ANEXO 1 Conteo en cámara de Neubauer. Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• • • • Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. • La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará lo siguiente.

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Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

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cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:

Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son las que no se deben contar.

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Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.

Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.

Si 1ml del preinoculo ?

____________ X esporas

____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

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ANEXO 2 Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos. Enfriar con hielo. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Agitar y dejar en reposo 15 min. Leer a 540 nm.

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Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente de correlación de 0.991 a 0.999.

0.5ml muestra problema + 0.5 ml DNS

Ebullición de muestra 5min

Enfriar con hielo 0.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min

Leer Absorbancia λ= 540nm Figura 14. Método de DNS

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ANEXO 3 Método de Lowry Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de Albúmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200, 300 y 400 µg/mL. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee la absorbancia a 750 nm, si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm. Se prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL de solución salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a las demás muestras. Procedimiento: • Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrón de albúmina, las muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para conservar el orden de concentraciones para la curva. • • • • • Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado a 100°C por un tiempo de 10 minutos. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente. Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante, mezclar y dejar reposar por 10 minutos. Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20 segundos. Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.

Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica Absorbancia vs. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA); con esta se puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor 128

de absorbancia. La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de 0.991 a 0.999. Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco

0.5ml de NaOH 2N

Adicionar

Calentar 100ºC 10min.

Enfriar a Tem. Ambiente 0.5ml de solución l j t Mezclar y agitar

0.5ml de Reactivo

Reposar 10 min.

Mezclar en vórtex 20

Leer absorbancia

Graficar Absorbancia Vs. Figura 15. Método de Lowry 129

ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano de microorganismos, variando el pH de extracción del Higo y la concentración de nutrientes. Tabla 35. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de A. niger.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124,684607 3 41,5615357 2,06354694 0,12229449 2,86626545 Dentro de los grupos 725,069663 36 20,140824 Total 849,75427 39

Tabla 36. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento de A. niger.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255,85077 3 418,616924 12,9680654 3,344E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1420,34637 44 32,2805993 Total 2676,19714 47

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Tabla 37. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en el comportamiento del Trichoderma harzianum
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108,935449 3 36,3118164 4,02126552 0,01446703 2,86626545 Dentro de los grupos 325,078109 36 9,02994747 Total 434,013558 39

Tabla 38. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en el crecimiento del Trichoderma harzianum
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971,163585 3 323,721195 12,0302319 7,0164E-06 2,81646351 Dentro de los grupos 1183,99485 44 26,9089738 Total 2155,15843 47

Tabla 39. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0,40189872 3 0,13396624 Dentro de los grupos 18,7962027 32 0,58738133 Total 19,1981014 35

F

Probabilidad

Valor crítico para F

0,22807371 0,87615582 2,90111757

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Tabla 40. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 0,89247125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545 Dentro de los grupos 10,8085088 36 0,30023635 Total 11,70098 39

Tabla 41. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Rhodotorula.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0,17674497 3 0,05891499 Dentro de los grupos 12,7860256 32 0,3995633 Total 12,9627706 35
Valor crítico F Probabilidad para F 0,14744845 0,93056632 2,90111757

Tabla 42. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Rhodotorula.
ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 3,88085737 3 1,29361912 4,16272894 0,01248242 2,86626545 Dentro de los grupos 11,187442 36 0,31076228 Total 15,0682993 39

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ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variación del pH de extracción • Aspergillus niger a pH de extracción 2

BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.333

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Aspergillus niger a pH de extracción 7

BiomasapH7 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.3556933 • Aspergillus niger a pH de extracción 12

BiomasapH12 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2194934

134

Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.1340424 Trichoderma harzianum variación del pH de extracción • Trichoderma harzianum a pH de extracción 2

BiomasapH2 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.1203965

135

Trichoderma harzianum a pH de extracción 7

BiomsapH7 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.2273364 • Trichoderma harzianum a pH de extracción 12

BiomasapH12 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.6580878

136

Trichoderma harzianum medio de Control

BiomasaControl = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.97329 A. Niger variación de la concentración de azúcares reductores • Aspergillus niger a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.9509181 137

Aspergillus niger a concentración de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4580631 • Aspergillus niger a concentración de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4753353

138

Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.6402406 T. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores • Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.8190618

139

Trichoderma harzianum a concentración de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/11.412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.1414981 • Trichoderma harzianum a concentración de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/29.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.6289445

140

Trichoderma harzianum medio de Control

Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.4885395

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