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AULA 8 Sebenta de Bactereologia

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AULA Nº 8 – Metabolismo Biossintético

O anabolismo é a síntese de moléculas complexas a partir dos produtos provenientes do catabolismo. Envolve uma série de passos. Basicamente, primeiramente formam-se pequenas moléculas que são chamadas de metabolitos percursores. Depois, dá-se a síntese dos monómeros (exemplo: aminoácidos, nucleótidos, carbohidratos simples e lípidos simples), que vão dar origem às moléculas complexas, a partir dos metabolitos percursores. De seguida, dá-se a síntese das macromoléculas (exemplo: proteínas, ácidos nucleicos, etc.) e a reunião destas mesmas nas estruturas celulares. Este processo requer energia e ela aparece-nos sob a forma de ATP. Além de energia, o anabolismo requer uma fonte de electrões reservada, pois o anabolismo é um processo redutivo e os electrões são adicionados às pequenas moléculas enquanto estas são usadas para formar as macromoléculas.

Resumindo…
Etapas da biossíntese das macromoléculas: • • • Produção de unidades moleculares; Activação desses monómeros com dispêndio de ATP; Polimerização dos monómeros activados.

Uma das macromoléculas sintetizadas nos procariotas é o peptidoglicano. A Síntese do Peptidoglicano tem três fases: 1. Fase citoplasmática 2. Fase membranar 3. Fase parietal

Fig 8.1: Síntese do peptidoglicano Esta síntese envolve dois “carriers”. O primeiro, uridina difosfafo (UDP) funciona nas reacções citoplasmáticas. No primeiro passo da síntese do peptidoglicano, derivados de UDP do N-acetilmurárico e da N-acetilglucosamina são formados. De seguida, há uma adição sequencial de aminoácidos ao UDP-NAM, de modo a formar o pentapéptido UDP – NAM, sendo que o ATP é necessário neste passo. Este produto é a primeira unidade importante sintetizada no citoplasma. De seguida, este péptido liga-se através de uma ligação fosfato ao bactoprenol que é considerado o segundo “carrier”, localizado no lado citoplasmático da membrana plasmática. O intermediário resultante é um álcool com 55 carbonos. Depois, UDP transfere NAG para o complexo bactoprenol-NAM-pentapéptido de modo a gerar o NAM-NAG-pentapéptido. Este último está ligado ao bactoprenol, que vai transportar o péptido pela membrana, desde a parte interna da membrana para a parte externa da membrana, onde vai ser sintetizado o peptidoglicano em si. Após isto, o NAM-NAG-pentapéptido, liga-se, já na parte externa da membrana, a uma cadeia de peptidoglicano. É esta unidade que vai ser libertada para o espaço periplasmático, sendo que o bactoprenol é desfosforilado (ficando apenas com um fosfato ligado a si) e volta para o lado citoplasmático, onde poderá participar numa nova síntese. (ver figura 8.1 para síntese esquematizada) Alguns antibióticos actuam a este nível, de modo a interferirem na síntese do peptidoglicano. Por exemplo, a bacitracina impede que haja a desfosforilação do bactoprenol. O último passo na síntese do peptidoglicano é a transpeptidação, onde se criam ligações peptídicas entre as cadeias de peptidoglicano. Antes de acontecer a

transpeptidação propriamente dita, há que haver uma descarboxilação do terminal Dalanina, que vai fornecer a energia necessária para que a transpeptidação aconteça.

Fig 8.2: Transpeptidação – Reacções de transpeptidação na formação de peptidoglicano em E. coli e S. aureus. Na transpeptidação estão envolvidas também as enzimas PBP – Penicillin Binding Proteins, que existem no folheto externo da membrana. Quando existem mutações nestas, as bactérias ficam sujeitas a alterações por parte da penicilina e da vancomicina. Além do mais, a penicilina liga-se às PBP, alterando-as. Não há transpeptidação e a célula morre porque para a célula crescer tem que haver biossíntese e corte (por parte das lisinas). O corte, neste caso, continua a funcionar, mas a biossíntese não e portanto o citoplasma sai pelos “buracos” formados pela diferença de pressão osmótica, e a célula morre. Já a vancomicina despromove a descarboxilação do terminal D-alanina, não havendo também transpeptidação.

Síntese do DNA
Outra síntese que estudamos nos procariotas é a síntese do DNA. Esta síntese é mais normalmente chamada de Replicação do DNA, e é importante para a duplicação do material genético. É semiconservativa, ou seja, as moléculas filhas contêm uma cadeia igual à molécula mãe e uma cadeia nova. O DNA na E. coli é circular e a replicação começa num único local, a origem (ver figura 8.3). Daí se dizer que o genoma bacteriano é um replicão. Quando se dá a conjugação da E. coli, observa-se um diferente tipo de mecanismo chamado “rolling-circle replication”, que é também observado quando há replicação de plasmídeos e reprodução de alguns vírus. Durante este processo, a extremidade 3’-OH livre cresce por obra das enzimas da replicação. À medida que esta extremidade cresce, enquanto o growing point anda à volta do molde circular, a extremidade 5’ é retirada (do inglês, “displaced”) e forma uma cauda que está constantemente a crescer. Este mecanismo é particularmente útil para os vírus porque permite uma produção rápida e contínua de muitas cópias do genoma a partir de um único evento de iniciação. As enzimas que catalisam a síntese do DNA são as chamadas DNA polimerases. A E. coli possui três: a I, que está envolvida em mecanismos de reparação de DNA, a II e a III, que está mais envolvida na replicação do DNA, mas para funcionar tem existir um primer, uma molécula iniciadora, que possui sequências curtas de ácidos nucleicos, com a extremidade 3’-OH livre, que se vai ligar à cadeia complementar. Todas as DNA polimerases conhecidas catalisam a síntese de DNA na direcção 5’ para 3’. Para que as DNA polimerases catalizem uma cadeia complementar de DNA, são necessárias três coisas: (1) um molde, que se leia na direcção 3’ para 5’, (2) um primer e (3) dNTPs. Na E. coli, a replicação começa quando um conjunto de proteínas DnaA se liga a sequências de nucleótidos específicas no sítio de origem da replicação (o locus oriC). Estas proteínas hidrolisam ATP de modo a que as ligações de hidrogénio que ligam as duas cadeias de DNA se partam e o molde seja de apenas uma cadeia. Mas não só estas proteínas conseguem manter esta única cadeia funcional. Outras proteínas, como as helicases, as single-stranded DNA binding proteins (SSBs) e as topoisomerases ajudamnas.

As helicases são responsáveis por desenrolar as cadeias de DNA. As SSBs mantêm as cadeias longe umas das outras assim que elas são separadas e as topoisomerases aliviam a tensão gerada pelo rápido desenrolamento da dupla hélice. Isto é importante porque por causa deste rápido desenrolamento, pode haver formação de superenrolamentos positivos na hélice e estes podem impedir a replicação se não forem removidos. A enzima DNA girase (uma topoisomerase) desfaz os superenrolamentos positivos que ocorrem à frente da bifurcação de elongação durante a síntese do DNA. Assim que o molde estiver preparado, o primer que é necessário para a DNA polimerase III pode ser sintetizado. Este é sintetizado por uma primase, com a ajuda de outras proteínas – formando um complexo chamado primossoma. Como a DNA polimerase deve sintetizar DNA na direcção 5’ para 3’, apenas uma das cadeias, chamada cadeia líder ou primária, pode ser sintetizada continuamente na sua terminação 3’, à medida que o DNA desenrola. A outra cadeia, chamada de cadeia secundária, não se pode formar na mesma direcção pois não há nenhuma extremidade 3’-OH livre onde os nucleótidos possam ser ligados. Então, esta cadeia é sintetizada descontinuamente na direcção 5’ para 3’ como uma série de fragmentos, chamados de fragmentos Okazaki (que são pequenos fragmentos de cadeias de DNA simples que se emparelham com a cadeia complementar, que se ligam covalentemente na extremidade 5’ a um primer). Ou seja; enquanto a cadeia primária precisa apenas de um primer (e apenas um primossoma) para iniciar a síntese, a cadeia secundária precisa de vários primers e vários primossomas, que serão, depois, eventualmente retirados. Quando isso acontece, os fragmentos Okazaki são ligados pela enzima DNA ligase, que forma uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 3’-hidroxil da cadeia que está a crescer e a extremidade 5’-fosfato do fragmento de Okazaki.

Fig 8.3: Genoma bacteriano é circular. Na figura maior, síntese do DNA resumida. A replicação pára quando o replissoma reconhece um local de terminação no DNA. Quando a replicação de um genoma circular está completa, as duas cadeias filhas podem permanecer entrelaçadas – formando catenanos. Isto traz obviamente problemas. Porém, as topoisomerases resolvem o problema, fazendo com que as moléculas de DNA sejam temporariamente cortadas, de modo a que cada cadeia seja separada (ver Figura 8.4).

Fig 8.4: Mecanismos de acção das topoisomerases (Catenação e Decatenação). Quando a antibióticos que inibam a síntese do DNA temos como exemplos as quinolonas. Isto porque afectam a actividade das topoisomerases II (girases) gyrA, gyrB e das topoisomerases IV (parC; parE) e logo, há uma paragem na síntese do DNA.

Síntese do RNA
A síntese do RNA a partir do DNA é chamada de transcrição. Esta é feita através da RNA polimerase e gera três tipos de RNA: mRNA (RNA mensageiro), rRNA (RNA ribossomal), tRNA (RNA de transferência) e os pequenos RNAs reguladores. A reacção é bastante similar à que é catalizada pela DNA polimerase. ATP, GTP, CTP e UTP são usados para produzir um RNA complementar a partir do molde de DNA. Porém, estes nucleótidos contêm ribose e não desoxirribose (ver Figura 8.5).

Fig 8.5: Fenómeno de transcrição. Esta síntese é feita, tal como a do DNA, na direcção 5’ -> 3’, com os nucleótidos a serem adicionados à terminação 3’ da cadeia que cresce. É produzido pirofosfato que é depois hidrolisado a ortofosfato. Esta reacção faz com que a síntese do DNA e RNA seja irreversível. A transcrição envolve três processos distintos: iniciação, elongação e terminação. Apenas uma pequeno segmento de DNA é transcrito (enquanto que na replicação do DNA é preciso que todo o molde seja copiado) e a iniciação começa quando a RNA polimerase se liga à região promotora do gene. É nesta altura que o factor sigma entra. Ele vai reconhecer a região promotora do gene e vai fazer com que se dê o início da transcrição. É de notar que o factor sigma serve apenas para reconhecer a região promotora e fazer com que a RNA polimerase se ligue lá, de modo a começar a transcrição. Ele sai dessa zona mesmo antes da transcrição em si começar. Essas regiões promotoras onde se vai iniciar a transcrição têm, nas bactérias, duas características: uma sequência de seis bases (muitas vezes TTGACA) que se situa 35 pares de bases antes do local de iniciação da transcrição, e uma sequência TATAAT que se situa 10 pares de bases abaixo do mesmo local. Estas regiões são chamadas -35 e

-10 sites. É entre eles (e até ao local +1, onde se inicia a transcrição) que se situa a região promotora, onde a RNA polimerase se liga. Assim que estiver ligada, a RNA polimerase começa a desenrolar o DNA sem a ajuda de helicases. O sítio -10 é rico em adeninas e timinas, o que faz com que as ligações de hidrogénio que mantém a dupla hélice do DNA enrolada sejam mais fáceis de serem “partidas”. Quando o DNA é desenrolado nesta zona, forma-se o “open complex”, que se move com a RNA polimerase à medida que esta procede à transcrição de mRNA a partir do DNA, durante a elongação. É também durante a elongação que mRNA’s com uma única cadeia são libertados e as duas cadeias de DNA ficam de novo com a sua estrutura de dupla hélice. A terminação da transcrição dá-se quando a RNA polimerase se dissocia do molde de DNA. Isso acontece quando a enzima encontra no gene sequências de nucleótidos que a “mandam” parar de sintetizar mRNA – sequências terminadoras. Forma-se então mRNA com dois genes (formam operão – conjunto de genes transcritos pelo mesmo DNA e dependentes do mesmo promotor).

Fig 8.6: Outra imagem relativa à transcrição: aqui pode ver-se as três fases desta síntese. ATENÇÃO: A RNA polimerase progride na direcção 3’ para 5’ aquando da transcrição. Porém, o mRNA é sintetizado na direcção 5’ para 3’, de modo a ser complementar e anti-paralelo ao molde de DNA.

Síntese Proteica nos Procariontes
A última síntese de que falamos é a Síntese Proteica nos procariontes. Esta dá-se por interacção entre os ribossomas e o mRNA. O ribossoma procariótico é constituído por duas subunidades, 30S e 50S, sendo que quando juntas, perfazem um valor de sedimentação de 70S (ver Fig 8.7). Estas subunidades são construídas a partir de uma ou duas moléculas de rRNA e muitos polipéptidos. A região do ribossoma directamente responsável pela tradução é chamada de domínio da tradução. Ambas as subunidades contribuem para este domínio.

Fig 8.7: Ribossoma procariótico. O RNA ribossomal tem três papéis. Obviamente, contribui para a estrutura do ribossoma. A parte rRNA 16S da subunidade 30S é necessária para a iniciação da síntese proteica nas bactérias, pois é a extremidade 3’ desta parte do rRNA que se complexa num local do mRNA, chamada sequência Shine-Dalgarno, que se situa no ribosome-binding site (RBS). Isto ajuda o mRNA a posicionar-se no ribossoma. O rRNA 16S também contém uma proteína necessária ao início da tradução, entre outros. Finalmente, parece que o rRNA 23S tem um papel catalítico na síntese proteica.

Iniciação da Síntese Proteica E. coli e a maioria das bactérias começam a síntese proteica usando um aminoacil-tRNA modificado, o N-formilmetionil-tRNA, que só pode ser usado para iniciação. Quando este se liga à subunidade 30S do ribossoma, dá-se a iniciação. Como já foi dito, esta subunidade tem uma molécula de rRNA 16S com sequências de nucleótidos que são complementares da sequência Shine-Dalgarno na sequência líder do mRNA. Esta sequência líder não é traduzida, apenas transcrita. Isto porque o papel da sequência líder é alinhar o mRNA com as bases complementares do rRNA 16S, de modo a que o codão para o iniciador fMet-tRNA seja traduzido primeiro. Os mRNA’s têm um codão iniciador (normalmente AUG) que se liga especificamente ao anticodão fMet-tRNA. Finalmente, a subunidade 50S liga-se à estrutura formada pela subunidade 30S + mRNA, formando um complexo activo ribossoma-mRNA. Nas bactérias, são necessários três factores iniciadores: IF-3, que previne que a subunidade 30S se ligue somente à subunidade 50S e promove a ligação correcta entre o mRNA e a subunidade 30S; IF-2, que liga GTP ao fMet-tRNA e promove a ligação do fMet-tRNA iniciador ao sítio P da subunidade 30S (GTP é hidrolisado quando se dá a associação da subunidade 50S à subunidade 30S); IF-1, que parece ser requerido para a libertação de IF-2 e GDP, e para ajudar a associação da subunidade 50S à subunidade 30S. Elongação da Cadeia Polipeptídica Toda a adição de aminoácidos a uma cadeia polipeptídica a crescer é resultado de um ciclo de elongação composto por três fases: Ligação do aminoacil-tRNA, reacção de transpeptidação e translocação. O ribossoma tem três locais onde os tRNAs se podem ligar: “site” P (local doador), “site” A (aminoacil ou aceitador site) e um “site” E (local de saída, do inglês “exit site”). A primeira fase do ciclo de elongação é a fase de ligação do aminoacil-tRNA. Este é inserido no “site” A de modo a que o seu anticodão esteja alinhado com o codão do mRNA. Esta ligação inicia a segunda fase do ciclo de elongação, a reacção de transpeptidação. Esta é catalisada pela peptidil transferase, que é uma ribozima existente no interior do rRNA 23S. O grupo alfa-amino do “site” A ataca nucleofilicamente o

grupo alfa-carboxilo do C-terminal do aminoácido do “site” P do tRNA. A cadeia peptídica ligada ao tRNA é transferida para o “site” A, à medida que se forma uma ligação peptídica entre a cadeia e o aminoácido. A última fase é a translocação. Três coisas acontecem simultaneamente: (1) o peptidil-tRNA move-se do “site” A para o “site” P; (2) o ribossoma move um codão com o mRNA de modo a que um novo codão seja posicionado no “site” A; e (3) o tRNA livre deixa o “site” P e é movido para o “site” E, de onde sai do ribossoma. Terminação da Síntese Proteica A síntese proteica pára assim que o ribossoma chega a um destes três codões – UAA, UAG e UGA. Estes são encontrados no mRNA.

Antibióticos Inibidores da Síntese Proteica
Muitos antibióticos são inibidores da síntese proteica por se ligarem ao ribossoma procariótico. São exemplos desses antibióticos: - Aminoglicosidas – Liga-se à subunidade 30S do ribossoma, não deixando que a 30S se reúna com a 50S. Interfere na síntese proteica porque inibe directamente o processo de síntese e também por causar uma má leitura do mRNA. São mais efectivos contra bactérias Gram Negativo. Pode ser tóxico, causar náusea, perda de equilíbrio e respostas alérgicas. Ex: Streptomicina, canamicina, gentamicina. - Tetraciclinas – Liga-se também à subunidade 30 S do ribossoma. Impede que as moléculas aminoacil-tRNA se liguem ao A site do ribossoma. São activos contra bactérias tanto Gram negativo como Gram positivo. Doses altas podem resultar em diarreia, náusea, entre outros. - Macrolidas – Liga-se ao rRNA 23S da subunidade 50 S do ribossoma, inibindo assim a elongação da síntese proteica. Funciona muito bem contra bactérias

Gram positivo e algumas Gram negativo. Costumam ser usadas em pacientes que são alérgicos a penicilina. - Lincosamidas - Oxazolidinonas - Everninomicinas - Streptogaminas

Bibliografia usada para a aula nº 8: Slides das Teóricas e Apontamentos Prescott, Harley, and Klein’s MICROBIOLOGY, de Joanne M. Willey, Linda M. Sherwood e Christopher J. Woolverton, Edição Internacional – 7ª edição, McGrawHill, Cap. 11 e 34

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