Meningkatkan Performa Pertumbuhan Udang Galah (Macrobrachium rosenbergii) Dengan Teknologi Manipulasi Kromosom (Poliploidi) Oleh: Robi Binur

(21110003) Bioteknologi SITH-ITB

1. Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Udang galah (Macrobrachium rosenbergii) merupakan udang air tawar terbesar di dunia dengan panjang tubuh jantan dapat mencapai 32 cm dan betina sekitar 25 cm dengan bobot tubuh lebih dari 300 gram. Oleh karena itu udang ini menjadi salah satu primadona dalam budidaya selain nilai ekonomisnya yang tinggi. Permintaan akan udang ini terus meningkat dari tahun-ketahun, tetapi tidak diiringi dengan produksi yang meningkat. Salah satu penyebabnya adalah terjadinya penurunan pertumbuhan udang galah diberbagai sentra budidaya sehingga udang yang dihasilkan memiliki bobot tubuh yang rendah. Untuk memenuhi akan permintaan ini salah satu solusinya adalah menggunakan teknologi manipulasi kromosom untuk meningkatkan produksi udang ini.

Gambar 1. Bentuk morfologi udang galah (Macrobrachium rosenbergii).

Manipulasi kromosom terutama poliploidi sudah secara intensif digunakan untuk meningkatkan produktifitas pada berbagai organisme akuakultur. Tujuan utama dari manipulasi poliploidi adalah menghasilkan Individu yang mandul (steril) (Beaumont et al. 2010; Thorgaard, 1983). Sehingga ketika diinduksi ke dalam sistim kultur maka individu tersebut memiliki pertumbuhan yang cepat. Karena energi dimaksimalkan untuk 1

pertumbuhan daripada untuk reproduksi yang ditandai dengan meningkatnya rasio konversi pakan atau feeding conversion ratio (FCR) dari tiap individu. Diketahui bahwa individu triploid dapat mengurangi energi yang dibutuhkan dalam perkembangan gonad, pemeliharan anak, perkawinan serta aspek reproduksi lainnya yang berhubungan dengan pertumbuhan (Aloise et al. 2011). Induksi triploidi umumnya sukses pada banyak spesies ikan. Ikan yang triploid sebagian besar memiliki pertumbuhan yang cepat walaupun ada beberapa tetap normal (Razak et al. 1999; Thorgaard, 1983). Manipulasi poliploidi pada udang pertama kali dilakukan pada Fenneropenaeus chinensis. Pada spesies ini, enam bulan pertama dapat meningkatkan pertumbuhan 20% lebih cepat dibandingkan individu diploid (Aloise et al. 2011). Selain itu juga berhasil dilakukan pada udang putih (Litopenaeus vannamei) (Dumas & Ramos, 1999) dan udang kuruma (Penaeus japonicus) (Coman et al. 2008; Norris et al. 2005). Peningkatan pertumbuhan ini karena terjadinya efisiensi FCR sehingga pakan yang diberikan dapat diserap secara maksimal untuk pertumbuhan. Hal ini tentunya mengurangi biaya pakan secara signifikan terutama pada budidaya skala besar (Aloise et al. 2011). Walaupun teknik ini sudah umum digunakan pada berbagai spesies ikan tetapi pada udang (crustacea) masih sedikit digunakan. Sampai saat ini belum ada laporan secara ilmiah yang pernah menggunakan teknik ini untuk meningkatkan performa pertumbuhan udang galah. Untuk itu, penulis berasumsi bahwa penelitian ini penting untuk dicoba dalam rangka meningkatkan produktifitas udang galah. 1.2. Masalah Berdasarkan data dari FAO (2009) dalam New (2010) produksi udang galah Indonesia masih rendah, yaitu sekitar 688,83 ton pertahun jika dibandingkan dengan negara tetangga seperti Thailand dan Vietnam yang masing-masing mampu memproduksi 19.435,5 dan 5.025 ton pertahun. Hal ini menunjukkan bahwa ada masalah dalam pembudidayaan udang ini di Indonesia. Salah satu masalah tersebut adalah rendahnya pertumbuhan udang ini di sentra-sentra budidaya. Rendahnya pertumbuhan ini dipengaruhi oleh banyak faktor antara lain manajemen broodstok yang buruk, pemilihan indukan yang tidak berkualitas, lemahnya penanganan penyakit, dan efek dari proses inbreeding yang menyebabkan menurunnya variasi genetik. Salah satu solusi yang dapat dilakukan untuk meningkatkan performa pertumbuhan udang ini adalah menggunakan teknologi manipulasi kromosom yaitu polidisasi. Dengan teknik ini kromosom pada udang betina (maternal) maupun jantan (paternal) dijadikan triploid atau tetraploid. Sehingga ketika dikultur udang akan menjadi mandul (steril). Sterilitas ini dapat menyebabkan pertumbuhan udang lebih cepat dibandingkan individu 2

diploid. Karena energi tidak digunakan untuk perkembangan gonad, tetapi untuk pertumbuhan sel somatik (Dumas & Ramos, 1999). Dengan teknik ini performa pertumbuhan udang galah diharapkan akan meningkat. 2. Dasar Teori 2.1. Poliploidi Poliploidi merupakan fenomena yang terjadi secara alami terutama pada tumbuhan dan beberapa vertebrata (Herbst, 2002). Poliploidi didefinisikan sebagai individu yang memiliki lebih dari sepasang kromosom yang normal bisa triploid (3 kromosom), tetraploid (4 kromosom) maupun lebih. Selain terjadi secara alami poliploidi dapat dimanipulasi dengan perlakuan fisik atau kimia. Perlakuan ini dapat menyebabkan terjadinya retensi pada polar bodi kedua (sel telur akan kehilangan kromosom pada miosis II) diikuti dengan fertilisasi kembali. Selain dapat menghasilkan Individu yang steril manipulasi poliploidi juga dapat menghasilkan jenis kelamin yang seragam (unisex) dan meningkatkan homozigositas (Beaumont et al. 2010). Di dalam akuakultur manipulasi ploidi dapat mengontrol overpopulasi, meningkatkan efisiensi produksi, dan mengontol breeding yang tidak dikehendaki (Coman et al. 2008; Thorgaard, 1983). Poliploidi (triploid dan tetraploid) juga terjadi secara alami pada hewan akuatik seperti ikan dan belum diketahui pada udang (crustacea). Pada ikan triploid secara alami dilaporkan terjadi pada Ameiurus nebulosus dan Oncorhynchus mykiss dan tetraploid pada Misgurnus anguillicaudatus. Untuk manipulasi triploid pada ikan sudah banyak yang berhasil dilakukan antara lain pada ikan mas (Cyprinus carpio), ikan mujair (Oreochromis niloticus), zebrafish (Danio rerio), salmon (Salmo salar) dan lain-lain (Herbst, 2002). Sedangkan pada udang manipulasi triploid yang dilaporkan berhasil adalah pada Fenneropenaeus chinensis (Aloise et al. 2011), udang putih (Litopenaeus vannamei) (Dumas & Ramos, 1999), dan udang kuruma (Penaeus japonicus) (Coman et al. 2008; Norris et al. 2005). Kesimbangan proporsi kelamin (sex) jantan dan betina diharapkan terjadi dalam induksi triploidi maupun tetraploid yaitu 50% jantan dan 50% betina. Pada betina yang homogametik menghasilkan telur XX ketika difertilisasi dengan salah satu sperma X atau Y. Jika kromosom Y pada jantan yang menentukan maka menghasilkan proporsi jantan triploid (XXY) dan betina triploid (XXX). Jika kromosom X pada jantan yang menentukan maka menghasilkan proporsi jantan triploid (XXX) dan betina (XYY). Pada tetraploid, jika kromosom Y dominan dalam penentuan kelamin maka menghasilkan individu XXXY. Sedangkan jika kromosom X maka menghasilkan individu XXXX (Thorgaard, 1983).

3

Selain memiliki keuntungan, manipulasi poliplodi juga memberikan dampak negatif antara lain dapat menurunkan performa untuk beberapa sifat unggul tertentu dan dapat meningkatkan mortalitas dibandingkan individu yang diploid. Meskipun sebagian besar individu triploid adalah steril (mandul) tetapi mereka tetap melakukan ritual perkawinan dengan demikian mereka dapat menganggu proses natural spawning dalam populasi lain. Induksi poliploid pada produksi skala besar kemungkinan tidak memberikan keuntungan secara ekonomi pada beberapa industri akuakultur (Rasmussen & Morrissey, 2007). 2.2. Triploid Memproduksi individu yang triploid menjadi target dalam manipulasi poliploidi. Di dalam akuakultur berbagai spesies sudah berhasil memproduksi individu yang triploid secara komersil terutama pada ikan contohnya ikan mas, ikan lele, ikan mujair (tilapia), salmon, dan beberapa jenis moluska contohnya tiram (oysters), kijing (clams), remis (scallops) dan kerang laut (abalones). Ada tiga alasan utama untuk menghasilkan individu yang triploid pada akuakultur yaitu menghasilkan individu yang steril (mandul), meningkatkan heterozigositas, dan polyploid gigantism (Beaumont et al. 2010). Sterilitas atau kemandulan merupakan alasan utama dalam manipulasi ploidi. Pada individu yang triploid perkembangan gonadnya berkurang atau tidak berkembang sama sekali sehingga tidak bisa mencapai matang kelamin (maturity). Pada individu yang diploid sebagian besar energi digunakan untuk perkembangan gonad sedangkan pada individu triploid digunakan untuk untuk pertumbuahan. Oleh karena itu, individu triploid memiliki pertumbuhan lebih cepat dari individu diploid. Sterilitas pada akuakultur dapat melindungi spesies asli dari spesies introduksi secara genetik dan mengurangi dampak terhadap lingkungan jika individu triploid lepas ke alam liar. Kombinasi antara gamet haploid dan diploid dapat menghasilkan 100% individu triploid metode ini disebut interploid triploids. Di awal perkembangannya, individu triploid biasanya mengalami mortalitas yang cukup tinggi hal ini pernah terjadi pada rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) (Beaumont et al. 2010). Di dalam genom individu triploid terjadi peningkatan heterozigositas dibandingkan dengan individu diploid. Meningkatnya heterozigositas ini menyebabkan juga meningkatnya performa ciri-ciri kuantitatif (quantitative traits) terhadap depresi lingkungan. Sel triploid memiliki nukleus (inti) lebih besar daripada sel diploid. Pada tumbuhan yang triploid memiliki dinding sel yang kuat serta ukuran sel yang besar. Sedangkan pada sel hewan hanya terjadi penambahan ukuran sel. Besarnya ukuran sel ini berpengaruh pada pertumbuhan dari individu tersebut menjadi lebih besar. Fenomena ini disebut polyploid gigantism. Pada sel diploid relatif seimbang antara nukleus dan sitoplasma sedangkan pada sel triploid cenderung tidak seimbang (Beaumont et al. 2010). 4

2.3. Tetraploid Individu tetraploid dapat digunakan sebagai sumber gamet diploid untuk menghasilkan interploid triploids dan androgens. Tetraploid pada ikan sudah sukses dibuat dengan target pada pembelahan pertama (miosis I), tetapi metode ini tidak sukses dilakukan pada moluska. Hal ini dimungkinkan karena adanya perbedaan pada masa awal pembelahan embrio. Pada ikan awal pembelahan adalah sama sedangkan pada moluska terdiri dari dua ukuran nukleus sel yang tidak sama dengan ‘polar lobe’ sitoplasmanya. Produksi individu tetraploid dapat dilakukan pada miosis I maupun miosis II (Beaumont et al. 2010). Tetraploid pada ikan jantan dewasa dan tiram sudah sukses untuk menghasilkan interploid triploids, walaupun spermatozoa diploid cenderung untuk sedikit aktif daripada spermatozoa haploid (normal). Telur dari ikan betina yang tetraploid disilangkan dengan spermatozoa yang haploid juga sukses menghasilkan interploid triploids (Beaumont et al. 2010). Menggunakan sperma diploid dari jantan yang tetraploid untuk memfertilisasi telur yang diploid dari betina yang tetraploid akan menghasilkan semua keturunan menjadi tetraploid. Broodstock tetraploid sudah dikembangkan pada ikan rainbow trout dan beberapa jenis ikan lainnya. Populasi tetraploid juga dapat memberikan ancaman terhadap munculnya gen resesif yang dihasilkan dari proses inbreeding yang tertutup. Untuk mengatasi ini maka individu yang diploid dan triploid digabung dalam populasi tetraploid untuk mengurangi resiko dan efek dari gen resesif ini (Beaumont et al. 2010). 3. Metode 3.1. Teknik induksi ploidi Manipulasi ploidi dilakukan pada tahap embrional menggunakan embrio diploid yang mengandung kromosom maternal atau kromosom paternal. Konsep dasar dari metode manipulasi poliploidi ini adalah membiarkan terjadinya pembelahan kromosom tetapi mencegah pembelahan sel dengan cara menekan pembelahan sitoplasmanya. Manipulasi poliploidi dapat dilakukan pada miosis I (umumnya dilakukan pada moluska) dan miosis II (umumnya dilakukan pada moluska dan ikan). Pada ikan, miosis II selalu menjadi target pembelahan untuk produksi triploid karena pada miosis I komponen pembelahan sel sudah komplit dan polar bodi pertama (first polar body) sudah ditekan sebelum telur dilepas (Beaumont et al. 2010). Manipulasi ploidi umumnya dilakukan dengan perlakuan kejutan fisik dan kimia. Dengan kejutan terjadi fertilisasi baru yang singkat setelah fertilisasi yang menghasilkan retensi pada polar bodi kedua (second polar body) pada sel telur. Hal ini menyebabkan 5

terjadinya depolarisasi tubulin (terurainya tubulin) yang membentuk mikrotubul yang penting bagi formasi spindle apparatus. Polar bodi kedua normalnya ditekan setelah fertilisasi tapi ditahan sehingga hasilnya telur mengandung tiga haploid pada inti, ketika terjadi fusi maka zigot menjadi triploid. Induksi ploidi dilakukan sebelum pembelahan pertama, jarang sekali dilakukan pada pembelahan kedua dan ketiga (Beaumont et al. 2010; Razak et al. 1999).

Gambar 2. Mekanisme kerja pada manipulasi poliploidi. Pada miosis I menghasilkan triploid dan miosis II menghasilkan triploid dan tetraploid. (a-d) adalah pembelahan normal; (a) oosit diaktivasi oleh spermatozoa; (b) miosis I, polar bodi pertama ditekan; (c) miosis II, polar bodi dua ditekan dan syngami terjadi; (d) membelah. (e-g) dengan perlakuan kejutan (shock) kromosom betina ditahan dalam telur dan pada miosis I terbentuk triploid. (h, i) pada miosis II membentuk triploid. (j, k) membentuk tetraploid (Beaumont et al. 2010). Perlakuan secara fisik dilakukan dengan menggunakan kejutan listrik, temperatur, dan tekanan. Pemberian perlakuan ini dilakukan dalam jangka waktu yang singkat (dalam hitungan detik). Perlakuan dengan kejutan fisik jarang sekali efektif 100%. Perlakuan ini menunjukkan hasil yang konsisten pada telur ikan dibandingkan moluska. Telur yang berhasil dimanipulasi tergantung dari besarnya kejutan fisik yang diberikan dan waktu perlakuan. Perlakuan dengan temperatur secara umum lebih mudah dilakukan. Teknik ini 6

dilakukan dengan memberikan kejutan panas (heat shock) atau kejutan dingin (cold shock) dengan suhu sekitar 5-10 oC dari suhu lingkungannya. Dengan kejutan panas, induksi triploid berhasil dilakukan pada udang Machrobrachium nipponense (Norris et al. 2005). Sedangkan dengan kejutan dingin berhasil dilakukan pada udang P. chinensis. Metode kejutan fisik lainnya yang umum dilakukan adalah telur ditempatkan didalam chamber kemudian diberi tekanan sampai 9000 lb/in2 (≈ 60 MPa atau 600 bar). Keberhasilan metode ini hampir mencapai 100% menjadi triploid. Faktor kunci yang mempengaruhi efektifitas perlakuan fisik adalah waktu perlakuan, intensitas dan durasi kejutan, dan optimasi prosedur yang diperlukan setiap spesies (Beaumont et al. 2010; Pandian & Koteeswaran, 1998). Pada moluska metode yang berhasil digunakan untuk induksi poliploidi adalah dengan perlakuan kimia, yaitu menggunakan Cytochalasin B (CB). Tetapi ketika diberikan pada sel telur udang yaitu pada Fenneropenaeus chinensis dan udang putih (Litopenaeus vannamei) menunjukkan rendahnya survival rate (Bao et al. 1994; Dumas & Ramos 1999). CB adalah ekstrak yang berasal dari fungi yang dapat menghambat pembentukan formasi mikrofilament atau sitokinesis. Perlakuan dengan CB diberikan sebelum sel mulai membelah. CB tidak bisa larut dalam air sehingga harus dibantu dengan pemberian dimethyl sulphoxide (DMSO). DMSO juga membantu masuknya CB ke dalam sel telur melalui dinding sel. CB sangat beracun bagi manusia meskipun dalam jumlah yang sedikit (2 mg/L) sehingga dikhawatirkan individu triploid yang dihasilkan dari perlakuan ini dapat terkontaminasi. Untuk itu digunakan zat kimia yang rendah kadar toksinnya yaitu 6dimethylaminopurine (6-DMAP) yang dapat larut dalam air. Pada moluska dengan menggunakan metode ini hampir 100% menghasilkan individu yang triploid. Selain menggunakan perlakuan kimia untuk menghasilkan individu yang triploid secara komersil juga dilakukan dengan perkawinan silang antara individu yang triploid dengan diploid (Beaumont et al. 2010). Selain dengan perlakuan fisik dan kimia, induksi ploidi juga dilakukan secara biologis menggunakan inseminasi heterospesifik, cross breeding, natural breeding, dan dispermy. Inseminasi heterospesifik digunakan luas untuk mengaktifasi perkembangan sel telur dan menyebabkan maternal diturunkan terpisah (sendiri). Sebelum digunakan sperma donor diiradiasi terlebih dahulu. Cross breeding diaktivasi atau difertilisasi oleh sperma yang membawa sejumlah set kromosom yang tidak sama. Natural breeding telur yang unisexual diaktivasi oleh sperma inangnya (contohnya pada ikan). Dispermy merupakan teknik baru yang digunakan untuk meningkatkan heterozigositas dengan cara menginduksi triploid atau androgenik. Metode ini difasilitasi dengan pemberian polyethylene glycol dan gamet heterologous (Pandian & Koteeswaran, 1998). 7

3.2. Identifikasi perubahan ploidi Individu yang poliploidi tidak berbeda secara morfologi dengan individu yang diploid sehingga perlu diidentifikasi perubahan ploidinya. Pada ikan dan kerang-kerangan dapat diidentifikasi dengan cepat dengan metode flow cytometer, yaitu pengukuran berdasarkan jumlah DNA spesifik pada setiap sel individu. Hasilnya berupa grafik yang menampilkan kalkulasi proporsi sampel yang triploid maupun diploid atau ploidi lainnya dengan

mengukur area dibawah puncak grafiknya bersamaan dengan jumlah DNA disetiap tipe ploidinya. Masalah utama dengan metode ini adalah harga cukup mahal sehingga tidak semua tempat budidaya mampu membelinya (Beaumont et al. 2010). Metode lain untuk mengidentifikasi triploid dan tetraploid adalah menghitung jumlah kromosom secara langsung (karyotyping), mengukur ukuran nukleus setiap sel yang diambil dari darah dan jaringan lainnya, skoring menggunakan penanda genetik, dan DNA finger printing. Penghitungan kromosom memerlukan pengalaman dan waktu yang lama, tapi akurasinya cukup tinggi karena menghitung jumlah kromosom secara langsung. Mengukur ukuran nukleus dari darah dan jaringan lainnya relatif lebih murah, cepat dan efektif, dan tidak merusak tetapi sampelnya harus dikorbankan. Penggunaan penanda genetik seperti mikrosatelit untuk konfirmasi poliploidi dapat digunakan karena memiliki polimorfisme yang tinggi berdasarkan jumlah alelnya. Contohnya individu yang triploid memiliki tiga alel dengan genotif ABC dapat dengan mudah ditentukan. Tetapi individu yang triploid heterozigotik dengan genotif AAB pengukuran dengan penanda ini tidak selalu tepat karena akan dibaca hanya dua alel yaitu alel A dan B artinya individu ini akan teridentifikasi sebagai diploid (Beaumont et al. 2010). Menggunakan metode DNA finger printing memiliki sensitifitas yang tinggi sehingga sangat tepat untuk identifikasi ploidi. Kelemahan dengan metode ini adalah memerlukan keahlian khusus dan berbiaya mahal sehingga tidak selalu bisa digunakan (Pandian & Koteeswaran, 1998). 4. Kesimpulan Penggunaan teknologi manipulasi kromosom terutama untuk menghasilkan individu yang poliploid (triploid dan tetraploid) sudah banyak dilakukan pada berbagai jenis ikan tetapi masih sedikit sekali dilakukan pada udang (crustacea). Tujuan utama dari penggunaan teknologi ini adalah untuk menghasilkan individu yang steril (mandul) dengan harapan pertumbuhan akan lebih cepat. Selain itu dapat meningkatkan efisiensi produksi, mengontorol overpopulasi, dan mengontol breeding yang tidak dikehendaki. Spesies udang yang dilaporkan sudah berhasil menggunakan teknologi ini adalah Fenneropenaeus chinensis, Litopenaeus vannamei, dan Penaeus japonicus. Pada Fenneropenaeus chinensis enam bulan pertama pertumbuhannya dapat mencapai 20% dari individu normal 8

(diploid). Untuk udang galah (Macrobrachium rosenbergii) sampai saat ini belum ada laporan ilmiah yang pernah menggunakan teknologi ini untuk meningkatkan

pertumbuhannya. Oleh karena itu, kedepannya teknologi ini bisa dicoba diterapkan dalam rangka meningkatkan produktifitas udang galah di Indonesia. Daftar Pustaka Aloise, D.A., Maia-Lima, F.A., de Oliveira, R.M., Cabral, T.M., & Molina, W.F. 2011. Ploidy Manipulation and Polyploid Detection in the White Shrimp Litopenaeus vannamei (Boone 1931) (Decapoda, Penaeidae). Mar Biotechnol 13:41–47 Bao, Z., Zhang, Q., & Wang H. 1994. Cytochalasin B Induced Triploidy in Penaeus chinensis. Acta Oceanol Sin/Haiyang Xuebao 12:261–267 Beaumont, A., Boudry, P., & Hoare, K. 2010. Chapter 7 : Triploids and Beyond: Why Manipulate Ploidy? In Biotechnology and Genetics in Fisheries and Aquaculture. Second Edition. A John Wiley & Sons, Ltd. Coman, F.E., Sellars, M.J., Norris, B.J., Coman, G.J., Preston, N.P. 2008. The Effects of Triploidy on Penaeus (Marsupenaeus) japonicus (Bate) Survival, Growth and Gender when Compared to Diploid Siblings. Aquaculture 276 : 50–59 Dumas, S., & Ramos, R.C. 1999. Triploidy Induction in the Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei (Boone). Aquacult Research 30:621–624 Herbst, E.C. 2002. Induction of Tetraploidy in Zebrafish Danio rerio and Nile Tilapia Oreochromis Niloticus. Thesis: The School of Renewable Natural Resources. University of North Carolina. Charlotte. USA New MB. 2010. Chapter 1: History and Global Status of Freshwater Prawn Farming In Freshwater Prawns Biology and Farming. Michael Bernard New, Wagner Cotroni Valenti, James H. Tidwell, Louis R. D’Abramo, Methil Narayanan Kutty (Editor). Willey-Blackwell: A John Wiley & Sons, Ltd. Norris, B.J., Coman, F.E., Sellars, M.J., & Preston, N.P. 2005. Triploid Induction in Penaeus japonicus (Bate) with 6-dimethylaminopurine (Short Communication). Aquaculture Research 36:202-206 Pandian, T.J. & Koteeswaran, R. 1998. Ploidy Induction and Sex Control in Fish. Hydrobiologia 384:167–243 Rasmussen, R.S & Morrissey, M.T. 2007. Biotechnology in Aquaculture: Transgenics and Polyploidy. Institute of Food Technologists Oregon State Univ. USA Razak, S.A., Hwang, G.L., Rahman, M.A., & Maclean, N. 1999. Growth Performance and Gonadal Development of Growth Enhanced Transgenic Tilapia Oreochromis niloticus (L.) Following Heat-Shock-Induced Triploidy. Mar. Biotechnol. 1: 533–544 Thorgaard, G.H. 1983. Chapter 8: Chromosome Set Manipulation and Sex Control In Fish In Fish Physiology. W.S. Hoar, D.J. Randall, & E.M. Donaldson (Editor). Volume IX. Academic Press, Inc. New York

9

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful