PRACTICA #1 IDENTIFICACION DE BACTERIAS POR REACCIONES SEROLOGICAS

OBJETIVO DE LA PRACTICA Conocimiento teórico de las principales técnicas serológicas utilizadas en el diagnóstico microbiológico y desarrollo de una técnica de aglutinación en placa para obtener bases aplicativas. INTRODUCCION En los vertebrados reside la capacidad de los sistemas inmunitarios para distinguir entre células o sustancias de su propio organismo y las que tienen otro origen. Entre los extraños se incluyen células de otros organismos, virus, bacterias, toxinas, toxoides, vacunas, etc. Cuando estos materiales penetran en el organismo son reconocidos como sustancias extrañas. La Inmunología estudia principalmente el desarrollo de la resistencia del hospedador frente a enfermedades causadas por microorganismos, es decir, la inmunidad adquirida específica. Las células germinales de la médula ósea que participan en las respuestas inmunitarias, se diferencian en una de dos posibles poblaciones de linfocitos: 1.- Linfocitos B, o Células B. Reciben ese nombre, porque las células precursoras maduran en un pequeño órgano linfoide llamado Bolsa de Fabricio en las aves (en los mamíferos hay tejidos linfoides equivalentes, como las placas de Peyer del tracto digestivo) y se transforman en linfocitos B. Sólo el 20 % de los linfocitos circulantes son Células B; el resto de las células están en el tejido linfoide. Viven días o semanas. Las Células B son las responsables de la respuesta inmunitaria humoral, ya que al entrar en contacto con el antígeno, originan células plasmáticas productoras de anticuerpos. También pueden originar células con memoria, linfocitos de larga supervivencia que están en reposo después de haber sido estimulados por un antígeno; cuando se renueva el contacto con un antígeno igual, producen la llamada "respuesta secundaria" que es más rápida y vigorosa que la "respuesta primaria", porque hay una mayor y más rápida producción de anticuerpos. El resultado es que el individuo responda con mayor prontitud e intensidad a una segunda exposición al antígeno. 2.- Linfocitos T, o Células T, que también se originan a partir de precursores producidos en médula ósea por las células germinales. Se desarrollan en el Timo, de donde toman su nombre. Abandonan el timo y se concentran en bazo, ganglios linfáticos y también van a la sangre. Viven durante varios meses. Como consecuencia de la activación antigénica, los Linfocitos T dan lugar a las células Efectoras responsables de la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T participan en la muerte o eliminación de materiales extraños y microorganismos invasores, e incluso células cancerosas. Son las principales responsables del

capaces de responder a la segunda aparición del antígeno. amplían la capacidad diagnóstica del clínico y orientan la terapéutica.Prueba de AGLUTINACION: En las reacciones de aglutinación el antígeno es una célula o una partícula. la inmunidad celular también está reforzada por una segunda exposición a un antígeno. la Prueba de Weill-Felix para Rickettsias. La mayoría de estas pruebas se efectúan en tubo. . PRUEBAS SEROLOGICAS MAS COMUNES: . entonces disminuye el precipitado. Hay muchas técnicas disponibles. determinándose el título. con diluciones seriadas del suero conteniendo el anticuerpo (antisuero). etc. añadiendo una cantidad fija del antígeno (la célula o la bacteria). la reacción se manifiesta por la formación de un precipitado visible en la interfase de los reactivos. Las reacciones serológicas son específicas entre un antígeno y un anticuerpo y pueden ser usadas para el trabajo de diagnóstico. . El título es un valor relativo representado por el recíproco de la máxima dilución que provoca aglutinación.PRECIPITACION: Aquí se utiliza un antígeno soluble y un anticuerpo homólogo. Se encargan de movilizar a los macrófagos en la destrucción de patógenos y de estimular a las células B para intensificar la producción de anticuerpos (hay una "cooperación celular"). el precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo. el desconocido puede ser detectado con un alto grado de sensibilidad y exactitud. Pueden llevarse a cabo en portaobjetos o en tubos de ensayo. Ejemplo de esta técnica es la Prueba de Vidal para diagnóstico de Salmonella. Las pruebas serológicas de reacción antígeno-anticuerpo. la Serología permite el estudio de las reacciones antígeno-anticuerpo que se encuentran en el suero sanguíneo. En el laboratorio clínico. cuando las proporciones de ambos son óptimas. su título es 256. Por ello las pruebas de mayor utilidad son las que se realizan hasta alcanzar las proporciones óptimas. lo que es representado por una nueva y mayor población de células T con memoria. pero no a 1:512. Por ejemplo. A partir de aquí. Aunque más difícil de medir. Cuando uno de los componentes es conocido. la adición del anticuerpo homólogo provocará la aglutinación o la agregación. Después de la incubación se observa la formación de agregados. dando como resultado la formación de agregados visibles de células o partículas. Generalmente la cantidad del anticuerpo (antisuero) es constante y la del antígeno es variable. A medida que la cantidad del antígeno aumenta. si continúa incrementándose la cantidad del antígeno. si un antisuero aglutina a una dilución 1:256.rechazo de trasplantes y de reacciones alérgicas cutáneas.

como si estuvieran impregnando un disco. Las cargadas positivamente emigran hacia el cátodo. los antígenos se distribuyen en manchas separadas a lo largo de una línea. En el suero aparecen 2 o más arcos. adecuada para estudiar la naturaleza de las macromoleculas que se difunden. con una carga eléctrica neta. En este caso los anticuerpos se difunden en un frente lineal. mientras que las negativas van hacia el ánodo. emigran en solución o en el gel de agar. bajo la influencia de una corriente eléctrica. se le denomina electroforesis. Gel de agar cátodo o pozo con antígeno + ánodo zona de reacción ‫ں‬ o pozo con suero (Ac) . Es un proceso electroquímico en el que las partículas o macromoléculas coloidales suspendidas. se produce una reaccion de precipitacion. mientras que los antigenos se difunden circularmente. Las bandas de precipitación aparecen entre los dos pocillos correspondientes a antígeno y anticuerpo. Inmunoelectroforesis: Cuando se aplica la electroforesis al estudio de las reacciones antígeno anticuerpo. mismas que al difundir forman un anillo de precipitación en la interfase. Cuando se suspende la corriente comienza la difusion de esas sustancias a partir de las manchas correspondientes.Difusión Simple: En un tubo pequeño se deposita la solución del antígeno sobre una solución del antisuero. Doble difusión: En el método de Ouchterlony los reactivos difunden desde pocillos excavados en una placa de agar. Si se depositan los anticuerpos en una zona rectangular excavada en paralelo a la linea de distribucion de los antigenos. dando zonas de precipitación en forma de arco. Cuando se deposita una solución que contiene antígenos proteicos en un pocillo excavado dentro de una lámina de agar y se aplica la corriente eléctrica.

El complemento se agota durante la reacción antígeno-anticuerpo (pero no hay cambios visibles). 3. Se deduce que si se agotó previamente el complemento.) Incubación 6. 4.) El complemento no se gastó (no se utilizó)..) Antígeno + Suero que no contiene el anticuerpo homólogo + Complemento. I) Reacción positiva: 1. 4. se adiciona al sistema un suero conteniendo anti- . en presencia del complemento. Antígeno + Suero conteniendo el Anticuerpo homólogo + Complemento.FIJACION DEL COMPLEMENTO: Esta prueba es útil en aquéllos casos en que la interacción antígeno-anticuerpo no se traduce en un efecto observable. 2. II) Reacción negativa: 1. En el segundo paso. Adición de eritrocitos de carnero + Hemolisina anti-eritrocitos de carnero (anticuerpo hemolítico). Incubación. en concentración desconocida + antígeno marcado (radiactivo) en concentración conocida. son capaces de provocar la lisis de células específicas. Esto es debido a que el complemento no fué utilizado al no ocurrir la reacción Ag-Ac previamente.) Hemólisis de eritrocitos de carnero.) Adición de eritrocitos de carnero + hemolisina-antieritrocitos de carnero 5. Se incuba varias horas. como precipitación o aglutinación. fue porque se utilizó en la primera reacción Ag-Ac. No hay hemólisis.RADIOINMUNOENSAYO (RIA): Es una microtécnica de gran sensibilidad para la determinación de cantidades pequeñas de antígeno: 1. Esta competencia se establece al adicionar una cantidad limitada de anticuepo específico para el antígeno marcado. Competencia entre el antígeno no marcado (no radiactivo) a ensayar.) Incubación 3. Estos anticuerpos. porque no queda complemento disponible para que ocurra la reacción antígeno-anticuerpo (eritrocitos de carnero con el anticuerpo homólogo: hemolisina antieritrocitos). . 3. La finalidad de esta prueba es detectar anticuerpos específicos en suero en forma indirecta. Primer paso. 2. Incubación. Se basa en la presencia de anticuerpos fijadores de complemento en el suero. 2. por lo tanto siguió quedando disponible para que ocurriera la segunda reacción Ag-Ac (eritrocitos de carnero con la hemolisina antieritrocitos). porque no hubo reacción antígenoanticuerpo.

Se añde el antisuero a probar y se incuba. En este caso la radiactividadad en el precipitado sería muy baja. Además de ser tan sencillo como el RIA. etc. Si los anticuerpos que contiene el antisuero son homólogos. el anticuerpo quedará libre para reaccionar con el antígeno indicador radiactivo. . . Sin embargo. Por ejemplo los isocianatos de fluoresceina y de rodamina. A continuación se aplica un segundo anticuerpo (antisuero-humano) marcado con fluoresceína. parásitos y virus tales como herpes 2.anticuerpo específico. Esta técnica es importante para detectar el antígeno del virus de la Hepatitis B. Si el antígeno que se ensaya en el primer paso ha reaccionado con el anticuerpo. Es muy sensible y se pueden detectar antígenos y anticuerpos a niveles de 10 a la menos 10 gr. Es aplicable en la determinación de muchos hongos. si el antígeno que se ensaya no reacciona con el anticuerpo. el antígeno radiactivo indicador no podría reaccionar con el anticuerpo. Método directo: Se mezclan en un portaobjetos microorganismos con suero conteniendo anticuerpos fluorescentes y se observan al microscopio de fluorescencia. Los anticuerpos pueden conjugarse con estas moléculas. Después se añaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana marcados con enzima. quedarán fijados al antígeno. mayor rapidez y seguridad y tiene la misma confiabilidad.ENSAYO INMUNOENZIMATICO (ELISA): Esta técnica de inmunoabsorción de enzima-ligada (enzyme-linked-immunosorbent assay) se utiliza para el diagnóstico serológico de infecciones vírales y para la detección de otros antígenos microbianos. en suero del donante de sangre. que se puede apreciar por observación o medir en el colorímetro. es de menor costo. Método indirecto: En primer lugar el anticuerpo no-fluorescente es enlazado a su antígeno. o de una parte por 10 a la 4 millones. que se fijarán a los complejos antígeno-anticuerpo formados en el primer paso. Las observaciones se llevan a cabo en un microscopio de campo oscuro con luz ultravioleta. Finalmente se añade el sustrato de la enzima cuya degradación determina un cambio de color proporcional a la concentración de anticuerpo presente en la muestra ensayada. .ANTICUERPOS FLUORESCENTES: Se basa en la capacidad de ciertos colorantes de presentar fluorescencia cuando se exponen a la luz ultravioleta. Procedimiento en microplaca: El antígeno se fija por adsorción pasiva a pocillos de poliestireno. y por lo tanto. rubeola. constituyendo anticuerpos marcados. Esto conduce a la precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo. capaz de fijarse al anticuerpo integrante de los complejos inmunitarios formados durante el primer paso. solo se observan los microorganismos (antígenos) que reaccionan con los anticuerpos marcados. Con ello la radiactividad del precipitado será elevada.

MATERIALES Y METODOS I. . OX-2 y OXK). cuidando que el en el visel de la aguja.suis o B. Se introduce el tubo para recolección de muestra. Son reacciones de aglutinación entre los antígenos de Salmonella. abortus) Tífico O (somático) Paratífico A (flagelar) Sueros control comerciales : control negativo control positivo 1. el orificio quede hacia arriba. 2. Deje secar antes de sangrar.paratyphi B. . REACCION DE AGLUTINACION EN PLACA: Prueba de Reacciones febriles: Esta prueba representa un método de laboratorio útil para seguir la secuencia de ciertas infecciones con acceso febril. Introduzca la aguja del vacutainer la muestra sanguínea: 4. 5. Se limpia toda la zona con una torunda impregnada con alcohol. Deje coagular la sangre y centrifugue.Reacción de Widal para diagnóstico de la fiebre tifoidea. Antígenos comerciales: Brucella (B. 3. aproximadamente a 6 cm por encima de la vena. Elija un brazos del paciente para localizar una vena adecuada. 6. 7. en el soporte del vacutainer y automáticamente se obtendrán 3 ml.Reacción de Weil-Felix para el tifo. La técnica comprende: 1. Paratífico B (flagelar) Tífico H (flagelar) Proteus OX-19 . La reacción mide el título de anticuerpos (aglutininas) en el suero contra una suspensión de antígenos conocidos de Salmonella typi . para evitar posibles reacciones alérgicas y que no arda. Brucella y Proteus y los anticuerpos contra estos antígenos presentes en el suero del paciente. S. En el brazo elegido se coloca una ligadura de hule látex. En esta prueba se utilizan antígenos de Proteus para diagnóstico de tifo. melitensis). B. Se revisan ambos paralelamente a la vena para no perforarla. 2. entérica y ondulante. causadas por bacterias. Saque la aguja de la vena y presione con la torunda hasta que no salga más sangre del paciente. tienen componentes antigénicos idénticos a Proteus (cepas OX-19.Reacción de Huddleson para la brucelosis (Brucella abortus. .paratyphi A y S. Las especies de Rickettsias que causan tifo.

005 0. etc.01 0.8. si el resultado de una titulación alta es a consecuencia de una enfermedad activa o de inmunoglobulina (IgG) de memoria. Anote el resultado de las pruebas febriles.02 de Suero control (+) 0.08 0. por ejemplo tífico “O” positivo 1:80. indicará una infección activa. Si por el contrario en la segunda muestra se encuentra un título menor que en la primera. Un título tífico somático (O) significativo es 1:80.02 suero control (-) ANTIGENO 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota AGLUTINACION TITULO 4+ 4+ 3+ 2+ 1+ 3+ No aglutina 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:80 Interpretación de los resultados: Se observa la aglutinación macroscópica y se valoran los resultados en la siguiente forma: (4+) 100% aglutinación (3+) 75 % " (2+) 50 % " (1+) 25 % " 0 Los enfermos de brucelosis aguda mostrarán un título de aglutininas 1:80 o mayor. Discuta los resultados. . indicando en las reacciones positivas. indica que el paciente está en recuperación y los anticuerpos detectados son de memoria.04 0. Un aumento cuádruple se considera importante. Si en la segunda muestra se encuentra un título más elevado que en la primera. pero mayor es importante.02 0. cómo se puede saber en base al título obtenido. Proteus negativo. Separe el suero con una pipeta pasteur y deposítelo en un tubo limpio. el menor título significativo es 1:80. Para las reacciones febriles se toman dos muestras con un intervalo de siete días. PRUEBA CUANTITATIVA # POZO 1 2 3 4 5 6 7 ml SUERO PROBLEMA 0. para las pruebas serológicas. Pueden persistir por meses o años. Para el tifo.

DISCUSION Y CONCLUSIONES .RESULTADOS.

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