Practica N 9

CULTIVO DE ANAEROBIOS
OBJETIVO: Preparar las condiciones adecuadas para obtener un cultivo anaerobio. FUNDAMENTO: El oxgeno molecular y el dixido de carbono son los principales gases que afectan al desarrollo de las bacterias. GENERALIDADES: Las bacterias presentan repuestas ante el oxgeno libre clasificndolas en cuatro grupos: 1.- Aerobias: Son aquellas bacterias que se desarrollan en oxgeno libre. 2.- Anaerobias: Son aquellas que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. 3.- Anaerobias facultativas: Estas bacterias tienen la capacidad de desarrollarse en presencia o ausencia de oxgeno libre. 4.- Microaerfilas: Son aquellas bacterias que se desarrollan en pequeas cantidades de oxgeno libre. Los anaerobios incluyen todas las morfologas bacterianas. Tienen la capacidad de formar esporas y las caractersticas morfolgicas con la tincin de Gram estn ampliamente clasificadas. Las infecciones anaerobias en humanos y varios animales pueden afectar cualquier rgano o tejido cuando las condiciones son apropiadas. Los anaerobios ms importantes en infecciones clnicas son: Bacteroides fragilis, algunas especies de Clostridia y los gneros Peptococos y Peptostreotococos. Dentro de los anaerobios podemos encontrar una clasificacin de acuerdo a la tolerancia de la bacteria anaerobia con el oxgeno: a) Anaerobio aerotolerante: Estas bacterias crecen mejor en ausencia de oxgeno que en su presencia. Son aisladas fcilmente en la mayora de los laboratorios donde se utilizan mtodos anaerbicos sencillos. En esta clasificacin se encuentra un nmero limitado de bacterias de importancia clnica. b) Anaerobio obligado: Estas bacterias no se desarrollan cuando son expuestas al oxgeno molecular. En este grupo se encuentran la mayora de las bacterias de inters clnico. c) Anaerobios estrictos: Estas bacterias son extremadamente sensibles al oxgeno, requiere atmsferas libres de este y medios de cultivos reducidos qumicamente. En este grupo son escasas las bacterias de inters clnico.

MTODOS PARA PRODUCIR AMBIENTES ANAEROBIOS Se reconocen bsicamente dos formas de producir ambientes anaerobios, en la primera se utilizan mezclas de gases de hidrgeno, nitrgeno y dixido de carbono, las cuales desplazan al oxgeno presente en el rea donde se desea tener el ambiente anaerbico (cmara anaerbica con guantes y tubos con medio prereducido). El segundo es por medio de reacciones qumicas en donde se producen atmsferas sin oxgeno como el Sistema Gas-Pak que es el que se utilizar en esta prctica y que se describir a continuacin. SISTEMA GAS-PAK Este sistema es el ms utilizado en los laboratorios por su fcil manipulacin. Consiste en un cilindro que puede ser de cristal o de plstico grueso, un sobre generador de H2 y CO2, un catalizador de paladio y un indicador de anaerobiosis (azul de metileno). Ver figura 1. Al agregar agua a las sustancias del sobre (borhidrato de sodio, bicarbonato de sodio y cido ctrico), se lleva a cabo una reaccin qumica que libera H2 y CO2, este reacciona con el oxgeno presente en la jarra, que en presencia del catalizador de paladio produce agua, la atmsfera alcanzada despus que ha sido consumido el oxgeno es de 90% H2 y 8 a 10% de CO2 esto se pone de manifiesto con el vire del indicador de azul a blanco en un lapso de 2 a 3 horas. No obstante para obtener un potencial de xido reduccin adecuado para el desarrollo de bacterias anaerobias se requiere de 10 a 12 horas, por lo que las jarras deben abrirse hasta 48 horas. .
Figura 1. Sistema Gas-Pak para producir ambiente anaerobio

MATERIAL Y EQUIPO:

A sa bacter iolgic a

Mechero Bunsen Cajas Petri con agar sangre de carnero Tubos de 13x100 con 5 ml de caldo de tioglicolato. Jarra de anaerobiosis Sobres generadores Catalizadores de paladio Indicadores de azul de metileno Desinfectante Clavos o tornillos oxidados

MATERIAL BIOLGICO:

Cepas: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli .

TCNICA: 1.- Sembrar las cajas con bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli y los Clavos o tornillos oxidados en Tubos de 13x100 con 5 ml de caldo de tioglicolato, colocarlos en la jarra anaerbica. 2.- Colocar dentro de la jarra el sobre generador y colocar el indicador dentro de la jarra en un lugar visible. 3.- Poner el catalizador en el dispositivo colocado en la tapa de la jarra. 4.- Cortar la punta del sobre e introducir 10 ml de agua de la llave y cerrar perfectamente la jarra e incubar a 35C durante 48-72 horas.

IDENTIFICACIN PRESUNTIVA: Consiste en determinar la morfologa colonial microscpica de las bacterias desarrolladas en el medio.

Morfologa colonial: Se pueden observar por ejemplo en el caso del desarrollo del Clostridium, colonias grandes mate, rizoide y hemolticas en agar gelosa sangre. Un dato importante es el olor desagradable que presenta este tipo de bacterias. Morfologa microscpica: Se deben de hacer frotis, uno se tie por medio de la tincin de Gram y por otro la tincin de Shaeffer- Fulton.

ACTIVIDADES: I.- OBSERVACIONES: Tabla 1.- Observacin de la morfologa colonial en placa:

BACTERIA Elevacin: Forma : Borde:

Pseudomona aeruginosa Plana Circular Entero

Escherichia coli Elevada Circular Entero

Tabla 2.-Observacin del caldo de Tioglicolato: Cepa: Clostridium tetani (tubo 1) clavo oxidado Negro deFondo del tubo Marrn Media

Color del caldo Superficie crecimiento Precipitado Turbidez

OBSERVACIONES MICROSCPICAS: Escherichia coli Pseudomona aeruginosa Clostridium tetani

Agar Sangre Caldo de Tioglicolato Gram negativo

Agar EMB

OBSERVACIONES MACROSCPICAS:

Agar chocolate sangre

Agar EMB

Agar

Caldo de Tioglicolato

Cuestionario: 1. Qu es una bacteria anaerobia? Se puede definir a las bacterias anaerobias como aquellas que para crecer en la superficie de un medio de cultivo necesitan una atmsfera sin oxgeno, ya que este elemento es txico para ellas. 2. Cmo se clasifican las bacterias anaerobias? Teniendo en cuenta la tolerancia al oxigeno las bacterias anaerobias se clasifican en: Anaerobias estrictas Anaerobias aerotolerantes Anaerobios Facultativos Microaerofilicas 3. Qu es una anaerobio aereotolerante? Toleran el oxgeno hasta un 8% pero son incapaces de utilizarlo para su metabolismo. La tolerancia al oxgeno de stas bacterias est dada por la presencia de enzimas superoxido dismutasa (SOD), catalasa y peroxidasa que catalizan la conversin de radicales superoxido a perxido de hidrgeno menos txico y a oxgeno molecular. 4. Qu tipo de mtodos se utilizan anaerobios?. Explicar cada uno de ellos. para producir ambientes

Jarra anaerbica: Recipiente de cierre hermtico, en el que se elimina el oxgeno por diferentes medios (sobres generadores de gases como hidrgeno, nitrgeno y CO2 que desplazan el oxgeno y crean un ambiente anaerobio), incluyen un catalizador y un indicador de anaerobiosis. Cmara de anaerobiosis: Cabina hermticamente cerrada de plstico, metal, fibra de vidrio o polivinilo, con un sistema de intercambio, dos puertas interna y externa y que puede llenarse de gas libre de oxgeno, lleva adems soportes con guantes incorporados para realizar manipulacin de muestras en el interior. Bolsas de anaerobiosis: Bolsas de plstico transparente.Usan tambin sobres generadores de gases proporcionales a su tamao e indicadores de anaerobiosis. MEDIOS DE CULTIVO Se utilizan medios selectivos, no selectivos y de enriquecimiento. Los medios de cultivo para anaerobios tienen una alta proporcin de peptonas e hidratos de carbono ya que su metabolismo es ms exigente que el de bacterias facultativas y requieren adems factores de crecimiento como la hemina y vitamina K. Los medios empleados con mayor frecuencia son:

AGAR SANGRE ANAEROBIO (ASA): Agar sangre complementado con Vitamina K y hemina Medio no selectivo. Crecen anaerobios y anaerobios facultativos. - AGAR SANGRE LACADA KANAMICINA VANCOMICINA (ASLKV): Medio selectivo para bacilos Gram negativos anaerobios, favorece produccin de pigmento. - FENILETIL ALCOHOL AGAR (FEA): Inhibe el crecimiento de bacilos Gram negativos aerobios facultativos.Crecen la mayor parte de anaerobios Gram positivos y Gram negativos, el alcohol sirve como aceptor final de electrones. - AGAR BACTEROIDES BILIS ESCULINA (BBE): Selectivo para Bacteroides sobre todo grupo frgilis, pueden crecer tambin fusobacterium. - AGAR YEMA DE HUEVO (EYA): Para Clostridium sp. - AGAR CICLOSERINA CEFOXITINA FRUCTOSA (CCFA): Para Clostridium difficile. - AGAR CHOCOLATE: Contiene hemina. - CALDO TIOGLICOLATO - CALDO GLUCOSA CON CARNE: Suplementado con vitamina k y hemina - CALDO INFUSION CEREBRO CORAZON INCUBACION La mayora de los casos se incuban a una temperatura de 35 a 37 C. El tiempo de incubacin debe ser de 72 a 96 horas ya que estos microorganismos a diferencia de los aerobios son de crecimiento lento. Se debe evitar la exposicin al aire. 5. Cite cuatro ejemplos de enfermedades anaerbicas. Meningitis Gingivitis Neumona Celulitis Anaerobia CONCLUSIN: Las bacterias anaerobias son otro tipo de microorganismos patolgicos del cual es importante hacer estudio. stas presentan caractersticas, y como su nombre lo dice, necesitan un ambiente libre de oxigeno es por eso que los mtodos empleados para su cultivo deben tener ciertas particularidades para su correcta observacin. Aunque estas bacterias no toleran el oxgeno en un 100%, son motivo de numerosas enfermedades entre los humanos, por lo que deben de ser estudiadas tambin con el correcto cuidado y aplicando todas las normas de bioseguridad. BIBLIOGRAFIA: http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap16.htm http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/documentos/Enf/BacteriasAnaerobias %20IVsem-I-07.pd causadas por bacterias

Practica N 10 PRUEBAS BIOQUMICAS PARTE I PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER (RM VP) OBJETIVO:

Aprender a diferenciar el genero Enterobacter y Klebsiella peumoniae

(generalmente positiva) de Escherichia coli. FUNDAMENTO: El cido pirvico es un compuesto formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, se metaboliza aun ms a travs de cierto nmero de vas metablicas. Una de esas vas da como resultado la produccin de acetoina (acetil metil carbinol) a travs de la accin de KOH y oxgeno atmosfrico. El diaceril es convertido en un complejo rojo bajo la accin cataltica de alfa naftol y creatina. GENERALIDADES: Esta prueba es usada con el propsito de distinguir entre Escherichia coli y Entorobacter de Klebsiella, aun cuando otros miembros de los Entorobacteriaceae son capaces de producir una reaccin de Voges Proskauer positiva. El medio comercial RM VP utiliza una concentracin de peptona y glucosa al 1% aunque resulta satisfactoria una concentracin inferior con un mnimo de no menos del 0.5% de glucosa. La menor concentracin reduce la concentracin del in hidrgeno que requieren los organismos VP positivos. Adems una concentracin del 0.5% de peptona da menos color al medio, haciendo ms fcil interpretar la reaccin de color. Reacciones de Voges-Proskauer La reaccin de Voges-Proskauer (VP) se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona), producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La cual es metabolizada en cido pirvico, intermediario de clave de la gluclisis. A partir del cido pirvico, una bacteria puede seguir muchas vas. La produccin de acetona es uno de los ciclos para la degradacin de la glucosa en las bacterias. La reaccin VP para la acetona se usa sobre todo para separar a la E. coli de los grupos Klebsiella-Enterobacter, aun cuando otras grupos miembros de las Enterobacteriaceae son capaces de producir una reaccin de VP positiva. Las Enterobacteriaceae se clasifican caractersticamente como fermentadoras de cidos mixtos o del acido frmico, lo cual indica que sus productos terminales por la fermentacin de la glucosa son cidos. Estos fermentadores de cidos mixtos pueden ser divididos en dos grupos: 1) Los que producen cidos pero no 2,3-butanediol, como la E. coli (VP-). 2) Los que producen 2,3-butanediol como productos terminales principales, como grupos Klebsiella-Enterobacter (VP+). Una molcula de acetona se forma por la descarboxilacin de dos moleculas de acido pirvico. Harden y Walpole afirman que la acetona es una etapa intermediaria en la conversin en 2,3-butanediol. Tanto la acetona como el 2,3-butanediol son productos de la fermentacin de la glucosa.

Paretsky y Werkman hallaron que la formacin de la acetona se acumula cuando un organismo es cultivado en condiciones aerbicas. La acetona puede ser metabolizada por uno de estos dos medios: 1) Reduccin a 2,3-butanediol, que se acumula a menos que se produzca la reoxidacin. 2) Lo que es mas raro, por oxidacin en diacetilo, que a su vez puede ser catabolizado. Stahly y Werkman encontraron que la formacin de acetona y 2,3-butanediol es un sistema reversible de reduccin o de oxidacin, en el que la acetona se convierte por reduccin en 2,3-butanediol, o ste es oxidado en acetona. El equilibrio entre la acetona y el 2,3-butanediol est determinado por el volumen de hidrgeno disponible, o las diferencias de potencial oxidacin-reduccin. En presencia de oxigeno atmosfrico y lcali, los productos finales neutros acetona y 2,3-butanediol son oxidados en diacetilo, que es el reactante para el color producido en la reaccin de Voges-Proskauer. Por lo tanto, el diacetilo es un producto de la oxidacin de la acetona. MATERIAL Y EQUIPO: Tubos con caldo RM-VP Indicador rojo de metilo Solucin de alfa-naftol Solucin de KOH Pipetas estriles

MATERIAL BIOLGICO: Cepas: Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. TCNICA: 1.- Inocular dos tubos de caldo de RM VP con Escherichia coli y dos tubos con Pseudomonas aeruginosa, incubar a 37C por dos das. 2.- Despus de incubar se realiza la prueba del rojo de metilo en cada tubo de la siguiente manera: Aadir 5 gotas de rojo de metilo a dos tubos (uno de cada bacteria) y observar el color obtenido para cada bacteria. 3.- Con las otras dos probetas (una de cada organismo), llevar a cabo la prueba de Voges Proskauer: Aadir 0.5 ml de solucin alfa naftol a cada tubo, luego aadir 0.5 ml de hidrxido de potasio, agitar y dejar en posicin vertical por 1 o 2 horas. Observar si aparece una coloracin rosa o roja, que indica que es una prueba de la presencia del acetil metil- carbinol.

INTERPRETACIN: Reaccin VP positiva: color rojo o Rosado en la superficie del medio. Reaccin de VP negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo) puede formarse un color cobrizo, pero aun as la reaccin es negativa. ACTIVIDADES: I.- Contestar: 1.- Por qu es importante la prueba de Voges Proskauer en el laboratorio de microbiologa? Porque es importante para la identificacin de gneros de bacterias y adems para diferenciar el genero Enterobacter y Klebsiella peumoniae (generalmente positiva) de Escherichia coli. 2.- Qu bacterias o especies se pueden identificar por medio de esta prueba? Enterobacter hafniae y Yersinia enterocolitica. RESULTADOS: TABLA DE RESULTADOS POR EQUIPO BACTERIA Klebsiella Pneumoniae Escherichia coli RESULTADO POSITIVO POSITIVO

OBSERVACIONES

Voges-Proskauer (negativo).

Rojo de metilo, positivo (izquierda) y negativo (derecha).

VP de Klebsiella Pneumoniae y Escherichia coli

CONCLUSIN: La prueba de Voges-Proskauer es indispensable para la identificacin de diversos gneros de bacterias que son fermentadoras de la glucosa, produciendo acetona, el cual es un intermediario de dicha fermentacin. La acetona en un medio fuertemente alcalino y en presencia de Oxgeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con compuestos que contengan ncleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosado-violceo. Se agrega -naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicar que la glucosa es fermentada por la va butanodilica. BIBLIOGRAFA: Introduccin a la microbiologa Ingraham John, Ingraham Catherine. Reverte, 1998

http: www.imb.usal.es Practica N 11 PRUEBAS BIOQUMICAS PARTE II REDUCCIN DE NITRATOS

OBJETIVO:

Observar la capacidad de ciertos microorganismos de reducir los nitratos en nitritos as como aprender su utilizacin en la identificacin y diferenciacin de microorganismos. FUNDAMENTO: Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de extraer oxgeno de nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. NO3 + Nitrato 2e + 2H NO2 + Nitrito H2O

La presencia de nitritos en el medio se detecta mediante el agregado de alfa naftilamina y cido sulfanilico con la formacin de un colorante de diazonio rojo psulfobenceno-azo-alfa-naftilamina. GENERALIDADES: La capacidad de un microorganismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante en la identificacin y diferenciacin de microorganismos esto es debido a que estas bacterias poseen una enzima llamada nitrato reductasa o nitrito reductasa. La secuencia de produccin de nitrito o de nitrgeno a partir del nitrato permite a ciertas bacterias oxidar la glucosa sin necesidad del oxgeno atmosfrico. Esta propiedad permite a algunas bacterias aerobias de forma obligada desarrollarse mnimamente en condiciones anaerobias estrictas, ya que la energa que se libera de la reduccin es casi similar al ATP producida por la respiracin del oxgeno. Todas las enterobacterias, excepto ciertos tipos de Enterobacter agglomerans y algunas especies de Erwinia reducen los nitratos. Es til para la identificacin de miembros de los gneros Haemophilus, Neisseria y Branhamella. Prueba de reduccin del nitrato La reduccin del nitrato (NO3-) en nitrito (NO2-) y en gas nitrgeno (N2) tiene lugar generalmente en condiciones anaerbicas, en las cuales un organismo obtiene su oxigeno del nitrato. La mayora de las bacterias aerbicas son anaerobios facultativos y slo pueden reducir el nitrato en ausencia de oxigeno. Esta respiracin anaerbica es un proceso de oxidacin por el cual las sustancias inorgnicas, especialmente nitrato y sulfato, o raramente hidratos de carbono proporcionan oxigeno para que sirva como aceptor de electrones para suministrar energa. En la reduccin del nitrato, los citocromos bacterianos transportan electrones a molculas aceptoras especficas. Gunsalus y Stanier aseguran que hay pruebas de que el nitrato acta como el oxidante

final en los sistemas citocromo. La caracterstica del nitrato de reducir una especie en particular es ms o menos constante.

Reduccin del nitrato en nitrito NO3 - + 2e- + 2H+ NO2- + H2O Nitrato Nitrito Sin embargo, las posibilidades del producto final de reduccin del nitrato son muchas: nitrito, amoniaco, nitrgeno molecular, xido ntrico, xido nitroso o hidroxilamina. El producto final de la reduccin que se forme depende de la especie bacteriana. La reduccin del nitrato en gas nitrgeno u xido nitroso se denomina desnitrificacin. El nitrato sirve como un aceptor de electrones; por cada molcula de nitrato reducido, se aceptan cinco electrones. Nitrato en nitrgeno molecular 2NO3- + 10e- + 12H+ N2 + 6H2O En el proceso de desnitrificacin, el oxido nitroso (intermediario) puede acumularse si la concentracin de nitrato es elevada; sin embargo, cuando sta es baja, el xido nitroso es reducido nuevamente a nitrgeno molecular. En la reduccin del nitrato pueden producirse varios procesos para la utilizacin de los productos terminales formados. La reduccin, por lo tanto, en la prueba de reduccin del nitrato, se manifiesta por la presencia de un producto final catablico o la ausencia de nitrato en el medio. MATERIAL Y EQUIPO Asa de inoculacin Mechero Bunsen REACTIVOS: Tubos con caldo Alfa-naftilamina (Reactivo A) cido sulfanlico (Reactivo B) Zinc en polvo Desinfectante MATERIAL BIOLGICO: Cepas: Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa. TCNICA: 1.- Inocular aspticamente tres tubos de caldo de nitratos uno con cada uno de los microorganismos proporcionados. Usar el cuarto tubo como control. Incubar a 37C por 24 48 horas.

2.- Despus de la incubacin agregar a cada tubo (incluyendo el control) 1 ml de reactivo A, seguido de 1 ml de reactivo B. No agitar los tubos ya que puede haber una introduccin de oxgeno que afecte la prueba. INTERPRETACIN El desarrollo de un color rojo que puede tornarse caf rpidamente dentro de los 30 segundos indica la presencia de nitritos dando una reaccin positiva. Si no se produce color la reaccin se considera negativa. Es necesario a las pruebas negativas de adicionarle una pequea cantidad de zinc reducen los nitratos a nitritos y si se forma el color rojo despus de la adicin del zinc ello indica la presencia de nitratos residuales con los que se confirma la reaccin negativa. ACTIVIDADES: I.- Contestar el siguiente cuestionario: 1.- Por qu importante en bacteriologa la capacidad de ciertas bacterias de reducir nitratos a nitritos? Porque de esta forma las bacterias aerobias pueden obtener su oxgeno en condiciones anaerbicas estrictas y desarrollarse. Adems esta prueba se utiliza principalmente para diferenciar entre s determinadas bacterias de los gneros Haemophylus y Neisseria. 2.- Qu enzima lleva a cabo la reaccin de reduccin de nitratos a nitritos? Nitrato reductasa o nitrito reductasa. 3.- Citar dos ejemplos de bacterias reductoras de nitratos. Neisseria mucosa y Branhamella catarrhalis. II.- RESULTADOS: Tabla de resultados por equipo: BACTERIA Escherichia coli REDUCCION DE NITRATOS POSITIVO

OBSERVACIN DE LA PRUEBA DE NITRATOS:

Positivo

Negativo

Caldo de nitratos (E. coli) POSITIVO

Caldo de nitratos (E. coli) POSITIVO

CONCLUSIN: Mediante la prctica e informacin obtenida y analizada se puede ver que la prueba de reduccin de nitrato es muy importante en microbiologa pero aun ms en bacteriologa debido a que permite que ciertas bacterias aerobias que se encuentran en condiciones anaerobias estrictas se desarrollen obteniendo el oxgeno mediante el nitrato. BIBLIOGRAFA: Introduccin a la microbiologa Ingraham John, Ingraham Catherine. Reverte, 1998

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Practica N12

PRUEBAS BIOQUMICAS PARTE III REACCIONES EN MEDIOS UREA, SIM, TSI, LIA Y CITRATO
OBJETIVO: Se ensayarn y observar algunas reacciones bioqumicas tiles en la identificacin de bacterias. FUNDAMENTO: Se identificar a las bacterias mediante la deteccin de los productos resultantes de la fermentacin o utilizacin de los hidratos de carbono, polihidroxialcoholes, glucsidos o sales de cidos carbnicos, denominados carbohidratos. GENERALIDADES: Todos los microorganismos de importancia clnica, aunque no todas las bacterias necesitan una fuente de carbono de cuyo metabolismo la bacteria obtiene la mayor parte de toda la energa que necesita para sintetizar sus elementos y regular los procesos metablicos. Las bacterias patgenas normalmente se limitan a metabolizar azcares simples o aminocidos. La demanda energtica microbiana se clasifica en tres categoras principales: quimiotrofia, fototrofias y paratrofias. La quimiotrofia es aquella donde la energa biolgica se obtiene a partir de reacciones que se llevan a cabo fuera de la luz; se conocen dos tipos fundamentales de quimiotrofia en las bacterias: La quimioorganotrofia y quimiolitotrofia. La primera de ellas es la que comparten todos los animales, significa que la energa es obtenida por la oxidacin o fermentacin de compuestos orgnicos exgenos. La quimiolitotrofia es un proceso mediante el cual las bacterias producen todos sus componentes reduciendo el anhdrido carbnico en la energa liberada durante la oxidacin inorgnica. La fototrofia es aquella donde la energa proviene de las reacciones fotoqumicas. Por ltimo la paratrofia es aquella donde la energa se obtiene a partir de la clula del husped ya sea animal, planta o microorganismos (los virus se encuentran dentro de esta clasificacin). La fermentacin es un proceso metablico de oxidacin anaerobia por accin enzimtica de microorganismos en donde el oxgeno gaseoso no participa y en su lugar se encuentra un sustrato orgnico. En los sistemas de prueba bacteriolgica, este proceso se detecta al observar cambios de color en indicadores de pH contenidos en los medio cuando la formacin de productos cidos aumenta.

La acidificacin de un medio ocurre generalmente por la degradacin de los hidratos de carbono, sin embargo tambin pueden ocurrir por vas no fermentativas como es el caso de algunos medio que no contienen hidratos de carbono en su composicin y que tambin dan como resultado final compuestos cidos. Generalmente el proceso que utilizan las bacterias para metabolizar es la va de Embden Meyer Hof, donde la glucosa es dividida en una serie de compuestos de tres carbonos del cual el ms importante es el cido pirvico. Tambin utilizan la fermentacin mixta en la cual el cido pirvico deriva finalmente en una variedad de cidos orgnicos. Las diferencias bioqumicas entre bacterias originan patrones especficos que se utilizan en la identificacin de ellas, ayudando como complemento de otros estudios bacteriolgicos. MEDIOS DE CULTIVO COMUNMENTE USADOS EN LAS PRUEBAS BIOQUMICAS AGAR HIERRO TRIPLE AZCAR (TSI) AGAR HIERRO DE KLIGER (KIA)

TSI y KIA son los medios ms utilizados para observar la fermentacin de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Para su utilizacin el medio debe estar en forma de pico de flauta. Se han incorporado a estos medios cuatro derivados proteicos: extracto de carne, extracto de levadura, peptona y proteosa, que hacen que los medios sean muy ricos nutricionalmente. La ausencia de inhibidores en el medio permite el crecimiento de todas las especies bacterianas excepto anaerobios obligados y otras bacterias exigentes. Por su contenido de sulfato ferroso se puede detectar cido sulfihdrico. De acuerdo a la actividad metablica del microorganismo se pueden obtener diferentes posibilidades de fermentacin. Como un mtodo para simplificar la interpretacin de las reacciones, se recomienda el uso de las siguientes siglas: K.- Designa una reaccin alcalina. (color rojo). A.- Designa una reaccin cido. (color amarillo). G.- Indica formacin de gas (burbujas en el medio). H2S.- Indica produccin de Sulfuro de hierro. (color negro). INTERPRETACIN DE LAS REACCIONES: Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K / K).- No hay fermentacin de hidratos de carbono. Bacteria no fermentadora. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K / A).- Glucosa fermenta; sacarosa (lactosa en KIA) no fermentada. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negro) (K / A H2S).- Glucosa fermentada, sacarosa (lactosa en KIA) no fermentada con produccin de H2S. Pico de flauta cido / profundidad cida (A / A).- Glucosa y sacarosa (lactosa en KIA) fermentadas. MEDIO DE AGAR HIERRO LISINA.

Muchas especies de bacterias poseen enzimas capaces de descarboxilar aminocidos especficos en el medio, con lo cual liberan aminas de reaccin alcalina y dixido de carbono. En este caso la enzima lisina descarboxilasa al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. En este medio se puede detectar la produccin de la lisina descarboxilasa, ya que se produce una reaccin coloreada por un cambio en el pH del medio que contiene como indicador prpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (prpura) hacia amarillo en el fondo indica una reaccin cida por la fermentacin de una pequea cantidad de glucosa en el medio, si el microorganismo produce lisina descarboxilasa la accin de esta sobre la lisina dar lugar a la cadaverina la cual producir un cambio en el pH que sobrepasa la acidez debida a la glucosa dando un color prpura, as pues un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color prpura que si es producida. Indicador de pH: pH cido: pH alcalino: Descarboxilacin positiva: Descarboxilacin negativa: Desaminacin positiva: Desaminacin negativa: Prpura de Bromocresol Vire del indicador a amarillo Vire del indicador a prpura Fondo del tubo prpura Fondo del tubo amarillo sin cambio Superficie del tubo rojo vino Superficie del tubo prpura o sin cambio

LIA al igual que en TSI o KIA se puede detectar la produccin de sulfuro de hierro. El medio se utilizar en forma de pico de flauta. MEDIO DE CITRATO DE SIMMONS. Esta prueba se basa en la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono para metabolismo y crecimiento. Una prueba positiva est representada por la aparicin de un color azul oscuro en 24 o 48 horas, en el medio originalmente de color verde, que indica que el microorganismo ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la produccin de productos alcalinos. La prueba tambin es considerada positiva si hay crecimiento en la lnea de inoculacin, si se incube 24 horas ms aparecer el color azul. Al inocular el medio se debe tener cuidado de no arrastrar con el inculo residuos del medio anterior o que el inculo sea demasiado grande, ya que se pueden arrastrar compuestos orgnicos del medio anterior o compuestos orgnicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias ya que se puede liberar suficiente carbono y nitrgeno como para dar un resultado falso positivo. El medio se utiliza en forma de pico de flauta. REACCIN: Citrato - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - > Oxalacetato + Acetato

Oxalacetato - - - - - - - - - - - - - - - - - > 2 Piruvato - - - - - - - - - - - - - - - - - - >

Piruvato +

CO2

Acetato + CO2 + Lactato.

Los cidos orgnicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos alcalinos. MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD) Este medio sirve para observar la produccin de sulfuro, indol y la movilidad del microorganismo. El color original del medio es blanco y de consistencia semislida. PRODUCCIN DE INDOL Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y deaminar triptfano con la produccin de indol, cido pirvico y amonaco en un medio enriquecido con triptfano. La prueba para la identificacin de indol se basa en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo de p-dimetilaminobenzaldehido. (reactivo de Kovac o de Erlich). PRODUCCIN DE SULFURO DE HIERRO. El cido sulfhdrico se detecta por la aparicin de un color negro, ya que se produce sulfuro de hierro debido a la capacidad de ciertas bacterias de liberar azufre de aminocidos. En este medio la fuente de azufre es el tiosulfato de sodio. MOTILIDAD. Algunas bacterias se mueven por medio de flagelos, la motilidad es una caracterstica importante para la identificacin final de una especie. La motilidad se interpreta por observacin macroscpica del medio observando si hay una zona difusa de crecimiento que se ensancha a partir de la lnea de inoculacin. El medio se utiliza en tubo. PRUEBA DE LA UREASA. La hidrlisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima especfica, la ureasa dando lugar a dos molculas de amonio, agua y dixido de carbono produciendo un color rosado mexicano.

REACCIN: O II NH C NH2 + 2HOH

CO2 + H2O + 2NH3

(NH4)2 CO3

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio lo que da como resultado alcalinizacin y aumento del pH del medio. El caldo urea se inocula con un asa de cultivo puro del microorganismo. MATERIAL Y EQUIPO Aguja bacteriolgica Mechero Bunsen Gradilla Medios de cultivo: TSI, LIA, Citrato de Simmons, SIM y Urea Desinfectante Cepas: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella tiphy.

TCNICA: 1.- Marcar los tubos con sus nombres correspondientes y el de la bacteria en estudio. Acomodarlos en serie de la siguiente manera: Urea, TSI, LIA, citrato, SIM. 2.- Inocular cada tubo de acuerdo como sigue: UREA: Inocular el caldo y disolver perfectamente el inculo. De este tubo se tomar la muestra para las siguientes inoculaciones. TSI: Picar el fondo del medio y estriar la superficie. LIA: Picar el fondo del tubo dos veces y estriar la superficie. CITRATO: Inocular solo la superficie del medio. SIM: Hacer una sola picadura recta en el medio. 3.- Tapar los tubos verificando que la rosca de los tapones no estn totalmente cerrados. Incubar a 37C por 24 horas.

IMGENES: Imagen 1.- Medio TSI Interpretacin: A.- Glucosa, lactosa y/o sacarosa fermentada B .-Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico y gas C.- Glucosa fermentada con produccin de cido sulfdrico

D. Ninguno de los tres azcares es fermentado

Imagen 2.- Citrato de Simons INTERPRETACIN: positiva: color azul negativa: verde Imagen 3.- Indol en medio de SIM INTERPRETACIN: positiva: anillo rojo en la superficie negativa: anillo amarillo

Imagen 4.- Caldo de urea INTERPRETACIN: Positiva: color rosa intenso Negativa: sin cambio de color Imagen 5.- Agar hierro lisina (LIA)

INTERPRETACIN: positiva: color violeta en la superficie negativa: sin cambio de color Shigella Descarboxilacin de lisina

Nota: para una mejor interpretacin se anexaran tablas de identificacin positiva y negativa de cada medio. INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS: K.- Designa una reaccin alcalina. (color rojo). A.- Designa una reaccin cido. (color amarillo). G.- Indica formacin de gas (burbujas en el medio). H2S.- Indica produccin de Sulfuro de hierro. (color negro). Pico de flauta alcalino / profundidad alcalina (K / K).- No hay fermentacin de hidratos de carbono. Bacteria no fermentadora. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (K / A).- Glucosa fermenta; sacarosa (lactosa en KIA) no fermentada. Pico de flauta alcalino / profundidad cida (negro) (K / A H2S).- Glucosa fermentada, sacarosa (lactosa en KIA) no fermentada con produccin de H2S. Pico de flauta cido / profundidad cida (A / A).- Glucosa y sacarosa (lactosa en KIA) fermentadas. RESULTADOS: Prueba TSI SIM UREASA LIA CITRATO SIMMONS Resultado Negativo para E. Coli NOTA: Debio dar positivo Negativo para E. Coli No hay movilidad para E. Coli Positivo para E. Coli Negativo para E. Coli Negativo

OBSERVACIONES:

ACTIVIDADES: I.- Contestar el siguiente cuestionario. 1.-Definir fermentacin: La fermentacin es un proceso metablico de oxidacin anaerobia por accin enzimtica de microorganismos en donde el oxgeno gaseoso no participa y en su lugar se encuentra un sustrato orgnico. 2.-Como se clasifican los hidratos de carbono? Simples Monosacridos: glucosa o fructosa Disacridos: formados por la unin de dos monosacridos iguales o distintos: lactosa, maltosa, sacarosa, etc. Oligosacridos: polmeros de hasta 20 unidades de monosacridos. Complejos Polisacridos: estn formados por la unin de ms de 20 monosacridos simples. Funcin de reserva: almidn, glucgeno y dextranos. Funcin estructural: celulosa y xilanos 3.-Cual es el indicador de pH que comnmente contienen los medios para pruebas bioqumicas para indicar que un hidrato de carbono ha sido fermentado? El cambio de color 4.-En el laboratorio de Microbiologa. Cules son las tres descarboxilasas utilizadas para la identificacin bacteriana? Lisina, ornitina y arginina III. CONCLUSIONES: Los diferentes medios utilizados en la prctica nos ayudan a poder diferenciar las bacterias debido a su reaccin bioqumica al hacer contacto con dicho medio. Estas pruebas son de gran importancia en la microbiologa ya que con ellas podemos identificar bacterias que tienen metabolismos similares con gran precisin.

BIBLIOGRAFA.: Introduccin a la microbiologa Ingraham John, Ingraham Catherine. Reverte, 1998 http: www.imb.usal.es

Practica No. 13

PRUEBAS BIOQUMICAS PARTE IV REACCIONES ENZIMTICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

OBJETIVO: Diferenciar gneros o especies de algunas bacterias mediante reacciones enzimticas. FUNDAMENTO: Comprobar la presencia de enzimas en las bacterias, mediante pruebas sencillas que ayudarn en su identificacin. GENERALIDADES: Dentro de las pruebas para identificacin de bacterias de tipo enzimtico encontramos las siguientes. OXIDASA.- Los microorganismos que poseen citocromooxidasa en su cadena respiratoria son considerados como microorganismo oxidasa positivos. Los citrocromos son hemoproteinas que contienen hierro, actan como el ltimo vnculo en la cadena de la respiracin aerobia, transfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno con la formacin de agua. Todos los microorganismos que son oxidasa positivos son aerobios o anaerobios facultativos.

En esta prueba se utilizan algunos colorantes reactivos como el clorhidrato de pfenilendiamina que sustituyen al oxgeno como aceptores de electrones. El colorante es incoloro pero en presencia de citocromooxidasa y oxgeno atmosfrico la pfenilendiamina es oxidada y forma azul de indofenol. Esta prueba es utilizada principalmente para la diferenciacin de las Pseudomonas y Neisserias (oxidas positivo) de Enterobacterias (oxidasa negativo). PRUEBA DE LA CATALASA.-Esta prueba se utiliza para observar la produccin de la enzima catalasa. La catalasa es una enzima que se encuentra en el grupo HEM y que se puede localizar en los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Su funcin es descomponer el perxido de hidrgeno formado durante la oxidacin de los azcares ya que este puede ser txico para la clula si se acumula.

En la descomposicin del perxido de hidrgeno, una molcula acta como substrato y la otra como donador; el substrato reducido por los tomos de hidrgeno suministrados por el donador da como resultado un substrato reducido y un donador oxidado. Catalasa H2O2 + H2O2 H2O + O2 PRUEBA DE LA COAGULASA.- La coagulasa es una enzima extracelular producida principalmente por la especie Staphylococcus aureus. Esta enzima reacciona coagulando el plasma por conversin del fibringeno en fibrina. Principalmente se ha utilizado en la diferenciacin de Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) y Staphylococcus epidermidis (coagulasa negativo).

METODOLOGAS I) DETERMINACIN DE OXIDASA: MATERIAL Y EQUIPO: Asa bacteriolgica Mechero Bunsen Papel filtro Discos comerciales oxidasa TCNICAS: PRUEBA EN PLACA.- Esta prueba se lleva a cabo en colonias aisladas de la bacteria en estudio en una caja Petri aadiendo directamente unas gotas del reactivo (2 o 3). REACTIVOS: Reactivo de Kovac Desinfectante para MATERIAL BIOLGICO: Cepas: Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli.

INTERPRETACIN: Presencia de un color azul en el papel si es positivo Ausencia de color indica un resultado negativo. PRUEBA CON PAPEL FILTRO:

1.- Humedecer un pedazo de papel filtro con unas gotas del reactivo. 2.- Con un asa tomar una colonia de la bacteria y colocarla en el papel humedecido. INTERPRETACIN: Presencia de un color azul en el papel si es positivo Ausencia de color indica un resultado negativo. TCNICA CON DISCOS COMERCIALES.- Tocar la colonia en estudio con el disco. Observar.

INTERPRETACIN: Coloracin azul oscuro en el sitio de contacto es resultado positivo. Sin cambio de coloracin es un resultado negativo.

II) DETERMINACIN DE CATALASA: Tubos de ensaye de 13X100 MATERIAL: Asa de inoculacin Mechero Bunsen Portaobjetos limpios REACTIVOS: Perxido de hidrgeno al 3% Desinfectante

MATERIAL BIOLGICO: TCNICAS: EN PORTAOBJETOS:

Cepas: Staphylococcus aureus y Escherichi coli.

1.- Colocar en un portaobjetos limpio una colonia pura de la bacteria en estudio. 2.- Aadir una gota de Perxido de hidrgeno al 3% sobre la colonia. TCNICA EN TUBO 1.- Aada directamente 1.0 ml de Perxido de hidrgeno al 3% a un cultivo puro en agar inclinado. 2.- Observar y anotar. INTERPRETACIN : Resultado positivo: Produccin de efervescencia. Resultado negativo: No hay reaccin. NOTA: No se deben utilizar colonias que provengan de medios con sangre ya que puede haber la probabilidad de resultados falsos positivos. Los tubos y portaobjetos utilizados deben depositarse en un frasco con desinfectante. III) DETERMINACIN DE COAGULASA: MATERIAL : Asa de inoculacin Mechero Bunsen Tubos de ensaye de 13X100 Portaobjetos REACTIVOS: Plasma humano citratado o de conejo Solucin salina estril Desinfectante MATERIAL BIOLGICO: Cepas: Staphylococcus aureus y S. epidermidis. 1.Preparar una

TCNICAS: EN PORTAOBJETOS.

suspensin gruesa de cada uno de los microorganismos en solucin salina. 2.- En un portaobjetos mezclar una gota de la suspensin y una gota del plasma, homogenizar. 3.- Esperar de 5 a 20 segundos. INTERPRETACIN: La prueba es positiva si hay coagulacin o formacin de precipitado en la mezcla. Si no se observa coagulacin la prueba es negativa. TCNICA EN TUBO:

1.- En un tubo de 13 por 100 se colocan 0.5 ml del plasma y se aade una asada de la colonia en estudio. 2.- Incubar a 35C de 6 a 24 horas. 3.- Con cuidado incline el tubo para observar. INTERPRETACIN: Si se observan cogulos o fibrinas o formacin de un cogulo completo, la prueba es positiva. Si los cogulos no son totales se pueden dejar incubar por 24 horas. En caso de no haber ninguna formacin el resultado es negativo. IV) -LACTAMASA Es una enzima extracelular producida por muchas cepas bacterianas, que hidroliza especficamente la unin amida del lactmico de anlogos de la penicilina, inactivando al antibitico. Se forma el cido peniciloico. Mtodo iodometrico Se puede impregnar tiras de papel filtro con una mezcla igual de solucin de almidn al 1% y solucin de penicilina G, y secarlas al aire para uso futuro. Al realizar la prueba , colocar una gota de iodo en la tira reactiva; inmediatamente aparece un color azul. Usando un asa de inoculacin, extender una porcin de colonia del organismo en estudio en el rea del reactivo iodado . La desaparicin del color azul al cabo de 3 a 5 minutos indica la produccin de -lactamasa y una prueba positiva. Mtodo iodometrico: EN TUBO

1. Preparar una suspensin del desarrollo bacteriano en la mezcla de penicilina buffer, 0.5 ml. 2. Incubar 1 hora a Temp. Ambiente, 3. Despus de incubar aadir dos gotas de almidn indicador y mezclar. 4. Aadir una gota de solucin yodo y mezclar 5. Interpretacin:

La rpida aparicin un color azul se debe a la reaccin del Iodo con el almidn. Rotar la mezcla durante 1 minuto. La persistenciaPositiva del color azul durante 10 minutos constituye una prueba negativapara S. ( no hay produccin de Beta lactamasa). Una rpida decoloracin Aureus del medio indica, que se ha formado acido peniciloico y que prueba positiva (produccin de -lactamasa

Observaciones:

II.-RESULTADOS: CATALASA: en portaobjetos

INTERPRETACIN : Resultado positivo: Produccin de efervescencia. Resultado negativo: No hay reaccin. Negativo en E.Coli Positivo en S. Aureus COAGULASA: INTERPRETACIN: Si se observan cogulos o fibrinas o formacin de un cogulo completo, la prueba es positiva. Si los cogulos no son totales se pueden dejar incubar por 24 horas. En caso de no haber ninguna formacin el resultado es negativo. Positivo para S. Aureus

-LACTAMASA INTERPRETACIN: La desaparicin del color azul al cabo de 3 a 5 minutos indica la produccin de -lactamasa y una prueba positiva.

ACTIVIDADES: I.- Contestar las siguientes preguntas. 1.- Para qu se utilizan las reacciones enzimticas en la microbiologa? Para la identificacin de bacterias que presentan la enzima determinada del medio utilizado 2.- Dar 5 ejemplos de Bacterias oxidasa positivo. Neisseria, Vibrio, Pseudomonas, Plesiomonas Shigelloides Burkholderia y

3.- Dar ejemplos de bacterias catalasa positiva. S. aureus, Stomatococcus, S. Epidermidis, S. Hominis y Micrococus 4.- Qu es la coagulasa, en que casos se utiliza? La coagulasa es una enzima extracelular producida principalmente por la especie Staphylococcus aureus. Esta enzima reacciona coagulando el plasma por conversin del fibringeno en fibrina. Principalmente se ha utilizado en la diferenciacin de Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) y Staphylococcus epidermidis (coagulasa negativo). III.- CONCLUSIN.Las reacciones enzimticas al igual que las pruebas bioqumicas nos ayudan a poder identificar bacterias dependiendo del tipo de reaccin que tengan al hacer contacto con el medio, entre estas pruebas se encuentran la catalasa, coagulasa y oxidasa, las cuales son de las ms populares para la identificacin de bacterias BIBLIOGRAFA: http: www.imb.usal.es

DETER MINACI N DEL TIEMPO DE GENER ACIN BACTER IANO POR TURBIM ETRIA OBJETIV O Aprende r cmo se determi na el tiempo de generaci n de un cultivo bacteria no por medio por medio del mtodo turbidim etrico. GENER ALIDAD ES Todas las bacteria s cuando se inoculan en un medio de cultivo Practica No. 14 fresco experim CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LOS MICROORGANISMOS entan

una fase de adaptacin conocida como fase lag, despus de la cual van a empezar a dividirse rpidamente hasta alcanzar un mximo de velocidad de crecimiento de la poblacin bacteriana conocido como fase exponencial o logartmica durante la cual se puede determinar el tiempo de generacin. Este tiempo de generacin puede definirse como el tiempo transcurrido entre una divisin celular y otra. Posteriormente la velocidad de crecimiento disminuye hasta que prcticamente no tenemos aumento de la poblacin en la fase conocida como fase estacionaria, que precede a la fase de muerte en la cual la poblacin bacteriana viable disminuye en forma logartmica nuevamente.

Curva de crecimiento microbiano donde: a.- fase lag b.- fase exponencial o Log c.- fase estacionaria d.- fase de muerte Para poder determinar el tiempo de generacin en primer lugar debemos iniciar un cultivo de microorganismo en cuestin y mediante lecturas de absorbancia a diferentes tiempos y una curva de calibracin que proporcionara el maestro encontrar la fase exponencial del crecimiento.

TECNICA

TCNICA 1.Inocular

un matraz con la cepa problema hasta lograr una concentracin en primer lugar equivalente a el tubo numero 2 de la escala de Mac Farland, homogenizar perfectamente. 2.-Tomar una alcuota de 4 ml y leer la absorbancia a 500 nm utilizado un tubo de caldo sin inocular como blanco, esta ser una concentracin en tiempo cero. 3.-Inocular a 37C en un bao mara con agitacin constante. 4.-Tomar una alcuota de 4 ml cada 15 minutos y efectuar al lectura de la absorbancia a 500 nm utilizando un tubo de caldo sin inocular como blanco, hasta 120 minutos CLCULOS: 1. - Con los datos de absorbancia y concentracin bacteriana que corresponden a un bacilo Gran negativo elabore una curva de calibracin. Absorbanc ia 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.22 0.3 0.4 0.54 0.61 0.69 0.8 0.92 Bacteri as /mlx108 0.14 0.43 0.72 1.01 1.3 1.58 5.06 7.38 10.29 14.35 16.38 18.7 21.9 25.3

2.Interpole los resultad os de sus lecturas

para conocer tiempos.

el nmero de bacterias por ml a los diferentes

3.-Grafique el logaritmo de la concertacin bacteriana contra el tiempo para elaborar una curva de crecimiento. RESULTADOS: Bacteria: Escherichia coli Tiempo 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Absorbancia 0.05 0.07 0.10 0.20 0.40 0.61 0.65 0.40 0.10 Bacterias/mlx108 0 0.72 1.58 4.98 10.00 16.38 17.00 10.29 1.58

4. En la curva de crecimiento localice la exponencial y seleccione dos puntos separados en la parte ms recta. El primero de estos datos ser la concentracin de su tiempo inicial (a) y el segundo la concentracin de su tiempo final (b). 5. Con la siguiente formula y los datos que este punto tiene calcule el tiempo de generacin (G). G=
(log 2)( t ) Logb Loga

En donde: G = Tiempo de generacin t = Tiempo a = cuenta inicial por ml b = cuenta final por ml

t= 20 min. a= 1.58 bact/ml x 108 b= 9.50

CLCULOS (Log 2)(20 min)

G=

---------------------------Log (b) 9.50- Log (a) 1.58 Tiempo de

generacin= 5.547572

GRFICA

CONCLUSIN Para medir el crecimiento microbiano en un medio de cultivo, se utilizan parmetros que establecen diferentes fases durante la evolucin. En la primer fase las bacterias se adaptan al nuevo medio que les ha sido otorgado para iniciar su crecimiento, en la segunda fase, las bacterias crecen de manera exponencial, aqu es donde se presenta el mximo desarrollo y las bacterias consumen y aprovechan todos los nutrientes del medio, en la tercera fase no se presenta ms crecimiento, esta es un etapa estacionaria donde las bacterias muestran su verdadero metabolismo y donde se puede definir de manera concreta como de desarrollan metablicamente en un ambiente real o natural. La ltima fase, es la fase de muerte, donde hay un decremento de las bacterias en el cultivo. Todas estas fases pudieron comprobarse a travs de la grfica diseada con los clculos previos. Entender el crecimiento microbiano es importante para reducir o potenciar los efectos de un microorganismo

Practica No. 16 USO Y ACCIN DE LOS DESINFECTANTES OBJETIVO: Probar algunos desinfectantes comerciales y conocer la accin de estos sobre los microorganismos. FUNDAMENTO: Los desinfectantes son agentes qumicos que se utilizan con la finalidad de destruir los microorganismos o reducir su cantidad, generalmente se emplean en los objetos inanimados. Algunos son bactericidas cuando destruyen a los microorganismos y bacteriostticos cuando inhiben el crecimiento. GENERALIDADES: La accin de este tipo de sustancias se considera inespecfica o de tipo general. Actan daando la membrana celular, inactivando las protenas o daando los cidos nucleicos. La eficiencia de estos agentes depende de diversas variables, como el tiempo de contacto, temperatura, concentracin, cantidad y naturaleza de los microorganismos presentes y tipo de material por desinfectar. Algunos principales agentes antimicrobianos son: a) COMPUESTOS FENOLICOS: Son bactericidas o bacteriostticos dependiendo de la concentracin en la que se usen, actan daando la membrana celular con prdida de los componentes celulares. Es muy eficaz para matar todas las clulas vegetativas aunque no lo es tanto con las esporas o los virus carentes de membrana. En la actualidad el fenol es muy poco usado debido a sus propiedades txicas; aunque existen derivados fenlicos con mayor actividad antimicrobiana sin ser txicos. b) DESINFECTANTES TENSOACTIVOS: Los depresores de la tensin superficial o agentes humectantes empleados principalmente para la limpieza de superficies se llaman detergentes. Muchos jabones y detergentes son bactericidas pero para el lavado de la piel la destruccin de los microorganismos no es muy significativa ya que el tiempo de accin es muy corto. Se han desarrollado muchos agentes limpiadores ms eficaces que el jabn, como los surfactantes o detergentes

sintticos, pues no forman precipitados con las aguas alcalinas o cidas, ni producen depsitos con los minerales de las aguas duras. Qumicamente los detergentes se clasifican en: 1.- Detergentes aninicos.- Son los que poseen una carga negativa en su molcula, presentan una rpida actividad bactericida en especial a pH bajo y son eficaces contra la mayor parte de las bacterias Gramnegativas. 2.- Detergentes catinicos.- La capacidad de desintegrar la membrana celular de estos compuestos aumenta probablemente por la atraccin entre la carga positiva de la molcula del detergente y la carga negativa de la membrana citoplasmtica, su eficacia aumenta en un pH alcalino. Estas sustancias actan ms contra bacterias Grampositivas. 3.- Detergentes no inicos.- No son muy tiles como desinfectantes pero algunos detergentes inicos bipolares pueden ser tan eficaces y menos txicos que los detergentes catinicos. Se sabe que los detergentes catinicos son ms germicidas que los compuestos aninicos. Entre los agentes bactericidades tensoactivos, los detergentes de amonio cuaternario son los ms importantes. ALCOHOLES: Los alcoholes son sustancias que se utilizan tambin como desinfectantes ya que se desintegran las membranas celulares. El etanol es muy utilizado a una concentracin del 70% y destruye todas las clulas vegetativas, siempre que el tiempo de contacto sea suficiente. Los alcoholes desnaturalizan las protenas y esta propiedad puede contar para su actividad antimicrobiana, aunque no son muy tiles para inactivar las esporas y no son confiables para una buena esterilizacin. El alcohol isoproplico y benzlico tienen mayor poder germicida pero son ms txicos para el ser humano que el etanol. HALGENOS: Algunos halgenos son utilizados como agentes desinfectantes, tal es el caso de el Yodo y el cloro. Ambos son bactericidas y actan probablemente como oxidantes. El yodo se oxida formando especies reactivas que reaccionan a la vez con las tirosinas y otros aminocidos en las protenas. Su utilizacin es principalmente en la medicina como desinfectante de la piel y en heridas. El cloro y sus derivados como es el hipoclorito y las cloraminas reaccionan con el agua y forman cido hipocloroso que es un agente oxidante fuerte y desinfectante eficaz. Se ha utilizado como bactericida en el agua y para la limpieza de objetos.

PEROXIDO DE HIDROGENO: Es un antisptico dbil no txico, cuando se utiliza al 3%. Acta como agente oxidante, pero su duracin en los tejidos es reducido ya que la enzima catalasa lo convierte en oxgeno y agua. COLORANTES: El trifenilmetano y algunos derivados de la acridina son compuestos colorantes que utilizados a concentraciones sirven como antimicrobianos, ya que pueden inhibir la sntesis de la pared celular como es el caso del trifenilmetano o insertarse en las bases de los cidos nucleicos como es el caso de la acridina. OXIDO DE ETILENO: Este compuesto es utilizado en fase gaseosa, es muy eficaz en la destruccin de todas las clulas vegetativas, esporas y virus. Posee un anillo de xido muy reactivo que se abre en presencia de grupos amino, carboxilo, sulfhdrico o hidroxilo de las protenas, a las que se une por enlace covalente, tambin reacciona con los cidos nucleicos y es mutagnico a dosis letales.

MATERIAL Y EQUIPO

Asa de inoculacin Mechero Bunsen Discos de papel filtro estriles

2 tubos con agar soya tripticasa (15-20 ml) 2 cajas Petri estriles 6 antispticos comerciales

MATERIAL BIOLGICO: Escherichia coli Pseudomona aeruginosa S. aureus

METODOLOGA: 1.- Derretir y enfriar el agar nutritivo a una temperatura de 45 50C. 2.- Inocular un tubo con dos asas llenas de Spseudomona aeruginosa y el otro tubo con la misma cantidad de Escherichia coli., verter inmediatamente a las cajas Petri evitando que se formen grumos o que se solidifique antes de verter.

3.- Dejar solidificar en una superficie plana, marcar cada caja con el nombre correspondiente de cada bacteria. 4.- De la manera ms asptica impregnar un disco con uno de los antispticos (no demasiado para no estropear el experimento) y colocarlo con cuidado en el medio. Repetir la operacin con los antispticos restantes, y con la siguiente caja, colocar las cajas ya tapadas boca arriba y dejar reposar 5 minutos. 6.- Inocular las cajas a 37C por 24 horas. Al acabo de este tiempo se debern observar zonas de inhibicin transparentes alrededor de los discos si el desinfectante actu en el microorganismo. ACTIVIDADES: I.- Contestar el siguiente cuestionario: 1.- Cules son las principales condiciones que influyen en la actividad de los desinfectantes? Tiempo de contacto, temperatura, concentracin, cantidad y naturaleza de los microorganismos presentes y tipo de material por desinfectar 2.Cmo actan los desinfectantes en los microorganismos para su inhibicin o destruccin? Actan daando la membrana celular, inactivando las protenas o daando los cidos nuclecos 3.- Qu es detergente? Son agentes qumicos que se utilizan con la finalidad de destruir los microorganismos o reducir su cantidad, generalmente se emplean en los objetos inanimados. 4.- Cmo se clasifican los detergentes? Detergentes no inicos, Detergentes catinicos, Detergentes aninicos 5.- En qu casos es recomendable el xido de etileno como desinfectante? la destruccin de todas las clulas vegetativas, esporas y virus II.-RESULTADOS DE LAS MEDICIONES DE LOS HALOS DE INHIBICIN

RESISTENT

Desinfectante
Cepa GLAIZOL CLORO AJAX PERXIDO H202 MERTIOLATE BENZAL

Escherichia

1.4 cm 0.0 cm

1.8 cm 0.0 cm

0.0 cm 0.0

cm se 1.3 cm Resistente pierde el halo

0.0cm
conbino halo inivicion

se el de

Stafilococcus Aureus

0.9 cm

0.0 cm

0.0

2.2 cm

CUESTIONARIO 1. Defina los siguientes trminos, esterilizacin, esterilizante, desinfeccin, desinfectante, saneamiento, antisepsia, antisptico, germicida, bactericida, bacteriosttico. Esterilizacin.- proceso por el que todas las clulas vivas, esporas viables , virus y viroides son destruidos o eliminados de un objetivo o habitad Desinfeccin.- consiste en la destruccin, inhibicin o eliminacin de microorganismos que pueden causar enfermedades Desinfectantes.- agentes normalmente qumicos, empleados para desinfectar y se emplean normalmente en objetos inanimados. Saneamiento.- relacin prxima con la desinfeccin y es cuando la poblacin microbiana se reduce a niveles que se consideran seguros y normales para la salud pblica. Antisepsia.- es la prevencin de una infeccin o sepsis Antispticos.- agentes qumicos que se aplican sobre tejidos para prevenir una infeccin, destruyendo o inhibiendo el crecimiento de agentes patgenos Germicidas.- destruyen agentes patgenos y muchos no patgenos , pero no necesariamente endo-esporas Bactericida.- un desinfectante o antisptico que puede ser particularmente eficaz contra un grupo especifico. Bacteriosttico.sustancia qumica que no destruyen, si no previenen el crecimiento. 2. Describa el modelo de muerte microbiana y como se sabe si los microorganismos estn realmente muertos. La muerte de una poblacin, al igual que su crecimiento, es generalmente es exponencial o logartmica, es decir, la poblacin se reduce en niveles iguales a intervalos constantes, cuando la poblacin se ha reducido notablemente, la velocidad de destruccin puede disminuir debido a la supervivencia de alguna variantes ms resistentes de los microorganismos expuesto. Se considera que una bacteria se encuentra muerta cuando no presenta crecimiento ni multiplicacin cuando se inocula en un medio de cultivo ; un virus

est inactivo cuando no es capaz de multiplicarse en husped apropiado. 3. Explique brevemente como varia la eficacia de los agentes antimicrobianos respecto a las diferentes situaciones. TAMAO DE LA POBLACION.- En cada intervalo de tiempo se destruye una fraccin igual de la poblacin microbiana COMPOSICION DE LA POBLACION. La eficacia varia con la naturaleza de los microorganismos que se van a tratar por que difieren en cuanto a su susceptibilidad. CONCENTRACION O INTENCIDAD DE UN AGENTEMICROBIANO A menudo, cuando ms concentrado este un agente qumico o ms intenso se est ms rpidamente se destruyen los microorganismos. DURACION DE LAEXPOSICION Cuando ms tiempo se exponga una poblacin aun gente microbicida, ms organismos sern los destruidos TEMPERATURAS. La actividad de los agentes qumicos aumenta con forme la temperaturas son ms elevadas AMBIENTE LOCAL La poblacin microbiana que debe ser controlada no est aislada, sino el contexto de una serie de factores ambientales que pueden ofrecerles 4. Definir punto de muerte trmica, tiempo de muerte trmica, tiempo de reduccin decimal, valor Z y F PMT.- es la temperatura ms baja a la cual una suspensin microbiana se destruye en 10 minutos

TIEMPO DE REDUCCION DECIMAL.- es el tiempo necesario para destruir el 90% de los microorganismos o esporas en una muestra, a una temperatura especifica. TMT.- es el tiempo ms corto necesario para destruir todos los microorganismos de una suspensin microbiana a una temperatura especifica y condiciones definidas VALOR Z.- es el aumento de temperatura necesario para reducir D a 1/ 10 de su valor o en un logaritmo VALOR F.es el tiempo,en minutos y a una temperatura determinada para destruir una poblacin de clulas o esporas

5. Defina el funcionamiento de la autoclave Qu condiciones requieren para esterilizar con calor hmedo y cules son las 3 fases cuando se trabaja con autoclave, con el fin de garantizar un resultado positivo? Se pone a hervir agua para producir vapor, que pasa a travs de una cubierta interior de la cmara del autoclave, el cual desplazando el aire que antes estaba en la cmara , para llenar esta con vapores saturados y se cierran las salida, se deja por 10-12 min cuando alcanza una temperatura de 121C y 6.8Kg de presin, una vez alcanzado, se deja durante 15 min mas en esas condiciones a fin de eliminar toda presencia de microorganismos. 6. Como se realiza la pasteurizacin, pasteurizacin rpida, esterilizacin con temperaturas ultraelevadas y esterilizacin por calor seco. PASTEURIZACION.- este mtodo no esteriliza una bebida, pero destruye cualquier agente patgeno que contenga y disminuye en gran medida la putrefaccin PASTEURIZACION RAPIDA.- consiste en calentar a 72 C durante 15 min ESTERILIZACION ULTRA-ELEVADAS.- se calienta la muestra entre 140-150C durante 1-3 segundos, y se puede almacenar casi durante 2 das sin que se produzca cambios en el sabor ESTERILIZACION CALOR SECO.los objetos se calientan en una estufa a una temperatura de 160170C durante 2-3hrs, los microorganismos se mueren debido a la oxidacin de los constituyentes celulares y desnaturalizacin de protenas 7.-De qu manera se puede emplear las bajas temperaturas para el control microbiano? Para provocar la inhibicin de la multiplicacin de los microorganismos mediante el empleo de la refrigeracin o congelacin., ya que estos no crecen debido a la falta de agua lquida libre

7. Qu son los filtros de profundidad, de membrana, y como se emplean para la esterilizacin de lquidos?

Describa el funcionamiento de una cabina de seguridad biolgica. F. PROFUNDIDAD.- consisten de materiales fibrosos o granulados con una capa gruesa rellena de canales retorcidos de dimetros pequeos. F.MEMBRANA.- son filtros circulares membranosos ( porosos) con un grosor aproximado de 0.1 mm de acetato de celulosa, nitrato de celulosa, policarbonatos, fluoruro de polivinilo y otros materiales sintticos Los filtros eliminan a los microorganismos cribndolos, igual que un tamiz, separa partculas de arena grandes de pequeas. Se utiliza en la industria farmacutica. Las cabinas de seguridad son un sistema de filtracin de aire mas importantes capaces de eliminar el 99.7% de partculas de 0.3 um, utilizan filtros HEPA, provocado una cortina vertical de aire estril en el frontal de la cabina. 8. Exponga las ventajas e inconvenientes de la luz ultravioleta y de la radiacin ionizante como agentes esterilizante. La radiacin ultravioleta es bastante letal aunque no atraviesa eficazmente el cristal, las pelculas de suciedad, el agua y otras sustancias, en cambio la radiacin ionizante es una agente de esterilizacin excelente y penetra en los objetos, suele destruir endo-esporas, bacterias y clulas vegetativas. 9. Describa cada uno de los agentes, fenol, alcoholes, halgenos (I, CL), metales pesados, compuestos de amonio cuaternarios, aldehdos y ox. De etileno. FENOL.- Es un antisptico y desinfectante, se utiliza en el rea medica para reducir el ndice infeccioso en operaciones, acta desnaturalizando protenas y alterando las membranas celulares. Sus ventajas es que permaneces activos sobre superficies orgnicas pero logra provocar irritacin cutnea. ALCOHOLES.- Es un desinfectante y antisptico, mayormente utilizado como bactericidas y fungicidas, suelen destruir algunos virus; actan desnaturalizando protenas y disolviendo los lpidos de la membrana. Requiere un proceso de 10-15 min de inmersin. HALOGENOS.- El yodo y el cloro son los agentes microbianos mas importantes de este gnero; el primero utilizado como antisptico cutneo destruyendo a los microorganismos oxidando a uno de los componentes y formando compuestos con las

protenas, el mayor utilizado es la solucin al 2%. El cloro es el desinfectante habitual por medio de la oxidacin de materiales celulares y destruccin de bacterias vegetativas. METALES PESADOS.- Se emplean como germicidas aunque la mayora de los metales son bactericidas, los mas utilizados con el nitrato de plata, sulfato de cobre. COMPUESTOS DE AMONO CUATERNARIOS.- En esta seccin se encuentras los detergentes los cuales son molculas orgnicas que actan como agentes humectantes y emulsiones, se les considera como agentes limpiadores muy eficaces. Actan alterando las membranas microbianas y pueden desnaturalizar protenas. ALDEHIDOS.- Son molculas muy reactivas que se combinan con cidos nucledos y protenas inactivndolos formando puentes cruzados OXIDO DE ETILENO.- Es un gas microbicida y esporicida, destruye los microorganismos al combinarse con protenas celulares.se utiliza principalmente en la autoclave. 10. Por qu es necesario utilizar tcnicas como la dilucin de uso y pruebas de uso real? Para estimar con mayor precisin la eficacia de un desinfectante 11. Describa brevemente la prueba de coeficiente fenolico. En esta prueba se preparan unas dilucin de fenol y del desinfectante experimental y se inocula con las bacterias, luego se mantienen en un bao a una temperatura entre 20-37C, posteriormente en intervalos de 5min se toman un muestreo de los tubos que se cultivan en medios fresco. DISCUSIN DE LOS RESULTADOS En las diferentes cepas de bacterias, se observo que la E. COLI es resistente al ajax, y que el Benzal junto con el perxido son unos muy buenos desinfectantes ya que sus halos de inhibicin se combinaron debido a su alta efectividad sobre el microorganismos. Por otro lado en la cepa de S. AUREUS, la accin de desinfeccin mostro que el mejor agente es el Benzal y que la bacteria presenta resistencia al glaizol, as como los multidiscos del cloro, perxido y Mertiolate se movieron a causa de estar muy empapados de desinfectantes que no permiti una buena adherencia al medio.

CONCLUSIN: La accin de los desinfectantes sobre los diferentes microorganismos dependen de condiciones idneas, as como los microorganismos pueden presentar resistencia a ellos gracias a que su membrana celular no es inactivada provocando que no puedan actuar sobre su material gentico. BIBLIOGRAFA: Introduccin a la microbiologa Ingraham John, Ingraham Catherine. Reverte, 1998