Tecnologia do DNA Recombinante

BIOTECNOLOGIA – CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Prof. Esp. Roberto Venerando Fundação Educacional Miguel Mofarrej. – FIO robertovenerando@fio.edu.br

FIO – Faculdades Integradas de Ourinhos.

Tecnologia do DNA recombinante.

Engenharia Genética
VENERANDO,R .2009

INTRODUÇÃO
• Década de 70 ⇔ surgimento da Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante ou Biotecnologia Moderna.

• Engenharia Genética – Conjunto de técnicas que tornam possível a criação de novas combinações gênicas, inexistentes na natureza, mediante recombinação ou alteração de seqüências de DNA.

– Permite manipular diretamente os genes de determinados organismos com objetivos práticos. – Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes. – Consiste em isolar e transferir genes responsáveis pela produção de certas substâncias para outros seres vivos que não produziam estas substâncias. dando origem a uma molécula de DNA recombinante (rDNA).TECNOLOGIA DO DNAr • Caracteriza-se pela aplicação de técnicas para manipulação de ácidos nucléicos. mas não necessariamente de espécies diferentes. .

deverão sofrer passos adicionais de processamento pós-traducional na célula hospedeira. necessita que: – DNA recombinante seja duplicado. . – Produtos da tradução por vezes. ainda.TECNOLOGIA DO DNAr • No entanto. – DNA recombinante deve ser transcrito e traduzido.

– Produção de grandes quantidades de uma proteína específica. .TECNOLOGIA DO DNAr • Objetivos – Produção de grandes quantidades de um gene específico.

especifica de DNA pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). – Plantas transgênicas. . – Vetores de expressão (procariotos e eucariotos). – Seqüênciamento de DNA. – Amplificação de uma seq.TECNOLOGIA DO DNAr • Aplicação prática – Clonagem de fragmentos de DNA em plasmídios de bactérias. – Construção de bibliotecas genômicas e de cDNAs. – Animais transgênicos.

o vetor genético. apenas aquelas que tiverem efetivamente incorporado o rDNA. capaz de multiplicá-lo. que. – Um meio de introduzir o vetor numa célula viva. . dentre uma grande população de células. – Um elemento transportador de genes.TECNOLOGIA DO DNAr • Requer: – Um método para clivar e voltar a ligar in vitro diferentes moléculas de DNA originando moléculas de DNA recombinante. – Uma maneira de selecionar. possibilitará que o gene estrangeiro que transporta também o seja. ao ser multiplicado por uma célula hospedeira.

– Segundo ⇔ a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível (transformação). . – Terceiro ⇔ célula hospedeira com o DNA recombinante (transformante). – Quarto ⇔ divisão celular resultando em milhares de cópias do DNA recombinante (clonagem).TECNOLOGIA DO DNAr • Metodologia de obtenção de DNAr – Primeiro ⇔ fragmento do DNA de interesse (inserto) é obtido por enzima de restrição e ligado (DNA ligase) a uma outra molécula de DNA (vetor) para formar o DNA recombinante.

onde a II apresenta importância na Engenharia Genética. não são encontradas em eucariotos. Três tipos: tipo I.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Encontradas nas bactérias e são utilizadas como sistema de defesa contra vírus (cortam o DNA viral que penetrar no citoplasma). em lugares determinados (sítios). Reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos na molécula de DNA e cortam ambas as fitas da hélice. O sítio de reconhecimento é normalmente uma seqüência palindrômica (ARARA) – – – . II e III.

images.google.com. Fonte: http://www.br . • Coesiva: fora do eixo de simetria.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Tipos de clivagem • Cega ou Abrupta: no eixo de simetria.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição – Nomenclatura • Primeira letra ⇔ representa o gênero • Segunda e terceira letra ⇔ espécie. • Exemplo: EcoRI – Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI. • Algarismo romano (ou outra letra) ⇔ indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual ela foi isolada. .

google.br .images.com.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Enzimas de restrição ou endonucleases de restrição Fonte: http://www.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Depois da clivagem. Os fragmentos migram em função de seus pesos moleculares sendo que os menores migram mais rapidamente. – A família de fragmentos gerados por digestão com enzima de restrição é geralmente detectada pela separação destes fragmentos por eletroforese em gel de agarose.. ..

com.Fonte: http://www.google.images.br .

Isso permite a separação de moléculas de DNA de diferentes tamanhos !!! Fonte: http://www.br .com.google.images.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Moléculas de menor massa irão migrar mais rapidamente que moléculas de maior massa.

images.br .google.Cortes com várias enzimas: Fonte: http://www.com.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Em alguns casos não é possível utilizar enzimas de restrição. – síntese química do DNA. . banco genômico ou genoteca ⇔ arquivo de DNA de interesse inserido num vetor para uso posterior. – obtenção do DNA complementar (cDNA) ⇔ obtido pela ação da transcriptase reversa a partir de um mRNA. – biblioteca genômica. logo: – procede-se à fragmentação mecânica do DNA.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene Biblioteca de cDNA Biblioteca genômica Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006 .

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: obtenção do gene de interesse • Em alguns casos não é possível utilizar enzimas de restrição. logo: – Técnica de PCR (Reação da polimerase em cadeia) .

– Molécula de DNA que aceita introdução de DNA estrangeiro em regiões não essenciais para sua multiplicação dentro da célula hospedeira.TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Moléculas de DNA que transportarão o DNA heterólogo para o interior da célula hospedeira. .

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Características básicas necessárias • Ser uma pequena molécula de DNA. • Possuir um marcador que permita a seleção do hospedeiro transformado (Ex. cosmídios. • Exemplos: plasmídio. • Dois ou mais sítios únicos de clivagem para as enzimas de restrição – Múltiplos sítios de Clonagem (MSC) – local onde o inserto é incorporado ao vetor de clonagem. bacteriófagos. .: Antibiótico). • Possuir uma origem de replicação.

pt/lab.ipcb.esa.biologia/disciplinas/bcm/recombinante.pdf .TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos – Características básicas necessárias Fonte: docentes.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: vetores genéticos • Vetores genéticos Plasmídio Fago Cosmídio Fonte: www.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.pdf .ibb.unesp.

TECNOLOGIA DO DNAr Primeiro passo: ligação do gene no vetor Digestão do vetor e do DNA pela enzima de restrição Fragmentos de DNA. vetor e DNA ligase: DNAr Fonte: adaptado de www.unb.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecom binante2006 .

cerevesiae. células de mamíferos em cultura. Organismos utilizados: Hospedeiros procarióticos ⇔ E.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr Hospedeiros do DNA recombinante Características ideais: Capacidade de crescer em meios de cultura baratos. Hospedeiro eucariótico ⇔ S. B. subtilis. . Estáveis em cultura. Não patogênicos. coli.

br/aulas/producao%20proteinas%20recombinantes.org.ppt .labimuno.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: hospedeiros do DNAr Transformação Transformação Transfecção Microprojéteis Eletroporação Fonte: www.

a célula hospedeira pode ser transfectada para inserir a molécula recombinante. . Transfecção ⇔ quando o vetor de clonagem tem características de vírus ou plasmídio.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Transformação ⇔ a célula hospedeira é tornada competente (cloreto de cálcio e choque térmico) para o vetor de clonagem ser introduzido. normalmente empregada para procariotos. normalmente empregada para eucariotos.

ufv.htm .br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004. Fonte: http://www.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Microprojéteis ⇔ partículas cobertas com DNA são projetadas contra uma célula e penetram em sua membrana.

unb.TECNOLOGIA DO DNAr Segundo passo: inserção dos vetores recombinantes em uma célula hospedeira Eletroporação ⇔ a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006.ppt . Fonte: www.

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos Transformação Transformante Células transformantes Fonte: miguelcorreia25.com/fundamentosdeengenhariagenética2 .googlepages.

TECNOLOGIA DO DNAr Terceiro e quarto passos Seleção das células recombinantes Crescimento de bactérias em meio de cultura contendo antibiótico Fonte: www.unesp.ibb.pdf .br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_clonagem_genes_fragme ntos_DNA_de_interesse.

ufv. 2007. R. 3 ed. S. Sites: – http://miguelcorreia25.esa.ibb.. VOET.googlepages. G.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/9_cl onagem_genes_fragmentos_DNA_de_interesse.biologia/disciplinas/bcm/recombinante. Recombinação gênica.pdf – docentes.unb. Porto Alegre: Artmed.unesp. Biotecologia industrial.ipcb. 1: Fundamentos. 2001. Apontamentos de aula. Edgard Blucher: São Paulo.br/dbg/trab2002/TRANSG/TRG004. et al.htm . J. 2006.D.ppt – http://www. SOUZA.br/ib/cel/pg/tecnologiaDNArecombinante2006. VOET.Referências bibliográficas BORZANI.pt/lab. V.pdf – ww. Bioquímica. 1 ed. W.com/fundamentosdeengenhariag en%C3%A9tica2 – www.