III.

PRODUCCION DE CIDO CTRICO A PARTIR DE SUERO LCTEO ENTERO E HIDROLIZADO CON Aspergillus niger, POR VA FERMENTATIVA
Leal D. 1, Pico Y2, Castro J.3, Guerra J.4, Castro G.5* Programa de Ingeniera de Alimentos. Facultad de Ingeniera. Universidad de la Salle Cra 2 N 10-70, Bloque D piso 7 *gacastro@unisalle.edu.co
1,2,3,4,5

RESUMEN El suero lcteo es un subproducto obtenido en gran cantidad en la elaboracin de quesos, por lo cual se buscan nuevas alternativas de aprovechamiento, una opcin es producir acido ctrico utilizando el suero lcteo como sustrato. En este trabajo se produjo acido ctrico a partir del suero lcteo entero (SE) e hidrolizado (SH) por medio de una fermentacin realizada con Aspergillus niger 765. Se inocul el hongo en los medios preparados de suero entero e hidrolizado con adicin de 48 mg de fosfato dicido de amonio ((NH4)H2PO4), se incubaron los medios a 30 C por ocho das durante los cuales se realizaron pruebas para determinar azucares reductores totales (ART), biomasa, produccin de acido ctrico, glucosa y pH. Hubo un consumo de azcares similar en los dos medios tratados (SE y SH), se present disminucin de pH debido a la fermentacin, un aumento exponencial de los microorganismo siendo mayor en el hidrolizado por tener disponibilidad de glucosa en el tiempo inicial. La produccin de acido ctrico fue similar en los dos medios, lo cual indica que independiente de la hidrolisis de azcares complejos realizada a uno de los medios (SH), el Aspergillus niger tiene la capacidad de producir cido ctrico desdoblando por si mismo la lactosa. La cantidad de biomasa producida en cada medio fue de 8,7g/L para SE y 15,2g/L para SH. La produccin final de acido ctrico para el suero entero e hidrolizado fue de 9,9g/L y 9,6g/L respectivamente. Palabras claves: cido ctrico, Aspergillus niger, suero de leche, hidrlisis de lactosa. ABSTRACT The whey is a byproduct obtained in large quantities in the manufacture of cheese, so it is looking for new alternative uses; one option is to produce citric acid using cheese whey as substrate. In this work, citric acid produced from whey whole (SE) and hydrolyzed (SH) through fermentation by Aspergillus niger 765. The fungus was inoculated in the media prepared whole and hydrolyzed whey with the addition of 48mg of ammonium dihydrogen phosphate (NH4) H2 PO4, media were incubated at 30 C for eight days during which tests were used to determine total reducing sugars (TRS, biomass, production citric acid, glucose and pH. There was a similar sugar consumption in the two media treated (SE and SH), there was a pH decreasing and a microorganism exponential increase being higher in

the hydrolyzate due to the availability of glucose in the initial time. The production of citric acid is similar in both media, indicating that despite the complex sugars hydrolysis in one of the means (SH), Aspergillus niger is capable of producing citric acid unfolding itself lactose. The final production of citric acid in whole whey and hydrolyzed whey was 5.246 g /L and 6.752g /L respectively. Key Words: Citric acid, Aspergillus niger, cheese whey, lactose hydrolysis.

I.

INTRODUCCIN

La industria de alimentos es una de las que producen mayor contaminacin, esto debido a la generacin de residuos orgnicos e inorgnicos durante sus procesos. En la industria lctea, algunos efluentes como el suero lcteo, forman parte de los residuos de mayor proporcin que existen; obtenido a partir de la elaboracin de los diferentes quesos del mercado; este subproducto comprende del 80 al 90% del volumen de la materia transformada. A pesar de los diferentes manejos que se han dado, casi el 50% del suero es descargado en suelo, drenajes y cuerpos de agua, el porcentaje restante es utilizado en la elaboracin de otros productos lcteos. Una alternativa para el aprovechamiento de subproductos se busca por medio de la biotecnologa; en donde el suero puede suministrar fuentes de carbono y energa (por medio de la lactosa contenida en este), como medio de cultivo para el desarrollo de diferentes microorganismos y por consiguiente la obtencin de metabolitos de gran importancia (Snchez et al., 2004). Es de aclarar que hay muy pocos microorganismos que pueden utilizar la lactosa como fuente, pero al hidrolizar este disacrido obteniendo glucosa y galactosa, se aumenta la posibilidad de utilizar ms microorganismos para estos procesos fermentativos (Lpez et al.,

2006). El suero de leche ha sido de gran uso en la obtencin de diferentes cidos, como lo son lctico, actico, propinico, glucnico y ctrico, (Lpez et al., 2006), adems es empleado en la misma medida para la propagacin de inculos en queseras, produccin de vinos, entre otras aplicaciones. El acido ctrico es obtenido industrialmente por la fermentacin de la glucosa o sacarosa obtenida de melaza de caa con Aspergillus nger (Snchez et al., 2004), el proceso tiene varias etapas como lo son la preparacin del sustrato de la melaza de caa, La fermentacin por parte del microorganismo A. niger, separacin, purificacin, cristalizacin y secado del acido ctrico. Siendo importante este cido por ser un producto de gran demanda en diferentes industrias (farmacutica, cosmtica, plsticos, detergentes) especialmente en alimentos como modificador de pH y acidulante. II. MATERIALES Y MTODOS. 2.1. Microorganismo Para la experimentacin se utiliz una cepa de Aspergillus niger 765, suministrada por la Universidad de los Andes, la cual fue mantenida en refrigeracin a 4 C. Para su posterior uso se realiz una re-siembra en Agar Saboraud en cajas de petri y en tubos,

incubado a 25 C por 7 das hasta que germinaran las esporas. Luego se realizaron suspensiones en agua esterilizada con twin 80 de aproximadamente 2 x 107 esporas/mL para su posterior inoculacin en los medios elaborados (Snchez et al., 2004). 2.2. Suero de leche Se utiliz suero lcteo deshidratado (protena del 9% base seca), posteriormente reconstituido, con el fin de obtener una humedad del 97%, simulando el que se obtiene normalmente en plantas queseras. El 50% del suero reconstituido fue sometido a un proceso de hidrlisis por va enzimtica, la cual es de mayor eficiencia que la hidrlisis cida (Ros et al., 2006), utilizando la enzima Maxilact (Lactasa comercial). Se toman 250 mL de suero y se adiciona 2 mL de Maxilact a 37 C y pH=6.6 durante 1 hora para obtener una hidrlisis del 80% (Lpez et al., 2006). Para asegurar que el suero ha sido hidrolizado adecuadamente, se realiz una prueba de determinacin de hidrlisis de la lactosa por el mtodo de glucosa-oxidasa. 2.3 Medio de cultivo de Aspergillus niger para produccin de cido ctrico Los medios utilizados para la experimentacin fueron suero entero (SE) y suero hidrolizado (SH); con el fin de comparar entre ellos, cual es el mejor sustrato para la produccin de cido ctrico, se adicionan 100 mL de cada tipo de suero en erlenmeyers de 250 mL, a los cuales se les adicion fosfato dicido de amonio ((NH4)H2PO4) en relacin de

48 mg/kg, el pH se ajust a 4 utilizando cido clorhdrico (HCl) 0.1N. Posteriormente fueron esterilizados a 121 C por 15 min. Se inocul cada medio con 3,4 mL de la suspensin de esporas (3%v/v) y se incubaron a una temperatura de 30 C (Snchez et al., 2004). 2.4. Mtodos de anlisis Luego de establecer las variables a manejar y las condiciones de produccin de acido ctrico, Se realiz un seguimiento durante 8 das, evaluando azcares reductores totales (ART), contenido de glucosa, biomasa y produccin de acido ctrico a una temperatura de 30 C, en donde se tomaron muestras cada 24 h. Para evaluar el contenido de azcares reductores totales, se determin por el mtodo DNS (cido 3,5-dinitrosaliclico), la glucosa se determin por el mtodo cuantitativo de glucosa IVD, las muestras fueron previamente desproteinizadas con cido tricloroacetico al 10%, para evitar que estas interfirieran con los resultados. El contenido de cido ctrico se estim por el mtodo espectrofotomtrico de la piridina-anhdrido actico (Marier y Boulet, 1958). La determinacin de biomasa se llev a cabo por el mtodo de peso seco (contenido de slidos) de las clulas bacterianas que se encuentran en una suspensin se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105 C hasta peso constante.

SUERO DESHIDRATADO RECONSTITUCIN DEL SUERO

para suero hidrolizado, lo cual supera lo encontrado por Lpez 7,02 g/L para suero desproteinizado, como en este caso.

SUERO

HIDROLISIS SUERO

ADICIONAR 48mg DE PO4-3

ESTERILIZAR MEDIOS (15min a 125 C) AJUSTE pH INOCULACION

Grfica 1. Produccin de de acido ctrico

INCUBACION PRUEBAS

3.2. Consumo de glucosa Diagrama 1. Preparacin de medios de cultivo para produccin de cido ctrico 2.5 Tratamiento de datos Las pruebas se realizaron por duplicado, analizndolas por mtodo descriptivo y de varianza ANOVA con un nivel de confianza del 95%. III. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1. Produccin de cido ctrico En la produccin de acido ctrico se observa una similitud en la cantidad producida entre los dos medios de suero preparados. La produccin final de cido ctrico en cada medio fue muy similar obtenindose 9,963 g/L para suero entero y 9,581 g/L La grfica 2. Muestra que el medio hidrolizado tiene mayor disponibilidad inicial de glucosa con 16,15 g/L en comparacin con el suero entero con un valor inicial de 4,91g/L, esto debido a la accin de la enzima Maxilac, la cual desdobla la lactosa en glucosa y galactosa. En ambos casos se ve disminuida la glucosa durante el tiempo y en el da ocho se observa el consumo total de glucosa en los dos medios, alcanzando niveles similares de glucosa en las ltimas tomas. Para el suero entero se puede inferir que a medida que el microorganismo desdobla la lactosa, la convierte de inmediato en cido ctrico, ya que no se observa una lectura alta de la glucosa para ninguno de los das.

Grfica 2. Determinacin del contenido de glucosa durante el tiempo de anlisis

Grfica 3. Determinacin del contenido de ART durante el tiempo de anlisis. 3.5. Determinacin pH

3.3. Consumo Reductores Totales

de

Azcares

La grfica 3. Muestra que hay mayor cantidad de azcares reductores inciales en el hidrolizado que en el entero con valores de 46,1 g/L y 23,7 g/L respectivamente. Pero en el da cuatro tienen la misma reduccin hasta 13 g/L y en el ltimo da de anlisis tienen valores de aproximadamente 3 g/L al comparar esto con la grfica 2 donde se reporta el consumo total de la glucosa se determin que la disponibilidad reportada en esta grfica se trata de otros azcares reductores diferentes a este; sin embargo la fuente utilizada para produccin de cido ctrico es la glucosa y no la galactosa, por lo cual esta cantidad restante no es utilizada para la produccin de este cido.

Inicialmente el suero tiene un pH de 4,1 y despus de los ocho das de anlisis el pH obtenido estuvo entre 3,5 y 3,8, como se observa en la Grfica 4. Lo cual indica una acidificacin del medio producido por la fermentacin que realiza el Aspergillus niger al producir el cido ctrico, es evidente la relacin directa entre la produccin de ste y el descenso en el pH. Estos valores coinciden con los trabajados por Snchez.

Grfica 4. Determinacin del contenido de pH durante el tiempo de anlisis.

3.6. Produccin de Biomasa En el da uno, la produccin de biomasa en el medio de suero entero es mayor que el hidrolizado, pero en el ultimo da el fenmeno es contrario por que hay mayor cantidad de microorganismos en el medio de suero hidrolizado por tener desde el inicio una fuente alta de glucosa. La cantidad de biomasa en el suero hidrolizado fue de 15,21 g/L y en el suero entero de 8,75 g/L mostrando una diferencia significativa (grfica 5). Esta diferencia en la cantidad de biomasa obtenida en el medio, se debe a la cantidad de glucosa disponible, sin ser un factor que afecte la produccin final de cido ctrico, ya que metablicamente la biomasa se puede aumentar, con la mayor disposicin de azcares reductores diferentes a la glucosa, para el suero hidrolizado. Lpez obtuvo un valor de 16 g/L aproximadamente, utilizando suero entero

pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradacin. Adems, la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta. IV. CONCLUSIONES Se puede concluir que el Aspergillus niger, es un microorganismo adecuado para la produccin de cido ctrico a partir del suero lcteo, sin observar diferencia entre el suero entero e hidrolizado, es decir que este microorganismo es capaz de sintetizar de forma eficiente la lactosa y tomar la glucosa como fuente de energa para su crecimiento; y as realizar la fermentacin para producir este cido. La cantidad de glucosa en el medio el da ocho fue de 0.27 g/L en suero entero y 0.20 g/L en suero hidrolizado. El tiempo de seguimiento escogido fue de ocho das siendo suficiente para agotar la glucosa y producir el cido ctrico, su produccin fue en forma logartmica proporcional al crecimiento de los microorganismos con una concentracin final de cido ctrico de 9,963 g/L en suero entero y 9,581 g/L en suero hidrolizado y una biomasa de 8.75 g/L y 15.21 g/L respectivamente, indicando que hidrlisis de lactosa solo favorece al crecimiento del microorganismo y no influye significativamente en la produccin de cido. Se recomienda que el cido ctrico obtenido a partir del suero lcteo por Aspergillus niger, sea extrado y refinado

Grfica 5. Determinacin del contenido de biomasa durante el tiempo de anlisis.

La desventaja de este mtodo es que componentes voltiles de la clula

para posteriores aplicaciones en la industria alimentaria, adems que su efecto sea comparado con el obtenido industrialmente con la melaza de la caa. V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Alderete, Juan Manuel. cido ctrico. Direccin de Industria Alimentaria S.A.G.P. y A., Alimentos Argentinos N 12. Pg. 5 de 7. Consultado en: http://www.alimentosargentinos.gov.ar/0 -3/revistas/r_12/Citrico.PDF Currie, James N. The citric acid fermentation of Aspergillus niger. Received for publication, April 20. From the Research Laboratories, Dairy Division, United States Department of Agriculture, Washington. Consultado en: http://www.jbc.org/content/31/1/15.full.p df Lpez C., Meneses A., Herrera S., Ruiz A., Medina V. (2006). Produccin de cido ctrico con Aspergillus niger nrrl 2270 a partir de suero de leche. Universidad Nacional de Colombia, Medelln. vol. 73 No.150 DYNA. Consultado en: http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid= S001273532006000300004&script=sci_arttext . Marier I R, Boulet M. Direct determination of citric acid in milk with an improved pyridine-acetic anhydride method (1958). J. Dairy Sci. 41:168392,. [Div. Applied Biology, National Research Council, Ottawa, Canada]. Consultado en:

http://www.garfield.library.upenn.edu/cla ssics1983/A1983RN89600001.pdf. Snchez O, Ortiz M, Betancourt A. (2004). Obtencin de cido ctrico a partir de suero de leche por fermentacin con Aspergillus spp. Revista Colombiana de Biotecnologa, Vol VI, N 001, p 43-54