II) DETERMINACION DE PESTICIDAS EN VEGETALES MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE

GASES

2.1. Generalidades sobre los pesticidas
Los insectos son los que ms plagas ocasionan. Escarabajos, orugas, moscas y mosquitos, y
muchos otros tipos de insectos causan grandes daos en las cosechas y transmiten
enfermedades. Ms de la mitad de los pesticidas son del grupo de los insecticidas.
Desde hace milenios los hombres utilizan sustancias como cenizas, azufre, compuestos
arsenicales, tabaco molido, cianuro de hidrgeno, compuestos de mercurio, zinc y plomo, etc.
para luchar contra los insectos. Forman el grupo de los llamados insecticidas de la 1
generacin. Son productos en general muy txicos, poco efectivos en la lucha contra la plaga
y muy persistentes en el ambiente (hasta 50 aos). Hoy da se usan muy poco y bastantes de
ellos estn incluso prohibidos por su excesiva toxicidad.
Los avances de la ciencia y de la industria qumica hicieron posible la aparicin de mejores
insecticidas que se suelen denominar de la 2 generacin. Son un variado conjunto de
molculas que se clasifican en grupos segn su estructura qumica. Las tres familias ms
importantes son los organoclorados (clorocarbonados), los organofosfatos y los carbamatos.
Los organoclorados (DDT, aldrin, endrin, lindano, etc.) son txicos, su persistencia en el
ambiente sin ser destruidos llega a ser de aos y se bioacumulan, es decir, van aumentando su
concentracin al ir ascendiendo en la cadena trfica.
Los organofosfatos (malation, paration, etc.) son poco persistentes (das) y se eliminan en la
orina. Muy txicos para el hombre, tanto como los ms conocidos venenos como son el
arsnico, la estricnina o el cianuro. Fueron desarrollados a partir del gas nervioso preparado
por los alemanes en la 2 Guerra Mundial. Se usan mucho en agricultura.
Los carbamatos (por ejemplo el carbaril, de nombre comercial Servin; o el propoxur, llamado
Baygon, etc.) son poco persistentes (das) y se eliminan en la orina. Son poco txicos para el
hombre pero menos eficaces en su accin como pesticidas que los organofosfatos. Se usan
menos en agricultura y ms en interiores, como insecticidas caseros, etc.
El caso del DDT resulta especialmente interesante de analizar por ser muy representativo de
los pros y contras de los insecticidas, especialmente de los ms antiguos. Algn autor ha
llegado a titular su captulo sobre este producto con el expresivo encabezamiento de "Una
historia de beneficios olvidados y de ingratitud social"
Qumicamente el DDT es el 2,2-bis-(p-clorofenil)-1,1,1-tricloroetano y fue el primero de los
insecticidas de la 2 generacin. Haba sido sintetizado en 1874 pero su uso como insecticida
comenz en 1939 cuando el qumico suizo Mller descubri sus propiedades como veneno
para los insectos y su baja toxicidad para los humanos. Este cientfico recibi el Premio Nobel
en 1948 en reconocimiento al impresionante avance que este producto haba representado en
la lucha contra las enfermedades y las plagas. Se calcula que en los primeros aos de uso del
DDT se evit la muerte de 5 millones de personas cada ao, adems de la proteccin de
cosechas y del aniquilamiento de insectos domsticos. As, por ejemplo, en la India, en 1952
hubo 75 millones de caos de malaria y en 1964, despus de usar masivamente el DDT,
100.000 casos.
Pero conforme se fueron descubriendo algunos importantes problemas asociados a su uso,
empez a ser cada vez menos usado. La mxima produccin de este insecticida se produjo en
1970 y a partir de entonces se fue prohibiendo su uso, cada vez en ms pases, y
descendiendo su produccin. El motivo de este declinar del favor social del DDT fueron los
graves problemas que se detectaron. En primer lugar es un producto de lenta conversin a
sustancias no txicas en la naturaleza, su persistencia media es de unos 3 aos. Adems es
muy poco soluble en agua, lo que hace que no se elimine en la orina, y es muy soluble en
grasas, por lo que se acumula en tejidos de los organismos. Por estos motivos se va
acumulando a lo largo de la cadena trfica. As, por ejemplo, el DDT que se extenda sobre un
cultivo se encontraba en una concentracin bajsima en las plantas; pero en los insectos que se
alimentaban de estas plantas estaba ya en concentraciones diez veces mayores. Si el insecto
resiste al DDT ser comido por ranas, por ejemplo, en las que el DDT alcanzar
concentraciones 100 veces mayores que las de las plantas; y las rapaces que comen a las
ranas llegan a tener concentraciones 1000 veces mayores.


Uno de los principales efectos de estas concentraciones de DDT fueron sobre la reproduccin
de las aves, porque sus huevos tenan unas cscaras extraordinariamente finas y frgiles y
muchos se rompan durante la incubacin. De esta forma las poblaciones de algunas especies
de aves disminuyeron de forma alarmante.
Otro importante problema fue que muchos organismos desarrollaron resistencia y para luchar
contra ellos haba que emplear cantidades cada vez mayores del producto y con menor
eficacia..
De ser un benefactor de la humanidad pas a ser enemigo pblico entre los aos 1970 a 80 y
con ello lleg su prohibicin. Aunque, afortunadamente, su desuso coincidi con el desarrollo
de nuevos insecticidas con caractersticas mucho menos peligrosas.
Tabla 1. Caractersticas de los pesticidas de importancia en esta investigacin.


2.2. Mtodos empleados en el anlisis de residuos de pesticidas en alimentos

El anlisis de pesticidas en alimentos est sujeto a la complejidad de la matriz y a las
concentraciones bajas a las cuales estos compuestos estn presentes. Por lo tanto, la
extraccin de los residuos constituye el paso ms crtico. Este paso consiste en la extraccin
de los analitos desde su matriz con un disolvente apropiado, opcionalmente se puede realizar
la remocin de sustancias que podran causar interferencias mediante varios pasos de limpieza
y finalmente, la reduccin del volumen del disolvente en el extracto antes del anlisis
instrumental (Patnaik, P., 2004).
Despus de la extraccin, el anlisis se contina comnmente con la separacin de los analitos
empleando cromatografa de gases (GC) o cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC),
acopladas a uno o varios detectores selectivos para la determinacin, identificacin y
cuantificacin de residuos de pesticidas (Pang, G. F. et al., 2006).
En las siguientes secciones se describen los procesos de extraccin y los mtodos de
separacin e identificacin de residuos de pesticidas en diversas matrices alimentarias.
En las siguientes secciones se describen los procesos de extraccin y los mtodos de
separacin e identificacin de residuos de pesticidas en diversas matrices alimentarias.

2.2.1. Mtodos de extraccin de residuos de pesticidas en alimentos.
El reto en la extraccin de pesticidas es maximizar la recuperacin de los analitos y minimizar
las interferencias mediante el uso de una extraccin apropiada. El proceso de extraccin
comienza con separar los analitos de la matriz y presentar el material en una forma que pueda
analizarse ms fcilmente. La extraccin selectiva de analitos se basa en sus diferentes
caractersticas y propiedades qumicas y fsicas, como: peso molecular, carga, solubilidad,
polaridad, volatilidad.
Se han propuesto muchas opciones para el pre-tratamiento y extraccin de residuos de
pesticidas en alimentos. En la mayora de estas, el proceso de extraccin usualmente involucra
la homogenizacin de la muestra con un disolvente orgnico, solo o en mezcla, usando un
homogeneizador, mezclador o sonicador, conocida como extraccin lquido-lquido o extraccin
slido-lquido, dependiendo de la naturaleza de la muestra.
Para este caso se empleo la extraccin slido-lquido con acetato de etilo como disolvente,
debido a que es la ms empleada en el anlisis multi-residuos de pesticidas en vegetales,
adems esta tcnica es relativamente sencilla, rpida y se recupera un porcentaje alto de los
residuos de pesticidas presentes en los vegetales.

2.2.2. Extraccin con disolventes orgnicos.
Es la tcnica ms usada, principalmente por la facilidad de uso y la amplitud de aplicacin. El
proceso de extraccin vara ligeramente dependiendo si la muestra es lquida o slida. Las
muestras slidas se homogenizan antes de la extraccin mediante la molienda, mezclado,
agitado, aplastado, macerado, presurizado y pulverizado. Despus, una porcin se lica o agita
con un disolvente orgnico o con una mezcla de diferentes disolventes orgnicos. Despus de
agitar correctamente, puede centrifugarse y la fase orgnica se evapora para obtener un
volumen pequeo, o a la fase orgnica se le agrega sulfato de sodio anhidro (Na2SO4) para
eliminar el agua presente en la muestra. En el primer caso, el residuo se re-disuelve en una
mezcla de disolventes orgnicos y, posteriormente se inyecta en el sistema de GC. En el
segundo caso, el Na2SO4 se separa, mediante la centrifugacin o filtracin, y el sobrenadante
se concentra o inyecta directamente en el cromatografa de gases.
Generalmente es necesario evaporar o concentrar el extracto para disminuir el volumen del
disolvente. La concentracin ayuda a reducir los lmites de deteccin.
Ya que las muestras alimenticias son complejas, suelen ser necesarios pasos de limpieza, para
eliminar pigmentos, protenas, azcares y cidos grasos que interfieren con la deteccin de
pesticidas a niveles de trazas y aunque stos consumen tiempo, se incluyen para evitar
contaminacin del sistema de GC, de esta manera se reduce la cantidad de interferencias que
provocan prdida de resolucin, aunque aumenta el costo del anlisis.

Para realizar la extraccin existe una gran variedad de disolventes orgnicos disponibles que
permiten una homogenizacin fcil durante el licuado o la agitacin.
La polaridad es el factor ms importante en la eleccin del disolvente para una aplicacin en
particular. En mtodos multi-residuos de pesticidas, la acetona, el acetonitrilo y el acetato de
etilo han mostrado proporcionar altas recuperaciones para un amplio intervalo de pesticidas,
cada uno con algunas ventajas sobre otros disolventes.
La habilidad para remover agua del extracto inicial es esencial para obtener un alto grado de
selectividad en muestras con humedad alta, como los alimentos. La co-extraccin de protenas,
azcares y otros compuestos polares suele incrementar junto con la cantidad de agua en el
extracto; as, los disolventes que eviten el agua dan una mayor selectividad. El acetato de etilo
y acetonitrilo son mejores que la acetona porque el agua se elimina ms fcilmente usando una
sal.
El acetonitrilo es un disolvente polar, miscible en agua pero con suficientes propiedades
dispersivas (hidrofbicas) para extraer eficientemente tanto residuos de pesticidas polares
como no polares desde alimentos no grasos. Los extractos de acetonitrilo contienen
usualmente co-extrados (pigmentos principalmente).
Se han descrito mtodos basados en el uso de acetato de etilo como disolvente y se han
validado y usado para la determinacin de diferentes grupos de pesticidas en frutas y
vegetales. Adems este disolvente provee buenas recuperaciones para un nmero amplio de
pesticidas con propiedades diferentes. Es menos contaminante que los disolventes clorados,
aunque puede co-extraer pequeas cantidades de compuestos de la matriz.
En la Tabla 2 se muestran algunos de los anlisis de pesticidas en vegetales empleando
diferentes tcnicas de extraccin, se observan los disolventes empleados y los pesticidas
detectados en dicho anlisis.
Tabla 2. Tcnicas de extraccin y pesticidas identificados en anlisis de frutas y
vegetales


2.2.3. Mtodos de separacin, identificacin y cuantificacin de pesticidas. Una vez
obtenido el extracto orgnico, la mezcla de pesticidas se separa mediante tcnicas
instrumentales como cromatografa de gases (GC) o cromatografa lquida de alta resolucin
(HPLC). La identificacin y cuantificacin de los pesticidas se realiza con detectores selectivos
que se encuentran acoplados al equipo de GC HPLC. Las tcnicas
Cromatogrficas permiten una aproximacin eficiente en el anlisis de pesticidas. La
espectrometra de masa (MS) generalmente se prefiere como detector y sus resultados
tpicamente son incuestionables.
2.2.3.1. Tcnicas de separacin: Cromatografa. La cromatografa permite separar entre s
los componentes de una sustancia, y su gran aplicabilidad se debe a la variedad de
condiciones que pueden utilizarse para separar dichos componentes. Se pueden utilizar fases
mviles distintas (gases, lquidos o fluidos supercrticos) y fases estacionarias distintas
(minerales, polmeros orgnicos e inorgnicos o slidos recubiertos de lquidos.

Actualmente el anlisis de pesticidas mediante GC, involucra el uso de columnas capilares, las
cuales poseen dimetros internos (d.i.) menores a 1 mm, paredes generalmente recubiertas de
una pelcula de fase estacionaria. El uso de columnas capilares permite una mejor resolucin y
separacin rpida de componentes comparadas con las columnas empacadas (d.i. mayores a
1 mm), lo que permite realizar ms ensayos aumentando el rendimiento en el anlisis de
muestras.
Las columnas capilares empleadas en la GC para el anlisis de pesticidas en alimentos
habitualmente poseen una fase estacionaria generalmente de polmeros de polisiloxano o
polietilenglicoles. Adems, debido a que los pesticidas en la muestra son de polaridad baja, las
columnas capilares son de polaridad baja y se prefieren aquellas con menor sangrado (ms) y
superficies inertes. Las columnas capilares FactorFourde Varian Inc. y las de Agilent
Technologies son las ms utilizadas en los anlisis de residuos de pesticidas, Tabla 3.
Tabla 3. Algunas columnas capilares empleadas en el anlisis de residuos de pesticidas
en alimentos

Inyectar una muestra en una columna capilar de dimetro inferior a un milmetro es complicado
porque la muestra debe ser pequea para no causar una sobrecarga de la fase estacionaria.
Para mantener la cantidad de muestra en el intervalo correcto se emplea el inyector
split/splitless, que reduce la cantidad de muestra que llega a la cabeza de la columna capilar.
Las muestras con concentracin baja de analito se inyectan por el mtodo splitless y se
arrastran mediante el gas acarreador a la columna. Por otro lado, si se utiliza el mtodo split, el
gas acarreador fluye continuamente, el flujo excesivo se expulsa y slo una fraccin de la
muestra llega a la columna.
Despus que la mezcla ha sido separada en el cromatgrafo de gases, cada uno de los
componentes se identifica por un detector. Para detectar los componentes separados se miden
los cambios que se producen en una serie de propiedades fsicas o qumicas diferentes.

2.2.3.2. Tcnicas de identificacin: Detectores. Existe una gran variedad de detectores que
pueden estar acoplados al cromatgrafo de gases y permiten identificar los compuestos de
inters que se encuentran en la muestra. En la Tabla 4 se enlistan los detectores utilizados,
con un resumen de sus caractersticas. Los detectores ms sensibles han permitido el
desarrollo de mtodos de anlisis de trazas. La GC puede usarse para cuantificar niveles de
ppm.
En este caso se emplea el detector de captura de electrones (ECD), que es apropiado para
determinar compuestos que contengan halgenos, (organoclorados, piretroides, etc.).
2.2.3.3. Tcnica de cuantificacin: la tcnica de cuantificacin que se emplea es el patrn
externo , ya que las reas son proporcionales a las concentracin de los pesticidas, para lo
cual el volumen de inyeccin es la misma para la muestra y las soluciones estndar(1l).
El resultado lo podemos comparar con lmites legales de acuerdo a la normativa establecida
por el Codex Alimentarius (1996) para tomate.
Tabla 4: Resultados de los LD y LC determinados por cromatografa de gases y lmites
legales de acuerdo a la normativa establecida por el Codex Alimentarius (1996) para
tomate.



CONDICIONES CROMATOGRAFICAS
A) EQUIPO: cromatgrafo de gases Perkin-Elmer 8500.
B) DETECTOR: captura de electrones (ECD)
C) COLUMNA CAPILAR:
- Fase liquida DB-5
- Dimensiones: 30mx0.251mm
- Temperatura: Detector 300
0
C
D) INYECTOR 250C
- Programa: 150
0
C, 5min,
200
0
C (4
0
C/min)
- Volumen de inyeccin: 1L
- Elucin: 6% (ter etlico en ter de petrleo)
MATERIALES Y REACTIVOS
- pera de separacin de 1000ml
- Vaso de precipitado de 600ml
- Probetas de 500 y 100ml
- Concentrador KudernaDanich de 500ml, con, columnas de 5 y 10ml.
- Cuentas de vidrio
- Columna cromatografca de vidrio (150mm de altura x24mm de dimetro).
- Lana de vidrio
- Licuadora o mezcladora de alta velocidad
- Acetato de etilo
- ter etlico grado pesticidas (g.p.)
- ter de petrleo g.p.
- Sulfato de sodio anhidro
- Cloruro de sodio
PROCEDIMIENTO
- Picar en trozos el alimento a ser analizado, pesar 50gr y colocar en el vaso de la
licuadora, aadir 10gr de sulfato de sodio anhidro (previo sacado en la estufa a
105
0
C por 2 horas).
- Aadir 200ml de acetonitrilo, licuar por uno o dos minutos a alta velocidad, filtrar
por succin con papel de filtro comn.
- Transferir el filtrado a una probeta graduada y medir el volumen (F).
- Transferir el lquido medido a una pera de separacin de 1000ml; que contiene
100ml. De ter de petrleo, agitar vigorosamente 1-2min. Agregar 10ml de solucin
saturada de cloruro de sodio y 600ml de agua destilada. Sostener el separador en
forma horizontal y mezclar vigorosamente 30-40min.
- Descartar la fase acuosa y lentamente lavar la fase orgnica con porciones de
agua cada una de 100ml, antes medir el volumen (P).
- Aproximadamente aadir 15gr de sulfato de sodio anhidro agitar vigorosamente.
No dejar ms de una hora, puede haber prdidas de pesticidas clorados por
adsorcin de sulfato de sodio.
- Se coloca la concentracin en el Kuderma-Danish, se enjuaga con tres porciones
de ter de petrleo, conectar la columna de fraccionamiento y todo el sistema de
bao Mara, conectar el extracto hasta que quede un volumen de 5ml. (cuando
este frio). No haga concentracin por debajo de 5 ml o se producir perdida de
pesticida.
Preparacin de la columna
- Colocar lana de vidrio en la parte inferior, agregar florisil y empacar en seco hasta
aproximadamente 10cm y aadir 1cm de sulfato de sodio (previo secado en la estufa a
130
0
C por 5horas).
- Lavar la columna con 40 -50 ml de ter de petrleo, colectar en un vaso y desechar.
Transferir la muestra evaporada y enjuagar el concentrado con dos porciones de ter de
petrleo enjuagando la columna y el tubo.
- Inyectar un 1ml al cromatografa de gases una vez que el sistema este equilibrado.
Preparacin de los estndares.
Para realizar las soluciones patrn de pesticidas, se pes la cantidad de polvo o lquido de
cada pesticida y se afor con etanol, las soluciones patrn se almacenaron en congelacin a -
20C.
A partir de las soluciones patrn, se prepararon soluciones etanlicas de trabajo STA con
concentraciones de: 1.0, 5.0 y 10 ppm de cada pesticida. Adems se prepararon soluciones
etanlicas de trabajo STB con las concentraciones siguientes: 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 ppm de cada
pesticida a partir de las soluciones patrn. Todas las soluciones etanlicas de trabajo se
mantuvieron en refrigeracin a 4C.

Tabla 5. Caractersticas de los pesticidas utilizados como estndares Pesticida
Pesticida
Pureza
(%)
Marca
Concentracin solucin
patrn (ppm)
4,4`-DDE (diclorodifeniletano) 99.9 Riedel-de Han 200
4,4`-DDD (diclorodifenildicloroetano) 99.9 Riedel-de Han 200
4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano) 99.9 Riedel-de Han 200



EJEMPLO DE CALCULO:
Para el 4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano) componente de los pesticidas organoclorados.
Empleando el mtodo estndar externo.

Soluciones estndar:
fd C C
sol.stock
DDT - 4,4
Stdi
DDT - 4,4
=

Para Std. se prepara con 500L de solucin stock y se enrasado con etanol 100mL.
0.1
L 10 100
L 10 500
fd
3
6
=

Std.1
DDT - 4,4
C
0.005
L
mg
200 =
Std.1
DDT - 4,4
C
1ppm =
Del mismo modo para los dems estndares:
solucin Vstock (ml) Vf (ml) C
4,4-DDT
(ppm) A
4,4-DDT
Std1 0.5 100 1 27.53
Std2 2.5 100 5 137.66
Std3 2.5 50 10 275.45
Con los valores concentracin y los resultados de lectura (A pesticida) hacemos una grafica
que ajustamos a una recta por mnimos cuadrados para luego en esta ecuacin de recta hallar
la concentracin del pesticida en las soluciones muestra.
A pesticida = m
Std.1
DDT - 4,4
C
+ b Y = mX + b


Tambm hallamos la correlacion:


i C = x A = y xy x2 y2
St
1
1 27.53 27.53 1 757.90
St
2
5 137.66 688.30 25 18950.28
St
3
10 275.45 2754.50 100 75872.70
16 440.64 3470.33 126 95580.88

0.0380
6 1 26 1 3
33 470 3 6 1 64 40 4 26 1
b
2
=


=
. .

( )

=
2
i
2
i
i i i i
x x p
y x y x p
m

+
=
2 2
2
y) ( y n
) y ( xy nm y nb
r
( )

=
2
i
2
i
i i i i
2
i
x x p
y x x y x
b
1
2
ppm 5471 27
16 26 1 3
64 440 16 33 470 3 3
m

=


= .
. .

0.9999
440.64 95580.88 3
440.64 3470.33 (27.5471) 3 440.64 0.038) ( 3
r
2
2
=

+
=
A
4,4-DDT
= (27.5471ppm
-1
)
C
DDT - 4,4
- 0.0380
Soluciones muestra:
De la ecuacin de la recta:
27.5471
0.0380 A
C
DDT - 4,4
DDT - 4,4
+
=
Para la solucin muestra: 90.37 A
DDT - 4,4
= 3.2792ppm C
DDT - 4,4
=
Esta es la concentracin de 4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano) en la solucin muestra de
6ml.
g 10 19.6752 W 6mL
L
mg
3.2792 W
6
-DDT 4,4 -DDT 4,4

= =


Gramos de muestra:
E2
P
E1
F
S Wmuestra =
S: gramos de muestra tomados (50g)
F: volumen filtrado (190ml)
E1: volumen de acetonitrilo empleado en la primera extraccin (210ml)
P: volumen final de de la segunda extraccin (90ml)
E2: volumen de ter de petrleo emplado en la segunda extraccin (100ml)
40.7143g Wmuestra
100ml
90ml
210ml
190ml
50g Wmuestra = =


Concentracin de pesticida en muestra:
4,4`-DDT (diclorodifeniltricloroetano)
| | (mg/Kg)
Wmuestra
e Wcomponent
componnte =
g 10 19.6752 W
6
DDT - 4,4

=
40.7143g Wmuestra =
[4,4-DDT] = 0.4833mg/Kg
RESULTADOS :
Pesticidas
organoclorados
t de retencin
(min)
rea [ ] ppb [ ] mg/Kg
lindano 3.19 77.7817 8.0 1.1789
heptachlor 4.53 13.2658 6.0 0.8842
aldrin 5.30 17.6214 3.96 0.5836
4,4`-DDE 7.45 62.4645 9.9 1.4589
4,4`-DDD 8.82 59.4632 13.9 2.0384
4,4`-DDT 9.66 90.3711 3.28 0.4834

CONCLUSION:
Los resultados sobrepasan los lmites permisibles para estos componentes por mucho, lo cual
demuestra su persistencia en los alimentos tratados con estos.
La cromatografa d gases es un excelente mtodo para hallar componentes que se presentan a
nivel de trazas.
El tratamiento de la muestra (alimentos) es necesario e importante en la seleccin del analito a
analizar.
APENDICE :













MUESTRA: tomate
VOLUMEN: 1,0 l
DETECTOR: ECD