Universidad Tecnológica de Chile

Ingeniería en Biotecnología j Laboratorio de Biotecnología Vegetal

Cultivo in vitro para la obtención de Callogénesis a partir de explantes de lechuga.

Nombre de Alumno: Miguel Muñoz F. Nombre Profesor: Hilda Moreno Fecha: 16 de Noviembre de 2011

Introducción Todo material vegetal que se desee trabajar bajo el concepto in vitro del cultivo de tejidos vegetales. es la composición del medio de cultivo. Para realizar este práctico y se ajustó un protocolo para que sea efectivo en las condiciones del laboratorio. además que de esta manera no se desperdiciará valioso tiempo de laboratorio y se evitará la repetición de experimentos. etc) (1). utilizando soluciones hormonales que promovieron la obtención de Callogénesis. El medio de cultivo está formado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta. El medio utilizado fue líquido y los explantes obtenidos fueron observados en cultivo en suspensión. gelrite. a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algún agente gelificante inerte (agar. en raíz se puede obtener con éxito la formación de callos en distintas zonas de la raíz. ya que éstos pueden impedir el desarrollo del explante o de procesos morfogenéticos que se pretenden obtener.5 mgL-1). sin descuidar la calidad y el tiempo necesario para el desarrollo del práctico. evitando así la repetición de experimentos. una planta completa o un órgano vegetal en particular. debe estar libre de microorganismos. vitaminas). . que ayudarán a obtener un callo. nutrientes (hidratos de carbono. Los resultados obtenidos indican que utilizando una solución hormonal de ANA (0. agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales. (1) Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica deseada en un cultivo de tejido in vitro.

solución hormonal ácido naftalen-acético (ANA) 0. Equipos Cámara de flujo laminar. Reactivos y otros. etanol al 70%.5mgL-1.Objetivos Ejecutar un protocolo aséptico que permita establecer semillas de lechuga en condiciones in vitro para su establecimiento y/o germinación. 1 cinta adhesiva. Semillas de lechuga obtenidas de un supermercado. cámara de cultivo. pinzas. Autoclave. hipoclorito de sodio (comercial). 1 piceta de 250 mL. Rollo de papel de aluminio. 2 placas de petri esterilizadas. parafilm. Obtención de Callogénesis a partir de explantes de lechuga. papel filtro. Familiarizarse con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro. Material Biológico. Material de laboratorio 1 vaso de precipitado de 250 mL. . 1 vaso de precipitados de 50 mL. agua destilada. 3 tubos de ensayo. Medio MS.

sumergir las semillas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos (exactos). el tiempo utilizado y los pasos a seguir. no fue necesario utilizar el extrán o detergente comercial. sostener las semillas con pinzas de ser necesario. en cada enjuague utilizar aproximadamente 30mL de agua destilada. El pH deberá ajustarse con NaOH 1. . 7) Lavar las semillas con agua destilada. para la mayoría de los casos fueron los siguientes: Agente Desinfectante Tiempo total Extrán (o detergente comercial) al 2%* 30 – 40 minutos (una sola vez) Etanol al 70% 30 segundos (una sola vez) Hipoclorito de Sodio al 1% 10 minutos (una sola vez) Agua destilada 8 minutos (un minuto por enjuague) *Debido a que las semillas fueron compradas y no sacadas de la tierra. 3) Eliminar la solución en otro vaso de precipitado de 250mL (vaso de desechos). Pasos a seguir: 1) En la cámara de flujo laminar. 6) Sumergir las semillas en una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 10 minutos. vertiendo suavemente la solución procurando que las semillas sigan en el vaso de 50mL. 2) En el vaso estéril.Preparación del medio de cultivo: Según el número de semillas a utilizar. cinco veces para eliminar restos del hipoclorito de sodio y eliminar el agua siguiendo el paso 3. 4) Enjuagar 3 veces con agua destilada para eliminar el etanol. en donde posteriormente se le añadirán los agentes desinfectantes. para semillas en general y semillas de lechuga se llegó a la conclusión de que los agentes desinfectantes. preparar medio de cultivo MS. Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para hacer 2 variables (ver anexo). utilizar pinza estéril para poner las semillas en un vaso de precipitados de 50mL. Desinfección de semillas: Luego de revisar diversos protocolos de desinfección.0 N antes de adicionar a los medios (Medio Knop a pH de 5. 5) Eliminar el enjuagado en el vaso de desechos como en el paso 3.5 y Medio MS a pH 6).

luego de eso fueron puesta a fotoperíodo natural. 2) Verificar día a día que exista la cantidad suficiente de agua dentro de las petri. . 4) Las placas una vez sacadas de la oscuridad. Los tubos ya contenían un volumen de 10mL del medio MS. 3 raíces. filtrada con jeringa y microfiltro. 12) Sellar correctamente la placa de petri. Las placas de petri que estén contaminadas con semillas. utilizar pinzas esterilizadas para hacerlo. 1) Abrir la placa de petri que contiene las semillas germinadas. procurando no contaminar la placa. los explantes serán cultivados en suspensión para la posterior obtención de callogénesis. retirando lentamente la cinta adhesiva. todo esto realizarlo en cámara de flujo laminar. deberán esterilizarse a la brevedad. procurando que no les falte agua y que no queden flotando. 13) Colocar las petri con las semillas en un cuarto de cultivo en la oscuridad a una temperatura de incubación de entre 30 y 35°C 14) Observar cada semana las semillas. humedecer hasta que estén superficialmente húmedas. exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la plántula alcance una altura aproximada de 1-3 cm. 3) La temperatura en la cámara de cultivo estaba entre los 30 y 35°C.Cultivo de las semillas: 8) Poner un papel filtro dentro de la placa de petri. utilizando parafilm o cinta adhesiva. de tipo fluorescentes de 25W/TB. En la cámara de flujo laminar. 3 tallos y tres hojas 3) Dejar los explantos en la tapa de la placa de petri para luego retirar con pinza. 15) A la aparición del coleóptilo. Observaciones: 1) Las semillas incubadas en placas de petri fueron puestas en completa oscuridad aproximadamente 5 días. procurando que queden separadas.5mgL-1. proceder cuidadosamente a añadir agua. 11) Añadir agua destilada a las semillas en las placas. estuvieron en un fotoperíodo de 24 horas continuas de luz clara. 2) Extraer cuidadosamente con la ayuda de un bisturí. se encontraban aproximadamente a unos 20 cm de las placas. 9) Del vaso de precipitado y con la ayuda de una pinza estéril. 10) Colocar de 10 a 15 semillas en cada petri. Debido a esto. el medio utilizado para el cultivo en suspensión fue MS líquido y no sólido como se había pensado. en caso de no ser así. Extracción y siembra de explantes: Por error. Separar aquellas contaminadas y anotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. 5) Los tubos en la cámara de cultivo eran dos. tomar una a una las semillas y colocarlas en las placas de petri. se agregó 85 μL de ANA de 0. antes de agregar a los tres tubos de ensayo.

Se logró obtener callos en el tubo que contenía los explantes de raíz. posteriormente a eso apareció contaminación en sólo una de las placas de petri. comenzaron a crecer y a colorarse con tonos verdes. y con el mismo tipo de explante. Cada tubo con la misma concentración hormonal. apreciándose un pardeamiento en dos de las 3 raíces observadas. sacar los explantos de la tapa de la placa de petri y dejar los explantes en los tubos. Figura 1: Tubos con explantes de tallos. Resultados y discusión: La desinfección de las semillas fue exitosa hasta la extracción de explantes para la obtención de callogénesis. en la izquierda se puede observar el pardeamiento en 3 zonas de la raíz.4) Con la ayuda de una pinza estéril. El largo tiempo de exposición en la oscuridad de las placas petri. Aún así las plantas al ser puestas en la luz. 5) Sellar los tubos con parafilm o cinta adhesiva. tenían un menor tamaño comparadas con las semillas que crecieron en fotoperíodo de luz continua. . tuvo como consecuencia de que las semillas y plantas que crecieron en estas. - - Fig. mientras que en la raíz de la derecha sólo se pudo observar en dos zonas. como se puede observar en la figura 1. 1) Posible formación de callos en los explantes de raíz observados con lupa. hoja y raíz respectivamente. 6) Dejar los tubos en la cámara de cultivo para la posterior obtención de callogénesis.

Los resultados obtenidos indican que utilizando una solución hormonal de ANA (0. ya que en ninguno de los casos se pudo apreciar pardeamiento o formación de callos.Conclusión La desinfección de semillas siguiendo el protocolo establecido fue exitosa hasta la tercera semana. en donde comenzó a aparecer contaminación fúngica. en raíz se puede obtener con éxito la formación de callos en distintas zonas de la raíz. lo que indica que la desinfección fue exitosa en al menos una de las placas. Se debe cambiar la solución hormonal para obtener callogénesis en hoja y tallo. .5 mgL-1). y el material utilizado para la posterior obtención de callogénesis no presentó contaminación.

Fuente: Instituto Politécnico Nacional. . Laboratorio de Cultivo de Tejidos (2). Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología.

. Fuente: Instituto Politécnico Nacional.Anexo II. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología. Laboratorio de Cultivo de Tejidos (2).

actiweb.pdf . Unidad Profesional Interdisciplinaria Biotecnología.biblioteca.mx/Archivos/Material%20Didactico/Manual%20del%20La boratorio%20de%20Cultivo%20de%20Tejidos%20.Bibliografía 1) Protocolo de desinfección y establecimiento in vitro de explantes y semillas de mono y dicotiledóneas.pdf 2) Instituto Politécnico Nacional.es/modbioveg/archivo2.upibi. de http://www. http://www.ipn. Laboratorio de Cultivo de Tejidos.

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