Universidad de La Frontera

Transformacin de clulas

Alumnos: Pedro G. Acua Quijada David A. Alarcn Campos Fernando A. Lpez Alarcn Javier A. Retamal Fontanaz Catalina R. Vidal Prez

Profesor gua: Javier Ro A.

Temuco- chile 2010

Marco Terico
La transformacin consiste en que las clulas capturan DNA libre presente en su entorno. Es un fenmeno que ocurre de forma normal en muchas bacterias, pero este proceso vara entre una especia u otras. Para que la transformacin se lleve a cabo la bacteria debe encontrarse en un estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula. Por consiguiente, una clula competente es la cual podemos transformar genticamente. Existen algunos tipos de bacterias que son competentes naturales (por ejemplo, el neumococo) y que, por tanto, siempre pueden captar DNA del medio externo; mientras que otras pueden ser competentes inducidas cuando se les somete a un tratamiento que les confiere esta capacidad. Con la prctica se ha podido mejorar estas tcnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas tcnicas se basan en diferentes tratamientos qumicos o fsicos que producen microporos en la clula, lo que permite el ingreso del DNA exgeno (transformacin) de modo bastante eficiente. Uno de estos mtodos fsicos es la electroporacin, que consistente en provocar la competencia mediante la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso. Tambin dicha competencia se puede inducir a travs de tratamientos qumicos utilizando compuestos tales como el cloruro de calcio. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes. Una vez introducido el DNA en la clula competente, este material puede ser eliminado por la clula receptora a travs de sus mecanismos de restriccin consistentes en endonucleasas que degradan el DNA extrao en sitios donde se encuentra una secuencia determinada. (endonucleasas de restriccin). Estas enzimas constituyen, por tanto, un sistema por el que las clulas bacterianas son capaces de eliminar el material gentico extrao que entra en su interior. Para evitar que las endonucleasas de restriccin degraden el material gentico propio, existe otro sistema enzimtico denominado de enzimas de modificacin que colocan grupos metilo (-CH3) en las secuencias del ADN que reconocen las enzimas de restriccin correspondientes y, de esta forma, evitan que la secuencia modificada sea degradada por ellas. Al conjunto de los dos sistemas se les conoce como sistema de modificacin /restriccin de la clula

Si una molcula de DNA que ha ingresado en una bacteria por el mtodo de transformacin no ha sido degradada por el sistema de modificacin/restriccin, puede replicarse autnomamente si posee un origen de replicacin, tambin puede integrarse por recombinacin en alguno de los elementos genticos de la bacteria o perderse al dividirse la clula. En cualquiera de estos dos primeros casos, la nueva informacin gentica podr ser expresada y, si confiere ventajas selectivas a la clula transformada, establecerse en la poblacin. La transformacin es una tcnica rutinaria de gran utilidad, que nos da la ventaja de poder ingresar prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. Se usaron estas clulas competentes obtenidas por tratamiento qumico con cloruro de calcio.

Materiales y mtodos

Para poder lograr la transformacin bacteriana iniciamos el proceso con la etapa de Preparacin de clulas competentes, para la cual procedimos desde el tercer punto del protocolo ya que el paso previo de; plaquear la cepa de bacterias no transformadas en una placa de agar LB sin antibitico e incubar por 12 a 16 horas a 37 C y posteriormente, picar una de las colonias aisladas de la placa e inocularla en un tubo falcn con 5 ml de medio LB sin antibitico e incubar nuevamente por 12 horas a 37C a 220 rpm fue realizado por el profesor gua. La razn de lo antes mencionado es que la preparacin de bacterias requera de mucho tiempo de incubacin y no es un proceso factible de realizar en los prcticos de laboratorio ya que ocuparamos varias clases para la primera etapa de seleccionar una cepa bacteriana. Por esta razn comenzamos el prctico con el cultivo de bacterias ya preparado. 1. El primer paso que realizamos consisti en tomar 300 ul del cultivo de bacterias previamente preparado y lo inoculamos en 900 ul de medio de cultivo LB lquido sin antibitico en un tubo eppendorf de 1,5 ml, con lo que obtuvimos una densidad ptica de 0.4 medido con espectrofotmetro a 590 nm (cabe mencionar que adaptamos los volmenes de bacterias y de agar ya que inicialmente las proporciones eran de 500 ul y 50 ml respectivamente lo que modificamos porque, al medir la densidad ptica de esta muestra nos daba un valor muy bajo de 0.06 tambin hay que decir que el proceso de inoculacin se realizo bajo campana de flujo laminar ya que se estaba trabajando con una cepa de bacterias patgenas.) 2. Posteriormente se cosecharon las bacterias en un pellet tras centrifugacin de la muestra a 4C en centrifuga refrigerada por 10 minutos a 4800 rpm. 3. Botamos el sobrenadante resultante de la centrifugacin y resuspendimos el pellet suavemente sin vortex en un volumen de 240* ul de CaCl2 de concentracin 0,1 M a 4C, con el objetivo de dejar susceptibles las membranas externas de las bacterias gram negativas y as hacer posible la entrada de macromolculas al metabolismo celular de la bacteria. 4. Se incubo la muestra por 10 minutos en hielo y luego se procedi nuevamente a centrifugar por 10 minutos a 4800 rpm en una temperatura de 4C. 5. En este paso posterior a la centrifugacin se boto el sobrenadante y resuspendimos nuevamente el pellet bacteriano esta vez en un volumen de 48** ul de CaCl2, sin vortex.

6. En el ltimo paso de conservacin de las clulas bacterianas mezclamos 25*** ul de clulas resuspendidas con 5**** ul de glicerol en tubos eppendorf de 1,5 ml los cuales estaban previamente enfriados en nitrgeno liquido, luego se le realizo un spin en la centrifuga a los tubos, se rotularon y se introdujeron en nitrgeno liquido para luego almacenar las clulas en el refrigerador de -80C. Todo este proceso se realizo bajo campana de flujo laminar

Obs: Los valores inciales presentes en el protocolo, fueron transformados realizando la equivalencia de volmenes respecto al cambio nombrado en el paso 1. (*): El volumen inicial del protocolo corresponda a 10 ml. (**): El volumen inicial del protocolo corresponda a 2 ml. (***): El volumen inicial del protocolo corresponda a 850 ul. (****): El volumen inicial del protocolo corresponda a 150 ul.

En la segunda etapa correspondiente al prctico nmero dos, se realizo la Ligacin del fragmento previamente amplificado por PCR, al vector de clonacin. 1. En primer lugar se nos entreg dos tubos de PCR en los cual se haba realizado la amplificacin del gen FABP4, relacionado con el nivel de infiltracin grasa en carne de bovinos. 2. Luego se escogi uno de los tubos y de l se extrajeron 5 ul. los cuales se dializaron por 20 min. en una membrana especial con el fin de eliminar el contenido de sales de la muestra. Para realizar la dilisis se deposito una cantidad considerable de ADESI dentro de una placa Petri desechable, luego se puso la membrana y encima de esta se dejaron los 5 ul de producto de PCR.

3. Al paso de los 20 min. se realizo la mezcla de los reactivos para llevar a cabo la reaccin de ligacin. 4. Se dispusieron los siguientes reactivos en un tubo de PCR:

Reactivos Buffer 2x T4 DNA ligasa Vector pGem T easy (50 ng) Producto PCR T4 DNA ligasa (3U) Volumen final

Volumen (ul) 5 1 3 1 10

5. La funcin del buffer 2x T4 DNA ligasa es de dar las condiciones inicas propicias para que la enzima acte de manera ms eficiente, por su parte el vector de clonacin pGem T Easy correspondiente a un plsmido, es el vehculo en el cual insertaremos nuestro DNA amplificado y posteriormente este replicar el gen seleccionado en la bacteria transformada. El producto de la PCR corresponde al gen o secuencia nucleotdica que amplificamos previamente y que ser el DNA forneo que introduciremos en el plsmido. La T4 DNA ligasa es la enzima de restriccin que unir los extremos de ambas secuencias, tanto del DNA forneo amplificado por la PCR como del plsmido el cual ser cortado tambin por esta enzima en el sitio de clonamiento mltiple. 6. Una vez agregados todos los reactivos al tubo y con un volumen final de 10 ul, se mezclaron con la micropipeta los componentes y se procedi a rotular el tubo para incubar la reaccin toda la noche a una temperatura de 4C en refrigerador. Con este proceso obtendremos al siguiente da nuestro DNA amplificado por PCR incluido en el vector de clonacin plasmidial.

En la tercera etapa, correspondiente al practico tres se procedi a la Transformacin de las clulas competentes, para esto se utilizaron las bacterias que en el practico uno haban sido tratadas con CaCl2 y de esta manera adquirieron la propiedad de aceptar la introduccin de pequeas molculas a travs de sus membranas. Tambin se utilizo el plsmido preparado en el prctico nmero dos el cual contena el inserto de DNA de nuestro inters. 1. En primer lugar se tena q dializar la muestra que contena nuestro DNA a introducir en las clulas competentes, pero como este paso se haba realizado en el practico anterior, se omiti. 2. En un tubo se agregaron 50 ul de las clulas competentes preparadas en el primer practico y luego se dispusieron 5 ul de la reaccin preparada en el practico dos la cual contena el vector de clonacin (plsmido) con el DNA inserto, se agito suavemente y se incubo en hielo por algunos minutos.

3. Luego la mezcla anterior se incubo a 42C durante 90 segundos, el cambio de temperaturas es la clave para lograr la introduccin del plsmido en las clulas competentes ya que en este caso es el shock trmico el que posibilita la transformacin celular. 4. A continuacin se volvi a dejar la muestra en hielo, esta vez por un tiempo de 3 minutos y posteriormente se agrego 400 ul de medio de cultivo LB sin antibitico a la muestra, esta muestra ya con el medio de cultivo se incub a 37C durante un tiempo de 45 minutos a 220 rpm en un agitador shaker el cual le entrega las necesidades de temperatura y movimiento a las partculas de la muestra.

Mientras se incubaban las bacterias en el agitador se procedi a Preparar las placas con medio de cultivo en las cuales sembraramos nuestras bacterias para luego analizar la eficiencia de transformacin celular. Para esto se utilizaron placas con medio de cultivo LB con antibitico de seleccin ampicilina ya que solo queremos obtener colonias de bacterias que presenten el vector plasmidial. Estas placas fueron preparadas durante el da y durante el practico se agregaron los dems componentes como los nombramos a continuacin. 1. Utilizando la campana de flujo laminar para mantener la esterilidad de nuestras placas con agar, se agrego 40 ul de X-Gal que tiene por funcin ser el sustrato de la - galagtosidasa que posee el vector, lo que nos permitir diferenciar las distintas poblaciones bacterianas por la coloracin de las bacterias, luego se agregaron 100 ul de IPTG que es el inductor que posibilita la reaccin del gen de la - galagtosidasa que utiliza el X-Gal, y finalmente se agregaron 80 ul de medio de cultivo LB liquido para lograr una mejor adhesin de los reactivos al medio de cultivo solido. Los tres componentes fueron distribuidos por toda la superficie de la placa utilizando un asa de siembra estril. 2. Posteriormente se dejaron secar las placas bajo la misma cmara de flujo laminar.

Pasado el tiempo de incubacin de las bacterias y ya con las clulas transformadas se procedi a Sembrar las bacterias en las placas con medio de cultivo LB con ampicilina y los componentes nombrados anteriormente. Este proceso se realizo tambin bajo campana de flujo laminar. 1. En cada una de las 4 placas que posea el grupo (con medio de cultivo LB con ampicilina, X-Gal e IPTG) se depositaron 100 ul de la reaccin de clulas transformadas y se inocul toda la placa con el asa de siembra estril.

2. Posteriormente se rotularon las placas y se incubaron durante 12 a 16 horas en una estufa de incubacin a 37 C.

3. Pasado el tiempo de incubacin se realizo el conteo de colonias bacterianas tanto de las azules como de las blancas.

Finalmente en el ltimo prctico nmero cuatro se realiz una reaccin de Colony PCR en la cual el DNA utilizado en la reaccin no es producto de una extraccin de tejido, si no que se utiliza una colonia bacteriana y se amplifica su DNA. Los reactivos utilizados y los volmenes se especifican en la siguiente tabla:

Reactivos Buffer 1x dNTPs 0,2 mM P1 250 nm P2 250 nm MgCl2 1,5 mM BSA 0,8 ug/ul Taq DNA pol. 0,1 U /ul ADESI Volumen final

Volumen (ul) 1X 2 2 0,5 0,5 0,6 3,2 0,25 10,95 20

Volumen (ul) 3X 6 6 1,5 1,5 1,8 9,6 0,75 32,85 60

1. El mix de la reaccin se realizo en triplicado por eso se muestra en la ltima columna el volumen de los reactivos que se utilizo para tres tubos. El mix contena Buffer 10x pero nosotros lo utilizamos en una concentracin de 1x, el Buffer cumple la funcin de aumentar la especificidad y fidelidad de la reaccin, tambin se agregaron los dNTPs que son los nucletidos que por accin de la DNA polimerasa se irn uniendo a la hebra de DNA molde, formando una nueva hebra de DNA doble. Se agregaron a la reaccin tambin los primer sentido y antisentido para el gen FABP4 introducido a la bacteria mediante un plsmido. Luego se agrego el MgCl2 que optimiza la reaccin de amplificacin y tambin se agrego BSA que enlaza compuestos que inhiben la reaccin por lo que tambin optimiza la reaccin de PCR, luego se agrego el ADESI para lograr un volumen final de 20 ul por tubo y finalmente se agrego al mix la Taq DNA polimerasa que es la enzima que unir los nucletidos a la hebra molde de DNA.

2. Ya al agregar la Taq DNA polimerasa al mix se procedi a alcuotar 20 ul del mix en cada uno de los tres tubos, un tubo control, el cual no lleva bacteria, y dos tubos de muestra los cuales si llevan bacteria.

3. El DNA que se amplificara en esta reaccin de PCR ser el de la secuencia del gen FABP4 que se introdujo en el plsmido, la forma de agregar el DNA a amplificar es pinchando una colonia bacteriana aislada con palitos mondadientes estriles y luego es introducido el palo con la colonia en el tubo de PCR para que quede la bacteria con el mix de la reaccin. 4. El paso anterior solo se realizo con los dos tubos de muestra y no con el control, luego de esto, los tubos estuvieron listos para correr la PCR en el termociclador.

Para visualizar si se amplifico el DNA inserto en la bacteria mediante la transformacin celular, posterior a la amplificacin por PCR se realiz una electroforesis en gel de agarosa al 1% donde se corrieron las tres muestras de cada grupo. 1. Primero se peso un gramo de agarosa y de deposit en un frasco Erlenmeyer con 100 ml de buffer TAE 1X, esta mezcla se someti a altas temperaturas para que la agarosa se disolviera completamente en el buffer TAE 1X. 2. Una vez disuelta la agarosa se procedi a agregar 1 ul de gel red a la solucin ya que la utilizacin de este reactivo nos permitira identificar la presencia de nuestro DNA de inters, de la misma manera que lo hacia el bromuro de Etidio, que era intercalndose en las dobles hebras de DNA. 3. Al enfriarse la solucin se polimerizo la agarosa en una cubeta que luego montamos en la cmara de electroforesis y de esta manera cargamos los pocillos del gel agregando 6 ul de nuestro producto de PCR y 1 ul de buffer de carga. 4. Finalmente se encendi la fuente de poder y se corri el gel de agarosa para comprobar que realmente nuestras bacterias de color blanco estaban transformadas con el DNA de inters.

Objetivos

General:

Realizar y comprender los procedimientos necesarios para llevar a cabo todas las reacciones requeridas en la transformacin celular.

Especficos:

Comprender la utilidad de los reactivos utilizados en cada reaccin. Obtener al final de los prcticos clulas transformadas para medir su eficiencia de transformacin. Comprobar la insercin de nuestro DNA de inters en las bacterias transformadas.

Resultados

Los resultados obtenidos luego de todas las reacciones se pudieron visualizar tras la incubacin (a 28 C por un tiempo aproximado de 24 horas) de las clulas que pasaron por el proceso de transformacin celular en el tercer practico.

1. Conteo de colonias: Cabe mencionar que las placas 1 y 2 fueron sembradas desde el mismo tubo (tubo 1). Placa N 1 : 211 colonias azules ; 1053 colonias blancas Placa N 2 : 158 colonias azules ; 1715 colonias blancas Porcentaje total de colonias blancas en el tubo 1 Porcentaje total de colonias azules en el tubo 1 : 88, 24% : 11,76%

Las placas 3 y 4 tambin fueron sacadas del mismo tubo (tubo 2). Placa N 3 : 68 colonias azules ; Placa N 4 : 109 colonias azules ; 535 colonias blancas 642 colonias blancas. : 86,93% : 13,07%

Porcentaje total de colonias blancas en el tubo 2 Porcentaje total de colonias azules en el tubo 2

2. Medicin de la eficiencia de transformacin de las clulas. Para el clculo de estos resultados se tomaran en cuenta los valores de colonias por tubo de reaccin de transformacin, estos datos son los descritos en la seccin anterior. Formula: N de colonias x 1000 pg 106 pg 1 ug x ul total Rx x 10 ul plaqueado = ufc/ug DNA plasmidial

 Tubo 1 Numero de colonias : 3137 Volumen de ul total Rx : 455 ul Volumen de ul plaqueado : 200 ul (ya que se sumaron los 100 ul de cada placa) ufc/ug DNA plasmidial = 71,366 x106

Tubo 2 Numero de colonias : 1354 Volumen de ul total Rx : 455 ul Volumen de ul plaqueado : 200 ul (ya que se sumaron los 100 ul de cada placa) ufc/ug DNA plasmidial = 30,803 x106

3. Resultado de la electroforesis de la colony PCR.

Fig. Foto gel de agarosa al 1% en el cual se ven las muestras del gen FABP4 amplificado por PCR.

Carril 1: marcador de peso Carril 2: muestra control (sin colonia bacteriana) Carril 3: muestra perteneciente a colonia del tubo 1. Carril 4: muestra perteneciente a colonia del tubo 2.

Discusin En primer lugar con los resultados del conteo de colonias en las placas, podemos decir que se realizo con xito la introduccin del vector de clonacin plasmidial a las bacterias termocompetentes tratadas con cloruro de calcio. Esto ya que el solo hecho de que crecieran bacterias en un medio de cultivo con ampicilina, nos indica que las bacterias captaron el plsmido el cual les otorgo la capacidad de sobrevivir en un medio en el cual antes de la transformacin no hubieran crecido. Por otra parte al comparar el numero de colonias que contenan el plsmido pero no el DNA de inters en su interior, nos pudimos dar cuenta que fue mayor el nmero de bacterias que si contenan el DNA de inters, correspondiente al gen FABP4. Esto lo apreciamos a simple vista ya que en el caso de las colonias azules que estaban en menor cantidad, el gen de la -galactosidasa se transcribi de manera correcta para as utilizar como sustrato el X-gal y generar de esta manera colonias azules, por el contrario en las colonias blancas que estaban en mayor cantidad y que posean tanto el vector como el DNA de inters, el gen de la -galactosidasa no se transcribi correctamente por la insercin del DNA de inters en su secuencia, por esta razn no se utiliz el X-gal como sustrato y no se vio la coloracin azul. Al comparar tambin la eficiencia de transformacin de los tubos 1 y 2 podemos darnos cuenta que el tubo 1 nos dio una mayor cantidad de colonias transformadas, por lo tanto con el gen FABP4 en su DNA. La razn de esta diferencia se pudo haber dado al manejar los volmenes de reactivos que se agregan a cada reaccin ya que este paso lo realizaron distintas personas en cada etapa, tambin podemos pensar que la diferencia se debe al volumen de reaccin de transformacin transferido a las placas ya que se pudo haber tomado volmenes diferentes, como tambin se pudo sacar ms concentracin de bacterias en la primera vez que en la segunda. Con respecto a las unidades formadoras de colonias por microgramo de DNA plasmidial podemos decir que el valor que nos arrojo esta ecuacin tanto en el tubo 1 como en el tubo 2 es bastante bueno, ya que supera con creces el valor mnimo de 1x106 ufc/ug de DNA plasmidial. Al comparar esta medicin entre el tubo 1 y el tubo 2 podemos ver la misma diferencia que se daba al sacar el porcentaje de colonias en las placas, ya que ambos clculos se hacen con la cantidad total de colonias bacterianas que se formaron a partir del contenido de cada tubo de reaccin. Finalmente con el resultado de la electroforesis de la colony PCR podemos verificar que cada colonia blanca que se repic para hacer la reaccin de PCR contena el DNA que codifica para el gen FABP4. Para esto basta ver el carril 2 el cual es el control por lo tanto no se aprecia la banda tenue que si posee el carril 3 y 4 en los cuales se puede apreciar la presencia de una banda no muy marcada pero que si se distingue a simple vista, tambin

ms abajo y en las tres muestras incluyendo el control, podemos visualizar una banda muy marcada y brillante la cual por su bajo peso molecular podemos inferir que es un exceso de primers. Con respecto al marcador de peso ubicado en el carril 1 vemos que no se definen claramente sus bandas ya que se ve un chorreado, lo que nos dificulta calcular el tamao de nuestro fragmento de DNA. Con los resultados obtenidos luego de la transformacin de clulas podemos inferir que hay una serie de factores que pueden alterar la calidad y cantidad de las clulas transformadas, puesto que, si bien para hacer la reaccin del tubo 1 como la del tubo 2 seguimos los mismos pasos, sus resultados fueron significativamente distintos ya que en el primero hubo una eficiencia de transformacin mayor que en el tubo 2.

Conclusin Luego de realizar esta serie de actividades prcticas hemos podido comprender en qu consiste la transformacin de clulas y obtener un gran nmero de copias de un gen de inters utilizando esta tcnica.

Anexos

Fig. Esquema de la visualizacin de los resultados de la transformacin celular luego de la incubacin de las placas.

Revisin bibliogrfica

1. Inohue H, Nojima H, Okayama H (1990): High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28. Artculo clsico optimizando el mtodo. 2. Old RW, Primrose SB (1989) Principles of gene manipulation. Blackwell Sci. Pub. Oxford. pp 11-13. Resumen completo del procedimiento. 3. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp. 1.74-1.84. Excelente recetario con variaciones tiles.

http://artemisa.unbosque.edu.co/facultades/medicina/revistaecm/vol11n1/tecnologiaclonaci on.pdf