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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Informe de Prácticas: Micología General
ASIGNATURA : Micología General DOCENTE : MSc. Gianina Llontop Barandiarán ALUMNO : Rómulo Aycachi Inga CICLO : 2006 - II

Lambayeque, noviembre de 2006.

PRÁCTICA Nº 01: MEDIOS DE CULTIVO
I.-INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar las diferentes especies en este caso de hongos, para luego proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios. En los medios de cultivo empleados para la propagación de microorganismos deben prevalecer condiciones adecuadas de humedad. Por otro lado, un medio de cultivo debe tener una fuente de energía, de carbono y de nitrógeno. De igual manera un pH (ligeramente ácido) y una temperatura adecuada en un medio de cultivo son extremadamente importantes para el crecimiento de los hongos. Un medio de cultivo adecuado es aquel que contenga los elementos nutricios esenciales en concentraciones adecuadas, la cantidad necesaria de sal y el adecuado volumen de agua, se encuentra exento de sustancias inhibitorias del organismo que se va a cultivar, que tenga la consistencia deseada, el pH conveniente para el metabolismo del cultivo, y ser estéril. Los medios de cultivo deben siempre almacenarse en atmósfera fría y húmeda (refrigeración) para evitar su deterioro y su deshidratación. II.- OBJETIVO El propósito de la presente práctica es conocer las fórmulas de los medios de cultivo y los materiales más utilizados en micología clínica. III.-MATERIALES  Para medios de cultivo Insumos (agar, agua destilada, glucosa, peptona, etc.)

 Para materiales empleados: Placas de Petri Tubos de ensayo Matraz

-

Probeta Balanza analítica Anzas, bisturí Mechero bunsen

IV.-PROCEDIMIENTO Fórmula de algunos medios de cultivo para hongos: Agar Sabouraud glucosado: Glucosa...................... 2.0 g Peptona...................... 10 g Agar........................... 20 g Agua destilada............. 1000 ml Se mezclan y se lleva a ebullición. pH: 5.6 –6.5. Este es el medio más utilizado, es el medio clásico para el aislamiento de todo tipo de hongos. Caldo glucosado: Peptona……….1.0g Glucosa………. 2.0g Agua destilada... 100ml Medio de conservación: Agar........................... 20 g Peptona...................... 30 g Agua destilada............. 1000 ml Medio arroz: Arroz........................... 1 g Agua destilada............. 2 ml Estimula la esporulación del hongo. Se recomienda de preferencia utilizar un arroz superior. Evita el pleomorfismo de los dermatofitos. Agar almidón- arroz: Arroz........................... 2.0 g Agar........................... 2.0 g Agua destilada............. 1000 ml Permite conservar cepas por un largo periodo de tiempo. Su propósito es reactivar cepas deshidratadas. Es un elemento para identificación de levadura del genero Candida.

Se hierve el arroz por 5 min, luego, colar en una gasa y en el líquido agregar agar y se reparte en tubos de 3ml por cada uno y se lleva al autoclave. Ayuda a estimular la producción de clamidosporas, blastosporas y pseudomicelio de C. albicans. Agar harina de maíz: Agar........................... 20 g Harina de maíz............. 62 g Glucosa............. ......... 20 g Agua destilada............. 1000 ml Se somete a baño maría (60ºC por 30 minutos) la harina de maíz con agua, luego se filtra con un gasa, y el filtrado se mezcla con el agar y la glucosa. Este medio es utilizado en microcultivo.

Agar Papa dextrosa: Papa ........................... 200 g Glucosa....................... 20 g Agar........................... 20 g Agua destilada ............. 1000 ml

Se pela las papas y se corta en trozos pequeños, hervir en 500 ml de agua por 30 minutos, filtrar y filtrado obtenido se mezcla con el resto de ingredientes. Este medio sirve para estimular la esporulación y para conservación de cepas.

Caldo base (para zimogramas): Peptona ........................... 1.0 g Cloruro de sodio................ 0.5 g Extracto de carne............... 0.3g Agua destilada............. 100.0 ml

Ajustar

a

pH

7,

agregando

el

indicador rojo de fenol (0.02g.). Luego agregar un carbohidrato en solución acuosa al 10%. Este medio sirve para identificar según a al su través género poder del Candida fermentativo Zimograma.

Reactivos: KOH 10% : reactivo que permite disgregarlas celulas epiteliales Azul de algodón: se usa en el examen directo de cultivo Azul de metileno: se usa cuando se sospecha de pitiriacis versicoides Azul de metileno ………...3g Alcohol …………… ….30.0ml Agua destilada ………. 70.0ml Antibiótico: Cloranfenicol: se usa para medio agar saboroud cloranfinicol ……………. 250mg Alcohol ………………… 10ml Una vez preparado se coloca 2 ml en un litro de agar saboroud,el cloranfenicol se especialmente para que elimine las bacterias y esto permite la proliferación del hongo esto porque la muestra viene mixta. A más concentración se usa menor cantidad de antibiotico . Se usa porque es de amplio espectro tanto en bacterias gram positivas como gram negativas.

V. Resultados:
Preparación De Agar Sabouraud Glucosado

Glucosa

Peptona

Agar

Agua destilada

Matraz con ingredientes pesados en balanza

Dejar enfriar y ajustar el pH

Matraz taponado con algodón y cubierto con una tapa de papel

Llevar a autoclave y luego a estufa para control de esterilidad

VI.-Conclusiones:
- Se reconoció las fórmulas más utilizadas para la preparación de medios de cultivo así como los materiales más utilizados en la Micología clínica.

VII.-Referencias:
-

Facultad de Ciencias Biológicas (1987). Medios de Cultivo en Microbiología: Manual de Laboratorio. 3º edic. Edit. Trilcem S.A. Lima.

PRACTICA No 02: TOMA DE MUESTRA
I. Introducción:

Las tomas de muestra son de suma importancia para el diagnóstico por examen directo y cultivo como aislamiento primario. Para realizar una buena toma de muestra, se deben tener en cuenta las sgtes. consideraciones: 1. Se debe preguntar al paciente si es que esta recibiendo tratamiento antimicótico. 2. Si la respuesta es positiva el tratamiento debe ser suspendida por los menos 5 días. 3. Para el caso de dermatofitosis y micosis subcutánea desinfectar la zona con alcohol de 70%. 4. La muestra debe ser representativa por Ejm: En Tiña corporis se debe conocer los síntomas y sospechar de micosis . Esto se evidencia por que los bordes son definidos y erimatosos rojisos. 5. La cantidad de muestra debe ser suficiente porque se usa para examen directo y para el cultivo. II. Objetivo: Adiestrar al alumno en las formas correctas de la toma de muestra para el examen directo y cultivo para aislamiento primario. III. Procedimiento:

Toma de muestra para dermatofitos Muestra: Escamas de piel. Examen directo : con KOH 10% Siembra: en agar soboraud glucosado Incubar: al medio ambientes de 2 a 3 semanas. Toma de muestra para pelo

Muestra: cabellos cortados de 1 cm con pinzas estériles. Extraer 8 a 10 cabellos de la raíz en placa petri estéril. Sembrar: en agar saboraud. Incubar: en el medio ambiente de 2 a 3 semanas. Toma de muestra para uñas Muestra: escamas del lecho ungeal o placa. Realizar raspado con hoja de bisturí de primer uso. Examen directo: con KOH 10% Sembrar: en agar saboraud. Incubar: en el medio ambiente de 2 a 3 semanas. Toma de muestra para Micosis Profundas 1. Mucosas: Mucosas oral: La muestra se obtendrá con hisopo o bisturí de punta roma ambos estériles. Mucosa vaginal: La muestra se obtendrá con hisopos una vez obtenida la muestra el hisopo es intrododucido en un tubo estéril .Si el procedimiento es largo colocarlo en solución salina fisiológica (2ml) y además la toma debe ser duplicada, esto porque con uno se hace examen directo y el otro sirve para el cultivo siembra. Siembra: Agar saboraud glucosado Incubación: en el medio ambiente por 2 semanas. 2. Muestras bronquiales: Muestra: Para obtener la muestra es necesario una desinfección bucal con lugol al 1% luego se procede a tomar el esputo para esto se debe hacer una inspiración profunda , fuerte y tociendo. Tomar la muestra en un frasco estéril. Examen directo: se colorea con KOH. Siembra: Agar saboraud glucosado. Incubación: A temperatura ambiente por 4 semanas. 3. Líquido cefalorraquídeo:

Realizar una Punción Lumbar: Tomar 5ml de líquido cefalorraquídeo y centrifugar a 3000rpm durante 30 minutos. Examen directo: a partir del sedimento, se realiza con KOH y tinta china. Siembra: Agar saboroud glucosado Incubación: durante 2 semanas e temperatura ambiente 4. Orina Muestra: tomar 40ml de orina y centrifugar a 3000rpm por 10 minutos. Examen directo: a partir del sedimento, se realiza con KOH y tinta china. Siembra: Agar saboraud glucosado. Incubación: todas las muestras deben incubarse a dos temperaturas a medio ambiente y a 37 oC para que el hongo este acostumbrado. Esto por 4 semanas. Toma de muestras para Micosis Subcutanea Muestra: Tomarla de abscesos cerradas, fístulas y úlceras. Desinfectar la zona con alcohol de 70%. Toma de muestra: Por punción y aspiración se inyecta 2ml de solución salina fisiológica y se aspira 4ml. De esta muestra se hace examen directo. Siembra: Agar Saboraud glucosado por duplicado. Incubar: A temperatura ambiente por 4 semanas Toma de muestra de Líquidos Corporales Sangre Líquido Ascítico Líquido Pleural

Punción aspiración: Se realiza con solución salina estéril mas anticoagulante esto para muestras no purulentas.

Punción drenaje : Se realiza en un tubo tapa rosca. Esto para muestras purulentas. Muestra purulentas: se realiza el examen directo y luego se siembra en agar saboraud. Muestra no purulenta: hay que centrifugar, la centrifugación tiene propósitos de concentración del hongo, se realiza un examen directo y luego se siembra. Para ambos casos por duplicado a temperatura ambiente y a 37oC por 4 semanas. IV. Referencias: Microsoft ® Encarta ® 2007. © 1993-2006 Microsoft Corporation. Reservados todos los derechos.

PRÁCTICA No3: DIAGNÓSTICO DE MICOSIS SUPERFICIALES
Pitiriasis Versicolor y Piedras
I. TOMA DE MUESTRA a) Pitiriasis versicolor: Muestra: Escamas de piel obtenidos por raspados con hojas de bisturí de primer uso en viales , placas o con cinta adhesiva. No observar limpieza Síntomas: Manchas pequeñas de color blanco a nivel del tronco anterior y posterior. b) Piedras: existe 2 tipos Muestra: Cabellos
-

Piedra blanca: Cabellos con nódulos de color blanco y fáciles de desprender pero con mayor frecuencia en barba y axila. Piedra negra: Cabellos con nódulos oscuros y difíciles de desprender.

-

Ambas muestra obtenerlas en placas ,viales o sobres estériles. II. OBJETIVO Diagnosticar la P. versicolor mediante examen directo y las Piedras por examen directo y cultivo. III. MATERIAL Escamas de piel - Pitiriasis Cabellos – Piedras

IV. PROCEDIMIENTO 1. Colocar las escamas de piel, pelos o cultivos en una gota de KOH depositada de antemano en el centro de portaobjeto. 2. Luego cubrir con laminilla y observar con objetivo de mediano aumento

3. Para el caso de Pitiriasis versicolor si se ha tomado la muestra con cinta adhesiva colocar esta en una gota de azul de metileno. V. RESULTADOS a) Pitiriasis versicolor Técnica de Diagnóstico Examen Directo. (escamas) Cultivos Tinción Gram Cultivo. M. furfur Células redondas agrupadas en racimos y fragmento cortos en micelio. Va a formar una colonia levaduriforme que con el tiempo se oscurece Se hace un gram y son gram positivos Van a formar colonias redondas y grandes. M. ovali. Células ovaladas con filamentos más largos Colonia levaduriforme, que con el tiempo oscurece. Son Gram positivos. Levaduras ovaladas pequeños gemantes.

y

b) Piedras Piedra Blanca Piedra Negra Examen Directo Veremos nódulos formados por artrosporas Nódulo formado por un tejido Cultivo. Examen directo de cultivo VI. Micelio artrosporado y cultivo hialino. OBSERVACIONES: o hialino. Formado por colonias organizado oscuro. levaduriformes, Colonia de color café oscuro. Y de crecimiento lento. Micelio tabicado y oscuro pigmentado.

aspecto seco y de color crema.

PRÁCTICA No4 Y No5: DIAGNÓSTICO DE DERMATOFITOS

I. Introducción Los dermatofitos son hongos que se nutren de la queratina de la piel, uñas y pelos, ocasionando enfermedades conocidas como dermatofitosis, estas, si no se tratan a tiempo pueden volverse crónicas y además son muy resistentes al tratamiento; de ahí la importancia de un diagnóstico temprano. II. Objetivo Diagnosticar dermatofitos por examen.directo.

III. MATERIAL Escamas de piel y de uñas. KOH al 10% Láminas Laminillas Mechero bunsen Microscopios

IV. PROCEDIMIENTO A) Condiciones para toma de muestra En el caso de que la persona esta en tratamiento suspender al menos cinco días antes. Eliminar infección secundaria por bacterias. Si se trate de escamas de piel realizar con hoja de bisturí de primer uso pero colectar de la periferia puesto que es la zona de la inflamación por ser sitio de mayor concentración de los hongos. Si es de uña, desinfectar la zona con alcohol al 70% y colocar algodón humedecido sobre la uña por 3 a 5 minutos para contribuir al reblandecimiento de placa ungueal, retirar la placa con ayuda de un cortaúñas y realizar la extracción con hojas de bisturí de primer uso o realizar el raspado del lecho ungueal Ambos muestra recepcionarse en placa de petri o vial estéril.

B) Examen directo Sobre una lámina porta objeto colocar la gota de KOH al 10% Con asa de siembra coger una pequeña cantidad de muestra y depositar sobre la gota, cubrir con laminilla Dejar actuar por unos minutos. Observar a objetivo de 40x ( para disolver la queratina con la luz).

V. RESULTADO La muestra procede de escamas de uña y es positiva se observará hifas tabicadas diferentes tanto en su longitud, forma y tamaño.

PRACTICA No6: MÉTODO DE ESTUDIO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE DERMATOFITOS: CULTIVO
I. Introducción Una vez que se ha determinado la presencia de hongos como hifas de una muestra se debe llevar a cabo el cultivo de los mismos para poder identificar el agente etiológico. No basta determinar la presencia de hongo en examen directo sino que el éxito en un 100% de la identificación radica en el cultivo. El cultivo puede ser negativo por las siguientes causas: 1. Se debe a una mala toma de muestra. No hubo desinfección de la zona No se tomo del lugar adecuado. No fue suficiente. No fue representativa.

2. Infección bacteriana asociados. 3. El paciente en el momento de toma de muestra estuvo siendo tratado. II. Objetivo Aislamiento primario de dermatofitos.

III. Material Escamas de piel o uña Agar sabouraud glucosado mas antibiótico Tubo estéril (15 x 150 mm) Alcohol absoluto Asa micológica Mechero bunsen

IV. Procedimiento Preparación del medio mas antibiótico

1. Disolver una cápsula de cloranfenicol de 250mg en 10ml de alcohol absoluto. 2. A un litro de medio disuelto y a una temperatura corporal agregarle 2ml de la solución del antibiótico al medio. 3. Distribuir el medio en tubos (15 x 150) y dejar enfriar en plano inclinado. 4. Comprobar esterilidad del medio en control de calidad (dejar 4 a 5 semanas) . Siembra de la muestra : Llevar a cabo la siembra por punto y esterilizar bien el asa Incubación: Se realizará a temperatura ambiente 25oC a 27oC durante 2 a 3 semanas. V. Resultados Al cabo del tiempo de incubación, una vez obtenida la colonia, realizar el estudio de las características macroscópica y microscópica.

Siembra del microcultivo

PRACTICA No7: ESTUDIO MACROSCÓPICO DE DERMATOFITOS
I. Introducción A partir de los cultivos obtenidos en Agar Saboraud glucosado se puede identificar las especies más frecuentes de los dermatofitos teniendo en cuenta las características macroscópicas del cultivo. Los dermatofitos son hongos hialinos que forman colonias de diferentes colores (blanquecinos, amarillentas, marronáceas ), pero si bien es cierto que las características de color de la colonia ayuda a la identificación , son las características microscópicas las que determinan este estudio. Para la identificación de dermatofitos es necesario contar con una colección de cepas de las especies más frecuentes para realizar dicha identificación por comparación. Para la conservación de la cepa se presentan dificultad debido al fenómeno del pleomorfismo el cual se presenta con la resiembra continua este fenómeno esta relacionado con la pérdida de de su capacidad de esporulación de la colonia , esta pierde su color y al final acaban formando un micelio compacto. Existen medios que evitan el pleomorfismo especialmente los que poseen baja concentración de azúcar. La técnica de Castellani que consiste en mantener una densa suspensión de hongos en agua destilada estéril a temperatura ambiente. Los tubos deben estar sellados a herméticamente. II. Objetivo Familiarizarse con las características culturales de las principales de los Dermatofitos para así describir las características culturales de las cepas obtenidas en un aislamiento primario. III. Material Cultivo puro o cepa.

IV. Procedimiento V. Llevar a cabo una resiembra de cepa en Agar papa dextrosa (PDA) para su conservación. Observar sus características culturales. Resultados:

DERMATOFITO
T. rubrum

Color
Blanco

Aspecto anverso
Algodonoso Pulverulenta, granulosa, yesosa zoofílicos, algodonosa antropofílicos.

Aspecto del reverso
Pigmento rojo púrpura Amarrillo parduzco, o ámbar, o marrón, o rojo castaño.

Tiempo de desarrollo
14 días

T. mentagrophytes

Blanco o crema

7 a 10 días

Amarillo inicialmente T. tonsurans crema, grisácea o marrón posteriormente. Amarillento o verde oliva Blanquecina Placa poco pulverulenta inicialmente y plegada posteriormente. Rojo caoba inicialmente rojizo oscuro después. 14 días

E. flocosum M. canis

Finamente velloso Poco elevado, escaso Plana finalmente

Amarillo azufrado Pigmento naranja amarillo o marrón Canela o crema

10 a 14 días 6 a 10 días

M. grypseum

Canela

granulosa y pulverulenta.

6 días

PRACTICA Nº 8:

I.

Introducción:

En los dermatofitos existen diferentes estructuras como clamidosporas y estructuras como hifas en espiral o raqueta. No obstante, para el diagnóstico definitivo nos ayuda la forma de las macroconidias y la disposición de las microconidias. Cabe mencionar que en un primocultivo estas estructuras estás ausentes (sobre todo si se siembran en medios con inhibidores). Se debe resembrar la cepa en un medio carente de inhibidores (p.ej. agra papa dextrosa) y a partir de este repicar un microcultivo. II. Objetivo: Determinar las estructuras microscópicas de los dermatofitos en un examen directo. III. IV. Materiales: Cepas de dermatofitos obtenidos con un aislamiento primario. Líquido de montaje (se recomienda azul de Amann). Láminas y laminillas Asa micológica Mechero bunsen Procedimiento:

Se procede con el montaje de la muestra usando el colorante adecuado. Se pasa a la observación. V. Resultados: Hifas Vegetativas
Ausentes

HONGO

Macroconidia
Generalmente ausentes. Alargadas, con varios lóbulos o espacios Alargadas, en forma de mazo, con varios lóbulos o espacios. Alargadas, pero de extremos curvos, con

Microconidia
Piriformes con forma de lágrimas y dispuestas lateralmente en las hifas Abundantes, redondeadas, formando grupos. Abundantes, de mayor tamaño y

T. rubrum

T. mentagrophytes T. tonsurans

En espiral Abundantes clamidosporas

varios lóbulos. M. canis En huso, de paredes gruesas y rugosas, extremos afilados. De 6 a más lóbulos. En huso, paredes lisas, extremos redondeados En clava, de 3 a 4 lóculos

algunos en forma de grupo. Ausentes

e hifas en raquetas.

M. gypseum E. flocosum

Ausentes No hay No hay

PRACTICA Nº 9: ESTIMULACION DE LA ESPORULACION
I. Introducción:

Una vez hecho el examen directo del primocultivo y no se observaron estructuras microscópicas que ayudan a la identificación de los dermatofitos, debemos recurrir a las técnicas especiales, tal es el caso del microcultivo, en la cual los dermatofitos desarrollarán. II. III. IV. V. Objetivo: Identificación de dermatofitos mediante la técnica del microcultivo. Materiales: Cepa Equipo de microcultivo Agua destilada estéril Agar Sabouraud glucosado (1 cm cada lado) Pinza y espátula estéril Mechero bunsen Procedimiento: Se sigue el procedimiento típico del microcultivo. Resultados:

PRACTICA Nº 10: ZIMOGRAMA O FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS
I. Introduccion:

La identificacion de levaduras del género Candida mediante el proceso de fermentación de carbohidratos. II. Materiales: Cepa problema Carbohidratos: tubos servidos con carbohidratos conteniendo campanas de Dirham. Deben ser preparados al 10%. III. Procedimiento: Preparación de los carbohidratos: o Glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa. o Preparados al 10%. IV. Tubos con 9 ml de caldo base conteniendo campana de Dirham invertida. A los tubos con caldo base agregar 1 ml del carbohidrato. Sembrar la cepa problema. Incubar a 37 ºC por 24 horas. Resultados: Presencia de gas (se lee) en las campanas de Durham. Se leerá fermentación de los carbohidratos (se evidenciará por el viraje del medio).

PRACTICA Nº 11: IDENTIFICACION DE Candida albicans
I. Introducción:

Esta se lleva a cabo por observación de examen directo de clamidosporas (otras especies por fermentación) II. Objetivo: - Identificación de C. albicans estimulando la producción de clamidosporas en un medio pobre de carbohidratos. III. Material: Cepa problema Agar almidón arroz (servido en placa o lámina portaobjeto). Placas de Petri estéril. Equipo de microcultivo. Asas en anillo y en punta. Mechero bunsen. Agua destilada estéril. IV. Procedimiento: o La placa servida con agar almidón arroz dividirla en cuadrantes y en cada cuadrante sembrar una muestra y se practican tres surcos no muy profundos, se cubren con laminilla y se incuban por 24 horas a temperatura ambiente. Siembra en lámina o El agar almidón arroz servido 3 ml en tubo diluido, se vierte sobre la lámina portaobjetos del equipo de microcultivo o imaginariamente se divide la lámina en dos y en cada extremo se siembra por estria con asa en punta. La cepa problema, se cubre con laminilla y se incuba a temperatura

Siembra en placa

ambiente por 24 horas (se le agrega agua antes de incubar). V. Resultados:

Directamente se lleva a observar al microscopio con 40x (placa). Siembra en lámina: se observa en microscopio a 40x. La presencia de células redondas de doble pared y un pseudomicelio identifican a C. albicans (clamidosporas).

PRACTICA Nº 12: MICOSIS SUBCUTÁNEAS Y SISTÉMICAS
I. Introducción:

II. -

Objetivo: Reconocimiento de las características de los hongos causantes de micosis subcutáneas y sistémicas.

III. IV.

Materiales: Microcultivos coloreados con azul de lactofenol. Resultados: