3.

Prparation des chantillons pour l'extraction: Tous les essais qui suivent ont port sur du matriel sch l'air libre, l'abri de la lumire. Le matriel vgtal t ensuite finement broy laide dun moulin couteaux ou l'aide d'un broyeur bille afin de permettre une bonne extraction. Les poudres des chantillons prpars sont ensuite, conserves dans des flacons l'abri de la lumire jusqu' utilisation. La conservation ce fait dans des flacons hermtiques au rfrigrateur. Toutes ces oprations permettent de pallier la dgradation de certains constituants et contribuent l'inhibition de toutes activits enzymatiques de leur dnaturation (Benamar, 2008). 5. Extraction : Le solvant dextraction utilis est le Mthanol. La mthode dextraction consiste porter lchantillon (10 % de poudre broye) bullition sous reflux en utilisant le Mthanol pendant 30 min avec trois extractions successives. Cette technique permet dextraire les composs chimiques les plus polaires prsents dans la plante tudie. Les trois extraits obtenus sont filtrs laide du filtre de papier pliss, runi, et poss lextrait de chaque chantillon dans des fioles. Les extraits sont ensuite concentrs et schs laide dun Rota vapeur (fig.15) afin dliminer toute trace de Mthanol, pour obtenir un poudre vgtale sche.

Figure 15: Rota vapeur utilis pour le schage des chantillon aprs l'extraction Poudre vgtale sche (10 % dans le mthanol)

Ebullition sous reflux, (3 fois 30 mn)

Runion des 3 extraits Filtration sur filtre de papier pliss

Extrait phnolique brute Rota vapeur

Jusqu' lobtention dune poudre Parfaitement sche (Conservation au rfrigrateur) Figure 16: Protocole dextraction des composes phnoliques

Figure 17:

a- Schma de dispositif de lextraction sous reflux. b- Dispositif de lextraction sous reflux.

6. Analyse statistique: Les rsultats sont exprims sous forme de moyenne erreur standard (Means standard errors (S.E.M.) calcule sur la moyenne de trois expriences pour chaque cas (le calcule est ralis l'aide du logiciel Microsoft Excel 2007). Les donnes exprimentales sont prsentes sous forme d'histogrammes pour les quantits des polyphnols totaux et sous forme de courbe pour l'talon (acide gallique). Le coefficient de corrlation R2 entre les DO et les concentrations des talons est calcul l'aide du logiciel Microsoft Excel 2007. 7. Dosage des polyphnols totaux: Principe: Les composs phnoliques sont oxyds par les acides phosphotungstique (H3PW12O40) et phosphomolybdique (H3PMo12O40) et ceux-ci sont rduits lors de l'oxydation des phnols, en un mlange d'oxydes bleus de tungstne et de molybdne (Ribereau, 1968). La coloration bleue dveloppe prsente un maximum dabsorbance 760 nm. Dosage: Lanalyse quantitative des polyphnols totaux est ralise par le dosage spectrophotomtrique selon la mthode de Folin Ciocalteu (Singleton et al., 1999; Heilerova et al., 2003). Dans des tubes essai, on additionne 100 l dextrait aqueux (dissous dans le MOH, une concentration de 2 mg/ml) 500 l de Folin Ciocalteu

(Merck) (1/10 dissout dans leau distille), on agite et on laisse lobscurit pendant 5 min temprature ambiante, ensuite on ajoute 1,5 ml dune solution de Na2CO3 sature lensemble (2 %, dissout dans lH20), on agite encore et on laisse lobscurit pendant une heure temprature ambiante, la couleur jaune du ractif vire au bleu. Les densits optiques sont lues au spectrophotomtre (PRIM SECOMAM) (fig. 18) 765 nm en utilisant des cuves en plastiques jetables (LP ITALIANA SPA, Italy, volume 2 ml).

Figure 18: Spectrophotomtre utilis pour la lecture d'absorbance La coloration produite, dont l'absorption maximum 765 nm, est proportionnelle la quantit de polyphnols prsents dans les extraits vgtaux (Ghazi et Sahraoui, 2005). Cette technique double faisceaux nous a aid liminer l'absorbance du blanc et donner directement la densit optique de l'chantillon. Pour s'assurer que les rsultats sont fiables, les dosages ont t raliss en triplicata, aprs on a calcul la moyenne des densits optique mesures. La quantification des polyphnols a t faite au moyen dune courbe dtalonnage ralise laide de diffrentes concentrations dacide gallique (Fluka) (4,76 - 9,52 - 14,2 -19 et 23,8 g/ml, concentrations finales) partir dune solution mre dacide gallique de 1 mg/ml dissout dans leau distille. Cette courbe est ralise dans les mmes conditions opratoires que les chantillons. La courbe de tendance obtenue dans ce cas (Excel 2003) est: y = 15.742x - 0.024 ( R2 = 0.993) Les rsultats sont exprims en mg dquivalent dacide gallique par g dextrait vapors. Ils reprsentent la moyenne de 3 rptitions. Le blanc est prpar en remplaant la quantit de lextrait aqueux par le mthanol dans les mmes conditions.

En annexes Expression des rsultats des polyphnols totaux:

D'aprs la courbe d'talonnage on l'quation suivante: y = 15.742x - 0.024 (Non infect) > x = (0.43 + 0.024) / 15.742 = 0.028 mg/ml On multiple cette valeur par 21 qui correspond au facteur de dilution de notre chantillon ( = 100 L (volume dpos de l'chantillon) /2100 L (volume ractionnel) = 1/21). Donc x = x X 21 = 0.028 X 21 = 0.59 mg/mL La solution mre est 2 mg/mL On a 0.59 mg/mL > 2 10-3 g/mL x > 1 g x = 0.59 103 / 2 = 295 mg x = (y + 0.024) / 15.742 avec y = DO = 1.06 (Infect) = (1.06 + 0.024) / 15.742 = 0.068 mg/mL x = 1.428 mg/mL x = 714 mg > x = (y + 0.024) / 15.742 avec y = DO = 0.43