Les grandeurs dérivées Elles sont définies à partir des grandeurs principales (surface, pression, capacité). 2.2. Dimensions A chaque grandeur principale a été attribuée une dimension symbolisée par une lettre (L - M – T - Θ - I – C). Les grandeurs dérivées auront donc pour dimension une combinaison des symboles précédemment établie en fonction de la description physique de cette grandeur. Exemple : Pression = = = = = Force / Surface (Masse x Accélération) / Surface (Masse x Longueur) / (Temps x Temps x Surface) M L T-2 L-2 M L-1 T-2

On peut faire les remarques suivantes: - Une grandeur peut ne pas avoir de dimension (1 et non 0) si la somme algébrique de tous les exposants est égale à zéro. - Il n’existe pas de grandeur dont la somme algébrique des exposants est supérieure à 4. - Une grandeur dérivée peut être obtenue par la combinaison d’autres grandeurs dérivées et témoigner ainsi de l’interaction des différents phénomènes physiques. Exemple: M L-1 T-2 Pression ML-1T2 Pression = = = = M L2 T-3 / L3 T-1 Puissance / Débit M L T-2 / L2 Force / Surface

La première équation correspond au fonctionnement d’une pompe, la deuxième au manomètre à soufflet. Si les deux membres d’une relation traduisant des lois de la physique n’ont pas la même dimension (à un facteur numérique sans dimension près), cette relation est inexacte. 2.3. Unités 2.3.1. Définition C’est une quantité de grandeur qui sert de référence pour exprimer la mesure de cette grandeur.

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Elle est représentée de façon plus ou moins arbitraire par un étalon. Cette notion est évolutive en fonction de la progression des connaissances et des techniques. Le choix des unités, correspondant aux grandeurs principales définies précédemment, décrit le Système International (J.O.Décret 75.1200 du 4 décembre 1975). - Longueur : mètre Longueur égale à 1 650 763,73 longueur d’onde, dans le vide, de la radiation correspondant à la transition entre les niveaux 2 p10 et 5 d5 de l’atome de krypton 86. - Masse : kilogramme Masse du prototype en platine iridié qui a été sanctionné par la Conférence générale des poids et mesures tenue à Paris en 1989 et qui est déposé au Bureau international des Poids et Mesures. - Temps : seconde Durée de 9 192 631 770 périodes de la radiation correspondant à la transition entre les deux niveaux hyperfins de l’état fondamental de l’atome de césium 133. - Intensité de courant électrique : ampère Intensité d’un courant électrique constant qui, maintenu dans deux conducteurs parallèles, rectilignes, de longueur infinie, de section circulaire négligeable et placés à une distance de 1 mètre l’un de l’autre dans le vide, produirait entre ces conducteurs une force de 2.10-7 newton par mètre de longueur. - Température : - kelvin Le kelvin, unité de température thermodynamique, est la fraction 1/273,16 de la température thermodynamique du point triple de l’eau. - degré Celsius La température Celsius t est définie par la différence t = T - T0 entre deux températures thermodynamiques T et T0 avec T0 = 273,15 kelvins. - Quantité de matière : mole Quantité de matière d’un système contenant autant d’entités élémentaires qu’il y a d’atomes dans 0,012 kilogramme de carbone 12. - Intensité lumineuse : candela Intensité lumineuse dans la direction perpendiculaire d’une surface de 1/600 000 mètre carré d’un corps noir à la température de congélation du platine sous la pression de 101 325 pascals. - Angle plan : radian Angle qui, ayant son sommet au centre d’un cercle, intercepte, sur la circonférence de ce cercle, un arc d’une longueur égale à celle du rayon du cercle. - Angle solide : stéradian Angle solide qui, ayant son sommet au centre d’une sphère, découpe sur la surface de cette sphère, une aire équivalente à celle d’un carré dont le côté est égal au rayon de la sphère.

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2.3.2. Multiples et sous multiples On utilise des préfixes et les symboles suivants :
Facteur multiplicatif 1018 1015 1012 109 106 103 102 101 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 Préfixe exa peta téra giga méga kilo hecto déca déci centi milli micro nano pico femto atto Symbole E P T G M k h da d c m µ n p f a

2.3.3. Ecriture a) Les noms des unités sont grammaticalement des noms communs. Ils s’écrivent avec une minuscule et prennent un s au pluriel, sauf s’ils se terminent par s, x ou z (exception: quintal - quintaux). b) Les symboles des unités sont exprimés en minuscules romaines, sauf s’ils dérivent d’un nom propre (seconde : s ; newton: N) (exception: l’ohm : Ω) Le symbole n’est pas suivi d’un point. Il ne prend pas la marque du pluriel. c) Le nom et le symbole des multiples et sous-multiples de l’unité de masse est appliqué au gramme et non au kilogramme. d) Les préfixes composés sont interdits (1 nm et non 1 mµm). e) Le produit des symboles de plusieurs unités est indiqué de préférence par un point (N.m). L’absence de ce signe ne doit pas prêter à confusion. (Exemple: Nm (Newton.mètre) mais pas mN (millinewton). f) Les trois écritures suivantes sont autorisées : m/s ou m ou m.s-1 s Il ne peut y avoir plus d’une barre oblique dans l’expression. Dans les cas compliqués des parenthèses ou des puissances négatives doivent être utilisées. m.kg/(s3. A) ou m.kg.s-3. A-1 et non m.kg/s3/A 2.4. Conversion d’unités L’introduction du système S.I. a diminué la fréquence des changements d’unités. Cependant, dans la pratique, on rencontre encore des unités non légales. Le passage d’un système à un autre système cohérent (les grandeurs principales définissant toutes les autres) s’obtient à partir d’un facteur multiplicatif. Celui-ci est égal au produit des rapports entre les unités principales élevées à la puissance qui apparaît dans l’équation aux dimensions. 11

Exemple : soit un système où les unités principales sont le centimètre, le gramme et la seconde (système C.G.S.) : la pression a pour unité la barye. Dans le Système International, l’unité de pression est le Pascal. L’équation aux dimensions de la pression est M L-1 T-2 : g M: = 10.10-3 kg L : cm = 10.10-2 m T: s =1 s Le facteur multiplicatif est : k = 10-3 x (10-2)-1 x 1 k = 1.10-1 -1 Une barye est donc égale à 10 Pascal.

3 - Mesures et incertitudes
Une mesure est le résultat d’un processus comprenant un certain nombre d’étapes : - production d’un signal - transformation du signal - transmission - amplification - conversion pour la présentation de la mesure - présentation (enregistrement - indication visuelle - aiguille, etc...) Toutes ces phases ne se retrouvent pas nécessairement impliquées dans une mesure. On utilise essentiellement les techniques hydrauliques, pneumatiques, électriques, électroniques, mécaniques, optiques et parfois acoustiques. On ne peut jamais affirmer que les résultats sont rigoureusement exacts. Les mesures peuvent être influencées par l’objet, la méthode, les instruments et l’opérateur : La grandeur à mesurer est définie avec une incertitude. 3.1. Précision Elle s’exprime en pour-cent. C’est la qualité globale de la mesure. L’imprécision est due à des erreurs. 3.1.1. Les erreurs accidentelles Elles sont dues à l’opérateur ou au manque de fiabilité du matériel. Elles conduisent en général à des résultats absurdes. Le sens critique de l’expérimentateur doit permettre leur élimination. Pour cela, il est utile que celui-ci ait une idée de l’ordre de grandeur du résultat. 3.1.2. Les erreurs systématiques Elles sont dues à l’instrument de mesure et elles se reproduisent de la même manière lorsque l’on répète plusieurs fois la même mesure. - l’erreur de parallaxe résulte d’une lecture en “biais” lorsque le repère et la graduation ne sont pas dans le même plan.

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- l’erreur d’hystérésis

L’indication de la mesure (X) est en retard par rapport à la variation de la grandeur (G).

Si la grandeur subit une variation périodique, on décrit un cycle d’hystérésis. Cette erreur est éliminée si on prend la moyenne de deux valeurs prises l’une à « la montée » et l’autre à « la descente ». - l’erreur de décalage
Correspond à un écart de la valeur de la mesure. Il peut être positif ou négatif.

- l’erreur de pente ou de calibrage

Dépend de manière linéaire de la quantité mesurée.

- l’erreur de linéarité La courbe de réponse X = f(G) n’est pas rigoureusement linéaire. Elle s’exprime en pourcentage de l’étendue de l’échelle. L’expérimentateur ne peut corriger cette erreur que s’il possède une courbe d’étalonnage. - l’erreur d’étalonnage Due à l’erreur commise sur l’étalon et sur les graduations lors de la création de l’appareil. Ces erreurs sont connaissables et peuvent éventuellement être prises en compte. 3.1.3. Les erreurs aléatoires On notera en particulier les erreurs dues aux causes suivantes : - le manque de mobilité C’est la conséquence des frottements des jeux mécaniques de l’inertie. Ce type d’erreur se manifeste surtout lorsque la grandeur à mesurer est stable. - l’influence des paramètres extérieurs tels que la température, la pression, l’humidité, l’accélération, le temps, etc…

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- le manque de rapidité Un appareil idéal ne doit pas ignorer un phénomène fugace et doit suivre rigoureusement les variations de la grandeur mesurée. - le manque de finesse L’instrument ne doit pas perturber la grandeur qu’il mesure. C’est le cas classique d’un voltmètre qui modifie l’intensité du circuit dans lequel il est inséré. Ces erreurs conduisent à des résultats dispersés. Si le nombre de mesures est important, on pourra appliquer les lois de la statistique. Les valeurs se répartiront autour d’une valeur réelle suivant une loi normale. Le résultat d’un tir sur une cible permet de représenter ces erreurs : On constate une dispersion des points d’impact (plus ou moins groupés) et l’on peut imaginer un point d’impact “moyen”. - les tirs hors de la cible représentent les erreurs accidentelles. - la position du point moyen par rapport au centre de la cible correspond aux erreurs systématiques - la dispersion correspond aux erreurs aléatoires. Il est alors possible de régler l’arme, donc de corriger les erreurs systématiques, pour que le point moyen soit au centre de la cible. Le tir est dit juste. Plus les impacts sont groupés, plus le tir est fidèle. Pour qu’un appareil soit précis, il doit être juste et fidèle. 3.2. Sensibilité C’est le rapport qui existe entre la variation de l’indication de la lecture et la variation de la grandeur. Un appareil est linéaire lorsque sa sensibilité est constante. Cette notion ne fait pas intervenir la précision de la lecture. Il ne faut donc pas confondre la sensibilité et le pouvoir de résolution (appelé aussi pouvoir séparateur) qui est la plus petite différence d’état ou de quantité d’une grandeur qu’un appareil peut déceler. C’est souvent cette définition qui correspond chez les constructeurs à la sensibilité. Par exemple, la sensibilité σ d’un galvanomètre s’écrit : rotation de l'aiguille ∆α σ= = variation du courant ∆i et peut se calculer si la relation physique entre α et i est connue. Elle ne dépend pas du dispositif ni de la précision de la lecture. La sensibilité définie par le constructeur tiendra compte de l’erreur due à la non mobilité du système, du dispositif de lecture (lunette de visée), etc... 3.3. Incertitudes 3.3.1. Erreur et incertitude absolue L’erreur absolue est la différence entre la valeur exacte Xo (qui est inconnue) de la grandeur G et de la valeur Xi donnée par la mesure. Aussi préfère t-on introduire la notion d’incertitude absolue ∆X qui est l’estimation de la limite raisonnable de l’erreur telle que l’on puisse affirmer : X - ∆X < Xo < X + ∆X Elle a bien sûr les mêmes dimensions que la mesure.

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3.3.2. Erreur et incertitude relative C’est le quotient ∆X/X de l’erreur ou de l’incertitude absolue par la mesure. C’est un nombre sans dimension qui représente la qualité du mesurage. On peut donner un ordre de grandeur de l’incertitude relative.
∆X/X 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 Informations Ignorance Evaluation Mesurage industriel Précision Haute précision

3.3.3. Incertitude sur une mesure directe L’expérimentateur doit chercher à réduire ou à corriger les erreurs systématiques puis estimer l’incertitude ∆X sur la mesure. Pour obtenir de meilleurs résultats, le mieux est de multiplier le nombre de mesures. En effet, sur un grand nombre de mesures relevées, les valeurs se répartissent dans la plupart des cas suivant une courbe de Gauss. On constate que l’incertitude absolue maximum ∆X est peu probable et on démontre que la moyenne des résultats d’une mesure répétée un grand nombre de fois de façon indépendante tend vers la valeur réelle, si on a pris soin d’éliminer toutes les erreurs non aléatoires. Si Χ est la valeur moyenne de la grandeur n Χ = 1 ∑i=1Xi n L’erreur apparente est alors égale à : x i =Xi − X L’erreur moyenne s’écrit : n x m = 1 ∑i =1 x i n On définit également l’écart type : n σ = 1 ∑i =1x i2 n

σ=

1 n (X −X) 2 n ∑i =1 i

N.B. : Dans l’expression de σ, utiliser (n-1) au lieu de n, si ce dernier est petit. Sur la courbe de Gauss, l’abscisse de σ correspond à 0,607 fois la hauteur de l’ordonnée maximum. On peut également définir la probabilité P de commettre une erreur inférieure à une certaine limite. Le tableau suivant donne P pour certaines valeurs remarquables de l’erreur.
Limite de l’erreur - xm + x m −σ + σ - 2xm + 2xm - 2σ + 2σ - 3σ + 3σ - 4σ + 4σ P 0,573 0,682 0,690 0,954 0,997 0,999

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3.3.4. Incertitude sur une mesure indirecte Les incertitudes absolues et relatives dépendent souvent de plusieurs mesurages. Soit g = f (u, v, w), les grandeurs u, v et w étant des variables indépendantes sur lesquelles on commettra l’erreur ∆u, ∆v et ∆w. Si ces valeurs sont petites, on peut appliquer les règles du calcul différentiel.

∂g ∂g ∂g , et étant les dérivées partielles, on peut écrire : ∂u ∂v ∂w ∂g ∂g ∂g dg = ⋅ du + ⋅ dv + ⋅ dw ∂u ∂v ∂w ∂g Nous ne pourrons connaître le signe des termes tel que .du , puisque l’on ne connaît pas le ∂u sens de l’incertitude. Il faut donc se placer dans le cas le plus défavorable en faisant la somme des valeurs absolues de chacun des termes. ∂g ∂g ∂g ∆g= ∆u + ∆v+ ∆w ∂u ∂v ∂w D’une manière plus particulière si la fonction est de la forme : g = k1u + k2v + k3w k1 , k2 et k3 étant des nombres sans dimensions, il vient : ∆g= k1 ∆u + k 2 ∆v+ k 3 ∆w
Si la fonction est de la forme : g = k uα vβ wγ ∆g = α ∆u + β ∆v + γ ∆w g u v w

Les cas les plus simples pourront être résolus en utilisant les deux théorèmes suivants : - l’incertitude absolue sur une somme ou une différence de termes indépendants est égale à la somme des incertitudes absolues sur chacun des termes. - l’incertitude relative sur un produit ou un quotient de termes indépendants est égale à la somme des incertitudes relatives sur chacun des termes.
3.3.5. Remarques a) Les cas des mesures non indépendantes ne sera pas traité ici. Le calcul de l’incertitude dans ce cas conduit à une valeur inférieure à celle que l’on obtiendra en appliquant les théorèmes précédents. b) L’incertitude relative résultant d’une différence peut être très grande si les deux termes sont peu différents. c) Le fait que l’erreur la plus probable est plus faible que l’incertitude permet de vérifier la cohérence entre des résultats différents. Il est en effet nécessaire (mais pas suffisant) que les intervalles définis par des résultats encadrés de leur incertitude aient une partie commune pour qu’il puisse s’agir de l’expression de la même quantité de grandeur.

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A et B sont compatibles. A et C, B et C ne le sont pas. d) Les calculs d’incertitude précédents s’appliquent dans le cas du calcul différentiel, ce qui suppose que les incertitudes sont petites et que les fonctions sont différentiables. Si ce n’est pas le cas, il faut calculer la valeur maximum et la valeur minimum du résultat (en choisissant pour ∆u, ∆v et ∆w des valeurs algébriques correctes) et prendre pour incertitude absolue la valeur de leur demi différence. e) La connaissance d’un résultat parmi l’ensemble des résultats possibles n’apporte aucune information sur la population concernée. En particulier, il est absurde de calculer une incertitude absolue en faisant la différence entre deux résultats expérimentaux.

4 – Expression des résultats
4.1. Le résultat Une mesure est représentée par un nombre limité de chiffres significatifs qui traduisent la précision de la mesure. Il n’est pas indifférent d’écrire 1,0183 ou 1,02. Dans le premier cas, l’erreur porte sur la quatrième décimale, dans le deuxième cas, elle porte sur la deuxième. Le dernier chiffre significatif exprime le niveau de l’incertitude absolue sur le résultat.

Un zéro situé à la fin d’un nombre peut faire exception et avoir plusieurs significations. Dans le cas d’un nombre entier : par exemple 1200 Cette valeur peut être considérée comme ayant 2, ou 3, ou 4 chiffres significatifs ; dans ce cas il est préférable d’utiliser les puissances de 10 et écrire selon le cas : 1,2.103 ou 1,20.103 ou 1,200.103. Cette difficulté n’existe pas si on fait suivre le résultat de son incertitude absolue : 1200 ± 100, 1200 ± 10 ou 1200 ± 1. Dans le cas d’un nombre décimal, le zéro doit être écrit s’il correspond au niveau de précision : 1,020 n’est pas équivalent à 1,02.
4.2. L’erreur L’incertitude absolue étant une estimation optimiste de la valeur maximum de l’erreur, on comprendra que l’on ne doit pas lui attribuer plus d’un chiffre significatif (deux à l’extrême rigueur). Par exemple, on ne peut pas écrire que l’incertitude absolue est également à ± 101 unités puisque le résultat n’est défini qu’à une centaine près. Il en résulte les pratiques suivantes : Lors d’un calcul d’incertitude, on négligera les erreurs sur les termes qui présentent une incertitude relative dix fois inférieure à celle du terme présentant l’incertitude relative la plus importante. Le résultat sera toujours arrondi à l’unité supérieure pour ne pas minorer la valeur de l’incertitude. Il est recommandé de garder dans les calculs intermédiaires un nombre de chiffres supérieurs au nombre de chiffres significatifs pour éviter d’introduire par le processus d’arrondissement des erreurs qui seraient du même ordre que celles qui appartiennent aux mesures.

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Pour les nombres irrationnels tels que π on utilisera un nombre de décimales tel que l’erreur relative sur ce nombre soit inférieure au dixième de l’incertitude relative qui affecte le terme présentant la meilleure précision. Dans ces deux derniers cas, il est inutile de « traîner » une quantité « ridicule » de décimales.
4.3. Ecriture des résultats On utilise la forme suivante : a b
±

c

d

e

signe

nombre

incertitude absolue

puissance 10

symbole de l’unité

Seules les cases b et e sont obligatoirement présentes lors de l’écriture d’une mesure. a) La case a ne contient le signe plus ou le signe moins que si la grandeur est orientée. b) La case b est remplie en respectant les règles de l’écriture des nombres : - La virgule sépare la partie entière et la partie décimale d’un nombre. Elle ne figure dans les nombres que si elle est suivie de zéros pour indiquer la précision de la mesure. Il n’y a qu’une seule virgule par nombre (les anglo-saxons remplacent la virgule par un point). - Les nombres sont séparés par tranches de trois chiffres de part et d’autre de la virgule. Un espace est utilisé à l’exclusion de tout autre signe. - Le nombre comporte un nombre de chiffres significatifs correspondant à la précision. c) La case c contient la valeur de l’incertitude absolue avec en principe un seul chiffre significatif auquel s’ajoute bien entendu le nombre de zéros nécessaires. d) La case d n’est utilisée que si le nombre est très petit ou très grand. e) La case e contient soit le symbole de l’unité utilisée si le résultat est exprimé en chiffres, soit le nom si l’énoncé de la mesure est littéral. Les règles d’écriture relatées au paragraphe 2.3.3. doivent être appliquées. Cette présentation imposant l’utilisation du même mode d’écriture pour le nombre et son incertitude, permet la comparaison immédiate de ces deux valeurs.
4.4. Les indications Les représentations instantanées des mesures peuvent être analogiques ou numériques. La lecture ne peut être correcte que si la vitesse des variations n’excède pas une valeur compatible avec l’appareil de mesure et les possibilités de l’observateur (expérimentateur ou système d’acquisition de données).

Les indications analogiques sont limitées par : - le pouvoir séparateur de l’œil - le grossissement que peut donner un dispositif adéquat - la possibilité d’interpolation directe ou à l’aide d’un vernier mais il faut noter que l’augmentation du pouvoir de résolution d’un indicateur ne modifie pas la qualité de la mesure (rien ne sert d’apprécier le dixième de milligramme si l’incertitude absolue sur la pesée est de l’ordre du milligramme). Les indicateurs numériques procèdent toujours par troncature, aussi faut-il ajouter à l’erreur instrumentale l’erreur due à l’incertitude portant sur le dernier digit (dernier chiffre).

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4.5. Représentation des résultats d’un ensemble de mesures 4.5.1. Le tableau Lorsqu’une grandeur physique dépend d’une ou plusieurs autres grandeurs, il est utile de rassembler les résultats sous forme de tableau. Afin de pouvoir comparer facilement les différentes valeurs, il faut veiller dans la mesure du possible à l’homogénéité de l’écriture des grandeurs appartenant à une même ligne ou une même colonne. 4.5.2. La représentation graphique L’exploitation des résultats en vue d’établir les lois des phénomènes physiques est facilitée par les représentations graphiques. En général, on utilise un système de coordonnées cartésiennes et parfois une représentation polaire.

Les mesures x et y suivant les axes X et Y étant incertaines, nous obtiendrons une ligne brisée en joignant les différents points. En réalité si le phénomène est continu, la courbe ne doit pas présenter de rupture de pente. Il faut donc tracer une courbe qui passe “au mieux” de tous les points. Les écarts ∆x et ∆y entre un point pris sur la courbe et le point expérimental correspondant constituent une appréciation de l’incertitude sur les mesures. On considérera qu’un point pris sur la courbe correspond à une mesure améliorée de x et de y. Ce type de représentation donne une vue générale du phénomène étudié et permet la mise en évidence de particularités (intersection avec les axes, point de rebroussement, surface sous la courbe, valeur de la pente et variations de celle-ci) ainsi que l’interpolation et l’extrapolation. Quelques règles simples et logiques permettent de réaliser un travail correct. - Toute courbe sera référencée par rapport à un système d’axes et à une origine (pouvant être différente du zéro). - Le choix de l’échelle doit permettre l’occupation maximale de la surface réservée à la courbe (celle-ci est en général un quadrilatère rectangle dont le rapport des cotés est inférieur à 1,5). - Elle doit être choisie pour rendre aisée la lecture des valeurs de X et de Y. En général, on prend à une puissance de 10 près, les rapports 1, 2 ou 5. - Les axes seront gradués de manière simple (1;2;3 – 1 ;5 ;10 ; 15 ; 10 ; 50 ; 100 ...). Les valeurs x, y correspondant aux valeurs expérimentales ne doivent pas figurer sur les axes. - Le tracé des points expérimentaux doit être suffisamment discret pour ne pas surcharger le graphique. Les traits de rappel seront proscrits sauf pour mettre une particularité en évidence. - Le tracé de la courbe doit être aussi propre et “lisse” que possible. Ceci suppose, faut-il le préciser, l’utilisation d’un système d’écriture à pointe fine et l’usage éventuel d’un pistolet à dessin. - La mesure de valeurs particulières obtenues à partir d’une représentation graphique ne doit pas utiliser les mesures x et y des points expérimentaux mais impérativement celles des points appartenant à la courbe. - La détermination de la pente d’une courbe doit être faite à partir des accroissements de x et de y pris sur la tangente tracée au point considéré. En aucun cas, ces valeurs ne doivent être prises sur la courbe, sauf bien entendu dans le cas d’une droite. Pour diminuer l’erreur graphique, on veillera à choisir des accroissements aussi grands que possible. 19

4.5.3. Représentation des mesures par des formules La courbe représentative des variations de Y en fonction de X étant obtenue, on se propose de déterminer s’il existe une relation Y = f(X) qui traduit une loi physique. Le seul cas ou l’on puisse vérifier avec sécurité la nature d’une courbe est celui de la droite. On cherchera empiriquement un changement du système de coordonnées.

Par exemple : * La courbe de la puissance électrique P en fonction de l’intensité I suggère de tracer la courbe de P en fonction de I2. Cette dernière est une droite qui vérifie la relation P = kI2. Il apparaît que la pente mesure la résistance du circuit. * L’intensité It transmise par une lame absorbante diminue rapidement avec l’épaisseur e. On obtiendra une droite de la forme y = ax + b en traçant la courbe log It = f(e). La pente de cette courbe mesure le coefficient d’extinction, la valeur de l’ordonnée pour e = 0 donne l’intensité I0 du faisceau incident. Dans la réalité, l’expérimentateur va obtenir, en raison des erreurs expérimentales, un certain nombre de points plus ou moins alignés. Il lui faudra alors choisir la droite la mieux adaptée. La méthode la plus utilisée est celle des moindre carrés. Cependant il est inutile d’appliquer cette méthode si les points sont pratiquement alignés. Le tracé se faisant facilement avec une règle transparente placée de manière à ce que son bord passe le plus près possible des points expérimentaux en laissant à peu près autant de points de part et d’autre de la droite.
4.6. La mémorisation Ces techniques permettent l’étude quantitative a posteriori d’une ou plusieurs grandeurs enregistrées simultanément. L’enregistrement analogique, d’utilisation très courante, est la mémorisation graphique sur un support (papier en général) des variations d’une grandeur. En dehors des erreurs dues à l’enregistreur, il faut parfois tenir compte des variations dimensionnelles du support dues à l’humidité par exemple. Actuellement, cette technique est concurrencée par l’enregistrement numérique sur un support magnétique (bande, disque) ou optique (vidéo disque).

Il faut également citer : - les mémoires électroniques - les cartes et rubans perforés - la position d’un index - les étalons - une branche d’un cycle d’hystérésis - etc... Toutes ces mémoires posent trois problèmes principaux - vieillissement et affaiblissement de l’information - l’introduction de parasites lors de la prise en compte des signaux - l’introduction de parasites lors de la restitution des signaux. Notons que les dispositifs numériques permettent de s’affranchir de ces phénomènes. On peut en effet régénérer périodiquement les mémoires et traiter électroniquement les signaux pour discriminer les informations.

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EXERCICES D’APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE
V. PICHON

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REGLES D’HYGIENE ET DE SECURITE AU LABORATOIRE

PRODUITS CHIMIQUES PRODUITS BIOLOGIQUES GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX

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PRODUITS CHIMIQUES
M-H. LIVERTOUX - L. FERRARI CONNAISSANCE DES PRODUITS CHIMIQUES ET DES RISQUES

Actuellement, il existe des centaines de milliers de substances organiques et de produits minéraux. Parmi eux, près de 50 000 présentent, à divers degrés, un danger pour la santé et la sécurité des manipulateurs. Les risques associés aux produits chimiques sont essentiellement de deux ordres : d'une part ces produits peuvent avoir une action néfaste sur l'organisme et c'est alors leur toxicité qui intervient ; d'autre part ces produits sont souvent inflammables.

1 – Les règles
1) CONTAMINATION PAR LES SUBSTANCES DANGEREUSES Les substances dangereuses peuvent : 1. contaminer la peau et les yeux par contact 2. contaminer l'air, sous forme de poussière, fumée, gaz, vapeur et aérosol 3. être portées à la bouche par méprise ou par les mains souillées. 2) VOIES DE PENETRATION DANS L'ORGANISME Les substances dangereuses peuvent entrer dans l'organisme par plusieurs voies à la fois : la voie respiratoire : les gaz, poussières, vapeurs, fumées pénétrant par inhalation dans les poumons et de là dans le sang les solides ou liquides sont avalés dissous et résorbés au niveau du la voie digestive : tube digestif plus ou moins totalement les liquides ou les gaz pénètrent dans l'organisme à travers la peau. la voie cutanée : 3) RISQUES DES SUBSTANCES DANGEREUSES Chaque substance dangereuse a ses risques particuliers. On peut classer ces risques en se basant sur la nature des effets. La réglementation classe les diverses substances en : E Substances nocives Xn Substances explosives O Substances corrosives Co Substances comburantes F Substances irritantes Xi Substances inflammables T Substances dangereuses pour l'environnement D Substances toxiques selon le danger et la nature spécifique des risques. E O F T

Xn

Co

Xi

D

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4) IDENTIFICATION DES SUBSTANCES DANGEREUSES Une mesure importante qui permet de travailler en sécurité avec des substances dangereuses est la mise au point d'un système d'identification et d'information efficace qui doit permettre d'identifier rapidement les substances, de noter les risques dus à ces produits et de recommander des mesures préventives. On trouve des listes de substances dangereuses avec leurs noms, symboles de dangers éventuels, catégories de risques : phrases R (risques) et S (sécurité). 5) ETIQUETAGE L'objet de l'étiquetage est d'indiquer simplement la substance dangereuse qui est contenue dans n'importe quel produit et cette mention est en relation étroite avec la surveillance médicale et les conseils du médecin du travail. L'étiquette sur tout emballage ou récipient doit comporter les indications suivantes : 1. le nom de la substance 2. les mentions spécifiques de danger et/ou les symboles qui s'y rapportent 3. les phrases mentionnant les risques particuliers dérivant de ces dangers : Phrases R (risques) 4. les phrases mentionnant les conseils de prudence destinés à pallier tous ces risques : Phrases S (sécurité) 5. le nom et l'adresse du fabriquant ou de toute autre personne qui met cette substance à la disposition des utilisateurs.

2 - Consignes générales de sécurité
- Eliminer le risque. - Circonscrire le risque à la source. - Prendre des mesures de prévention matérielle. - Utiliser des moyens de protection. - Au cours des manipulations de chimie, manipuler toujours au-dessus de la table : les souliers ne résistent pas à l'action des produits chimiques !

3 - Précautions nécessaires
La manipulation des produits dangereux doit être entourée de toutes les précautions nécessaires : Porter des lunettes de protection. Ne jamais pipeter à la bouche. Utiliser des pipettes automatiques pour les prélèvements. Eviter le contact avec la peau. Porter des gants lors de la manipulation de produits corrosifs ou hautement toxiques par contact (produits allergisants). Travailler si possible sous une hotte ventilée pour les produits volatils toxiques par inhalation, ou pour toute réaction susceptible de dégager des gaz toxiques, et loin d'une source de chaleur ou d'électricité statique. Ne jamais jeter à l'évier des solvants toxiques ou inflammables. Se laver soigneusement les mains après la manipulation des produits toxiques. Ne jamais fumer, boire, manger, dans la salle de Travaux pratiques. 34

Pour utiliser des produits volatils, toxiques, il est indispensable de porter un masque de protection respiratoire. Ne pas stocker en laboratoire des quantités importantes : * de solvants * de réactifs susceptibles de se décomposer spontanément à température ambiante * de produits réagissant violemment avec l'eau * de produits toxiques, qui seront gardés sous clé.
PREVENTION DES RISQUES D'INCENDIE ET D'EXPLOSION 1) Incendie et explosion

La déclaration d'un feu est consécutive à la coexistence de trois conditions : a- présence d'un combustible b- présence d'un comburant c- présence d'une source de chaleur. Le feu peut prendre un caractère explosif pour certaines proportions du mélange combustiblecomburant.
L'électricité peut être aussi à l'origine d'incendie, d'explosion, de brûlures ou d'électrocution. Attention aux mains mouillées ! ! ! A partir de quelques milliampères, le courant peut être dangereux dès l'instant où les tensions sont supérieures à quelques dizaines de volts. Dans les conditions habituelles, la résistance du corps humain est généralement comprise entre 1000 et 2000 ohms. Un courant d'intensité 0,22A est largement suffisant pour entraîner la mort.

La suppression du risque d'incendie ou d'explosion est associée à la suppression de l'une de trois conditions (appelées côtés du "triangle" du feu) : a- suppression du COMBUSTIBLE Une bonne ventilation permet d'empêcher l'accumulation des vapeurs volatils combustibles qui peuvent s'accumuler dans la salle et former avec l'air un mélange explosif. La ventilation consiste à avoir environ 3 ou 4 trous de 10 à 15 cm de diamètre répartis en bas et sur toute la longueur de la salle. b-Suppression du COMBURANT On travaille en présence d'air, il est difficile de supprimer ce risque. c- suppression de CHALEUR On doit éviter toute surchauffe locale.
2) Moyens d'intervention a- Cas d'incendie Au laboratoire, les feux qui prennent accidentellement peuvent s'éteindre rapidement si le poste de travail est bien ordonné et si nos réactions sont rapides et sûres. b- Lutte contre le feu Pour arrêter un incendie, il faut éliminer l'un des trois côtés du "triangle" du feu.

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c- Les types de feu Classe A Nature

B C D

Feux de matériaux solides (cellulose, bois, tisss, papier) dont la combustion se fait généralement avec formation de braises. Ces feux sont parfois dits "feux secs". Feux de solides liquéfiables ou de liquides (produits pétroliers, alcool, huiles, solvants organiques, graisses). Ces feux sont parfois dits "feux gras". Feux de gaz : méthane, propane, butane. Feux spéciaux: métaux, ..., phosphore.

d- Les extincteurs utilisés au laboratoire Les deux extincteurs les plus utilisés sont : - l’extincteur à poudre (d'hydrogénocarbonate de potassium, de phosphate d'ammonium ...) propulsée par du dioxyde de carbone - l’extincteur à dioxyde de carbone : lors de sa libération dans l'atmosphère, celui-ci subit une détente qui s'accompagne d'un refroidissement, une partie passe à l'état solide et provoque un refroidissement et un étouffement.

4 - Les règles à respecter GARDEZ VOTRE SANG FROID !

1) USAGE DE LA VERRERIE

Tenez un tube à essais entre le pouce et l'index, près de l'ouverture, jamais au milieu du tube. Ne tenez jamais le tube à essais en dirigeant l'ouverture vers votre visage ou vers celui de votre voisin. Tenez le tube incliné selon le grand axe de la table, l'ouverture du côté du paroi, de la cloison, des fenêtres. Pour mettre un solide en poudre dans un tube à essais, utilisez une spatule ou un papier plié en deux. Descendez lentement l'agitateur dans un tube à essais. Ne remplissez jamais complètement un tube à essais, surtout s'il faut chauffer : 2 cm de hauteur de liquide, ou un quart de cm de hauteur de solide, pas plus. [Pour enflammer un gaz qui se dégage d'un tube à essais, mettez la main sur le côté du tube et présentez l'extrémité de l'allumette juste au-dessus du tube. Attention aux flammes incolores, très peu visibles, comme celles du dihydrogène (H2)].

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Pour enfoncer un tube de verre dans le trou d'un bouchon, saisissez-le délicatement entre le pouce et l'index, à travers un chiffon, près de l'extrémité que vous voulez mettre dans le bouchon. Humidifiez légèrement le tube. Enfoncez-le en tournant. Si le tube est coudé, ne mettez jamais la paume de la main sur la partie coudée. Après usage, posez le tube délicatement dans le portoir : tenez-le jusqu'à ce que le fond touche le socle.
2) MANIPULATIONS DE LIQUIDES Pour verser un liquide d'un flacon dans un tube à essais, ou d'un tube à essais dans un autre, tenir les récipients inclinés. S'il s'agit d'un liquide corrosif, tenir le tube avec une pince. L'étiquette des flacons doit se trouver diamétralement opposée au côté où coule le liquide. Pour protéger les doigts, tenir le flacon en mettant le pouce d'un côté de l'étiquette, l'index et le médius de l'autre. Pour éviter tout incident, verser lentement le liquide. S’il s’agit d’une dilution d’acide ou de base concentré, verser lentement l’acide dans l’eau, en remuant : la dilution de ces liquides dégage beaucoup de chaleur. Ne jamais verser d’eau dans un acide ou une base concentrée. Il y a risque de projections. Ne jamais mélanger de liquides sans l'avis de l’enseignant. Il y a risque de réactions brutales et de projections. Ne jamais verser un liquide froid dans un liquide chaud, il y aurait des projections brutales et corrosives. Refroidir d'abord le tube à essais et son liquide chaud en le mettant dans le porte tubes. N'ajoutez surtout pas de liquide froid dans le tube chaud. Pour mélanger deux liquides, ne jamais retourner sur le pouce. Utiliser l’agitateur rotatif ou boucher le tube avant agitation en maintenant le bouchon en place par pression de l’index. Certaines réactions entraînent un dégagement gazeux : ATTENTION AUX PROJECTIONS ! Pour déceler une odeur, ne mettez jamais le récipient sous le nez. Si le tube contient un produit chaud, il y a risque de brûlures aux yeux et dans le nez, lorsque le gaz est corrosif et que le dégagement est abondant.

N'aspirez jamais aucun liquide corrosif ou toxique avec un tube effilé dit "pipette". Pour prélever du liquide dans un flacon ou dans un tube, plongez la pipette dans le liquide. Lorsqu'il aura fini de monter, fermez la pipette avec l'index et tenez-la entre le pouce et le médius. S'il faut absolument aspirer, utilisez de préférence une pipette automatique. Tenez toujours la pipette contenant le liquide au-dessus de la table. Ne pas pipeter les solvants à la pipette automatique ou pipette jetable en plastique, mais avec une pipette en verre.
3) CHAUFFAGE DE PRODUITS CHIMIQUES 1) Le brûleur

Avant d'allumer le brûleur, assurez-vous que le tube souple d'arrivée du gaz est posé sur la table de manière telle qu'il ne risque pas de faire basculer le brûleur. Pour allumer, fermez l'arrivée d'air, ouvrez le gaz, allumez en mettant la main du côté du brûleur, surtout pas au-dessus. Puis ouvrez progressivement l'arrivée d'air jusqu'au moment où

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un cône bleu apparaît dans la flamme. Fermez un peu l'arrivée d'air pour faire disparaître le cône bleu. Vous devez avoir une flamme régulière et incolore. Tenez-vous buste vertical, tête redressée. Maintenez vos cheveux. Eventuellement, faites un chignon ou portez un filet. Les cheveux pourraient s'enflammer. NE JAMAIS LAISSER LES CHEVEUX LIBRES. Maintenez le brûleur à l'écart du robinet d'arrivée du gaz. Il arrive parfois que la flamme rentre dans le brûleur, celui-ci ronfle, la flamme est verte. Attention, le brûleur devient brûlant en bas. Il enflamme parfois le tube souple. Fermez alors le robinet d'arrivée du gaz. Si vous ne le pouvez pas, demandez à l’enseignant de fermer le robinet de la salle. Enfin arrosez abondamment avec de l'eau le tuyau souple s'il continue à s'enflammer. Surtout ne soufflez pas. Lorsque le chauffage d'un tube ou d'un ballon est terminé, mettez le brûleur en flamme éclairante, si possible, en fermant l'arrivée d'air. Si la flamme reste invisible, virole fermée, éteignez-la.
2) Chauffage de produits chimiques

Pour chauffer un liquide ou un solide dans un tube à essais, tenez celui-ci près de l'ouverture avec une pince à tube en bois. Tenez-la par le manche. Ne mettez jamais la pince dans la flamme, elle charbonne ou s'enflamme. Pour chauffer un liquide dans un tube à essais, et à plus forte raison pour le porter à l'ébullition, ne chauffez jamais le fond du tube: placez la surface de séparation air / liquide dans la partie chaude de la flamme incolore et dirigez l'ouverture du tube à essais vers la cloison ou les fenêtres. Pour chauffer progressivement, déplacez doucement le tube horizontalement dans la flamme. Si l'ébullition est trop rapide, ou si la réaction s'emballe, soulevez-le verticalement au-dessus de la flamme et baissez-le de manière à obtenir un dégagement gazeux tranquille. Pour chauffer des produits chimiques dans un petit ballon (100 ou 125 mL), tenez-le avec une pince à tube à essais. Prenez les mêmes précautions que précédemment. Pour chauffer un ballon fixé à un support de chimie, installez-le sur une toile métallique en bon état. Si le feu prend dans un récipient, ne soufflez pas. Eteignez le brûleur. Prenez une toile métallique ou une soucoupe à l'aide d'une pince à tube et posez-la délicatement sur le récipient. Attendez que la flamme s'éteigne. N’ajoutez pas d'eau qui risque de briser le récipient et d’étaler les flammes sur la table. On peut aussi prendre une serpillière mouillée et la poser tranquillement sur le récipient. Il y a peu de risques pour que les paillasses prennent feu.
4) NETTOYAGE

Les produits chimiques contenus dans les flacons doivent rester purs. Par conséquent, ne remettez jamais dans un flacon un produit ou un mélange resté inutilisé, qu'il soit solide ou liquide. A la fin de la séance de manipulation, videz et rincez tous vos tubes et ballons dans les bidons « Déchets » réservés à cet effet. Quand vous utilisez le goupillon pour nettoyer un tube, sortez-le lentement et progressivement pour éviter de recevoir des éclaboussures de produits chimiques. Nettoyez soigneusement la paillasse ou la table quand des produits chimiques y sont tombés. Prenez un chiffon ou un papier, éventuellement tenu avec une pince pour protéger les doigts. 38

Surtout n'envoyez jamais des produits chimiques sur le sol et ne jetez pas de solides ni de liquides concentrés dans l'évier. Faites couler l'eau dans l'évier très abondamment chaque fois que vous y aurez vidé accidentellement des produits chimiques.
Ne pas verser le contenu des tubes et des fioles dans l’évier mais dans les bidons « DECHETS ORGANIQUES » ou « DECHETS AQUEUX » prévus pour cela. Ramassez soigneusement tout ce qui tombe sur le sol. Pensez aux accidents dont les aides de laboratoire pourront être victimes en faisant le nettoyage des tables, des éviers et du sol.

LES REGLES DE BASE
LES INTERDITS FUMER, BOIRE, MANGER TRAVAILLER SEUL PORTER DES VÊTEMENTS INADAPTÉS (flottants ou inflammables)

LES OBLIGATIONS BLOUSE EN COTON CHEVEUX LONGS ATTACHÉS

LES UTILES GANTS LUNETTES DE SÉCURITÉ

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PRODUITS BIOLOGIQUES
A. PAVIS

Les laboratoires de Microbiologie et d’Hématologie concentrent un certain nombre de risques infectieux bactériens, viraux, parasitaires, qui sont liés à la manipulation d’agents pathogènes ou de produits biologiques contaminés (sang et ses dérivés, selles, urines…). En conséquence, diverses mesures de prévention doivent être prises pour assurer la sécurité au Laboratoire. Les agents biologiques pathogènes * au laboratoire de Microbiologie : L’arrêté du 18 juillet 1994 fixe la liste des agents biologiques pathogènes. La classification s’appuie sur différents critères : pathogénicité et virulence, mode de transmission, gravité de la maladie, potentiel épidémique, existence d’une prophylaxie et/ou d’une thérapeutique. Il existe 4 classes numérotées de 1 à 4 : - la classe 1 comportant des micro-organismes non pathogènes pour l’Homme - la classe 4 des agents pathogènes provoquant des maladies graves pour l’Homme, pour lesquelles il n’existe pas de traitement. * au laboratoire d’Hématologie : essentiellement virus des hépatites B et C, virus du SIDA Les modes de contamination La transmission peut se faire par voie transcutanée et cutanéo-muqueuse, aérienne, digestive. - voie transcutanée et cutanéo-muqueuse : par coupure, piqûre, projection sur les muqueuses ou par contact d’une peau lésée avec des surfaces contaminées - voie aérienne : par inhalation d’aérosols - voie digestive : risque essentiellement lié au pipetage. Il existe différents systèmes d’aspiration qui seront impérativement utilisés. Prévention du risque infectieux Considérer tout prélèvement comme potentiellement contaminé et prendre pour tous les prélèvements les mêmes précautions Les stratégies de préventions sont multiples et leur application s’appuie sur de nombreux textes réglementaires Le respect des règles de bonnes pratiques d’Hygiène, la formation et l’information des manipulateurs, la décontamination et le nettoyage du matériel, des locaux et des paillasses, l’élimination des déchets font partie de la politique de prévention active.

LA SECURITE AU LABORATOIRE EST L’AFFAIRE DE TOUS

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GESTION DES DECHETS CHIMIQUES ET BIOLOGIQUES
F. JORAND Toute activité humaine génère des déchets divers. Certaines activités de recherche ou d’enseignement produisent des déchets dangereux (déchets chimiques toxiques ou inflammables, déchets biologiques pathogènes, déchets radioactifs…).

I - EVALUER LES RISQUES Les déchets présentent au moins les mêmes dangers que les produits neufs correspondants. A ces dangers peuvent s’ajouter les risques liés à la transformation spontanée ou provoquée des produits sous l’influence d’autres produits, de divers facteurs imprévisibles ou du temps (lumière, température, vieillissement…). A ce titre, la gestion des déchets doit être considérée comme une composante fondamentale des expériences réalisées dans les laboratoires de recherche et les salles de travaux pratiques. II - PREVENIR LES RISQUES La prévention relative aux déchets de différentes natures est identique à celle décrite pour les activités les ayant générés. Pour pouvoir être éliminés sans porter atteinte aux personnes et à l’environnement, les déchets nécessitent des traitements spécifiques (détoxications chimiques ou biologiques, incinération…). III - GERER LES DECHETS
Dans les établissements, il convient d’organiser la collecte, l’entreposage et l’évacuation des différents types de déchets, car le producteur en est toujours responsable. Pour les déchets industriels spéciaux (DIS), il importe qu’au moment de leur remise au transporteur, leur confinement soit tel qu’il n’y ait aucun risque de porter atteinte aux personnes chargées de la collecte, du transport et de l’élimination. Chaque enlèvement doit être obligatoirement accompagné d’un bordereau de suivi de déchets industriels (BSDI). CATEGORIE DU DECHET NATURE DU DECHET FILIERES D’ELIMINATION

Ordures ménagères Déchets produits exclusivement par les personnels logés, les cafétérias, les restaurants Déchets inertes

Ramassage municipal ou collecteur privé Collecteur privé

Mobilier, gravats, encombrants

Déchets industriels Papiers, cartons, emballages, verres non Ramassage municipal ou souillés, bois collecteur privé banals (DIB)

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DECHETS INDUSTRIELS SPECIAUX (DIS)
CATEGORIE NATURE DU DECHET FILIERES D’ELIMINATION

DECHETS CHIMIQUES (non infectieux, non radioactifs)

-Liquides Solvants halogénés ou non, acides, bases, colorants, produits photographiques, huiles… -Solides (y compris les conteneurs vides), résidus de chromatographie, gants, lames de microscope, aiguilles… Cas particulier de l’amiante Flocage, cordons, plaques, poussières et tous matériaux contenant de l’amiante Liquides Inactivés ou non Solides Inactivés ou non, déchets d’activités de soins, de recherche, tous objets piquants et coupants, cadavres d’animaux, litières…

Emballages appropriés, réglementaires, et étiquetés

Enlèvement et traitement par une entreprise spécialisée et agréée, BSDI

Déchets en emballages spéciaux, double enveloppe, étiquetés

Enlèvement et traitement par une entreprise spécifique spécialisée et agréée, BSDI spécifique

DECHETS BIOLOGIQUES (non radioactifs)

Emballages à usage unique, inviolables et étiquetés Ces déchets doivent être soit incinérés, soit prétraités par des appareils de désinfection Conteneurs réglementaires, étiquetés fournis par l’ANDRA

Stockage temporaire en chambre froide ou congélateur Enlèvement et traitement par une entreprise spécialisée agréée, BSDI Période supérieure à 100 jours Enlèvement par l’Agence Nationale pour la Gestion des Déchets Radioactifs (ANDRA)

DECHETS RADIOACTIFS

Solutions aqueuses (LA) Solvants organiques (LS) Solides putrescibles (SO) Solides compactables (SP) Flacons de scintillation en polyéthylène (SL) Flacons de scintillation en verre (SLV)

bonbonnes

fûts métalliques

Stockage en conteneurs appropriés, étiquetés et datés Après décroissance : 10 périodes à partir du dernier dépôt, enlever le pictogramme radioactif

Période inférieure à 100 jours Gérés selon leur nature comme des déchets banals chimiques biologiques

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SECURITE LES MINERAUX 1 - Oxydants fort concentrés risquant de donner des réactions explosives en présence de réducteurs - Acides perchloriques - paracétiques -périodiques persulfuriques (acide de caro) - Perchlorates - paracétates - périodates -permanganates... De façon générale tous les persels et tous les paracides. 2 - Produits concentrés risquant de provoquer de très fortes élévations de température - Anhydride sulfurique - Anhydride acétique - Chlorure de sulfuryl - Chlorofluorure de sulfuryl... et de façon générale, tous les oléums. 3- Produits risquant de s’enflammer au contact de l’eau - Sodium - Nitrure de sodium - Hydrure de sodium - Potassium... et tous les alcalins et alcalino-terreux sous forme métallique. Produits risquant de s’enflammer au contact de l’air : - En particulier, phosphore blanc.

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SECURITE MELANGES A EVITER DANS LES BONBONNES CEDILOR ORGANIQUES Tous les déchets pouvant prendre en masse dans les bonbonnes. Tous produits risquant de réagir spontanément de façon très exothermique ou explosive. 1 - Composés vinyliques - Chlorure de vinyl - Chlorure de vinylède - Styrène - Acrylates, etc... 2 - Composés carbonylés - Anhydrides organiques - Chlorures d’acides 3 - Produits azotés - Tous nitrites et nitres de façon générale 4- Composés à liaisons non saturées conjuguées - Butadiène - Nitrite acrylique - Acroléine - Crotonaldéhyde, etc... 5 - Produits auto-réactifs - Cétène - Oxyde d’éthylène 6 - Paroxydes - Acétyléniques - Tous les peroxydes et tous les acétyléniques

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LISTE DES MELANGES A EVITER

01 Acides minéraux 02 Acides organiques 03 Bases (ammoniaque exclu) 04 Amines et alkanolamines 05 Composés halogénés 06 Alcools, glycols et éthers de glycol 07 Aldéhydes 08 Cétones 09 Hydrocarbures saturés 10 Hydrocarbures aromatiques 11 Oléfines 12 Huiles de pétrole 13 Esters 14 Monomères et esters polymérisables 15 Phénols 16 Oxydes d’alkylènes 17 Cyanohydrines 18 Nitriles 19 Ammoniac (NH3) 20 Halogènes 21 Ethers 22 Phosphore élémentaire 23 Soufre à l’état de mélange 24 Anhydrides d’acide

01 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 02 ● ● ● 03 04 ● 05 06 ● 07 ● 08 09 10 11 12 13 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● 14 ● ● 15 ● 16 ● ● ● 17 18 ● 19 ● 20 ● 21 ● 22 ● 23 24 ●

● ● ● ●

● ● ● ●

● mélange à éviter

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SECURITE AU LABORATOIRE, SECURITE DES LOCAUX
L. DIEZ A) Rappels

Loi (Code du travail) Responsabilités pénales Rappel sur l'organisation universitaire de l'Hygiène et de la Sécurité (Comité Hygiène et Sécurité)
B) Sécurité des bâtiments

Plan de prévention Sécurité incendie Savoir lire un plan et utiliser les renseignements fournis Respect des indications et des installations
C) Sécurité au laboratoire

Rappel sur les BPL (port de blouse, lunettes, gants…) Exigences des manipulations (hottes, paillasses…) Les interdits Prévention - Responsabilité Que faire en cas d'incident ? Cahier Hygiène et Sécurité

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MESURE DES VOLUMES ET DES MASSES

VERRERIE, PIPETAGE, PESEE

VERRERIE ET VOLUMETRIE

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VERRERIE, PIPETAGE, PESEE

UTILISATION DES PIPETTES
J. COULON

1 – Choix des pipettes à utiliser
Ce choix s'effectue en fonction : - de la nature du liquide : ne pas utiliser de pipettes en plastique pour les solvants organochlorés. Pour tous les liquides dangereux (acides et bases concentrés, toxiques), utiliser une propipette, ou une pipette automatique.
NE JAMAIS PIPETER A LA BOUCHE - du volume désiré : utiliser, dans la mesure du possible, des pipettes jaugées à deux traits. Il est par contre nécessaire d’utiliser des pipettes graduées, lors du prélèvement de liquide visqueux (exemple : sang total) ; dans ce cas, il est recommandé de laisser le liquide s’écouler très lentement, et de rincer la pipette une fois avec de l’eau distillée ou un réactif de façon à éviter les pertes. Lors de l’emploi de pipettes graduées, choisir une pipette dont le volume est légèrement supérieur au volume du liquide à mesurer (exemple : mesurer 3,2 mL avec une pipette de 5 mL). Pour des volumes inférieurs à 0,100 mL, utiliser de préférence des micropipettes en verre ou automatiques.

2 - Utilisation des pipettes
2.1. Règles générales Une pipette propre ou sale ne doit jamais rester sur une paillasse pour des raisons de propreté et de sécurité. Les pipettes propres doivent être rangées sur un porte-pipettes. Après utilisation, les pipettes en verre doivent être placées dans un récipient contenant une solution d’attente de nettoyage (sulfochromique très dilué ou détergent). Les pipettes doivent y être placées pointes dirigées vers le haut. En général, le récipient cylindrique contient un panier amovible qui permet le transfert de toutes les pipettes dans un autre récipient contenant du mélange sulfochromique pur. Après un passage bref (quelques heures) dans le mélange sulfochromique, le panier est transféré dans un laveur automatique et l’ensemble subit un grand nombre de rinçages par de l’eau non distillée. Ce rinçage est assuré par un système de siphon qui permet la vidange intermittente et rapide de l’ensemble du bac, alors que l’entrée de l’eau est permanente, mais lente. Puis les pipettes sont séchées individuellement par passage d’air chaud (50°C au maximum). 2.2. Règles de pipetage - Vérifier que la pipette est propre, sèche, non ébréchée aux parties inférieures et supérieures

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- Pipeter le liquide jusqu'à un niveau légèrement supérieur au trait de jauge - Essuyer l'extérieur de la pipette à l'aide d'un papier absorbant - Ajuster le niveau supérieur en maintenant la pipette verticale, les yeux restant constamment au niveau du ménisque inférieur du liquide qui doit affleurer le trait de jauge - Laisser couler lentement le liquide jusqu'au trait de jauge inférieur - La pointe de la pipette repose délicatement sur la paroi du récipient qui est légèrement incliné, la pipette étant bien droite - Après avoir délivré le volume choisi, rejeter le reste du liquide (sauf s’il s’agit d’un réactif qu’il convient d’économiser ou d’un réactif toxique ou polluant) - Placer la pipette sale dans une éprouvette de plastique remplie d’eau. Ceci permettra d’éviter que les pipettes ne se bouchent.
Remarques : 1) Il est essentiel d'essuyer l'extérieur de la pipette, surtout lorsque l'on mesure de petits volumes ou que le liquide est visqueux. 2) On ne souffle dans une pipette que si elle est à écoulement total et d'un volume inférieur à 1 mL. 3) Certains solvants sont volatils (éther, dichlorométhane, …) ou plus denses que l’eau (solvants chlorés). Laisser le liquide s’écouler plus rapidement que dans le cas d’une solution aqueuse en évitant les pertes au moment du transfert.

3 - Utilisation des micropipettes
TRES IMPORTANT - Avant utilisation, CHOISIR LE BON INSTRUMENT en fonction du volume désiré, par exemple : * de 40 à 200 µL : utiliser une P 200 (embout jaune) * de 200 à 1000 µL : utiliser une P 1000 (embout bleu) Il est ABSOLUMENT INTERDIT d'utiliser les P 200 et P 1000 en dehors des "fourchettes" ci-dessus précisées. - Aucun liquide ne doit pénétrer dans le corps de la micropipette. Les solutions prélevées ne doivent être en contact qu'avec les cônes de prélèvement bleus ou jaunes. La micropipette doit toujours être maintenue verticalement et l'extrémité inférieure vers le bas.

Suivre la séquence suivante pour le pipetage (s'exercer quelques fois avec de l'eau distillée avant de réaliser votre premier prélèvement) : - sélectionner le volume désiré (tourner le bouton supérieur vers la droite ou la gauche), - bien enfoncer un cône bleu ou jaune à l'extrémité inférieure de l'appareil, - presser le bouton supérieur au premier cran (cran intermédiaire) avec le pouce, - immerger alors une partie du cône dans le liquide à prélever, - laisser remonter lentement le bouton supérieur vers sa position normale (ne pas lâcher brusquement celui-ci) en exerçant une légère contre-pression avec le pouce, - vérifier qu'il n'y a pas de bulle(s) d'air au sein du volume prélevé, - essuyer le cône plastique avec du papier filtre, - transférer le liquide pipeté dans le récipient voulu en posant l'extrémité inférieure du cône sur la paroi du récipient légèrement incliné (environ 60°) et en appuyant sur le bouton supérieur de façon à parvenir au premier cran puis au deuxième cran, c'est-à-dire à fond. Après quoi, normalement, il ne doit pas subsister de liquide dans le cône. Toutefois, pour 49

des liquides à viscosité élevée, il restera toujours un volume résiduel sur les parois qui se concentrera peu à peu à la base du cône. Dans ce cas, il est possible de limiter les erreurs de pipetage : a) en réalisant des aller-retours successifs avec le bouton supérieur. Pour ce faire, procéder lentement pour éviter que du liquide rentre dans le corps de la micropipette, b) en rinçant à 2 - 3 reprises l'intérieur du cône avec le mélange eau distillée + solution visqueuse.

4 - Contrôle des pipettes
Le contrôle des pipettes fait partie des vérifications nécessaires en chimie. Deux procédés sont utilisés : - le contrôle gravimétrique Un bécher de volume approprié est taré sur une balance. La pipette est remplie d’eau distillée qui est ensuite introduite dans le bécher. Cette opération est répétée 30 fois en moyenne. Les résultats des pesées sont ensuite analysées de manière statistique. Remarque : Contrôler la température de travail car la densité des liquides dépend de la température. Eviter toute évaporation. - le contrôle photométrique Il consiste à pipeter un volume donné d’une solution colorée, à l’introduire dans un volume de diluant donné et à mesurer l’absorbance de la solution obtenue. On peut alors déterminer l’exactitude et la précision des pipettes :
- expression de la précision La précision représente la distribution statistique des valeurs obtenues par des mesures répétées, effectuées sur un même échantillon, dans des conditions constantes et déterminées. On calcule, à partir de ces mesures, le manque de précision ou « imprécision ». Celle-ci peut s’exprimer par l’écart type de la distribution de ces mesures, l’écart type relatif à la moyenne, ou par le coefficient de variation, qui est le plus classiquement utilisé. - expression de l’exactitude L’exactitude représente la qualité de l’accord entre la valeur mesurée et la valeur vraie, en dehors des erreurs fortuites. L’inexactitude peut être appréciée par la différence (positive ou négative) entre la moyenne d’une série de mesures répétées et la valeur vraie. Dans le cas du contrôle gravimétrique, la valeur vraie doit tenir compte de la valeur de la densité de l’eau à la température utilisée. Dans le cas du contrôle photométrique, la valeur vraie est donnée par la valeur de l’absorbance de la dilution préparée dans un volume final de 100 mL. Exemples Les valeurs de précision et d’exactitude varient en fonction du volume des pipettes. Le tableau ci-dessous, issu de spécifications de pipettes automatiques du commerce, en donne quelques exemples.

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Capacité 1 µL 2 µL 5 µL 10 µL 20 µL 25 µL 50 µL 100 µL – 2500 µL

Erreur de justesse ± 2,5 % ± 2,0 % ± 1,5 % ± 1,0 % ± 0,6 % ± 0,6 % ± 0,6 % ± 0,6 %

Erreur de répétabilité ≤ 1,8 % ≤ 1,2 % ≤ 0,8 % ≤ 0,5 % ≤ 0,2 % ≤ 0,2 % ≤ 0,2 % ≤ 0,2 %

Conditions opératoires : Eau distillée Température de référence : 20°C Nombre de mesures : 15 Ainsi, une pipette de 1 µL délivre, d’après ce constructeur, un volume compris entre 0,975 µL et 1,025 µL. Par contre, le volume (compris entre ces deux extrêmes) est délivré avec un coefficient de variation de 1,8 %. Il est à noter que plus les volumes sont petits, plus les erreurs sont grandes.

5 - Utilisation des propipettes
La propipette est un système utilisé lorsque l'on veut pipeter des liquides DANGEREUX. Le modèle utilisé aux T.P. est le ballon à pipettes "ASSISTENT" modèle standard.

Le mode d'emploi est le suivant : 51

1-. Tenir le ballon dans le creux de la main, au moyen du pouce et de l'index, appuyer sur la soupape R et exercer une pression sur le ballon avec les doigts, pour en chasser l'air. 2-. Avec le pouce et l'index, appuyer légèrement sur la soupape A (Aspiration) pour recueillir la quantité de liquide désirée. 3-. Pour obtenir l'écoulement du liquide, appuyer sur la soupape M avec le pouce et l'index. 4-. Pour l'écoulement total et rapide, appuyer sur la soupape M et fermer l'orifice avec l'index de la main gauche en exerçant une pression sur l'olive au moyen du pouce et du majeur.
Nota : Au cas où du liquide aurait pénétré à l'intérieur du ballon, prévenir de suite le responsable des T.P.

6 - Utilisation des distributeurs de réactifs
Le distributeur est un appareil destiné à délivrer avec précision, de manière répétitive, rapide et simple un volume déterminé. On l’emploie pour les produits toxiques avec lesquels il ne faut pas être en contact ou pour les travaux en série qui nécessitent la répétition des opérations de pipetage. La plupart des distributeurs sont composés d’un flacon réservoir contenant le liquide à prélever sur lequel est monté un piston que l’on fait courir jusqu’à une butée réglable. Les volumes délivrés peuvent variés de moins de 0,1 à plus de 50 mL selon les modèles. La reproductibilité est de l’ordre de ± 5 %. Les parties de l’appareil venant en contact du liquide sont en verre ou en PTFE ; ils peuvent convenir à toutes sortes de réactifs, néanmoins les produits trop visqueux risquent de bloquer le piston. De même, certains sels peuvent cristalliser dans la seringue.
POUR UTILISER L’APPAREIL : Lors de la première utilisation, on ne se fiera pas aux volumes indiqués mais on étalonnera soi-même l’appareil et on fixera la butée au volume désiré. Pour l’utilisation en série, on doit d’abord orienter convenablement la pointe de la pipette vers le récipient destiné à recevoir le liquide. On ôte ensuite le capuchon pour libérer l’orifice éventuellement, puis on soulève (ou on enfonce selon le modèle) le piston jusqu’à la butée avec précaution et on le laisse revenir à sa place d’origine. La meilleure reproductibilité est obtenue en manœuvrant lentement. On doit reboucher la pointe de la pipette après utilisation. Les distributeurs existent actuellement en très grand nombre dans le commerce et tous les modes opératoires ne peuvent être décrits ici. Certains seront utilisés aux Travaux Pratiques. Leur contrôle s’effectue de la même manière que pour les pipettes.

7 - Manipulation : initiation au maniement des micropipettes automatiques
7.1. Réalisation de gammes d’étalonnage par différentes méthodes de dilution

- Matériel : - des micropipettes et cônes - des tubes à hémolyse - un spectrophotomètre - un vortex - des cuves de spectrophotomètre de 1 mL en plastique

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- Mode opératoire : dilutions dans un volume final constant : - Dans des tubes à hémolyse, introduire des volumes croissants de colorant à une concentration donnée: 10 µL, 50 µL, 100 µL, 150 µL, 250 µL, 500 µL - Compléter à un volume final de 1 mL.
7. 2. Contrôle gravimétrique d’une micropipette

- Matériel : - 2 béchers de 100 mL - eau distillée à température ambiante - une micropipette - une balance… - Protocole : - tarer un bécher sur la balance - régler la pipette sur un volume de votre choix - pipetter l’eau distillée et ensuite l’introduire dans le bécher - répéter 15 fois la mesure - renouveler l’opération pour un volume différent affiché sur la micropipette. - Expression des résultats : Calculer le coefficient de variation correspondant à vos mesures pour un volume donné.

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PESÉE
F. BONNEAUX - J. COULON - D. DECOLIN - B. LEININGER-MULLER - C. ZINUTTI

La pesée est l’opération pharmaceutique de base par excellence. A l’officine, elle conditionne la qualité des préparations réalisées. Nombreuses sont les recommandations des «Bonnes pratiques de préparations officinales », normes officielles, qui s’appliquent au bon usage des balances : « Le matériel nécessaire à la préparation est… en bon état de fonctionnement et de propreté » - « La pesée des principes actifs fait l’objet d’une surveillance toute particulière du pharmacien : dans le cas des substances vénéneuses notamment, le pharmacien procède à une vérification de la pesée » « Procédures générales : elles concernent notamment : ….. la maintenance et l’entretien du matériel (balance par exemple) ». Nombreux sont les autres domaines d’activité pharmaceutiques concernés par la pesée : la possession d’une balance de précision est obligatoire dans les laboratoires d’analyse médicale ; des pesées précises sont primordiales en recherche comme dans l’industrie…

I – Matériels
A – Balances 1 - Paramètres définissant les qualités d’une balance a) Justesse : c’est-à-dire capable de fournir les mêmes indications (maintien en parfait équilibre dans le cas d’une balance à fléau) sous des masses égales quelles que soient leurs position et emplacement, aussi bien qu’à vide b) Fidélité : c’est-à-dire capable de donner toujours les mêmes indications avec les mêmes masses c) Sensibilité : c’est-à-dire capable de répondre (d’osciller dans le cas d’une balance à fléau) avec une quantité minimum de masse. Ainsi, il existe des balances dites sensibles au milligramme, au centigramme d) La portée, qui est la masse maximale mesurable avec l’instrument La vérification obligatoire et périodique des instruments de mesure a pour but précisément de contrôler la conservation de ces qualités essentielles. 2 – Types de balances Au cours de vos études et dans votre vie professionnelle, vous rencontrerez essentiellement 4 types de balances. a) Balance de Roberval C’est la balance à plateau la plus couramment employée pour mesurer les masses élevées. Sa sensibilité est de l’ordre du gramme et peut supporter des poids maxima de 2 à 15 kilogrammes selon les modèles. Pratiquement, on lui réserve, en pharmacie, les pesées supérieures à 5 g. Le fléau est muni de 3 couteaux (1 médian, 2 latéraux) ; sur les fléaux latéraux, se trouvent 2 tiges verticales supportant les plateaux. Un contre-fléau inférieur relie les 2 tiges verticales pour que celles-ci conservent toujours leur position. Un cadran central permet de suivre les oscillations. Au repos, cette balance est donc toujours en position oscillatoire. On l’utilise avec des masses en laiton généralement (de 1 g à 1000 g).

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b) Trébuchet C’est un type de balance permettant des pesées plus sensibles. Sa portée est généralement de 100 g ou 200 g avec une sensibilité de 0,05 g ou 0,10 g. Le fléau est représenté par une barre horizontale rigide, le couteau central est perpendiculaire au fléau ; aux deux couteaux latéraux, sont suspendus les plateaux. Pour ménager l’arête des couteaux, les plateaux reposent sur un socle en bois et sont mis en suspension au moment de la pesée par la manœuvre d’un levier ou d’un bouton. On l’utilise avec des masses en laiton généralement (> 1 g), correspondant à la portée de l’instrument et avec une série de lamelles métalliques, en aluminium généralement, pour les subdivisions du gramme. c) Balances électriques Il s’agit de balances mono-plateau. Les masses sont intégrées dans l’appareil et sont sélectionnées manuellement. Leur mode de fonctionnement, leur portée et leur sensibilité varient selon le modèle considéré. d) Balances électroniques et/ou analytiques Il s’agit de balances mono-plateau. L’appareil fonctionne sans fléau ni couteau et il possède un système de tarage automatique (cf NB1). Leur portée et leur sensibilité varient selon le modèle considéré. Ce type d’appareillage, le plus simple à manier, supplante les autres balances de précision. Nota : Pour une meilleure précision des mesures, ces balances, excepté le type Roberval, peuvent être protégées par une « cage » transparente. B – Petit matériel de pesée En fonction de la nature de l’élément à peser, on utilisera comme tare soit : - un verre de montre (cas le plus général) - un sabot de pesée - un papier non absorbant, anti-humidité et souple (pas de papier filtre donc pour une pesée précise) - une feuille d’aluminium - un bécher - une fiole jaugée En pratique, chaque fois que cela est possible, il est préférable d’éviter le transfert de la substance pesée, c’est-à-dire qu’il est préférable, soit de peser directement dans le récipient dans lequel la substance doit être utilisée, soit d’introduire l’ensemble (substance pesée + support) dans ce récipient. Si un transfert est nécessaire, il conviendra le cas échéant de bien rincer le matériel ayant servi à la pesée et de joindre les eaux de rinçage à la solution préparée, ou d’opérer une pesée par différence (NB2). NB1 : La tare est la masse d’un récipient vide. Le tarage consiste à amener la lecture à 0 avec la tare posée sur la balance. NB2 : La pesée par différence consiste à mesurer l’ensemble tare + produit à peser (m1), à transférer le produit à peser, puis à mesurer la tare (m2). La masse du produit transféré est la différence entre les 2 mesurer (m1 – m2). NB3 : Dans le cas des pesées précises sur papier ou feuille d’aluminium, les déplacements dans le laboratoire sont prohibés.

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NB4 : Dans le cas d’un liquide, connaissant sa masse volumique, il peut être plus facile de mesurer un volume que de réaliser une pesée.

II – Principes et méthodes de pesée
Certaines méthodes sont spécifiques à un matériel donné, tandis que des principes généraux prévalent dans tous les cas. A – Principes généraux 1 - Ordre et propreté L’ordre et la propreté s’imposent pour les pesées comme pour toutes les opérations pharmaceutiques • Nettoyage de la balance et de son environnement • Protection des plateaux de la corrosion (ex : Iode, Nitrate d’argent) par un papier • Elimination de tout ce qui peut conduire à une confusion ou une contamination 2 – Qualité de la pesée a) Le choix de la balance doit être adapté à la masse à déterminer. Ainsi, il faut tenir compte de la portée maximale, de la portée minimale, de la sensibilité et de la précision de l’instrument. - il ne faut pas peser une masse inférieure à la pesée minimale, par exemple peser 20 mg quand la portée minimale de la balance est de 100 mg ; - il faut que la sensibilité de la balance permettre de lire le dernier chiffre significatif souhaité, par exemple s’il s’agit de peser 100 mg, une balance dont la sensibilité est de 0,01 g ne permettra de peser que 0,10 g c’est-à-dire 10 cg. Alors qu’une balance dont la sensibilité est de 0,001 g permettra de peser 0,100 g c’est-à-dire exactement 100 mg ; - il faut veiller à ce que la précision de la balance soit suffisante. Par exemple, il ne faut pas peser 5 mg sur une balance dont l’incertitude (∆m) est de 1 mg : dans ce cas, un affichage de 5 mg signifie que la pesée est comprise entre 4 et 6 mg, ce qui représente (∆m) une incertitude relative m considérable (∆20 %). b) Il importe de réfléchir au but de la pesée. Un composé destiné à préparer un étalon primaire ou une prise d’essai pour un dosage devront être pesés avec le plus grand soin. A ce propos, on utilise parfois dans les polycopiés de Travaux pratiques la formule « peser environ exactement ». Si on considère par exemple l’étalonnage d’une solution de KMnO4 environ 0,1 N, celui-ci est réalisé à l’aide d’une solution étalon de sel de Mohr 0,1 N (392,13 g/mole) qu’il convient de préparer extemporanément. Si on désire préparer 100 mL de cet étalon primaire, la pesée idéale devrait être 3,9213 g. Dans ce cas, peser environ exactement signifie qu’il ne faut pas chercher à avoir 3,9213 g (on peut y passer des heures), mais qu’il faut connaître avec précision ce que l’on a pesé, cette connaissance permettant de calculer le titre exact de l’étalon primaire (si on pèse 3,9950 g, le titre de la solution de sel de Mohr sera de 0,102 N). c) Dans le cas de masses très faibles (de l’ordre du mg), il vaut mieux peser une quantité plus importante et procéder par dilution Cas n° 1 : solution étalon : préparer une solution mère à partir de la pesée et procéder ensuite à des dilutions successives de celle-ci. Cas n° 2 : Incorporation de principes actifs à marge thérapeutique étroite en faible quantité : réalisation d’une poudre mère.

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La Pharmacopée décrit la préparation d’une poudre de digitaline au 1/100e par exemple : la masse de digitaline à peser est de 1 g pour 100 g de mélange (ou 100 mg pour 10 g…). La dilution est effectuée par du lactose, additionné d’un traceur en quantité déterminée, le carmin. Cette poudre mère est ensuite utilisée à la place du principe actif pour la suite des opérations, en tenant compte de la dilution effectuée : s’il faut 2 mg de digitaline dans la préparation magistrale, il sera nécessaire de peser 200 mg de poudre mère. d) En ce qui concerne la pesée de composés utilisés comme réactifs auxiliaires au cours d’une réaction chimique ou d’un dosage, on peut se contenter d’une pesée plus approximative. 3 – Enregistrement des mesures La traçabilité des mesures est d’une grande importance. Ainsi, il conviendra de porter les valeurs mesurées sur le cahier de laboratoire ; inscription manuscrite ou édition d’un ticket de pesée faisant mention de la mise à zéro notamment, dans le cas d’une balance électronique dotée d’une imprimante. B – Méthode spécifique à l’usage d’un modèle de balance donné 1 – Balance de Roberval 2 – Trébuchet a) On ne doit jamais poser ou enlever les masses si les plateaux ne sont pas au repos. On doit donc veiller à n’effectuer les pesées que dans ces conditions. b) On ne doit jamais effectuer une pesée directement sur les plateaux. Il faut interposer des feuilles de papier équilibrées. c) On ne doit pas se servir des masses au hasard mais en adoptant un ordre méthodique, c’est-à-dire en commençant par les plus grosses ; les masses ne doivent jamais rester inutilisées sur les plateaux. d) On ne doit jamais agir avec brutalité, mais au contraire avec délicatesse, pour conserver les qualités de la balance utilisée. e) Les balances et les masses doivent toujours être d’une propreté méticuleuse. Les plus légères, les subdivisions du gramme notamment, doivent être manipulées au moyen d’une pince. 3 – Balances électriques et électroniques Les points b et d concernant l’utilisation du trébuchet s’appliquent. Les spécificités d’emploi des balances électriques figurent sur la notice d’utilisation placée à proximité de l’appareil.

III – Résultat
La façon dont sont rapportés les résultats d’une pesée est très importante. La Pharmacopée considère le dernier chiffre donné exact à plus ou moins 5 unités après le dernier chiffre indiqué. En conséquence, lorsqu’on pèse par exemple un gramme d’une substance, écrire 1 g n’a pas la même signification qu’écrire 1,00 g (1 g : de 0,5 g à 1,5 g ; 1,00 g : de 0,995 g à 1,005 g). 57

Le résultat peut être accompagné de son incertitude absolue, par exemple : 1,00 g ± 0,005 g Dans le cas d’une pesée par différence, il ne faut alors pas oublier que l’incertitude absolue correspond à la somme des incertitudes absolues réalisées sur les deux pesées. Par exemple : Tare = 15,70 ± 0,005 g Si prise d’essai = 1,00 g, on lira : 16,70 g ± 0,005 g. D’où, résultat de la pesée = 1,00 ± 0,01 g.

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VERRERIE ET VOLUMETRIE
D. DECOLIN Chaque fois qu’un volume de liquide doit être mesuré, il convient de réfléchir à l’incidence du matériel utilisé sur le résultat de la manipulation en cours. En dehors des pipettes qui sont évoquées précédemment, on n’utilisera pas indifféremment les fioles jaugées, les burettes graduées ou les éprouvettes graduées. Les fioles jaugées Ce sont des récipients en verre ou en pyrex portant un trait de jauge. Leur bouchage est réalisé soit par un bouchon rodé, soit par un bouchon en silicone.

Leur emploi réside essentiellement dans la préparation de solutions de concentration exactement connue et dans la dilution exacte de solutions étalon ou à doser. Avant d’ajuster le niveau d’une fiole jaugée, on prend soin de dissoudre complètement la masse du produit pesé. Pour cela, après avoir ajouté le produit, on verse une certaine quantité d’eau distillée ou du solvant requis, on agite et on chauffe éventuellement très légèrement, puis on ajuste après refroidissement. L’homogénéisation de la solution s’effectuera, fiole bouchée, par de multiples retournements.
Les burettes graduées Ce sont des récipients cylindriques très allongés, gradués et munis à leur extrémité inférieure d’un robinet permettant l’interruption du flux. Ce robinet peut être rodé, ce qui nécessite son graissage soigneux ; s’il est en téflon, le risque de grippage est éliminé et aucun lubrifiant n’est nécessaire.

Les burettes permettent la distribution avec précision de volumes de réactifs titrés lors de dosages volumétriques ou lors de la préparation de gammes de concentration (capacité : 25 mL, précision : 0,05 ou 0,1 mL). Le dosage est généralement réalisé à la goutte près, soit 0,05 mL. Pour remplir « sans bavure » les burettes, il est utile d’utiliser un petit bécher de 50 mL par exemple. Après emploi, une burette doit toujours être vidée, rincée avec de l’eau distillée et stockée verticalement, robinet ouvert, et à l’envers (pointe en haut).
Les éprouvettes graduées Elles se présentent sous la forme de récipients cylindriques permettant la mesure de volumes de 5 mL à 5 L. Leur précision est très nettement inférieure à celle de pipettes ou fioles jaugées et leur emploi doit se limiter aux seuls cas où la mesure approximative de volumes de réactifs est suffisante.

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MICROSCOPIE

PRINCIPE DU MICROSCOPE A FOND CLAIR

EXAMEN A L’ETAT FRAIS ET A L’IMMERSION

MICROMETRIE

NUMERATION D’ELEMENTS FIGURES

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MICROSCOPIE OPTIQUE
Le microscope est un instrument très utile dans de nombreuses disciplines : en Botanique, en Physiologie végétale, en Pharmacognosie, comme en Parasitologie, en Histologie, en Hématologie, en Biologie cellulaire, en Microbiologie, en Biologie moléculaire… Dans la pratique courante, on emploie un microscope à fond clair. Toutefois, les laboratoires plus spécialisés utilisent des équipements permettant l’examen en fond noir, en contraste de phase, ou font appel de plus en plus à la microscopie de fluorescence. Cette séance a pour objet de vous apprendre, ou de vous rappeler les principes de base du microscope à fond clair (vus en 1ère année), ainsi que son mode d’emploi correct, et de faire quelques applications.

LE MICROSCOPE A FOND CLAIR
V. PICHON

1 – BASES D’OPTIQUE
A. LE TRAJET OPTIQUE La figure 1 montre le trajet optique : la source S envoie un faisceau lumineux sur l’objet O grâce à la lentille L1 appelée condenseur. La lentille L2 ou objectif, donne de l’objet une image agrandie I1 ; une partie de cette image est reprise par la lentille L3 ou oculaire pour donner une image finale agrandie I2 (Fig. 1).

Fig. 1 : Trajet optique du microscope à fond clair

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B. LES VALEURS CARACTERISTIQUES DU MICROSCOPE La limite de résolution ε est définie par la relation d’Abbe : 0,61λ ε= n.sinu - ε est la limite de résolution, c’est-à-dire la distance minimale entre 2 points pouvant être perçus comme distincts par l’œil - λ est la longueur d’onde de la lumière incidente ; dans notre cas, il s’agit de la lumière visible, entre 400 et 800 nm - n est l’indice de réfraction du milieu situé entre l’objet et l’objectif. S’il s’agit de l’air, n = 1 - u est l’angle, exprimé en degrés, de demi-ouverture de l’objectif sur l’objet. u est d’autant plus grand que l’objectif est plus puissant. On utilise aussi les termes suivants : - γ = grandissement de l’objectif : il est égal au rapport de la taille de l’image à la taille de l’objet - G = grossissement de l’oculaire : il est égal au rapport entre l’angle α’ sous lequel est vue l’image de l’objet et l’angle α sous lequel est vu l’objet à l’œil nu à une certaine distance dm (limite de vision distincte). Donc le grossissement total du microscope pour un objectif et un oculaire donnés est : Gxγ Cette valeur doit toujours être indiquée sur vos compte-rendus à côté de chacun de vos dessins.

éléments du microscope
• oculaire • objectif

microscope
• platine

TP d’initiation à la manipulation

• condenseur • éclairage

1
microscope

2
microscope

L’objectif
•système convergent •constitué de plusieurs lentilles •assimilable à une lentille •de courte distance focale de l’ordre du mm

L’appareil d’éclairage
• La lampe incorporée • Le diaphragme Fonction : sélectionner les rayons lumineux • Le condenseur Système convergent Fonction : concentrer la lumière sur l’objet

L’oculaire
•système convergent •constitué de plusieurs lentilles •équivalent à une loupe (lentille) •de distance focale de l’ordre du cm
3
microscope

4
microscope

62

schéma simplifié
oeil oculaire

microscope modélisé
Oculaire Objectif F1 O1 F’1 L1 O1F’1 = - O1F1 = f ’1 O2F’2 = - O2F2 = f ’2
5 6
microscope

F2

platine

objectif préparation condenseur diaphragme source lumineuse

O2

F’2

L2

microscope

marche des rayons lumineux
Oculaire Objectif A2 B F1 A O1 F’1 F2 A
1

position, grandeur, nature de l’image
L1 A A1 objet réel image réelle
1 1 − 1 = O1A 1 O1A O 1F' 1
γ1 = A 1B1 = O1 A1 AB O1 A

O2

F’2

grandissement
L2 A A1 2 objet réel image virtuelle

B1

1 − 1 = 1 O2 A 2 O 2 A1 O 2 F2 '
γ 2 = A 2B 2 = O 2 A 2 A 1B1 O 2 A1
8

grandissement
B2
7
microscope microscope

puissance du microscope
• Pmicros = • Pmicros = Pocu . γobj
α' = α' x A 1B 1 AB AB A 1B 1

ouverture numérique
•O.N. = n sin u •Limite de résolution =

en dioptrie (δ)

grossissement
B A α dm α = AB
dm
9

• Gmicros = α' = Pmicros . dm α = Pocu . dm . γobj = Gocu . γobj • Gcommercial = Gcom ocu . γobj
microscope

0,61λ n sin u

lentille frontale objet u platine

10
microscope

profondeur de champ
• distance séparant deux points objets vu nettement

cercle oculaire
• Image de l’objectif à travers l’oculaire

11
microscope

63

2 – DESCRIPTIF DES MICROSCOPES OPTIQUES A FOND CLAIR
Tous les microscopes optiques sont composés du statif et de l’optique. Leur dispositif d’éclairage est, en principe, indéréglable. Les principaux microscopes à fond clair (Fig. 2) que vous rencontrerez lors des divers Travaux pratiques au cours de vos études sont de 2 sortes : - les uns (type 1) comportent une platine fixe et une optique mobile - les autres (type 2) comportent, au contraire, une platine mobile et une optique fixe.

Fig. 2 : Les 2 types de microscope optique monoculaire Les microscopes peuvent être mono ou binoculaires. Les microscopes monoculaires de type 1 peuvent être penchés pour un emploi plus confortable, mais seulement lorsqu’on observe une préparation solide, c’est-à-dire fixée. Les microscopes binoculaires (Fig. 3) permettent de travailler plus agréablement quand les observations sont longues ; l’écartement des 2 oculaires est ajusté à l’écartement pupillaire de l’utilisateur en écartant ou rapprochant les deux manchons d’oculaires. Mais un seul des deux oculaires peut être mis au point, l’autre sera ensuite amené à la bonne vision de l’utilisateur en le tournant de manière à obtenir deux images nettes et exactement superposées dans le champ de vision.

64

Fig. 3 : Microscope binoculaire A. STATIF C’est l’ensemble de toutes les parties mécaniques du microscope. Le statif comprend : - le tube, dont la partie supérieure reçoit l’oculaire et dont la partie inférieure est terminée par une pièce tournante : le revolver (R), sur lequel sont fixés d’autres systèmes optiques, les objectifs, au nombre de 3 ou 4. - la potence (P), qui supporte le tube et forme aussi la poignée. Elle comporte un mécanisme de mise au point macro et micrométrique, formé d’une crémaillère (C) et d’un pignon commandé par 2 boutons moletés B et b qui sont soit séparés (type 1) soit concentriques (type 2). Ce mécanisme communique au tube (type 1) ou à la platine (type 2) un mouvement vertical de grande amplitude pour la mise au point rapide (bouton B = vis macrométrique) ou au contraire de faible amplitude pour le réglage précis (bouton b = vis micrométrique). Ces boutons sont situés sur le côté de la potence. - la platine (PL), placée perpendiculairement à la crémaillère, à la base de la potence. Elle est percée d’une ouverture circulaire permettant aux rayons lumineux d’arriver jusqu’à la préparation. Sur cette platine, se trouve soit simplement un dispositif à ressort, les valets (V), soit un guide-objet (ou chariot) muni d’une pince ou doigt mobile (Fig. 5), servant à la fois à maintenir et à déplacer la préparation à observer (Pr) selon les 2 dimensions, grâce à 2 boutons concentriques (CP). - le pied (Pi), pièce lourde, qui assure la stabilité de l’appareil et supporte tout l’ensemble.

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B. OPTIQUE C’est l’ensemble des systèmes concourant à la formation des images agrandies des objets à examiner. Ces systèmes sont au nombre de 3 : l’objectif, l’oculaire et l’appareil d’éclairage. 1) L’objectif (Ob) C’est un petit tube disposé près de l’objet (d’où son nom) et dans lequel sont enchâssées plusieurs lentilles simples ou composées ; leur nombre est d’autant plus grand que l’objectif est plus puissant ou plus perfectionné. Les objectifs donnent de l’objet une image réelle agrandie et renversée. La lentille inférieure qui est la seule que l’on distingue est appelée lentille frontale. Les microscopes utilisés couramment peuvent comporter 4 objectifs : 5, 40, 63 ou 80 et 100 ou alors 3,2 , 10, 40, 100 (l’objectif 100 étant, et lui seul, un objectif à immersion). Les objectifs 3,2 ,5, 10 conviennent à l’examen général de toute préparation. Les objectifs 40, 63 et 80 permettent d’observer à un fort grossissement et à sec les points intéressants repérés avec les objectifs inférieurs, lors d’une observation entre lame et lamelle (préparation à l’état frais) ou pour une préparation fixée. Quant à l’objectif à immersion, il est utilisé lorsque l’observation exige des grossissements importants et une définition particulièrement bonne des images. Dans un tel objectif, la lentille frontale est amenée au contact d’une goutte de liquide qui a été déposée sur l’objet examiné (préparation fixée uniquement). Ce liquide d’immersion est choisi pour avoir le même indice de réfraction que le verre. Il permet une utilisation complète de l’ouverture numérique ON de l’objectif. Remarques : Plusieurs chiffres sont gravés sur l’objectif (Fig. 4) :

Fig. 4 : Caractéristiques des objectifs - le grandissement est indiqué, pour chaque objectif, par un chiffre : l’objectif 10 grandit 10 fois l’objectif 40 grandit 40 fois, etc… Les objectifs 100 utilisés à nos T.P sont en général marqués d’un cercle rouge ou noir. Ils s’utilisent avec immersion dans l’huile. - à côté du grandissement est gravé le n° d’ouverture numérique ON; par exemple : 0,30 pour un objectif 10, 0,65 pour un objectif 40, 1,30 pour un objectif 100.

66

Plus ce chiffre est grand, plus petite est la limite de résolution, c’est-à-dire plus le microscope permet la séparation de points très rapprochés. La limite de résolution d’un bon microscope de laboratoire médical est d’environ 0,25 µm (alors que celui de l’œil humain normal est de 0,25 mm). L’huile à immersion permet d’obtenir des ouvertures numériques plus importantes en empêchant les pertes de lumière qui ont lieu par réfraction dans l’air avec les objectifs à sec. On emploie généralement une huile synthétique ayant le même indice de réfraction que la lamelle couvre-objet en verre, c’est-à-dire 1,515. - d’autres chiffres peuvent être gravés sur les objectifs : * la longueur en mm recommandée pour le tube du microscope ; le plus souvent 160, parfois 170 * l’épaisseur en mm recommandée pour la lamelle à placer sur la lame porte-objet ; par exemple 0,17. 2) L’oculaire (Oc) C’est un petit tube situé près de l’œil (d’où son nom) et comprenant 2 lentilles. La plus petite de ces lentilles est la plus proche de l’œil. L’oculaire généralement employé est un n° 10. Le grossissement total fourni par la combinaison des objectifs 5 et 40 avec l’oculaire est respectivement 50 et 400. Avec l’objectif à immersion, on atteint un grossissement de 1000. 3) L’appareil d’éclairage Il comprend 3 parties : le condenseur (Co), la lampe incorporée (L) et le diaphragme à iris (D). Le condenseur est un système de lentilles convergentes qui concentre, sur la préparation, la lumière produite par la lampe installée dans l’axe du condenseur, qui coïncide d’ailleurs avec celui du système objectif-oculaire. Le condenseur peut être rapproché plus ou moins de la platine au moyen d’un bouton moleté (Dc). Le diaphragme-iris se trouve juste en dessous du condenseur, il permet de régler l’ouverture du cône lumineux admis dans le système optique du microscope et par conséquent, d’obtenir le maximum de pouvoir séparateur. Plus le grossissement est important, plus le diaphragme doit être ouvert. Il existe parfois un logement pour un filtre coloré ou non. Les verres dépolis permettent, par diffusion, d’éliminer des images parasites provenant de la source lumineuse.

3 – MODE D’EMPLOI DU MICROSCOPE
A. INSTALLATION DU MICROSCOPE Le microscope doit être installé de préférence à l’ombre, loin d’une fenêtre, sur une surface plane et stable. Pour certains modèles, les plus anciens (type 1), la potence est tournée vers soi, pour les plus récents (type 2), c’est la platine qui est tournée vers soi. Préalablement à toute observation, il est nécessaire de nettoyer avec un papier doux (papier Joseph) ou un linge fin non pelucheux, toutes les parties apparentes de l’optique du microscope : la lentille frontale du condensateur, les lentilles frontales des différents objectifs et la lentille supérieure de l’oculaire. On place en premier lieu l’objectif ayant le plus faible grossissement dans le prolongement du tube en manœuvrant le revolver jusqu’à sentir une encoche.

67

B. REGLAGE DE L’ECLAIRAGE Il s’agit d’un système d’éclairage électrique incorporé. Après allumage de la lampe, on met l’œil très près de l’oculaire et on manœuvre le diaphragme et le bouton du condenseur jusqu’à ce que le champ du microscope soit éclairé au maximum. Il est recommandé de ne pas trop diaphragmer pour ne pas faire apparaître des phénomènes de diffraction parasites pouvant fausser l’interprétation ; toutefois, dans le cas de préparations incolores liquides dans lesquelles les éléments recherchés ont un indice voisin du milieu dans lequel ils se trouvent, il convient de diaphragmer jusqu’à ce qu’ils deviennent nettement visibles (cas des examens de suspensions cellulaires ou bactériennes à l’état frais et sans coloration). C. MISE EN PLACE DE LA PREPARATION Dégager l’accès de la platine en la baissant au maximum (type 2) ou en montant le tube (type 1). Vérifier la propreté de la lame et de la lamelle de l’échantillon à observer. Présenter la préparation à l’endroit, lamelle et étiquette tournées vers le dessus, sans quoi il sera impossible de mettre au point avec les objectifs 40 à 100. Poser la préparation sur la platine en la faisant glisser bien à plat avec le pouce de manière à éviter tout risque de rayure de la lentille frontale de l’objectif ou du condenseur. Il est rigoureusement interdit de présenter la préparation en oblique sur la platine. Le coin de la préparation doit être bien calé dans l’angle de l’équerre fixe du chariot, sans cela la lame risque de sauter en cours d’observation.

Fig. 5 : Mise en place d’une lame sur la platine D. MISE AU POINT
Il faut toujours commencer l’observation avec l’objectif le plus faible (objectifs 3,2 , 5 ou 10) avant de passer à une observation détaillée à l’aide des objectifs de plus fort grossissement (objectifs 40, 63, 80 ou 100). Afin de travailler correctement sans endommager le microscope, on suit systématiquement les recommandations suivantes :

1) Observation au plus faible objectif Au moyen de la vis macrométrique, relever le tube (type 1) ou abaisser la platine (type 2). Poser la lame propre sur la platine en veillant à ce que la lamelle couvre-objet soit bien au dessus. Caler la lame à l’aide des valets ou du doigt mobile. 68

Cadrer la préparation au centre de la platine, au niveau de l’orifice des rayons lumineux. En regardant à l’extérieur du microscope, abaisser le tube (type 1) ou remonter la platine (type 2) jusqu’au maximum (objectifs 3,2 , 5 ou 10). Attention, l’objectif ne doit pas toucher la lame. En regardant à l’intérieur du microscope cette fois, chercher l’apparition de l’image à l’aide de la vis macrométrique en relevant lentement le tube (type 1) ou en abaissant lentement la platine (type 2) ; puis utiliser la vis micrométrique pour une bonne mise au point avec une image nette. Adapter le réglage du condenseur et celui du diaphragme, de manière à ce que la lumière soit suffisante pour donner un bon contraste mais sans éblouir. Si l’image est floue, c’est que l’optique ou la préparation sont souillées ; procéder à leur nettoyage. A l’aide des boutons concentriques, déplacer la préparation sur la platine afin d’en examiner les différentes parties. Lorsque l’endroit le plus intéressant a été trouvé, il faut le placer exactement au centre du champ du microscope avant de passer à un objectif de grossissement supérieur. 2) Observation aux objectifs 40 ou 63 ou 80 Quand la mise au point a été faite correctement pour un objectif de faible grossissement, il est recommandé de ne plus bouger la vis macrométrique lorsqu’on passe à l’objectif supérieur ; en effet, les longueurs des objectifs sont choisies de manière à ce qu’on puisse les placer sans endommager la préparation. Il suffit donc de placer l’objectif immédiatement supérieur en faisant tourner le revolver jusqu’à sentir le déclic ; puis on utilise uniquement la vis micrométrique pour affiner la nouvelle mise au point. 3) Observation à l’immersion : objectif 100 Quand la mise au point a été faite correctement avec l’objectif 40, ou 63, ou 80, et que la préparation est exactement centrée sur le champ choisi, basculer légèrement le revolver et rester entre 2 objectifs sans toucher à la vis macrométrique. Déposer une goutte d’huile à immersion sur la lamelle couvre-objet, au centre de la préparation, en s’assurant qu’il n’y a pas de bulle d’air. En tournant alors le revolver jusqu’au déclic, placer alors l’objectif 100 dans l’axe du tube ; il doit toucher l’huile. La mise au point se fait en employant uniquement la vis micrométrique. Tout déplacement vertical du tube ou de la platine doit être fait sans brusquerie et avec une extrême prudence, car il peut provoquer des rayures ou des éclats irréparables sur l’objectif, et casser la préparation. Adapter le réglage du condenseur et du diaphragme : condenseur relevé au maximum et diaphragme légèrement fermé. Quand l’observation est terminée, on remonte le tube (type 1) ou on abaisse la platine (type 2) pour en libérer l’accès, on enlève la lame de la platine en la tenant horizontale et en la faisant glisser à plat ; on la nettoie à l’aide de papier absorbant imprégné d’un peu d’alcool ou de mélange alcool-éther (aa). On veille à ne pas étaler l’huile sur l’étiquette de la préparation. On nettoie de même l’objectif à immersion qui ne doit pas rester couvert d’huile : il faut enlever d’abord le maximum d’huile à immersion avec du papier Joseph à sec, sans appuyer, de manière à ne pas faire rentrer de l’huile dans les ressorts de l’objectif, puis passer du papier Joseph imprégné d’un peu d’alcool-éther, de manière à éliminer toute trace résiduelle d’huile

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à immersion. Ce procédé sera mis en œuvre chaque fois que vous aurez travaillé à immersion sur n’importe quel microscope.

E. ENTRETIEN DU MICROSCOPE On doit veiller à la propreté parfaite de toutes les parties optiques, notamment de la lentille frontale de l’objectif. Une simple empreinte digitale sur la lentille annule le contraste. Utiliser si possible du papier Joseph pour nettoyer les optiques, car il ne raye pas et ne peluche pas. On ne doit jamais démonter les objectifs d’un microscope. L’oculaire, lui, peut être démonté en cas de besoin pour être nettoyé ; il faut remettre les lentilles soigneusement en place ensuite. On évite de laisser le microscope en présence de poussière, ou dans une atmosphère humide, ou au contact de vapeurs corrosives. Après utilisation, n’oubliez pas d’éteindre la lampe de votre microscope, après avoir replacé l’objectif le plus faible dans l’axe. Puis on protège le microscope en le recouvrant d’une housse ou en le rangeant dans un coffret.

F. REMARQUES IMPORTANTES * Au cours de votre observation, il est nécessaire de manœuvrer continuellement la vis micrométrique de manière à percevoir les différents plans de l’objet, ce qui facilite la compréhension de sa structure. * Après un examen à l’immersion, on ne peut pas revenir à un examen à un objectif inférieur. Il faut alors procéder au nettoyage de la lame avant de recommencer les mises au point successives, car les objectifs 40, 63 et 80 ne sont pas étanches et ne doivent absolument pas être mis en contact avec de l’huile. * Si une préparation est mise au point à l’immersion, ne déplacez-pas votre microscope, car vous risquez de perdre le champ d’observation choisi.

4 – APPLICATIONS
Faire une préparation microscopique consiste le plus souvent à enfermer l’objet à examiner entre 2 lames de verre, l’une étant la lame porte-objet, l’autre la lamelle couvre-objet. On dit que l’objet est « monté entre lame et lamelle ». L’observation d’une préparation peut se faire : à l’état frais : soit à sec, soit après montage dans un goutte de liquide approprié après coloration : soit une coloration vitale (l’objet est encore vivant quand on l’examine), soit après fixation. La fixation a pour but d’immobiliser les structures cellulaires, tissulaires... dans un état aussi proche que possible de leur état vivant. Après montage, pour éviter la dessication et assurer une bonne conservation des préparations, on les lute en emprisonnant l’objet dans un ciment, ou lut (baume du Canada, Eukitt). Puis on étiquette la préparation : nature, coloration, date.

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Le microscope peut être utilisé pour dénombrer des cellules ou des éléments. Dans ce cas, la suspension est introduite dans une cellule à numération : chambre de Malassez, ou cellule de Thoma, ou encore cellule de Nageotte, de Neubauer… qui possèdent un quadrillage permettant de compter le nombre d’éléments présents dans un volume déterminé. On peut aussi évaluer la taille d’éléments grâce au microscope. Au cours de cette séance, 3 ateliers vont vous permettre de vous familiariser avec l’usage du microscope en abordant quelques applications.

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EXAMEN A L’ETAT FRAIS ET A L’IMMERSION
M. ALBERT

1. Observation de cellules à l’immersion Exemple choisi : bactéries fixées et colorées par la méthode de Gram. Suivre les consignes précitées pour faire la mise au point. A l’objectif 100, la préparation, fixée et colorée, montre des bactéries de 2 sortes : - les bactéries « Gram positif » apparaissent colorées en violet foncé - les bactéries « Gram négatif » apparaissent colorées en rose. Le microscope est remis en état en commençant par passer du papier Joseph, ou à défaut du papier absorbant, sur les objectifs qu’on emploie à sec, puis sur les oculaires, puis sur la platine. Ensuite, il faut nettoyer l’objectif à immersion : enlevez d’abord le maximum d’huile à immersion avec du papier Joseph à sec, sans appuyer, de manière à ne pas faire rentrer de l’huile dans les ressorts de l’objectif, puis passez du papier Joseph imprégné d’un peu d’alcool-éther, de manière à éliminer toute trace résiduelle d’huile à immersion. 2. Observation de cellules à l’état frais Exemple : cellules de l’épiderme interne d’une écaille d’Oignon. Sectionner l’oignon : on voit de nombreuses écailles, entourant un bourgeon central. Prélever un lambeau de l’épiderme interne d’une écaille, c’est-à-dire la membrane qui tapisse sa face concave ; mettre contre la lame la partie de l’épiderme qui a été coupée. Déposer dessus une goutte d’eau, puis une lamelle couvre-objet. Suivre les consignes précitées pour faire la mise au point. - Au faible grossissement, on voit un réseau de cellules bien délimitées par leur paroi pectocellulosique, et, à l’intérieur de chaque cellule, un globule réfringent : le noyau. - Passer ensuite à l’observation à l’objectif 40 ou 63 ; centrer sur une cellule et observer : la paroi pecto-cellulosique le noyau, sphérique, ou aplati contre la paroi le cytoplasme formant une mince couche autour de la cellule, contre la paroi la vacuole, qui occupe la quasi-totalité du volume cellulaire. 3. Observation de cellules après coloration vitale Exemple : cellules de l’épiderme interne d’une écaille d’Oignon. Le Rouge neutre, étant un colorant vital, pénètre dans la cellule sans l’altérer. La cellule est vivante et on peut observer les organites intracytoplasmiques en l’état.

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Placer un fragment d’épiderme d’oignon dans une solution de Rouge neutre pendant quelques minutes. Monter entre lame et lamelle. Suivre les consignes précitées pour faire la mise au point. Observer la vacuole colorée en rouge, et le cytoplasme, non coloré. 4. Observation de cellules après coloration par le réactif de Lugol Exemple : cellules de l’épiderme interne d’une écaille d’Oignon. Le réactif de Lugol va fixer les cellules (elles sont donc mortes) et colorer le noyau, les nucléoles et le cytoplasme en jaune. Déposer quelques gouttes de réactif de Lugol sur la préparation, et observer la fixation progressive des cellules et la coloration des constituants cellulaires. On ne discerne pas la vacuole, car elle n’est pas colorée.

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MICROMETRIE
C. GANTZER

Les mesures de longueur à l’aide du microscope représentent souvent le seul moyen pour déterminer avec précision la taille d’un élément. Le domaine d’application de cette technique concerne notamment la mesure d’objets infiniment petits (cellules, agents infectieux…), ou inaccessibles avec les moyens de mesure habituels (mesures effectuées dans un creux…), ou encore d’objets risquant d’être altérés par un instrument de mesure inadéquat (préparations botaniques, cristaux fragiles…). Pour ces mesures, on se sert d’une échelle graduée disposée dans l’oculaire et appelée : micromètre oculaire. L’oculaire complet muni de son micromètre se nomme : oculaire micrométrique. Le micromètre oculaire mis à votre disposition est un petit disque en verre poli optiquement, et muni d’une échelle graduée de 10 mm divisée en 100 parties. La valeur d’un intervalle compris entre 2 divisions de l’échelle, parfaitement définie pour l’œil, varie avec le grossissement de l’objectif, et d’un microscope à l’autre. C’est pourquoi, avant de commencer, il est nécessaire d’étalonner le microscope afin de déterminer la valeur d’une division du micromètre oculaire pour chaque objectif (5, 10, 40…). On se sert pour cela d’un micromètre-objet. 1. Etalonnage du microscope Vous disposez : - d’un oculaire micrométrique (A, sur la figure 6), comprenant une échelle graduée de 10 mm divisée en 100 parties - d’un micromètre-objet (B) : c’est une lame de verre munie d’une échelle de 2 mm divisée en 200 parties (valeur d’un intervalle : 10 µm), que vous posez sur la platine du microscope comme une préparation. Mettez au point en suivant les consignes précitées. Vous devez voir en même temps et distinctement l’échelle graduée de l’oculaire micrométrique (A) et celle du micromètre-objet (B). En déplaçant le micromètre-objet (B) sur la platine, et en tournant l’oculaire micrométrique (A), faites correspondre les 2 zéros des échelles graduées, comme indiqué sur la figure 6.

Fig. 6 : Etalonnage du microscope Recherchez alors la graduation la plus éloignée du zéro du micromètre oculaire (A) correspondant exactement à une graduation du micromètre-objet (B).

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Sachant qu’une division du micromètre-objet correspond à 10 µm, calculez la valeur d’une division du micromètre oculaire. Exemple : Pour un objectif donné (grossissement 40 par exemple), on constate que 70 divisions du micromètre oculaire correspondent à 0,4 mm (400 µm) du micromètre-objet. Par conséquent, une division = 5,7 µm. Ainsi, un élément dont la taille correspond à 3 divisions de ce micromètre oculaire mesure 17 µm. Etalonnez le micromètre oculaire pour chaque objectif du microscope.

2. Mesure d’éléments figurés Le micromètre oculaire étant étalonné, retirez le micromètre-objet de la platine et placez-y la préparation à observer. Mettez au point en suivant les consignes précitées. A l’aide du micromètre oculaire et en tenant compte de l’objectif utilisé, déterminez la taille de l’élément microscopique à mesurer.

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NUMERATION D’ELEMENTS FIGURES
M. BEAUD

Il existe diverses chambres de comptage (chambre de Malassez, cellule de Thoma, cellule de Nageotte…) qui permettent de dénombrer des éléments figurés dans un volume déterminé, de manière à pouvoir établir leur concentration. Ces chambres, ou cellules, ont des quadrillages et des volumes différents et appropriés à leur utilisation. Elles ont en commun la fragilité et doivent être manipulées avec beaucoup d’attention. Lors de cette séance, vous utiliserez une chambre de Malassez (Fig. 7) pour déterminer la concentration d’une suspension de Levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae.

Fig. 7 : Aspect de profil et de face d’une chambre de Malassez La chambre de Malassez est une plaque de verre épais munie de 2 ergots et de 2 rigoles délimitant une surface transparente au centre de laquelle est gravé un quadrillage. Les côtés extérieurs de ce quadrillage central, visible à l’œil nu malgré sa finesse, délimitent un grand rectangle dont la surface est de 5 mm2 (Fig. 8). Lorsqu’on dispose une lamelle planée sur les ergots, et qu’on la monte correctement, elle aménage ainsi un espace de 0,2 mm de haut, ce qui, au niveau du grand rectangle extérieur du quadrillage, correspond à un volume de : 0,2 x 5 = 1 mm3

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Si l’on remplit cet espace avec une suspension d’éléments figurés, il suffit de compter le nombre d’éléments présents dans ce volume de 1 mm3 (donc au-dessus du quadrillage) pour déterminer leur concentration. N.B : en Biologie, les concentrations s’expriment soit en unités S.I, soit en sous-multiples du litre : le microlitre µL est très utilisé. En fait, très souvent, on compte les éléments figurés dans des volumes plus petits aménagés par le quadrillage, pour améliorer la précision et diminuer le temps d’exécution de cet examen.

Fig. 8 : Schéma du quadrillage d’une chambre de Malassez Le grand rectangle extérieur est divisé par le quadrillage en 100 rectangles plus petits, ayant chacun une surface de 0,05 mm2 Chacun des 100 rectangles correspond donc à un volume de 0,01 mm3 Pour plus de commodité, 25 des 100 rectangles sont sous-quadrillés en chacun 20 petits carrés, ayant une surface de 25.10-4 mm2 et correspondant à un volume de 5.10-4 mm3 Pour effectuer une numération, il suffit donc de remplir l’espace central formé par la lamelle planée et la surface centrale, entre les rigoles, avec la suspension à examiner, et de dénombrer les cellules en s’aidant du quadrillage qui délimite un volume exactement déterminé. 1- Montage de la chambre de Malassez : Humidifiez les ergots, positionnez la lamelle planée et faites-la glisser à l’aide de vos pouces par des mouvements de va-et-vient jusqu’à ce qu’elle ne bouge plus. Après montage correct, des irisations doivent apparaître, témoignant de l’adhérence de la lamelle aux ergots. 2- Remplissage de la chambre avec la suspension de levures : Homogénéisez soigneusement votre suspension de levures, car elle sédimente très vite. Prélevez-en une certaine quantité et, en posant le bout de la pipette sur la partie centrale transparente, contre le bord de la lamelle, remplissez tout l’espace central de la chambre. La suspension doit déborder légèrement dans les rigoles latérales, ce qui garantit que tout le 77

volume central est parfaitement rempli, et constitue une réserve de liquide contre la déshydratation. 3- Comptage sous le microscope : Placez la chambre sur la platine du microscope en la tenant horizontalement, et positionnez-la de telle sorte que le quadrillage soit situé dans l’axe de l’objectif. Cherchez à l’aide de l’objectif 10 le quadrillage de la chambre. Il faut réduire l’intensité lumineuse pour le voir, car ce qu’on observe est transparent (pas de coloration). Passez ensuite à l’objectif 40 pour faire le comptage, qui s’effectue sur 10 rectangles sous-quadrillés. Remarque : on ne compte dans un rectangle que les cellules comprises dans ce rectangle, et celles qui sont situées à cheval sur les côtés droit et inférieur. On ne compte pas celles qui sont situées sur les côtés supérieur et gauche, de manière à équilibrer les valeurs. 4- Détermination de la concentration de la suspension de levures : Calculez le nombre de levures par mm3, puis par millilitre de suspension. 5- Nettoyage et rangement : Les lamelles des cellules de Malassez sont planées optiquement et ne se jettent pas, contrairement aux lamelles ordinaires employées pour les autres préparations microscopiques. Elles doivent être rendues non cassées, non rayées, et indemnes de souillure. Les levures collent ; pour les éliminer efficacement, il faut passer la chambre de Malassez et la lamelle planée à l’eau du robinet en les frottant doucement entre vos doigts. Puis séchez-les à l’aide de papier absorbant, et reposez-les dans leur emballage respectif. N’oubliez pas d’éteindre la lampe de votre microscope, après avoir replacé l’objectif le plus faible dans l’axe. NB : les cellules de numération permettent de faire une estimation quantitative d’une population d’éléments, mais aussi une observation qualitative de l’échantillon : aspect des cellules, taille régulière ou non, forme, présence d’éléments étrangers, répartition homogène ou non sur le quadrillage…

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METHODES DE SEPARATION ET D’ANALYSE QUALITATIVE

ELECTROPHORESE DE ZONE

CENTRIFUGATION

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

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ELECTROPHORESE DE ZONE
J-C. CHEVIN

Support: acétate de cellulose 1. Généralités
Sous l'action d'un champ électrique, les particules chargées dissoutes ou dispersées dans une solution électrolytique migrent vers l'électrode de polarité opposée. Le composé chargé est soumis à une force: où F=E.e.z z = électrovalence de l'ion

E = champ électrique ; e = charge élémentaire et

La force étant constante, le mouvement serait uniformément accéléré, mais la particule en se déplaçant est freinée par la viscosité du milieu. La force de frottement est donnée par la loi de Stockes: où F' = 6 π η r v

η = viscosité du milieu; r = rayon de la particule et v = vitesse de la particule Eez

Les deux forces s'équilibrent et le mouvement devient uniforme. La vitesse de la particule ou vitesse électrophorétique est: v = 6πηr La séparation des particules chargées va, dans des conditions opératoires données, dépendre de leurs charges et de leurs dimensions. v On définit la mobilité électrophorétique: µ = m2.V-1.s-1 E Le déplacement a lieu dans une veine liquide emprisonnée dans un solide relativement inerte et homogène qui sert de support. La méthode est appelée électrophorèse de zone (méthode employée dans cette manipulation). De nombreux supports sont utilisés en analyse et séparation des protéines, des acides nucléiques et des ions minéraux: - l'acétate de cellulose présente une porosité uniforme et une bonne résolution. Ce support peut être transparisé et les spots pourront être lus par densitométrie - le papier, méthode simple, présente une forte adsorption utile à la séparation des petits ions - les gels d'agarose, de gélose, d'amidon, de polyacrylamide permettent une séparation selon la charge et la dimension des particules (tamisage moléculaire). En outre, l'utilisation de tube capillaire en silice (électrophorèse capillaire de zone) permet d'obtenir des séparations rapides avec une très grande efficacité et de détecter de nombreux composés.

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2. Méthode
2.1. Principe

Quel que soit le support, les principes et les facteurs influençant la migration sont les mêmes. Une bande d'acétate de cellulose est saturée avec une solution tampon qui sert d'électrolyte de migration. Une petite quantité de produit à analyser est déposée en spot ou en ligne fine sur la bande, à un endroit déterminé. Une différence de potentiel électrique continu est appliquée aux extrémités de la bande et chaque composant migre selon sa mobilité électrophorétique. Après un temps approprié, on sèche la bande et on note la position des composants après action d'un révélateur approprié. SCHEMA DE L'APPAREIL couvercle support

−−

plaque de verre électrolyte
2.2. Facteurs influençant la migration 2.2.1. Température - flux capillaire

électrode de platine

Le passage du courant électrique entraîne par effet joule, un échauffement de l'électrolyte et du support. Cette élévation de température augmente la mobilité électrophorétique par diminution de la viscosité. Les pertes de liquide par évaporation créent un flux capillaire de remplacement de la solution tampon, flux qui augmente ou diminue la mobilité électrophorétique selon la position de l'ion sur le support et sa charge. Ce flux capillaire est aussi appelé rhéophorèse. évaporation flux capillaire

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Si le courant est trop intense, l'évaporation, qui n'est plus contrebalancée par le flux capillaire, entraîne une augmentation de la concentration de l'électrolyte, de sa conductivité et la mobilité électrophorétique diminue. En pratique, on diminue l'évaporation en utilisant une enceinte fermée et en refroidissant si besoin la plaque support.
2.2.2. Electroosmose

L'interface liquide (électrolyte) - solide (support) conduit à une polarisation électrostatique. Le support, immobile, se charge négativement à la plupart des pH et la veine liquide se charge positivement. En présence d'un champ électrique, on observe un flux liquide vers la cathode appelé flux d'électroosmose ou électroendosmose. Il augmente avec le pH et diminue avec l'élévation de la force ionique du milieu. Il est possible d'évaluer le flux capillaire et le flux d'électroosmose en observant la migration d'une substance à mobilité électrophorétique nulle: dextran, glucose, ou tout autre molécule neutre. La mobilité électrophorétique corrigée µc d'un composé A s'écrit: µ = µ − µ = d A −d neutre E×t

c

A

neutre

dA et d neutre = distances de migration en cm E = champ électrique en V.cm-1 t = durée de l'expérience en s
2.2.3. Adsorption

Les ions se fixent sur le support, ce qui entraîne un retard dans la séparation, avec effet de traînée. L'acétate de cellulose présente une adsorption assez faible. Le papier est plus adsorbant et les traînées sont parfois assez marquées.
2.2.4. Diffusion

C'est la migration des composés dans toutes les directions du support avec étalement et élargissement du dépôt. Elle est plus importante pour les petites molécules, acides aminés, ions minéraux, que pour les grosses (protéines). Pour limiter la diffusion, on utilise une tension élevée, ce qui diminue le temps de l'électrophorèse.
2.2.5. Choix de l'électrolyte

La séparation des constituants dépend de: - force ionique du milieu = 1/2 Σ [i].zi2 où [i] = concentration de l'ion i et zi = valence de l'ion i 82

Une force ionique élevée entraîne une bonne séparation mais une mobilité électrophorétique faible. De la force ionique, liée à la concentration, dépend la conductibilité du milieu qui doit rester faible pour limiter l'intensité du courant. Un bon compromis est une force ionique de 0,05 à 0,1. - pH et pouvoir tampon: au contact des électrodes, il se produit une électrolyse avec variation de pH; l'électrolyte devra présenter une capacité tampon suffisante pour maintenir un pH constant au cours de l'électrophorèse. - concentration: elle doit être suffisamment grande pour que la variation locale de la conductivité due au dépôt de la substance à analyser soit négligeable, mais pas trop élevée pour limiter l'intensité du courant et l'effet Joule. - nature: elle est déterminée par la substance à analyser qui doit y être soluble.

3. Partie expérimentale
3.1. Matériel

Le Laboratoire dispose de différents matériels. Se reporter à la fiche de manipulation. Description du matériel: - générateurs 100 à 1200 V, 200 à 500 mA - cuves à électrodes de platine séparées - plaques de verre 20 x 20 cm - acétate de cellulose en feuilles - volume total d'électrolyte: environ 1 L

3.2. Produits à analyser

Nous nous proposons de séparer les cations d'un mélange après complexation avec les constituants de l'électrolyte et de les caractériser ensuite par coloration. La complexation forme des ions de polarité et de taille différentes. Ions proposés: Mn2+ ; Co2+ ; Cu2+ ; Zn2+ ; Cd2+ à la concentration de 0,1 mol.L-1. Substance neutre: bleu dextran (colorant neutre ne nécessitant pas de révélation), dextran ou glucose
3.3. Préparation des électrolytes

- Solution tampon Tris-glycine.

Cette solution est déjà préparée.

Composition: - Tris (tri(hydroxyméthyl) aminoéthane NH2-C-(CH2OH)3 ; pKA = 8,8) 6 g 28,3 g - glycine (glycocolle NH2-CH2 -COOH ; pKA1 = 2,4 ; pKA2 = 9,6) - H2O 1 L - HCl 1 M qs pH = 8,3 Ligne de dépôt: ligne médiane Durée de migration: 20 ou 30 min selon la dimension de la feuille. Consulter la fiche. Révélateur: dithizone (diphénylthiocarbazone)

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3.4. Préparation du support de migration

- Dimensions, indications et dispositions des bandes: consulter la fiche de manipulation. - Il est nécessaire d'imprégner les bandes avec l'électrolyte pendant 15 min. Pour gagner du temps, cette opération a été faite avant la séance. - Ne jamais toucher les bandes d'acétate de cellulose avec les doigts, utiliser des pinces en inox ou en matière plastique. Attention, les bandes sont fragiles. - La face de dépôt est mate et devra se trouver au dessus; le coin coupé sert de repère. - Placer une plaque de verre sur la feuille quadrillée servant de plan de situation, déposer la bande sur la plaque de verre. - Utiliser un crayon à bille noir pour indiquer: - à une extrémité de la bande: une polarité et un signe distinctif à votre convenance. - sur un bord: la situation de la ligne de dépôt. - Remplir au même niveau les compartiments de la cuve avec l'électrolyte approprié. - Repérer les polarités sur le couvercle: le fil rouge correspond à l'anode (+), le fil noir à la cathode (-). - Poser la plaque de verre avec sa bande dans la cuve, en respectant les polarités. - Placer les bandes de conduction en papier filtre après trempage dans l'électrolyte. - Essorer légèrement le tout en posant une feuille de papier filtre. - Procéder soigneusement aux dépôts.
3.5. Migration

- Fermer le couvercle. - Les générateurs présentent des sorties en parallèle qui doivent être branchées en même temps.
ATTENTION: COURANT D'ENVIRON 500 V

- Brancher les fils. Alimenter le générateur. Ne pas manipuler les fils pendant l'électrophorèse. - Laisser migrer le temps indiqué. Noter les tensions et courants en début et en fin d'électrophorèse. Observer les bulles sur les électrodes. - Pendant la migration, déposer, sur une feuille de papier filtre préalablement imprégnée de l'électrolyte et séchée, une série de spots témoins de chaque solution étalon. - En fin de migration, couper l'alimentation, attendre 10 s, débrancher les fils du générateur. - Oter le couvercle.

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3.6. Séchage et révélation

- Retirer avec précaution les bandes de conduction, sortir la plaque de verre, essorer avec un morceau de papier filtre sans décoller les bandes d'acétate de cellulose du verre et procéder au séchage. - Révéler les taches par pulvérisation sous hotte ventilée du produit approprié en même temps que la feuille de spots témoins. - Vidage des compartiments: * prélever, par aspiration à la seringue, une partie de solution d'un compartiment et la déposer dans un bécher, mesurer le pH puis verser cette solution dans le flacon étiqueté ; y ajouter, toujours par aspiration, le reste de solution du même compartiment. Faire de même avec la solution de l'autre compartiment. Ne pas jeter à l'évier. * rincer deux fois les compartiments à la pissette d'eau distillée, vider par aspiration. Ne pas frotter ni essuyer.

4. Interprétation des résultats
Indiquer, dans le cahier de laboratoire, pour chaque électrophorèse : - le pH de l'électrolyte avant migration et dans chaque bac après migration - le temps réel de migration - les tensions et intensités en début et fin de migration - la référence du générateur de courant - la composition du ou des mélanges inconnus. Calculer la mobilité électrophorétique corrigée de l'ion manganèse pour chaque électrophorèse.

5. Commentaires et discussion de fin de séance
- Ecrire la formule des composés migrants. - Action des flux capillaires, électroosmotiques et du champ électrique: indiquer de façon schématique à l'aide de flèches plus ou moins longues le sens et la vitesse de migration des substances en fonction de la position du dépôt (milieu, côté anode). - La même manipulation réalisée sous une tension d'environ 200 V conduit à la migration de tous les composés du côté de la cathode. Comment expliquer le phénomène? - Observation des effets de bord. - Caractéristique de la micropipette utilisée pour les dépôts. - Expliquer pourquoi doit-on remplir, dans cette manipulation, les cuves au même niveau - Indiquer la nature des gaz produits au contact des électrodes. Conséquences pour la séparation. - Ouverture aux autres techniques d'électrophorèse.

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CENTRIFUGATION
M. WELLMAN-ROUSSEAU – B. LEININGER-MULLER

Les principes théoriques de cette méthode séparative ou analytique ayant été abordés en cours de Physique et en Travaux dirigés de Biologie cellulaire lors de la 1ère année, nous ne les rappellerons pas. Les manipulations se font sur : 1. centrifugeuse à angle fixe 2. centrifugeuse à godets mobiles 3. ultracentrifugeuse 4. centrifugeuse de paillasse

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CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE [C.C.M.]
B. MOREAU

Travaux pratiques concernés : - 2ème Année : T.P. Biochimie générale (J. COULON)
T.P. Chimie organique (C. PERDICAKIS – T. HUMBERT) -3
ème

Année : T.P. Chimie thérapeutique : Synthèse des médicaments (F. BONNEAUX) Essais physico-chimiques des médicaments (J-L. MONAL) T.P. Pharmacognosie (B. MOREAU) T.P. Toxicologie (M-H. LIVERTOUX - L. FERRARI)

INTRODUCTION

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une méthode de séparation physicochimique particulièrement indiquée pour la recherche analytique : - analyse de drogues en pharmacie - recherche toxicologique sur milieux biologiques après extraction - contrôle de pureté des matières premières et de produit fini - cinétique de réaction lors de synthèses de médicaments. Cette technique chromatographique requiert peu de substances à analyser et un appareillage réduit aux travaux pratiques. Elle utilise un support poreux le long duquel une phase liquide entraîne irrégulièrement les divers constituants de l'extrait à analyser.
I – GENERALITES

Plusieurs mécanismes physico-chimiques peuvent intervenir lors du déplacement des substances dans le support poreux : - l'adsorption sur le support - le coefficient de partage entre une phase fixe (ou stationnaire) retenue par le support et la phase mobile circulant à travers celui-ci - l'échange d'ions, où une substance ionisée peut remplacer un ion du support, se fixant ainsi sur ce dernier. Dans la CCM sur silice, c'est le phénomène d'adsorption qui domine généralement. La CCM met en jeu 3 éléments : la phase stationnaire, l’éluant et la substance chromatographiée. La phase stationnaire est constituée d'un matériau adéquat, étalé en une couche mince uniforme, fixée sur un support (plaques ou feuilles) de verre, de métal ou de plastique. La solution du mélange inconnu est déposée sur la ligne de départ. La plaque est introduite dans une cuve étanche contenant l'éluant approprié (phase mobile). La séparation des constituants du mélange s'effectue grâce au déplacement par capillarité de la phase mobile le long de la phase stationnaire (développement ou migration). Puis les substances non colorées sont rendues visibles (détection).

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1) Phase stationnaire

Différents matériaux sont utilisés en fonction de la substance à analyser : gel de silice (Kieselgel, Kieselguhr), oxyde d'aluminium, cellulose et polyacrylamides. La fabrication et la teneur en humidité influencent fortement leur pouvoir de séparation. On choisit donc un standard : le Kieselgel G (Merck) suivant Stahl, le plus utilisé. On trouve dans le commerce des plaques prêtes à l'emploi. Pour éviter que les plaques ne s'abîment pendant le transport, on ajoute très souvent des liants spéciaux qui peuvent modifier le pouvoir séparateur. Pour des temps de migration très longs, les zones deviennent diffuses et les séparations mauvaises. Pour le travail de laboratoire du pharmacien et pour les travaux pratiques, les plaques prêtes à l'emploi sont toutefois fort utiles. Au moment de l'emploi, les plaques peuvent être activées par chauffage à 100-105°C pendant 1 heure.
2) Phase mobile : éluant, solvant de migration

La phase mobile est le moyen de transport et est constituée d'un ou de plusieurs solvants. Elle monte par capillarité le long de la phase stationnaire, c'est-à-dire la couche poreuse. Des solvants "pour analyse" sont seuls utilisés comme éluants. Ceux-ci sont aussi simples que possible. La composition du mélange est donnée en parties par volume, la somme des différents volumes atteignant 100. Dans la chromatographie par adsorption, les solvants sont placés suivant le pouvoir d'élution (série éluotrope). Comme le montre le tableau suivant, le pouvoir d'élution augmente avec la polarité du solvant. Ainsi l'hexane, non polaire, a un faible pouvoir éluant, le chloroforme a un pouvoir éluant plus marqué et le méthanol, polaire, présente un pouvoir éluant élevé.
Série éluotrope de systèmes à un ou deux solvants
(Les chiffres indiquent des volumes. La colonne de droite est la suite de celle de gauche)
A U G M E N T A T I O N D E L A F O R C E D ' E L U T I O N

Ether de pétrole Cyclohexane Tétrachlorure de carbone Trichloréthylène Toluène Benzène Benzène/chloroforme (1:1) Chlorure de méthylène Chloroforme Cyclohexane/acétate d'éthyle (8:2) Chloroforme/acétone (95:5) Benzène/acétone (9:1) Benzène/acétate d'éthyle (8:2) Chloroforme/éther (9:1) Benzène/méthanol (95:5) Benzène/éther (6:4) Cyclohexane/acétate d'éthyle (1:1) Chloroforme/éther (8:2) Benzène/acétone (8:2) Chloroforme/méthanol (99:1) Benzène/méthanol (99:1) Benzène/méthanol (9:1) Benzène/méthanol (9:1) Chloroforme/acétone (05:15)

Benzène/éther (4:6) Benzène/acétate d'éthyle (1:1) Chloroforme/éther (6:4) Cyclohexane/acétate d'éthyle (2:8) Acétate de butyle Chloroforme/méthanol (95:5) Chloroforme/acétone (7:3) Benzène/acétate d'éthyle (3:7) Acétate de butyle/méthanol (99:1) Benzène/éther (1:9) Ether/méthanol (99:1) Ether Ether/diméthylformamide (99:1) Acétate d'éthyle Acétate d'éthyle/méthanol (99:1) Benzène/acétone (1:1) Chloroforme/méthanol (9:1) Dioxane Acétone n-Propanol Ethanol Méthanol Dioxane/eau (9:1) Eau

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Pour les séparations de substances aminées basiques (alcaloïdes, médicaments) on ajoute une faible quantité d'amine protonable (ammoniac, diéthylamine...) qui a pour fonction de neutraliser les groupements acides du gel de silice.
3) Relations réciproques en chromatographie

La vitesse de migration est fonction de la viscosité de l’éluant et de la structure de la phase stationnaire. Les adsorbants retiennent fortement l'eau et les alcools inférieurs. Les molécules seront plus ou moins fortement adsorbées suivant les groupements fonctionnels qu'elles comportent. - Les hydrocarbures saturés sont peu ou pas adsorbés ; leur vitesse de migration est donc la plus grande. Les hydrocarbures non saturés sont d'autant plus adsorbés que le nombre de doubles liaisons est grand et que celles-ci sont plus conjuguées. Pour une bonne séparation on choisira un adsorbant actif et un éluant peu polaire. - La présence de groupements fonctionnels fixés sur un hydrocarbure influence l'intensité d'adsorption dans l'ordre décroissant suivant : -COOH, -OH, -C=O, O-alkyl, -CH3, -H Sur couches de Kieselgel ou d'oxyde d'aluminium par exemple et en utilisant le toluène comme éluant, les éthers et les esters apparaissent à la partie supérieure du chromatogramme, les cétones et les aldéhydes environ au milieu, suivis par les alcools tandis que les acides restent au point de départ. La séquence de séparation est donc fonction de la polarité des liaisons. Les acides organiques et les bases fortes peuvent être chromatographiées sous forme de leurs dérivés peu polaires ou en utilisant des éluants acides ou basiques. Les principes de la chromatographie d'adsorption et les relations réciproques entre les trois facteurs (phase stationnaire, phase mobile et substances à séparer) peuvent être représentés par le schéma triangulaire de Stahl :

Le triangle hachuré peut pivoter. Par exemple, pour un mélange d'hydrocarbures, on place un sommet du triangle sur H.C. (en pointillé), les deux autres sommets (en pointillé) montrent qu'il faut utiliser un éluant non polaire et un adsorbant actif. Inversement, pour des mélanges de substances polaires, les deux sommets libres du triangle montrent la nécessité d'employer des éluants polaires et des adsorbants peu actifs.

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4) Essais préliminaires

Un essai préliminaire peut être réalisé afin d'obtenir rapidement, pour un support donné, des indications utiles sur : - la vitesse de migration de la substance à analyser dans différents solvants, - le pouvoir séparateur de ceux-ci face à un mélange de substances. Cet essai consiste à déposer une goutte de la solution à examiner sur une plaque de CCM. Après avoir séché le dépôt, on soumet celui-ci à l'action éluante d'une petite quantité de solvant. Pour chacun des solvants choisis, on observe le comportement de la solution à analyser. Lorsqu'on a à faire à des mélanges de composition inconnue, on commence par tester un solvant peu polaire : - Si les substances ne se déplacent pas (cas du développement par le cyclohexane, dans le schéma ci-dessous), on choisit un solvant doté d'un pouvoir d'élution plus élevé (ex. : toluène), ou on ajoute au solvant employé des quantités croissantes d'un éluant plus actif (ex. : mélange cyclohexane/chloroforme). - Lorsque les vitesses de migration sont trop élevées (cas du développement par le chloroforme, dans le schéma ci-dessous), ou ne sont pas assez différenciées, c'est-à-dire si les substances se trouvent à proximité de la ligne frontale, on ajoute un éluant moins polaire (ex. : mélange toluène/chloroforme). Dans l'exemple choisi, l'essai préliminaire sur le comportement chromatographique du mélange X sur gel de silice a montré que le toluène se prête au développement de celui-ci.

1 X

2 X

3 X

1 = développement par le cyclohexane 2 = développement par le toluène 3 = développement par le chloroforme

X = dépôt du mélange de substances à séparer

5) Développement

Par développement, on entend la résolution de la solution inconnue en ses divers constituants grâce au déplacement de l'éluant sur le support. La distance normale d'élution (départ, front de solvant) est de 10 cm. A côté du développement simple (1 x 10 cm), le plus classique, on pourra, pour améliorer le pouvoir de séparation, procéder à : - un développement multiple : un développement double consiste à faire migrer deux fois successivement sur 10 cm avec séchage intermédiaire complet, - un développement en escalier : à l'aide de deux éluants de pouvoir d'élution différent et à des hauteurs d'élution différentes (la première fois sur 5 cm, la deuxième fois sur 10 cm), - un développement bidimensionnel : à l'aide d'éluants différents ou non, migration horizontale puis verticale à partir d'un dépôt en coin.

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6) Détection des substances séparées

Il existe différentes possibilités permettant de mettre en évidence des substances incolores sur un chromatogramme.
A l'aide d'une lampe UV: Attention : les UVB-UVC sont dangereux pour les yeux. à 254 nm : les substances contenant deux ou plusieurs doubles liaisons, ainsi que les dérivés aromatiques (par exemple ceux du benzène) présentent une absorption plus ou moins forte entre 250 et 300 nm. Pour les identifier sur la plaque, on ajoute un indicateur de fluorescence (= F 254) qui présente une fluorescence intense aux environs de 254 nm. Sur ce type de "plaque fluorescente" jaune vert les substances ci-dessus se reconnaissent par une diminution ou une extinction de fluorescence, donc par l'apparition de taches sombres, grises ou violettes. à 365 nm : certaines substances présentent une fluorescence propre.

-

-

A l'aide de réaction chimique : Le réactif est caractéristique d'une classe chimique, plus ou moins spécifique d'un groupement donné, et peut être utilisé de différentes manières : - par pulvérisation sous forme très dispersée, en "nuage" et non "en pluie". On utilise fréquemment un vaporisateur manuel dont le réservoir à aérosol et le récipient en verre pour le réactif peuvent être facilement renouvelés. Après avoir vérifié la régularité du jet, on asperge la plaque de manière régulière sans la "tremper". La révélation a lieu à température ambiante ou après chauffage. Pour obtenir une coloration maximale, il est souvent nécessaire de porter quelque temps le chromatogramme à une température déterminée, dans une étuve à température réglable ou sous un courant d'air chaud. - par immersion de la plaque dans le réactif. - sous forme de vapeurs dans une cuve saturée. 7) Analyse qualitative : identification des substances.

Les constituants chimiques sont ainsi visualisés sur le chromatogramme et leur position est exprimée en Rf (Rapport frontal) :
Rf = Distance parcourue par la substance (centre de la substance) -----------------------------------------------------------------------

Distance parcourue par le solvant (front du solvant) La valeur du Rf est comprise entre 0,00 et 1,00 et est donnée avec une précision de deux chiffres après la virgule. Comme elle est étroitement liée aux conditions opératoires (température, pression, lumière...), elle doit être considérée comme une "valeur d'orientation". Ce Rf étant difficilement reproductible, on identifie la tache inconnue par comparaison à une solution de référence (solution témoin) de concentration connue et préparée si possible avec le même solvant que la solution à analyser. Les solutions de référence et inconnue étant soumises aux mêmes conditions opératoires, il sera possible d'identifier la tache inconnue par comparaison du Rf et de la couleur.

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II – PRATIQUE DE LA CCM 1) Méthode classique - Matériel utilisé : . support prêt à l'emploi : gel de silice sur plaque de verre, feuille d'aluminium, film plastique : 10 x 20 cm ; 20 x 20 cm . solvants organiques purs ou en mélange : 100 mL . cuve de verre étanche . micropipettes capillaires de 5 µL ou pipettes Pasteur - Préparer le solvant de migration, mesurer exactement la quantité nécessaire Placer la cuve à l’abri des courants d’air et des sources de chaleur. - Préparation de la plaque de CCM : Pointer délicatement l’emplacement des dépôts, à l’aide d’un crayon à papier, à 15 mm des bords latéraux et du bord inférieur et espacés de 10 mm.

Avec une micropipette, déposer des quantités croissantes de solution à analyser en ayant soin d’appliquer la pipette perpendiculairement et doucement sur la couche mince sans l’abîmer. Déposer les extraits bien concentrés sous forme de trait et non de point et en plusieurs fractions. Bien laisser évaporer le solvant de la solution déposée entre chaque application du capillaire afin de concentrer les dépôts. Intercaler les dépôts inconnus et les dépôts de référence (témoins), ceux-ci n’étant jamais situés en bord de plaque. Tracer la limite du front de solvant à 10 cm de la ligne de dépôt. Les indications sur la nature des dépôts sont inscrites au crayon à papier sur la partie supérieure libre de la plaque, au-delà du front du solvant mais jamais à leur niveau. A chaque nature de dépôt correspond une micropipette. Après usage, la nettoyer, si nécessaire, avec le solvant du produit déposé. micro CCM
T1 X2 2X1 T2 2X2

CCM classique front du solvant 10 cm

X1
4 cm

0,5 cm 0,5 cm 1,5 cm

1,5 cm

ligne de dépôt

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- Développement : Déposer délicatement la plaque dans la cuve sans la laisser tomber. Fermer rapidement la cuve avec le couvercle rodé et laisser migrer jusqu’au front de solvant. Si on travaille avec plusieurs plaques par cuve, les introduire au même moment, le plus rapidement possible. En aucun cas ne déplacer la cuve pendant toute la durée de la migration.

Après migration, sortir rapidement la plaque et la placer à plat à l’air sous hotte aspirante. Refermer la cuve immédiatement. Faire évaporer le reste de solvant de la plaque sous courant d’air chaud (sous hotte) ou en étuve. En fin de séance, vider les cuves CCM dans un bidon « poubelle-solvant », jamais dans l’évier. Ne pas rincer à l’eau, laisser évaporer les solvants résiduels sous hotte.
- Révélation - Interprétation : Révéler le chromatogramme avec la lampe UV ou un réactif approprié. Entourer les taches apparues d’un trait de crayon et noter avec soin couleur et Rf. Par comparaison du Rf et de la couleur entre témoins et inconnus, identifier les substances présentes dans les extraits. Effectuer toujours la révélation physique avant toute révélation chimique.

2) Microméthode - Matériel utilisé : . gel de silice sur film plastique 5 x 5 cm . micropipette de 1 µL ou pipette Pasteur . mini cuve de verre étanche . solvants organiques purs ou en mélange : 3 ou 4 mL. - Dépôts des solutions : à 0,5 cm du bord inférieur et des bords latéraux . dépôts croissants de 1 à 5 µL de solution inconnue par fraction de 1 µL et séchage entre chaque dépôt . dépôts de 1 µL de solution témoin entre chaque dépôt inconnu. - Développement : tracer le front du solvant à 4,5 cm du bord inférieur et faire migrer sur 4 cm. 1 seule plaque par cuve. - Révélation – Interprétation :
identique à la méthode classique.

III – REDACTION D’UN RAPPORT

Si les techniques utilisées sont détaillées dans le polycopié, il est inutile de les citer dans le rapport. Par contre ce document doit comporter les résultats obtenus, les commentaires et les conclusions qui en dérivent :

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-

sujet de l’étude, CCM en précisant les conditions opératoires : nature de la phase stationnaire, de l’éluant, nature et quantité des dépôts, révélation(s), description du profil chromatographique et calcul des Rf, dans un tableau, schéma : recopier le chromatogramme obtenu dans tous ses détails (en couleur). Ne pas oublier la légende. Fixer, si possible, la plaque de CCM sur votre feuille. conclusion générale. T1 X2 2X1 T2 2X2

X1

X1: 2 µL solution inconnue 1 T1: 1 µL témoin 1 X2: 2 µL solution inconnue 2 2X1: 4 µL solution 1 T2: 1 µL témoin 2 2X2: 4 µL solution 2

IV – APPLICATION = CCM d’une huile essentielle (H.E.) de Menthe

-

Phase stationnaire et support: . gel de silice sur film plastique (5 cm x 5 cm) Dépôts : . témoins : . menthol : T1 1 µL d’une solution à 1 % m/V dans toluène . menthone : T2 1 µL d’une solution à 1 % V/V dans toluène . acétate de menthyle : T3 1 µL d’une solution à 1 % V/V dans toluène . H.E. : E1 : 1 µL - E2 : 2 x 1 µL - E3 : 3 x 1 µL de l’échantillon dilué Eluant : . Toluène – Acétate d’éthyle (95/5) 4 mL par cuve, exactement mesurés à la pipette. Migration : sur 4 cm Révélation : . vanilline sulfurique à chaud : après avoir pulvérisé la plaque avec le réactif, placer celle-ci à l’étuve à 110° pendant 5 minutes, jusqu’à ce que les couleurs apparaissent (réaction de condensation avec les aldéhydes : la vanilline, en milieu acide, fixe un proton et donne un réactif électrophile susceptible de se condenser sur un noyau aromatique). Identification : Observer la coloration verte de T1, bleue de T2 et bleue foncée de T3. Calculer les Rf. Comparer valeurs de Rf et couleurs avec l’H.E. Reproduire le schéma de la CCM sur la feuille de rapport.

-

-

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DOSAGES COLORIMETRIQUES ET NEPHELEMETRIQUES

NEPHELEMETRIE

SPECTROMETRIE

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NEPHELEMETRIE
J-L. MONAL

Cette technique est conduite comme les autres techniques de la spectrométrie, à la différence que la solution est stabilisée et trouble. Elle sera appliquée au dosage des ions sulfate dans une eau, selon la norme AFNOR en vigueur.

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SPECTROPHOTOMETRIE D’ABSORPTION DANS L’ULTRAVIOLET ET LE VISIBLE
P. LEROY

1. Principales notions fondamentales
Ce chapitre a pour objectif d’indiquer les notions fondamentales utiles pour la réalisation des travaux pratiques d’initiation à la manipulation ainsi que les autres manipulations utilisant cette méthodologie réalisées dans les différentes disciplines d’enseignement du cursus pharmaceutique.
Pour une description complète de cette méthodologie, se reporter à l’enseignement de Physique et d’Instrumentation.

- Le domaine du spectre ultraviolet (UV) utilisable en analyse s’étend d’environ 200 à 400 nm et celui du spectre visible (vis.) d’environ 400 à 900 nm. - Un chromophore est une fonction ou groupe d’atomes modifiant la fréquence de l’onde UV ou vis. ainsi que l’intensité d’absorption. - La lumière polychromatique issue d’une source lumineuse est décomposée en radiations monochromatiques par réflexion sur un réseau. Après avoir sélectionné la radiation monochromatique correspondant au maximum d’absorption de la solution à analyser, cette radiation traversera l’échantillon placé dans une cuve à faces planes et parallèles et sera partiellement absorbée. Le matériau de la cuve doit être transparent aux radiations utilisées (quartz en UV, verre ou plastique dans le vis.) - La radiation incidente d’intensité I0 subit une atténuation d’intensité ; soit I l’intensité de la radiation transmise. - La transmittance T est égal au rapport I/I0 et est exprimée en pourcentage (solution transparente : T = 100 % ; solution opaque : T = 0 %) - L’absorbance A est le logarithme décimal de l’inverse de la transmittance :
A = log (1/T) = log (I0/I).

- L’absorbance mesurée A est proportionnelle à la longueur de la cuve l et à la concentration c du soluté absorbant à cette λ (loi de Beer-Lambert) :

A=axlxc
- Le coefficient de proportionnalité a est égal à : - ε , absorbance molaire, si l est exprimé en centimètres et c en moles par litre (M-1.cm-1), - A1%1cm , absorbance spécifique, corrrespond à l’absorbance d’une solution d’une substance dissoute à 10 g/l sous une épaisseur de 1 cm. A une longueur d’onde déterminée, l’absorbance molaire ou spécifique est caractéristique d’un soluté dans des conditions expérimentales définies (température, solvant, pH).

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- La loi de Beer-Lambert est largement appliquée à l’analyse quantitative. - La loi de Beer-Lambert est applicable dans les conditions suivantes : - le milieu doit être transparent, - la température doit être constante, - la solution ne doit pas être trop concentrée (valeurs lues ne dépassant pas 1 unité d’absorbance), - la substance ne doit pas donner lieu à des réactions chimiques sous l’effet du rayonnement incident, ni des associations variables avec le solvant, - le faisceau lumineux doit être monochromatique. - La loi de Beer-Lambert est une loi additive (contribution à l’absorbance totale des différents chromophores absorbant à une même longueur d’onde). - Les solvants utilisés ne doivent pas absorber dans la zone de longueurs d’onde étudiée (exemple : le dichlorométhane ne peut être utilisé qu’au dessus de 220 nm). Attention : ne pas utiliser des solvants organiques (solvants chlorés, acétone,…) avec des cuves en plastique. - Un spectrophotomètre comprend les éléments principaux suivants : - des sources lumineuses polychromatiques UV (lampe au deutérium), vis. (lampe à incandescence type tungstène) ou UV-vis. (lampe au Xénon pulsée), - un monochromateur : dispositif dispersif de la lumière polychromatique émise par la source permettant de n’envoyer vers l’échantillon qu’un intervalle de longueurs d’onde très étroit appelé « bande passante » ; ce dispositif peut être motorisé afin de faire varier λ en continu lors d’un tracé de spectre. - un détecteur, en général une photodiode. - Il existe différents types de spectrophotomètres UV-vis. : mono-, double faisceau , barrette de diodes. - Les spectrophotomètres utilisés aux Travaux Pratiques sont de type mono-faisceau : ils comportent un monochromateur constitué d’un réseau par réflexion suivi d’une fente. Grâce à un miroir semi-réfléchissant, une partie de l’énergie du rayonnement est envoyée sur un premier détecteur (I0) et une partie égale vers l’échantillon ; la lumière transmise par l’échantillon absorbant (I) est reçue par le second détecteur. - Le tracé d’un spectre UV et/ou vis. (A = f (λ)) d’une substance dissoute, à l’aide d’un spectrophotomètre mono-faisceau nécessite l’enregistrement préalable du spectre du « blanc » (solvant pur, tous les réactifs sauf la substance à doser en spectrophotocolorimétrie). Ce spectre sera « mémorisé » par l’appareil et le spectre de la substance étudiée correspondra à la différence entre le spectre de la solution contenant celle-ci et celui du « blanc ». - Il en est de même pour la mesure d’absorbance à une seule valeur de λ. - Les intérêts de la spectrophotométrie UV-vis. sont multiples : identification de composés organiques et inorganiques et leur dosage, détermination de constantes d’équilibre (exemple : pKa ; complexation) détection en chromatographie liquide haute performance et en électrophorèse capillaire.

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2. Manipulation
2.1. Propriétés spectroscopiques UV du paracétamol 2.1.1. Principe La détermination des caractéristiques spectroscopiques UV d’un composé organique (λmax, coefficients de la loi de Beer Lambert) présente un intérêt sur le plan de l’identification de ce composé ainsi que celui de son dosage (spectrophotométrie UV directe ou couplée à une méthode séparative : chromatographie liquide haute performance, électrophorèse capillaire,…). 2.1.2. Réactifs et solutions étalons Acide chlorhydrique (HCl) 0,1 M Solution prête à l’emploi Solution mère de paracétamol (Mr = 151,2) Paracétamol 50 mg Méthanol q.s.p. 100 ml Solution prête à l’emploi Solution fille de paracétamol solution mère de paracétamol 1,0 ml HCl 0,1 M 0,5 ml Méthanol q.s.p. 100 ml Solution à préparer extemporanément et à protéger de la lumière (envelopper la fiole jaugée de papier aluminium) 2.1.2. Mode opératoire Enregistrer le spectre UV (de 210 à 380 nm) de la solution fille de paracétamol. Pour ce faire, utiliser des cuves en quartz* et enregistrer la ligne de base en utilisant comme référence du méthanol. Se reporter à la fiche d’utilisation simplifiée de chaque spectrophotomètre. * Précautions d’emploi : - Manipuler avec précaution les cuves en quartz - Remplir au ¾ la cuve avec la solution à tester et essuyer avec un papier doux les 4 faces ainsi que le fond de la cuve - Placer la cuve dans le porte-cuve du spectrophotomètre en veillant à ne pas renverser la solution et à placer les faces transparentes sur le trajet du faisceau lumineux - Tracer le spectre - Nettoyer la cuve au moyen d’une pissette d’eau distillée - Noter la longueur d’onde maximale d’absorption (λmax) ainsi que la valeur d’absorbance correspondant à ce λmax - Calculer les valeurs d’absorbance molaire et d’absorbance spécifique du salicylate de sodium à λmax

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2.2. Dosage spectrophotocolorimétrique du salicylate de sodium 2.2.1. Principe Le salicylate de sodium donne en milieu acide et en présence d’ions Fe3+ une coloration violette qui sera utilisée pour son dosage spectrophotocolorimétrique . Cette réaction colorimétrique est utilisable pour l’identification des salicylates et pour le dosage des salicylés libres et totaux (après hydrolyse) dans des milieux biologiques en toxicologie. 2.2.2. Réactifs et solutions étalons Acide chlorhydrique (HCl) 1 M Solution prête à l’emploi Réactif ferrique Fe(NO3)3, 9 H2O (Mr = 404) 40 g HCl 1 M 120 ml eau distillée q.s.p. 1000 ml Solution prête à l’emploi Solution mère de salicylate de sodium (Mr = 160,1) 14,5 mM salicylate de sodium 232 mg eau distillée q.s.p. 100 ml Solution prête à l’emploi Solution fille de salicylate de sodium 2,9 mM solution mère de salicylate de sodium 20 ml eau distillée q.s.p. 100 ml Solution prête à l’emploi 2.2.3. Mode opératoire Dans une série de tubes à essai bouchés, verser successivement : Tube n° 1 2 3 Solution fille de salicylate 0 0,6 1,2 de sodium (ml)* Solution à doser (ml)** Eau distillée (ml)* 3,0 2,4 1,8 r Réactif ferrique (ml)*** 15 15 15 * : utiliser une burette graduée au 1/20ème de ml ** : utiliser une pipette jaugée de précision (classe A) *** : utiliser un distributeur automatique 4 1,8 1,2 15 5 2,4 0,6 15 6 3,0 0 15 7 2,0 1,0 15

- Agiter immédiatement pendant 30 s au moyen d’un vortex et laisser reposer pendant 5 min. - Enregistrer le spectre visible (de 400 à 800 nm) de la coloration obtenue en utilisant le tube n° 4. Pour ce faire, utiliser des cuves en plastique* et enregistrer la ligne de base en utilisant comme référence la solution correspondant au tube n°1. Se reporter à la fiche d’utilisation simplifiée de chaque spectrophotomètre.

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* Précautions d’emploi : - Remplir au ¾ la cuve avec la solution à tester et essuyer avec un papier doux les 4 faces et le fond de la cuve - Placer la cuve dans le porte-cuve du spectrophotomètre en veillant à ne pas renverser la solution et à placer les faces transparentes sur le trajet du faisceau lumineux - Faire la lecture, retirer la cuve, la vider dans le récipient prévu à cet effet - Jeter les cuves après emploi. - Noter la longueur d’onde maximale d’absorption (λmax) et régler le spectrophotomètre sur cette valeur de λ. Mesurer l’absorbance pour chacun des tubes (n° 2 à 7) en utilisant comme référence la solution correspondant au tube n°1. - Diluer, si nécessaire, la solution à doser afin d’obtenir une absorbance située entre celles mesurées pour les tubes n° 2 et n° 6. - Reporter les valeurs de concentration en salicylate de sodium (x) et d’absorbance (y) dans le tableau Excel fourni (ne pas reporter les valeurs du tube n° 1 ou « blanc ») et calculer : - l’équation de la droite par régression linéaire ainsi que son coefficient de corrélation (représenter graphiquement cette droite d’étalonnage) - la concentration (en g.l-1 et en molarité) de salicylate de sodium dans la solution à doser (tenir compte du volume de la prise d’essai et de la dilution effectuée). - Reporter le valeurs de concentration en salicylate de sodium (x) et d’absorbance (y) sur une feuille de papier millimétré, tracer la droite d’étalonnage et calculer la concentration (en g.l-1 et en molarité) de salicylate de sodium dans la solution à doser (tenir compte du volume de la prise d’essai et de la dilution effectuée). Les résultats (valeurs, graphiques) seront consignés dans le cahier de laboratoire et commentés en fin de séance en présence d’un enseignant.

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NOTIONS DE METROLOGIE, CALCULS D’INCERTITUDE, CONTROLE DE QUALITE

APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE

QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE

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APPLICATION DES CALCULS D’INCERTITUDE
V. PICHON (voir le premier chapitre « Suivi et rendu des résultats »)

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QUALIFICATION DES APPAREILS ET NOTION DE CONTROLE DE QUALITE
Igor CLAROT

1. LA QUALITE DANS UN LABORATOIRE
QUALITE : Ensemble des propriétés et caractéristiques d’un produit ou service qui lui confèrent l’aptitude à satisfaire des besoins explicites ou implicites d’un client. CONTRÔLE QUALITE : processus qui vise à garantir que le niveau de qualité défini par un fabricant pour un bien ou un service donné est bien respecté. L’Assurance Qualité peut se résumer en une démarche qui : tend vers le « zéro défaut » ou Qualité Totale ; et prévient l’erreur ou le défaut plutôt que d’avoir à le constater a posteriori.

La Qualité, OUI, mais pas n’importe comment ! ! Il existe des normes de gestion de la Qualité (ISO 9000, 9001, 9002… ou EN 29000,…), ces normes représentent une définition commune des règles et des pratiques qui assurent ou garantissent la Qualité.
Certification / Accréditation : la certification s’adresse à l’Assurance Qualité de l’entreprise alors que l’accréditation comprend en plus sa compétence et sa fiabilité.

Un système essentiel pour les laboratoires : Les Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL). Il s’agit d’un ensemble de règles se rapportant au mode d’organisation et aux conditions dans lesquels les essais de laboratoire sont planifiés, effectués, contrôlés, enregistrés et diffusés. La description complète de ces BPL est parue au Journal Officiel des Communautés Européennes (1999). Un référentiel majeur pour l’analyse pharmaceutique « La Pharmacopée Européenne ». Le rôle de ce document est de participer à la protection de la Santé publique par le biais de l’élaboration de spécifications communes reconnues, destinées à être utilisée par les professionnels de la santé et, de façon générale, par tous ceux que concerne la qualité du médicament. Ce référentiel indique les méthodes et les techniques à utiliser pour chaque substance (Monographie). L’utilisation de techniques analytiques implique un appareillage répondant aux attentes de l’utilisateur mais surtout à celles de la Pharmacopée. Il devient donc primordial de travailler avec des matériels propres à être utilisés et à donner un résultat fiable, ces matériels sont dit « Qualifiés ».

2. LA QUALIFICATION D’EQUIPEMENT
La Qualification d’Equipement est un processus formel qui fournit la preuve documentée qu’un équipement de mesure est approprié à l’utilisation à laquelle il est destiné et qu’il est 104

maintenu à un niveau de performance adéquat pour cette utilisation grâce à un suivi métrologique. Ce processus est nécessaire pour garantir la fiabilité des résultats de mesure obtenus. En particulier, elle fournit l’assurance qu’un équipement fonctionne correctement indépendamment de l’application ou de la méthode utilisée.
Phases de Qualification d’Equipement

Un processus complet de Qualification d’Equipement se divise en 4 étapes :
Qualification Fonctionnelle : cette qualification traduit les exigences de l’utilisateur en termes de spécifications. Cette première partie est utilisée le cas échéant par l’acquéreur pour soumettre un appel d’offre (sélection d’un équipement chez un fournisseur, processus d’achat). Qualification d’Installation : cette qualification est conduite sur site au moment de l’installation. Elle documente tous les aspects de l’installation conformément aux spécifications du constructeur. Qualification Opérationnelle : cette qualification est effectuée à la suite de l’installation et doit être répétée suivant un intervalle de temps précis. Elle vérifie que tous les modules de l’équipement fonctionne correctement sur les plages d’utilisation spécifiées. Qualification de Performance : cette qualification permet d’établir que l’équipement est approprié aux types de mesures analytiques envisagées et doit être réalisée par l’utilisateur. Classement de l’instrumentation

En fonction de l’utilisation qui en est faite, l’équipement peut être divisé en trois grands groupes : Equipement nécessitant une maintenance Equipement nécessitant un étalonnage Equipement nécessitant un test de performance

Equipement nécessitant une maintenance : tout équipement utilisé pour des travaux analytiques, mais ne comportant pas d’éléments optiques, électronique ou mécanique susceptible de se dérégler. Equipement nécessitant un étalonnage : tous les appareils effectuant des mesures doivent être périodiquement inspectés, calibrés et ajustés aux normes de tolérances et spécifications de précision et d’exactitude à l’aide de substance de références ou de matériels certifiés. Equipement nécessitant un test de performance : tous les appareils comportant des pièces d’usure et/ou pour lesquels il n’existe pas de substance de référence permettant de réaliser un étalonnage doivent être soumis à un test de performance répétitif.

Pour être efficace, un programme de qualification doit clairement identifier les tests à effectuer sur chaque type d’appareil, s’appuyer sur des bases techniques scientifiquement établies et utiliser des tests statistiques. La totalité du parc d’appareil doit être sous contrôle. 105

EXEMPLE 1 (EXEMPLE THEORIQUE)
Les questions sont en italique avec .

SPECTROPHOTOMéTRIE D’ABSORPTION DANS L’ULTRAVIOLET ET LE VISIBLE (Pharmacopée Européenne 4ème Ed. 2.2.25.) Détermination de l’absorbance. L’absorbance (A) d’une solution est le logarithme décimal de l’inverse de la transmittance (T) pour un rayonnement monochromatique. Elle s’exprime par l’équation

T = I/I0, I0 = intensité du rayonnement monochromatique incident, I = intensité du rayonnement monochromatique transmis. En l’absence d’autres facteurs physico-chimiques, l’absorbance mesurée (A) est proportionnelle à l’épaisseur (b) de la couche traversée et à la concentration (c) de la substance dissoute, en accord avec l’équation :

ε = absorbance molaire, si b est exprimé en centimètres et c en moles par litre.

L’expression représentant l’absorbance spécifique d’une substance dissoute, se rapporte à l’absorbance d’une solution à 10 g/l sous une épaisseur de 1 cm à une longueur d’onde déterminée d’où :

Sauf indication contraire, mesurez l’absorbance à la longueur d’onde prescrite sous une épaisseur de 1 cm à 20 ± 1 °C. Sauf indication contraire, effectuez les mesures par rapport au même solvant ou au même mélange de solvants. L’absorbance du solvant, mesurée par rapport à l’air et à la longueur d’onde prescrite, ne doit en aucun cas dépasser 0,4 et doit être Pourquoi ? de préférence inférieure à 0,2. Tracez le spectre d’absorption en portant en ordonnées les valeurs d’absorbance ou toute fonction de celle-ci et en abscisses la longueur d’onde ou toute fonction de celle-ci. Lorsque la monographie donne une seule valeur pour la position d’un maximum d’absorption, il est admis que la valeur obtenue peut s’en écarter de 2 nm.
Appareil. Les spectrophotomètres utilisés pour l’étude des régions ultraviolette et visible du spectre sont constitués par un système optique, susceptible de fournir un rayonnement monochromatique dans la région de 200 nm à 800 nm, et par un dispositif approprié à la mesure de l’absorbance. Donner les limites en nm des régions ultraviolette et visible.

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Contrôle des longueurs d’onde. Vérifiez l’échelle des longueurs d’onde en utilisant les maximums d’absorption de la solution de perchlorate d’holmium R [1043101], la raie de la lampe à hydrogène ou au deutérium ou les raies de l’arc à vapeur de mercure indiquées dans le tableau 2.2.25.-1. La tolérance admise est de ± 1 nm pour la région de l’ultraviolet et de ± 3 nm pour la région du visible.

Tableau 2.2.25.-1. – Maximums d’absorption pour le contrôle de l’échelle des longueurs d’onde 241,15 nm (Ho) 253,7 nm (Hg) 287,15 nm (Ho) 302,25 nm (Hg) 313,16 nm (Hg) 334,15 nm (Hg) 361,5 nm (Ho) 365,48 nm (Hg) 404,66 nm (Hg) 435,83 nm (Hg) 486,0 nm (Dβ) 486,1 nm (Hβ) 536,3 nm (Ho) 546,07 nm (Hg) 576,96 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)

Pour un contrôle avec une solution de perchlorate d’holmium, quelles sont les raies caractéristiques à prendre en considération ? Quelle est la tolérance sur chacune de ces raies ? Contrôle de l’absorbance. Contrôlez l’absorbance au moyen de filtres appropriés ou de solution de dichromate de potassium R [1069500] aux longueurs d’onde indiquées dans le tableau 2.2.25.-2. Pour chaque longueur d’onde, la valeur précise et les valeurs limites de l’absorbance spécifique y figurent. La tolérance admise pour l’absorbance est de ± 0,01. Pour le contrôle de l’absorbance, utilisez une solution de dichromate de potassium préparée comme suit : desséchez au préalable le dichromate de potassium R [1069500] à 130 °C jusqu’à masse constante ; dissolvez une prise d’essai de 57,0 mg à 63,0 mg de substance desséchée dans de l’acide sulfurique 0,005 M et complétez à 1000,0 ml avec le même acide. Tableau 2.2.25.-2 Longueur d’onde (nm) 235 257 Absorbance spécifique 124,5 144,5 Tolérance max 122,9 to 126,2 142,8 to 146,2

313 350

48,6 107,3

47,0 to 50,3 105,6 to 109,0

Pourquoi dessécher le dichromate ? Sachant que pour une solution contenant 59,0 mg de dichromate préparée comme indiqué, l’absorbance lue sous 1 cm à 235 nm est 0,734, déterminer l’absorbance spécifique correspondante de deux manières différentes et conclure. (Mr K2Cr2O7 = 294,2) Limite de lumière parasite. La lumière parasite peut être décelée à une longueur d’onde donnée à l’aide de filtres ou de solutions appropriés ; par exemple, l’absorbance d’une solution de chlorure de potassium R [1069100] à 12 g/l mesurée sous une épaisseur de 1 cm augmente de façon abrupte entre 220 nm et 200 nm et est supérieure à 2 à une longueur d’onde comprise entre 198 nm et 202 nm, lorsqu’elle est comparée à l’eau comme liquide de compensation.

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Pouvoir de résolution (analyse qualitative). Lorsque la monographie l’exige, effectuez comme suit la mesure du pouvoir de résolution de l’appareil : enregistrez le spectre d’une solution de toluène R [1091300] à 0,02 pour cent V/V dans l’hexane R [1042600]. Le rapport minimal entre l’absorbance au maximum à 269 nm et l’absorbance au minimum à 266 nm est indiqué dans la monographie. Qu’est ce que ce test implique au niveau du spectrophotomètre ? Largeur de la fente spectrale (analyse quantitative). Pour éviter des lectures erronées dues à la largeur de la fente spectrale, lors de l’utilisation d’un instrument à largeur de fente variable à la longueur d’onde choisie, la largeur de la fente doit être faible par rapport à la demilargeur de la bande d’absorption mais, en même temps, elle doit être aussi large que possible pour obtenir une valeur élevée de I0. Toutefois, la largeur de fente est choisie de telle façon que toute nouvelle diminution de largeur ne modifie pas la lecture de l’absorbance. Cuves. La tolérance d’épaisseur des cuves utilisées est de ± 0,005 cm. Remplies du même solvant, les cuves destinées à contenir la solution à examiner et le liquide de compensation doivent présenter la même transmittance. Si tel n’est pas le cas, une correction appropriée doit être apportée. Veillez soigneusement à l’entretien et au nettoyage des cuves. Quels sont les éléments qui permettent de choisir les cuves appropriées ?

EXEMPLE 2 (EXEMPLE PRATIQUE)

CONTROLE DES PERFORMANCES DES pH METRES ANALYTIQUES
I. Extrait du Guide de Méthodologie pratique, Assurance de la Qualité, édité par MERCK, Mars 2000. 1 - VERIFICATION DE L'ELECTRODE
1.1 Vérification de la pente de l’électrode Matériel nécessaire • pH mètre capable d’effectuer des mesures en millivolts, • Electrode indicatrice de verre et de référence au calomel saturé • Solutions tampons pH = 4,00 et 7,00

Lorsqu'on mesure des ions H+ (n = +1), la pente à 25 °C (298 K) a pour valeur 59,16 mV. Elle est désignée par facteur de pente idéal. Il en découle que pour une variation de pH d'une unité, un système de mesure idéal enregistrera une variante de tension égale à 59,16 mV. Pourquoi ? Cette mesure du facteur de pente est indicatrice de la qualité du système d'électrode.

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Mettre le pH-mètre sous tension, rincer soigneusement les électrodes avec de l’eau distillée. Immerger les électrodes dans une solution tampon de pH 7,00. Laisser les électrodes s’équilibrer pendant 5 minutes et lire le potentiel de l’électrode (EpH7) (bouton pH/mV).
La valeur lue doit être comprise entre +10,00 mV et – 10,00 mV.

Si la valeur lue s’écarte de ces spécifications, il convient de changer l’élecrolyte de l’électrode de référence puis de répéter ce test avant de continuer. Rincer soigneusement les électrodes puis les immerger dans une solution tampon de pH 4,00. Laisser les électrodes se stabiliser pendant 5 minutes puis lire la valeur du potentiel. (EpH4) La différence des potentiels ainsi obtenue (EpH4 - EpH7) doit se situer entre 170 et 178 mV. Calculer la valeur de la pente par unité de pH.
Cette valeur doit être comprise entre 56,20 et 62,12 mV par unité de pH.

Lorsque la valeur de la pente tombe en dessous de 56,20 mV par unité de pH (efficacité de la pente de 95 %) ou si la dérive du point zéro dépasse ± 20 mV, un conditionnement peut rétablir le niveau de qualité requis de l'électrode, mais il peut s'avérer nécessaire de remplacer l'électrode afin d'assurer des mesures de pH précises.
1.2 Vérification du temps de réponse de l’électrode

Rincer soigneusement l’électrode dans la solution tampon de pH 4,00. Laisser l’électrode s’équilibrer 2 minutes. Noter la valeur du potentiel. Rincer l’électrode avec de l’eau distillée. Immerger l’électrode dans une solution tampon de pH 7,00 et noter le potentiel après 1 minute, puis après 2 minutes.
La valeur du potentiel lue après une minute, ne doit pas différer de plus de 3 mV de celle lue après deux minutes.

Si le temps de réponse est plus long, nettoyer l’électrode à l’acide fluorhydrique à 1% (m/v) pendant 1 minute.
Justifier le choix de l’acide et la limitation du temps de contact.

2. Vérification du PH mètre. ( ne pas réaliser cette partie pendant la séance, partie grisée)

Raccorder le générateur de tension par un cordon approprié au pH mètre à tester. Générer des tensions qui correspondent aux valeurs de potentiel d’électrode pour des valeurs de pH de 2.000, 4.000, 7.000, 9.000, 12.000.

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Tension exprimée en mV

Valeur théorique de pH

Limites d’acceptation de la valeur relevée sur l’afficheur.

+ 295.8 + 177.5 + 0.00 - 118.3 -295.8

2.00 4.00 7.00 9.00 12.00

1.95 à 2.05 3.95 à 4.05 6.95 à 7.05 8.95 à 9.05 11.95 à 12.05

Lire les valeurs de pH indiquées par le pH mètre pour chacune des tensions. Effectuer 3 mesures pour chacune des tensions.
Vérification de l'exactitude du pH mètre. Détermination de l'erreur de gain

L'erreur de gain est estimée par l'écart absolu de la pente par rapport à 1, cet écart étant exprimé en pourcentage. Soit y = f x dans laquelle : y = valeur du pH lue sur le pH mètre x = valeur théorique du pH (valeur indiquée par le fabricant) On obtient une courbe d'équation y = ax + b dont la pente a devrait être égale à 1. Déterminez a ainsi que l’erreur sur le gain. L'erreur de gain est égale à :
Eg = 100 × a − 1 [%]

L'erreur de gain ne doit pas être supérieure à 1,5 pour cent.

II. Etalonnage automatique
Suivre la procédure d’étalonnage présente à coté de chaque pH-mètre. Comparer la valeur de pente obtenue avec la méthode précédente. Que pensez vous de la méthode automatique d’étalonnage ?

3. REFERENCES
- « L’assurance qualité dans les laboratoires agroalimentaires et pharmaceutiques » Max Feinberg, Ed. Tec et Doc, Paris, 1999. - Directive 1999/11/CE de la Commission du 08 mars 1999 : Journal Officiel des Communautés Européennes, 23.3.1999, L77/9. - « Assurance de la Qualité, Guide de Métrologie Pratique » G. Gaspar, P. Jonvel et T. Maisonneuve, Merck S.A. France, Mars 2000. - Pharmacopée Européenne, 4ème Ed., Conseil de l’Europe, Strasbourg, 2002. - La Qualification d’Equipement pour Instruments de Mesure en Chimie Analytique, Radiometer Analytical S.A.

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