LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI

KELOMPOK C2 I Putu Riska Winatha Fajar Handayani Arum Wahyuningsih Wulan Putri Asih Dita Pertiwi A.D 08613007 09613149 09613152 09613153 09613155

LABORATORIUM FARMAKOLOGI DAN TERAPI JURUSAN FARMASI – FAKULTAS MIPA UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA 2011/2012

yaitu kecukupan mendapat makanan. Mikroorganisme dapat hidup jika pada kondisi yang sesuai. Maka untuk menghambat daya infeksi agar tidak berkelanjutan lebih tinggi. selain itu juga terdapat di permukaan tubuh. lingkungan akuatik dan atmosfer. Ciri.ciri bakteri patogen yaitu kemampuan untuk menularkan. melekat pada sel inang. hidung dan bagian- bagian tubuh yang lain. . di dalam sel pencernaan makanan. kelembapan dan suhu. seperti dalam tanah. mampu untuk meracuni serta mampu untuk menghindari dari sistem kekebalan inang. LATAR BELAKANG Mikroorganisme terdapat di berbagai habitat. menginvasi sel inang dan jaringan.UJI POTENSI ANTIMIKROBIAL MENGGUNAKAN METODE DILUSI I. TUJUAN Mahasiswa dapat menentukan MIC dan MBC suatu antibiotika terhadap bakteri menggunakan teknik dilusi dan mikrodilusi II. Beberapa infeksi disebabkan oleh bakteri yang secara umum dianggap patogen tidak menampakkan gejala (asimptomatik). Suatu penyakit terjadi jika bakteri atau reaksi imunologi yang ditimbulkannya menyebabkan suatu bahaya bagi seseorang. Mikrobia dapat menyebabkan banyak bahaya. mulut. Mikroorganisme tidak dapat dipisahkan dengan lingkungan abiotik dan biotik dari suatu ekosistem karena peranannya sebagai pengurai. perlu adanya antibakteri atau antibiotik sebagai obatnya. Patogenesis infeksi bakteri meliputi permulaan awal dari proses infeksi hingga mekanisme timbulnya tanda dan gejala penyakit. karena dapat menginfeksi organisme lain mulai dari infeksi ringan sampai kepada kematian. bahkan kematian.

kloramfenikol. Menghambat pembentukan dinding sel. Resistensi bakteri adalah suatu sifat tidak terganggunya kehidupan sel bakteri oleh antimikrobia. gentamisin. DASAR TEORI Antibiotik adalah senyawa kimia khas yang dihasilkan oleh organisme hidup. Contoh : penisilin. 5. 4. streptomisin. dan dalam kadar rendah mampu menghambat proses penting dan kehidupan satu spesies atau lebih mikroorganisme (Siswandono. gentamisin. nifampin. Contoh : streptomisin.III. antagonis metabolit contoh : isoniazid (Jawetz. ampisilin. sefalosporin. Resistensi genetic Terjadi mutasi spontan pada gen bakteri sehingga terjadi perubahan pada bakteri yang semula sensitive terhadap suatu antimikrobia . sefalosporin. Berdasarkan sasaran bakteri. Secara umum resistensi di bagi dalam 3 kelompok : A. isoniazid (Ganiswara. Contohnya : eritromisin. Antibiotik spectrum luas (broad spectrum) yaitu antibiotic yang efektif terhadap berbagai macam pathogen.2000). termasuk turunan senyawa dan struktur analognya yang dibuat secara sintetik. Antibiotik spectrum sempit (narrow spectrum) yaitu antibiotic yang hanya ektif terhadap mikroba pathogen terbatas. mengganggu pembentukan membrane sel. 2. metsilin. Contoh : siproploksazin. Menghambat sintesis asam nukleat. Contohnya : ampisilin. 2005). Contoh : polimiksin B. antibiotic dibedakan menjadi : a. Mekanisme aksi antibiotic : 1. menghambat sintesis protein. 3. b.2001).

2. Resisten non genetic Bakteri dalam keadaan istirahat. 2. sifat resistensi ditentukan oleh suatu lokus genetic. Mencegah pemakaian antibiotic tanpa pembedaan kasus-kasus yang tidak membutuhkan antibiotic. Resistensi silang Resistensi silang adalah keadaan resisten terhadap antimikroba yang juga memperlihatkan sifat resisten terhadap antimikroba yang lain. Bila berubah menjadi aktif kembali. Mengguanakan antibiotic yang tepat dengan dosis agar infeksi cepat sembuh. Menghentikan penggunaan antibiotic pada infeksi biasa atau sebagai obat luar. Bakteri ini dikenal sebagai “persistem”. Bakteri dapat berubah menjadi resisten akibat memperoleh suatu elemen pembawa factor resisten. 3. C. 4. Cara transformasi factor resisten bakteri terjadi dengan jalan bekteri menginporlasi factor resisten langsung dari media sekitarnya (lingkungan). Pada resisten silang. Mikroba menurunkan permeabilitasnya sehingga obat sulit masuk ke dalam sel. Mikroba membentuk jalan pintas untuk menghindari tahap yang dihambat oleh mikroba. Inaktivasi oleh mikroba.menjadi resisten. Meninggkatkan produk enzim yang dihambat oleh antimikroba. Resistensi silang biasanya terjadi antara antimikrobia dengan struktur yang hamper sama. Mekanisme resisten kuman terhadap antimikroba ada 5 yaitu : 1. 3. misalnya antara beberapa derivate tetrasiklin. bakteri kembali bersifat sensitive terhadap antimikroba semula. Terbentuknya resistensi dapa dikurangi dengan cara: 1. B. biasanya tidak dipengaruhi olah antimikrobia bakteri. Perubahan tempat kerja obat pada mikroba. . 5.

Menggunakan keefektifannya. Bakteri bersifat resisten karena mutasi.4. Penentuan kepekaan bacteria pathogen terhadap antimikrobia dapat dilakukan dengan salah satu dari dua metode pokok yakni dilusi atau difusi. 1. Pengobatan yang tidak tuntas antau penghentian antibiotic sebelum bakteri benar-benar mati. Suspensikan ke dalam 0. Pemakaian dosis obat antibiotic dibawah dosis terapi. 2. DIFUSI Media yang dipakai adalah agar Mueller Hilton dan pada difusi ini ada beberapa cara yaitu : a. Sedangkan pada delusi pada tiap konsentrasi obat dicampur dengan media agar. Ambil beberapa koloni kuman dari pertumbuhan yang diinkubasi selama 24 jam pada agar.5 ml BHI cair. 4. DILUSI PADAT ATAU CAIR Pada prinsipnya antibiotik diencerkan hingga beberapa konsentrasi. lalu ditambah kuman (Lay. Cara Kirby Baeur 1. kombinasi antibiotic yang telah terbukti 5. Mengguanakan antibiotic yang lain bila ada tanda-tanda bahwa suatu organisme akan menjadi resisten terhadap antibiotic yang digunakan semula. 2. 1994). . Pada delusi cair. inkubasi 5-8 jam pada suhu 37ºC. Penyebab mikroorganisme resisten terhadap antibiotic adalah 1. 3. Pemakaian antibiotic yang tidak tepat. masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi kuman dalam media.

ambillah satu mata ose dan masukkan dalam 4 ml agar base 1. Letakkan paper disk yang mengandung antibiotik di atasnya. Bahan kimia yang mematikan bakteri .3 sama dengan Kirby Bauer. 4. 2.2. 3.5 % yang mempunyai temperatur 500 C (diambil dari waterbath). Kemudian oleskan pada permukaan media agar hingga rata. 108 CFU/ml. Inkubasi pada 37ºC selama 19-24 jam (Lay. 3. Inkubasi selama 15-20 jam dengan temperatur 37ºC (Lay. 1994). Kapas lidi steril dicelupkan ke dalam suspensi kuman lalu di tekan-tekan pada dinding tabung hingga kapasnya tidak terlalu basah. c. 4. 2. Inkubasi pada 37ºC selama 18-24 jam (Lay. Pada agar dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu dan kedalam sumuran tersebut di tetesi larutan antibiotik yang digunakan. Setelah suspensi kuman tersebut dibuat homogen.1994). tuanglah pada media Mueler Hilton agar.2. 1994). pada langkah 1 dan 2 sama dengan cara Kirby Bauer. SUMURAN 1. Pada langkah 1. dengan menggunakan ose khusus. b. Bahan kimia yang digunakan dalam pengobatan (kemoterapeutik) menjadi pilihan bila dapat mematikan dan bukan menghambat pertumbuhan mikroorganisme. 3. Cara Pour 1. Suspensi di atas di tambah aquades steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi kuman.

Bahan antimicrobial dapat bersifat bakteriostatik pada konsentrasi rendah. namun bersifat bakterisidal pada konsentrasi tinggi. luasnya wilayah juga berkaitan dengan kecepatan berdifusi antibiotic dalam medium. Metode penentuan keampuhan antibiotic ini disebut MIC (Minimun Inhibitory Concentration). . namun tidak menyebabkan keracunan pada induk semang yang menggunakan bahan tersebut. Bahan kemoterapeutik yang baik mempunyai daya mematikan mikroorganisme. Keampuhan antibiotic dapat ditentukan dengan melihat konsentrasi terendah antibiotic yang masih mampu mematikan atau menghambat pertumbuhan mikroortanisme pathogen. sedangkan bahan kimia yang menghambat pertumbuhan bakteri disebut bakteriostatik. Kecepatan berdifusi ini harus diperhitungkan dalam penentuan keampuhan antibiotic. Luas wilayah jernih merupakan petunjuk kepekaan mikroorganisme terhadap antibiotic. Selain itu.disebut bakterisidal. bahan dengan sifat demikian memiliki toksisitas selektif.

IV. ALAT DAN BAHAN  ALAT Tabung reaksi Gelas beker Gelas ukur Pipet tetes Mikropipet Erlenmeyer Autoclve LAF Bunsen  BAHAN Media TSB (Trypticase Soy Broth/nutrien broth) Suspensi bakteri eschericia colli Antibiotik ampisilin .

10 8 CFU/ml). Harikedua Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan. 100 μg/ml. Seri pengenceran yang dibuat adalah 400 μg/ml. bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan.1 ml biakan E coli (24 jam. CARA KERJA A. 2. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. dan 25 μg/ml dengan volume akhir tabung adalah 2 ml. Inokulasikan setiap tabung (kecuali kontrol 1) dengan menggunakan 0. HariPertama Siapkan 7 buah tabung reaksi ( 2 tabung untuk kontrol dan 5 tabung untuk perlakuan) Lakukan pengenceran larutan streptomisin/penisilin dengan menggunakan media TSB/NB sebagai pengencer. TeknikDilusiCair 1. Inkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel. 200 μg/ml. Pindahkan satu mata ose biakan dari tabung jernih (-) kedalam media TSB atau media TSA yang baru. 50 μg/ml. .V.

3. . Laporkan hasilnya dalam bentuk tabel. bila tabung jernih (-) berarti tidak terjadi pertumbuhan. Hari ketiga Amati tabung yang menunjukkan pertumbuhan dengan di kocok. apabila tabung keruh (+) berarti menunjukkan pertumbuhan. Tentukan konsentrasi bahan kimia yang bersifat bakteriostatik atau bakterisidal.

coli dan antibiotic amphicilin 1. Foto hasil Percobaan Gambar. 1 Keterangan Gambar 1 : Tabung A : 400 µg/ml Tabung B : 200 µg/ml Tabung C : 100 µg/ml Tabung D : 50 µg/ml Tabung E : 25 µg/ml (bening/tidak keruh = tidak terjadi pertumbuhan bakteri ) Gambar. DATA DAN HASIL Laporan Hasil Percobaan Jenis/jumlah sampel : Bakteri E.VI. 2 Keterangan : Tabung K (+) = tabung control positive berisi media + bakteri (keruh) Tabung K (-) = Tabung control negative berisi Aquades (bening) .

Hasil data Dilusi Cair Kadar sampel 400 µg/ml 200 µg/ml 100 µg/ml 50 µg/ml 25 µg/ml Hasil (-) (-) (-) (-) (-) Keterangan : (+) = tumbuh (-) = tidak tumbuh 3.105 0.360 0.101 0.094 0.092 .104 0.103 0. Data ELISA Tabung Kontrol (+) Kontrol (-) A B C D E Absorbansi 0.2.

.4. D. E. Presentase kematian sel bakteri A. C. B.

Dilusi cair. perbedaanya terletak pada media pertumbuhan yang digunakan. Colly ini digunakan teknik dilusi cair. Pengenceran hanya dilakukan dari tabung ketiga yng diambil dari tabung kedua. Hari pertama praktikum melakukan inkubasi bakeri E. untuk MKC merupakan konsentrasi terendah antibiotik yang mematikan bakteri. Sehingga antibiotic ini aktif dalam menghambat bakteri Eschericia colly. Beberapa golongan penisilin ini juga aktif terhadap bakteri Gram negative. Golongan penisilin bersifat bakterisid dan bekerja dengan mengganggu sintesis dinding sel. sedangkan dilusi padat menggunakan menggunakan media agar padat. Untuk tabung . Kelebihan dilusi cair adalah dapat menentukan MIC dan MKC. Bahan antimikrobial yang bersifat menghambat pertumbuhan bakteri bila digunakan dalam kosentrasi yang kecil. Untuk menentukan MIC dan MKC pada bakteri E. Metode dilusi juga memiliki kekurangan yaitu metode ini bersifat subjektif karena parameter yang digunakan adalah kekeruhan. Dilusi cair memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan teknik delusi. menggunakan media tumbuh berupa agar yang cair. Antibiotika penisilin mempunyai ciri khas secara kimiawi adanya nukleus asam amino-penisilinat. Ampicilin merupakan golongan antibiotic Penisilin. colly dimana dilakukan pengenceran pada 5 tabung reaksi yang berisi antibiotik ampicilin. MIC merupakan konsentrasi terendah bahan antimikrobial yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Metode dilusi dibedakan menjadi 2 macam. Konsentrasi antibiotik yang digunakan adalah 400µg/ml.VII. PEMBAHASAN Untuk menentukan MIC dan MKC maka dilakukan teknik dilusi. yakni dilusi cair dan dilusi padat. Spektrum bakteri terutama untuk bakteri Gram positif. yang terdiri dari cincin tiazolidin dan cincin betalaktam. namun apabila konsentrasinya besar dapat untuk membunuh bakteri. Penisilin adalah antibiotika yang termasuk paling banyak dan paling luas dipakai. Dan untuk media agar yang digunakan adalah media TSB. sedangkan pada teknik difusi hanya dapat diketahui zona hambatnya.

Tabung ini berisi media dan sample bakteri. 100µg/ml. 25 µg/ml tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri. Kekeruhan menunjukkan bakteri masih dalam keadaan baik. tabung 1 berisi media agar cair dengan aqudes. menurut definisi dari MIC adalah kadar terendah antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Semua tabung dari konsentrasi 400.Pengenceran yang dilakukan adalah 400µg/ml. Ini didesain untuk digunakan dalam mengestimasi konsentrasi bakteri Gram negatif. Kekeruhan larutan bakteri pada tiap tabung kurang lebih sesuai dengan nomor skala McFarland yaitu kekeruhan bakteri pada konsentrasi . Pada praktikum kali ini setelah dilakukan teknik dilusi pada hari pertama dan tabung berisi biakan berbagai konsentrasi antibiotik di inkubasi selama 24 jam. yang menjelaskan konsentrasi spesifik dari bakteri per mL. Dari hasil praktikum didapatkan semua tabung jernih kecuali tabung berisi kontrol positif. dan tabung yang lain berisi media cair dengan bakteri. Dan dinnkubasi selama 24 jam. kekeruhan media pada tabung kontrol positif ini menandakan bakteri masih dalam keadaan baik. Standar McFarland berada dalam bentuk skala yang bernomor dari 1 sampai 10. 100. sedangakan waktu 24 jam dalah waktu maksimum pertumbuhan bakteri. kontrol positif ini untuk melihat apakah bakteri yang digunakan masih bagus. 50. maka kadar hambat minimum adalah 25 µg/ml. maka tabung dengan jumlah konsentrasi antibiotik terendah yang jernih menunjukkan MIC (Minimum Inhibitory Concentration). 200µg/ml. Suhu 370c adalah menyesuaikan dengan suhu tubuh pada manusia. 200. Kekeruhan memiliki standar brown atau Standar Kekeruhan McFarland. 25µg/ml. dengan suhu 370c.pertama dan kedua diambil langsung dari konsentrasi antibiotik 400µg/ml. 50µg/ml. Dua tabung yang lain digunakan sebagai kontrol.

Metode ELISA ini akan membaca absorbansi dengan panjang gelombang 570 nm. Pada praktikum ini hanya bisa diketahui MIC-nya karena untuk menentukan MKC dibutuhkan kultur ulang dengan pembuatan media TSB yang baru dan diambil dari kadar terendah dari MIC. jadi penambahan bakteri pada tiap tabung diperlukan standar McFarland agar dihasilkan konsentrasi yang sama sehingga saat diinkubasi dan dibaca hasil presentase kematian bakteri didapatkan hasil yang benar dalam perhitungan presentase kematian bakteri.1 x 109/mL. Pengadaan kontrol negatif yang berisi media + aquades berfungsi untuk mengetahui media yang digunakan masih baik atau tidak. dan E tidak lagi diketahui. sedangkan kontrol positif yang berisi media dan bakteri berfungsi untuk mengetahui apakah bakteri yang digunakan masih baik atau tidak. Dari hasil yang diperoleh dapat dihitung prosentasi kematian sel bakteri dengan rumus : Dengan absorbansi kontrol sama dengan absorbansi pada kontrol positif. Hal ini dapat disebabkan karena kesalahan saat proses dilusi dimana terjadi kesalahan pengenceran pada tabung C sehingga konsentrasi antibiotik pada tabung C. Jadi nilai absorbansi yang dianalisis menggunakan metode ELISA yaitu pembacaan absorbansi dari MBC. . seharusnya semakin tinggi konsentrasi antibiotik semakin rendah serapan dari hasil ELISA karena semakin sedikit pula bakteri yang masih hidup. Hasil yang didapat kurang signifikan. dan absorbansi media sama dengan absorbansi kontrol negatif.2. Selanjutnya media dimikropipet sebanyak 50µl dalam lubang mikroplate yang kemudian dianalisis dengan metode ELISA ( Enzym Linked Immun Sorbent Assay).D.

VIII. MIC yang didapatkan pada kadar 25 µg/ml.Kelebihan dari metode mikrodilusi cair ini adalah dapat memberikan hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikroba yang dibutuhkan untuk mematikan bakteri. KESIMPULAN Semakin tinggi konsentrasi antibiotik yang digunakan maka semakin banyak bakteri yang mati. .

edisi 2. Jakarta. Hal 515-522 4. Lud. Mikrobiologi Dasar. Penerjemah Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran UNAIR. & Adelberg’s. 2001. DAFTAR PUSTAKA 1.& E. Mulyaningsih. 351-357 2. Penerbit Salemba Medika.S. Mikrobiologi Kedokteran. 1988.C.IX.. 2005. Melnick. S. Malang .Penerbit UI-Press. Mikrobiologi Umum. 2004. Michael J. UMM-Press. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hal 223-228. Yokyakarta 3. Jawetz. FMIPA UII. Chan. Waluyo. Pelczar. Jakarta.