OSNOVNI MEHANIZMI EMBRIONSKOG RAZVOJA

Profesor Dr Duan Trpinac

Institut za histologiju profesor Dr Aleksandar . Kosti PERIODIZACIJA RAZVOJA Razvoj se deli na prenatalni (pre roenja) i postnatalni (posle roenja) period. Prenatalni period (naziva se i period gestacije) se deli na preembrionski, embrionski i fetusni period. Preembrionski period razvia (ili rani embrionski period) traje tri nedelje, od fertilizacije do kraja tree nedelje po oploenju. Embrionski period razvia traje od poetka etvrte nedelje po fertilizaciji do kraja osme nedelje. Fetusni period razvia poinje od poetka devete nedelje po fertilizaciji i traje do roenja. Oploena jajna elija, zigot, ima sposobnost da proliferacijom i diferencijacijom stvori ceo organizam u kome su razliiti tipovi elija rasporeeni na precizno odreeni nain. Kod mnogih kimenjaka, ukljuujui sisare, ovu sposobnost imaju i elije koje su nastale prvim deobama (brazdanjem) zigota. Takve elije se nazivaju totipotentnim. Period brazdanja jajeta se zavrava kada neke elije zapoinju ekstenzivne migracije i prerasporeivanje u tri primarna germinativna sloja (klicina lista): ektoderm, endoderm i mezoderm. ELIJSKA DEOBA I APOPTOZA U EMBRIONSKOM RAZVOJU U odravanju odgovarajueg broja elija neke elijske populacije, podjednako su vane elijske deobe kao i uklanjanje ostarelih elija apoptozom. Na prvi pogled izgleda paradoksalno da elijska smrt ima neophodnu ulogu u razliitim fazama razvoja embriona. Tako se, na primer, apoptoza odigrava ve pri nastanku blastule doprinosei time stvaranju upljine blastociste. Tokom razvoja, pojedinih elija nastaje u veem broju nego to je neophodno, pa se one uklanjaju apoptozom. Na primer, u CNS-u, motorni neuroni koji ne uspostave sinapsu sa skeletnim miinim elijama, umiru. EMBRIONSKE INDUKCIJE Jedan od najvanijih sistema signala u embrionu je proces embrionske indukcije koja predstavlja specifian tip meuelijske komunikacije. Za tkiva embriona je karakteristina preciznost sa kojom signali razvoja nastaju i prenose se do odgovarajueg receptora. Ovi signali mogu biti razliiti i njihovo dejstvo moe da se iskae na razliite naine. Pod indukcijom se podrazumeva dejstvo jednog tkiva embriona, induktora, na drugo, indukovano tkivo, tako da se razvoj indukovanog tkiva kvalitativno menja u odnosu na razvoj koji bi se odvijao bez prisustva induktora. Primarni induktivni dogaaj u embrionu (primarna ili neuralna indukcija) je dejstvo mezoderma (notohorda) na ektoderm koji ga prekriva. Ona dovodi do diferencijacije trake nespecijalizovanih elija ektoderma u primordijum (zametak) centralnog nervnog sistema. Osetljivost nekog tkiva na indukciju je vremenski ograniena i mora da se odigra u odreenom periodu. Indukcije se esto deavaju u nizu, to omoguava pravilan razvoj nekog organa. Postoji nekoliko mehanizama indukcije: Ekstracelularna difuzija induktivnih supstanci koje lui tkivo-induktor. Induktor lui nedifuzibilni matriks koji dolazi u dodir sa indukovanim tkivom i deluje na njega. Indukcija posredovana direktnim fizikim kontaktom elija induktora i indukovanog tkiva. ELIJSKE ADHEZIJE Na ponaanje elija utiu i elijske adhezije. Naime, ekspresija pojedinih elijskih adhezionih molekula (CAM, engl. Cell Adhesion Molecule) na povrini plazmaleme, utie na meusobno pribliavanje i adheziju odgovarajuih elija, ili obrnuto: njihovo nepostojanje izaziva suprotni efekt meusobnog udaljavanja elija. Takoe, oni utiu na adhezuju elija na ekstracelularni matriks. Pored CAM-a, izuzetan uticaj na elije ima i nastanak ili nestanak pojedinih elijskih veza u ijem sastavu se takoe nalaze i neki CAM. DIFERENCIJACIJA Diferencijacija oznaava sazrevanje elija i njenih potomaka tokom nekoliko elijskih ciklusa i predstavlja progresivnu fenotipsku karakterizaciju i specijalizaciju elija tokom razvoja. Embrionske elije, osim to se diferenciraju, moraju i da ostanu u tako diferenciranom stanju, inae bi se vratili u prvobitno, nediferencirano stanje. Ovo odravanje diferencijacije omoguava elijska memorija. Mehanizmi elijske memorije mogu biti citoplazmatski, autokrini ili nukleusni. Citoplazmatski mehanizam podrazumeva molekule citoplazme koji deluju na nukleus. Autokrini mehanizam ukljuuje izluene molekule koji deluju na samu eliju. Nukleusni mehanizam ukljuuje procese koji deluju na modifikaciju DNK, odnosno hromatina.

Tokom razvoja jedinke i pojave razliitih elija dolazi do ekspresije razliitih delova njihovog genoma tako da je u jednom trenutku eksprimiran samo mali deo genoma. Ova pojava se naziva diferencijalna ekspresija gena. U razliitim elijama eksprimirani su razliiti delovi genoma. Kao posledica dva naina mitoze, simetrine i asimetrine, tokom embriogeneze nastaju razliite vrste elija. Tokom prvih deoba zigota i stvaranja blastule, erke-elije su meusobno jednake i iste kao majka-elija. U odreenom periodu, deobama majke-elije nastaju po dve meusobno identine erke-elije koje se, meutim, od majke-elije razlikuju po tome to su neto diferenciranije. Oba pomenuta naina deoba predstavljaju tzv. simetrine deobe jer su erke-elije meusobno identine. Meutim, pri deobi majke-elije mogu nastati i dve meusobno razliite erke-elije, jedna identina majci-eliji, a druga neto diferenciranija, pa se takve deobe nazivaju asimetrinim. Ovakav tip elijske deobe karakteristian je, osim za neke embrionske elije, i za matine elije u adultnim tkivima. Ako od majke-elije nastanu dve meusobno razliite erke-elije, a koje se istovremeno razlikuju i od majke-elije, takva deoba se takoe naziva asimetrinom. KLONSKI NAIN RAZVOJA Sva tkiva i organi u embrionu su potomci malog broja elija-prethodnika. Sve elije koje potiu od jedne elijeprethodnika nazivaju se klon (engl. clone). Koncept klona se zasniva na imunolokim istraivanjima gde je zapaeno da jedna imunoloki kompetentna elija proliferie i stvara veliki broj potomaka, koji zatim sintetiu antitelo protiv odreenog antigena. To je osnova teorije klonske selekcije. U stvari, svaka jedinka predstavlja klon elija-potomaka koje potiu od jedne elije, zigota. Zato su sve elije jedne individue meusobno genetski identine, dok velike fenotipske razlike nastaju tokom diferencijacije. Ovo je jo 1962. godine eksperimentalno dokazao Gurdon transplantacijom nukleusa enterocita abe u neoploenu jajnu eliju abe kojoj je ultraljubiastim zraenjem prethodno inaktivisana DNK. Takva jajna elija se razvila u blastulu od koje je konano nastala normalna jedinka. Ovako nastale jedinke su klonovi abe od koje su uzeti nukleusi preneti u jajnu eliju i genetski su identine sa njom. Citodiferencijacija je proces kojim od zigota, tokom razvoja, nastaje veliki broj razliitih tipova elija. Histogeneza je proces tokom koga pojedina tkiva diferencijacijom njihovih elija dobijaju karakteristian izgled. Morfogeneza je celokupni niz procesa koji oblikuju spoljanji i unutranji izgled i grau embriona. U morfogenezu se ubraja veliki broj pojava kao to su, na primer, grananje bronhijalnog stabla, oblikovanje udova, nastanak one jabuice i nastanak ara (tzv. dermatoglyphi) na koi prstiju. Morfogeneza je veoma malo razjanjena. Oigledno je da je vie procesa ukljueno u nju, a pre svega to su poziciona informacija i obrasci formiranja (engl. pattern formation). Jedan od eksperimentalnih modela, na kome se najee ispituju pozicione informacije i obrasci formiranja, su ekstremiteti. Poziciona informacija oznaava sposobnost elije da prepozna mesto u organizmu na kome se nalazi i da se razvija u saglasnosti sa svojim poloajem, tj. u embrionu postoji neka vrsta koordinatnog sistema na osnovu koga elija otkriva svoju lokalizaciju, i u skladu sa njom, se dalje diferencira. Smatra se da elije otkrivaju svoj poloaj zahvaljujui postojanju gradijenta koncentracije signalnih supstanci morfogena. Morfogeni koje lue elije u signalnom centru nekog primordijuma, na primer pupoljku ekstremiteta, vezuju se u razliitoj koliini u zavisnosti od svog gradijenta koncentracije, odnosno udaljenosti od signalnog centra, za odgovarajue membranske receptore elija primordijuma, ime ih "obavetavaju" o njihovom relativnom poloaju, odnosno udaljenosti od signalnog centra. Pri tome, elije iste vrste e se, u zavisnosti od svog poloaja, ponaati razliito. U sluaju obrazaca formiranja, postoje dokazi koji ukazuju, da u vrlo ranom razvoju mnogih struktura, pre poetka elijske diferencijacije, postoji nevidljiv "uzorak" (engl. pattern) po kome se odvija dalji razvoj. HOX GENI Prema teoriji evolucije sve ivotinjske vrste su srodne. Dok je, na primer, slinost izmeu izmeu oveka i mia uoljiva po osnovnom planu grae tela, dotle je mnogo tee uoiti slinost izmeu oveka i crva ili oveka i drozofile. U njima postoje slini elijski tipovi, na primer miine elije i neuroni. Meutim, u pogledu organizacije organa i delova tela teko je uoiti neku slinost. Primenom metoda molekularne biologije je naeno da kod svih ivotinjskih vrsta, od najprimitivnijih pa do oveka, postoji veliki procenat homologih gena. Pokazano je da su ti geni izuzetno vani za razvoj jedinke jer determiniu odgovarajue segmente tela pa su zato nazivani homeotic selector geni. Kako sadre sekvence nazvane homeobox, nazivaju se jo i geni sa homeoboxom, ili Hox geni. Oni spadaju u regulatorne gene koji kodiraju transkripcione faktore. Nalaze se du hromosoma u serijama, formirajui klaster gena (Hox cluster). Karakteristino je da je njihov redosled lokalizacije du hromosoma korelisan sa njihovom ekspresijom, odnosno funkcijom du anteroposteriorne ose embriona. Aktiviranjem odgovarajueg niza razliitih Hox gena aktivira se specifini skup strukturnih gena karakteristian za odreeni tip elije. S druge strane, aktivnost transkripcionih faktora zavisi i od prisustva specifinih hormona i indukcionih faktora koje lue okolne elije. Time se, u stvari, elijama obezbeuju pozicione informacije koje

odreuju razlike u razvoju izmeu segmenata tela du kraniokaudalne ose. Ovako programirana meusobna zavisnost elija ostvaruje prostornu i vremensku regulaciju razvoja vieelijskog organizma. Nain prostorne ekspresije odgovarajuih Hox gena je isti u svim ivotinjskim vrstama. Ako se neki Hox gen drozofile aktivira prvo u regionu glave, onda e se njemu odgovarajui Hox gen oveka takoe aktivirati prvo u regionu glave. Osim u segmentaciji tela du kraniokaudalne ose, Hox geni su ukljueni u razvoj ekstremiteta, segmentaciju primordijuma mozga na neuromere, a verovatno i u razvoj branhijalnog sistema. LEVO-DESNA ASIMETRIJA Dok spoljanji izgled tela kimenjaka pokazuje bilateralnu simetrinost u odnosu na srednju ravan, visceralni organi pokazuju znaajnu asimetriju u svojoj grai i svom poloaju. Pri tome izraena je sklonost da se asimetrija uvek manifestuje na isti nain i u istom pravcu, na primer poloaj jetre ili srca u odnosu na srednju ravan. Tek nedavno su nainjena eksperimentalna otkria koja ukazuju na mogue mehanizme njenog uspostavljanja, kao i inicijalnog mehanizma pri izboru strane razvoja. Poznati su sluajevi potpune inverzije asimetrije unutranjih organa (situs inversus viscerum), to ukazuje na globalnu regulaciju njihove levo-desne asimetrije. S druge strane, zapaene su i pojave inverzije samo pojedinih visceralnih organa. To ukazuje da se instrukcije o levo-desnom poloaju mogu interpretirati i globalno, na nivou celog organizma, ali i na nivou pojedinanog organa. Ispitivanja embriona pilia su pokazala da do pojave prve prolazne asimetrije u razvoju dolazi tokom gastrulacije u predelu primitivnog (Hensenovog) voria, dok do prve velike asimetrije u razvoju dolazi u periodu organogeneze u primordijumu srca. U eksperimentima je u elijama Hensenovog voria, manipulacijom nekim od gena za koje je pokazano da se prvi asimetrino eksprimiraju tokom razvia, izazvana je njihova simetrina ekspresija. Kao posledica genske manipulacije, kod jedne polovine eksperimetalnih ivotinja srce je bilo sa (normalne) leve, a kod druge polovine sa desne strane, to govori o njegovom randomizovanom (nasuminom) razviu kod genetski manipulisanih ivotinja. Kod oveka, najpoznatije nasledno obolenje sa poremeenom levo-desnom asimetrijom je Kartagenerov sindrom kod koga oko polovina obolelih ima potpuni situs inversus. Kod ovih bolesnika, mukaraca, osim situs inversusa, sindrom karakteriu neplodnost i este respiratorne infekcije. Neplodnost i respiratorne infekcije su jo ranije objanjene genetskim poremeajem (defektom dineina) u strukturi i funkciji flagela spermatozoida, odnosno kinocilija respiratornog epitela, ali veza sa asimetrijom tela nije bila jasna. Nedavno je pokazano da elije Hensenovog voria na svojoj bazalnoj povrini imaju kinocilije koje svojim pokretima stvaraju ulevo usmerenu struju ekstracelularne tenosti u koju okolne elije izluuju signalne supstance. Na ovaj nain signalne supstance preteno deluju na elije u levoj polovini embriona aktivirajui mehanizme za uspostavljanje normalne, levo-desne asimetrije. U sluaju defekta dineina u konocilijama, osim nepokretnosti spermatozoida i cilija epitela, nepokretne su i cilije elija Hensenovog voria, to dovodi do nasuminog uspostavljanja levo-desne asimetrije. FERTILIZACIJA Veoma je vano da se, poto prodre prvi spermatozoid, sprei polispermija, prodiranje veeg broja spermatozoida u ovocit, odnosno oploenje jajne elije sa vie od jednim spermatozoidom. Spreavanje polispermije se odvija u dve faze, brzoj i sporoj. U brzoj fazi, plazmalema jajne elije se trenutno depolarizuje. Na taj nain omoguava jajnoj eliji da neto sporijim i sloenijim mehanizmima, ostvari potpuno spreavanje polispermije. Dogaaji ukljueni u brzu fazu zapoinju sporu fazu. Prvo se iz depoa u jajnoj eliji oslobaa Ca2+ koji zapoinje korteksnu reakciju, egzocitozu granula korteksa ovocita i oslobaanje njihovog sadraja u prostor oko jajne elije. Ove granule sadre enzime, strukturne proteine i glikozaminoglikan koji menjaju zonu pelucidu i izazivaju odvajanje priljubljenih spermatozoida i ubijaju ih. EPITELNO-MEZENHIMNA TRANSFORMACIJA U embrionu prvobitno postoje dva osnovna tipa tkiva: epitelno i mezenhimno. Prvi i osnovni tip tkiva koji nastaje u ranom embrionu je epitelno tkivo. Drugi tip tkiva, mezenhim, nastaje epitelno-mezenhimnom transformacijom. Epitelne elije lee na povrini ekstracelularnog matriksa, na bazalnoj membrani, a sastoje se od jednog ili vie slojeva polarizovanih elija. Njihova polarizacija je orjentisana u apikalno-bazalnom pravcu, a Goldijev aparat je obino u apikalnom delu citoplazme. elije epitela su meusobno povezane razliitim elijskim vezama. Za razliku od epitelnih elija, mezenhimne elije pojedinano prodiru u ekstracelularni matriks i kreu se kroz njega. Mezenhimne elije su vretenastog ili razgranatog oblika. Kao i epitelne, i mezenhimne elije su polarizovane. Meutim, kod njih razlikujemo frontalnu (prednjaeu) i terminalnu (prateu) pseudopodiju. Goldijev aparat je lokalizovan u frontalnom delu citoplazme gde stvara novu membranu koja se inkorporira u membranu frontalne pseudopodije. Prilikom epitelno-mezenhimne transformacije epitelne elije se odvajaju od bazalne membrane, menjaju oblik u vretenast, formiraju frontalnu pseudopodiju na bazalnom delu, i zapoinju migraciju kroz ekstracelularni matriks do odreenog mesta. Odvajanje od bazalne membrane i migracija podrazumeva promene u ekspresiji CAM na povrini elije. Poto se nau na odreenom mestu, mogu da se dalje diferenciraju u neku eliju. Na primer, neke epitelne elije epiblasta se transformiu u mezenhimne elije i migriraju kroz primitivnu prugu stvarajui mezoderm i

endoderm. U sluaju endoderma, mezenhimne elije koje ga stvaraju ponovo se transformiu, ali ovaj put u suprotnom smeru, iz mezenhimnih u epitelne elije. Takav, obrnuti proces, se naziva mezenhimno-epitelna transformacija. Tada se mezenhimne elije grupiu, dobijaju epitelan izgled, stvaraju bazalnu membranu i uspostavljaju apikalno-bazalnu polarizaciju. Smatra se da u osnovi ovih transformacija lei promena ekspresije epitelnog programa gena u mezemnhini i obrnuto. Kod odraslih osoba, epitelno-mezenhimna transformacija je vana u patolokom procesu nastanka metastaza tumora. RAZVOJ NERVNOG SISTEMA I HISTOGENEZA NERVNOG TKIVA Neurulaciju ine je procesi koji formiraju nervnu plou i pretvaraju je u nervnu cev. Tokom neurulacije preembrion se naziva neurula. Primarni induktivni dogaaj, primarna indukcija, je dejstvo notohorda na ektoderm koji ga prekriva. Ona dovodi do diferencijacije trake nespecijalizovanih elija ektoderma u primordijum centralnog nervnog sistema. Indukovani ektoderm postaje zadebljala nervna ploa koja se transformie prvo u uzduni leb, a zatim konano u cev. Elongacijom mikrotubula kockaste elije ektoderma na koje dejstvuje indukcija notohorda postaju visoke cilindrine elije koje ine nervnu plou. Do formiranja sulkusa dolazi usled kontrakcije prstena aktinskih filamenata u predelu apeksa cilindrinih neuroepitelnih elija, jer dovodi do njegovog suavanja i pretvaranja cilindrine u piramidalnu eliju, i nagomilavanja ekstracelularnog matriksa u mezenhimu nervnih nabora. Vei deo nervnog tkiva potie od nervne cevi. Kranijalne dve treine nervne cevi predstavljaju budui mozak, a kaudalna treina buduu kimenu modinu. Od lumena nervne cevi, nervnog kanala, nastae modane komore i centralni kanal kimene modine. U poetku, odmah po zatvaranju, nervna cev se sastoji od jednog sloja neuroepitelnih elija koje svojim rasporedom daju utisak pseudoslojevitog epitela. Sve neuroepitelne elije imaju sposobnost deobe i od njih nastaju dve osnovne vrste elija: neuroblasti, od kojih e nastati neuroni, i glioblasti, od kojih e nastati makroglija (neuroglija). Mikroglija (mezoglija) potie od monocita ili matinih elija mezenhima. RAZVOJ EKSTREMITETA Pupoljci ekstremiteta nastaju na ventrolateralnom zidu tela. U poetku, pupoljci se sastoje od mezenhimne sri prekrivene slojem prostog kockastog epitela (ektoderma). Mezenhim sri potie od somatskog sloja lateralnog mezoderma. Od njega e nastati kosti i vezivno tkivo ekstremiteta. Razvoj ekstremiteta se odvija kroz niz uzajamnih indukcija epitela i mezenhima. Mezenhim indukuje stvaranje zadebljanja ektoderma na vrhovima ekstremiteta, nokatni nabor ili apikalni ektodermni greben (engl. apical ectodermal ridge, AER) koji specifino induktivno deluje na subepitelni mezenhim. Zbog toga ovaj, apikalno lokalizovan mezenhim ostaje kao populacija nediferenciranih, brzo proliferiuih elija, dok elije udaljenijeg mezenhima poinju da se diferenciraju u hrskavicu i miie. Na ovaj nain razvoj i rast ekstremiteta se odvija u proksimodistalnom pravcu. Prsti nastaju kada se kao posledica lokalizovane apoptoze elija AER podeli na pet manjih AER regiona. Na taj nain apikalni deo pupoljka ekstremiteta se razdvaja na pet delova od kojih se svaki razvija na specifian nain. Prsti se dalje razvijaju kontinuiranim rastom pod uticajem pet novonastalih AER regiona. Mezenhim se kondenzuje, nastaju trake hrskavice, modeli buduih kostiju prstiju, i apoptoza tkiva izmeu njih. Meutim, osim AER na rast prstiju utie i induktivno delovanje grupe elija lokalizovanih du zadnje ivice proksimalnog dela osnove ekstremiteta. Ova grupa elija se naziva zona polarizacione aktivnosti (ZPA). Luenjem induktora ZPA uspostavlja morfogenetski gradijent du kranijokaudalne ose ekstremiteta. Poto se uspostavi spoljanji oblik pupoljaka ekstremiteta, mezenhim u njima poinje da se kondenzuje i do 6. nedelje nastaju prvi hrskaviavi modeli kosti. Osifikacija kostiju ekstremiteta se odvija enhondralnim nainom. Izuzetak je klavikula koja nastaje endesmalnom osifikacijom. KONGENITALNE ANOMALIJE Kongenitalne anomalije (uroeni poremeaji) nastaju tokom gestacije. Spoljanji inioci koji izazivaju uroene poremeaje se nazivaju teratogeni. U teratogene se ubrajaju: mnoge hemikalije (ukljuujui mnoge lekove i alkohol), infektivni agensi, radijacija kao i neki drugi inioci. Izloenost teratogenim agensima tokom prvih nedelja razvoja esto direktno ubija embrion ne interferirajui sa razvojem organa, zato to on nije ni poeo. Izloenost teratogenima u periodu od 3 do 8 nedelje dovodi do pojave malformacija karakteristinih za pojedine organske sisteme, zato to je to period organogeneze. Izloenost teratogenim agensima tokom fetusnog perioda deluje na rast i sazrevanje organa, ali ne izaziva primarne strukturne malformacije. Svaki teratogen ima sopstveni vremenski period kada maksimalno deluje na embrion kao celinu ili na neki organski sistem. Svaki organ ima neto drugaiji period kada je podloan dejstvu teratogena.
LITERATURA 1. Alberts B, et al: Molecular Biology of the Cell, 4th. Ed, Garland Science, NY, 2002 2. Carlson BM: Patten's Foundations of Embryology, 6th. Ed, McGraw-Hill, New York, 1996 3. Moore KL, Persaud TVN: The Developing Human, 6th. Ed, Saunders, Philadelphia, 1998 4. Trpinac D: Embriologija, 2. izdanje, Kua tampe, Beograd, 2001