Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie CINÉ I.

ÉLÉMENTS DE CINÉTIQUE CHIMIQUE
A. VITESSE D’UNE RÉACTION A.
Voir Doc 1 et exercice N°1. On peut suivre une cinétique enzymatique de 2 manières : - En mesurant la disparition du substrat en fonction du temps - En mesurant l’apparition du ou des produits en fonction du temps

F. LAURO

Soit la réaction : A P La vitesse de réaction est directement proportionnelle à la concentration du réactif A qui varie au cours de la réation selon la vitesse V = -d [A] / dt = d [P] / dt = k.[A] (1) k est la constante de vitesse pour la réaction. La disparition du réactif A est de type exponentielle. - Si les concentrations sont exprimées en mole/L (M) - Si le temps en secondes (s) -1 V s’exprime en M.s -1 k en s . On voit donc que la vitesse décroit au cours du temps
1 Concentration relative en substrat

0,5

temps t1/2

On peut exprimer léquation (1)sous la forme : -d [A] / [A] = d ( ln [A] ) = -k.dt (2) Si on intègre cette équation de [A0] (concentration initiale de A à t=0) jusqu’à [A] (concentration de A au temps t) on obtient l’équation suivante : Ln [A] = ln [A0] – kt (3) Ou [A] = [A]0 e
-kt

(4)

Si on considère l’équation (3) on a une équation de la forme Y = - a.X + b - Y = ln [A] - a = k coefficient directeur de la pente - X=t - b = ln [A0] On peut alors tracer le graphe ln [A] = f(t) et on obtient une droite de pente – k qui coupe l’axe des ordonnées pour ln [A] = ln [A0] Page 1 sur 25

Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie
Ln [A] Ln [A]0 Ln [A] = - kt + ln [A0] Y = -aX + b

F. LAURO

Pente = - k = yB-yA / xB - xA yB - yA

xB - xA

temps Tracé de Ln [A] en fonction du temps pour une réaction d’ordre 1

B. ORDRE D’UNE RÉACTION B.
Soit la réaction : A+B La vitesse d’une réaction dépend de différents facteurs : [ ] en réactifs et produits Température Milieu C+D

La vitesse de cette réaction s’exprime de la manière suivante : où

V = k.[A]α.[B]β

k représente la constante de vitesse ; elle dépend de la température [A] et [B] représentent les concentrations de A et B α + β représente l’ordre global de la réaction NB : Dans une réaction simple, α et β sont les coefficients stoechiométriques. Si l’ordre de la réaction est nul : α + β = 0 ( c’est à dire α = 0 et β = 0 ), on a :
V

k

[A]

La vitesse d’apparition du produit est donc indépendante de la concentration des réactifs.

Si la réaction est du premier ordre ou d’ordre 1 : α + β = 1 ; on a

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[A] ordre de la réaction = 1 Zone 3 : V = k ordre de la réaction = 0 1 2 3 temps Page 3 sur 25 . LAURO k [A] La vitesse d’apparition du produit est directement proportionnelle à la concentration du substrat.[A]² ordre de la réaction = 2 Zone 2 : V = k. Si la réaction est d’ordre 2 ou supérieur : α + β = 2 ou > 2. on obtient le tracé suivant : [A] 1 Zone 1 : V = k. on a Vi k [A] La vitesse d’apparition du produit dépend directement des concentrations de 2 substrats. NB : Si l’on suit l’évolution d’une réaction en fonction du temps.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie Vi F.

[D] / [A].soit il y a 1 seul substrat : 2A P . Détermination grâce à Vi sur un graphe [Vi] = f[A] Si entre [A1] et [A2] = [2A1] : Vi = constante Ordre 0 Vi double (x2) Ordre 1 - F. LAURO Vi quadruple (x4) Ordre 2… 2.soit A. ÉQUILIBRE D’UNE RÉACTION C. nommé demi-vie et noté t1/2. Détermination par essais successifs : Mesure de [A] en fonction du temps : [A] = f(t) . donc Et donc k1 / k2 = [C]. A : le réactif A disparaît à la vitesse V = -d [A] / dt = k. La vitesse d’une réaction dépend de : .s-1. FACTEURS INFLUENÇANT LA VITESSE D’UNE RÉACTION D. Comme V est toujours en M.soit A et B : le réactif A disparaît à la vitesse V = -d [A] / dt = k.[B] = Ke = constante d’équilibre Une réaction en équilibre se caractérise par sa constante d’équilibre. est une constante.soit il y a 2 réactifs notés A et B conduisant à un produit P : A + B P La vitesse des réactions est fonction de la concentration des 2 réactifs en présence . La demi-vie est en fait indépendante de la concentration initiale du substrat.la concentration des réactifs .de la nature du milieu (pH.de k la constante de vitesse. température…) .Ln 2 = t1/2 t1/2 = Ln2/k Réaction d’ordre 2 ou bimoléculaire : En fait 2 cas de figure : .[A] = f(t) est une droite . Démonstration : Ln [A] = ln [A0] – kt soit [A] = [A0] / 2 : la moitié du substrat initialement présente a été transformé Ln ([A0]/2) = Ln [A0] – kt1/2 Ln ([A0]/2) – Ln ([A0]) = -kt1/2 Ln ([A0]/2 / [A0]) = -kt1/2 Ln (1/2) = -kt1/2 . Mais cette fois la vitesse V est proportionnelle à un produit de 2 concentrations. Page 4 sur 25 .[D] Quand la réaction atteint l’équilibre.[A]² .[A]m Ln V = Ln k + m Ln [A] e[A] = f(t) determination graphique de V Ln V = f(Ln [A]) droite de pente m Ordre 0 Ordre 1 Ordre 2 La demi-vie ou t1/2 Une des caractéristiques des réactions d’ordre 1 est que le temps nécessaire pour que la moitié du substrat initialement présent soit transformé.[B] Dans le sens 2 : V2 = k2 [C]. V1 = V2.[A]. Méthode de Van’t Hoff V = k. La plupart des réactions sont réversibles et atteignent un équilibre (voir doc 3) 1 A+B 2 C+D Les vitesses de réaction s’expriment de la manière suivante : Dans le sens 1 : V1 = k1 [A].Ln [A] = f(t) est une droite . Remarque : si le réactif B est largement excédentaire dans le milieu réationnel de telle sorte que sa concentration soit pratiquement constante on retrouve une réaction d’ordre 1 C.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie Détermination expérimentale de l’ordre d’une réaction : 1.s-1 alors la constante k s’exprime en M-1.1/[A] = f(t) est une droite 3.[B] La vitesse d’apparition du produit dépend directement soit des concentrations de 2 substrats. soit du carré de la concentration d’un seul substrat. D.

on a intérêt à mesurer la vitesse au début de la réaction. On néglige ainsi la réaction inverse. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN ENZYME SUR LA Vi B. on introduit un large excès de S. A. B. on obtient Km = 2. c’est à dire quand t tend vers 0 et concentration en substrat saturante. pour réaliser ces conditions appelées conditions initiales. C. Voir exercice N°2 Conclusion : Pour étudier une cinétique enzymatique. En pratique. ce qui permet de mesurer correctement la vitesse initiale. P= produit F. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT SUR LA Vi C.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie CINÉ EXPÉRIMENTALE II. Voir exercice N°4 NB : On définit aussi une concentration en substrat appelée Km. VITESSE INITIALE DE LA RÉACTION A. l’enzyme n’est pas consommée.6. Application : on peut doser ainsi une enzyme dans un milieu réactionnel. Sur la courbe. qui correspond à la concentration en substrat pour laquelle Vi = Vmax / 2. S= substrat . Elle catalyse la réaction suivante : Saccharose + H2O α-D-glucopyranose + β-D-fructofuranose L’étude cinétique de cette réaction enzymatique peut être réalisée : Par mesure de la quantité de glucose formé par unité de temps par colorimétrie (méthode au DNS = ac 3-5 dinitrosalicylique) Par mesure de la quantité de saccharose restant par polarimétrie. lorsque peu de substrat a été transformé et peu de produit formé. on a Vi proportionnelle à la concentration en enzyme dans le milieu. L’équation globale peut s’écrire sous la forme : E+S E= enzyme . LAURO E+ P Exemple : On prend l’exemple de la β-fructosidase (invertase ou saccharase) qui est une enzyme intestinale que l’on trouve également dans la paroi de la levure. CINÉTIQUE ENZYMATIQUE : ÉTUDE EXPÉRIMENTALE Dans le cas des réactions enzymatiques. la pente est alors maximale. Voir exercice N°3 Conclusion : Quand on se place dans les conditions initiales.10-2 mol/l de saccharose. Page 5 sur 25 .

MODÈLE DE MICHAËLIS MENTEN A.CINÉTIQUE ENZYMATIQUE : ÉTUDE THÉORIQUE CINÉ A. En remplaçant [E] dans l’équation 2. soit la réaction : 1 3 F. donc si [ES] est constante. on obtient : k3 [E total] [S] Vi = k3 [ES] = Equation ( 3 ) Km + [S] Quand [S] est >>> Km (conditions saturantes en S ).[S] = Km [S] [E total] = Km + [S] [ES] [ES] = [S] [E total] Km + [S] En remplaçant [ES] dans l’équation 1. k1 S+E ES k3 E+ P k2 On aura donc : V1 = k1 [S] [E] V2 = k2 [ES] V3 = k3 [ES] La vitesse de catalyse Vi est directement liée à la réaction 3 qui est la réaction limitante. La vitesse de formation de ES est la vitesse V1 et celle de sa destruction est V2 + V3. LAURO S+E 2 ES 4 E+ P On se place dans les conditions initiales. [E] = [E total] . V1 = V2 + V3 D’où k1 [S] [E] = k2 [ES] + k3 [ES] = ( k2 + k3 ) [ES] k2 + k3 k1 = [S] [E] [ES] = Km = constante de Michaëlis exprimée en mol/L Equation ( 2 ) Or.[ES] ) = [ES] [ES] [S] [E total] . on a : L’Equation de Michaëlis Menten Vmax [S] Vi = Km + [S] Page 6 sur 25 . c’est à dire où [ES] est une constante. soit Vi = V3 = k3 [ES] Equation ( 1 ) On se place dans les conditions de l’état stationnaire .[ES] .[S] [ES] = [ES] [S] [E total] . c’est elle que l’on mesure. il y a autant de complexe ES qui se forme que de complexe ES qui est détruit .Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie THÉ III. Plusieurs hypothèses ont été émises : Il se forme un complexe transitoire entre S et E. on peut alors négliger la réaction 4. c’est à dire quand il y a très peu de P formé . on obtient : [S] ( [E total] . tous les sites enzymatiques sont occupés et donc [ES] = [E total] D’où Vi = Vmax = k3 [E total] En remplaçant k3 [E total] dans l’équation 3.

Plus l’affinité du S pour l’E est grande et plus Km est petit. d’où : Vmax = Vi quand [ES] = [E total] et donc Vmax = k3 [Et] . Vmax est la vitesse initiale maximale quand [S] est >>>>> [E] dans des conditions expérimentales déterminées ( [E]. En utilisant la représentation des doubles inverses ou représentation de Lineweaver et Burk. k1 Kd = [S] [E] / [ES] = Km S+E ES K a = 1 / Kd et K m = 1 / Ka k2 et donc Km est l’inverse de la constante d’affinité de E pour S. pH. donc toute l’enzyme est sous forme ES. composition du milieu. fonction d’une hyperbole.y = Vi . il y a donc proportionnalité entre la Vmax et la conc en E. LAURO L’équation de Michaëlis est une fonction de forme y = ax / b + x .F. on obtient une plus grande précision. temps de contact ). avec a = Km / Vmax et b = 1 / Vmax Page 7 sur 25 . on a : Vmax / 2 = Vmax [S] / Km + [S] D’où [S] = ( Km + [S] ) / 2 Km + [S] = 2 [S] 2 [S] . d’après l’équation de Michaëlis Menten .x = [S] Vm Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie Vi Quand Vi = Vmax / 2. La mesure de Vmax permet donc indirectement de doser l’enzyme et donc de représenter l’activité enzymatique. nature du S. LES CONSTANTES CINÉTIQUES B. 2) Détermination graphique Nous avons vu que l’on pouvait déterminer Km et Vmax à partir de la courbe Vi en fonction de [S]. mais c’est une détermination imprécise. où . Vi = Vmax [S] / 1 / Vi = 1 / Vi = 1 / Vi = ( Km ( Km Km / Km / + [S] ) + [S] ) / Vmax [S] Vmax [S] + 1 / Vmax Vmax * 1 / [S] + 1 / Vmax On obtient une équation du type y = a x + b.[S] = Km [S] = Km Vm / 2 Km [S] B. 1) Définition du Km et de Vmax On a définit Km comme la constante de dissociation du complexe ES ( k2 + k3 ) / k1 = [S] [E] / [ES] = Km NB : k3 est négligeable devant k2.

1 / [S] Représentation de Lineweaver et Burk Page 8 sur 25 . LAURO 1 / Vi Km / Vmax 1 / Vmax .1 / Km Voir exercice N°5.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie Donc en traçant • • • la courbe 1 / Vi en fonction de 1 / [S]. on obtient une droite qui coupe l’axe des ordonnées en y = b = 1 / Vmax ( x = 0 ) qui coupe l’axe des abscisses en x = .1 / Km de pente Km / Vmax F.b / a = .

Représente la quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’1 mole de substrat par minute.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie IV. b ou Catc (kat. mole –1 d’enzyme.L-1) Le nombre de rotation (kcat) = le nombre de moles de P formé ou de S transformé par moles d’enzyme par seconde.min-1) x (Vréact / Venz) x 1/60 (UI. Page 9 sur 25 .mg-1) = Vmax (en moles.L-1. LAURO Le Katal n’est jamais utilisé car beaucoup trop grand.L-1. Pour cette concentration il faut tenir compte de la dilution du volume d’enzyme dans le milieu réactionnel.L-1 ) = Vmax (en moles.L-1 ) (en s) b ou Catc = Vmax (en moles. Zsp (en kat.min-1 ou UI. L’ACTIVITÉ EXPRESSIONS DE L’ACTIVITÉ ENZYMATIQUE L’activité enzymatique est une vitesse. 60 UI = 1 kat.L-1 : c’est la concentration qui transforme 1 mole de substrat par seconde dans des conditions définies.L-1) / [E]réact (en mg. Représente le nombre de moles de substrat transformé par mole d’enzyme (kcat x 60). g-1 d’enzyme C’est l’activité catalytique (z) d’une enzyme ramenée à la masse d’enzyme contenue dans le système . g-1) = Vmax (en moles. = nombre de kat . Ce paramètre permet de comparer la pureté d’une enzyme. L’activité enzymatique molaire ZM (AES ) ou activité molaire spécifique (AMS) = nombre de UI . Quand le substrat est saturant Vi = Vmax ce qui permet d’exprimet la concentration d’activité catalytique (b ou catc) en fonction de Vmax.L-1) Zsp (en U.min-1) x 1/60 (en s) / [E]réact (en g.min-1) x (Vréact / Venz) L’activité spécifique ( Zsp ou AS ) ou catabilité spécifique = nombre de UI . = nombre de moles de P formé ou de S transformé par min.L-1. = nombre de UI. La concentration d’activité catalytique ( b ou Catc ) = nombre de katal. Zsp = z / qmprotéine = b / ρprotéine Quand le substrat est saturant Vi = Vmax ce qui permet d’exprimer l’activité spécifique (Zsp ou AS) en fonction de Vmax. C’est aussi la concentration catalytique (b ou catc) rapportée à la concentration massique en enzyme (ρ).L-1. F.L-1 : c’est la concentration qui transforme 1 mole de substrat par minute dans des conditions définies C’est l’activité enzymatique ramenée à un volume de milieu réactionnel. On préfèrera des sous-unités comme les katals) ou les nkat (10-9 katals) ou les pkat (10-12 katals) kat (10-6 L’unité internationale UI ou UA ou unités d’activité (préférée par les biochimiste). elle peut s’exprimer de plusieurs manières : L’activité catalytique z en Katals ( kat ) ou catabilité = unité officielle = nombre de moles de P formé ou de S transformé par seconde. mg –1 d’enzyme (unité courante). Cette dernière valeur n’étant généralement pas connue on considère l’ensemble des protéines contenues dns le système. C’est l’activité enzymatique ramenée à une mole d’enzyme.

Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F. LAURO CALCULS DE RENDEMENTS LORS DE PURIFICATION D’ENZYMES Au cours d’une purification d’enzyme on mesurera donc régulièrement : Grâce L’activité totale z (en IU ou kat) La quantité totale de protéines q (mg) Le volume total v de solution (mL) à ces 3 valeurs on va pouvoir calculer : L’activité spécifique (Zsp) = z / q (en IU. MESURE DE L’ACTIVITE ENZYMAIQUE A PARTIR DE MESURES D’ABSORBANCE Les mesures d’activité se réduisent souvent à une mesure de variation d’absorbance en fonction du temps .mg-1) Le rendement R = z / z0 (activité totale / activité totale avant la 1ère étape de purification) Le taux de purification τ = Zsp/Zsp0 (activité spécifique / activité spécifique avant la 1ère étape de purification) L’activité spécifique et le taux de purification atteignent une valeur maximale lorsque l’enzyme est pure. on aura donc une formule du type : Page 10 sur 25 .mg-1 ou kat.

il n’y a pas d’action enzymatique. LAURO RÉ V. Page 11 sur 25 . TUBES Levures fraiches Levures chauffées Eau distillées Saccharose 2% Empois d’amidon 1% pH Test au lugol Test à la liqueur de Fehling A 2 mL 10 mL B 2 mL C 2 mL D 2 mL E F G 2 mL H 2 mL 10 mL 10 mL + + - 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL HCl - 10 mL NaOH - - - + - Le tableau de résultats montre que seul le saccharose est transformé en sucres réducteur par les levures.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie A. de couleur marron clair. INFLUENCE DES AGENTS PHYSIQUES SUR LA RÉACTION ENZYMATIQUE L’approche expérimentale proposée concerne une enzyme de levure qui agit sur un sucre non réducteur. Cette réaction a lieu à froid. Rappel : . Si un précipité rouge brique se forme. Ces levures sont des champignons microscopiques qui se développent dans un milieu sucré. Le test est alors positif. L’invertase des levures nécessite donc des conditions de pH particulières.La liqueur de Fehling de couleur bleue versée dans un tube à essais et l’ensemble est porté à ébullition. L’invertase est nommée aussi saccharase car elle agit sur le saccharose. Les enzymes étant de nature protéique. cela signifie que des sucres réducteurs sont présents dans le tube testé. Le tableau ci-dessous résume les conditions expérimentales utilisées pour étudier l’action de l’invertase contenue dans des levures de boulanger Saccharomyces cerevisiae. Le test est alors positif. A pH acide ou basique. Le signe + signifie que le test est positif et le signe – indique que le test est négatif. Enfin le chauffage empêche l’action enzymatique par dénaturation. le saccharose. la configuration tridimensionnelle de l’enzyme est perturbée par la haute température provoquant une perte de sa fonction biologique. Le lugol. Au bout de 20 minutes. C’est un diholoside constitué de l’association d’une molécule de glucose et d’une molécule de fructose. Ces champignons présentent donc une spécificité d’action sur ce substrat et n’agissent pas sur l’amidon. l’expérimentateur réalise alors les tests à la liqueur de Fehling et des tsts à l’eau iodo-iodurée ou lugol. MISE EN ÉVIDENCE EXPÉRIMENTALE (voir doc 3) A. La température est réglée à 37°C. devient bleu indigo (ou bleu nuit) en présence d’amidon. F. Chaque tube numéroté de A à H est placé au bain marie électrique pendant 20 minutes.

NB : On peut étudier la dénaturation thermique en faisant chauffer la solution enzymatique pendant un temps constant à différentes T° et on ramène ensuite la préparation à une T° optimale et on mesure l’activité résiduelle. On obtient une courbe biphasique : Vi Courbe de dénaturation L’augmentation de la T° provoque une augmentation d e la cinétique réactionnelle. De plus. il y a renforcement des liaisons hydrogène (ou liaison H) mais affaiblissement des interactions hydrophobes. liaisons ioniques.une T° d’inactivation De 0°C à 40°C environ. l’élévation de T°C tend à renforcer les liaisons hydrophobes ce qui rigidifie la molécule. l’augmentation de la T° provoque une augmentation de l’agitation moléculaire ce qui augmente la probabilité de rencontre des molécules réactives. Il en résulte une inactivation qui est réversible. la vitesse de la réaction augmente avec la température. c’est la dénaturation de la protéine qui perd sa configuration spatiale par destruction des liaisons faibles (liaisons H. On peut ensuite calculer un % d’inactivation à chaque T°. on mesure la Vi en ne faisant varier que la température. la vitesse de la réaction double chaque fois que la T° augmente de 10°C. Quand la T° est trop basse. Au-delà de 45°C environ (cette valeur varie selon les enzymes). enzymatique chute (c’est toujours le cas dans les réactions biocatalysées).Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie B. Cela s’explique par une augmentation de la concentration de complexe Enzyme – Substrat (ES) activé. Les limites d’action de la T° sont donc imposées par la nature protéique de l’enzyme. forces de Van der Walls). Cette dénaturation est irréversible.une T° optimale (Vi max sans dénaturation de l’E . Courbe d’activation T° optimale - Courbe de vitesse T° critique T° d’inactivation T° C Cette courbe est la résultante de deux phénomènes : . Page 12 sur 25 . les autres facteurs sont constants. X La courbe de vitesse est donc la résultante de la courbe d’activation et de la courbe de dénaturation : La T° optimale est la T° pour laquelle activation et dénaturation s’équilibrent.courbe 2 : action de la T° sur la Vi ( la Vi augmente de façon exponentielle ) On peut définir ainsi pour chaque enzyme : . La T° optimale est la T° pour laquelle la Vi est la plus grande Au-delà d’une certaine T° il y a dénaturation de la protéine ce qui ralentit puis arrête la réaction. LA TEMPÉRATURE B.une T° critique : dépend de l’E et du milieu . La réaction ralentit et s’arrête rapidement au-delà d’une certaine zone de température (55° environ). Les réactifs acquièrent un excès d’énergie d’activation Par contre au-delà d’une certaine valeur de T° la vitesse . LAURO Pour étudier l’influence de la température sur la réaction enzymatique. Cette règle n’est plus valable au-delà d’une certaine T°. Rem : Règle du Q10 Dans la 1ère partie de la courbe.courbe 1 : action de la T° sur la dénaturation de l’enzyme . F.

Si on trace Vi en fonction du pH. LAURO Comment la température peut agir sur les états d’équilibre et sur la cinétique réactionnelle : . .Le nombre de liaisons hydrogènes peut varier en fonction de la disponibilité en protons dans le milieu. l’estomac. Le lysozyme : .Des ponts disulfures (liaisons covalentes) (ex : la ribonucléase pancréatique). Page 13 sur 25 . Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie C. Vi est 100 fois plus faible.Le pH agit sur la vitesse de la réaction catalytique notamment lorsque son mécanisme est basé sur des échanges de protons avec le solvant (Cf. on obtient une courbe en cloche : La pepsine : .Ont leur maximum d’efficacité à pH neutre . Le pH C.Ce sont les conditions qui règnent dans la bouche et l’intestin.Des ions métalliques (ex : la thermolysine).Activité optimale pour un pH = 2 . Ribonucléase).Protéase gastrique . .Soit sur l’enzyme . on détermine la Vi de la réaction enzymatique à différents pH. organe dont l’acidité est très importante car il sécrète du HCl.Présente un maximum d’efficacité pour un pH 5 L’acétylcholinestérase : .Ne devient efficace qu’à partir de pH 6 et le reste jusqu’à pH 9.Le degré d’ionisation peut affecter aussi la conformation spatiale native de la protéine enzymatique.Peu surprenant étant donné son lieu d’action. A quel niveau agit le pH : .en altérant la stabilité du complexe ES . De manière générale les enzymes sont moins sensibles à la chaleur en présence de leur substrat car l’interaction Enzyme – Substrat stabilise la structure tridimensionnelle.Soit sur les 2.5. . . Pour la plupart des enzymes.F.Modification du degré d’ionisation de certains groupements fonctionnels dont la charge positive ou négative est indispensable à la formation et/ou la transformation du complexe Enzyme – Substrat. les autres facteurs étant constants. 1) Il existe un pH optimum pour chaque enzyme Les variations de pH ont un effet : . L’amylase salivaire et la trypsine : . Il est donc primordial d’utiliser un tampon pour annuler les variations de pH lors de la réaction. En effet la structure 3D de la molécule peut résulter (en partie) de liaisons ioniques. la courbe de vitesse de la réaction en fonction du pH présente une même allure en « cloche » sauf pour l’acétylcholinestérase. De part et d’autre de l’optimum (sommet de la cloche) la Vi décroit très rapidement : à 2 unités pH de part et d’autre de cet optimum. leur lieu de sécrétion.en ionisant certains sites de l’enzyme formant ainsi de nouvelles liaisons Certaines enzymes sont particulièrement résistantes à la chaleur car leur conformation est stabilisée par : .Soit sur le substrat . Pour étudier l’effet du pH. Ce changement de conformation peut concerner le site actif ou bien une autre partie de la molécule.

(GDH). On mesure l’activité de la GDH en étudiant la réaction dans le sens de formation de l’acide glutamique. LAURO Le complexe ARN – Rnase Importance du pH sur le degré de protonation des résidus His de l’ARNase et sur son activité enzymatique.4 mL de solution tampon pH = 8 0.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F. Pour cela. qui permet d’aboutir à la 1. 2. Ecrire substrats et produits sous forme chimique. Page 14 sur 25 .1 mL d’extrait enzymatique purifié 0. Ecrire l’équation de la réaction catalysée par la GDH sachant que l’acide glutamique est un diacide α-aminé possédant 5 atomes de carbone. Exercice n°6 On détermine l’activité de la glutamate déshydrogénase déshydrogénation de l’acide glutamique en présence de NAD+.2 mL d’une solution de substrat S1 (diacide α-cétonique à 5 carbones) a) Expliquer le rôle de la solution tampon La solution tampon maintient approximativement le même pH à 8 malgré l'addition de petites quantités d'acide (αCG) pour que l’enzyme puisse fonctionner à son pH optimum.2 mL d’une solution de sulfate d’ammonium 2.1 mL d’une solution de NAD réduit (quantité en excès) 0. on verse successivement : 0.

1510) (8.430 Tracer le graphe représentant l’absorbance en fonction du temps.5 8 8. l'absorbance maximale correspond à la vitesse initiale maximale de l'enzyme.5 11 11.1675) 1600 (5.760 1.5 10 10.595 1.1595) 1550 1500 1450 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1050 (6.F. Pour cela il faut que l’ensemble des réactifs soient portés avant la réaction à 37°C.5 1 1.800 1. H+. Page 15 sur 25 . donc une formation de NAD+ : la réaction va dans le sens de la réduction du substrat : αCG + NADH. En suivant l'absorbance à 340 nm. on pourra ainsi suivre l'évolution de la [NADH] c’est-à-dire l’évolution de la concentration en substrat en fonction du temps.une diminution d'absorbance indique la consommation de NADH. c) On mesure à 340 nm l’absorbance obtenue en fonction du temps dans une cuve spectrophotométrique dont le trajet optique est égal à 1 cm.5 4 4.5 d) Justifier la diminution de l’absorbance en fonction du temps.1718) (3. Ainsi.1550) (7.une augmentation d'absorbance indiquera une formation de NADH à partir de NAD+ : la réaction va dans le sens de l'oxydation du substrat : L-Glu + NAD+ αCG + NADH.5 0 0. H+ L-Glu + NAD+ La courbe A= f(t) correspond à la courbe Vi=f(t) (voir Équation de Michaelis-Menten).476 1. La forme réduite du NAD (NADH) possède un maximum d'absorption à 340 nm.5 3 3.675 1.5 9 9.718 1.450 1. On peut ainsi suivre la cinétique de la réaction enzymatique.635 1. Justifier le choix de cette longueur d’onde.5 6 6. Abs 340 nm 1950 1900 1850 1800 1750 1700 1650 (4.1760) (2. Il faut faire en sorte d’être à la température optimale de la GDH c’est-à-dire 37°C. On obtient les résultats suivants : Temps en min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A à 340 nm 1.1450) (10. LAURO b) Quelles précautions faut-il prendre quant à la température avant et pendant la réaction ? Justifier la réponse.510 1.1476) (9.5 5 5.5 7 7.1430) Temps (min) 1000 -1 -0. on pourra ainsi suivre l'évolution de la réaction enzymatique : . En suivant l'absorbance à 340 nm.5 2 2.1800) (1.550 1.1635) Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie (0. .

1 mL d’extrait enzymatique dans les 3mL de milieu réactionnel 19.76 / 1.296 kat kat.L-1.mg-1 Déterminer l’activité spécifique molaire de la GDH. sachant que sa masse molaire est égale à 560.106 mg Soit 123.106 mg.776 mol.mol–1.103 mol–1.min 1 mL b(UI/mL) Catc = b(UI/mL) = 19.min-1 -1 0.cm-1 à 340 nm. Si on continuait la réaction au-delà de 10 min.6 x 560.L. sachant que 5 mL de l’extrait purifié contiennent 8 mg de protéines.103 g.3.76/60 = 3.6 mg de protéine par mL d’extrait purifié : ρ(mg/mL) = 1. 6592 mol.53/6.10-6 kat.min-1 Coefficient directeur (pente) = 41.103).106 mg 1 mole Or on a 123.min-1 pour 3mL = 3 x 6592 / 1000 = 19.296 Catc = b(kat/mL) = 3.min-1 1. Déterminer la concentration de coenzyme transformé en mol.6 UI dans 1 mg On a donc 123.9216.6 UI.mg-1 de protéine.296.6 x 560.106 = 6592 mol.F.1 mL 19.776 mol.mL-1 d’enzyme Calculer l’activité spécifique en mUA.106 UI dans 560.776 mol.min-1 dans 3 mL de milieu réactionnel en période initiale.l = (41.mol-1 560.mL-1 d’extrait enzymatique 60 UI = 1 kat 197.l. la courbe montrerait un infléchissement de la vitesse de disparition du NADH avec une tangente à la courbe de plus en plus horizontale signifiant que la vitesse tend vers 0 : la réaction se termine car tout le substrat est consommé soit l’équilibre est atteint.000 mL ? 3 mL Z. LAURO e) Que représente la pente de la courbe ? Comment et pourquoi varie-t-elle ? Comment évoluerait-elle si l’on continuait la réaction au-delà de 10 min ? La courbe est une droite décroissante dont le coefficient directeur ∆A/∆t représente la vitesse constante de la réaction de disparition de NADH.6 mg Soit 1. Cela correspond à la vitesse initiale de la réaction de réduction de l’αCG en L-Glutamate par le NADH. puis la donner en katal par mL d’enzyme.76 UI = 197.6 mg.3. M = 560. L’AMS (activité molaire spécifique) = nombre d’UI par mole d’enzyme. 5 mL 8 mg 1 mL 8/5 = 1.1010 UI.106 UI pour 1 mole AMSGDH = 6.mL-1 = 3.mL-1 AS = Zsp (UI/mg) = b(UI/mL) / ρ(mg/mL) = 197. ∆C/min ∆C/min = ∆A/ε.min-1 Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie En déduire l’activité enzymatique en milliunités d’activité (mUA) par mL d’extrait enzymatique.L-1.mole-1 Page 16 sur 25 . 0.53 ∆A/min ∆A/min = ε.76 UI. f) Calcul de l’activité enzymatique : sachant que le coefficient d’absorption molaire ε de NAD réduit est égal à 6.6 = 123.min-1 Déterminer la quantité de coenzyme transformé en mol.776 x 10 = 197.

En enzymologie.KI représente la concentration en inhibiteur pour laquelle la moitié des sites enzymatiques sont occupés. l'affinité d'un inhibiteur est d'autant plus grande que le KI est petit. L'affinité d'un inhibiteur pour une enzyme est donnée par la constante d'inhibition KI. On distingue généralement : . On obtient comme tracé : Page 17 sur 25 . et notamment dans la régulation des voies métaboliques. Cette constante d'inhibition. Des applications existent dans de nombreux autres domaines : beaucoup de médicaments. non compétitives.les inhibiteurs réversibles. En se liant sur une enzyme. ou provoquer une déformation de l'enzyme qui rend celle-ci inactive (inhibiteur allostérique). RÉ LES EFFECTEURS DE LA RÉACTION ENZYMATIQUE F. : . Les effecteurs sont répartis en deux groupes : Les activateurs : qui augmentent l’activité enzymatique Les inhibiteurs : qui diminuent l’activité enzymatique A. qui se lient à l'enzyme par des liaisons de faible énergie (cas des inhibitions compétitives. qui se fixent de manière covalente (cas de l’inhibition suicide). Donc pour atteindre Vmax il faut augmenter la quantité de substrat dans le milieu. . LAURO Un effecteur est une substance chimique qui modifie l’activité enzymatique. exprimée en mole par litre correspond aussi à la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur. 1) Résultats expérimentaux Voir exercice N°7. un inhibiteur peut empêcher la fixation du substrat sur le site actif.Vmax est inchangée : V’max = Vmax . mixtes et par excès de substrat ou de produit). Défintion : Un inhibiteur est une substance qui diminue la vitesse d'une réaction catalysée par une enzyme. 2) Inhibition compétitive La représentation de Michaëlis-Menten montre qu’en présence d’inhibiteur compétitif : . LES INHIBITEURS A. pesticides ou insecticides sont des inhibiteurs enzymatiques. les inhibiteurs sont très utilisés pour déterminer le mécanisme d'action d'une enzyme.Km (constante d’affinité) augmente : K’m > Km La présence de cet inhibiteur rend l’enzyme moins affine pour son substrat.Ainsi.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie VI.les inhibiteurs irréversibles. . incompétitives. L'inhibition des enzymes joue un rôle important dans le contrôle des mécanismes biologiques.

Les quatre courbes ont la même asymptote à vmax = 5 kat En double-réciproque (représentation de Lineweaver-Burk). 2. LAURO Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM . 4. 6 et 9 mM . 8 mM .[I] = 0. alors que la pente augmente.Et donc des KM apparents = 3.La droite « tourne » dans le sens trigonométrique autour d’un axe constitué par le point 1/Vmax . 4.5.mais -1/KM est de plus en plus petit (flèches colorées).Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F. Page 18 sur 25 .1/vmax est donc le même . on obtient des droites de pentes différentes qui se croisent à 1/[S] = 0 : .

GS4071. La représentation de Michaëlis-Menten montre que la fixation de (I) : . C'est un médicament anticancéreux. KM est remplacé par: Km' = Km • (1 + [I]/KI) où KI = ki/k-i = [E]. 3) Inhibition non compétitive (I ) se combine à l’enzyme dans un site de fixation différent du site actif. sans être transformé. Sélectivité: plus efficace sur PDE5 que sur PDE6 (10x). PDE2. Le sildenafil citrate (Viagra®) est un analogue du cGMP et en conséquence un inhibiteur compétitif de la phosphodiesterase de type 5 spécifique du cGMP (PDE5). PDE6 est impliquée dans la vision des couleurs.ne modifie pas le Km de l’E pour son S : Km’ = Km . et PDE4 (>1000x). Le substrat ne peut alors pas se fixer : il y a compétition entre le (S) et l’(I). Il en résulte que [E]libre susceptible de se lier à (S) diminue. Un nombre croissant de médicaments sont des inhibiteurs compétitifs.[I] / [EI] : est la constante de dissociation entre l'inhibiteur et l’enzyme.F. PDE1 (>80x). L’inhibiteur (I) se fixe donc sur le site de fixation de l’enzyme. Le virus a besoin de cet enzyme pour se détacher de la cellule qui l'a produit. La connaissance précise de la structure tertiaire permet l'adaptation plus précise au site actif. Zanamivir (Relenza®). sur laquelle il se fixe 1000x mieux que le substrat naturel. Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie Or Km = [E] [S] / [ES] En présence d’(I) : . Quand [S] devient très grande. La même approche permet aussi de développer des inhibiteurs irréversibles. Le complexe (EI) est inactif. Le KM apparent augmente. sont des inhibiteurs compétitifs (KI < 1 nM) de la neuraminidase du virus de la grippe.par contre la vitesse diminue : Vmax’ < Vmax Page 19 sur 25 . donc il y a perte apparente d'affinité pour le substrat. Pas de compétition entre le (S) et l’(I). Exemples de médicaments: Le méthotrexate. (I) se lie de façon réversible à (E). et GS4104 (Tamiflu®) forme utilisable oralement de la substance active. Il augmente l'effet du signal transmis par le NO dans les corps caverneux du pénis et renforce l'érection.et donc Km apparent (Km’) augmente (il y a perte apparente d'affinité pour le substrat) Dans l'équation de Michaëlis-Menten. Leur développement est facilité par l'identification d'une enzyme cible. PDE3 dans la contraction cardiaque. est un inhibiteur compétitif de la dihydrofolate réductase. afin de diminuer le risque d'effets indésirable sur des enzymes apparentées. sa purification et sa cristallisation. un analogue structurel du tétrahydrofolate. PDE3. utilisé par inhalation. on peut dépasser l’inhibition et atteindre Vmax car quand [S] >>> [I] la probabilité de rencontre entre (E) et (S) est beaucoup plus forte que la probabilité de rencontre entre (E) et (I) et donc (E) se fixera beaucoup plus à (S) que l’(I). ce qui explique certains effets secondaires.[ES] diminue . LAURO Mécanisme d’action : Ces inhibiteurs sont toujours des analogues structuraux du substrat : mécanisme basé sur la ressemblance entre l’inhibiteur (I) et le substrat (S).

Page 20 sur 25 . 2.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F.33.(ESI) complexe ternaire inactif. 8 mM .[I] = 0.5. En double-réciproque (représentation de Lineweaver-Burk). Les molécules d’enzymes peuvent donc former 3 types de complexes : .Les quatre courbes ont le même KM à = 3 mM donc la présence de cet effecteur n’a aucune incidence sur l’affinité de (E) pour (S). L’inhibiteur n’empêche donc pas la formation du complexe (ES).(EI) complexe binaire inactif .Vmax = 5. on obtient une droite qui « tourne » dans le sens trigonométrique autour d’un axe constitué par le point -1/KM L’inhibiteur se fixe à l’enzyme mais sur un site différent du site actif. L’augmentation de [S] dans le milieu ne permettra pas d’atteindre la Vmax obtenue en absence d’inhibiteur. 2.(ES) complexe binaire actif .67 kat . 1. LAURO Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM : . 4. 3.

1 mM . 3. 8 mM.67 kat Page 21 sur 25 . Vmax diminue alors. C’est un mode de competition rare. 2. 1. Vmax est remplacé par: Vmax' = Vmax / (1 + [I]/KI) KI = [ES].[I] = 0.Km apparents = 3. 4) Inhibition incompétitive L’inhibiteur ne se fixe qu’une fois le complexe (ES) formé mais il se lie directement au complexe (ES) sans pouvoir se lier à l’enzyme libre (E). 2. Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM : .5.Vmax = 5. .33. L’inhibiteur agit en diminuant le “turn over” de l’enzyme mais pas le nombre de substrats liés à l’enzyme: c’est pour cela que la vitesse diminue en presence de l’inhibiteur alors que le Km reste inchangé.[I] / [EI]: est la constante de dissociation entre (I) et le complexe (ES) ou l’inverse de l’affinité de (E) pour (I). On peut donc considérer que le site inhibiteur constitue un site allostérique et que l’inhibition non compétitive est un phénomène allostérique. Les inhibiteurs non-compétitifs se comportent comme des effecteurs allostériques puisqu'ils agissent ailleurs (allo-) dans l’espace par rapport au site actif et ils affectent la conformation de l’enzyme dont l’activité diminue. 4. LAURO Dans l'équation de Michaëlis-Menten. 1.5. 2.[I] / [ESI] = [E].Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F.

on obtient des droites parallèles de pente constante Km / vmax F.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie En double-réciproque.Mais Km / Vmax reste inchangé.L'affinité apparente de l'enzyme pour le substrat augmente donc! Vmax' = Vmax / (1 + [I]/KIs ) Km' = Km / (1 + [I]/KIs ) 5) Inhibition par excès de substrat Il arrive que l’on observe in vitro une inhibition par excès de substrat : pour de fortes [S] la loi de Michaëlis-Menten n’est plus valable.Vmax et Km diminuent du même facteur (1 + [I]/KIs ) . produisant un complexe SES partiellement inactif. LAURO Dans ce cas : . Il y a une inactivation partielle et réversible de l’enzyme : une 2ème molécule de substrat se fixe à l’enzyme. . Page 22 sur 25 .

La modélisation montre qu’il s’agit d’un cas d’inhibition compétitive par le produit P. Intérêt biologique : Les réactions enzymatiques cellulaires font souvent partie de voies métaboliques.Dans les conditions normales l’enzyme possède un site de positionnement (niche anionique) sur lequel se fixe l’azote de l’Ach et un site catalitique estérasique (cuvette cationique) sur lequel se fixe l’O du groupement carbonyle de la même molécule d’Ach.Enzyme qui détruit l’Ach. Les cellules sont donc de véritables « usines » très efficaces mais très économes également car elles ne gaspillent ni énergie ni matériaux. celui-ci sera reconnu par l’enzyme avec qui il peut former un complexe. contribuant ainsi à la rapidité de la transmission synaptique. 6) Inhibition par excès de produit Définition : Si dans le milieu réactionnel contenant enzyme et substrat. Ces voies nécessitent des métabolites que la cellule doit se procurer ou produire elle-même. Page 23 sur 25 . . la vitesse n’est plus maximale et elle décroît. Au-delà d’une certaine [S] notée « S » sur le graphe. Mécanisme de l’inhibition : . Cas fréquent en enzymologie.Enzyme présente dans la fente synaptique et qui empêche une action trop durable du NT. La représentation de Michaëlis-Menten de la Vi en fonction [S] présente l’allure suivante : Cinétique enzymatique de l’action de l’acétylcholinestérase sur l’acétylcholine.Lorsque l’Ach est en excès. elles utilisent le mécanisme de rétroinhibition : le flux de métabolites dans une voie s’arrête lorsque la 1ère enzyme de la voie est inhibée par le produit final de cette voie. Pour stopper la fabrication d’un produit si celui-ci est déjà abondant. les 2 sites sont occupés par 2 molécules de substrat différentes et l’enzyme n’est plus fonctionnelle. Ce produit agit en se fixant sur un site de rétroinhibition différent du site actif. NT de la synapse neuro-musculaire chez les vertébrés. on rajoute une quantité donnée de produit P. . LAURO Exemple : l’AcétylCholineEstérase (Achase) : . On observe alors un ralentissement de la réaction enzymatique.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie F.

polymérases. Les dossiers d'information pour médicaments ne sont pas toujours précis quant au mode d'action: des substances sont appelées "inhibiteurs spécifiques" sans préciser s'ils sont compétitifs ou irréversibles. Exemples concrets d'inhibiteurs irréversibles: Un nombre croissant de médicaments sont des inhibiteurs irréversibles. Pour des polymérases. afin de diminuer le risque d'effets indésirable sur des enzymes apparentées.L'enzyme reconnait l'inhibiteur comme son substrat et commence la modification de ce dernier. On les inactive à l'aide de DEPC.) ont besoin de Mg2+ et sont inactives en présence d'EDTA. La connaissance précise de la structure tertiaire permet l'adaptation plus précise au site actif. . Remarque: Beaucoup d'enzymes ont besoin d'un ion métallique comme cofacteur. il s'agit d'un substratsuicide. signaux d'inflammation. les inhibiteurs irréversibles ressemblent souvent au substrat. Sa liaison béta-lactame étant très labile elle est mise en position de réagir sur le site actif de l'enzyme par l'enzyme elle-même.Comme les inhibiteurs compétitifs.Intervient alors une étape au cours de laquelle l'inhibiteur modifié devient très réactif et se lie de façon très stable à l'enzyme (en général par liaison covalente). La même approche permet aussi de développer des inhibiteurs compétitifs. . Les inhibiteurs réversibles peuvent être rapidement perdus par dilution et l'enzyme retrouve alors son activité.Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie 7) Inhibition irréversible ou « inhibition suicide » F. qui est nécessaire pour inactiver le neurotransmetteur acétylcholine.Leur effet est de diminuer la quantité totale d'enzyme disponible. Exemples dangereux: Certains gaz de combat agissent en modifiant l'acétylcholinestérase. responsable de la perte des cheveux chez certains hommes. Leur développement est facilité par l'identification d'une enzyme cible. La pénicilline est un « inhibiteur suicide » de la transpeptidase des bactéries à peptidoglycane. qui entre dans la composition de tous les tampons de stockage d'ADN. Ainsi la lactate déshydrogénase (LDH) musculaire à besoin de Zn2+ et est inhibée par l'o-phénanthroline. on obtient un marqueur d'affinité. Ils rendent l'ADN inutilisable comme substrat pour la réaction suivante. ce qui leur permet de se fixer sur le site actif de l'enzyme Exemples de médicaments qui sont des inhibiteurs irréversibles : L'aspirine (= acétylsalicylate) modifie chimiquement la cyclo-oxygénase et empêche ainsi la synthèse de prostaglandines. Si on y ajoute un marqueur radioactif ou fluorescent. etc. en ajoutant un groupe réactif (parfois photoactivable). On peut inhiber ces enzymes en complexant le métal pour le rendre indisponible. Ainsi les inhibiteurs de la transcriptase réverse utilisés contre des virus (en particulier HIV) sont des analogues de substrat incorporés correctement dans l'ADN.L'enzyme contribue ainsi à sa propre inactivation irréversible d'où le nom d'inhibition « suicide ». Propecia® inhibe la testostérone 5-α-réductase et empêche la production de la dihydrotestostérone. LAURO Il y a formation d'un complexe stable avec l'enzyme visant à l'inactiver de façon permanente : . Page 24 sur 25 . Par contre les ribonucléases se passent de magnésium. L'Orlistat (Xenical®) est dérivé de la substance bactérienne lipstatine. . Complément sur les inhibiteurs irréversibles Conception d’inhibiteur irréversibles : On développe donc souvent un inhibiteur irréversible à partir de la structure d'un substrat ou inhibiteur compétitif connu. jusqu'à ce que l'organisme ait resynthétisé l'enzyme. Elle se fixe alors de façon thermodynamiquement très stable à l'enzyme au niveau de son site actif. L'effet des inhibiteurs irréversibles est plus durable. La plupart des enzymes agissant sur l'ADN (nucléases. leur effet sur la cinétique ressemble donc à l'inhibition non-compétitive pure (∆! ne pas confondre). Si l'inhibiteur doit d'abord être activé par l'enzyme-cible. Il inhibe la lipase pancréatique (C50 = 0. puisque l'activité enzymatique est perdue. . un inhibiteur peut agir de manière indirecte. Elle modifie de manière covalente l'enzyme des bactéries et les empêchant ainsi de construire leur paroi. sa purification et sa cristallisation.14 M) et empêche ainsi la résorption des graisses des aliments. les fragilise et les empêche de se diviser.

Enzyme qui catalyse en présence d’ATP. . Les activateurs sont des espèces qui augmentent l’activité enzymatique sans être eux-mêmes impliqués dans la réaction catalysée par l’enzyme.L’enzyme E1 fixe réversiblement le produit Z sur des sites différents du site catalytique appelés sites allostériques (-allo = ailleurs dans l’espace).Chapitre 2 – CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE – Enzymologie B. . À une concentration saturée et constante du substrat. tels que des groupements prosthétiques ou cofacteurs .Km reste constant : K’m = Km Ce sont des molécules ou des ions qui s’associent avec l’enzyme ou au complexe ES.peuvent être nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme. ions inorganiques). la phosphorylation du glucose en G6P. F.Il augmente la Vi de la réaction : Vi’ > Vi . Ces espèces : . ce sont des cations métalliques. . .L’ATP et le glucose sont les 2 substrats de l’hexokinase mais leurs sites de liaison sont distincts. Exemple de l’hexokinase : .Une enzyme allostérique a une courbe en forme de S. . . des concentrations croissantes de l’activateur augmentent la vitesse initiale de réaction. En général. LES ACTIVATEURS C. LES EFFECTEURS ALLOSTERIQUES B. une vitesse limitante est atteinte à des concentrations élevées d’activateur.peuvent augmenter l’activité spécifique d’une enzyme qui est déjà active (ex.Cette modification conformationnelle d l’enzyme augmente l’affinité de celle-ci pour l’ATP d’un facteur 50. LAURO Les enzymes allostériques sont des enzymes jouant un rôle fondamental dans la régulation des voies métaboliques chez tous les êtres vivants : . À l’exception des groupes prosthétiques ou co-facteurs.Enzyme dimérique définissant entre ses 2 domaines une cavité permettant la fixation des substrats. courbe sigmoïde.Une enzyme à cinétique michaélienne a une courbe en hyperbole . C. l’enzyme E1 qui catalyse la 1ère réaction A B est inhibée par le produit final Z (inhibition par rétrocontrôle négatif ou rétroinhibition) .La fixation du glucose à l’hexokinase provoque un rétrécissement de la cavité et l’enzyme passe de sa forme « ouverte » à « fermée ». Page 25 sur 25 . les activateurs ne sont pas généralement spécifiques et plusieurs espèces peuvent avoir le même effet d’activation sur une enzyme (ex : l’amylase est activé par une variété d’anions. Etude expérimentale : voir exercice N°8 Caractéristiques d’un activateur : .Ces enzymes sont dites allostériques et Z est un effecteur allostérique de E1 s’y fixant réversiblement par liaison non covalente.Ce couplage conformationnel est appelé allostérie et l’enzyme est dite allostérique La cinétique des enzymes allostériques n’obéit pas à l’équation de MichaëlisMenten : . incluant le Cl-).Dans la voie métabolique A B C D->…Z.

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