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FACULTAD DE CIENCIAS EN LA SALUD.

LICENCIATURA EN LABORATORIO CLINICO

MANUAL DE
DIAGNOSTICO
BACTERIOLOGIC
O.
INTRODUCCIÓN.

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de

Bacteriología, con el fin de conocer las vías bioquímicas y metabólicas que

sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mención de

las normas de bioseguridad útiles para mantener la seguridad dentro del

laboratorio y de quienes laboran en el, así como también normas generales en

toma, manejo y envío de muestras para los diferentes análisis bacteriológicos, y

su respectivo control de calidad. Además está elaborado de tal manera que sea

aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos de

laboratorio en Bacteriología.

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CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIÓN PERSONAL

Todas las muestras de especimenes biológicos deben considerarse


potencialmente infecciosas.

Vacunarse contra los principales agentes infecciosos.

Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida. Debe limpiarse y


desinfectarse cualquier superficie contaminada por algún espécimen biológico.

Lavarse las manos correctamente, después de haber tenido contacto con cada
paciente y al concluir cualquier procedimiento.

No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar durante los


diferentes procedimientos en el Laboratorio.

Vigile que los elementos de trabajo estén en perfectas condiciones físicas. Algún
elemento en mal estado, podría causarle una herida.

ESTERILIZACIÓN

Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los


microorganismos de un objeto o de una sustancia para evitar su reproducción.

ASEPSIA: Libre de microorganismos.

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

Comprende todos los procedimientos físicos, mecánicos y preferentemente


químicos, que se emplean para destruir gérmenes patógenos. A través de esta,
los materiales quirúrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de
desinfección que evita la contaminación operatoria. Hay varias formas de
esterilizar como:

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MÉTODOS QUÍMICOS

Estos métodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos.

Hipoclorito de Sodio: Es el mas utilizado por su fácil adquisición y por su


efectividad en la desinfección. Vida media 20 minutos.
Oxido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus.

Aldehídos: Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas. Estos
compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehído: Este método tiene la ventaja
de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Formaldehído: Las
pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gas-
plasma de Peróxido de Hidrógeno: Es proceso de esterilización a baja
temperatura la cual consta en la transmisión de peróxido de hidrógeno en fase
plasma.

Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fácilmente.

MÉTODOS FÍSICOS

Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el


tiempo de exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son
susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca
desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o
procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Calor Húmedo: El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de


proteínas.

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Autoclave
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado
es el de Chamberland. Esteriliza a 121º C, 15Lb de presión, por 20 minutos.

Calor seco: El calor seco produce desecación de la célula, es esto tóxico por
niveles elevados de electrolitos, fusión de membranas.

Estufas –Hornos

Doble cámara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la
cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras, a temperatura de 170º C
para el instrumental metálico y a 140º C para el contenido de los tambores.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

• Mantenga el lugar de trabajo en óptimas condiciones de higiene y aseo.


• Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo.
• NO SE DEBE UTILIZAR ELTELEFONO CELULAR DENTRO DE LAS
PRACTICAS DE LABORATORIO
• No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeración de
sustancias contaminantes o químicos.
• Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas
universales deben aplicarse con todos los pacientes, independientemente
del diagnóstico, por lo que se hace innecesaria la clasificación específica
de sangre y otros líquidos corporales.

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• Lávese cuidadosamente las manos antes y después de cada
procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patógeno.
• Utilice en forma sistemática guantes plásticos o de látex en
procedimientos que con lleven manipulación de elementos biológicos
y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atención de
pacientes.
• Utilice un par de guantes por paciente.
• Absténgase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del cuerpo y
de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el
procedimiento.
• Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que
puedan generar salpicaduras góticas -aerosoles- de sangre u otros
líquidos corporales.
• Use batas o cubiertas plásticas en aquellos procedimientos en que se
esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros
líquidos orgánicos.
• Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de
su sitio de trabajo.
• Mantenga sus elementos de protección personal en óptimas condiciones
de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso.
• Evite la atención directa de pacientes si usted presenta lesiones
exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto éstas hayan desaparecido.
• Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios
expuestas al riesgo biológico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, deberán ser
muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y
cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en áreas de menor riesgo.
• Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia
necesarias.
• Utilice las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento.

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• No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro.
• Absténgase de doblar o partir manualmente las hojas de bisturí, cuchillas,
agujas o cualquier otro material cortopunzante.
• Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de
bisturí.
• Realice desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de
trabajo al final década procedimiento y al finalizar la jornada.
• En caso de derrame o contaminación accidental de sangre u otros
líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro
material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o
cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la
superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después
limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma
concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal encargado
de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.
• En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro
líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor,
nunca con las manos.
• Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material
irrompible y cierre hermético. Deben tener preferiblemente el tapón de
rosca.
• Manipule, transporte y envíe las muestras disponiéndolas en recipientes
seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias
para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarán en recipientes
herméticos de plásticos o acrílico que retengan fugas o derrames
accidentales. Además deben ser fácilmente lavables.
• En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe
lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.

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• Restrinja el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no
autorizado, al que no utilice los elementos de protección personal
necesarios y a los niños.
• La ropa contaminada con sangre, líquidos corporales u otro material
orgánico debe ser enviada a la lavandería en bolsa plástica roja.
• Disponga el material patógeno en bolsas resistentes de color rojo que lo
identifique con símbolo de riesgo biológico.
• En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el
reporte inmediato de accidente de trabajo.

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GENERALIDADES

A. OBJETIVO GENERAL
 Conocer las técnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el
área de bacteriología dentro de un Laboratorio Clínico.

B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
 Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el área de

bacteriología.

 Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriología.

 Conocer el manejo y envío de muestras en el área de bacteriología.

 Conocer los diferentes procedimientos que se realizan en la preparación

de medios de cultivo.

 Conocer las diferentes técnicas bacteriológicas aplicables para la

identificación de cepas bacterianas.

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I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y
ENVIÓ DE MUESTRAS PARA ANÁLISIS CLÍNICOS.

1. Los análisis clínicos se practicarán a los pacientes que sean referidos al


laboratorio, por el personal autorizado del Establecimiento.

2. Todo examen deberá ser solicitado en el formulario proporcionado por el


laboratorio, completando los siguientes datos:
Nombre del paciente, número de registro, edad, sexo, servicio que lo refiere,
sello del establecimiento, diagnóstico clínico, firma y nombre de quien lo
refiere y especificar si es de urgencia.

3. Todo paciente con solicitud de exámenes de Laboratorio, deberá


presentarse a éste para que se le de la orientación sobre la colección de la
muestra, la hora y la fecha en que se le recibirá. Estos datos deberán ser
anotados en la hoja de solicitud del examen y en el libro de citas del
laboratorio.

4. Toda solicitud de examen de Laboratorio, deberá revisarse confirmando los


datos requeridos y comparando los datos de identificación con la tarjeta del
expediente del paciente.

5. El Laboratorio Clínico de cada establecimiento para efecto de control de


exámenes llevará un libro de entrada en el que anotará el número
correlativo, fecha, nombre del paciente y análisis a realizarse.

6. Los tubos, láminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las
muestras, deberán ser identificados inmediatamente después de tomadas o
recibida la muestra con el número correlativo de Laboratorio, nombre o
iniciales del paciente.

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7. Previo al envío de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con
éste para notificar del envió y saber quien recibirá la muestra.

8. Toda muestra clínica que se envíe a otro laboratorio, debe ser transportada
en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar
roturas, derramamientos de la misma o extravío.

9. En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes:


a) Protegerlas del calor excesivo.
b) Protegerlas de la luz solar.
c) Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.

10. Para el envió de la muestra es conveniente disponer de cajas de madera


con tabiques interiores; si no se dispone de ellas se puede usar una caja
de cartón grueso en la que se anotará la dirección del Laboratorio al cual se
envía y se le marcarán flechas verticales indicado la posición en que debe
mantenerse. Cada envío deberá ir acompañado de la lista con la
identificación de cada muestra contenida en la caja.

RECEPCIÓN DE LA MUESTRA:
Comprobar que las muestras están bien identificadas y que correspondan a la
lista adjunta.

1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodón o
toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solución bactericida. Si se
comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o
incineración
2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y
cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envío.

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ENVIÓ DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.
ALMACENAMIENTO Y ENVIÓ:

1. Suero: Deben almacenarse entre- 20°C y/o 4°C y transportarse a iguales


temperaturas, evitando así el congelamiento y descongelamiento de las
mismas que dañaría a los microorganismos.

2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la vía más
rápida, máximo una semana, además cada envío de muestra debe
acompañarse con la ficha epidemiológica correspondiente.

3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4° C (refrigeradora) y enviarlas


rápidamente al laboratorio dentro de las 24 horas siguientes a la obtención
de la sangre. Nunca deben congelarse, pues se hemolizan, además siempre
deben ser acompañadas por su ficha epidemiológica correspondiente.

4. Empaque: Los métodos de empaque y envío deben garantizar protección


tanto a la muestra como al personal que las manipula.

5. Los sueros enviados estarán en tubos o viales perfectamente cerrados, las


tapas o tapones se aseguran bien con cinta adhesiva para que no se aflojen
con la vibración del transporte. Se pueden sujetar con una banda de goma y
colocar cada lote en un recipiente de plástico o en una pequeña bolsa del
mismo material, cada paquete se dispondrá verticalmente en una hielera
que contenga bloques refrigerantes.

6. Al enviar sangre completa debe evitarse el contacto de los bloques


refrigerantes o del hielo de agua con las paredes de los tubos, para que las
muestras no se hemolicen.

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NORMAS DE BACTERIOLOGÍA.
Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada
antes de la administración de antibióticos.

ORINA.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción
suprapúbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes
condiciones:
a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital
con agua y jabón.
b) Colectar la primera orina de la mañana o tener como mínimo 2 horas de
retención urinaria.

c) En un frasco estéril de boca ancha, tapón de rosca, transparente, recoger


una cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro.
d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe
exceder de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar
hasta por 12 horas.

SECRECIÓN URETRAL.
Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción
luego exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos
estériles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martín o Agar
chocolate). Si la secreción es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y
raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para
coloración de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar
colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair. Si no se puede
sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de
transporte.

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SECRECIÓN VAGINAL.
Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el
especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se
recomienda sea tomada por el médico. El hisopo debe estar estéril e
impregnado con solución salina fisiológica al 0.85% estéril. Hacer de inmediato
un frotis para coloración de Gram y hacer un examen directo al fresco,
colocando una gota de solución salina en un porta objetos y suspender en ella
la secreción vaginal; cubrir con el cubre objetos y buscar Trichomonas
vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato
colocar el hisopo en 0.5 mL de solución salina, en refrigeración no más de 2
horas. En la coloración de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay
predominio de bacilos gram negativos.

HECES
La muestra debe tomarse en los tres primeros días de la enfermedad y antes de
comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el
hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solución
salina estéril ), dos o tres cms. en el ano imprimiéndole movimientos de
rotación amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del
recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del
hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con
sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es sólida y de 3 a 4 mL. si es
diarreica.

Si el cultivo se hace dentro de las dos horas después de tomada la muestra, no


se requiere medio de transporte. Pasado ese período se recomienda usar el
medio de transporte Cary & Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.

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SECRECIÓN FARINGEA.
La muestra debe tomarse de amígdalas y faringe, colocar al enfermo en
posición cómoda y buscando la mejor iluminación, pedir al paciente que
pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el
hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amígdalas y
luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede
impregnado de exudado faríngeo, evite tocar con el hisopo lengua y úvula.
Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de
tripticasa soya, infusión cerebro corazón, o sembrar de inmediato en agar
sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por
Gram para investigar difteria.

EXPECTORACIÓN.
Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con
solución de bicarbonato de sodio o con solución salina estéril.
Tomar la primera expectoración de la mañana (este esputo debe ser purulento
no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapón de rosca y estéril, debe
taparse bien e identificarse correctamente. Enviarlo al Laboratorio
inmediatamente.

SECRECIÓN NASAL.
Introducir el hisopo con solución salina estéril profundamente en dirección
paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada
fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular
de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.

SECRECIÓN OCULAR.
La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que
inmovilice la cabeza del paciente. Previa separación del párpado inferior con el

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pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secreción conjuntival dirigida
hacia el ángulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno
para úlcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey,
tioglicolato y también un tubo de sabouraud. En este caso es recomendable que
el oftalmólogo, con anestesia local tome la muestra con careta. Siempre hacer
examen directo.

SECRECIÓN OTICA.
Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y
teñirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.

PUS DE HERIDAS.
En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el
absceso es abierto tomar con un hisopo o bisturí de las paredes internas y no
del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de
tioglicolato.
LESIONES DE LA PIEL.
Lavar con agua, jabón y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las
costras y la piel que cubre las pústulas o vesículas, frotar firmemente con
hisopo o bisturí dentro de la lesión. Si la lesión es seca usar hisopo húmedo y
colocarlo en caldo tioglicolato.

SANGRE.
Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabón y agua después
aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa
colectar 5 a 10 mL. y colocar en medio de cultivo líquido en volumen 10 veces
mayor.

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LÍQUIDOS CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS
LÍQUIDOS DE DERRAME.

Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio


Bacteriológico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad
es de evolución rápida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es
básico la identificación del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1
a 2 mL. de muestra en tubos de tapón de roscas estériles, enviarlos al
Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para
bacteriología y otro para química. Si no es posible, primero procesar
bacteriología y luego remitirlo para química, la muestra debe guardarse en la
estufa a 35°C. hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el
sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una
preparación con tinta china.

1. PUS.
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con
yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar
con bisturí el pus del borde de las lesiones.
Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el
pus es abundante colocarlo en un tubo estéril con tapón de rosca.

2. SECRECIONES.
Lavado bronquial, líquidos de derrame, LCR, médula ósea y biopsia. Serán
colectadas por el médico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estéril
con tapón de rosca u otro recipiente estéril sin preservativo.

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Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible,
guardarlas en refrigeración no más de 24 horas.

EXAMEN DIRECTO.
3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.
Colocar una gota de secreción en un porta objeto y cubrir con laminilla-
examinar al microscopio. Es recomendable hacer simultáneamente un frotis
de la secreción y colorearla por Gram.

4. PUS Y MEDULA
Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.

5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL.


Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al
mismo tiempo hacer una preparación con KOH al 10 ó 20%.

6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LÍQUIDOS DE DERRAME


Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1
gota pequeña y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas
gotas con una laminilla para que se forme un gradiente de color negro.
Observar con el objetivo 10 x; si se ven círculos claros, contra fondo negro
observar con el 45x para apreciar la morfología. Además colocar una gota
del sedimento en un porta objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y
observar con objetivo de inmersión, esto para LCR. En caso de líquido
pleural y ascítico se agrega 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10
ml. Y se conserva en refrigeración si la muestra no se procesará
inmediatamente.

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7. BIOPSIA
Macerar el tejido con 1 mL. de solución salina en un mortero o con un
homogenizador estéril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer
preparación al fresco.

8. SANGRE
Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15
minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa
de leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por
Giemsa.

TOMA DE MUESTRA PARA LA IDENTIFICACION DE


MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Para que el Laboratorio pueda obtener resultados confiables, no solo es


necesario que ejecute las técnicas en forma correcta, sino que reciba una
buena muestra que provenga del sitio de la lesión a investigar y obtenida en
cantidad suficiente.

La muestra de mayor rendimiento para la baciloscopía es la expectoración,


especialmente de la mañana, proveniente del árbol bronquial, se le pide al
paciente que inspire profundamente, que retenga un instante el aire en sus

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pulmones y que lo expulse violentamente con un esfuerzo de tos hasta
obtener no menos de tres esputos.

Para el diagnóstico se requiere dos muestras: la primera se tomará en el


momento de la consulta, la segunda será recogida al despertar la persona
(matinal) previo aseo de la boca.

Para control de tratamiento: dos baciloscopías al segundo, cuarto y sexto mes


de tratamiento.

Para control post tratamiento: se deben realizar baciloscopías a los 12 y 24


meses de finalizado el tratamiento.

Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el


recipiente y marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.

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CONTROL DE CALIDAD.

1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVO DESHIDRATADOS:


Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y absorven agua del
exterior, (así como la formación de agua dentro de una botella) como
consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Además
favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de
nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. También la
exposición a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los
constituyentes del medio de cultivo.

Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo


deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos
contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe hacerse
en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los
medios elaborados en forma de polvo tienen una vida útil de al menos un año y
los medios en forma granular tienen una duración de al menos tres años. Para
asegurarnos que un medio de cultivo está en buen estado, es conveniente
marcar cada frasco de medio con la fecha en que fue recibido y tomarse las
previsiones necesarias para que la existencia del mismo en bodega cubra las
necesidades del laboratorio por períodos de al menos seis meses. De esta
manera controlaremos su vida útil y evitaremos que se nos deterioren durante el
almacenamiento.

El material que ha sufrido cambios sustanciales, tales como hidratación y


endurecimiento, debe descartarse.

2. RECONSTITUCIÓN O REHIDRATACIÓN.
El grado de disolución del medio deshidratado, así como la eficacia del medio
de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado
en la rehidratación.

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Debe emplearse siempre agua recién destilada o completamente
desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a
la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad
indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se
mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea y luego, se
agrega el resto del agua asegurándose que cualquier partícula de medio
adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso.

Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este
propósito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potenciómetro
debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de éste y para medios
que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH.

Si un medio de cultivo contiene Agar, gelatina o cistina, es indispensable


calentarlo en un baño de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta lograr
su disolución completa. Esta se logra cuando no se observen partículas
adheridas a la pared del erlenmeyer y el medio disuelto se observe homogéneo.

Una vez logrado el propósito anterior, debe suspenderse el calentamiento, ya


que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos constituyentes
del medio, tornándolo inadecuado.
Si el medio debe ser distribuido en tubos (TSI, Citrato, etc.) debe agitarse
frecuentemente para asegurar una distribución homogénea del mismo en cada
tubo. Los medios que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin
necesidad de calentarlos.

3. ESTERILIZACIÓN.
El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario)
debe someterse al proceso de esterilización, excepto aquellos que no lo
requieran (agar SS, por ejemplo).

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Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para
asegurarse la obtención de medios de cultivo útiles. Debe tenerse en mente que
la presión varía de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante.
De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parámetros que deben
tomarse en consideración en el proceso de autoclavado.

4. DISTRIBUCIÓN DEL MEDIO EN PLACAS.


El medio esterilizando debe enfriarse a 45°- 50°C en un baño maría ajustado a
esa temperatura para evitar la formación de agua de condensación. Debe ser
vertido en las placas evitando la formación de burbujas. En caso de que éstas
se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la superficie del
medio con ayuda de la llama del mechero. Durante el vaciado los componentes
del medio deben estar distribuidos uniformemente, por lo que es necesario
agitarlo con frecuencia. Si el medio de cultivo se ha enfriado a 45-50°C, el agua
de condensación que pueda formarse en las placas será poca y por tanto,
pueden mantenerse cerradas para evitar contaminación.
Debe guardarse una pequeña cantidad del medio para determinar el pH
después de autoclavado. Si el valor no es el indicado para el medio, descártelo.

5. PRUEBA DE ESTERILIDAD.
Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y
someterla a control de esterilidad a 35°C por 24 horas. Este procedimiento dará
una idea sobre la contaminación obtenida en la preparación del medio.
Esto a su vez permitirá determinar si se deben tomar medidas más rigurosas en
la limpieza y desinfectación del sitio en que se preparan los medios de cultivo y
en el procedimiento de distribución del medio.

6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO.


El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea de
inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su
utilidad durante un período de tiempo.

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El almacenamiento a 4°C es el mejor para la mayoría de los medios. Sin
embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a
temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.

Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar
algunos de sus componentes. Para evitar la desecación los medios pueden
guardarse en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas
de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.

Dado que los medios almacenados en refrigeración cuando pasan a


temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la
superficie, se recomienda poner las placas en el incubador a 35°C por un
período de dos horas, colocándolas con el fondo hacia arriba. De esta manera
se obtendrá una superficie seca.

CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN.


Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en
pruebas de identificación bacteriana funcionen adecuadamente, deben
utilizarse bacterias que muestren las diferentes características distintivas para
cada prueba o tinción.
Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterias de referencia
y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al almacenamiento de
reactivos, inoculación de medios, períodos de incubación, metodología para
efectuar las pruebas y tiempo de lectura de las mismas.

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PRACTICA No.1
PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.

PRACTICA No.1
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO.

Los medios de cultivo usados en Bacteriología contienen los nutrientes y factores


físicos y químicos (pH, concentración de iones), necesarios para la reproducción
bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios líquidos permiten
la proliferación bacteriana por todo el medio, son de fácil manejo. Los medios sólidos
permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas características
macroscópicas sirven de guía para la identificación de ciertas bacterias.

COMPETENCIA.
Preparar adecuadamente, medios de cultivos líquidos y sólidos, a partir de medios
deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes.

MATERIAL.

• Caldo tripticasa soya o caldo tioglicolato


• Agar tripticasa soya deshidratado
• Soporte con maya metálica
• Frascos Erlenmeyer o balones volumétricos con apon de algodón o gasa
• Cajas de petri
• Bajalenguas de madera
• Balanza
• Agua destilada
• Probetas tubos de ensayo

25
• Olla de presiona
• Mecheros

PROCEDIMIENTO.
MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO
1. se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se
observan las especificaciones en el frasco.

2. el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la
superficie de la balanza.

3. colocar 50 ml de agua destilada en un erlenmeyer (el volumen se mide en una


probeta)

4. agregar el medio deshidratado. Disolver por agitación y calentamiento hasta que


empiece a hervir. Luego esterilizar en la olla de presión ( 15 lbs de presión por
dos horas).

5. después de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de


ensayo (esterilizados previamente) quedando así listo el medio de cultivo. Los
medios líquidos deben mantenerse debidamente enroscados o sellados para
evitar la contaminación.

MEDIO DE CULTIVO SÓLIDO.

6. se pesa el medio TSA o algún medio sólido, en una balanza granataria


( instrucciones en el frasco)

7. el procedimiento es igual a la de los medios líquidos

26
PRACTICA No. 2
OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO

Un paso fundamental para el diagnostico bacteriológico es el aislamiento de


bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza
variada (pruebas bioquímicas, coloraciones, serología, etc.) se procede a su
identificación.
Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las técnicas para obtención
de cultivos puros a partir de una flora mixta.

OBJETIVOS
1- Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y
Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.
2- Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los
resultados que obtenga en esos medios.
3- Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo cultivo
puro.

PARTE I.
MATERIAL POR LADO DE MESA.
- Una suspensión de heces 1:1000
- Una placa de Agar de tripticasa soya
- Una placa de Agar Mac Conkey
- Una placa de Agar sangre.

PROCEDIMIENTO
Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la
suspensión de heces utilizando el método de estrías para extenderlo.

27
Incubar todas las placas a 36ºC +/- 1ºC, hasta la siguiente practica de
laboratorio.

PARTE II
MATERIAL:
- Colorante para Gram y dos placas de agar tripticasa soya.

PROCEDIMIENTO
1- Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de
agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que
hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.

2- Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y


agar sangre, colorearlos por el método de Gram. Observarlos en el
microscópio y anotar los resultados.

3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por
bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya,
incubarla a 36ºC hasta el próximo laboratorio. Hacer lo mismo con una
colonia Gramnegativa.

28
PARTE III
PROCEDIMIENTO
1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer
frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo
cultivos puros.

2- Discusión
a) Método de estrías (fundamento y objetivo)
b) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación,
composición (sustratos, nutrientes e inhibidores)
c) Descripción de colonias.
d) Análisis de los resultados.

Frotis Bacteriano.
1. Se observa Morfología
2. Se observa tinción ( Gram, Acido resistencia).

29
PRACTICA No. 3
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

PROPOSITOS
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibióticos
es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del
paciente.
Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base
científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento.
Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y
difusión en agar. La técnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y
fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas de
susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los
agentes antimicrobianos más apropiados para el tratamiento de las
enfermedades infecciosas.

OBJETIVOS
1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los
antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBY
BAUER).
2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas
recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.
3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la forma
de evitarlas.

Suceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son


inhibidos por concentraciones de antibióticos obtenidos con un régimen usual
de dosificación.

30
Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran
concentraciones de antibióticos superiores a las que pueden obtenerse en la
sangre por medio de un régimen usual de dosificación.

Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto
debe repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana
resistente.

PROCEDIMENTO
Por medio de la técnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados
confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones.
Es una técnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de
Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentración del inoculo, humedad,
temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para
que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es
muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el
antibiograma a las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento
rápido:
1. Staphylococcus aureus
2. Enterobacterias
3. Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en


Mueller-Hinton con 5% de sangre “achocolatado”.
Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones:

1. Las cajas de petri deben tener un tamaño estándar (100 mm de diámetro)


deben llenarse con aproximadamente 25 mL de agar líquido ya
autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.

31
2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas (de 2 a
8°C) por no más de 7 días.

3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4.

4. De cada lote de medio, incubar de 2 – 5 cajas por 24 horas a 36°C para


comprobar su esterilidad.

ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBIÓTICOS:

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no
pierdan su potencial:

1. Congelar (idealmente a –20°C) los discos de Penicilina, Ampicilina,


Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar periódicamente sólo los discos
que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas
antes de usarlos.

2. Los discos del resto de antibióticos pueden almacenarse refrigerados sin


congelación. De preferencia con un desecante.

PROCEDIMIENTO:
1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual
morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.

2. Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusión de


cerebro - corazón.

3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36°C, hasta que aparezca una ligera


turbidez.

32
4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Mac
farland 0.5. Si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo o
solución salina estéril.

5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir un


hisopo estéril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionándolo ligeramente
contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.

6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre


toda la superficie, cerca del mechero encendido.

7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no más de 15 minutos, con la


tapadera cerrada.

8. Con pinzas estériles, colocar los discos impregnados de antibióticos a


manera que queden lo más separado entre sí. Escoger los antibióticos a
colocar dependiendo de la bacteria aislada.

9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con
candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp)

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.
1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las cajas
ya con crecimiento.
2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con una
regla por detrás de la caja petrí.
3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual
no debe tomarse en cuenta.
4. Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en
milímetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.

33
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS DE
INHIBICIÓN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
Agente Contenido del Resistente Intermedio Moderadamente Susceptible
antimicrobiano disco (meg) susceptible
Amikacina 30 14 15-16 14-17 17
Amoxicilina- 20/10 13 14-16 18
ácido
clavulánico
Ampicilina 10 13 12-14 17
Ampicilina- 10/10 11 16-21 15
sulbactan
Aztreonam 30 15 15-17 22
Cefamandol 30 14 15-17 18
Cefazolina 30 14 13-15 18
Cefmetazol 30 12 15-17 16
Cefonicida 30 14 16-20 18
Cefoperazina 75 15 15-22 21
Cefotaxima 30 14 13-15 23
Cefotetan 30 12 15-17 16
Cefoxitina 30 14 15-17 18
Ceftazidima 30 14 15-19 18

Ceftizoxima 30 14 14-20 20
Ceftriaxona 30 13 15-22 21
Cefuroxima 30 14 15-17 23
(oral)
Cefuroxima
30 14 15-17 18
(parenteral)
Cefalotina 30 14 15-17 18
Cloranfenicol 30 12 13-17 18
Ciprofloxacina 5 15 16-20 21
Gentamicina 10 12 13-14 15
Imipenem 10 13 14-15 16
Kanamicina 30 13 14-17 18
Mezlocilina 75 17 18-20 21
Netilmicina 30 12 13-14 15
Piperacilina 100 17 18-20 21
Tetraciclina 30 14 15-18 19
Ticarcilina 75 14 15-19 20

(Continuación)
Agente Contenido Resistente Intermedio Moderadamente Susceptible
antimicrobiano del disco susceptible
(mcg)
Ticarcilina-ácido 75/10 14 15-19 20
clavulánico
Tobramicina 10 12 13-14 15
Trimetoprim- 1.25/23.75 10 11-15 16
sulfametoxazol

34
Reportar sólo
en Urocultivo
Carbenicilina 100 19 20-22 23
Cinoxacina 100 14 15-18 19
Nitrofurantoína 300 14 15-16 17
Norfloxacina 10 12 13-16 17
Ofloxacina 5 12 13-15 16
Sulfisoxazol 250 ó 300 12 13-16 17
Trimetroprim 5 10 11-15 16

INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS

Agente Contenido del Resistente Intermedio Moderadamente Susceptible


antimicrobiano disco(mcg) susceptible
Amoxicilina- 20/10mcg 19 14-16 20
ácido
clavulánico
Ampicilina 10mcg/ml 28 29
Ampicilina- 10/10mcg. 11 12-14 15
sulbactan
Cefazolina 30mcg. 14 15-17 18
Cefotaxima 30mcg 14 15-22 23
Ceftriaxona 30mcg 13 14-20 21
Cefalotina 30mcg 14 15-17 18
Cloranfenicol 30mcg 12 13-17 18
Ciprofloxacina 5mcg 15 16-20 21
Clindamicina 2mcg 14 15-17 18
Eritromicina 15mcg 13 14-22 23
Gentamicina 10mcg. 12 13-14 15
Imipenem 10mcg. 13 14-15 16

Continuación

Agente Contenido del Moderadamente


Resistente Intermedio Susceptible
antimicrobiano disco (mcg) susceptible
Meticilina 5mcg 9 10-13 14
Ofloxacina 5mcg 12 13-15 16
Oxacilina 1 mcg 10 11-12 13
Penicilina G 10 U 28 29
Rifampicina 5mcg 16 17-19 20
Tetraciclina 30mcg 14 15-18 19
Trimetoprim- 1.25/23.75m
10 11-15 16
sulfametoxazol cg.
Vancomicina 30mcg 9 10-11 12
Reportar sólo
en Urocultivo

35
Nitrofurantoína
300mcg 14 15-16 17
Norfloxacina
10mcg 12 13-16 17
Sulfisoxazol 250 ó
12 13-16 17
300mcg
Trimetroprim
5mcg 10 11-15 16

DISCUSION
1- Características del medio de cultivo.
2- Principio del método de difusión.
3- Elaboración del reporte.
4- Antibiótico. Quimioterapéutico.
5- Otros controles: inóculo, discos, siembra e incubación.

PRACTICA No. 4
COPROCULTIVO

La infecciones éntericas pueden ser causadas por varios microorganismos,


siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y
desde 1991 el Vibrio cholerae O1

PROPÓSITO:
Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es
decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea,
dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte.

OBJETIVOS
1- Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la
muestra de heces.

36
2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias
entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.
3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las
bacterias que aisle e intérprete los resultados obtenidos.
4- Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales
Enterobacterias patógenas.
5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las
tablas de referencia para la identificación de Enterobacteriaceae.

MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
 Heces frescas (la mejor muestra)
 Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
 Material obtenido por proctoscopia.
 Biopsia de mucosa intestinal.
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia antes de 2-3
horas de ser emitidas.

El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible
obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se
encuentran dentro de la mucosa.

En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estéril 4 centímetros,


dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En niños, introducir el
hisopo 2.5 centímetros y dar la misma cantidad de vueltas.

Cuando las heces, que se encuentran a 37°C dentro del intestino, son
colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20°C),
el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente

37
Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por
esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada,
debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios
bruscos de pH.

Para éste propósito colocar con hisopo estéril una porción de las heces (con
sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de
transporte:
 Glicerol – Salino bufferado, (especialmente para Shigella).
 Caldo de Hagna GN (Gramnegativo).
 Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.

Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en


encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24
horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su
utilidad clínica.
La coloración de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de
significado clínico a menos que el médico lo solicite.

PROCEDIMIENTO:
Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es niño menor de 6 meses. Para
efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen
inhibidores, por lo que sólo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y
diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se
produce ácido, lo que hace cambiar el color de las colonias y así las diferencia).
Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de
sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen ácido sulfídrico.

El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de


preferencia uno más inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar

38
Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con
moco y sangre (disentería) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.

EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA:


1. Inocular una porción anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de
muestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS.
El inóculo se coloca con asa en anillo (flameada y fría) o con hisopo en las
cajas de ambos medios. Inocular sólo ½ cm en un extremo en el Mac
Conkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey.

2. Diseminar el inóculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas
mientras la otra se enfría.

3. Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas,


incubar a 36°C por 18 a 24 horas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Después de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse


con una luz de lámpara que ilumine las cajas por detrás y observarlas.
Marcar por detrás con un círculo de crayón graso cada tipo diferente de
colonias sospechosas así: primero Mac Conkey escoger colonias lactosa-
negativo (incoloras). Si el paciente es un niño menor de un año, se marcaran
colonia típica de Escherichia colí (roja, brillante y de bordes lisos pero no
mucosa).

Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento será más


escaso ya que es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia lactosa-
negativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (ácido

39
sulfhídrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña
verde azulado (lactosa-negativo).

2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa
en aguja bien recta, flameada y fría, toque la superficie de la colonia
seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras
colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya
tocó la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flameé la
boca del tubo, luego pínche el medio en el centro y hasta el fondo a manera
de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del
tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con
la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estríe la superficie del
medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al
medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de
movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo
metilo y el Voges Proskauer.

3. Incube a 36°C la gradilla que contiene las bioquímicas. Deben permanecer


en incubación de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar
ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno.

4. Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de


identificación de pruebas bioquímicas.

5. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma).

40
COPROCULTIVOS
Incubar 8 horas
Heces frescas o Hisopo rectal
Subcultivar Mac Conkey
Inocular Mac Conkey, SS y
(placas standard)
Selenito
Incubar 18 – 24 horas a 36ºC
Crecimiento colonias lactosa
Lactosa Incubar de 18 a 24 horas a 36ºC

(-)

41
(-)
Incubar TSI-Movilidad - Urea
Reportar NBP (adultos)
Según crecimientos y
numero de Colonias
Identificar y hacer
antibiogramas en niños.

Urea Urea
(+) K/A (-)

Otras Urea Shigella


Urea Urea
Enterobacterias
Antibiograma Pruebas bioquímicas
Primarias

Tipeo Serológico
(Antisueros: B.C.D.A.AD.

PRACTICA No.5
CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO
CHOLERAE O1

En el caso de cólera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves
la vida del paciente puede depender de éste resultado.

MATERIALES:
 Hisopos estériles

42
 Tubos de vidrio 15 x 100 mm
 Tubos de vidrio 16 x 100 mm
 Asa redonda

MEDIOS:
 Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vómito.
 Agua pectonada alcalina (APA)
 Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).

MUESTRAS:
 Heces líquidas
 Hisopo rectal
 Vómito

PROCEDIMIENTO:
1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo

en el medio T.C.B.S regresar el hisopo al tubo de medio.

2. Estriar por agotamiento e incubar a 35°C por 18 a 24 horas.

3. El otro hisopo introducirlo en el agua peptonada alcalina e incubar a 35°C

por 6 a 8 horas máxima a las 8 horas, hacer un subcultivo del agua

peptonada, tomando 2 a 3 asadas de la superficie de dicho caldo o inocular

otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35°C por

18 a 24 horas.

LECTURA:

43
 Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y

chiclosas, de estas inocular un TSI y un TSA (Tripticas soya agar), incubar a

35°C por 18 a 24 horas.

 Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en

una lámina porta objetos suspender el inoculo de un cultivo de 18 a 24

horas en una gota de suspensión acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%)

y la prueba de oxidasa.

 Si ambas pruebas son positivas pasar a la serotipificación con: antisuero

polivalente y solución salina para ver si es una cepa autoaglutinable. Con

solución salina no tiene que aglutinar.

 Si aglutina con el suero polivalente continuar con el antisuero INABA, si con

éste antisuero también aglutina reportamos: Se aísla Vibrio cholerae O1

INABA, si no aglutina con el INABA, continuar con el antisuero OGAWA. Si

este aglutina, reportamos. Se aísla Vibrio cholerae 01 OGAWA.

 Si en los tres antisueros aglutina se reporta: Se aísla Vibrio cholerae O1

HIKOJIMA.

 Si la oxidasa nos da positiva y con el antisuero polivalente no aglutina se

reporta: Se aísla Vibrio cholerae Nº O1.

 Si no se observan colonias con características antes mencionadas se

reporta: No se aísla Vibrio cholerae.


VIBRIO CHOLERAE
Hisopo rectal
Cary Blair Vómito
Heces

TCBS
Agar Mac Conkey Agua Peptona

Colonias lactosa (-) Resiembra en TCBS a las


6-8 horas
Colonias amarilla de ± 3 mm de diámetro
(Trabajar con varias colonias sospechosas)

44
Identificar Salmonella
o Shigella

Si No crecimiento

No se aísla
Vibrio cholerae
TSI
TSA
A/A ó K/A
Gas (-)
H-S(-) Si

Reporte
No TSA

No se aísla Vibrio cholerae Oxidasa y prueba del collar

NEGATIVO POSITIVO

Reporte Aglutina con Antisuero


No se aísla Vibrio cholerae Polivalente anti. V.Cholerae
Serogrupo 01.

POSITIVO NEGATIVO
V. cholerae V. cholerae
Serogrupo 01 No Serogrupo 01

DISCUSION
1. Definir coprocultivo. Casos especiales (niños menores de 5 años e
inmunodeprimidos)
2. Muestras clínicas: ¿Cómo se toman? ¿Cuándo se indican? Cuidados en el
manejo. Procesamiento.
3. Medios de cultivo: consistencia, composición, aplicación e importancia.
4. Reporte preliminar. Importancia, indicación, como se hace, como se reporta.
5. Análisis del resultado del cultivo.

45
6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubación e interpretación.
7. Antibiograma. Importancia. Antibióticos recomendados por la Organización
mundial de la salud.
8. Uso de tablas para identificación bacteriana. Reporte.

PRACTICA No. 6
UROCULTIVO

PROPÓSITO:
El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se
efectúa para demostrar la presencia de un número significativo de bacterias.

46
En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estéril, pero siempre se
contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razón, el criterio para
interpretar el crecimiento es cuantitativo.
De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de bacterias mayor o
igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina)
se considera infección verdadera, es decir es un recuento significativo. A
diferencia de otros cultivos bacteriológicos, las bacterias que causan la
infección urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento
rápido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las
Enterobacterias (bacilos Gramnegativos).

La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con más frecuencia se aísla de
urocultivos positivos, luego tenemos:
 Klebsiella spp.
 Enterobacter spp.
 Proteus spp.
 Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).

De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos:


 Enterococcus spp.
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros).
 Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminación)
 Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminación).
Las infecciones mixtas causadas por dos o más especies bacterianas son raras,
por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminación.
La demostración de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el
sedimento urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran
importancia para establecer el diagnóstico de infección urinaria.

OBJETIVOS

47
1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre
dicho procedimiento.
2. Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de orina
proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte
preliminar.
3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa
calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados.
4. Identificar los posibles microorganismos patógenos. Interprete los
resultados.

RECOMENDACIONES GENERALES.

TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE:


a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estéril
empapada con jabón antiséptico no irritante. Remover el jabón con otra gasa
estéril, empapada en agua estéril.
b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro.
c) Después de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rápidamente pero
con cuidado un frasco estéril de boca ancha tomar “al vuelo” a medio chorro
una muestra de orina de la parte central de la micción.
Se deja correr la primera porción de orina para que remueva las bacterias de
la parte anterior del meato urinario, que contaminaría el Urocultivo. Tapar
rápidamente el frasco.
d) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la
muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeración
se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un máximo de
48 horas.

TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER:

48
En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la
muestra, ya que sus genitales están expuestos, por lo tanto hay una abundante
colonización de bacterias. Proceder de la siguiente manera:

a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las
piernas abiertas. Con los dedos índices y medio de la mano derecha
izquierda debe separarse los labios genitales mayores.
b) Con una gasa empapada con jabón antiséptico no irritante, limpiar bien toda
el área y luego remover el jabón con otra gasa empapada con agua estéril.
c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina
unos segundos y luego la tomar de la porción central de la micción. Tapar
rápidamente.
d) Sembrar antes de una hora ó refrigerar la muestra.

TOMA DE UROCULTIVO EN NIÑOS PEQUEÑOS:


a) En niños varones desinfectar bien con jabón antiséptico no irritante, todo el
pene y el área genital.
En las niñas desinfectar bien los labios mayores y el área genital que los rodea.
Quitar bien el jabón con gasa y agua estéril, luego secar finalmente con una
gasa estéril seca.
b) Pegar una bolsita de plástico estéril y descartable, especial para tomar
urocultivos pediatricos. En niños tener la precaución de introducir todo el pene
en el orificio del llenado y en las niñas que el agujero de la bolsa quede pegado
al centro por donde saldrá la orina.

MATERIALES
 Placas de agar sangre.
 Placas de Mac Conkey
 Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traerá el alumno)
 Asa calibrada de 0.001ml

49
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo según la técnica del Asa calibrada.
Los medios de cultivo a utilizar son:
a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayoría de microorganismos
b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios
(Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.

2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que
tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear
la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la orina,
justamente por debajo de la superficie.

3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de
la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el
medio de Mac Conkey.

4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en


ambas cajas, haciendo estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada
por el asa calibrada.

5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 36°C en jarro de boca ancha con


un trozo de papel absorbente húmedo y una candela encendida, cerrar bien.

6. Incubar el Mac Conkey sin jarro en la incubadora a 36°C.

INTERPRETACIÓN:

50
1. Después de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados
de ambas cajas simultáneamente y con buena luz.

2. Contar el número de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se usó el


asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utilizó un asa calibrada
de 0.01 mL.

3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con


bioquímica, hacer sensibilidad y reportarlo.

UFC/ML CRITERIO PARA REPORTAR

Negativo a las 24 horas de incubación a 36°C


0 –10,000
Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma
10,000-50,000 de muestra y correlación de leucocitos en sedimento
urinario.
Se aisló ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el
50,000-100,000 número de UFC contado y especie bacteriana con su
sensibilidad antimicrobiana.
Se aisló ___, más de 100,000 UFC / mL infección
100,000 ó más
urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.

UROCULTIVOS
Sembrar con Asa
calibrada de 0.001 mL
Agar sangre (carnero)
Agar Mac Conkey
Incubar 18 a 24 horas

Crecimiento No Crecimiento

51
Reporte
Recuentos mayores Recuentos menores Recuento de
de 50,000 de un solo de 50,000 de un solo más de un tipo
tipo de bacterias tipo de bacterias de bacterias
Recuento y
Reporte
cultivo negativo

Identificar bacteria
sensibilidad Identificar bacteria Crecimiento
mixto. Pedir
nueva muestra
Reporte Reporte

Recuento Recuento y
Bacteriano nombre de
Sensibilidad bacteria

DISCUSION
1- Muestra de orina. Obtención. Cantidad y procesamiento.
2- Detección de bacterias por la coloración de Gram en orina no centrifugada.
Aplicación
3- Utilidad de usar agar sangre y agar Mac Conkey.
4- Cultivo. Inóculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de cultivo.
5- Uso del factor y reporte.

52
PRACTICA No. 7
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO Y OTROS LÍQUIDOS DE
DERRAME.

PROPÓSITO:
Demostrar por medio de la tinción de Gram y el cultivo, la presencia de
bacterias en estas muestras que normalmente deben ser líquidos estériles ya

53
que son tomadas por el médico que las solicita en condiciones quirurgicas
estériles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patógeno. Las bacterias
de mayor importancia en el líquido cefalorraquídeo son:

GRAMNEGATIVOS.
 Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa)
 Haemophilus influenzae (Meningitis en niños de 6 meses a 4 años de edad)
 Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes)
 Pseudomonas aeruginosa

GRAMPOSITIVOS:
 Streptococcus pneumoniae (muy importante)
 Staphyloccus aureus
 Streptococcus sp
 Streptococcus pyogenes.

OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES:


 Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum
 Cryptococcus neoformans, Candida albicans

OBJETIVOS
1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquideo, interpretar y hacer
su reporte.
2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros
líquidos de derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas.
3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados.
4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis.
5. Procesar otros líquidos de derrame.

MUESTRA:

54
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
 Líquido cefalorraquídeo
 Líquido ventricular
 Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)
 Líquido pleural
 Líquido pericardico
 Líquido sinovial
 Médula ósea.

Las muestras deben transportarse rápidamente al laboratorio y ser procesadas


inmediatamente no después de 30 minutos de recolectados. Rotular con el
nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el
médico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol ácido
resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio.

PROCEDIMIENTO:
1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del
cual desee examen completo).

2. Uno de los tubos no se centrífuga, enviarlo para que se le haga el


citoquímico (recuento total de células) recuento diferencial (fórmula) y
análisis químico. El otro tubo sirve para análisis microbiológico.

3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM).


Decantar asépticamente, tapar, agitar y procesar sólo el sedimento.
4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios:
a. Agar sangre de carnero al 5%
b. Agar chocolate
c. Agar Mac Conkey
d. Sabouraud (hongos)
e. Tioglicolato
f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR)

55
5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos. Introducir el
agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro húmedo con candela
encendida. Incubar todos los medios a 36°C, excepto el sabouraud que se
incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patógenos
especialmente (Cryptococcus neoformans).

6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis


pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro de
la lámina.

7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista
que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes
con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo
cuidado. Observar las siguientes morfologías:

1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arriñonados, dispuestos en


parejas como granos de café, idénticos a N. gonorrhoeae de pus uretral:
morfología compatible con N. meningitidis. Dar alerta al médico
inmediatamente.
2. Cocobacilos gram-negativos (rojo pálido) pleomorficos, con escasas formas
bacilares: morfología compatible con H. Influenzae agente de meningitis en
niños de 6 meses a 4 años.

3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en


parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como halo claro alrededor
de las bacterias: En LCR morfología compatible con Streptococcus
pneumoníae.

56
4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloración sólida, no pleomorficos, bacilos
alargados: morfología compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E.
Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa).

5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo


se insinúa cápsula, hacer “tinta china”, para demostrar la presencia de
levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans.

6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistente (rojos) cortos, algunos con


coloración dispareja en forma de gránulos: morfología compatible con
Mycobacterium tuberculosis.

INFORME:

 El primer informe, entregar el mismo día de la obtención del muestra: Frotis


de Gram: se observan morfología de bacterias, cantidad de leucocitos.
Cultivo pendiente.
 El segundo informe; entregar el día que termina la identificación:

 Cultivo: se aísla: Nombre de la bacteria, género, especie más


antibiograma.

L.C.R. Y LÍQUIDOS DE DERRAME

 Agar sangre
 Agar chocolate
 Caldo, Tripticasa soya
 Gram
Incubar 18 a 24 horas

57
Crecimiento No crecimiento
Reincubar 24 horas
más

Gram
Identificar bacteria
Sensibilidad Crecimiento No crecimiento
Reporte Reporte

Bacteria aislada Gram


Sensibilidad Subcultivo del caldo Cultivo negativo
a las 48 horas
Identificar bacteria
Antibiograma

Reporte

Se aislo: (Dar nombre de bacteria y sensibilidad

DISCUSIÓN
1- Muestra. Cantidad y procesamiento.
2- Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clínico.
3- Diagnostico preliminar.
4- Medios de cultivo.
5- Aislamiento e identificación bacteriana.
6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7- Reporte definitivo.

58
PRACTICA Nº. 8
HEMOCULTIVO

PROPÓSITO:
El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se
están reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las
bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema
retículo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se

59
diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el
torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana.

OBJETIVOS
1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e inocularlas
en los medios de cultivo apropiados.
2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento
bacteriano de un hemocultivo positivo.
3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de muestras
de sangre en el laboratorio, así como también los procedimientos efectuados
para la identificación bacteriana.
4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los
hay.

MUESTRA:
Los síntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo
son: Aumento súbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales,
escalofríos, postración y presión baja. Además la recuperación de las bacterias
de la sangre depende de los siguientes factores.

1. Cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 mL y en


adultos usualmente 5 mL.
2. La relación entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir
sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulación.

3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos,


complemento o antibióticos.
4. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa” es decir que requiere de
un medio de cultivo enriquecido y complejo.
5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con
antibióticos.
6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en
tiempo y sitios diferentes, es decir “seriado”.

60
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:

1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapón de hule


perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodón empapado en
solución de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapón perforable. Dejar
secar mientras se atiende al paciente.
2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar
con precisión el sitio donde se va a puncionar.
3. Lavar con agua y jabón el brazo del paciente, antes de aplicar desinfectante.
Limpiar el sitio correcto con un algodón empapado en tintura de yodo al 3%.
Dejar secar y luego limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en
alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el
sitio de punción.
4. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente
5 mL o más de sangre.
5. Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de
caldo o 10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos
pediátricos, inyectar 2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo.
6. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36°C.

PROCEDIMIENTO:
1. Incubar los hemocultivos por siete días, excepto en casos especiales en los
cuales debe prolongarse la incubación, por ejemplo para el aislamiento de
Brucella spp.
2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los
frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles
que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de
bacteria que esta creciendo:

61
Signos Visible Posible Bacteria
 Bacilos Gramnegativos aerobios
Turbidez  Staphylococcus spp.
 Bacteroides spp.
 Estreptococcus spp.
 Staphylococcus spp
Hemólisis  Listeria spp
 Clostridium spp.
 Bacillus spp.
 Bacilos Gramnegativos aerobios
Formación De Gas
 Anaerobios
Colonias Visibles Como “Motas  Staphylococcus spp.
de Algodón”  Streptococcus
 Pseudomonas spp.
Formación De Película  Bacillus spp.
 Levaduras
 Pseudomonas aeruginosa
Coloración Verdosa (Raro)

1. En caso de observar cualquiera de estas características, agitar suavemente,


limpiar el tapón perforable con algodón y alcohol, puncionar con jeringa y
aguja estéril, y aspirar una pequeña cantidad de caldo. Inocular una gota y
luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar
chocolate; incubar ambas en jarro con candela. Simultáneamente dejar secar
dos gotas del caldo sobre un porta objetos, colorear con Gram.

2. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de


inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su
caracterización. Además, algunas bacterias como Haemophilus influenzae,

62
no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos
gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey;
incubar aeróbicamente. Esto es especialmente importante para el
aislamiento o identificación de Salmonella typhi.

3. Si se observan cocos gram-positivos esféricos y con tendencia a agruparse


en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento
e identificación de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o
cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de
optoquina y bacitracina sobre la segunda estría del agar sangre, para aclarar
la identificación presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus
pyogenes.

4. Rutinariamente revisar los hemocultivos aparentemente negativos.


Procederá así: hacer asépticamente un frotis de Gram del caldo a las 48
horas y también al séptimo día de incubación. La incubación prolongada
puede producir una leve turbidez de fibrina.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

1. Con siete días de incubación a 36°C se recupera el 95% de las bacterias

clínicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de

colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar

inmediatamente el crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente anti-

salmonella, anti-salmonella del grupo D y anti-antígeno Vi. Si hay

aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de salmonella

typhi.

63
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:

 Salmonella typhi

 Escherichia coli

 Streptococcus pneumoniae

 Staphylococcus aureus

 Streptococcus pyogenes

 Pseudomonas aeruginosa

 Haemophilus influenzae

3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como

contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:

 Bacillus sp

 Corynebacterium sp.

INFORME:

1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan

bacterias en el Segundo control por coloración de Gram, a los siete días de

incubación, NUNCA ANTES. Reportar así: NEGATIVO A LOS SIETE DÍAS

DE INCUBACIÓN A 36°C.

2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación

reporta cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta

64
especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLÓ

____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.

3. En el caso del aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae ó

Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así: SE AISLO

Streptococcus________________, se recomienda tratamiento con

penicilina. Sí se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la

penicilina.

4. Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad

antimicrobiana, enviar otro reporte, así:

Se aisló:__________________________________

Susceptible a:______________________________

Intermedio a:_______________________________

Resistente a: _______________________________

HEMOCULTIVOS
Muestra N° 1
Muestra N° 2
5 mL de sangre
45 mL de medio

Incubar 24 horas

Sub-cultivo en agar
chocolate y hacer
coloración de Gram

65
Subcultivo y Subcultivo y
Gram positivo Gram negativo
Incubar
Observar diariamente
Identificar bacteria
Sensibilidad

Reporte
Bacteria 7° día hacer Subcultivo en
Sensibilidad agar chocolate y
Gram

Cultivo negativo al
6° día de incubación

DISCUSION
1- Obtención de la muestra
2- Medios de cultivo utilizados e incubación
3- Elaboración del reporte preliminar
4- Resultado Final
5- Resultado del antibiograma

66
PRACTICA N0.9
IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS

Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tiñen con dificultad por el alto
contenido de grasa en su pared celular. Para lograr teñirlas deben usarse
coloraciones con fenol y calor. Una vez teñidas con fucsina carbólica, no se
decoloran con alcohol acidificado. Por esta característica muy particular se les
llama “BACILOS ALCOHOL-ÁCIDO RESISTENTES”.

Las mycobacterias son aerobios estrictos, no móviles, no poseen cápsula no


producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento, la mayoría de especies
patógenas crecen después de 2 a 6 semanas de incubación a 36°C en el medio
de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se

67
asocian con enfermedad , en nuestro medio, sin lugar a duda, M. tuberculosis
es la especie más importante

PROPOSITO.
Demostrar por medio de coloración y cultivos especiales la presencia de
bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, especialmente
Mycobacterium tuberculosis.

OBJETIVOS
1-Conocer las técnicas de laboratorio útiles para la identificación de M.
tuberculosis.
2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificación presuntiva de M.
tuberculosis.

MUESTRAS.
1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para
la investigación de tuberculosis.
 El esputo debe colectarse temprano en la mañana, inmediatamente al
despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en días
alternos.
 El primer esputo de la mañana es la más adecuada para el análisis, pues
es más concentrada y menos contaminada.
 Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento.
 Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con
agua corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antiséptico.

 El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estéril de boca


ancha.

 El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos
métodos:

68
b) Nebulización de solución salina hipertónica (cloruro de sodio al 10%,
sin propilenglicol), es excelente para inducir la producción de esputo,
generalmente diluido.
c) Los hisopos faríngeos pueden ser usados en estos pacientes para
extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable
para niños pequeños a los cuales no se les pude pedir una muestra
adecuada.
d) Broncoscopía: Puede ser usada para obtener las muestras
directamente del sitio infectado.
2. Lavado gástrico: Frecuentemente se solicita lavado gástrico para análisis de
micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estómago, sirve para
demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha
tragado.
3. Orina: Se debe examinar un mínimo de tres muestras de la PRIMERA
ORINA DE LA MAÑANA colectar a “medio chorro” en un recipiente estéril de
boca ancha.
4. Otro tipo de Muestra:

 Lavado bronquial
 Fragmentos de pulmón
 Hisopado faríngeo
 Líquido cefalorraquídeo
 Líquido pleural
 Líquido articular
 Pus
 Raspado endometrial (sangre menstrual)
 Médula ósea

69
 Líquido pericardico
 Trozos de tejido de biopsias.

PROCEDIMIENTO:
El diagnóstico de Micobacterias se basa en la observación de los bacilos
alcohol-ácido resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos
alcohol-ácido resistentes deben teñirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o
Kinyoun. Ambas técnicas dan buen resultado.

COLORACIÓN DE KINYOUN:
Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder así:

1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor.

2. Colocar la lámina en la gradilla de coloración y dejar que enfríe. Cubrir el

frotis con Fucsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es

necesario calentar.

3. Lavar con agua corriente

4. Decolorar el frotis con alcohol-ácido hasta que ya no salga más colorante

rojo.

5. Lavar con agua corriente.


6. Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 ó 2 minutos.
7. Lavar con agua corriente.
8. Dejar secar y examinar con lente de inmersión.

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN:


1-Cubrir el frotis previamente fijado con fucsina fenicada por 5 minutos y
calentar hasta la emisión de vapores. (No hervir).
2- Lavar con agua de chorro.

70
3- Decolorar con alcohol-ácido por 2 minutos.
4- Lavar con agua de chorro.
5- Cubrir el frotis con azúl de metileno por 1 minuto.
6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.

INTERPRETACIÓN DE LA BACILOSCOPÍA:
Número de Bacilos Reporte
Alcohol-Ácido Resistente
0 No se observan bacilos Alcohol-Ácido Resistente
1 a 2 en todo el frotis Informar el número de BAAR encontrados y

pedir nueva muestra


3 a 9 en todo el frotis + ó escasos
10 ó más en todo el frotis ++ ó regular cantidad
1 ó más por campo +++ abundantes

CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Antes de inocular los medios de cultivo para la identificación final de M.


tuberculosis deben realizarse una serie de procedimientos para tener éxito en
los aislamientos. Dentro de los procedimientos a realizar tenemos:
A) Descontaminación
B) Neutralización
C) Centrifugación

Luego de realizar estos procedimientos se procede a inocular los medios de


cultivo apropiados.

DISCUSION
1- Medios de cultivo utilizados en la identificación de Mycobacterias.
2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.

71
3- Reporte preliminar.
4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clínica.

PRACTICA No. 10
CULTIVO DE GARGANTA.

Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el área faríngea, el


estudio bacteriológico del exudado faríngeo es uno de los procedimientos que
con mayor frecuencia se realizan en el laboratorio clínico. La flora aislada
incluye cocos y bacilos, tanto Grampositivos como Gramnegativos además de
encontrarse cierto número de levaduras.
Para un estudio satisfactorio del exudado faríngeo es necesario tomar una
adecuada muestra de la región de amígdalas y faringe. El cultivo se efectúa
para demostrar la presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus
agalactiae y otras especies del género Streptococcus.

Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta


son las siguientes:

72
 Streptococcus pneumoniae

 Haemophilus influenzae

 Staphylococcus aureus

 Klebsiella pneumoniae

 Pseudomonas aeruginosa

Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la

microbiota normal.

OBJETIVOS

1- Colectar muestras de exudado faríngeo en forma adecuada y cuando sea

conveniente la estudie por la técnica del examen directo con la coloración de

Gram y Azul de metileno.

2- Observar los microorganismos presentes en las preparaciones anteriores y

determinar cuales pudieran ser patógenos de la faringe. Escribir el reporte

correspondiente.

3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus

compañeros.

4- identificar los posibles microorganismos patógenos aislados en los medios de

cultivo y realizar pruebas especiales para su identificación.

MUESTRA:

La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algún tratamiento con

antibióticos. Además si el paciente ya comió se recomienda dejar pasar unas

dos horas para que se vuelva a formar la secreción deglutida.

73
Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los

lados), observar las siguientes lesiones:

 Inflamación (Enrojecimiento)

 Pus (secreción blanquecina o amarillenta)

 Úlceras blanquecinas.

Con un hisopo estéril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no

tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al

retirar el hisopo.

PROCEDIMIENTO:

1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos
cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser
aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja.
El propósito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para
alejarlos del oxígeno atmosférico y así incrementar la hemólisis tipo beta.
2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin
necesidad de hacer sub-cultivos proceder así: Con pinza flameada y fría,
colocar en la zona de más fuerte inoculación en el agar sangre de carnero
(primera estría), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 –10 mm de
distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus
pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibiótico
neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de éste disco.

3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo


una toalla de papel húmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir
una candela corta y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagará sola.

4. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C

74
INTERPRETACIÓN.
Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados
faríngeos, tomar en cuenta lo siguiente:

Tipo de Hemólisis Apariencia del Halo


ALFA Verde (Incompleta)

BETA Claro, del color del medio (Completa )

REPORTE
Inhibición por Bacitracina Reportar
+ (Si produce halo) Se aisló Streptococcus pyogenes beta
hemolítico del grupo “A” de
Lancefield

- (No inhibición) Streptococcus sp. beta hemolítico no


del grupo “A” de Lancefield
DISCUSION
1- Reporte preliminar
2- Toma de muestra.
3- Cultivo. Medios utilizados. Inoculación. Lectura e interpretación.
4- Subcultivo. Identificación. Antibiograma.
5- Reporte final.

75
PRACTICA No.11
SECRECIONES GENITALES

PROPÓSITO:
Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que
infectan los órganos genitales femeninos y masculinos, tales como:

 Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea.


 Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis.
 Treponema pallidum: Bacteria causante de la sífilis.
 Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis.
 Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.

OBJETIVOS

76
1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la coloración de
Gram.
2. Elaborar el reporte preliminar.
3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha
bacteriológica correspondiente para la identificación del microorganismo
causante de la infección.
4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
5. Elaborar el reporte final.

LA TOMA DE LA MUESTRA

HOMBRES:
1. Tener listo: hisopos estériles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar
Thayer –Martin.
2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción.
3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo
rodar el palillo sobre la lámina, no frotar
4. Simultáneamente inocular los medios sólidos (agares)

MUJERES:
1. En las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo. Tener listo el
mismo material que en el caso de los hombres.
2. Hacer el mismo procedimiento.

PROCEDIMIENTO:
1. Colorear los frotis con coloración para Gram.
2. Con asas flameadas y frías, diseminar por estrías el inoculo sobre la
superficie de las placas.
3. Incubar el agar sangre y el de Thayer –Martín durante 24 a 48 horas a 36°C
en jarro húmedo con candela encendida.

77
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y
Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de
los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)

CULTIVO: Después de 24 a 48 horas de incubación a 36°C en jarro con


candela, examinar el Thayer –Martín, ya que este contiene sustancias
enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la
prueba de oxidasa para verificar género.
La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo
líquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo.
Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de
oxidación de tres azúcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa).

DISCUSION
1- Toma de muestra.
2- Diagnostico preliminar.
3- Medio de cultivo. Composición. Incubación.
4- Interpretación del cultivo
5- Pruebas bioquímicas utilizadas.
6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7- Reporte final.

78
SECRECIONES

 Agar Sangre
 Agar Chocolate
 Agar Mac Conkey
 Tioglicolato
 Gram
Incubar de 18 a 24 horas

Crecimiento
No crecimiento
Reincubar 24 horas más

Gram Crecimiento en placas No crecimiento


Identificar bacteria ó en subcultivos de
Sensibilidad caldo Reporte

79
Reporte Cultivo negativo a
Bacteria aislada las 48Gram
horas de
Sensibilidad Identificar bacteria
incubación
Sensibilidad

Reporte nombre de
bacteria y sensibilidad

BIBLIOGRAFÍA

Gustavo A. Gini Q.B. “Manual de Procedimientos para la Identificación de


las bacterias con importancia clínica”, Segunda Edición, Guatemala 1995.

Ministerio de Salud Pública y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio


“Manual Normativo, toma, manejo y envió de muestras para análisis de
laboratorio”. Páginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.

Miguel Francisco Torres. “Manual Práctico de Bacteriología Médica”.


Segunda Edición. Páginas 41-189, Guatemala 1999.

Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi “Diccionario de Bacteriología Humana”


Centro Documentación Científica Menarini Barcelona 1990.

80
Hospital Nacional de Niños Benjamín Bloom. “Manual de Técnicas de
Microbiología” Pág. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.

Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico


Microbiológico. 4ta Edición. Editorial Médica Panamericana.

Anexos

81
Anexo 1
Coloraciones
COLORACIÓN DE GRAM.

1. Hacer un frotis.
2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto.
4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua
5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto.
6. Lavar con agua de chorro.
7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos.
8. Lavar con agua de chorro.
9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.
10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con
objetivo 100x.

INTERPRETACION
 Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado.
 Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.

82
TINCION DE ALCOHOL ÁCIDO RESISTENTE.
(Ziehl- Neelsen).

Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias
que por su alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con dificultad
por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten el
colorante aún cuando se les lave con una mezcla de alcohol- ácido clorhídrico.
Esta tinción es importante para distinguir, entre otras las bacterias ácido
resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen
varias técnicas para este tipo de tinción, sin embargo nos referimos a la de
Ziehl- Neelsen.

REACTIVOS:
1. CARBOLFUCSINA:
Fucsina básica...................................... 0.3 g
Etanol 95°C........................................... 10.0mL
Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL
Agua destilada....................................... 95.0mL

Disuelva la fucsina básica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos


soluciones y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en
frascos ámbar a temperatura ambiente.

2. ALCOHOL- ÁCIDO:
Etanol 95°C.............................................97.0mL
Ácido clorhídrico concentrado................ 3.0mL
Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura
ambiente.

3. AZUL DE METILENO:

83
Azul de metileno.................................... 0.3 g
Agua destilada....................................... 100.0mL
Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitación. Almacene en
frascos ámbar a temperatura ambiente.

FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES.

PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.

2. Cubra la lámina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que


haya emisión de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE
SEQUE. Agregue más carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisión
de vapor durante 3-5 minutos.

3. Lave la preparación con agua del grifo.

4. Decolore con alcohol- ácido durante 2 minutos o hasta que queden sólo
trazas de color rosado.

5. Lave con agua del grifo

6. Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto.

7. Lave con agua del grifo.

8. Deje secar y observe con objetivo de inmersión.

RESULTADO:
Bacterias alcohol- ácido resistentes: rojas.
Bacterias alcohol- ácido sensibles: azules.

84
CONTROL DE CALIDAD:
Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol ácido resistentes
(Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- ácido sensibles (Staphylococcus sp.)

COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO PARA


MUESTRAS DE HECES.

Es una coloración directa simple usada para diferenciar las características


morfológicas de microorganismos y glóbulos blancos en materia fecal. Utilizado
para diferenciación de glóbulos blancos en muestras de heces el procedimiento
puede desarrollarse: Con un montaje húmedo (directo al fresco) o con frotis de
heces que contengan leucocitos (el cual ha sido previamente fijado).

PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS.


1. Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.

2. Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar.

3. Cubrir la preparación con azul de metileno por 30-60 segundos.

4. Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.

INTERPRETACIÓN.

85
En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades
invasivas.

Predominio de Neutrófilos: se asume que existe un proceso infeccioso de


origen bacteriano.
Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen
viral.
Elevado número de Eosinófilos: Se sospecha la presencia de parásitos o una
enfermedad crónica.

REPORTE.
 Contar 100 células y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de
PMN.
 Si están escasas las células reportar: solo el número de células
encontradas sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos.
 Si no se observan células, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.

86
Anexo 2.
Otras pruebas bacteriologicas

PRUEBA DEL CORDÓN.

En una lámina colocar unas gotas de desoxicolato de sodio al 0.5% y


suspender las colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve
sumamente viscosa si es una bacteria del género Vibrio. Esta viscosidad se
puede visualizar mejor si se sumerge dentro de la mezcla un asa. Al retirar el
asa de la preparación se forma un cordón o hilo de mucosidad entre el asa y la
mezcla.

PRUEBA DE LA COAGULASA.

La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno


que está presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se
evidencia en el laboratorio por la formación de un coágulo visible.

Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre


produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.

87
La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a
la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo
la prueba en lámina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en
tubo. La prueba en lámina es presuntiva y a todos los cultivos que den la
prueba débil o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas
cepas de S. aureus sólo producen la coagulasa libre.

MEDIOS Y REACTIVOS.
1. Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estéril, no
nitratada.
2. Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite
en un balón aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca
de aforo.
3. Medio de cultivo: Cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse
para que crezca el microorganismo a probar.

PRUEBA EN LAMINA.
1. Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio.
2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido
en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsión homogénea en la
gota de solución salina.
3. Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.
4. Observe si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de
coágulos blancos.

PRUEBA EN TUBO.
1. Agregue asépticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estéril 12 x 75 mm.

88
2. Añada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusión de cerebro y corazón o
una asada de un cultivo crecido en un medio sólido.
3. Incube el tubo en un baño María a 35°C.

LECTURA E INTERPRETACIÓN

1. PRUEBA EN LAMINA:
PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un
período de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece
precipitado, monte la prueba en tubo.

PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea.


Confirme el resultado con la prueba en tubo.
2. PRUEBA EN TUBO:
Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas está
negativa, deje 24 horas en el baño María.

PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de


coágulo.

PRUEBA NEGATIVA: Suspensión permanece homogénea.

CONTROL DE CALIDAD:
a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35°C.
b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de Cloruro de calcio
al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1
minuto.

89
c. Control positivo: S. aureus.
d. Control negativo: S. epidermidis.

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar


falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que
utilizan citrato causan coagulación del plasma al consumirlo.

2. Si el cultivo a probar tiene más de 24 horas o es escaso se puede obtener


una prueba de coagulasa débil.

3. Si una colonia no se suspende en la solución salina en la prueba en lámina,


el resultado es imposible de interpretar.

4. No se deben emplear inóculos provenientes de medios con alta


concentración de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solución salina.

5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la


formación de coágulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un
rompimiento del coágulo inicial que no se formará de nuevo.

6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas


de S. aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que
el coágulo se puede lisar antes de 4 horas e interpretar erróneamente el
resultado como negativo.

90
7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formación del
coágulo se evidencia hasta las 24 horas de incubación.

PRUEBA DE LA CATALASA.

La catalasa, es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y


anaerobias facultativas.

El peróxido de hidrógeno es uno de los productos finales del metabolismo


oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a
la siguiente reacción:

CATALASA
H202 2H2O+O

Esta prueba es de vital importancia en la diferenciación de Streptococcus


(catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).

91
REACTIVO
Peróxido de hidrógeno al 3%: Se prepara con peróxido de hidrógeno y agua
destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se
descompone fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color
ámbar. Además justo cuando se va a usar debe revisarse que dé bien con los
controles de calidad.

1. PRUEBA EN LAMINA.
a) Con una aguja bacteriológica o un aplicador estéril, pique el centro de una
colonia bien aislada y transfiera el inóculo a un portaobjeto limpio.
b) Añada 1 o 2 gotas de peróxido al 3%.
c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade
el reactivo.
d) Descarte la lámina en un recipiente con desinfectante.

2. MÉTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR.


a) Añada unas gotas del peróxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la
superficie donde hay crecimiento.
b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.

CONTROL DE CALIDAD.
a) Control positivo: Staphylococcus sp.
b) Control negativo: Streptococcus sp.

PRECAUCIONES.
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de
platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de
nihcrome no interfiere.

92
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos
pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.
3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se debe
evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En
caso que ocurran, inunde de inmediato el área afectada con alcohol al 70%
para neutralizar la acción. NO DEBE USAR AGUA.

PRUEBA DE OXIDASA.

La enzima Oxidasa, conocida también como CITOCROMO O OXIDASA O


INDOFENOL OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres
vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su función
es la de promover la oxidación del citocromo “c” a expensas del oxígeno
molecular.

En bacteriología se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una


población bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- p-
fenilendiamina y el resultado observado es la aparición de color que va del
rosado al púrpura.

Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:

2 citocromos “c” reducidos + 2H* + ½ O2 CITOCROMO.c2 citocromo “c” oxidativos + H2O


OXIDASA.

2 citocromos “c” reducidos + REACTIVO COMPUESTO COLOREADO


OXIDACIÓN

93
Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias Gram
negativas y en la diferenciación de cocos Gram positivos de importancia clínica:
Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S.
Sciuri).

REACTIVOS.
I. PARA GRAM NEGATIVOS.
1. REACTIVO DE KOVAC
Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g
Agua destilada................................................................... 10 mL.

Agregue agua al tetrametil – p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario


caliente lentamente para lograr la disolución completa.
Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si
presenta otro aspecto, descártelo; es poco estable y se oxida rápidamente, de
tal forma que debe prepararse justo antes de usarlo.
De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MÁS
SENSIBLE.

2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD:


Dimetil – p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g
Agua destilada...................................................................10 mL

Agregue el agua al dimetil –p- fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario,


caliente lentamente para lograr la disolución completa.

Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro
aspecto, descártelo. Es más estable que el reactivo de Kovac pero MENOS
SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.

II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

94
1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER:
Tetrametil – p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g
Dimetilsulfóxido.................................................................10 mL.

Agregue el dimetilsulfóxido al tetramil- p- fenilendiamina y disuélvalo. Este


reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible.
Almacénelo en botellas color ámbar. Si el reactivo presenta otro color,
DESCARTELO.

PROCEDIMIENTO
I. PARA GRAM NEGATIVOS
A. TIRAS DE PAPEL
A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino
o palillo de madera estériles y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro
impregnada con el reactivo para oxidasa

B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA.


Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.

II. PARA COCOS GRAM POSITIVOS.


A partir de un agar incubado a 36°C por 18-24 horas en atmósfera aerobia tome
una asada del cultivo y espárzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del
reactivo de Faller y Schleifer.

LECTURA E INTERPRETACIÓN:

a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un período de hasta 10


segundos.

95
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un período de
hasta 30 minutos.
c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un período de
hasta 2 minutos.

PRUEBA POSITIVA: Aparición de color púrpura en el tiempo estipulado


PRUEBA NEGATIVA: No aparición de color púrpura en el período señalado.

CONTROL DE CALIDAD:
a) Control positivo para:
Gram negativos: Aeromonas hydrophila.
Pseudomonas aeruginosa.

Gram positivos: Micrococcus sp.

b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli

Gram positivos: Staphylococcus aureus.

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES:

96
1. La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para
oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia
orgánica, ya que ésta contribuye a oxidar el reactivo.

2. No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios


que contengan glucosa, ya que su fermentación inhibe la actividad de la
enzima y ocasiona falsos negativos.

3. La prueba debe realizarse únicamente a colonias provenientes de medios


no selectivos y no diferenciales.
4. Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que
ésta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidación del
reactivo y dar falsos positivos.

5. La reacción debe observarse ÚNICAMENTE en la colonia y no alrededor


de ésta.

6. El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas


(mucosas) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca
penetración del reactivo.

97
Anexo 3.
PROCEDIMIENTOS BACTERIOLÓGICOS
PARA LA INOCULACIÓN O INTERPRETACIÓN DE LAS
PRUEBAS BIOQUÍMICAS.

1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI).


A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el
asa en punta. Picar el medio hasta el fondo solamente una vez y luego
estriar el “Bisel”. Incubar a 36°C. Por 18 a 24 horas.
Interpretación de las reacciones en TSI:

A- Utilización de los carbohidratos.


1. Fermentación sólo de la glucosa:
Bisel: alcalino (rojo), Fondo: ácido (amarillo).

2. Fermentación de la glucosa y otro azúcar:


Bisel: ácido (amarillo), Fondo: ácido (amarillo).

3. Ninguno de los carbohidratos es fermentado:


Bisel: alcalino (rojo), Fondo: alcalino (rojo).

98
B- Producción de gas.
Positivo:
 Burbujas dentro del medio
 Rompimiento del medio
 Desplazamiento del medio hacia arriba.

Negativo:
 No se produce lo anteriormente descrito en el medio.

C- Producción de H2S
Positivo:
 Todo el fondo del tubo se observa negro, ó se produce un precipitado
escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel).

Negativo:
 No se observa ningún precipitado negro.

2. LA UTILIZACIÓN DEL CITRATO.

99
Se inocula el medio sólido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia
aislada, se estría únicamente el bisel.
Incubar por 24-48 horas a 35- 36°C, en algunos casos puede requerirse una
incubación de 4 días.

INTERPRETACIÓN.
Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter
freundii).

Negativo: No hay crecimiento ni cambio de color (Control: Escherichia colí


ATCC 25922).

3. PRUEBA DE LA UREASA:
Inocular el medio de urea (caldo o sólido) a partir de una colonia pura, el
más utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estría únicamente en el
bisel.
Incubar a 35°C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 días si es necesario.

INTERPRETACIÓN.
Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis).
Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Colí ATCC 25922).

4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD.
Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de
18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriológica e introduciéndola en
el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35°C por 24-
48 horas y el otro se mantiene durante el mismo período de tiempo a
temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad
únicamente a temperatura ambiente.

INTERPRETACIÓN

100
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se observan los tubos inoculados
comparándolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es móvil.

Prueba positiva: Se observará migración de la bacteria a partir de la línea de


inóculo que se manifiesta por la aparición de turbidez en el tubo. En bacterias
no fermentadoras puede observarse esta misma migración pero a nivel de la
superficie del medio.

Prueba negativa: La bacteria crecerá solamente a lo largo de la línea de


inoculación y el resto del tubo permanece sin turbidez.

CONTROL DE CALIDAD:
a) Control de esterilidad: 24 horas a 35°C.
b) Control positivo: Escherichia colí y Pseudomonas sp.
c) Control negativo: Klebsiella sp.

5. PRUEBA DE INDOL.
Inocular el microorganismo en un caldo o medio semisólido que contenga
triptófano.
Incubar a 36°C por 24 horas.
Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente.

INTERPRETACIÓN
Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio.
Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo
Control positivo: E. Colí ATCC 225922.
Control negativo: Enterobacter cloacae.

ROJO DE METILO Y VOGES – PROSKAUER

101
Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien
aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36°C.

INTERPRETACION
ROJO DE METILO (RM).
 A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo
limpio.
 Agregar a éste 5 gotas del indicador rojo de metilo.

Positivo:
 El indicador permanece rojo.

Negativo:
 El indicador cambia a un color amarillo.

VOGES-PROSKAUER (VP):
 A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6
gotas del reactivo de alfa- naftol ( α - naftol) y luego 2 gotas de KOH al
40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos. Se
sugiere agitar de vez en cuando.

INTERPRETACION
Positivo: Color rojo o rosado en el medio.

Negativo: El medio no tiene color o es amarillo.

Control positivo: Klebsiella pneumoniae.

Control negativo: Escherichia Colí ATCC 25922.

102
TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.

ROJO
VOGES-
BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD DE
PROSKAUER
METILO
Proteus AóK A + 2-4+ +ó- + + + + -
vulgaris
Proteus K A + 4+ + ó (+) + - + + -/+
mirabilis
Morganella K A + - - -ó+ + + + -
morganii 1/2
Proteus K A -ó - + + + + + -
retgeri +w
Providencia K A + - + - + + + -
stuartii
Providencia K A - - + - + + + -
alkalifaciens
Edwarciella K A - + - - + + + -
torda
Yersinia A A - - - + - -A + -
pseudote-
berculosis
Yersinia A A - - - + +ó- -A + -
enterocolitica
Pseudomona K K - - + - - + - -
s aeroginosa
Pseudomona K K - - + - - + - -
flurorecens
Pseudomona K K - - - - - + - -
s multophilia
Pseudomona K K - - +ó- - - + - -
s cepacias
Pseudomonas K K - - + - - + - -
pseudomollei

103
Pseudomona K K - - + - - - - -
s mallei
Pseudomona K K - - - - - - - -
s stutzeri
Pseudomonas K K - + - - - + - -
putrefaciens
Alcaligenes K K - - +ó- - - +ó- - -
fecales
Alcaligenes K K - - + - - +ó- - -
odorans
Alcaligenes K K - - + - - + - -
Denitrificans

TABLA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS.

ROJO
VOGES-
BACTERIA BISEL FONDO GAS H2S CITRATO UREA INDOL MOVILIDAD DE
PROSKAUER
METILO
Escherichia colí A ó K A +ó- - - - + -ó+ + -
Escherichia colí K A - - - - + - + -

Alcalescens
dispar
Shigella K A - - - - d - + -
dysenteriae
Shigella K A - -** - - d - + -
flexneri
Shigella boydii K A - -*** - - d - + -
Shigella sennei K A - - - - - - + -
Salmonella sp. K A d D - - - + + -
Salmonella K A - +w - - - + + -
Typha
Salmonella K A + - + + - + + -
paratyphi A
Salmonella d A + + - - - + - -
arizonae
Arizona sp. KóA A + 2-4+ + - - + + -
Citrobacter A A + - + d + + + -
intermedius
Citrobacter KóA A + 2-4+ + (+) - + + -
freundii
Klebsiella A A + - + + - - - +
pneumoniae
Klebsiella K A + - D d - - + -
ozonae
Klebsiella K A - - - - - - + -
rhinoschleronal
is
Enterobacter A A + - + + - + - +
cloacae
Enterobacter A A + - + - - + - +
aerogenes
Enterobacter K A + - +ó- - - + - -
hafnae
Enterobacter AóK A -ó+ - +ó- - ó +s -ó+ + -/+ +/-
agglomerans

104
NOMENCLATURA.

D = Diferentes tipos de bioquímicas.


**= Algunas S. Flexneri serotipo 6 producen.
***= Serotipos 13 y 14 son gas+ -
W = reacción débil.
(+) = positivo lento ó tardío.
S = débil
A – ácido - negativo.

Pseudomonas aeruginosa. Oxidasa positiva


Pseudomonas fluorecens Oxidasa positiva
Pseudomonas multophilia. Oxidasa positiva
Pseudomonas cepacia. Oxidasa positiva
Pseudomonas pseudomallei Oxidasa positiva
Pseudomonas mallei Oxidasa positiva
Pseudomonas stutzeri Oxidasa positiva
Pseudomonas putrefaciens. Oxidasa positiva

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NAR/aa

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