DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS BSICAS

GUA DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

SEGUNDO AO
SEGUNDO SEMESTRE ACADMICO

2011 - II LIMA - PER

Introduccin
El Manual de Prcticas de Microbiologa tiene como objetivo orientar a los alumnos a un mejor conocimiento y aplicacin de los procedimientos de identificacin y aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiologa es una disciplina que estudia la biologa de los microorganismos capaces de producir enfermedad. Desde que se describiera por primera vez la morfologa de las bacterias (Leeuwenhoek .Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnstico de distintos microorganismos sobre todo en las dos ltimas dcadas del Siglo pasado en la que se inicia la denominada poca dorada de la bacteriologa esta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos as como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de informacin cientfica relacionada con la microbiologa clnica y la infectologa. Los avances tecnolgicos con aumento de la automatizacin, el desarrollo de la biologa molecular, la qumica de los cidos nucleicos, los avances en inmunologa clnica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisin continua de los textos de microbiologa. Tenemos el convencimiento que sta orientacin acadmica proporcionar a los alumnos de la Asignatura de Microbiologa los recursos para preveer el inicio del padecimiento , as como la base para la orientacin teraputica y la prevencin de las enfermedades infecciosas. Se da una relacin concisa de los mtodos de laboratorio empleados en el estudio de las bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo sern expuestos conceptos y ejercicios fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acorde con la actualizada tecnologa. Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodolgicamente a fin de facilitar la aplicacin de los conceptos bsicos y as llegar al diagnstico de los diferentes procesos infecciosos en humanos. El objetivo de estas prcticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las tcnicas ms comnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiologa y permitir la observacin experimental de los conceptos aprendidos durante las clases tericas. Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prcticas , no es una compilacin amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos bsicos y orientacin, adecuando los recursos y procedimientos que contribuirn a cimentar la formacin integral del mdico humano. Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnstico en el proceso enseanza aprendizaje.

Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difcil, debido al tamao que presentan, siendo ste entre 1 y 6 micras. Para su observacin se requiere el empleo del microscopio de luz , el cual , no proporciona el suficiente poder de resolucin que permite observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del microscopio electrnico. Para la observacin y estudio de las bacterias se utilizan diversos mtodos. El ms simple de ellos consiste en la observacin en fresco, de esta manera se visualizan caractersticas someras que proporcionan una idea del tamao, forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase. Otra tecnologa que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los mtodos tintoriales , que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos colorantes. Entre las tcnicas de mayor utilidad destaca la tincin de Gram, la cual permite clasificar a las bacterias segn su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas. Existen grupos bacterianos que para su observacin requieren otras tcnicas como la de Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias cido-alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante tcnicas de coloracin especial como por ejemplo, para observar cpsula, esporas, flagelos . Para realizar el diagnstico de hongos y virus existen tcnicas particulares, las mismas que sern descritas en los captulos correspondientes.

Normas de Bioseguridad
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Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las tcnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de Microbiologa donde se trabaja con materiales susceptibles de contaminacin accidental, se recomienda la adopcin rigurosa de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de infeccin de las personas que en l trabajan. Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiologa se consideran cuatro niveles de seguridad biolgica, segn los microorganismos con los que se trabaja : Nivel 1 : Microorganismos no patgenos y patgenos oportunistas Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de seguridad , nunca en las mesas. Nivel 4 : Microorganismos de altsimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de experimentacin y no en laboratorios de microbiologa clnica . Se requiere este nivel cuando se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus, tambin con algunas bacterias y hongos. De toda forma durante las prcticas se recomienda seguir las siguientes recomendaciones : 1. No ser permitido ingresar a la Sala de Prcticas sin el respectivo mandil. Como medida de precaucin no dejar sobre las mesas de trabajo prendas de vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio. 2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo . Los profesores de cada grupo les indicarn la metodologa a seguir. 3. Est prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prcticas, as como llevarse los dedos , el lpiz o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos. 4.La evaluacin de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de Ciencias Bsicas se regir segn el Reglamento de Evaluacin de Estudiantes de Pregrado , Perodo Lectivo 2011. 5. Por razones de seguridad, ningn material de prcticas saldr de la sala de trabajo. En caso que se rompa algn material de vidrio con cultivo bacteriano , avisar de inmediato al profesor para que disponga la inmediata desinfeccin y limpieza. 6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio programado deber ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones dadas por el profesor. 7. Todo material de trabajo como son: lminas portaobjetos, laminillas o pipetas, debern ser depositadas en los bocales de vidrio con solucin desinfectante, los que estarn a la vista en cada mesa. Si fuera material de desecho , como restos de algodn , papel, etc. , depositarlos en los recipientes para la basura, nunca en la

mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos, placas de Petri o frascos de cultivo se dejarn en canastillas o depsitos destinados para ser esterilizados. 8. Los profesores estarn en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda que se presente en el desarrollo de las prcticas. 9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prcticas, el que deber ser estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los ejercicios que se van a presentar.

Material y Equipo bsico en las prcticas de Microbiologa

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En el campo de la microbiologa mdica se requieren de conocimientos bsicos, indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos ; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e identificacin de los microorganismos (bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente esterilizados para asegurar que los ejercicios renan los requisitos exigidos para el trabajo microbiolgico. A continuacin se describen algunos de ellos: Asa y aguja de siembra : Muy usada en la prctica microbiolgica, hecha de alambre de platino o de otro material , se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeo anillo. Autoclave : Aparato para esterilizacin por vapor bajo presin , provisto de manmetro y una llave que regula la presin y la temperatura a la que desea esterilizar. Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona rea estril , para los trabajos microbiolgicos, en especial en cultivos , evitando la interferencia de los microorganismos de contaminacin ambiental. Centrfuga : Aparato diseado para acelerar la separacin de partculas slidas suspendidas en lquidos. Contador de colonias : Sirve para contar electrnicamente y de forma exacta las colonias de microorganismos. Crioviales : Pequeos tubos cnicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura (- 4C). Usados para guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero, cepas virales. Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a 37C. Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado lquido, los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la accin del calor en sus diferentes modalidades. Gradilla : Soporte para tubos de ensayo. Jarra de anaerobiosis : Instrumento til para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que permite un cierre hermtico no dejando ingresar oxgeno. Lmina portaobjetos : Lmina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos. Matraces y balones : Recipientes volumtricos de gran utilidad para la preparacin y almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios de cultivo , etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esfrica con fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.

 Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que ste se mezcla con aire antes de producir la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra. Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos .En su composicin se incluye un nmero balanceado de nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo con su consistencia pueden ser lquidos, semislidos y slidos. Se presentan en forma deshidratada. Microscopio : Instrumento ptico utilizado para la observacin de microorganismos que no son visibles a simple vista. Pipetas : Son tubos cilndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven para medir volumen conocido de lquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia de lquidos. Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de dimetro y de 20 a 30 cm de longitud. Se les emplea para la toma de pequeos inculos de siembra. Pipeteadores automticos : Pipetas que absorben de forma automtica sin necesidad de uno aspirar, pequeos volmenes (1l a 1 000 l ) de muestras. Placa de Petri : recipiente de vidrio o plstico que , en general se usa para contener medio de cultivo y proporciona una suficiente rea para el crecimiento bacteriano.

Autoclave

Cabina de Flujo laminar

PRCTICA N 1 OBTENCIN Y MANEJO DE MUESTRAS CLNICAS

OBJETIVOS Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad apropiadas. Conocer las tcnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clnicas para su ptimo procesamiento. Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clnicas. INTRODUCCIN En trminos de la efectividad del Laboratorio de Microbiologa , nada es ms importante que la apropiada seleccin , coleccin y transporte de las muestras clnicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y mtodos defectuosos usados en la recoleccin y manejo de las muestras. Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodologa de recoleccin muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clnicas : La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso. Cuando se va a proceder a tomar un espcimen clnico, es importante evitar la contaminacin con microorganismos saprofitos del rea. Esta flora normal puede interferir con la interpretacin del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiolgico de la enfermedad. Seleccionar el lugar anatmico correcto de donde se obtendr el espcimen y utilizar la tcnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtencin . Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios. Nunca refrigerar una muestra por anaerobios. Coleccionar un apropiado volumen de la muestra. Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos. Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de anlisis en la que debe figurar el nombre del paciente, nmero de identificacin personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y hora de coleccin, especificar regin anatmica, diagnstico clnico, duracin de la enfermedad, terapia antibitica , prueba requerida e iniciales del funcionario que tom la muestra. El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de instruccin sobre los procedimientos a realizar. Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibiticos o agentes antimicrobianos. Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un lquido cefalorraqudeo no revela patgenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibitico en las 24 horas anteriores. Colocar la muestra en un recipiente estril y adecuado para su transporte como cajas, gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante , con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espcimen y mantener medidas de bioseguridad apropiadas.

 Ordenar siempre un frotis para tincin o coloracin de Gram, para los especmenes que procedan de cavidades aspticas y anotar su inters en determinado microorganismo. CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA Hoja de solicitud de anlisis no llenada correctamente Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o con derrames Muestras secas o con contaminacin obvia Muestras sin preservacin adecuada Las muestras ms frecuentes en los estudios microbiolgicos son : ORINA : En las muestras de orina se pueden realizar diferentes anlisis como : examen microscpico de orina, urocultivo, determinacin de algunos residuos de medicamento (doping) e investigacin de microorganismos especiales como Leptospira. El xito de estos exmenes depender de la tcnica con que se tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el anlisis, ya que el proceso de descomposicin que se sucede en la orina por accin de las bacterias all presentes , modifica el parmetro de los componentes y muy especialmente altera la carga microbiana. Procedimiento Lavarse las manos Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con agua y jabn y de adelante hacia atrs, mientras que los hombres solo lo realizarn en el caso de solicitarse cultivos. Secarse con un apsito estril Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estriles, depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la maana a travs del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase). En mujeres la miccin debe ser separando los labios mayores de la vulva. En hombres se hace la retraccin del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente . Tapar el frasco con precaucin , evitando contaminar la muestra y/o derramarla. En casos de nios pequeos utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales. La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible refrigerarla no ms de 4 horas. HECES : Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriolgico, virolgico, bioqumico y para la bsqueda de parsitos. Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben colectarse antes de la administracin de cualquier antibitico.

Procedimiento Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo cuidado de no miccionar para que sta no se mezcle con orina. Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodn estril , el cual se desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introducindolo en el medio de transporte , de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de rotacin. El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de transporte (Cary Blair o Amies). El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura ambiente hasta su procesamiento o envo al laboratorio, no ms de 12 horas. No se debe refrigerar la muestra. HEMOCULTIVO : La sangre de los individuos sanos es estril. Una afluencia repentina de bacterias habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un perodo de tiempo corto de minutos a horas, excepto cuando existe una infeccin masiva o est presente un foco intravascular infectado. Bsicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema retculoendotelial para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El trmino FUNGEMIA se utilizar para designar la presencia de hogos en sangre. Siempre que exista una razn para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre o hemocultivo. Procedimiento Los hemocultivos se obtendrn antes de iniciar la terapia antibitica, el incumplimiento de este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida del paciente. Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extraccin, dificultando la interpretacin de los resultados. Adems algunos contaminantes actan como patgenos oportunistas , por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la extraccin. La toma debe realizarse por venopuncin y para ello se debe hacerse : Lavado de manos y utilizacin de guantes estriles Limpiar con jabn lquido o alcohol el lugar de la puncin Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar Desinfectar los tapones de los frascos Efectuar la extraccin No airear los frascos Nunca debe hacerse la extraccin a travs de catteres , salvo en aquellas circunstancias en que se indica especficamente. Cuando la extraccin se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de un slo uso.

MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :

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Ms del 70 % de procesos estn ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus, adenovirus(3,4,7,14,21), parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros enterovirus, virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I Entre el 10 y 20 % de la faringitis agudas en nios de 5 a 10 aos, estn ocasionados por Streptoccoccus pyogenes. Otras bacterias patgenas son : Streptococcus grupos C o G, Corynebacterium diphteriae, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae . Procedimiento Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de inflamacin. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior. No se requieren medidas especiales para su transporte y conservacin. La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se hace por un especialista en las condiciones adecuadas. Es recomendable realizar hemocultivos. MUESTRAS NASALES : Procedimiento La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en suero fisiolgico estril, unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa de la superficie nasal. CATTERES : El estudio bacteriolgico de los catteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente causal de una bacteriemia relacionada con el catter y prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia podemos decir que de una u otra forma el 82 % de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catteres. Vas de infeccin : a. Piel y catter : en los catteres perifricos y de corta duracin b. Endoluminal : en las vas centrales tunelizadas. Procedimiento Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes a la zona de entrada del catter Retirar el catter con la mxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estriles, cortar los 5 cm distales del catter que corresponde a la porcin intravascular. Introducir el segmento del catter en un recipiente estril correctamente identificado La muestra debe ser enviada al laboratorio en un perodo de tiempo menor de 30 minutos. Cuando no sea posible deber ser guardada en refrigeracin a 4 C LQUIDOS ESTRILES :

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El fundamento es la bsqueda de agentes patgenos u oportunistas, que pueden estar presentes en los lquidos o fluidos orgnicos . En este grupo incluimos lquidos producidos , ya sea de forma espontnea o bien provocada a nivel de las serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y son presumiblemente estriles. Su buen manejo presenta un triple inters por : La trascendencia de esta patologa por su elevada morbilidad o mortalidad Dificultad de diferenciar patgenos y oportunistas como consecuencia de cuidados teraputicos instaurados o prtesis aplicadas previamente. Posibilidad de contaminacin exgena, sea en la obtencin o en su manipulacin, siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y procesamiento. Muestras Lquido Lquido Lquido Lquido asctico o peritoneal articular o sinovial pericrdico pleural

Procedimiento La obtencin de estos lquidos es un procedimiento mdico La toma se realiza por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis, puncin pericrdica o puncin articular) Para el estudio bacteriano se requerir de 1 a 10 ml; para lquido de dilisis peritoneal se requerir de un volumen superior a 100 ml. Para evitar la coagulacin de algunos lquidos se utilizar heparina sin conservantes, ya que otros anticoagulantes podran tener accin antibacteriana. Los recipientes idneos son los viales de transporte para anaerobios Los frascos de hemocultivo tambin son tiles para cultivar lquidos biolgicos estriles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extrada en un frasco para anaerobios. LQUIDO CFALORRAQUIDEO (LCR) La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las leptomeninges y al lquido cefalorraqudeo . Se trata de una urgencia mdica y requiere un diagnstico y tratamiento precoz . Su morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se relaciona directamente con el retraso en el inicio de la teraputica. Los casos espordicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el retraso en el inicio de la teraputica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75 % de los casos en menores de 1 ao. Muestra La toma de la muestra la realiza el mdico tratante o el patlogo clnico del laboratorio. Se obtendr antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las condiciones lo permitan. LCR se obtiene por puncin lumbar Generalmente se obtendrn dos tubos, el primero se enviar para el estudio bioqumico, el segundo para el estudio microbiolgico con el mayor volumen

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posible. El tubo ms turbio se enviar a Microbiologa. Se debe solicitar simultneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir acompaadas de un proceso bacterimico El volumen mnimo para el estudio bacteriolgico rutinario es 1 ml, aunque es preferible disponer de volmenes superiores. Para hongos o micobacterias se necesitarn al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml. La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes etiolgicos como Streptococcus pneumoniae pueden lisarse rpidamente a partir de la primera hora de su recogida Si no fuera posible se mantendr en estufa entre 35 a 37C y una parte se incubar en frasco de hemocultivo, que se mantendr en idnticas condiciones. Si no se dispone de estufa se mantendr a temperatura ambiente. Nunca se refrigerar pues se afectar la viabilidad de Neisseria meningitidis y H. influenzae. Procesamiento del lquido cefalorraqudeo Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos. En caso de lquidos muy purulentos no ser necesario centrifugar. Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estril y conservarlo a 4C en frigorfico. Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37C, atmsfera de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37C atmsfera de CO2 ,caldo Tioglicolato o caldo Infusin Cerebro Corazn BHI a 35 - 37C por 72 horas. Se realizarn tres extensiones para tincin : tincin de Gram, Azul de metileno, Wright. EXTRACCIN DE SANGRE PERIFRICA : 1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitar para ejecutar la obtencin de la muestra. 2. Lavarse las manos previamente a la extraccin de la sangre y si es preciso colocarse guantes. 3. El paciente deber sentarse cmodamente de manera que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizar la extraccin se sangre. 4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeo cojn bajo el codo. Con la palma de la mano hacia arriba. 5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzndolo y a continuacin introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura aproximadamente dos dedos por encima de la flexin del codo. sta se deber ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar la vena , sin apretar tanto que reduzca el paso de la sangre por las arterias. 6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas.

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7. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducir la aguja. 8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de algodn embebido en alcohol yodado. 9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja. 10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el centro de la vena sin titubeos., de 1 a 1,5 cm aproximadamente. 11. Luego de extraer la sangre por puncin venosa, retirar la aguja de la jeringa y colocarla en un depsito de metal ( para autoclavar o incinerar); verter lentamente la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.

EVALUACIN 1. Por qu una muestra de lquido cefalorraqudeo no debe ser refrigerada , si no se enva de inmediato al laboratorio? 2. Cules son los agentes etiolgicos de la meningitis aguda en neonatos, nios y adultos? 3. En qu casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial?

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4. Cul es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un neonato, nio y en un adulto?, cules son los agentes etiolgicos ms frecuentes de una septicemia en cada caso? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS PRCTICA N 2 COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES

OBJETIVOS Explicar la coloracin Azul de metileno. Identificar la diferencia entre coloracin simple y coloracin diferencial INTRODUCCIN Debido al pequeo tamao de los microorganismos , se requiere de un microscopio ptico, ya sea de campo claro (lo ms usado) o de campo oscuro, para hacer la descripcin morfolgica de estos. La observacin de los frotis teidos es lo ms recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensin de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tien los microorganismos. Las coloraciones son tcnicas que permiten observar microorganismos en funcin de la capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la clula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos: Catinicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las clulas y las tien. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. Aninicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la clula, de modo que no tien las clulas sino el entorno. En este caso se habla de tincin negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. Liposolubles: se mezclan con los lpidos celulares y los tien. Ejemplo: Negro sudn. Los colorantes aumentan el contraste combinndose qumicamente con el protoplasma microbiano y permiten localizar estructuras especficas del microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamao, agrupacin y afinidad a

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ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar las siguientes formas esfricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos) , en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilndricas (bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos). De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son : Simples : Utilizan un solo colorante. Las clulas presentan una composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta frente a un colorante . El colorante tie las clulas como en el caso de : Azul de metileno, Safranina o no la tie : Nigrosina. Diferenciales : Los diferentes tipos de clulas presentan distinta composicin qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tincin, lo que permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, segn su capacidad de tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan ms de un colorante. Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin qumica de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpsculos metacromticos. Pueden utilizar uno o ms colorantes.

COLORACIN AZUL DE METILENO Es una coloracin simple que permite observar presencia o ausencia de microorganismos y distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos. Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensin por un minuto , luego del cual se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con la lente de mayor aumento. MATERIALES Guantes quirrgicos estriles Hisopos estriles Lminas portaobjetos Mechero de alcohol Jeringa de 10 cc Algodn y alcohol yodado Ligadura

METODOLOGA HISOPADO FARNGEO 1. El profesor, con la colaboracin de un alumno, ensear a tomar una muestra de

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exudado farngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentar cmodamente de frente al profesor , el rea debe tener buena iluminacin para que permita visualizar adecuadamente el sitio anatmico a examinar. 2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer que la faringe quede expuesta, con un hisopo estril frotar firmemente la pared posterior de la faringe y las amgdalas, particularmente en donde existan puntos blancos o reas que presenten signos de inflamacin o sangrado. 3. Cuando el paciente no tenga amgdalas, la muestra se obtendr del fondo de las fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaucin de no hacer contacto con ninguna otra rea de la boca. 4. A partir de la muestra tomada, se realizar el aislamiento por el mtodo de aislamiento en estra en placa, se utilizarn placas de agar sangre , agar chocolate y agar manitol salado. 5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensin para preparar un frotis, fijar la muestra y teir con una tincin simple (Azul de metileno) para observar : Morfologa de la bacteria Agregacin o tipo de distribucin bacteriana.

RESULTADOS Frotis de hisopado farngeo :

Hisopo

Lmina portaobjetos Aislamiento en estra

Coloracin simple : Azul de Metileno

Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto Lavar con agua corriente Dejar secar a temperatura ambiente

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1. Cubrir con Azul de metileno

2. Lavar con agua

Graficar lo observado al microscopio

EVALUACIN 1. Cules son las estructuras celulares o molculas que pueden ser observadas cuando se emplea la tincin simple?. Ejemplos de dos (2) colorantes que podran utilizarse para realizar una tincin simple. 2. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple ?

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

PRCTICA N 3 COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS COLORACIN DE GRAM OBJETIVOS Explicar el fundamento de la coloracin de Gram. Ejecutar la tcnica de coloracin ms usada en bacteriologa : coloracin de Gram. Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas. INTRODUCCIN Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos taxonmicos : Gram positivas y Gram negativas. En esta tcnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales : Las bacteria Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial Al aadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamao La penetracin est condicionada por la permeabilidad de la pared celular. Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composicin qumica de la pared de las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor

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cantidad de murena, cido tecoico, pocas protenas y algunas contienen polisacridos. Las bacterias Gram negativas poseen poca murena, una elevada cantidad de lpidos , protenas y polisacridos y no contienen cido tecoico. La murena en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violetayodo sea eliminado por el decolorante alcoholacetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto contenido de lpidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante. Al finalizar la coloracin las bacterias Gram positivas quedan teidas con el cristal violeta : morado y la bacterias Gram negativas quedan teidas con el colorante de contraste : safranina : rojo. MATERIALES Cultivos en medio lquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp. Asa bacteriolgica Equipos de coloracin para tincin de Gram Mechero, portaobjetos y puentes para tincin Microscopio METODOLOGA Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus sp Preparacin del frotis para la tincin Trabajar en un rea aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del mechero ( zona considerada estril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla enfriar por 30 segundos Con un lpiz graso identificar cada una de las lminas portaobjetos donde se van a realizar las preparaciones. Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propsito los dedos anular y meique , introducir el asa, tomar una pequea muestra de cultivo. Depositar el material en el centro de una lmina portaobjetos y extenderlo en un rea aproximadamente de 0,5 cm. Cuando se trata de cultivos de medio slido , colocar una gota de agua destilada sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparacin seque espontneamente al aire libre. Fijar la preparacin pasndola rpidamente sobre la llama del mechero , evitando un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice. Con un lpiz graso identificar cada una de las preparaciones. Para la realizacin de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones : Utilizar lminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben tocar con las yemas de los dedos . Debe ser delgado, translcido y homogneo para que, durante el proceso de tincin, reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias qumicas y se debe usar para la preparacin la tcnica asptica.

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 Utilizar un mnimo de cultivo cuando es un medio slido. Cuando se trabaja a partir de un medio lquido debe tomarse suficiente cantidad : una muestra con el asa de siembra. Tcnica de coloracin de Gram : Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente. Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente. Decolorar con la mezcla alcohol acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua corriente Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar. Colocar sobre la coloracin una gota de aceite de inmersin . Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.

1. Cubrir con cristal violeta (1 minuto)

2. Lavar con agua corriente

3. Cubrir con lugol (1 minuto)

4. Lavar con agua corriente

5. Decolorar con alcohol acetona (5 a 6 gotas)

6. Lavar con agua corriente

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7. Cubrir con safranina (30 segundos)

8. Lavar con agua corriente

Bacteria Gram positiva

Bacteria Gram negativa

RESULTADOS Graficar lo observado al microscopio

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EVALUACIN 1. Cules son las principales precauciones del manejo del microscopio y por qu se debe utilizar el aceite de inmersin al hacer el estudio microscpico de las bacterias ?

2. Cules son las fuentes de error ms frecuentes en la preparacin de un frotis? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS PRCTICA N 4 MEDIOS DE CULTIVO MTODOS DE SIEMBRA

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OBJETIVOS Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiolgico. Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y funcin. INTRODUCCIN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Debido a que la diversidad metablica de los microorganismos es muy amplia, la variedad de los medios de cultivo tambin lo es. La mayora de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar La preparacin de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente esterilizados en la autoclave. CONDICIONES GENERALES Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades necesarias. pH adecuado Condiciones osmticas adecuadas Estril y preservado de cualquier contaminacin. Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrndose el resto de los componentes. COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO Agua : destilada o desionizada Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. Azcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa. Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales, obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de malta. Peptonas : son protenas hidrolizadas , se obtienen por digestin qumica o enzimtica de protenas animales o vegetales. Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo, son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patgenos. Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al medio para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisdicos o bipotsicos. Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se aaden para detectar cambios de pH en el medio. Agentes reductores : sustancias que se aaden al medio para crear condiciones que

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permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. Ejemplo : cistena, tioglicolato. CLASIFICACIN Por su consistencia Medio de cultivo lquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado Medio de cultivo semislido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad, Indol y Ornitina (MIO) Medio de cultivo slido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado. Por su funcin o fines especiales Medios nutritivos (simples): con nutrientes mnimos para que las bacterias poco exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo. Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se aaden ciertos productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate. Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que por su composicin qumica favorecen o permiten la multiplicacin de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino. Medios selectivos: permiten el crecimiento slo de la especie que se desea aislar, para lo cual se les agrega colorantes bacteriostticos: Azul de metileno, Verde malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella (SS), agar Manitol salado. Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permite detectar las reacciones bioqumicas especficas de los microorganismos. Ejemplo: agar Triple azcar (TSI),agar rea, agar Citrato de Simmons. Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.

MATERIALES Caldo nutritivo : en matraz y tubos Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate, agar Triple azcar (TSI), agar rea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.

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METODOLOGA Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la prctica. Medios Simples:

Medios Enriquecidos:

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 Medios Selectivos:

Medios Selectivos:

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EVALUACIN 1. Qu medios de cultivo utilizara para cultivar una secrecin abdominal en la que se sospecha de bacterias anaerobias? 2. Qu medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de ? : Vibrio cholerae : Clostridium botulinum : Brucella spp : Campylobacter jejuni :

3. Qu precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

OBJETIVOS Conocer y realizar las diferentes tcnicas de siembra y aislamiento bacteriano. Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro. INTRODUCCIN En Microbiologa se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porcin de una poblacin de microorganismos (inculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de prctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre prximos a la llama del mechero que , debido a las corrientes de conveccin verticales que genera es capaz de crear un ambiente estril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el nmero de clulas bacterianas (inculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse tcnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilizacin de medios tanto simples como especiales , mayormente slidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo. Las tcnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas : Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones ptimas de temperatura y tiempo de incubacin , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, agua servida). La siembra puede ser : Por inoculacin Por estras simples Por dispersin o agotamiento Por puntura Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inculo, sta se utiliza cuando se tienen muestras lquidas ( orina, agua ) , se realiza haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilucin en placas de Petri con medios de cultivo.

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Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscpico : morfologa de las colonias, actividades bioqumicas o caractersticas inmunolgicas de los microorganismos aislados.

Tomado de Microbiologa Tomo II de Granados 2 edicin

Tcnica de siembra por diluciones sucesivas

MATERIALES Asa de siembra en aro y en punta Tubos de vidrio de 16 x150mm Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano : Staphylococcus aureus y Escherichia coli Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado Tubos con caldo y agar Nutritivo Suero fisiolgico estril Mechero de Bunsen METODOLOGA Manejo del asa bacteriolgica o de siembra :

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El profesor demostrar el manejo adecuado del asa y explicar las precauciones que se deben tener en la toma de la muestra : Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo lquido, ya que en este lugar se encuentra una mayor concentracin de microorganismos. Observar que al retirar el asa del tubo est cubierta por una pelcula lquida.
El asa de siembra se toma del mango como si fuera un lpiz

El tapn del tubo se toma con el dedo meique La boca del tubo se flamea despus de abrirlo y antes de cerrarlo

Mtodo de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto Con un lpiz graso marcar por detrs de la placa que contiene el agar , las lneas como est indicado en la figura N 1, por lo que quedarn tres sectores : el sector uno (1) el ms pequeo de los otros dos , servir para descargar el asa. Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio lquido , cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una serie de lneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno (1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano , hacer un movimiento rpido para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como lo indicar el profesor. Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1) quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inculo, trazar un zigzag un poco ms abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno (1) en las primeras lneas del zigzag , pero no en las ltimas.

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 Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estar a la izquierda y el sector tres (3) hacia la derecha. Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso puede repetirse sembrando un cuarto sector. Incubar las placas a 37 C durante 24 horas. Las placas ya sembradas debern colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.

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Figura N 1

Figura N 2

Mtodo de siembra en caldo de cultivo Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos. Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura N 1) . Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura N 2), coger la torunda, que est dentro de este con el dedo meique de la mano con que se est cogiendo el asa de siembra con la colonia Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de siembra. Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el caldo. Llevar a incubar a 37 C por 12 horas.

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Figura N1 Figura N2

Transcurrido el tiempo de incubacin, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo lquido y slido Medio lquido : la turbidez indica desarrollo Medio slido : presencia de colonias RESULTADOS Realizar la lectura, observar y graficar los resultados. Staphylococcus aureus

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

Escherichia coli

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Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

EVALUACIN 1. Qu mtodo de siembra usara en cada uno de los casos siguientes? Cultivo de heces : Cultivo de lquido cefalorraqudeo : Contaje de colonias en urocultivo :

2. Por qu el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? Qu sustancias se le pueden agregar par hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?

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3. Cul es la importancia de un cultivo puro? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

PRCTICA N5 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las principales fuentes de error. Conocer los principales mtodos de susceptibilidad a un antimicrobiano. Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibiticos de una bacteria de crecimiento rpido aislada en prcticas anteriores. El mtodo utilizado es el de difusin en agar o de Kirby-Bauer. INTRODUCCIN La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro para obtener la informacin que permitir decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto. Los antimicrobianos actan produciendo toxicidad selectiva , no actan directamente sobre el husped, sino que se combinan qumicamente con

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determinados sistemas de los microorganismos , enfocando as la accin sobre los microorganismos ms que sobre el husped. La determinacin de la mnima concentracin inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mnima necesaria del quimioterpico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clnico y detectar mutantes resistentes. Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le denomina : antibiograma. Accin de los antibiticos La actividad antimicrobiana in vitro determina: a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento. Inhibicin de sntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina. Alteracin de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina. Inhibicin de la sntesis proteica : Aminoglucsidos ( Kanamicina, Amikacina , Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrlidos ( Eritromicina ), Lincomicinas. Inhibicin de sntesis de cidos nucleicos : cido Nalidxico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina. Medicin de la actividad antimicrobiana Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de difusin. Prueba de dilucin En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos, se inoculan despus con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. Mtodo de difusin Preparacin del inculo La tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio lquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusin cerebro corazn) o preparar una suspensin directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente mtodo: a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solucin salina frotando en la pared del tubo. b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad ptica con un patrn de turbidez N 0,5 de Mac Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de cido sulfrico 0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 108 clulas/ml . Diluir si es necesario la suspensin o aadir ms inculo. c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estril en la suspensin, rotar la torunda estril varias veces. Presionando

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firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del lquido, para remover el exceso de inculo. d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando con una torunda en tres direcciones mediante rotacin de la placa, para asegurar una distribucin uniforme del inculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estril (o con un aplicador automtico) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo son la superficie del agar. Distribuir los discos uniformemente de modo que estn a una distancia de 15 mm del borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse ms de 6 discos en una placa. La dificultad de ste mtodo est en las diferentes velocidades de crecimiento para los diversos microorganismos. El uso de un disco para cada antibitico estandarizado , permite dar el informe de S (sensible), I (intermedio) y R (resistente) Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro : El pH del medio, ya que algunos antibiticos son ms activos a pH cido (Nitrofurantona), otros a pH alcalino (Aminoglucsidos , Sulfonamidas) Los componentes del medio, en este caso las protenas sricas fijan a las penicilinas desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina. Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos pierden su actividad. Cuanto ms grande sea el inculo bacteriano, ms baja ser la sensibilidad del microorganismo. Cuanto ms tiempo se prolonga la incubacin, mayor es la oportunidad de presentarse las mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rpido y activamente son ms sensibles a la accin de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de reposo. Dilucin en tubo Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos caractersticas importantes : Concentracin mnima inhibitoria (CMI) : es la concentracin mnima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. Concentracin mnima bactericida (CMB) : es la concentracin que mata a los microorganismos. Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infeccin, ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo. MATERIALES Caldo de cultivo con suspensin bacteriana a la escala de turbidez de N 0,5 de Mc Farland Placas de Petri con agar Mueller Hinton Torundas estriles Discos impregnados con diferentes antibiticos Pinzas estriles. METODOLOGA

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 Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller Hinton. Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibitico sobre la superficie del agar. Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos. Incubar a 37C durante 24 horas.

Realizar la lectura, observar y anotar los resultados. Lectura de los discos de sensibilidad El dimetro de la zona de inhibicin se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placas de Petri. El lmite del rea de inhibicin est dado por la inhibicin completa del desarrollo, tal como se puede apreciar a simple vista.Los milmetros de la lectura sern llevados a la tabla correspondiente para traducir su interpretacin en los trminos : Sensible (S), Intermedio (I) ,Resistente (R).

Tomado del Manual de laboratorio para la identificacin y prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patgenos bacterianos de importancia para la salud pblica en el mundo en desarrollo. Organizacin Mundial de la Salud 2004.

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Sensible

Resistente

Lectura de lo halos de Inhibicin de los discos de sensibilidad

Quimioterpico Ampicilina AM Amikacina AK Ac. Nalidxico AN Cefalotina CF Cefoxitina CTX Ceftriaxona CRO Cloranfenicol C Kanamicina K Nitrofurantoina FD Sulfatrimetoprim SXT Ciprofloxacino CIP Concentracin del Disco mcg 10 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 300 ug 231,2 ug 5 ug Halo de Inhibicin Sensible Intermedio Resistente +17 14-16 -13 +17 -15 +19 14-18 -13 +18 15-17 -14 +21 16-10 -15 +21 14-20 -13 +18 15-18 -14 +18 14-17 -13 +17 15-16 -14 +16 11-15 -10 +21 16-20 -15

Antibitico

Antibitico

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EVALUACIN 1. Qu importancia clnica tiene el antibiograma? 2. Mencione cuatro (4) posibles causas de error en el procesamiento o lectura del antibiograma. 3.. En qu casos es necesario realizar la concentracin mnima inhibitoria? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS PRCTICA N 6 DIFERENCIACIN BIOQUMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS OBJETIVOS Reconocer las caractersticas morfolgicas y en los cultivos de las bacterias Gram positivas Identificar bioqumicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia

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clnica. INTRODUCCIN Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clnica con forma de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus , principalmente S. pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus. Entre los bacilos Gram positivos patgenos ms comunes tenemos Bacillus anthracis, Clostridium, Gardnerella, Listeria , Corynebacterium. Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificacin realizar toma de muestras y procesamiento bacteriolgicos correctos. Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los Staphylococcus son los ms fciles de aislar e identificar mediante observacin de hemlisis, pruebas bioqumicas o diferenciales especficas como la prueba de catalasa para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus patgenos de los no patgenos, la reaccin de Quellung para distinguir neumococos etc. MATERIALES Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estriles Reactivo de perxido de hidrgeno Equipo para la coloracin de Gram Lminas portaobjetos Asas bacteriolgicas Mecheros Microscopios

METODOLOGA Pruebas bioqumicas para Staphylococcus y Streptococcus Observar el tipo de hemlisis que presentan las placas de agar Sangre Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una de Manitol salado. Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno, depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml de Streptococcus epidermidis . Incubar 30 minutos a 37 C. Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol salado.

Preparacin de Frotis :

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1. Con el asa de siembra tomar una colonia de la placa de Petri

2. Extender la muestra sobre la lmina portaobjetos

3. Fijar el extendido con la llama del mechero

METODOLOGA La identificacin de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfologa de las colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemlisis en agar Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretacin , se emplean pruebas bioqumicas como :

Prueba de Catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposicin de perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. Se encuentra presente en la mayora de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos. La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rpida con desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el perxido de hidrgeno , en agua y oxgeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los gneros Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del gnero Streptococcus : catalasa negativo.

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negativo. Con el asa de siembra se toma una colonia del cultivo del microorganismo y se coloca en la lmina
Perxido de hidrgeno

Figura N 1

Figura N 2

(+) BURBUJEO :
Staphylococcus

(-) NO BURBUJEO :
Figura N 3 Streptococcus

Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin

POSITIVO

NEGATIVO

Fermentacin del manitol El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus patgenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en este caso se observar la formacin de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.

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 Coagulacin del plasma Staphylococcus aureus produce una protena llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero. Este factor srico reacciona con la coagulasa , activando el fibringeno y produciendo un cogulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la clula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), tambin llamado factor de agregacin , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37 C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulacin.

(+) PRUEBA POSITIVA

Formacin de cogulo Staphylococcus aureus

Cogulo

(-) PRUEBA NEGATIVA No hay formacin de cogulo Staphylococcus epidermidis

No se forma cogulo

Tomado de Diagnstico Microbiolgico de Bailey y Scott 11 edicin

POSITIV

NEGATIVO

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS Streptococcus

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Hemlisis

Fermentacin del manitol

Prueba de catalasa

Staphylococcus aureus

Fermentacin del manitol

Prueba de catalasa

Prueba de coagulasa

Staphylococcus epidermidis

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Fermentacin del manitol

Prueba de catalasa

Prueba de coagulasa

EVALUACIN 1. Mencione dos (2) pruebas bioqumicas que permitan diferenciar: Streptococcus pneumoniae : Streptococcus pyogenes : 2. Realice un flujograma para la identificacin de bacteria Gram positivas

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS PRCTICA N 7 IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONA

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OBJETIVOS Conocer los procedimientos de identificacin bioqumica de las principales bacteria Gram negativas. Interpretar los resultados de las pruebas bioqumicas y correlacionarlas con la diferentes especies de bacterias Gram negativas. INTRODUCCIN Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los ms abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos estn asociados a infecciones entricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando stas bacterias invaden otros rganos o sistemas). Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la diseminacin endgena de la bacteria en una persona susceptible, pudindose ver afectado cualquier rgano del cuerpo. Familia de bacilos entricos Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos . Un gran nmero de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el mdico, con base en el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de infeccin. Dentro de los bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, ms del 70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales. Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiolgicos de infecciones entricas tenemos : Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infeccin sistmica , que son procesos infecciosos que se diseminan generalmente por va sangunea o linftica. Medios de aislamiento primario Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente especfica (Sulfato de bismuto y Verde brillante). Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa : Salmonella, Shigella. Medios diferenciales : Pruebas Bioqumicas Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metablicas de los microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos o ms caractersticas metablicas de la bacteria inoculada . Entre los ms utilizados estn : Agar Triple Azcar (TSI): medio slido que contiene glucosa, sales de hierro y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos. Se detecta la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S), as como

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de gas. El tubo se siembra por picadura y en estra por lo que se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio Agar Lisina Hierro (LIA) : medio slido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un indicador de pH. Se determina la descarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S) y la fermentacin de glucosa. Se siembra por picadura y estra. Medio para Sulfuro , Indol y Movilidad (SIM) : medio semislido, se utiliza en la produccin de sulfuro de hidrgeno, la formacin de Indol y movilidad. Se inocula con una nica puncin con asa de siembra recta a travs del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del medio. Agar Citrato de Simmons : medio slido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado como nica fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estra Agar rea (Mtodo de Christensen) : medio slido, se utiliza para determinar la capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la rea . La hidrlisis de la rea produce amonaco y anhdrido carbnico. La formacin de amonaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de naranja plido a magenta. Existen ms pruebas bioqumicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilizacin de malonato, las cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metablicas, no se consigue la identificacin , siendo necesario realizar reacciones inmunolgicas para llegar al diagnstico definitivo. BACTERIAS PIGENAS GRAM NEGATIVAS Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clnica son las bacterias pigenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que producen por lo general incluyen la acumulacin de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis , neumonas , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis etc. Las bacterias pigenas Gram negativas patgenas en humanos son : Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Moraxella. Las bacterias del gnero Neisseria son diplococos Gram negativos inmviles, cuyos lados adyacentes son aplanados y ligeramente cncavos. Slo dos especies de este gnero son patgenas exclusivamente de humanos : Neisseria gonorroheae o gonococo, agente causal de la enfermedad de transmisin sexual, la gonorrea y la N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el tracto respiratorio superior. Espordicamente se pueden comportar como patgenos oportunistas N. sicca y N. mucosa.

El diagnstico definitivo de una infeccin gonoccica se hace por el aislamiento en cultivo de N. gonorrhoeae.

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Para el diagnstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra depender de la edad, sexo y de las caractersticas de la infeccin. La tincin de Gram es el mtodo de eleccin para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva. Para los cultivos , el medio debe ser de preparacin reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar adems en una atmsfera que contenga de 3 a 5 % de CO2. El diagnstico de la infeccin meningoccica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de lquido cefalorraqudeo, sangre, lquido sinovial, pleural o pericrdico. Las ms utilizadas son las dos primeras. Con la tincin de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmsfera de CO2. Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos. MATERIALES Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas. Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y SalmonellaShigella Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, REA, SIM, sin sembrar y sembrados con cepa problema Asas de siembra Reactivo de Kovacs Lminas fijadas con frotis de lquido cefalorraqudeo con tincin de Gram. Microscopio Aceite de inmersin Placas de cultivo con agar Chocolate. METODOLOGA Enterobacterias En las prcticas se harn los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las caractersticas de cultivo y con ello su identificacin A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente esterilizada una muestra y sembrar por estras en los medios Eosina azul de metileno y Salmonella Shigella. Incubar a 37C por 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubacin , observar la morfologa de las colonias de las placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S). Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons, LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estras en la parte de inclinacin (pico de flauta) como lo indicar el profesor en cada medio. Llevar a incubar a 37C por 18 a 24 horas. Hacer la lectura de las pruebas bioqumicas, interpretar y realizar la identificacin del microorganismo proporcionado.

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 Interpretacin Bioqumica Agar Triple Azcar (TSI): Fermentacin de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color amarillo. Es una reaccin dbil. Fermentacin de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo, principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reaccin de la glucosa. Fermentacin de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo. Debido a la fermentacin puede hacer produccin de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas en el medio. Produccin de cido sulfhdrico o sulfuro de hidrgeno (H2S): por degradacin enzimtica de aminocidos que contienen azufre originan un precipitado de color negro. La produccin de H2S tiene lugar en ambiente cido, de ah que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan cidos a partir de la glucosa. As , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro. Agar Lisina Hierro (LIA) : Descarboxilacin de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie. Fermentacin de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo. Desaminacin de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es caracterstico de Proteus y Providencia. Produccin de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente). Agar Citrato de Simmons : Utilizacin de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul. Agar rea : Los microorganismos que hidrolizan la rea producen un cambio de color en el pico de flauta de naranja plido a magenta. Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) : Motilidad: Los cultivos mviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la lnea de inoculacin , por lo que observando si el crecimiento est solo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmvil o mvil. Indol : la aparicin transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehdo

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del reactivo originando un complejo de color rojo. Produccin de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente).

Escherichi a coli

Klebsiella

Salmonell a

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Shigella

RESULTADOS Realizar la lectura e identificacin de los microorganismos, observar y anotar los resultados.

Escherichia coli :

TSI

LIA

Citrato de Simmons

rea

SIM

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 Klebsiella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

rea

SIM

Proteus sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

rea

SIM

Salmonella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

rea

SIM

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 Shigella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

rea

SIM

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PSEUDOMONA Las especies pertenecientes al gnero Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la tierra, materia orgnica en descomposicin, en la vegetacin, en el agua. Tambin podemos encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares hmedos, como comida, baos, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con excepcin de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos. Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su amplia distribucin ambiental, siendo capaces de utilizar un gran nmero de compuestos orgnicos como fuentes de carbono y nitrgeno. Son bacilos Gram negativos mviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios estrictos, la mayora de las cepas son mviles por medio de uno o ms flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos El gnero Pseudomonas se divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri, Grupo Alcalgenes y Grupo con pigmento amarillo. Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomona aeruginosa, Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida , las cuales se caracterizan por la produccin de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Slo una especie, Pseudomona aeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina. Pseudomona aeruginosa produce un aspecto caracterstico cuando crece en una placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemlisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimn y con brillo metlico. La exudacin de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la produccin de piocianina es caracterstico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un antibitico que puede permitir que la Pseudomona aeruginosa exista en la naturaleza, tambin puede desempear un papel en la nutricin , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos inorgnicos. Se puede realizar una identificacin rpida de Pseudomona aeruginosa si se observan las siguientes caractersticas : morfologa tpica de las colonias, produccin de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.

CARACTERSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE : PRUEBA PIOVERDINA PIOCIANINA MATERIALES Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema. Asas de siembra Pseudomona aeruginosa + + Pseudomona fluorescens + Pseudomona putida + -

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Pseudomon a aeruginosa

piocianina

RESULTADOS

EVALUACIN 1.Cules son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico? 2. Realizar un flujograma para la identificacin de bacterias Gram negativas.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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 PRCTICA N 8 IDENTIFICACIN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN

OBJETIVOS Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con micobacterias. Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias. Explicar el fundamento de la coloracin de Ziehl-Neelsen. Ejecutar la tcnica de coloracin de Ziehl-Neelsen. INTRODUCCIN El gnero Mycobacterium est integrado por ms de 100 especies, presentan alto contenido de cidos miclicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes : fucsina , auramina, aun despus de ser tratadas con alcohol-cido de modo que todas las especies se presentan como cido-alcohol resistentes (BAAR). El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiolgicos de tuberculosis M.tuberculosis , M.africanum y M.canetti , los cuales son primariamente patgenos en el hombre. M.tuberculosis y M.africanum son las especies de micobacterias ms importantes por ser altamente patgenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles expulsados por la tos de pacientes con lesin pulmonar. La muestra ms examinada en la investigacin de Mycobacterium tuberculosis es la de esputo debido a que la tuberculosis pulmonar es la ms frecuente, sin embargo dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier rgano , con menor frecuencia puede requerirse la investigacin de muestras como orina, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido asctico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse tambin para cultivo. La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del rbol bronquial que se obtiene despus de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 3 muestras de cada sintomtico respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al da siguiente al despertar por la maana. Puede obtenerse una tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser de boca ancha y con tapa de rosca. Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo da, se debe introducir cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se conservarn en refrigeracin a 4 C, para impedir la proliferacin de la flora secundaria, preferentemente dentro de una caja de plstico. Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es importante hacerlos en la cabina de seguridad. Para que la baciloscopa sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000 bacilos por ml de muestra.

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Las micobacterias se multiplican con ms lentitud que otras bacterias patgenas para el hombre a causa de su pared celular hidrfoba, que las hace agruparse e inhibe la permeabilidad celular a los nutrientes El medio de cultivo ms conocido es el Lwenstein-Jensen. La temperatura ptima de crecimiento es de 37C. Los cultivos se revisarn diariamente hasta un total de 60 das , pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarn negativos. Lectura de los extendidos Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo micromtrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en lneas rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de izquierda a derecha. El nmero mnimo de campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser ledos por un microscopista experimentado en cinco . Los bacilos se observarn como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados. Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tincin Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscpico No se encuentran BAAR en 100 campos observados Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos observados Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos observados Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos observados Se observan ms de 10 BAAR en 20 campos observados Informe No se observan bacilos cido-alcohol resistentes N exacto de bacilos en 100 campos Positivo (+) Positivo (++) Positivo (+++)

Tincin de Ziehl-Neelsen La cido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fucsina fenicada y retenerla aun con la accin de los decolorantes como la mezcla de cido y alcohol . Esta caracterstica se debe al alto contenido lipdico fundamentalmente fosfolpidos, ceras y cidos miclicos. MATERIALES Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos Tubos con medios de cultivo Lwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias Equipo de coloracin para tincin de Ziehl-Neelsen Mecheros Lminas portaobjetos Microscopios METODOLOGA Preparacin y fijacin del extendido

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1. Ordenar las muestras 2. Numerar las lminas portaobjetos 3. Tomar la muestra y la lmina portaobjetos y colocarlas por detrs del mechero, de manera que la llama quede entre el operador y el frasco 4. Destapar con cuidado el envase 5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la mano derecha entre el pulgar y el ndice y con los extremos irregulares seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la muestra 6. Colocar las partculas seleccionadas sobre la lmina portaobjetos y extenderla con movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente 7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solucin de hipoclorito de sodio al 1 %. 8. Cerrar el envase de la muestra 9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o cuatro (4) veces para fijarlo. Tincin de Ziehl-Neelsen 1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada 2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivn, hasta observar que se desprenden los primeros vapores blancos 3. En el trmino de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisin de vapores. No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. 4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua 5. Cubrir todo el extendido con la solucin decolorante y dejar actuar por tres minutos. Enjuagar con abundante agua 6. Cubrir todo el extendido con solucin de Azul de metileno, dejar actuar por un minuto 7. Enjuagar con abundante agua 8. Dejar secar al medio ambiente

1. Cubrir con fucsina bsica fenicada

2. Calentar suavemente

con ayuda del hisopo (5 minutos) 59

3. Enjuagar con abundante agua

4. Cubrir con solucin decolorante (3 minutos)

5. Enjuagar con abundante agua

6. Cubrir con Azul de

metileno (1 minuto)

7. Enjuagar con abundante agua

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Bacilos cido-alcohol resistentes

Medio de cultivo Lwenstein-Jensen

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis

RESULTADOS Realizar la observacin microscpica de las lminas y graficar los resultados.

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BACTERIAS ANAEROBIAS Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos los rganos y regiones anatmicas del cuerpo. Los abscesos ms profundos y las lesiones necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerfilos como microorganismos acompaantes. Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la stasis vascular o la necrosis tisular, reducen la tensin de oxgeno y el potencial de oxidoreduccin en los tejidos y proveen las condiciones favorables para la multiplicacin de los anaerobios obligados. En las ltimas dcadas , las infecciones anaerobias se han vuelto ms comunes, para lo cual existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endgenas no son ms mal diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporcin mayor de pacientes est recibiendo frmacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la resistencia del husped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen fcilmente en reas de tejido daado y la bacteriemia, diseminacin metastsica de las bacterias con formacin de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificacin de las bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el tratamiento vara segn la especie implicada. Aislamiento de bacterias anaerobias Seleccin de las muestras para el cultivo : Debido a que los anaerobios residentes a menudo estn presentes en grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas , incluso la contaminacin mnima de una muestra puede dar resultados errneos. Todos los materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como lquidos corporales que no sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos pueden ser cultivados para bacterias anaerobias. Recoleccin y transporte de las muestras: Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabn , alcohol etlico al 70 % y tintura de yodo por un minuto ( en crculos concntricos comenzando por el centro), tambin se puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de la extraccin de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia de tejidos o por puncin y aspiracin . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada debido a la exposicin excesiva de la muestra a los efectos de la desecacin , la posibilidad de contaminacin durante la recoleccin y a que los microorganismos pueden quedar retenidos dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de transporte exento de oxgeno. Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las muestras; el efecto letal del oxgeno atmosfrico debe ser nulo hasta que la muestra pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por puncin . Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla libre de oxgeno. La muestra (pus,lquidos corporales u otro material lquido) se inocula a travs del tapn de goma despus de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si slo se puede obtener una muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la recoleccin con una atmsfera libre de oxgeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que

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provocara la salida y el desplazamiento del anhdrido carbnico o el nitrgeno libre de oxgeno al aire ambiental. El tejido puede colocarse en una pequea cantidad de lquido para preservarlo de la desecacin y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis. Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el laboratorio, dado a que la refrigeracin puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben ser remitidas al laboratorio lo antes posible. Examen directo de los materiales clnicos : El anlisis macroscpico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos orientadores sern el hallazgo de un olor ftido, el aspecto purulento de muestras lquidas as como el hallazgo de tejido necrtico y gas. En los portaobjetos preparados para la tincin de Gram, es ms til la fijacin con metanol que el calor; se deben observar caractersticas celulares y el fondo del frotis y en la tincin de Gram , observar la forma, tamao, disposicin de las bacterias y registrar el nmero de microorganismos presentes . Observar caractersticas morfolgicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpsculos esfricos, formas granulares. La tincin de Gram permite determinar caractersticas celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar informacin adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las ms tiles para detectar bacterias en hemocultivos, lquido cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido articular y exudados. Procesamiento de las muestras Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo comn con incubacin en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cmara anaerobia. Jarras para anaerobiosis : el sistema que ms se utiliza para crear una atmsfera anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plstica transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla hermtica. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrgeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas. Bolsas plsticas anaerobias : Es una bolsa de plstico transparente , de varios tamaos, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de dimetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmsfera cuando se le agrega agua, partculas de catalizador de paladio fro y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activacin del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias. Incubacin de los cultivos En la mayora de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37C, para el aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clnicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 das para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen ms lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposicin de oxgeno. Debe evitarse la exposicin prolongada de las placas

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recin inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clnicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recin inoculadas se mantienen en el aire ambiental. CUADRO N1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina Respiratorio externos Superior BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Bacteroides 0 +/2 +/+/+/Prevotella 0 2 2 1 +/1 Porphyromonas 0 1 1 D D +/Fusobacterium 0 2 1 D D +/Veillonella 0 2 1 0 D 1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS Finegoldia 1 2 2 1 +/1 magna Micromonas 1 2 2 1 +/1 micros Clostridium +/+/2 +/+/+/Actinomices 0 1 1 0 0 +/Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/Eubacterium 0 1 2 D D 1 Lactobacillus 0 1 1 0 +/2 Propionibacteriu 2 1 +/+/+/1 m D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo comn presente; 2 : Presente en grandes cantidades CUADRO N2 : Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios HISOPADOS FARNGEOS O NASOFARNGEOS Hisopados gingivales Muestras broncoscpicas o esputo Contenido gstrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales, fstulas colonocutneas Superficies de lceras por decbito, hisopados de muestras de costras de abscesos, revestimientos mucosos Materiales adyacentes a la piel o las mucosas Orina de miccin espontnea Hisopados cervicales o vaginales MATERIALES Placas con agar Chocolate Jarra anaerobia GNERO Piel

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RESULTADOS

EVALUACIN 1. Qu personas son ms susceptibles a la contaminacin con Mycobacterium tuberculosis? 2. A quines se les llama multidrogorresistentes? 3. En qu casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad antibitica a los pacientes con tuberculosis? REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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 PRCTICA N 9 CULTIVO DE MUESTRAS CLNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO OBJETIVOS Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clnica. Identificar los microorganismos ms frecuentes causantes de patologas clnicas. Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una muestra clnica. CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO La infeccin del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicacin de microorganismos en el tracto urinario con invasin de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayora de las veces debido a una invasin tisular por bacterias. Por lo general la piuria, est presente en las ITU , por lo que se le considera un criterio diagnstico para sta enfermedad. La mayora de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias , siendo la Escherichia coli y Klebsiella sp, los ms frecuentemente aislados , en infecciones no complicadas. Tambin pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp , Enterobacter sp y Pseudomona aeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a instrumentacin, portadores de catteres urinarios, con anomalas anatmicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados. Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la mayora de las ITU , se recupera un nico microorganismo en la orina. La presencia de ms de una especie bacteriana puede deberse a una contaminacin de la muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales o sondaje prolongado. El diagnstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina : urocultivo . Hay que considerar que por cuidadosa que sea la tcnica de toma de muestra ( salvo puncin suprapbica) , es difcil excluir la contaminacin de la orina con las bacterias del tramo distal de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas. La orina de miccin media es la ms recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del prepucio. La primera parte de la miccin casi siempre ests contaminada con la flora bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La miccin media debe recogerse en un envase estril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la maana , donde se encuentra mayor nmero de bacterias. El cultivo de orina se realizar para identificar y cuantificar el nmero de bacterias presentes por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo

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mximo de 2 horas a temperatura ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la multiplicacin de los grmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo, alterar los resultados. Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen microscpico cuantitativo , para determinar el nmero de leucocitos por milmetro cbico. MATERIALES Frasco estril de 100 ml Asa de siembra calibrada 0,01ml Pipetas graduadas de 1ml estriles Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno Lminas portaobjetos , laminilla Equipos de coloracin para tincin de Gram Centrfuga y microscopio

METODOLOGA Evitar la contaminacin de la muestra, utilizando equipos estriles: frascos, pipetas, placas de Petri, tubos de pruebas estriles. Examen directo: Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de 40X Cultivo Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitacin de la muestra , tomar una muestra con el asa y sembrar por estras en agar Mac Conkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estras por el primer cuadrante y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto cuadrante. Rotular la placa e incubar 24 horas a 37 C.

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RESULTADOS Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioqumicas para la diferenciacin. Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.

Sedimento urinario

Agar Mac Conkey

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TSI

Citrato

LIA

SIM

CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO La diarrea puede definirse como el proceso de eliminacin frecuente de heces, disminucin de su consistencia o ambas cosas. El diagnstico etiolgico se realiza mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal : Coprocultivo , realizndose primero el aislamiento y luego la identificacin de las bacteria presentes en las heces. Las bacterias causantes de diarreas ms frecuentes son : Salmonella, Shigella y Escherichia coli enteropatgena .Tambin puede producirse cuadros diarreicos por : Campylobacter sp, Yersinia enterocoltica ,Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y Clostridium difficile. Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estril, procurando no mezclarla con la orina. Si esto no es posible es conveniente conservar la muestra en un medio de transporte adecuado manteniendo en refrigeracin hasta su siembra. Muestras inaceptables: Muestras no conservadas de ms de 4 a 6 horas. Muestras mltiples el mismo da Muestras contaminadas con orina. METODOLOGA Examen Directo El examen microscpico directo de las heces permite la observacin de polimorfonucleares, lo que sugiere la infeccin de por un patgeno invasivo. Examen en fresco y/o tincin de Azul de metileno de Loeffler. Tincin de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante. Inoculacin El coprocultivo se realiza a partir de muestras recin emitidas de preferencia, de las cuales se inoculan los medios de cultivo.

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Medios diferenciales Para diferenciar a los bacilos entricos fermentadores de lactosa (L+) de los no fermentadores de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva aerobia: agar Mac Conkey, agar Eosina azul de metileno, agar Endo. Medios selectivos Para inhibir el crecimiento de la mayora de las enterobacterias y permitir el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar Salmonella Shigella (SS) Medio lquido Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubacin. Se resiembran en medio slido a partir de las 6 horas. Este medio de cultivo es fundamental para el estudio de portadores asintomticos. Medios especiales Vibrio spp Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas , subcultivar en agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS) Medio selectivo :TCBS Campylobacter medio selectivo : medio CAMP MATERIALES Muestra de heces Placas de Petri con agar SS, EMB Tubos con caldo Selenito Lminas portaobjetos y laminillas Asas de siembra Tubos con medios diferenciales o bioqumicos. RESULTADOS Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas bioqumicas para diferenciar las especies de enterobacterias.

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TSI

Citrato

LIA

SIM

CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO Mielocultivo La deteccin de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia diagnstica. Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razn que supera la capacidad del sistema retculoendotelial del torrente sanguneo , se produce bacteriemia y fungemia. Bacteriemia persistente o crnica ocurre cuando no se ha podido localizar o drenar adecuadamente, el foco de la infeccin. La entrada directa de bacteria al torrente sanguneo ocurre en infecciones intravasculares como : endocarditis, fstulas arteriovenosas, aneurismas micticos, flebitis supurativas, catteres intravenosos infectados y arteriales permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para planificar los mtodos de diagnstico as como la interpretacin de los resultados. Las fuentes de bacteriemias son : sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % , abscesos 10%, heridas quirrgicas 5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios desconocidos 25 %. Siempre que exista una razn para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre, perifrica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnstico mediante este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo de los hemocultivos es transcendente porque establece el diagnstico etiolgico de la bacteriemia y permite la eleccin del tratamiento. Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumona , pielonefritis: en estos casos el hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia. Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a catteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la muestra se puede tomar en cualquier momento.

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Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta escalofros o poco despus o durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14 % de los casos esta prueba establece el diagnstico. INDICACIONES Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematolgicos . Siempre se deben realizar en un mnimo de dos (2) horas. Nunca debe refrigerarse antes de su envo , puede conservarse en estufa. MATERIALES Cultivos en medios Ruz -Castaeda METODOLOGA Se observarn los medios usados para hemocultivo. RESULTADOS Grafique lo observado en la prctica.

EXUDADOS VAGINALES (exocervicales) La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y consideracin son importantes para el estudio microbiolgico de las infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones : Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante Bsqueda de agentes exgenos , trasmitidos normalmente por va sexual Deteccin de portadoras de determinados microorganismos La mayora de las situaciones clnicas que pueden ser objeto de estudios microbiolgicos para el aislamiento o visualizacin del agente etiolgico son : Vulvovaginitis : agentes etiolgicos ms frecuentes : Cndida spp , principalmente C. albicans; Trichomonas vaginalis y virus Herpes simple. La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tincin de Gram con leucocitos , puede tener significacin. Vaginosis : desde el punto de vista microbiolgico se caracteriza por la ausencia o disminucin de la flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios (Mobilluncus, Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasma hominis. Infeccin gonoccica : la endocervicitis gonoccica cursa con leucorrea , el exudado vaginal no es la muestra adecuada para el diagnstico por lo que se recomienda la obtencin de exudado endocervical. Tipos de estudios microbiolgicos Cultivo bacteriano Cultivo de levaduras Despistaje de Streptococcus agalactiae

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Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y cultivos especiales, se realiza por peticin expresa del clnico. Toma de muestra No debe usarse antisptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espculo, lubricar con agua caliente. Se recomienda tomar dos (2) hisopados . Se introduce un hisopo estril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo en el medio de transporte. El envo de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendr en refrigeracin o a temperatura ambiente. Si se sospecha de infeccin gonoccica, no refrigerar la muestra. Tiempo mximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Uno de los hisopos se emplear para el examen microscpico y el otro para el cultivo. Examen microscpico : es el nico mtodo aceptado para el diagnstico microbiolgico de la vaginosis bacteriana. Se har una extensin del hisopo en lmina y tincin de Gram. Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en funcin de la orientacin diagnstica : agar Sangre en atmsfera de CO2 , agar Chocolate en atmsfera de CO2, Mac Conkey, agar Thayer Martin en atmsfera de CO2, medio para Gardnerella en atmsfera de CO2 , Sabouraud con antibitico u otro medio para Cndida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis. Examen de la muestra Examen microscpico : en el exudado vaginal normal se observar flora regional con predominio de morfotipo Lactobacillus sp y clulas epiteliales Presencia de leucocitos Presencia de levaduras o pseudohifas Presencia nica o abundante , de cualquier otro microorganismo Exudado caracterstico de vaginosis bacteriana Presencia de clulas clue : clulas epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram variables. Ausencia o escasos leucocitos. Flora mixta alterada. Examen en medios de cultivo El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas , a excepcin del cultivo en agar Mac Conkey que se descarta a las 18 horas. El agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo.

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Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumoniae. Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Haemophilus sp. Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias. Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaos, oxidasa positivo, compatibles con gonococo. Medio Gardnerella : presencia de colonias hemolticas puntiformes en gran cantidad posiblemente Gardnerella vaginalis. Agar Sabouraud : presencia de levaduras. SECRECIN URETRAL La uretritis es el sndrome ms comn dentro de las Enfermedades de Transmisin Sexual (ETS), aunque muestra un claro descenso en las ltimas dcadas en relacin con otras ETS, tanto en Espaa como en otros pases desarrollados. Atendiendo a su etiologa se clasifican en uretritis gonoccica y no gonoccica (UNG) , siendo estas ltimas las ms frecuentes en pases desarrollados. N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los episodios de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis, Ureaplasma urealyticum y por un nmero variable de otros potenciales patgenos en los que la asociacin causa-efecto con la uretritis est menos aclarada . La asociacin de ms de un patgeno como causa de la uretritis es ms que anecdtica y la ms frecuente de ellas es la asociacin de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginales como nico agente encontrado hasta en un 4 % de las uretritis no gonoccicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de condilomas intrauretrales. La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 das tras la exposicin, en tanto que la UNG es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonoccicas como las no gonoccicas producen supuracin uretral, disuria y escozor. El diagnstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos Sntomas : historia de secrecin uretral y/o disuria Demostracin con tincin Gram : ms de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo de 1 000 aumentos en el examen directo de la secrecin uretral. Los pacientes con sntomas de uretritis, sin secrecin, visible, deben ser examinados, pidindoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de muestra . Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la centrifugacin a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de ms de 15 leucocitos polimorfonucleares por campo confirma el diagnstico de uretritis. Los sntomas de la uretritis gonoccica puede permanecer hasta ms de 7 das, por ello la uretritis postgonoccica se suele diagnosticar despus de transcurrido este perodo. En el examen con tincin de Gram, la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares , establece el diagnstico de uretritis gonoccica. La presencia de clulas inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo negativo para establecer el diagnstico de UNG.

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El xito del diagnstico microbiolgico de la uretritis gonoccica depende de la correcta obtencin, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensin del exudado uretral para realizar la tincin de Gram. Las muestra para cultivo debern inocularse en medios selectivos (Thayer Martin modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37C durante 72 horas en una atmsfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) . Examen microscpico : en la secrecin uretral se debe observar presencia de clulas y bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y extracelulares. Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares. Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de patgenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se incubar hasta 72 horas si es negativo. Agar Sangre : Streptococus pyogenes o Streptococus pneumoniae Agar Chocolate : Haemophilus sp, Thayer Martin ,gonococo. Pruebas bioqumicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioqumicas : Prueba de oxidasa y fermentacin de carbohidrato para Neisseria.

EVALUACIN 1. Esquematizar un flujograma de urocultivo

2 .Cules son los agentes bacterianos ms frecuentes, que se aislan en los cultivos de catteres intravenosos?

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 3. Esquematizar un flujograma de secrecin de herida.

REFERENCIA BIBLIOGRFICAS PRCTICA N 10 DIAGNSTICO MICOLGICO: HONGOS AMBIENTALES OBJETIVOS Conocer las tcnicas para la toma de muestra en el diagnstico micolgico. Identificar los productos patolgicos de donde se pueden aislar los agentes etiolgicos de las micosis humanas. Conocer las caractersticas de los exmenes directos, como de los cultivos de hongos. INTRODUCCIN La mayora de los hongos tienen un hbitat saproftico, presentan una variedad de morfologa, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de inters para la industria alimentaria, qumica farmacutica y los venenosos. Del gran nmero de especies estudiadas hasta la fecha (ms de 250 000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en stos casos las enfermedades denominadas micosis. Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfolgicos bsicos: levaduras y mohos.

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 Levadura Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemacin o fisin binaria. Una levadura tambin puede ser el estadio morfolgico en el ciclo biolgico de una especie filamentosa se denomina a esto dimorfismo. Mohos Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una espora .El elemento tubular que emerge de denomina hifa, el que sigue creciendo y ramificndose llegando a formar un conjunto entrelazado al que se denomina micelio o talo. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman el micelio vegetativo y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio areo, muchas levaduras en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir pseudohifas. El micelio areo muestra macroscpicamente diferentes caractersticas, lo cual contribuye a la identificacin primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En l se producen los elementos de propagacin, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar un nuevo sustrato y as producir un nuevo elemento. Este conjunto de caractersticas observadas sobre el medio de cultivo se denomina colonia. Los hongos como clulas eucariticas poseen ncleo, nucleolo, retculo endoplasmtico, ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipdicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana y una pared celular con caractersticas muy definidas. Se multiplican a travs de estructuras que pueden ser asexuales o sexuales previa fusin del protoplasma y ncleo de clulas distintas. Tambin lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio. Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el esquema clsico : examen directo, cultivos e inmunodiagnstico. Examen directo El examen microscpico de la muestra patolgica, escamas de piel, pelos, fragmentos de uas, exudado purulento, LCR o biopsias, permite observar las caractersticas hifas, esporas , levaduras ,etc. Se hace una preparacin en la lmina portaobjetos con una gota de hidrxido de potasio al 10% (KOH al 10 %). Para la cpsula de Criptococcus neoformans (LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cpsula. En los exudados purulentos se recomienda realizar una tincin de Gram, Giemsa, y tambin Wright. Si se trata de cortes histolgicos hacer una preparacin con hematoxilina y eosina. Cultivos El medio ms utilizado en micologa clnica es el descrito por Sabouraud. A este medio base se le aade una cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominndose as agar glucosado de Sabouraud (SGA) , al cual posteriormente se le han adicionado antibiticos con el fin de evitar la contaminacin bacteriana y cicloheximida (actidiona) , para inhibir los hongos saprofitos.

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La incubacin en micologa mdica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2 a 3 das para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubacin es 32 C ; los dermatofitos y otros causantes de micosis cutneas a 25 a 30 grados centgrados (temperatura ambiental) El producto patolgico y la tcnica de toma de muestra se elegir de acuerdo con el tipo de micosis por investigar. MATERIALES Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA) Cultivos de especies ambientales : Penicillum , Alternaria , Aspergillus, Hormodendrum Frasco con KOH al 10 % Asa de siembra METODOLOGA Observar macroscpicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su observacin microscpica.

Penicillum

Aspergillus fumigatus

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Aspergillus niger

Rhizopus

RESULTADOS Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.

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EVALUACIN

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1. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas , nutricionales y sensibilidad a antibiticos de hongos y bacterias.

2. Mencionar y explicar brevemente las tcnicas de diagnstico directas e indirectas para hongos. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS. PRCTICA N 11

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DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTNEAS OBJETIVOS Describir las caractersticas de las colonias de hongos causantes de las micosis superficiales y cutneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscpicamente. INTRODUCCIN La colonizacin e invasin en mayor o menor grado de una especie fngica se denomina micosis. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiolgicos que pueden colonizar la piel. Las infecciones cutneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y anexos (pelo y uas). La infeccin puede estar limitado a la capa crnea o llegar a los estratos ms profundos , sin invasin linftica. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso mictico de la piel y el de dermatofitosis se reserva para los producidos por hongos dermatofitos. MICOSIS SUPERFICALES Piedra Negra Se caracteriza por la presencia de ndulos en la porcin extrafolicular del pelo, ptreos y de color negro. El agente causal es Piedra hortae Piedra blanca Muestra ndulos blanco-grisceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente causal : Trichosporum cutaneo o T. beigelii. Tia negra Es una infeccin superficial de la piel debido a la colonizacin de Hortaea werneckii. Se caracteriza por la presencia de manchas negro-marronceas, no descamativas e indoloras , frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel. Pitiriasis versicolor Caracteriza lesiones furfurceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen microscpico detectan los grupos de levaduras con hifas MICOSIS CUTNEAS Dermatomicosis Micosis producida por Cndida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos (submamario o inguinal) , eczema de paales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidisico., Adems de C. albicans tambin pueden presentar onicomicosis Cndida stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C parapsilosis.

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Las preparaciones teidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales , con brotes de blastosporas de 3 a 4 m acompaadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud. La mayora de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Cndida; de todas las formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibiticos (cloranfenicol).Los medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies . La incubacin se realiza a temperatura ambiente (25 a 30 C) cuando se trata de medios con inhibidores y a 37C en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se puede observar las colonias caractersticas de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a 3 mm de dimetro. La prueba de filamentacin y produccin de clamidosporas caractersticas , son muy sencillas y tiles para la identificacin de C. albicans. Dermatofitosis Es una infeccin fngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uas) que ocurre en los seres humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados dermatofitos. Los agentes etiolgicos de las dermatofitosis se clasifican en tres gneros : Epidermophyton , Microsporum y Trichophyton. El diagnstico se puede hacer mediante : Examen directo Para el estudio micolgico se procede a tomar la muestra, que en este caso sera , pelos, escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con pinzas o bistur estril del centro o borde de la lesin y se colocan en una lmina. Se transportan entre dos lminas portaobjetos limpias y se observan directamente al microscopio, con una gota de hidrxido de potasio al 10 % (KOH ) cubierto con una laminilla. Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor del pelo (ectotrix). Cultivo Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos saprofitos. La identificacin se hace sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias entre ellos la produccin de pigmento. Luego las caractersticas microscpicas , observacin de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para definir cada gnero y especie. Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las caractersticas de sus colonias desarrolladas en SGA. MATERIALES Tubos sellados de SGA con cultivos de : Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans Microsporum gypseum, Microsporum canis Preparaciones en lminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.

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Cndida albicans

Trichophyton mentagrophyt es

Trichophyto n rubrum

Trichophyto n tonsurans

Microsporu m gypseum

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METODOLOGA Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

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EVALUACIN 1. Qu caractersticas morfolgicas en los cultivos presentan los siguientes hongos? Epidermophyton flocosum : Trichoporum cutaneum :

2. Cules son las manifestaciones clnicas de las micosis producidas por : Malassezia furfur : Piedra hortae :

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

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PRCTICA N 12 DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTNEAS, SISTMICAS Y OPORTUNISTAS OBJETIVOS Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de las micosis subcutneas. INTRODUCCIN Se consideran en este grupo las infecciones fngicas que afectan el tejido subcutneo, dermis y epidermis, causadas por hongos exgenos, saprofitos , cuyo hbitat es el suelo y las plantas. Las infecciones ms frecuentes son : La esporotricosis debida al Sporotrix schencki, que se produce habitualmente por la penetracin en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infeccin tiende a permanecer localizada en el tejido subcutneo y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesin ulcerada en el punto de inoculacin , que va seguida de la formacin de ndulos y abscesos mltiples que siguen las vas de drenaje de los linfticos superficiales. La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una ppula en el sitio de la inoculacin, que ms tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales , semejantes a una coliflor, puede haber infeccin secundaria y ulceracin . Las lesiones , por lo general, estn limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; tambin puede haber abscesos cerebrales. El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza por lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se localizan en los pies y las manos. Las lesiones se caracterizan por edema, coloracin purprea y deformacin tumoral del tejido subcutneo, con la presencia de surcos sinusales que drenan pus, que contiene grnulos amarillentos o negros. La infeccin progresa gradualmente, atacando los huesos , los msculos y otros tejidos adyacentes, hasta que por ltimo obliga a la amputacin, a veces se produce la invasin ms extensa afectando el cerebro y otros rganos internos . MATERIALES Tubos sellados de SGA con cultivos de: Sporotrix schenki Phialophora verrucosum Preparaciones en lminas coloreadas con azul de lactofenol. Microscopio

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METODOLOGA Examinar al microscopio las lminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

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DIAGNSTICO DE LAS MICOSIS SISTMICAS Y OPORTUNISTAS OBJETIVOS Identificar microscpicamente los agentes etiolgicos de las micosis subcutneas Describir las caractersticas morfolgicas de las colonias de los hongos causantes de las micosis subcutneas INTRODUCCIN Las micosis sistmicas, son infecciones fngicas que afectan varios rganos y tejidos. Se dividen en dos grupos : las producidas por especies consideradas patgenas con carcter endmico, este tipo de micosis se transmite por inhalacin, ingesta o traumatismos . Blastomicosis y Paracoccidioidomicosis las producidas por especies oportunistas . Estas patologas se dan en huspedes inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades oncohematolgicas, alteraciones metablicas y anatmicas , drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o citostticos , sometidos a ciruga, dializados , quemados transplantados y cateterizados) , son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales del cuerpo humano. Por ejemplo Cndida y Criptococcus La infeccin se adquiere por inhalacin de conidios en la fase micelial , desarrollndose en el husped un foco pulmonar primario. En caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una diseminacin sistmica. El diagnstico de laboratorio se realiza mediante la observacin de la fase levaduriforme en los siguientes productos : expectoracin, secrecin de lesiones mucocutneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37C. Estas pueden ser: Blastomicosis : Blastomyces dermatitis La infeccin comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por va hematgena causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, prstata y vsceras, en general no se afecta el tubo digestivo. Las lesiones cutneas son particularmente manifiestas , parecen originarse como metstasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se abren a la superficie cutnea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se caracterizan por

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inflamacin granulomatosa, microabcesos y progresiva destruccin de los tejidos, las calcificaciones son raras. Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis) Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se difunden por expansin directa, es decir a travs de los lmites cutneo-mucosos, afectan la cara, en ocasiones , la diseminacin se produce a travs de los tejidos linfticos incluyendo el bazo. En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede originar formacin de lceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutneos que por extensin a la superficie cutnea , puede producir lesiones deformantes de gran tamao, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutneas constituyen abscesos pigenos y lesiones inflamatorias granulomatosas. Histoplasmosis : Histoplasma capsulatum Causada por la inhalacin de esporas que lo conduce a una infeccin pulmonar, aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parnquima pulmonar y aumento de tamao de los ganglios linfticos. La infeccin inicial es benigna puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como un infeccin respiratoria autolimitada. En un pequeo nmero de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa lesiones en prcticamente todos los tejidos y rganos, aparece fiebre y postracin, as como el aumento del tamao de hgado , bazo y ganglios linfticos simulando tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin, simulando la tuberculosis pulmonar crnica. Las lesiones de los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamacin granulomatosa. Coccidiomicosis : Coccidioides immitis La infeccin se establece por inhalacin de esporas transmitidas por el aire aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto nicamente por la adquisicin de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antgenos del hongo, en un 40 % se produce neumonitis aguda, acompaada con frecuencia de pleuresa y varias erupciones cutneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar crnica con cavitacin que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificacin; en menos del 1 % aparece una diseminacin con lesiones granulomatosas aspticas en muchos rganos y tejidos, entre ellos, la piel, huesos articulaciones y meninges. Las lesiones de la neumonitis aguda son histolgicamente semejantes a las causadas por bacterias pigenas , pero en la enfermedad pulmonar crnica y en las

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formas diseminadas , la inflamacin es granulomatosa. Criptococosis Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las clulas T y se debe a Criptococus neoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hbitat es el suelo contaminado con materia fecal de aves. La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA en la enfermedad del virus de Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas clnicas existe : Criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada , cutnea y mucocutnea. El producto ms frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las tpicas levaduras capsuladas que se destacan por contraste negativo mediante emulsin con tinta china. Candidiasis : Cndida spp Las infecciones caudadas por Cndida son muy variadas, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser patgeno en humanos y animales en los cuales vive en estado saproftico . La cavidad bucal y es resto del tracto gastrointestinal son los territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y en menor proporcin otras especies de Cndida. Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis : Cambios fisiolgicos como diabetes y embarazo Uso prolongado de antibiticos o frmacos antitumorales e inmunosupresores Maniobras diagnsticas y teraputicas agresivas : cateterismo, sondajes Debilidad general y/o desnutricin Infeccin por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.

El diagnstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostracin directa de Cndida mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clnicas y cultivo MATERIALES Tubos de SGA con cultivos de : Histoplasma capsulatum Cndida albicans Preparaciones en lminas con azul de lactofenol Microscopio METODOLOGA Observar de las muestras macroscpicamente Realizar preparaciones en lminas con azul de lactofenol y observar al microscopio (10x y 40x)

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PRCTICA N 13 DIAGNSTICO VIROLGICO OBJETIVOS Familiarizar al estudiante con las diferentes tcnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades que presentan Observar y caracteriza morfolgicamente clulas cultivadas Explicar la importancia de las tcnicas de cultivo de tejidos en virologa y en otras disciplinas cientficas. La demanda de los servicios de los laboratorios de virologa clnica, han aumentado en las ltimas dos dcadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso por parte de los mdicos de frmacos antivirales especficos, el desarrollo de tcnicas de diagnstico rpido y la aplicacin de los procedimientos de cultivo celular para virologa al diagnstico de otras enfermedades como infeccin genital por Chlamydia. Las enfermedades virales que requieren diagnstico de laboratorio son las enfermedades de transmisin sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en nios y adultos, las meningitis aspticas, las enfermedades congnitas y las infecciones en huspedes inmunodeprimidos. CULTIVO CELULAR Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de rganos completos y luego con mtodos de clulas individualizadas : cultivos de clulas primarias (clulas somticas de un animal de experimentacin o tomadas de un paciente humano (que pueden mantenerse en cultivo durante un perodo breve de tiempo) o lneas celulares inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo indefinidamente. En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantific virus animales, utilizando un ensayo de placas de lisis, tcnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan clulas crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando para impedir la difusin del virus. ste destruye las clulas en focos localizados que se observan al teirse la monocapa. MECANISMOS DE LESIN CELULAR La infeccin viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen visual o bioqumico de las clulas infectadas, estos cambios se deben a la produccin de protenas y cidos nucleicos vricos, y a las alteraciones biosintticas de las clulas. En las clulas infectadas por virus se reconocen cambios fenotpicos comunes, denominados efectos citopticos del virus , los cuales son : Forma alterada : las clulas adherentes que normalmente estn pegadas a otras clulas ( in vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfologa redondeada diferente de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la clulas los procesos de ampliacin implicados en la adhesin y la movilidad. Despegamiento del sustrato : para las clulas adherentes , esta fase de dao celular sigue de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradacin parcial

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o la disrupcin del citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la clula. Lisis : es el caso ms extremo, la clula entera se rompe, se pierde la integridad de la membrana y la clula se puede hinchar por la absorcin de lquidos extracelulares y finalmente estalla. ste es un caso extremo de dao celular, no todos los virus causan este efecto, aunque pueden causar otros efectos citopticos. La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un mtodo para liberar nuevas partculas vricas de una clula infectada. Fusin de membranas : las membranas de las clulas adyacentes se fusionan originando una masa de citoplasma que contiene ms de un ncleo : sincitio, o dependiendo del nmero de clulas que se fusionan : clula gigante. Las clulas fusionadas tienen vida corta y luego se lisan. Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traduccin de algunos ARNm vricos es resstente a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la expresin de genes vricos a expensas de mensajeros celulares. Cuerpos de inclusin : son reas de la clulas en las que se han acumulado componentes vricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones celulares consisten en acmulos cristalinos de partculas vricas. No est claro si estas estructuras daan a la clula, pero frecuentemente estn asociadas a virus que causan lisis celular , como los herpesvirus. Apoptosis : la infeccin vrica puede activar la apoptosis ( muerte clular programada ), mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos. INMUNODIAGNSTICO ENSAYO INMUNOENZIMTICO La prueba de inmunoabsorcin ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas (EIAs) en la cual el antgeno o anticuerpo est adsorbido a una fase slida , constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnstico microbiolgico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya que , la enzima acta catalticamente y de forma objetivable , por lo que es posible medir la densidad ptica de la coloracin final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-istopos utilizados en radioinmunoensayo (RIA). En la actualidad estas pruebas estn tomando un rol importante en los laboratorios mdicos y de investigacin, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificacin de muchos virus a nivel de gnero. Estn reemplazando a los RIA en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminacin y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos . Debido a su objetividad, facilidad de automatizacin y posibilidad de trabajar con un gran nmero de muestras, estos ensayos inmunoenzimticos estn

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reemplazando parcialmente a tcnicas en el laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinacin. Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en funcin de cmo se combinen : el analito (antgeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antgeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos que permiten valorar las uniones antgeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubacin, con la adicin posterior de un sustrato. Fundamento La prueba de ELISA se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interaccin de un sustrato cromognico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antgeno en la fase slida, como una capa de captura. Despus de la reaccin del antgeno con el suero del paciente, la capa de deteccin puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase especfica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase especficos Dentro de los parmetros fisicoqumicos que intervienen en la unin del antgeno con el anticuerpo tenemos: Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de tomos en la superficie de las molculas generado por un cambio elctrico. Son fuerzas dbiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande. Fuerzas electrostticas originadas por la fuerza de atraccin entre molculas de carga inica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amonaco)que reaccionan vidamente con el grupo COOH- (grupo carboxilo). Uniones por puentes de hidrgeno son de carga energtica baja entre tomos electropositivos de hidrgeno y tomos electronegativos de oxgeno o nitrgeno. Metodologa Los mtodos de ELISA se dividen en : ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Se debe incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado, o bien se le ha aadido). ELISA indirecto Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el mtodo directo, los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antgeno, y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpo secundarios por cada primario. ELISA sndwich : ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la

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muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo. Fijacin del Antgeno a la fase slida : La reaccin inmunolgica tiene lugar en la fase slida, sta puede ser de plstico, vidrio o nitrocelulosa. Los ms usados son los de plstico, dentro de stos los de poliestireno gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados. El antgeno diluido en buffer es adherido a la fase slida por enlaces electrostticos entre los sitios activos del plstico y regiones de la protena responsables de esta interaccin. El buffer puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4. La estabilidad de los enlaces electrostticos, el tiempo de incubacin y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar prdidas de las protenas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo. Reaccin con anticuerpo : La reaccin del antgeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiolgicas : pH 7,4, temperatura de 37C y concentracin salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas. Molculas no especficas en solucin pueden adherirse a la fase slida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reaccin un exceso (0,1% a 1%) de una protena inerte para que compita eficientemente por los sitios de unin inespecficos en la fase slida. Esta protena puede ser seroalbmina bovina, casena, suero entero, gelatina u otros. Tambin es necesario aadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno sorbitn { surfactante } )para evitar uniones inespecficas de macromolcula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilucin y de lavado. Adicin del conjugado enzimtico : El conjugado enzimtico se prepara por unin covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rbano (Horseradish peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la seleccin de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo. Las condiciones de reaccin entre el conjugado y el complejo formado por la unin antgeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior. Adicin del sustrato:

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La eleccin del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato perxido de hidrgeno produciendo oxgeno que oxida a otros compuestos cromgenos tales como: Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidacin genera un producto de color azul oscuro. o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja a pardo oscuro. cido azino-(3-etil)-benzo-sulfnico (ABTS) : la oxidacin genera un producto que puede variar del color al azul. La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reaccin. La lectura se realiza en un espectrofotmetro a 405 nanmetros PRUEBA RPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA Uno de los pilares bsicos de la lucha contra el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es la deteccin precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas precoces de la infeccin, as como intentar modificar las conductas que favorecen la transmisin del virus a otras personas. Descripcin de las pruebas de deteccin rpida del VIH Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mnimo y generan un resultado en menos de 15 minutos en comparacin con la prueba estndar de cribado con tcnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o das. Tanto la prueba de deteccin rpida como el EIA detectan anticuerpos especficos del VIH. Se han establecido los diferentes criterios que debera cumplir una prueba de deteccin rpida del VIH: Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%) Ser reproducible Ser fcil de aprender, realizar e interpretar Ser precisa Ser de fcil almacenamiento No requerir equipamiento adicional No tener carcter invasivo

Durante la realizacin de las pruebas de deteccin rpida, se recomienda que los pacientes reciban informacin y asesoramiento sobre la enfermedad y la infeccin. Si la prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el perodo ventana de exposicin (primeros 3 a 6 meses de post exposicin) . Si el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con tcnicas de EIA y con la prueba Western blot . Los resultados indeterminados se deberan repetir en un mes. La mayora de las pruebas de deteccin rpida del VIH se comercializan con un equipo o kit que

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incluye todo lo necesario para realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (ms fcil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan visualmente. Capacidad diagnstica de las pruebas de deteccin rpida del VIH Es difcil realizar una comparacin de la capacidad diagnstica de las numerosas pruebas de deteccin rpida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de accin ms frecuentes en estas pruebas son la aglutinacin, la inmunoconcentracin (flow through), la inmunocromatografa (lateral flow) y la fase slida (solid phase). El mtodo de produccin y de combinacin especfica de los antgenos vara entre las distintas pruebas de deteccin. La mayora incluye uno o ms antgenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antgeno core (p24). Actualmente, existe controversia en la duracin del perodo ventana entre 3 6 meses. En general, se recomienda el alta mdica a los 6 meses despus de una actividad de riesgo de infeccin. PRUEBA DE INMUNOFIJACIN DE DOT-BLOT Prueba para la deteccin del VIH en la cual los antgenos virales se encuentran unidos a una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plstico. Los antgenos utilizados son recombinantes o sintticos. Se utilizan conjugados de antiinmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adicin del sustrato permite la visualizacin del color en el papel. Su ventaja y principal indicacin es la posibilidad de identificacin entre los dos tipos de virus . Las pruebas son rpidas y fciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 15 minutos. TCNICAS DE INOCULACIN EN ANIMALES DE LABORATORIO Este fue el primer mtodo que se utiliz para el aislamiento de virus , demostrndose la reaccin positiva por la muerte y los cambios histolgicos o clnicos. Existen factores negativos en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una infeccin cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia de enfermedades vricas latentes en los animales de experimentacin que pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculacin con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretacin de los resultados . Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , as como la va de inoculacin, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos respecto a un tipo de clulas . El animal ms utilizado es el ratn de menos de dos das de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnstico siendo el que proporciona el principal mtodo de aislamiento de los virus Coxsakie A. el ratn lactante se utiliza en virologa para : Inocular por va intracerebral (0,06 ml) : Herpes simple Inocular por va subcutnea (0,06 ml) : infeccin por Coxsakie, Arbovirus y Reovirus Inocular por va intradrmica (0,02ml) virus Coxsakie el ratn adulto se utiliza : Inocular por va intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de encefalitis Inocular por va intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria

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 Inocular por va intranasal ( 0,05 ml): Influenza A,B y C Inocular por va intraperitoneal o intracerebral para obtencin de inmunosueros. la cobaya se utiliza para : Inocular por va intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria Inocular por va intraperitoneal o intramuscular para obtencin de inmunosueros hasta un ml. el conejo se utiliza para : Inocular por va intradrmica Herpes tipo B Inocular por va intradrmica para la obtencin de vacunas Inocular por va intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o intraperitoneal hasta 2 ml para la obtencin de inmunosueros. Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodn. Reactivos : alcohol etlico de 70, ter etlico, solucin de inoculacin Tcnica : a) Anestesiar al ratn con un algodn empapado de ter etlico colocado en el interior de un embudo invertido , introducir en l el ratn. b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solucin de inoculacin en el lugar de inoculacin que puede ser : IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutnea, ID intradrmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal. Interpretacin de los resultados : Se manifiesta la infeccin en el ratn ,se observar sta por la sintomatologa , la muerte o la elevacin del ttulo de anticuerpos. Se observar durante dos o ms semanas el animal inoculado

TCNICAS DE INOCULACIN EN EMBRIN DE POLLO Existen varios mtodos de inoculacin de huevos frtiles , dependiendo del virus que desea cultivarse. Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38C ( dependiendo del virus). Antes de proceder a la inoculacin de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con alcohol. Inoculacin corio-alantoidea

Tomado de Microbiologa Granados 1aedicin

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 Edad del embrin : 10 a 12 das Mtodo : Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lmpara de 100 vatios . sta tcnica llamada de iluminacin permite apreciar los vasos sanguneos del embrin , la cmara de aire con claridad a travs de la cscara. Con un lpiz se delimitar la cmara de aire as como tambin el punto en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cmara de aire artificial de la siguiente manera: a) Quitar un pequeo tringulo de cscara de encima del corio-alantoides sin daar la frfara b) Utilizando una aguja de diseccin incidir cuidadosamente la frfara sin daar la membrana corio-alantoidea que est debajo. c) Realizar una pequea abertura en la cmara de aire y valindose de un gotero realizar una succin suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corioalantoidea se separa de la frfara efectundose entonces la inoculacin a travs de la hendidura de la misma. Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 das examinando diariamente Inoculacin en saco amnitico Edad del embrin: 7 a 14 das Mtodo Proceder como para la inoculacin corio-alantoidea. Cuando la membrana corioalantoidea aparezca se aumenta el tamao del orificio . A travs de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas estriles se extrae una parte de la membrana amnitica. Inocular en la cavidad amnitica, sellar e incubar. Inoculacin de saco alantoideo Edad del embrin : 10 das Mtodo Se procede como en la inoculacin corio-alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular directamente en la cavidad alantoidea . Con el agujero realizado en la cmara de aire se evita el reflujo del inculo motivado por la presin. Sellar e incubar. Inoculacin en saco vitelino Edad del embrin: 3 a 8 das Mtodo Se efectuar la inoculacin directa a travs de la cmara de aire, puesto que a la edad sealada el saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar. Examen Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodn empapado en desinfectante. Utilizando tijeras y pinzas estriles eliminar la cscara de encima de la cmara de aire. Extraer la membrana interna (frfara) y colocarla en agua destilada estril. Examinarla para apreciar lesiones. La identificacin de virus aislados en huevos puede hacerse por tcnicas de neutralizacin o de fijacin del complemento con sueros especficos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular producido por el virus como la formacin de placas o muerte del embrin, como en el caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los hemates. Las pruebas de fijacin de complemento tienden a dar reacciones de grupo ms que especficas de tipo.

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Tomado de Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica Baker

PRCTICA N 14 REVISIN OBJETIVO Fortalecer el conocimiento de los procedimientos desarrollados a lo largo de las prcticas de laboratorio de microbiologa.

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Fuentes de Informacin Arenas R. Micologa Mdica Ilustrada.2 edicin.2005. Editorial Mc Graw Hill Bailey & Scott. Diagnstico Microbiolgico .11 edicin 2004.Editorial Mdica Panamericana. Granados R. Microbiologa Tomo II.2 edicin.2003.Editorial Thomson Paraninfo Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiologa Mdica 18 edicin 2005 Editorial Manual Moderno Koneman Diagnstico Microbiolgico 6 edicin .2008.Editorial Mdica Panamericana Murray P. Microbiologa Mdica.5 edicin 2008.Editorial Elsevier Sherris Microbiologa Mdica. 4 edicin.2005.Editorial Mc Graw Hill Baker F.J, Breach M.R. Manual de Tcnicas de Microbiologa Mdica.1990.Editorial Acribia Cann A Principios de Virologa Molecular. 4 edicin.2005. Editorial Acribia Organizacin Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional de la Organizacin Mundial de la Salud. Garanta de calidad en el diagnstico serolgico de la Infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana . Publicacin N 42 Ministerio de Sanidad y Poltica Social. Catalua .Espaa. Prueba de deteccin rpida de la infeccin por VIH. AATRM Nm. 2007/3 Cristhopher Donats Cruz Malpica. Estandarizacin de la prueba de Ensayo Inmunoenzimtico para la deteccin de anticuerpos IgG en sueros humanos para el virus Phlebotomus fever. Tesis para optar el ttulo de qumico farmacutico. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioqumica 2001 http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.htm Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Procedimientos en Microbiologa Clnica. www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm Moura AC Diversidade gentica, densidade populacional e potencial de promoo de crescimento de rizobactrias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestra].Bahia :

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Universidade Federal do Renccavo ; 2007. Chaves L Aspectos bioqumicos e moleculares de bacterias isoladas de terra preta antropognica (TPA) na regio da Amaznia Brasileira.[Tesis Maestra] Piracicaba : Universidade de So Paulo; 2007

GLOSARIO DE MICROBIOLOGA cido-alcohol resistencia: Propiedad de las especies del gnero Mycobacterium, por la que las clulas teidas con carbolfucsina caliente no se decoloran al tratarlas con alcohol cido. cido desoxirribonucleico (ADN): Gran molcula de cido mucleico que se encuentra principalmente en losc cromosomas de los ncleos celulares y que es portadora de la informacin gentica de las clulas vivas. cido nucleico: Polmero de nucletidos. Vase cido desoxirribonucleico y cido ribonucleico. cido ribonucleico (RNA): Polmero de nucletidos unidos por un esqueleto de fosfato-ribosa. Interviene en la sntesis de protenas. Acidfilo: Organismo que crece de manera ptima en un medio cido. Caracterstica de la clula u organismo celular que tiene afinidad por los colorantes cidos. Adherencia: Propiedad de las bacterias que les permite adherirse (pegarse) a las superficies de la clula hospedadora. cido desoxirribonucleico (ADN): Gran molcula de cido nucleico que se encuentra principalmente en los cromosomas de los ncleos celulares y que es portadora de la informacin gentica de las clulas vivas. 3: Marca el final de una cadena de una molcula de ADN. El trmino 3 se refiere a la posicin de la base relativa a la molcula de azcar en la armazn del ADN. 5: Marca el principio de una cadena de una molcula de ADN. El trmino 5 se refiere a la posicin de la base relativa a

la molcula de azcar en la armazn del ADN. cADN : biblioteca de secuencias de ADN ADN mitocondrial: Contiene 16,569 bp de ADN, adems de 37 genes que codifican algunas protenas y molculas de ARN relacionadas con la funcin mitocondrial. Este material se hereda por va materna. Cuando se forma el cigoto, el espermatozoide aporta su genoma, pero no su genoma mitocondrial. El ADN mitocondrial lo aporta el ovocito Aerobio: Microorganismo que vive y crece en presencia de oxgeno libre. Aerobio estricto: Microorganismo que no puede crecer en ausencia de oxgeno. Aerobio facultativo: Microorganismo capaz de crecer en condiciones anaerobias pero que se desarrolla mas rpidamente en un media aerobio. Agente antimicrobiano: Producto que mata o inhibe el desarrollo de microorganismos. Agudo: En relacin a una enfermedad o sntoma que comienza bruscamente con una intensidad marcada para desaparecer despus de un perodo relativamente corto de tiempo. Amiloide. Que se vuelve azul con el yodo Anlogo: Sustancia qumica idntica a otra, excepto en un grupo funcional. Anticuerpos: Protenas globulares que aglutinan al antgeno. Poseen 2 sitios iguales para la fijacin del antgeno. Se compone de 2 cadenas iguales livianas L de 220 aminocidos, (Low -molecular weight- = bajo peso molecular) y 2 cadenas pesadas H de 440 aminocidos, (High molecular weight = Alto peso molecular).

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Anaerobio: Microorganismo capaz de vivir y crecer en condiciones anaerobias. Anaerbico: Entorno carente de oxgeno. Generalmente se refiere a un hbitat microbiano. Anafilaxia (choque anafilctico): Reaccin alrgica violenta causada por una reaccin entre un antgeno y un anticuerpo. Antibitico: Agente qumico producido por un organismo que es daino para otros organismos. Antgeno: Sustancia que interacciona con un receptor de las clulas T o con una inmunoglobulina. pice o apical. Extremo superior o punta de una cosa.. Argenta. Plateada. Asca : Clula madre de los hongos Ascomycetes : Donde se encuentran las esporas. Asexual : Reproduccin que no requiere la unin de los ncleos. Atenuacin : Seleccin de cepas de un microorganismo patgeno que no son virulentos, pero que mantiene intacta su capacidad inmunitaria. Bacteria : Microorganismo unicelular de la especie Esquizomicetos .El gnero presenta variedades morfolgicas y sus componentes pueden ser alargados (bacilos), redondeados (cocos), o en forma de coma (vibrios). La naturaleza de la enfermedad que producen es diferente en cada bacteria. Basidio : Clula ms bien ancha y corta que lleva en su exterior a las esporas de algunos hongos superiores. Basidioesporas : Esporas propias de los basidiomycetes. Basidiomycetes : Hongo superior cuyas esporas se sitan en la parte exterior de los basidios.

Basfilos : Producen y almacenan: histamina, factor quimiotctico eosinfilo anafilctico, y otras sustancias. Su funcin aparente es la hipersensibilidad rpida, como el asma alrgica. La reagina IgE se une fcilmente a la membrana y si un antgeno especfico se aglutina a este complejo se libera histamina, heparina y otros mediadores. Tambin tienen un rol en las alergias por contacto. Betalactamasa : Antibiticos del tipo de la penicilina, formados por una anillo betalactmico heterocclico, con cuatro tomos. Bactericida : Sustancia antimicrobiana con capacidad para matar bacterias. Bacteriemia : Aparicin transitoria de bacterias en sangre. Bacterifago :Virus que infecta clulas procariticas. Bacteriosttico: Sustancia con capacidad para inhibir el crecimiento bacteriano, pero sin matar a la bacteria. Brote: Aparicin de gran nmero de casos de una enfermedad en un corto periodo de tiempo. Cpside: Cubierta proteica de un virus. Carcingeno: Sustancia que inicia la formacin de un tumor. CD4 Clulas T molculas superficiales, cooperadoras/inductoras Clula: Unidad fundamental de los seres vivos. Con excepcin de la clula bacteriana, todas las dems poseen ncleo, citoplasma y diversos orgnulos que estn rodeados por una membrana citoplasmtica. Clulas B: Linfocitos dependientes de la mdula sea; precursoras de las clulas plasmticas, sintetizan y liberan inmunoglobulinas. Clulas cooperadoras: Basfilos, eosinfilos y mastocitos. Clula Gram negativa: Clula procaritica cuya pared celular contiene relativamente poco peptidoglicano pero que tiene una membrana externa

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compuesta por lipopolisacrido, lipoprotena y otras macromolculas complejas. Relativo a la coloracin rosada de la contratincin que se utiliza para teir microorganismos. Clula Gram positiva: Clula procaritica cuya pared celular est formada principalmente por peptidoglicano y que carece de la membrana externa de las clulas Gram negativas. Relativo a la coloracin, clula que conserva el color violeta de la tincin que se utiliza en el mtodo Gram para tedir microorganismos Clulas T: linfocitos dependientes del Timo, responsables de la inmunidad celular. Clamidospora : Clula hifal, encerrada por una gruesa pared celular. Claviforme : En forma de clava. Colonia: Grupo de microorganismos de un cultivo procedentes de una sola clula. Tienen diferentes caractersticas morfolgicas de tamao, forma y color. Columnela : Parte central estril de la gleba de muchos Gasteromycetes y Myxomicetes que en forma de columna sale de la base del exoperidio. Congnita, anomala: Anomala generalmente estructural presente en el momento del nacimiento que puede ser heredada , adquirida durante la gestacin u ocasionada en el parto. Congnita, enfermedad: Defecto fsico o mental presente en el momento del nacimiento que puede ser heredada, o causada por la influencia de factores ambientales durante el embarazo. Conidio : Espora de origen asexual que no se encuentra en el himenio. Conidiforo : Hifa que llevan los conidios. Contagio: Transmisin de una enfermedad, se refiere sobretodo a infecciones.

Contagioso: Que es transmisible. Por contacto directo o indirecto. Crateriforme : Que tiene forma de crter. Crnico: Enfermedad o proceso que se desarrolla lentamente y persiste por largo tiempo, con frecuencia toda la vida. Dehiscente : Que tiende a abrirse por s solo. Desinfectante: Agente que mata microorganismos, pero que puede ser tambin daino para los tejidos humanos. Dextrinoide : Se dice de las esporas que con un reactivo yodado toman coloracin rojiza. EBV: Epstein-Barr Virus, = VEB en espaol = Virus de Epstein Barr. Eosinfilos: Clulas producidos en la mdulas sea , pueden aumentar su produccin si las clulas progenitoras son estimuladas por la interleucina 5 segregada por los linfocitos T. Su nivel aumenta en las infestaciones por parsitos, en reacciones alrgicas, en el asma y en alguna patologa del miocardio. Endmico (a): En relacin a una enfermedad o a un microorganismo propio de una zona geogrfica o una poblacin. Endocitosis: Proceso en el que una partcula es introducida intacta en una clula animal. La fagocitosis (incorporacin de cuerpos slidos) y la pinocitosis (incorporacin de sustancias lquidas) son dos tipos de endocitosis. Enfermedad de transmisin sexual (ETS): Enfermedad que se transmite por contacto sexual. Entrico: Referido al intestino. Enterotoxina : Toxina que afecta al intestino Epidmico (a): Que afecta a un nmero significativamente grande de personas al mismo tiempo. Se refiere tambin a la enfermedad que se transmite rpidamente en una poblacin que puede oscilar entre un rea demogrfica delimitada o cerrada.

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Epidemia: Enfermedad que se presenta al mismo tiempo en una gran cantidad de individuos de una poblacin. Epidemiologa: Estudio de la incidencia, distribucin y causa de las enfermedades en el hombre. Espora : Corpsculo reproductor de las plantas criptogmicas. Esporangio : Estructura a modo de saco cuyo contenido protoplasmtico se convierte en gran cantidad de esporas. Esporocitos : Recipiente hueco: estructura que contiene las esporas. Esporulacin : Accin y efecto de esporular: producir esporas. Esterigma : Pequea rama o estructura hifal que sostiene un esporangio, un conidio o una basidispora. Exotoxina: Toxina que se libera al exterior de la clula. Fagocito Clula capaz de rodear engullir y digerir microorganismos y detritus celulares. Los macrofagos y las clulas del sistema reticuloendotelial son fagocitos no circulantes. Los leucocitos y los macrfagos libres circulan en la sangre. Falso negativo: Resultado incorrecto de una prueba diagnstica que indica equivocadamente la ausencia de la enfermedad. Falso positivo: Resultado incorrecto de una prueba diagnstica que indica la existencia de la enfermedad. Fiebre: Elevacin anormal de la temperatura corporal por encima de 37 C causada por una enfermedad. Filiforme : Que tiene forma o apariencia de hilo. Fotofobia: Sensibilidad ocular anormal a la luz. Fungemia: Presencia de hongos en la sangre.

Fngico : Relativo a los hongos. Fusiforme : En forma de huso. Gangrena: Muerte o necrosis de un tejido como consecuencia de isquemia, o invasin bacteriana, afecta con mayor frecuencia las extremidades, pero puede desarrollarse tambin en rganos internos (intestino, vescula biliar). Germen: Cualquier microorganismo, especialmente los patgenos. Hbitat. Lugar donde vive. Hemlisis : Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una colonia desarrollada en una placa de agar sangre de carnero. Hemlisis alfa : Las colonias estn rodeadas por una destruccin parcial de los eritrocitos y prdida de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en una coloracin verde (hemlisis incompleta). Hemlisis beta : Las colonias estn rodeadas por una zona de hemlisis completa (clara, transparente) debido a una destruccin total de los eritrocitos Hemoptisis: Expulsin de sangre de la vas respiratorias con la tos. Hemorragia: Prdida externa o interna de una gran cantidad de sangre en un perodo corto de tiempo. Hialina. Transparente como el vidrio o parecido a l. HTLV-1: Retrovirus asociado a la leucemia de clulas T .Endmico en el Caribe, Japn y Sur-este USA. Ictericia: Coloracin amarillenta de la piel, mucosas y conjuntivas ocasionada por aumento de la bilirrubina. Incubacin : Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo y multiplicacin. Infeccin : Invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped, pudiendo progresar hacia una

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enfermedad. El trmino enfermedad infecciosa se aplica cuando aparecen signos y sntomas como resultado de la infeccin. Infeccin intrahospitalaria (IIH) : Infeccin que se adquiere luego de 48 horas de permanecer en el establecimiento de salud y que el paciente no portaba a su ingreso. Se consideran tambin a aquellos procesos infecciosos que ocurren hasta 30 das luego del alta. Infeccin por gotitas: Infeccin adquirida por inhalacin de microorganismos patgenos suspendidos en las partculas de lquidos procedentes de una persona infectada a travs del estornudo o la tos. Inmunocompetente: Persona que presenta un estado ptimo de su inmunidad, celular y humoral que le permite resistir a un proceso infeccioso. Inmunodeficiente-inmunodeprimido: Persona que en el que existe un estado anormal del sistema inmunitario, por lo que la inmunidad humoral o celular o humoral son inadecuadas y disminuyen la resistencia a las infecciones. Inmunidad celular: Respuesta inmunitaria con ausencia de anticuerpos, se necesitan linfocitos activos. Inmunidad humoral: Respuesta inmunitaria caracterizada por la sntesis y liberacin de anticuerpos. Inculo: Alicuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo. Limpieza: Es la remocin mecnica de toda materia extraa con el objeto de disminuir el nmero de microorganismos. Se realiza a travs del arrastre mecnico, sin embargo no se asegura la eliminacin de stos. Linfocitos :Clulas bsicas de la inmunidad adquirida. Macrfago : Clula fagoctica del sistema reticuloendotelial. Mcula : Mancha.

Medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento y multiplicacin de laa bacterias in vitro, que puede encontrarse en estado slido, semislido o lquido. Meningitis : Infeccin o inflamacin de las meninges que son las membranas que recubren el cerebro y la mdula espinal. Metabolismo: Proceso de degradacin y biosntesis enzimtica que tiene lugar dentro de una clula y por medio del cual se mantienen las actividades nutricionales y funcionales. Micelial : Relativo al micelio o propio de l. Miclico : Perteneciente o tocante al micelio. Micelio : Aparato nutritivo o talo de los hongos. Parte vegetativa del hongo formada por el entrelazamiento de las hifas. Micosis : Infeccin causada por un hongo. Microaeroflico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensin del 5% de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno. Microorganismo viable: Es aquel que es capaz de reproducirse. Mitgeno : Sustancia que induce la mitosis. Monocitos : Leucocito mononuclear producido en la mdula sea, fagoctico, en trnsito por sangre perifrica. Tienen receptores Fc. Los monocitos con los macrfagos componen el sistema mononuclear fagoctico del sistema reticuloendotelial. Segn el estmulo pueden funcionar como clulas citotxicas. Necrosis : Muerte de una porcin de tejido como consecuencia de una enfermedad o lesin. Nucletidos, bases: Adenina (A),Timina (T),Guanina (G), Citosina (C)

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Oncogn : gen que estimula la reproduccin celular. Oxidacin: Reaccin qumica que implica la prdida de electrones de los tomos. Mezcla de una sustancia con el oxgeno y un aumento en la valencia. Paciente : Persona que recibe un cuidado sanitario, que esta hospitalizado o enfermo. Plsmido : ADN de forma circular, situada fuera del cromosoma, a veces porta informacin gentica y se replica de modo independiente. Patgeno : Microorganismo capaz de producir enfermedad. Polimorfa: Que puede tener varias formas. Predisposicin: Estado de una persona de ser susceptible a determinado estmulo. Prevalencia : Nmero de casos nuevos de una enfermedad durante un tiempo determinado. Reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su conservacin y almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado. Registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos. Riesgo : Estado de vulnerabilidad de una persona o una poblacin frente a una enfermedad. Riesgo, factor de : Cualquier factor (ambiental o fisiolgico) que produce en una persona o poblacin un estado de vulnerabilidad ante un suceso nocivo (enfermedad-infeccin). Secuencia : Orden que siguen las bases de nucletidos en una cadena de ADN. Septicemia : Infeccin sistmica que se caracteriza por la aparicin de patgenos en sangre circulante que provienen de

una infeccin localizada en cualquier lugar del organismo. Siembra primaria : Inoculacin de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de enriquecimiento. Shock : Estado fisiolgico anormal que se caracteriza entre otras por disminucin del gasto cardaco, aumento de la frecuencia cardaca, disminucin de la presin arterial. Es la primera fase de la reaccin del organismo frente a una lesin traumtica. Shock sptico : Shock causado por la septicemia debido a la liberacin de endotoxinas bacterianas que estn en la corriente sangunea Subcultivo : Pasaje de bacterias viables derivadas de otro cultivo a un medio de cultivo nuevo. Traduccin : Formacin de una secuencia de aminocidos a partir de una secuencia de bases de una molcula de ARNm. Transcripcin : Transferencia de la informacin gentica del ADN por medio de la sntesis de una copia de ARN de una plantilla de ADN. Translocacin : Transferencia de un fragmento de un cromosoma a otro, y tambin el desplazamiento del ARNm por el ribosoma durante la traduccin. Traduccin : Segundo paso de la expresin gentica: es la sntesis de protenas a partir de un molde plantilla de mARN, donde la secuencia de aminocidos est determinada por la informacin contenida en el mARN UFC: Unidad formadora de colonia. Vector: Portador capaz de transmitir una enfermedad .Los vectores biolgicos son por lo general artrpodos en los cuales el microorganismo infectante completa su ciclo vital.

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