RIBONUCLEASI Le ribonucleasi sono degli enzimi che catalizzano l'idrolisi dell' RNA a livello del legame fosfodiestereo.

La ribonucleasi A pancreatica una endonucleasi, catalizza la rottura di un legame fosfodiestereo interno alla molecola, con una elevata specificit di taglio a livello dei nucleotidi pirimidinici. Nel sito attivo dell' enzima sono presenti due residui di istidina (His-12 e His-119) che svolgono un ruolo di catalizzatore acido/base e un residuo di lisina (Lys-41) che stabilizza gli intermedi pentacovalenti (stato di transizione); Il substrato viene ancorato all' enzima attraverso la formazione di due ponti idrogeno nella cosidetta 'tasca di legame per le pirimidine' (Thr-45). His-12, come catalizzatore basico generale, strappa un protone dall' ossidrile 2'; lo ione alcossido in 2' effettua un attacco nucleofilo sull' atomo di fosforo generando un intermedio pentacovalente. L' intermedio pentacovalente (stato di transizione) stabilizzato dalla carica positiva di Lys41, collassa e His-119, come catalizzatore acido generale, dona un protone all' ossidrile 5' del nucleotide adiacente: una met dell' RNA viene rilasciata nel mezzo, mentre sul nucleotide terminale dell'altra met ancora legata all' enzima si forma un 2',3' fosfodieststere. Con l' ingresso dell' acqua nel sito attivo inizia la seconda parte del meccanismo catalitico. His-119 rimuove un protone da una molecola di acqua generando uno ione idrossido che attacca il fosforo del nucleotide 2',3' ciclico: l' intermedio pentacovalente viene stabilizzato da Lys-41. Il collassamento dello stato di transizione portato a termine da His-12 che dona un protone all' ossigeno 2'. La seconda met dell' RNA viene rilasciata nel mezzo, mentre l' enzima pronto per un altro ciclo.

LISOZIMA Il lisozima una glicosidasi in grado di idrolizzare il polisaccaride della parete cellulare dei batteri avente un pH ottimale di 5.0. Questo polisaccaride formato da unit alternate di acido N-acetilmuramico (2-N-acetil-3O-lattil-2-deossiglucosio, NAM) e N-acetil glucosamina (2-N-acetil-2-desossiglucosio, NAG) Il lisozima catalizza la rottura del legame 1,4-glicosidico tra il C1 dell' acido N-acetilmuramico ed il C4 del NAG. L anello del MurNAc deve cambiare conformazione ( da sedia a semisedia ) per poter interagire con il sito attivo dell enzima. Il carbossile di Glu-35 in una tasca relativamente idrofobica ed indissociato a pH 5 Il carbossile di Asp-52 in una zona relativamente polare ed dissociato a pH 5 Glu-35 dona il protone all ossigeno del legame glicosidico, provocando la rottura del legame e la formazione di un carbocatione sul C1 del MurNAc. Asp-52 stabilizza il carbocatione (stato di transizione) Glu-35 strappa un protone ad una molecola di acqua generando un ossidrile che neutralizza il carbocatione sul C1 del NAG. Un analogo stabile dello zucchero un chetone; dibattito sul meccanismo: -Phillips: intermedio carbocat planare -Koshland: legame transiente covalente con Asp

PROTEASI Le proteasi sono enzimi che catalizano l' idrolisi di legami peptidici. Le serin proteasi sono una classe di proteasi il cui meccanismo catalitico basato sulla presenza nel sito attivo di un residuo di serina

. Chimotripsina e tripsina sono proteasi digestive sintetizzate in forma di zimogeni inattivi nel pancreas ed attivate nell 'ntestino ad opera di altre proteasi. Entrambe sono delle endopeptidasi ( idrolizzano i legami peptidici interni della proteina dando origine a frammenti pi corti). Le serin proteasi sono cos denominate perch un residuo di serina responsabile dell' attacco nucleofilo al carbonile del legame peptidico. Normalmente l'ossidrile della serina non un buon nucleofilo in quanto il pKa di dissociazione del protone estremamente elevato e quindi il suo protone non si stacca. Nelle serin proteasi esiste per un sistema di legami idrogeno soprannominato, "sistema rel di carica" o "triade catalitica", che coinvolge i residui aminoacidici di Asp-102, His-57 il cui ruolo quello di abbassare il pKa dell'ossidrile della Ser-195 permettendone la ionizzazione L' azoto basico di His-57 rimuove il protone da Ser-195 generando un ossianione L ossianione (forte nucleofilo) attacca il carbonio carbonilico del legame amidico generando un forte nucleofilo intermedio tetraedrico L intermedio tetraedrico stabilizzato dai legami ponte idrogeno tra l' ossianione e i gruppi NH di Gly-193 e Ser-195. Successivamente l' intermedio tetraedrico collassa in seguito alla catalisi acida esercitata da His-57. Si stacca la porzione del polipeptide con l NH2 terminale, mentre il resto del polipeptide rimane ancorato con legame estereo a Ser-195 Il residuo di His-57 strappa un protone ad una molecola di acqua generando un gruppo ossidrile che attacca il carbonio carbonilico: si genera cos un nuovo intermedio tetraedrico L' intermedio tetraedrico collassa in seguito alla catalisi acida esercitata da His-57. La seconda parte del polipeptide viene rilasciata e la serin proteasi torna nello stato iniziale, pronta per un nuovo ciclo di catalisi

Chimotripsina: tasca media ricoperta da residui idrofobici (Phe) Tripsina: tasca profonda con un Asp lungo residuo cationico Arg Lys Elastasi: tasca piccola per residui piccoli e idrofobici CISTEIN-PROTEASI

METALLO-PROTEASI (Carbossipeptidasi) La carbossipeptidasi A un enzima digestivo, una metallo esopeptidasi. La Carbossipeptidasi A catalizza l'idrolisi del legame tra il primo aminoacido e il resto della proteina o del polipeptide, partendo dalla estremit carbossilica. L'idrolisi avviene pi rapidamente se l'aminoacido in questione ha una catena laterale aromatica o alifatica. L'enzima contiene come cofattore metallico lo ione zinco che si tova nel cuore del sito attivo. Qui lo ione zinco forma un legame di coordinazione tetraedrico con tre amino acidi: tramite l'azoto della istidina-69, l'azoto dell'istidina196 e l'ossigeno dell'acido glutammico 72. La quarta posizione una molecola d'acqua. Il meccanismo comunemente proposto che la arginina 127 interagisca col gruppo carbossilico. Lo

ione Zn mantiene un legame con l'acqua, ulteriormente attivato dal glutammato 270. L'idrossido attacca il gruppo carbonilico con il risultato di rompere il legame amidico.

HIV ASPARTICO PROTEASI LHIV-proteasi un termine della famiglia delle proteasi aspartiche. Strutturalmente lenzima costituito da due met uguali, cio un omodimero simmetrico. In questo sito sono presenti due residui aspartici (Asp25) che catalizzano la scissione delle poliproteine. Un Asp deprotonato attiva una molecola dacqua che interverr nella catalisi, mentre lAsp neutro polarizza il gruppo carbonilico del legame peptidico per renderlo pi suscettibile allattacco nucleofilo. Unaltra molecola dacqua va a mediare la chiusura delle orecchiette.

Nella progettazione degli inibitori della PT si imitata la struttura dello stato di transizione inserendo gruppi isosteri nel legame ammidico non idrolizzabili. stato posto un asse di simmetria in diversi posti e se ne fatta limmagine speculare: diolo oppure monoidrossile con la coppia Phe/Phe. Numerosi inibitori sono stati prodotti a partire dalla Statina: ammide ridotto, monoidrossietilene, diiidrossietilene. Criteri per la produzione: Sostituire il legame peptidico con uno non idrolizzabile Modellarne la struttura in base al ST Ridurre le dimensioni Ridurre la natura peptidica non pi di 5 prot.d non pi di 10 prot.a 500-600 Da coeff.di ripartizione >5

Regole di Lepinski:

PIRIDOSSAL FOSFATO Coenzima nella transamminazione - Il piridossalfosfato passa reversibilmente dalla forma aldeidica (piridossalfosfato) che accetta il gruppo amminico dallamminoacido, alla forma amminata (piridossammina fosfato) che dona il gruppo amminico al chetoacido accettore. Prima che allamminoacido, si lega alla catena di una Lys. Il primo substrato (amminoacido) si lega allenzima, dona il gruppo amminico al PLP, che diventa piridossammina fosfato, e si allontana come chetoacido. Il secondo substrato (chetoacido) si lega allenzima, accetta il gruppo amminico dalla piridossammina fosfato ed esce sotto forma di amminoacido (meccanismo catalitico a ping-pong). Nella maggior parte delle reazioni di transaminazione il chetoacido accettore lchetoglutarato. Plp pu dare anche racemizzazione o decarbossilazione

TIAMINA PIROFOSFATO Il meccanismo di reazione della decarbossilazione del piruvato catalizzata dalla tiamina pirofosfato prevede la formazione di un legame covalente tra l'atomo di carbonio adiacente all'atomo di azoto e di zolfo dell'anello tiazolico (C2) (precedentemente deprotonato) ed il carbonio carbonilico (elettronpovero) del piruvato. Questo intermedio della reazione porta poi alla perdita di CO2 in quanto l'anello tiazolico stabilizza il legame con il carbonio carbonilico mentre il gruppo -COO - si riarrangia liberandosi come CO2. Se si considera per lintermedio neutro la reazione procede con la condensazione per dare acetolattato

Regolazione Enzimatica 1. Controllo allosterico 2. 3. 4. 5. 6. Compartimentalizzazione Controllo genico Mod. covalenti reversibili Mod. covalenti irreversibili Inibizione competitiva

1 ASPARTATO TRANCARBAMILASI presente nei batteri e stabilisce quando la timina e la citosina devono essere sintetizzate. Questo enzima composto da sei grandi unit catalitiche e da sei unit regolatorie pi piccole. Il sito attivo dellenzima collocato nel punto dove due unit catalitiche si toccano; se esse sono in stretto contatto, un amminoacido delluna si estende sullaltra, bloccandolo; se, invece, le due unit sono leggermente separate, il sito attivo libero e pu funzionare. Lattivazione o linibizione del sito attivo stabilita dal sistema regolatorio: quando i prodotti della reazione a cui lenzima preposto scarseggiano, le unit catalitiche sono libere e pronte ad interagire con i reagenti permettendo il decorrere della reazione; quando invece i prodotti si accumulano troppo, uno di essi (la citidina trifosfato, CTP) si lega ad ununit regolatoria, costringendo lenzima a cambiare forma e a chiudere il sito attivo. Enzimi come quello appena descritto, il cui funzionamento collegato a un cambiamento di forma, vengono detti allosterici e sono molto frequenti in natura; effetti allosterici di questo tipo rappresentano, infatti, un modo di fornire al sistema segnali di feedback Anche Atp un effettore allosterico: elevate concentrazioni di Atp segnalano la presenza di molte pirimidine e inoltre che c molta energia per la sintesi di mRna e Dna enzima attivato carbammilfosfato + L-aspartato = fosfato + N-carbammil-L-aspartato

4 PKA Fosforilazione

6 cAMP ATTIVA LA PKA La PKA formata da due diverse subunit: una regolatoria e una catalitica; il legame di 4 molecole di cAmp attiva la proteina attraverso un meccanismo che comporta la dissociazione delloloenzima inattivo in una sub regolatoria (R2) e due catalitiche. Ciascuna catena R contiene una sequenza pseudosubstrato con una Ala al posto di una Ser; questa sequenza nella chinasi inattivata blocca il sito catalitico impedendo laggancio della proteina bersaglio. Il legame del cAmp allontana proprio le sequenze pseudosubstrato 5 TAGLI PROTEOLITICI Alcuni enzimi (proteasi) sono prodotti e secreti in forma inattiva (proenzimi o zimogeni). La conversione di una preproteina nella proteina matura richiede un processo di proteolisi selettiva, mediante uno o pi tagli proteolitici. ESEMPI: Enzimi digestivi (pepsina, tripsina, chimotripsina), Ormone insulina, Fattori della coagulazione Gli enzimi proteolitici PANCREATICI agiscono di fatto a livello intestinale e sono secreti dalla componente esocrina del pancreas: 1. TRIPSINOGENO TRIPSINA, questa conversione avviene attraverso un taglio proteolitico con conseguente rilascio di peptide; la proteasi che si occupa della attivazione la ENTEROCHINASI o ENTEROPEPTIDASI rilasciata nel lume, come gi sottolineato, dal duodeno. Anche la TRIPSINA, come la PEPSINA, presenta attivit autocatalitica, inoltre presenta una azione di natura catalitica su tutti gli altri enzimi proteolitici pancreatici: 2. CHIMOTRIPSINOGENO CHIMOTRIPSINA 3. PROELASTASI ELASTASI. 4. PROCARBOSSIPEPTIDASI CARBOSSIPEPTIDASI

CASCATA DELLA COAGULAZIONE: Vi sono due vie principali, che congiungono:

poi

si

La via estrinseca pi rapida per il minor numero di fattori che vi prendono parte. Essa viene attivata quando una lesione di un vaso sanguigno produce la liberazione, dalle cellule danneggiate, di fosfolipidi e di un complesso proteico detto fattore tissutale o tromboplastina tissutale. I fattori attivati, oltre il fattore tissutale, sono i fattori plasmatici VII, X e V. La via intrinseca pi lenta, perch comprende, oltre i tre fattori dell'altra via, anche i fattori XII, XI, IX e VIII, tutti fattori plasmatici. Questa via

innescata dall'attivazione del fattore XII, o fattore di Hageman, la quale si verifica quando il sangue entra a contatto con la matrice extracellulare, in particolare con le macromolecole di collagene

La transglutaminasi un enzima che viene covalenti tra le molecole di fibrina (tra Lys e Gln)

attivato

dalla trombina.

Questo

forma legami

La vitamina K il cofattore di una carbossilasi che catalizza la carbossilazione di specifici residui di acido glutammico presenti in alcune proteine per formare residui di acido -carbossiglutammico Tra le proteine che subiscono questa reazione, le principali sono coinvolte nel processo di coagulazione del sangue (protrombina, fattore VII, fattore IX, fattore X ed altre quattro proteine recentemente identificate nel plasma)

EFFETTO COOPERATIVO La mioglobina una proteina globulare costituita da una singola catena E dotata di un gruppo eme che inserito in una porzione idrofobica (o lipofila) della proteina, costituita da ripiegamenti riconducibili alle strutture -elica delle proteine fibrose. La mioglobina, ma anche lemoglobina, composta principalmente da segmenti di -eliche, presenti in numero di otto. Gli unici residui polari sono due istidine, che svolgono un ruolo fondamentale per lattacco dellossigeno al gruppo eme. Mentre la mioglobina confinata nei muscoli e nei tessuti periferici in generale, lemoglobina si trova negli eritrociti o globuli rossi Nelleme, il ferro forma: - quattro legami planari con i quattro atomi di azoto che si trovano al centro dellanello della proto-porfirina ed - un quinto legame con un azoto dellistidina prossimale; il ferro ha il sesto legame di coordinazione libero e pu legarsi allossigeno La struttura quaternaria della deossiemoglobina prende il nome di forma T (tesa), mentre quella della ossiemoglobina viene chiamata forma R (rilasciata); nello stato teso vi sono una serie di interazioni elettrostatiche piuttosto forti tra amminoacidi acidi e amminoacidi basici che portano ad una struttura rigida della deossiemoglobina, mentre quando si lega lossigeno, lentit di queste interazioni diminuisce 1. Effetto Bohr: pH le Istidine-146 C terminali delle catene , nella deossi- Hb formano un ponte salino con le Asp-94, se lanello dellIstidina protonato stabilizzando la forma deossi; il ponte salino non si forma nellHb4O2 perch lIst-146 non protonata. Si intensifica leffetto Bohr per aumento di H+ si producono cariche negative che permettono la formazione di altri ponti salini, stabilizzando la forma deossi

2. Effetto della CO2:

Due meccanismi per alterare laffinit della Hb per lO2 : - Effetto Bohr (influenza della modifica del pH) - Formazione dei carbammati dei gruppi N terminali delle 4 catene proteiche dellHb. R-NH2 + CO2 <-> R-N-COO- + H+ H I gruppi amminoterminali sono posti alle interfacce dei dimeri alfa-beta che una volta carbossilati stabiliscono legami salini che stabilizzano la forma T. 3. 2,3-Bifosfoglicerato Effettore allosterico presente in concentrazioni variabili nella cellula (g. rosso) si lega con alta affinit in una nicchia prodotta da aa. con cariche +, il suo ruolo quello di stabilizzare la forma deossi con conseguente maggior rilascio di ossigeno. Permette ladattamento immediato ad alte quote, e lutilizzo dellossigeno materno dal feto Hb fetale due catene e due catene al posto delle . Anemia Falciforme: Glu in posizione 6 della catena beta sostituito con una Val, producendo una zona idrofobica appiccicosa sulla superficie della Hb mutata

ENZIMI DELLE VIE METABOLICHE

La trioso fosfato isomerasi agisce spostando un H+ da un atomo di carbonio ad un altro adiacente: in questo modo il trioso pu interconvertirsi tra la forma chetonica (diidrossiacetone fosfato) e quellaaldeidica (gliceraldeide-3-fosfato); Catalizzatori acido/base sono Glu165 e His95 E un enzima cineticamente perfetto, che catalizza efficientemente la reazione e impedisce la reazione che avverrebbe spontaneamente ( formazione di metil-gliossale ) La gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi un enzima della classe delle ossidoreduttasi che catalizza la seguente reazione chimica, tappa della glicolisi e della gluconeogenesi: gliceraldeide-3-fosfato + NAD+ + Pi 1,3-difosfo glicerato + NADH + H+ Il gruppo carbonilico della gliceraldeide-3-fosfato si lega con lo zolfo di una cisteina rompendo il doppio legame dell'O. Di seguito avviene un'ossidoriduzione con NAD+: il NAD+ si riduce a NADH si riforma il doppio legame con l'O (con perdita di un idrogeno). Il carbonio carbonilico viene fosforilato, si rompe il legame con lo zolfo e si libera l'1,3-difosfoglicerato. Citrato sintasi: Nel sito catalitico (due per enzima) presente un residuo di aspartato che, insieme ad un residuo di istidina, contribuisce a mantenere in sede la molecola di acetil-CoA attraverso interazioni ioniche. Tali residui contribuiscono ad attivare la molecola ad un intermedioenolico, rendendola affine per un centro carbonioso dell'ossalacetato. Una volta creato il legame, attraverso un meccanismo simile ad una condensazione di Claisen, si genera l'idrolisi del gruppo tioestere (CoA) attraverso una molecola di acqua. Si tratta di una reazione decisamente esoergonica (dG o > -30 kJ/mol), che rende questo step irreversibile (motivo per cui la reazione in grado di regolare l'intero ciclo metabolico). Le molecole di citrato prodotte dalla condensazione sono in grado di legare il sito di legame per l'ossalacetato, inibendo competitivamente l'attivit dell'enzima. Nonostante il fatto che la reazione sia altamente esoergonica, dunque, la citrato sintasi pu essere saldamente regolata. La aconitasi catalizza la isomerizzazione del citrato ad isocitrato (attraverso la formazione dicisaconitato). L'enzima catalizza anche la reazione inversa, ma nel ciclo di Krebs tale reazione unidirezionale a causa della legge di azione di massa: le concentrazioni (incondizioni standard) di citrato (91%), dell'intermedio cis-aconitato (3%) e di isocitrato (6%), infatti, spingono la reazione decisamente verso la produzione di isocitrato. Nel sito attivo dell'enzima presente un cluster ferrozolfo (chiamato cubano) che, insieme ad alcuni residui amminoacidici polari, lega il substrato. Pi nel dettaglio, il legame al substrato viene assicurato dalla presenza di un residuo di serina, di arginina, di istidina e di aspartato, che permettono il legame stereospecifico del solo citrato 1R,2S, respingendone la forma opposta. La succinato-CoA ligasi (forma GDP) (o succinil-CoA sintetasi) un enzima, appartenente alla classe delle ligasi, che, nel ciclo di Krebs, catalizza la formazione di succinato a partire da succinilCoA. L'energia proveniente dal tioestere succinil-CoA viene semplicemente convertita in energia legata ad un legame fosfato. Il primo passaggio della reazione genera un nuovo intermedio ad alta energia, noto come succinil fosfato. Successivamente, una istidina presente nel sito catalitico rimuove il fosfato dalla molecola glucidica, generando il prodotto succinato ed una molecola di fosfoistidina, che dona velocemente il fosfato ad un nucleoside difosfato, ricaricandolo a trifosfato. L'ATP-sintasi una pompa protonica di tipo F costituita da due strutture dette Fo[1] (o F0) e F1. F1 una proteina periferica, F0 una proteina integrale della membrana cellulare. La subunit polipeptidica F1 direttamente responsabile della sintesi di ATP; costituita da 3 subunit proteiche e 3 subunit proteiche , organizzate in dimeri - disposte come gli spicchi di un'arancia. Al centro vi la subunit che si collega alla struttura della porzione F0. Associate a F1 vi sono altre subunit, ed . La subunit polipeptidica F0 attraversa la membrana mitocondriale interna, nel caso degli Eucarioti, o la membrana cellulare, nel caso dei Procarioti. Essa costituisce il canale per il passaggio degli ioni H+ (o protoni), i quali forniscono l'energia necessaria alla sintesi di ATP. La porzione Fo costituita da un anello di 10-14 subunit c che costituisce il canale protonico e da una subunit a che lega le subunita c e che contiene due semicanali (uno collegato al citosol e l'altro collegato alla matrice mitocondriale). Un protone proveniente dallo spazio intermembrana entra nel semicanale citoplasmatico, per neutralizzare un

Asp della subunit c; con la carica neutralizzata lanello c pu ruotare in senso orario di una unit c, esponendo lAsp allesterno, nel semicanale della matrice. Il protone si stacca ed entra nella matrice. Il passaggio dei protoni attraverso il canale creato dalle subunit c della F0 determina la rotazione della subunit che a sua volta provoca il cambiamento conformazionale contemporaneo dei 3 dimeri - e la sintesi di ATP. Sulla porzione F1 vi sono 3 siti attivi che catalizzano a turno la sintesi di ATP: uno di questi siti si trova in conformazione -ATP (che lega ATP), un altro in ADP e l'ultimo sito in -vuoto (incapace di legare ATP). La forza motrice protonica provoca la rotazione dell'asse centrale c che entra in contatto con le subunit . Ci causa una modifica conformazionale cooperativa in cui il sito -ATP viene convertito in -vuoto rilasciando ATP; quindi il sito -vuoto passa in conformazione -ADP che lega debolmente ADP e gruppo fosfato dal solvente e per ultimo il sito -ADP viene convertito nella conformazione -ATP a promuovere la condensazione di ADP e Pi.

Glicogeno Fosforilasi : l'azione associata alla presenza di Piridossal fosfato (PLP). La presenza del Piridossal fosfato di fondamentale importanza, perch l'energia rilasciata dalla scissione del legame o-glicosidico (1->4), viene conservata sotto forma di legame fosforico all'estremit anomerica del glucosio, formando glucosio-1-fosfato, il quale, poi, potr essere convertito in glucosio-6-fosfato dalla fosfoglucomutasi. L'attivit della glicogeno fosforilasi regolata sia allostericamente sia covalentemente. Nella regolazione allosterica intervengono: ionicalcio, AMP (attivatori); ATP (inibitore); ed il glucagone. Nella regolazione covalente, interviene la fosforilazione della glicogeno fosforilasi b, e quindi la sua attivazione in glicogeno fosforilasi a, mentre la defosforilazione comporta la sua inattivazione. Transchetolasi: trasferisce ununit bicarboniosa da un chetosio ad un aldosio, con lausilio di TPP (che stabilizza lintermedio)

Transaldolasi: trasferisce ununit tricarboniosa ( diidrossiacetone ) da un aldosio ad un chetosio, mediante formazione di una base di shiff tra il carbonilico del chetosio e lamminico della catena laterale di una lisina (stabilizzazione da parte dellimmina)

Shuttle mitocondriali

Il NADH citoplasmatico non pu passare attraverso la membrana mitocondriale e quindi non pu essere ossidato. Ci sono due sistemi che permettono il trasporto degli equivalenti riducenti del NADH citoplasmatico allinterno dei mitocondri: sistemi navetta (shuttles) del o malato\aspartato o glicerolo fosfato Lo shuttle malato\aspartato bidirezionale e fornisce 3 ATP ed pi utilizzato nel fegato, nel cuore e nel rene. Lo shuttle glicerolo fosfato unidirezionale e fornisce 2 ATP, ma pi veloce del precedente ed pertanto pi utilizzato nel cervello e nel muscolo scheletrico, dove pi attiva la glicolisi. SHUTTLE GLICEROLO 3- FOSFATO

SHUTTLE MALATO-ASPARTATO Il NADH citosolico passa i suoi due equivalenti riducenti allossalacetato, formando malato Il malato viene trasportato attraverso la membrana interna dal trasportatore malato-chetoglutarato. Nella matrice il malato trasferisce i suoi due equivalenti riducenti al NAD; il NADH cos generato viene poi riossidato dalla catena respiratoria. Lossalacetato non pu ritornare direttamente nel citosol e quindi viene prima transamminato ad aspartato, che pu uscire dai mitocondri. Lossalacetato viene rigenerato nel citosol

TRASLOCATORE ADP/ATP Cambia conformazione solo se legato. Ad ogni esportazione di ATP (-4) ed importazione di ADP (-3) corrisponde il trasferimento di una carica, che guidato dalla differenza di potenziale attraverso la membrana mitocondriale interna (+ allesterno), che guida anche lentrata di Ca2+ CANALE NICOTINICO att. da LIGANDO Il recettore nicotinico un recettore ionotropico che permette il flusso di ioni attraverso la membrana cellulare in seguito al legame con il proprio ligando. Sono costituiti da 5 subunit, arrangiate simmetricamente in modo da circoscrivere un poro attraverso il quale avviene il flusso di cationi (Na e Ca in entrata, K in uscita). L' unica subunit in grado di legare l' acetilcolina la subunit , che presenta la specifica tasca all' interno della quale il ligando si pu collocare. A seguito dell' interazione con l' acetilcolina, il recettore cambia la propria conformazione, permettendo l' apertura del canale. Nello stato chiuso infatti le catene laterali di residui ingombranti occludono il canale (leu, ile), formando un reticolo idrofobico compatto; il legame con lacetilcolina fa ruotare le eliche transmembrana, in modo che ora il poro si coperto da piccoli residui polari. Poich la selettivit nei confronti dei cationi non assoluta, ioni di medesima carica e di raggio atomico simile possono fluire attraverso il canale. Viene permesso perci il flusso in particolare di ioni Na, ma anche di Ca (entrambe in entrata), e di K in uscita. A seguito della variazione delle concentrazioni ioniche cellulari, si ha variazione del potenziale di membrana che permette la depolarizzazione della fibra.

L'acetilcolinesterasi un enzima appartenente alla classe delle idrolasi che catalizza la seguente reazione: acetilcolina + H2O colina + acetato L'enzima normalmente presente nell'organismo dei mammiferi localizzato nella membrana post-sinaptica delle giunzioni colinergiche. La sua funzione quella di idrolizzare l'acetilcolina scindendola in colina e acido acetico. Il sito catalitico composto dalla cosiddetta triade catalitica (his440, ser200, glu327) che, prima dell'interazione col substrato, vede la formazione di un legame d'idrogeno fra un'azoto imidazolico dell'istidina e l'idrogeno della serina. Tale interazione polarizza il legame idrogeno - ossigeno della stessa serina al fine di rendere l'atomo d'ossigeno pi suscettibile a formare un legame con il carbonio carbonilico dell'acetilcolina e a cedere l'idrogeno. L'idrogeno della serina viene ceduto all'ossigeno della colina con contemporanea rottura del legame estereo colina - acetato e formazione del legame acetato - serina. Successivamente, interviene l'acqua che, grazie alle sue proriet nucleofile, idrolizza il legame acetato serina, riportando l'enzima alla situazione di partenza e liberando una molecola di acido acetico. CANALE ATTIVATO DAL POTENZIALE I canali ionici voltaggio dipendenti sono attivati da differenze di voltaggio nel potenziale di membrana, che modificano la geometria della proteina trasportatrice. Tra questi, il canale del Na+ e del K+ presenti nelle cellule nervose, e responsabili della propagazione del potenziale d'azione, nonch della successiva rigenerazione del potenziale di membrana di riposo. L'attivazione di tali canali avviene per lo pi a seguito di depolarizzazioni di membrana). I canali voltaggio dipendenti sono altamente selettivi e sono molto complessi nella loro strutturalizzazione. Sono costituiti per lo pi da 4 subunit o domini ognuno costituito da 6 alfaeliche. 5 di questi hanno residui idrofobici, mentre S4 ricca di residui carichi positivamente. Dopo qualche millisecondo dallapertura i canali vengono inattivati: il dominio per linattivazione (palla) legato al canale da una catena flessibile; nello stato chiuso la palla fluttua nel citoplasma; la depolarizzazione apre il canale e crea sulla bocca del poro un sito di legame per la palla carica positivamente. ATPASI di TIPO P Le ATPasi transmembrana sono in grado di favorire l'ingresso nella cellula dei metaboliti necessari e di espellere tossine e rifiuti che possono danneggiare i processi cellulari. Un esempio importante la pompa sodio-potassio ATPasi, che mantiene l'equilibrio transmembrana di ioni sodio e potassio. Le ATPasi sfruttano al massimo l'energia potenziale contenuta nell'ATP, convertendola di fatto in lavoro meccanico: esse infatti trasportano i soluti in direzione opposta a quella termodinamicamente favorita (cio dalla parte della membrana dove sono a minore concentrazione verso quella dove maggiore). Questo processo definito trasporto attivo. Pompa sodio-potassio: All'inizio del processo di trasporto tre ioni di Na+ vanno a legarsi ai siti specifici ad alta affinit della proteina veicolo rivolti verso l'interno della cellula. Questo legame stimola la fosforilazione dipendente dall'ATP della pompa determinando un cambio conformazionale della proteina veicolo, la quale esporr i siti di legame per gli ioni Na + verso l'ambiente extracellulare, abbassando cos la propria affinit per questi ioni cosicch essi vengano rilasciati al di fuori della cellula. Contemporaneamente alla fuoriuscita degli ioni Na+, due ioni K+ vanno a legarsi ai siti specifici esposti verso l'ambiente extracellulare stimolando la defosforilazione della proteina, la quale torner al suo stato conformazionale di partenza e rilascer questi ioni all'interno della cellula. VIA DELLAMP CICLICO (cAMP) ORMONE ( MESSAGGERO) + RECETTORE ATTIVAZIONE (INIBIZIONE) ADENILATO CICLASI AUMENTO (RIDUZIONE) [cAMP] (2 MESSAGGERO) ATTIVAZIONE (INATTIVAZIONE) DI PROTEIN KINASI A

VIA DEL FOSFOINOSITOLO (PIP2) ORMONE (1 MESSAGGERO) + RECETTORE ATTIVAZIONE FOSFOLIPASI C (PLC) AUMENTO [Inositolo-3-P (IP3)] e [Diacilglicerolo (DAG)] (2 MESSAGGERI) A) APERTURA CANALI PER IL CALCIO B) ATTIVAZIONE DI PROTEIN KINASI C FOSFORILAZIONE DI ALTRI ENZIMI La calmodulina una proteina particolarmente abbondante nelle cellule eucariotiche (fino all' 1% delle proteine totali). particolarmente importante nei processi di segnalazione intracellulare, dove lega ioni Ca+ + con alta affinit. La calmodulina una piccola proteina monomerica (148 aa) capace di legare fino a 4 ioni Ca2+. La struttura primaria altamente conservata in specie che vanno dal paramecio(protozoo) alluomo e caratterizzata da 4 sequenze chiamate EF-hand dove le lettere E ed F indicano eliche a. Questa mano-EF un dominio in cui 2 a-eliche contigue sono interrotte da un nodo formato da 10-12 aa nel quale Ca2+ eptacoordinato La coordinazione del Ca2+ alla calmodulina induce precisi cambi di conformazione La calmodulina amplifica piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di Ca2+. RECETTORI TIROSIN.CHINASICI Ogni recettore e costituito da un dominio N-terminale di interazione con il ligando, ununica alfa elica transmembrana, e un dominio citosolico C-terminale con attivita protein-tirosin chinasica. I recettori dellEGF e dellinsulina hanno dei domini extracellulari ricchi di cisteina, mentre il recettore del PDGF ha dei domini immunoglobulin-like. Il legame con il ligando provoca un cambiamento conformazionale dell'N-terminale del recettore che, causando la dimerizzazione dei domini extracellulari, permette la diffusione laterale dei domini citoplasmatici, consentendo quindi il contatto tra i C-terminali e attivando l'attivit chinasica. La dimerizzazione innesca quindi un processo di autofosforilazione, in cui l'attivit chinasica di ogni recettore monomerico fosforila residui dell'altro. Inizialmente vengono fosforilati i residui di tirosina del labbro di fosforilazione, situato in prossimit del sito attivo. Questo causa lo spostamento di quest'ansa di attivazione dal sito catalitico, favorendo cos il legame dell'ATP in alcune proteine, direttamente delle proteine substrato in altre. Successivamente vengono fosforilati altri residui dei domini citoplasmatici, fornendo il sito d'attacco per le proteine substrato. INTERAZIONE COL LIGANDO DIMERIZZAZIONE AUTOFOSFORILAZIONE / Attivazione (siti di legame ad alta affinita) ASSOCIAZIONE A PROTEINE TARGET FOSFORILAZIONE DI ALCUNE PROTEINE TARGET (anche fosfolipasi c)

Schema di un ciclo di PCR -

tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali

1.

La soluzione di DNA da replicare, desossiribonucleotidi trifosfati, ioni magnesio, primer e TAQ polimerasi viene portata a una temperatura compresa tra 94 e 99 C. Ci si trova, di conseguenza, in una situazione in cui la doppia elica del DNA viene completamente scissa ed i due filamenti di cui essa composta sono liberi (fase di denaturazione). 2. Successivamente la temperatura viene abbassata fino a 40-55 C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). 3. Infine la temperatura viene alzata fino a 65-72 C al fine di massimizzare l'azione della TAQ polimerasi che determina un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA (fase di prolungamento). MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI ACETILAZIONE: NH2 terminale PIROGLUTAMMICO: glu FOSFORILAZIONE: tyr ser thr O-GLICOSIDAZIONE: ser thr N-GLICOSIDAZIONE: asn LEGAMI CON METALLI: his cys LEGAMI CON PROSTETICI: cys lys PONTI DISOLFURO: cys IDROSSILAZIONE: lys pro DEAMMINAZIONE A CITRULLINA: arg

AMIDAZIONE: OH terminale